WO2023085433A1 - ヒト細胞内でヒト人工染色体ベクターを作製する方法 - Google Patents

ヒト細胞内でヒト人工染色体ベクターを作製する方法 Download PDF

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康宏 香月
愛海 宇野
一磨 冨塚
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Tottori University NUC
Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences
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    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/208—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of mammalian origin, e.g. minichromosome

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing human cells, such as normal or aneuploid human cells, in which human artificial chromosome vectors derived from human chromosomes and substantially free of endogenous genes are formed.
  • the present invention also relates to human cells containing the above human artificial chromosome vectors.
  • mouse artificial chromosome vectors and human artificial chromosome vectors have been developed by the present inventors, for example, mice capable of producing human proteins (e.g., human antibodies, etc.) were created (Patent Document 1 ).
  • Human artificial chromosome vector contains a human centromere, a long arm fragment near the centromere (many of the endogenous genes have been deleted), and a telomere produced by modifying the human chromosome, and a site for inserting a foreign gene Contains a specific recombinase recognition site.
  • the production of such a vector involves fusing human fibroblasts with mouse A9 cells, introducing human chromosomes into chicken DT40 cells that are modifiable by homologous recombination, and generating as many human chromosomes as possible in the DT40 cells. It involves removing the endogenous gene region to create a human chromosomal vector (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Documents 2 and 3 describe methods for site-specific DNA cleavage and homologous integration in mammalian cells such as human cells using genome editing with CRISPR/Cas9. It is
  • Patent Document 3 also describes a method for producing human artificial chromosome vector-retaining cells using human cell-derived micronuclear cells. This method also uses mouse A9 cells and chicken DT40 cells to prepare human chromosome vectors from human cells as described in Patent Document 1, and then converts the vectors into MMCT (Microcell-Mediated introduction into Chinese hamster ovary (CHO) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells by Chromosome Transfer).
  • MMCT Microcell-Mediated introduction into Chinese hamster ovary (CHO) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells by Chromosome Transfer).
  • the present inventors have now discovered a method for producing a highly safe human artificial chromosome vector using human cells instead of non-human animal cells.
  • the invention includes the following features.
  • a disomy human cell containing a pair of homologous human chromosomes or a trisomy human cell containing a trisomy of homologous human chromosomes one of the two chromosomes of the disomy, or one of the three chromosomes of the trisomy
  • the long arm and short arm endogenous genes are substantially deleted from the two chromosomes, thereby including a human artificial chromosome vector having a long arm and a short arm portion substantially free of endogenous genes, a human centromere, and a telomere
  • a method for producing human cells containing a human artificial chromosome vector comprising producing a cell population containing human cells and collecting human cells containing the human artificial chromosome vector from the cell population.
  • a human cell containing one human chromosome and one or two human artificial chromosome vectors derived from human chromosomes homologous thereto, wherein the human artificial chromosome vector is substantially free of endogenous genes A human cell having arm and short arm segments, a human centromere and a telomere, and wherein said cell contains two copies of the haploinsufficiency gene.
  • lane 1 shows the results of adding T7E to the PCR product of DNA derived from ribonucleoprotein complex (“RNP”)-introduced cells consisting of CRISPR-Cas9 protein.
  • Lane 2 shows the results of PCR products of DNA derived from RNP-introduced cells without addition of T7E.
  • Lane 3 shows the results of adding T7E to the PCR product of DNA derived from RNP-unintroduced cells.
  • Lane 4 shows the result of not adding T7E to the PCR product of DNA derived from RNP-unintroduced cells.
  • lane 5 shows a DNA size index marker (“Marker” in the figure), Gene ladder wide 2.
  • Marker in the figure
  • This figure shows the analysis results of PCR amplification products obtained by introducing a guide RNA (gRNA) into a human iPS cell line (201B7) for deletion of the long arm of human chromosome 21.
  • Lane 1 is DNA ladder marker, Gene ladder wide 2.
  • Lane 2 shows the results of PCR using untreated wild-type 201B7 cell-derived DNA ("201B7 wt" in the figure).
  • Lane 3 to Lane 8 show the analysis results using genomic DNA collected 48 hours and 1 week after introduction of the combination of gRNAs for deleting the long arm of chromosome 21 into 201B7. Even when the genomic DNA collected after 1 week was used, an amplified product specific to deletion of the long arm of chromosome 21 was detected when using a sample amount of about 1500 cells corresponding to 10 ng of DNA. indicates In the figure, "100 ng", “10 ng", and "1 ng” each indicate the amount of template DNA used. These are the results of Example 3. This figure shows the results of determining the deletion of the long arm region in the human chromosome 21 long arm deleted cell population for the amplified product by the PCR method. Lane 1 shows DNA size index markers.
  • Example 4 shows that in the determination of deletion of the long arm region in the human chromosome 21 long arm deletion cell population, when DNA derived from the 6F locus was used, no amplified product specific to the appearance of the long arm inversion on chromosome 21 was detected. indicates that These are the results of Example 4.
  • This figure shows 12 subclones out of 49 subclones (#3, #10, #14, #18, #19, #21) for the cell population at the 6F locus in which the full length of the long arm of chromosome 21 has been deleted, by the PCR method. , #22, #27, #29, #32, #37, and #38), the target amplification product (245 bp) was confirmed.
  • "201B7" indicates the results when untreated 201B7 cells were used, NC indicates the negative control, and PC indicates the positive control.
  • This figure shows the presence of a chromosome fragment (?del(21)(q11.2q22.3)) indicating deletion of the long arm of chromosome 21 in human iPS cells using the #10 clone using the G-Band method. shows the results confirmed by In the #10 clone, a chromosome fragment with deletion of the long arm of chromosome 21 was observed as compared with the wild-type 201B7 cell. These are the results of Example 7. This figure shows that a chromosome fragment (?del (21) (q11.2q22.3) indicating deletion of the long arm of chromosome 21 is present in human iPS cells using the #29 clone by the G-Band method.
  • Example 8 shows the results of confirmation by the mBand method of the presence of a chromosome fragment indicating deletion of the long arm of chromosome 21 in human iPS cells when #10 clone was used.
  • white arrowheads large and white arrowheads (small) are the same as explained in FIG. 8-1.
  • #10 clone a chromosomal fragment with deletion of the long arm of chromosome 21 was observed as compared with the wild-type 201B7 (FIG. 8-1).
  • Example 8 shows the result of confirming by the mBand method that a chromosome fragment indicating deletion of the long arm of chromosome 21 exists in human iPS cells when #29 clone was used.
  • white arrowheads large
  • white arrowheads small
  • FIG. 8-1 white arrowheads
  • a chromosomal fragment showing deletion of the long arm of chromosome 21 was observed as compared with the wild-type 201B7 (FIG. 8-1).
  • This figure shows the results of determining the deletion of the long arm region in a cell population of human trisomy 21 iPS cell lines with deletion of the long arm region of human chromosome 21 for amplification products by the PCR method. It shows that amplification products specific for chromosome long arm deletion were obtained for DNAs derived from 96-well Nos. 59, 64, 66, 71 and 78 loci. These are the results of Example 9.
  • This figure shows the results of determining the deletion of the long arm region in a cell population of human trisomy 21 iPS cell lines with deletion of the long arm region of human chromosome 21 for amplification products by the PCR method. DNA from 96-well No.
  • 59, 64, 66, 71, 78 loci shows no amplification products specific for chromosomal length inversions.
  • This figure shows that the target amplification product (245 bp) was confirmed in 4 subclones (#8, 17, 24, 26) out of 26 subclones for the human chromosome 21 long arm deleted cell population.
  • These are the results of Example 9.
  • This figure shows the results of confirmation by the DAPI staining method that a chromosomal fragment indicating deletion of the long arm of chromosome 21 is present in human iPS cells when the trisomy strain (2767-4) is used.
  • Example 10 shows the analysis results using genomic DNA collected 48 hours and 1 week after introduction of a combination of gRNAs for deleting the short arm of chromosome 13 into normal karyotype iPS cells (201B7). . Even when the genomic DNA collected after one week was used, an amplification product specific to deletion of the short arm of chromosome 13 was detected when using a sample amount of about 1500 cells corresponding to 10 ng of DNA. indicates These are the results of Example 11.
  • This figure shows the result of determination of deletion of the short arm region in a normal karyotype iPS cell line (201B7) in which the long arm of human chromosome 13 was deleted, using PCR amplification products.
  • 11 locus-derived DNAs (4B to 8G, 10A, 10C, 11D), including 96-well numbers 4C and 5C, show that human chromosome 13 short arm deletion-specific amplification products were obtained.
  • These are the results of Example 12.
  • This figure shows the results of determination of deletion of the short arm region in a human chromosome 13 short arm deletion cell population in a normal karyotype iPS cell line (201B7) for amplified products by PCR.
  • Example 12 shows that no chromosomal short-arm inversion-specific amplification products were obtained for DNA from 96-well No. 4C, 5C loci. These are the results of Example 12.
  • This figure shows 96 wells #4, 10, 22, 23, 25, 31, 39, 47, 52, 62 in human chromosome 13 long arm deleted subclones in a normal karyotype iPS cell line (201B7). , shows that chromosomal short-arm deletion-specific amplification products were obtained for DNA derived from 63 loci. These are the results of Example 13.
  • This figure shows the DNA from subclones #2, 4, 5 from the 96-well number #4 locus in the human chromosome 13 long arm deletion subclone in a normal karyotype iPS cell line (201B7). This indicates that a good amplification product was obtained. These are the results of Example 13. This figure shows the results of confirmation by the G-Band method that a chromosome fragment and a chromosome showing deletion of the 13th short arm exist in human iPS cells when using the disomy strain (201B7).
  • Lanes 2 to 7 show the analysis results using genomic DNA collected 48 hours and 1 week after introduction of the combination of gRNAs for deleting the short arm of chromosome 21.
  • Lane 1 is a DNA ladder marker (“Marker” in the figure). In the figure, "100 ng", “10 ng”, and “1 ng” each indicate the amount of template DNA used.
  • the upper row shows the results when using 201B7 cells (“201B7” in the figure), which is a disomy human iPS cell line, and the lower row shows the results when using 2767-4 cells (“2767-4” in the figure), which is a trisomy human iPS cell line. ) is used. It was found that the efficiency of deleting the short arm of chromosome 21 was increased by using a trisomy cell line.
  • human centromere and to produce a cell population containing human cells containing a human artificial chromosome vector having a telomere, further comprising recovering human cells containing the human artificial chromosome vector from the cell population , provides a method for making human cells containing a human artificial chromosome vector.
  • Human chromosomes that can be used in the above method may be any of human chromosomes 1 to 22 and sex chromosomes (X and Y), and the trisomy is human chromosomes 1 to 22 and sex chromosomes Any trisomy.
  • a “disomy” herein is a pair of homologous human chromosomes, which may be a pair of normal chromosomes, or have a mutation in one gene of an allele and thus are produced from that gene. It may be a pair of human chromosomes containing a gene (referred to as a "haploinsufficiency gene") involved in so-called haploinsufficiency, a phenomenon in which the amount of a protein to be produced is insufficient and the function is impaired.
  • trisomy refers to a human cell exhibiting an aneuploid chromosomal abnormality that includes an extra homologous chromosome in addition to a pair of homologous chromosomes.
  • chromosomal abnormalities are known in humans, for example, trisomy 21, trisomy 19, trisomy 18, trisomy 16, trisomy 13, trisomy 7, and the like. contains three chromosome 21 homologous to
  • the methods of the present invention can be performed in human cells from one of the two chromosomes of a disomy comprising a pair of homologous human chromosomes of interest (or of interest) or from a trisomy of three chromosomes of interest (or interest). It is characterized by comprising producing a human artificial chromosome vector from one or two chromosomes. This vector has human centromeres and telomeres, but the long and short arms are substantially free of endogenous genes.
  • substantially means one or more genes excluding causative genes that cause chromosomal abnormalities when the human cells of the present invention are used for treatment, for example, 30 or less, 20 or less, 10 or less, 5 It means that it can contain no more or no more than two genes. However, in the present invention, it is preferred that the vector does not contain any endogenous genes in the long and short arms in consideration of therapeutic safety.
  • a disomic human cell can be a cell containing a pair of homologous chromosomes of interest (or of interest), or can be a human cell containing a haploinsufficient gene, as described above.
  • Trisomy human cells are, for example, cell lines derived from trisomy human patients as described above, induced pluripotent stem (iPS) cells generated from trisomy human patient-derived cells, or human normal cells with one human chromosome. Including artificial trisomy human cells that are artificially produced by introduction. Human cells may optionally contain a haploinsufficient gene.
  • iPS induced pluripotent stem
  • the above trisomy human patient-derived cells include, but are not limited to, Down syndrome patient fibroblast cell lines such as JCRB9044 Detroit 532 (skin-derived), ATCC CCL-54 TM Detroit 532 (skin-derived), CORIELL Institute GM02767 (fibroblasts origin), etc.
  • the iPS cells produced from the above trisomy human patient-derived cells include, but are not limited to, Down syndrome patient fibroblast-derived iPS cells, such as ATCC-DYP0730 IPS Cells (ACS-1003 TM ) (this cell is ATCC CCL-54 TM Detroit 532 (human Down's syndrome cell line) was reprogrammed (reprogrammed) under the expression of Oct4, Sox2, Klf4 and Myc genes.), SKIP001644: ND50026 (SKiP Stemcell Search), etc.
  • Down syndrome patient fibroblast-derived iPS cells such as ATCC-DYP0730 IPS Cells (ACS-1003 TM ) (this cell is ATCC CCL-54 TM Detroit 532 (human Down's syndrome cell line) was reprogrammed (reprogrammed) under the expression of Oct4, Sox2, Klf4 and Myc genes.
  • SKIP001644 ND50026 (SKiP Stemcell Search), etc.
  • iPS cells can be produced by the following known methods. Specifically, the above iPS cells are somatic cells (including somatic stem cells), introduced with a specific reprogramming factor (DNA or protein), cultured in an appropriate medium, and further Colonies are formed in about 3-5 weeks by subculturing.
  • Reprogramming factors are, for example, the combination consisting of Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc; the combination consisting of Oct3/4, Sox2 and Klf4; the combination consisting of Oct4, Sox2, Nanog and Lin28; , Klf4, c-Myc, Nanog and Lin28 are known (K. Takahashi and S.
  • the above-mentioned culture is carried out, for example, by using mitomycin C-treated mouse fetal fibroblast cell lines (e.g., STO) as feeder cells, using a medium for ES cells on this feeder cell layer, and reprogramming factor-expressing vector-introduced somatic cells (about 10 4-10 5 cells/cm 2 ) at a temperature of about 37°C.
  • mitomycin C-treated mouse fetal fibroblast cell lines e.g., STO
  • reprogramming factor-expressing vector-introduced somatic cells about 10 4-10 5 cells/cm 2
  • feeder cells are not necessarily required (Takahashi, K. et al., Cell; 131:861-872 (2007)).
  • the basal medium is, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), Ham's F-12 medium, RPMI-1640 medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), mixed medium thereof, etc., and human iPS
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • RPMI-1640 medium RPMI-1640 medium
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium iPS
  • a primate ES cell medium Reprocell, Japan
  • Feeder cells are not necessarily required.
  • MMCT Microcell-Mediated Chromosome Transfer
  • human cells are cultured in a medium containing a micronucleus formation inducer (e.g., a microtubule polymerization inhibitor) to produce human cell-derived micronucleated cells (WO2020/075823).
  • a micronucleus formation inducer e.g., a microtubule polymerization inhibitor
  • Micronucleated cells containing any of the human chromosomes can be generated by this method and fused with human cells using the MMCT method similar to the method of Nawata et al. to generate trisomy human cells.
  • Trisomy human cells can be identified, for example, by Karyotype analysis.
  • one of the chromosomes in disomy human cells, or one or two of the three homologous chromosomes that constitute trisomy in trisomy human cells for example, genome editing (e.g., CRISPR / Cas system), telomere cleavage method, site-specific recombination enzyme / using techniques such as recombination method by the enzyme recognition site system, the endogenous gene of the long arm and short arm is substantially deleted, and in some cases the foreign gene Site-specific DNA insertion sequences for loading (eg, site-specific recombinase recognition sequences), and optionally foreign genes or DNA can be inserted.
  • genome editing e.g., CRISPR / Cas system
  • telomere cleavage method e.g., telomere cleavage method
  • site-specific recombination enzyme / using techniques such as recombination method by the enzyme recognition site system
  • Site-specific DNA insertion sequences for loading eg, site-specific
  • a phenomenon that certain enzymes recognize specific recognition sites and specifically cause recombination of DNA at the recognition sites is known, and the human artificial chromosome in the present invention
  • a target foreign gene or DNA can be inserted using a system consisting of such an enzyme and its recognition site.
  • Such systems include, for example, a system of Cre enzyme derived from bacteriophage P1 and a loxP sequence as its recognition site (Cre/loxP system; B.
  • telomere editing a foreign gene or DNA sequence can be knocked into a target site by using, for example, the CRISPR/Cas9 system shown below together with a donor vector containing the foreign gene or DNA sequence.
  • the foreign gene or DNA is, for example, a human gene or DNA useful for the treatment of human diseases or disorders, in some cases, a reporter gene (for example, a gene encoding a fluorescent protein such as GFP, EGFP, or YFP), a selection marker gene (for example, it may contain drug resistance genes such as Neo R , Amp R , BSR , etc.).
  • a reporter gene for example, a gene encoding a fluorescent protein such as GFP, EGFP, or YFP
  • a selection marker gene for example, it may contain drug resistance genes such as Neo R , Amp R , BSR , etc.
  • any human foreign gene or DNA that can be used in regenerative medicine or gene therapy that is promising for treatment of chromosomal abnormalities or genetic diseases.
  • human cells include, for example, somatic cells, progenitor cells, stem cells, and cells derived therefrom, including cultured cells, cell lines, passaged cells, Artificially induced cells (eg, iPS cells) and the like are included.
  • Cell types are not limited, and examples include skin cells, lung cells, renal cells, hepatocytes, intestinal cells, renal cells, muscle cells, nerve cells, and bone marrow cells.
  • human stem cells include tissue stem cells (having self-renewal ability and differentiating into cells in tissues), somatic stem cells (having differentiating into multiple cells in vivo, eg, mesenchymal stem cells), and the like.
  • Examples of preferred cells include human-derived somatic cells, progenitor cells, iPS cells, and stem cells such as mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells can be obtained from bone marrow, cord blood, adipose tissue, and the like.
  • the following describes how to convert one or two chromosomes into human artificial chromosome vectors by genome editing in disomy or trisomy human cells.
  • Genome editing is a technique for editing genomic DNA and genetic modification using artificial cleavage enzymes such as TALEN (Transcription Activator-Like Effector nuclease), ZFN (Zinc Finger nuclease), CRISPR-Cas system, and the like. Any technique of genome editing can be used in the method of the present invention, but preferably the CRISPR-Cas system is used.
  • the CRISPR / Cas9 system in particular was discovered from the adaptive immune system against viruses and plasmids of bacteria and archaea, but the construction of vectors is relatively simple and multiple genes can be modified at the same time.
  • This system has a Cas9 nuclease that cleaves double-stranded DNA on the genome and a guide RNA (sgRNA or crRNA (CRISPR RNA) + tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)).
  • the most currently used Cas9 protein is the SpCas9 type, and the PAM sequence is NGG, so there are few restrictions on the mutation introduction position.
  • the sites on the long and short arms of the human chromosome targeted by the guide RNA are sites that allow deletion of endogenous gene regions. Such sites are, for example, in the case of the long arm of human chromosome 21, for example, NC — 000021.9, Homo sapiens chromosome 21, GRCh38. p13 Primary Assembly: NC — 000021.9, Homo sapiens chromosome 21, GRCh38.
  • p13 Primary Assembly sites such that the region from nucleotide numbers 5,011,894 to 10,540,501 is deleted, that is, sites 13,084,315 and 46,670,306 in the long arm, and the short 5,011,894 and 10,540,501 sites on the arm.
  • the guide RNA sequences for cleavage of the long arm of human chromosome 21 and the short arm of human chromosome 13 and their target sequences are, without limitation, for example the following sequences.
  • thymine (T) is uracil (U) in the case of RNA.
  • the target sequence is a nucleotide sequence in which the indicated PAM sequence is bound to the 3' end of each sequence of SEQ ID NOs: 1-4. Note that the PAM sequence is added intracellularly.
  • gRNA near Cen: 5'-GACAGGTAAGGATTACTAGG-3' (SEQ ID NO: 1) + (AGG)-PAM
  • gRNA near Tel: 5'-TAAAGATGTGCTCCTTCCCG-3' (SEQ ID NO: 2) + (AGG)-PAM
  • gRNA near Cen: 5'-AGAACTGAAGCATCACTCAC-3' (SEQ ID NO: 3) + (TGG)-PAM
  • gRNA near Tel: 5'-AGAAGCGAATCCTGCTTGCA-3' (SEQ ID NO: 4) + (GGG)-PAM
  • the guide RNA sequence for cleavage of the short arm of human chromosome 21 and its target sequence are non-limiting, for example, the following sequences.
  • thymine (T) is uracil (U) in the case of RNA.
  • the target sequence is a nucleotide sequence in which the indicated PAM sequence is bound to the 3' end of each sequence of SEQ ID NOS: 15 and 16.
  • gRNA for human chromosome 21 long arm: gRNA (near Tel): 5'-AGACTGTAGCCTTGACCCAG-3' (SEQ ID NO: 15) + (AGG)-PAM gRNA (near Cen): 5'-CTGTGGACGTATTAACTTAC-3' (SEQ ID NO: 16) + (TGG)-PAM
  • human chromosomes other than human chromosomes 21 and 13 as described in the examples below, in the same way as in the case of human chromosomes 21 and 13, for example, by a method such as genome editing Endogenous genes can be deleted from the long and short arms, thereby forming a human artificial chromosome vector.
  • Genomic sequence information for human chromosomes is available from databases such as the NCBI in the United States.
  • Human cells containing the human artificial chromosome vector of interest for example, human cells containing a pair of homologous human chromosomes and one human chromosome-derived human artificial chromosome vector homologous thereto, the human artificial chromosome vector is an endogenous gene Human cells having substantially free long and short arm portions, human centromeres, and telomeres.
  • human cells containing the human artificial chromosome vector of interest for example, human cells containing one human chromosome and one or two human artificial chromosome vectors derived from human chromosomes homologous thereto, the human artificial The chromosomal vector is a human cell having long and short arm portions substantially free of endogenous genes, a human centromere and a telomere, and wherein said cell contains two copies of a haploinsufficient gene.
  • a site-specific DNA insertion sequence and/or a foreign gene or DNA can be further inserted into the long-arm and short-arm portions of the artificial chromosome vector using, for example, genome editing or site-specific recombination technology.
  • Human artificial chromosome vector of interest from a cell population containing human cells containing a human artificial chromosome vector having a long arm and short arm portion, human centromere, and telomere produced by the above method, substantially free of endogenous genes Harvesting human cells containing
  • Animal cell culture media such as EMEM, DMEM, IMDM, RPMI164 and Ham's F12 media can be used as culture conditions for human cells.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells, it is preferable to use a medium for primate ES cells.
  • the medium contains amino acids, vitamins, inorganic salts, trace elements (Cu, Fe, Zn, etc.), nucleosides and bases, substances for energy metabolism (glucose, galactose, Coenzyme A, etc.), antibiotics, cytokines (growth factors , hormones, etc.), supplements, lipids, and, if necessary, serum (fetal bovine serum, etc.) and the like can be appropriately selected and included.
  • a serum-free medium a medium containing the above-described medium components can be used, except that serum is replaced with an alternative serum (human serum albumin, etc.).
  • pH 7.4 can usually be used for culturing human cells.
  • the culture temperature is usually 37°C.
  • Culturing for cloning usually uses a solid culture, such as an agar or agarose medium. Cultivation can be performed in the presence of 5-7% CO 2 in the atmosphere using containers such as petri dishes, multi-well plates and flasks.
  • a solid culture such as an agar or agarose medium. Cultivation can be performed in the presence of 5-7% CO 2 in the atmosphere using containers such as petri dishes, multi-well plates and flasks.
  • containers such as petri dishes, multi-well plates and flasks.
  • culture for example R. I. Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique and Specialized, Applications, Six Ed. , 2010, A John Wiley & Sons, Inc. described in detail.
  • nucleic acid For each colony that appears on the medium, nucleic acid (DNA) is isolated and gene amplified by PCR to identify the deletion of the long- and short-arm endogenous genes, as described in the Examples below. Analysis such as confirmation of chromosomal disruption can be performed to isolate colonies containing the desired human artificial chromosome vector. Furthermore, after the colonies are further purified by solid culture, the target cell clones can be grown and isolated by culturing in a liquid medium containing the above culture components.
  • Karyotype analysis is performed by using a mitotic inhibitor such as colchicine, colcemid, etc.
  • a mitotic inhibitor such as colchicine, colcemid, etc.
  • Giemsa staining method FISH method
  • each chromosome is identified based on the characteristic band pattern and shape of the chromosome, and the presence or absence of polyploidy, aneuploidy and translocation. Abnormalities such as structure and shape can be analyzed.
  • the present invention also provides human cells containing the following human artificial chromosome vector.
  • Haploinsufficiency is as explained in Section 1 above, and when a human chromosome contains a haploinsufficiency gene, it is necessary to contain two copies of the haploinsufficiency gene for the survival and maintenance of cells containing the chromosome. Therefore, the human cell of (2) above contains two copies of the haploinsufficient gene. In such a case, the human cell may contain two copies of the haploinsufficiency gene on one human chromosome, e.g., by translocation; A foreign gene vector loaded with DNA may be prepared and introduced into human cells containing the human artificial chromosome vector of interest described above so that the cells contain two copies of the haploinsufficiency gene.
  • Such vectors are preferably vectors that can be used in humans, such as viral vectors (eg, adeno-associated virus, Sendai virus, etc.) and plasmid vectors.
  • the human cells can be produced, for example, by the methods described in Section 1 above and Examples below.
  • the human artificial chromosome vector can contain a site-specific DNA insertion sequence, or the vector can contain any foreign gene or DNA. It can optionally further include at least one of a reporter gene and a selectable marker gene. Examples of these genes are described in Section 1 above. Human cells can contain human artificial chromosome vectors containing human-derived foreign genes or DNA, which are useful, for example, in gene therapy.
  • Gene therapy includes, but is not limited to, therapeutic methods for resolving deterioration or insufficiency of protein function due to genomic gene mutation, and therapeutic methods for acquired diseases such as cancer and neurodegenerative diseases.
  • the human cells of the present invention are, for example, cells as described in Section 1 above, and are somatic cells or stem cells.
  • Preferred human-derived stem cells are iPS cells or mesenchymal stem cells.
  • Human-derived stem cells such as iPS cells and mesenchymal stem cells containing the human artificial chromosome vector can produce various progenitor cells and differentiated cells by inducing differentiation from these cells, so gene therapy / regenerative medicine Useful.
  • progenitor cells, differentiated cells, or other cells are also included in the human cells of the present invention.
  • Example 1 Design of guide RNA for deletion of entire gene region on human chromosome 21 long arm , POTED (chr21: 13, 609, 777-13, 645, 823), a translated gene closest to the centromere, and PRMT2 (chr21: 46, chr21: 46, 635, 156-46, 665, 685), the POTED gene start point (chr21: 13, 609, 777), the centromere downstream, the long arm start point (chr21: 12,915,808) and between the PRMT2 gene end (chr21: positions 46,665,685) and the telomeric sequence start (chr21: positions 46,699,983).
  • gRNA guide RNA sequence
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  • GRCh38/hg38 The edition of the genome database follows GRCh38/hg38, which is the latest edition currently available.
  • gRNA-21q-01 was designed as a gRNA that cleaves near the centromere.
  • gRNA-21q-TeloT9 was designed as a gRNA that cleaves near telomeres.
  • the target sequences of each gRNA are as follows.
  • gRNA-21q-01 5′-GACAGGTAAGGATTACTAGGAGG-3′ (SEQ ID NO: 5)
  • gRNA-21q-TeloT9 5′-TAAAAGATGTGCTCCTTCCCGAGG-3′ (SEQ ID NO: 6)
  • gRNAs that can target these sequences Integrated DNA Technologies, Inc. It was produced by crRNAXT artificial synthesis service in Alt-R (registered trademark) CRISPR-Cas9 crRNA provided by.
  • telomere guide RNA for deletion of entire gene region on human chromosome 21 long arm crRNA containing the target sequence specified by gRNA-21q-TeloT9 has target sequence-specific cleavage activity
  • human iPS cells 201B7 RIKEN BioResource Research Center Cell Material Development Office, HPS0063 strain
  • CRISPR-Cas9 protein by the following method Ribonucleoprotein complex ("RNP") was performed and T7 endonuclease analysis was performed.
  • RNP Ribonucleoprotein complex
  • RNP CRISPR-Cas9 protein complex
  • 201B7 was cultured on a 6-well plate (ThermoFisher) using StemFit AK02N (Reprocell) and iMatrix-511 Silk (Matrixome). In advance, 10 ⁇ M Y-27632 (Fujifilm Wako) was added to the culture medium. Cells were incubated for 1 hour at 37°C. After that, 2 ⁇ 10 6 cells of 201B7 cells were collected as introduced cells, suspended in 10 mL of Opti-MEM (ThemoFisher), centrifuged at 700 rpm for 10 minutes, and washed.
  • Opti-MEM ThemoFisher
  • RNP introduction into 201B7 was carried out by electroporation using a super electroporator NEPA21 manufactured by Nepagene Co., Ltd. as an apparatus. Electroporation conditions were as follows: Poring Pulse: Voltage 150 V, Pulse Length 5.0 msec, Pulse Interval 50.0 msec, Number of Pulses 2, Decay Rate 10%, Polarity +/-, and Set Parameters: Volta ge 20.0V , Pulse Length 50.0 msec, Pulse Interval 50.0 msec, Number of Pulses 5, Decay Rate 40%, and Polarity +/-.
  • 201B7 was seeded in 1 well of a 6-well plate in 2 mL of StemFit AK02N medium supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 and 4.8 ⁇ L of iMatrix-511 silk. One day after electroporation, the medium was changed to regular StemFit AK02N medium. Two days after electroporation, genomic DNA derived from the electroporated 201B7 cells was extracted and amplified by PCR using Re-21q tel F3 and Re-21q tel R3 as a template.
  • PCR amplification was performed using approximately 100 ng of genomic DNA.
  • KOD One (registered trademark) PCR Master Mix manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used as the DNA polymerase, and the reaction conditions were 35 cycles of denaturation at 98°C for 10 seconds, annealing at 60°C for 5 seconds, and extension at 68°C for 5 seconds.
  • Amplified products were detected by ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2% agarose gel. As a result, an amplification product of around the expected length (507 bp) was detected.
  • the amplified product was subjected to T7 endonuclease analysis using T7 Endnuclease I reaction Mix (Nippon Gene).
  • Primers were prepared using Primer3Plus based on nucleotide sequences obtained from the NCBI database. The names and sequences of the primers are shown below.
  • Re-21q tel F3 5'-AACTGAGCCCCTTTCTTCGG-3' (SEQ ID NO: 7)
  • Re-21q tel R3 5'- AGGATTCTCTGCTCCCCCAT-3' (SEQ ID NO: 8)
  • T7 endonuclease analysis was performed by the following method.
  • a PCR solution containing the amplified product was subjected to denaturation and annealing of the amplified product using a thermal cycler.
  • 1 ⁇ L of 1 M NaCl was added to 8 ⁇ L of the amplified product, and the reaction conditions were denaturation at 95° C. for 5 minutes, annealing at 95° C. ⁇ 85° C. at 2° C./second, and 85° C. ⁇ 25° C. at 0.1° C./second.
  • 9 ⁇ L of the substrate DNA fragment and 1 ⁇ L of T7 Endonuclease I reaction Mix (T7E) were mixed together and reacted at 37° C. for 1 hour.
  • reaction products were detected by ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2% agarose gel. As a result, reaction products of expected lengths (before cleavage: around 507 bp, after cleavage: around 364 bp, around 143 bp) were detected (Fig. 1).
  • Lane 1 (RNP+, T7E+) in FIG. 1 shows the results of adding T7E to the PCR product of DNA derived from RNP-introduced cells.
  • Lane 2 shows the results of PCR products of DNA derived from RNP-introduced cells without addition of T7E.
  • Lane 3 shows the results of adding T7E to the PCR product of DNA derived from RNP-unintroduced cells.
  • Lane 4 shows the results of adding T7E to the PCR product of DNA derived from RNP-unintroduced cells.
  • Lane 5 shows a DNA size index marker, Gene ladder wide 2 (Nippon Gene). From this, the gRNA-21q-TeloT9 cleavage efficiency was about 12.19% and was chosen for use. On the other hand, gRNA-21q-01 was used without evaluating the cleavage activity efficiency.
  • Example 3 Introduction of gRNA into a human iPS cell line for deletion of the long arm of human chromosome 21 Telomere of the long arm of human chromosome 21 designed and evaluated for cleavage activity in Examples 1 and 2 gRNA-21q-TeloT9, which cleaves near the centromere, and gRNA-21q-01, which cuts near the centromere on the long arm of human chromosome 21, were introduced into human iPS cell line 201B7 by electroporation.
  • gRNA-21q-TeloT9 2.5 ⁇ L of gRNA-21q-TeloT9, 2.5 ⁇ L of 200 ⁇ M gRNA-21q-01 and 5 ⁇ L of 200 ⁇ M tracRNA were mixed in the same microtube and heated at 95° C. for 3 minutes. After heating, the temperature was returned to room temperature. After this, it was performed in the same manner as the CRISPR-Cas9-RNP electroporation procedure described in Example 2. Next, after culturing the RNP-introduced human iPS cells for 2 days (48 hours) and 1 week, genomic DNA was extracted, and this genome was used as a template.
  • 21q-01 F (5'-GTGCAACTGTCAGACCAAAACA-3' (SEQ ID NO: 9)) and human chromosome 21 long arm telomere vicinity-specific reverse primer Re-21q tel R3 (SEQ ID NO: 8) were used for amplification by PCR. gone.
  • the amount of template DNA used for one reaction was 100 ng, 10 ng, and 1 ng.
  • KOD One (registered trademark) PCR Master Mix manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used as the DNA polymerase, and the reaction conditions were 35 cycles of denaturation at 98°C for 10 seconds, annealing at 65°C for 5 seconds, and extension at 68°C for 5 seconds.
  • the amplified product was detected by ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2% agarose gel. Genomic DNA after one week confirmed the expected amplification product (about 245 bp) at 100 ng and 10 ng (Fig. 2). A DNA ladder marker, Gene ladder wide 2, was set in lane 1 (Marker). Lane 2 (201B7 wt) shows PCR results using untreated wild-type 201B7-derived DNA. Lane 3 to Lane 5 (After 48H; 100 ng, 10 ng, 1 ng) show the analysis results using genomic DNA collected 48 hours after introduction of the combination of gRNAs for deleting the long arm of chromosome 21 into 201B7. show.
  • a specific sequence generated when the long arm of chromosome 21 was deleted as intended was obtained as a result of PCR.
  • the deletion efficiency of the long arm of chromosome 21 can be calculated from the amount of template DNA used in which the amplified product was detected.
  • 1 ng of template DNA template DNA for about 150 cells
  • an amplification product specific to deletion of the long arm of chromosome 21 was detected, so deletion of the long arm of chromosome 21 in at least 1 cell out of 150 cells is thought to have occurred.
  • the deletion of the long arm of chromosome 21 occurred at a frequency of 1 cell or more in approximately 150 cells corresponding to 1 ng of DNA for the minimum amount of template DNA used, 1 ng.
  • Lanes 6 to 8 show analysis results using genomic DNA collected 1 week after introduction of the gRNA combination for deletion of the long arm of chromosome 21 into 201B7. indicate. 48 hours after RNP introduction, deletion of the long arm of chromosome 21 occurred in more than 1 cell (0.67%) out of about 150 cells corresponding to 100 ng, 10 ng, and 1 ng of DNA. was done.
  • the culture was continued for a further week, and the DNA after growing the cells was used as a template DNA to perform detection specific to the deletion of the long arm of chromosome 21.
  • the DNA after growing the cells was used as a template DNA to perform detection specific to the deletion of the long arm of chromosome 21.
  • the expected results were obtained.
  • As many specific recombinant bands were detected. This suggested that deletion of the long arm of chromosome 21 occurred in more than 1 cell (0.067%) out of about 1500 cells.
  • Example 4 Acquisition of human chromosome 21 long arm deleted clone and determination of long arm region deletion by PCR method For isolation and establishment, the RNP-introduced 201B7 cell population for deletion of the long arm region was seeded in 96 wells so that 10 cells per well of a 96 well plate, and about 960 cells were selected. After culturing for 7 to 9 days, cells were collected sequentially from wells in which proliferation was observed. The cells were collected by washing with 100 ⁇ L of 1 mM EDTA-added PBS, adding 100 ⁇ L of 1 mM EDTA-added PBS, allowing to stand at 37° C. for 5 minutes, and then removing the supernatant.
  • the cells were suspended in 25 ⁇ L of PBS containing Y-27632. 15 ⁇ L of the cell solution was subcultured in a 96-well plate, 10 ⁇ L was mixed with 10 ⁇ L of proteinase K solution, incubated overnight at 55° C., and then heated at 95° C. for 3 minutes to extract genomic DNA.
  • the Proteinase K solution used was a mixture of 471 ⁇ L of sterilized water, 25 ⁇ L of ExTaq buffer (TAKARA), and 4 ⁇ L of 10 mg/mL Proteinase K (Fujifilm Wako).
  • PCR primers that specifically detect the deletion of the long arm of chromosome 21 using the resulting genomic DNA as a template, Re-21q tel R3 (SEQ ID NO: 8) and 21q-01 F (SEQ ID NO: 9), Amplification was performed by the PCR method. As a result, an expected amplified product (245 bp) was confirmed when the cell-derived DNA of the 96-well plate 6F locus shown in lane 10 was used as a template (Fig. 3). As a positive control (PC), DNA derived from a cell population 48 hours after RNP introduction was used as a template. Lane 1 (Marker) shows a DNA size index marker, Gene ladder wide 2 (Nippon Gene). When DNAs derived from loci other than 6F shown in lanes 2 to 9 and 11 to 13 in order from the right of lane 1 were used, no amplification product specific to deletion of the long arm of the chromosome was obtained.
  • PC positive control
  • 21q-01 R (sequence No. 10), and human chromosome 21 long arm telomere vicinity-specific forward primer, Re-21q tel F3 (SEQ ID NO: 7), amplified by PCR method, and the presence of chromosome 21 long arm inversion was evaluated. .
  • Re-21q tel F3 (SEQ ID NO: 7)
  • the reverse primer specific to the vicinity of the centromere on the long arm of human chromosome 21 is shown below with the name of the primer and the sequence of SEQ ID NO: 10.
  • Example 5 Acquisition of human chromosome 21 long arm deleted clone and determination of long arm region deletion by PCR method From the results of Example 4, the cell population at the 6F locus (cell population 6F) has the full length of the chromosome 21 long arm It was suggested that there is a population in which is deleted. Based on this result, it was decided to clone cells in which the long arm of chromosome 21 was deleted. Since the 6F locus-derived cell population is a population formed from about 10 cells, 150 cells were seeded per plate in a 96-well plate for single cloning. Colonies that arose after 10 days were picked. The pick-up method was the same as the procedure using Proteinase K solution described above.
  • Example 6 Evaluation of improvement in efficiency of human trisomy 21 long arm deletion in human trisomy 21 iPS cell line Human cells are usually disomy with two chromosomes 21, but trisomy syndrome with three chromosomes 21 , human Down's disease patient-derived iPS cell line 2767-4 was used to delete the long arm of chromosome 21.
  • the expected amplification product was not observed when 1 ng of template DNA was used for DNA derived from RNP-introduced cells (Fig. 2). From this result, the appearance frequency of cells with the deletion of the long arm of chromosome 21 when using the trisomy cell line was approximately 1 cell per 150 cells. Furthermore, when the human iPS cell line 201B7 was used, the appearance frequency of cells with the long arm deletion of chromosome 21 was about 1 per 1,500 cells. This suggested that the efficiency of deletion of the long arm of chromosome 21 when using the trisomy cell line was 10 times higher than that of the human iPS cell line 201B7.
  • Example 7 Verification by G-band chromosome analysis for the deletion of the long arm of chromosome 21
  • G-band chromosome analysis by the GTG method was performed.
  • 12 subclones 2 subclones (#10 and #29) were expanded and cultured on a 6 cm dish for 11 to 13 days.
  • Metaphase Arresting Solution (Genial Genetic Solutions)
  • Chromosome Resolution Additive (Genial Genetic Solutions) were added to the cells in logarithmic growth phase to a final concentration of 0.25 ⁇ g/mL and 0.1 ⁇ L/mL, respectively.
  • a motorized upright microscope AxioImager Z2 (CarlZeiss microscopy) equipped with a CoolCube1m CCD camera (MetaSystems) and Metafer Slide Scanning System software (MetaSystems) were used to search for metaphase cells, and randomly selected 20 cells were subjected to Ikaros G-band chromosome analysis was performed with Karyotyping System software (MetaSystems).
  • MethodaSystems Karyotyping System software
  • #10 and #29 have a partial deletion of the long arm, which is thought to be caused by the intended long arm deletion in all 20 cells analyzed. Chromosome 21, ? del(21) (q11.2q22.3) was detected.
  • Example 8 Verification by mBand chromosomal analysis for the deletion of the long arm of chromosome 21 Structural chromosomal abnormalities detected in Example 5, ?
  • mBand chromosomal analysis of two subclones was performed to identify details of structural abnormalities such as breakpoints.
  • the Carnoy-fixed floating specimen prepared in Example 5 was developed on a slide glass and stained using Human mBAND Probes XCyte 21 (MetaSystems) according to the protocol attached to the product.
  • Metaphase cells were searched in the same manner as in Example 5, and three randomly selected cells were subjected to mBand chromosome analysis using Isis FISH Imaging System software (MetaSystems). Were both #10 and #29 detected in Example 5 in all three analyzed cells? Chromosomes with DAPI images similar to del (21) (q11.2q22.3) and der (21) were detected, and by comparison with the mBand signal seen on normal chromosome 21 of wild-type 201B7 that was simultaneously stained ,? del(21) (q11.2q22.3) lacks the chromosomal region 21q11.2-q22.3, and der(21) contains the chromosomal region 21q11.2-q22.3 at the end of the long arm.
  • Figs. 8-1 to 8-3 The chromosomal structural abnormality detected in der(21) is ? Structural abnormality caused by reverse insertion or translocation of the chromosomal region deleted in del (21) (q11.2q22.3), 21q11.2 to q22.3, to the end of the long arm of chromosome 21, ? ins(21;21)(q22.3;q22.3q11.2), assumed to result from a deletion of the long arm of chromosome 21? It was concluded that del(21) (q11.2q22.3) was obtained.
  • Example 9 Acquisition of human chromosome 21 long arm deletion clone by improving human chromosome 21 long arm deletion efficiency in human trisomy 21 iPS cell line (2767-4) and determination of long arm region deletion by PCR Example 3 Similarly, in order to isolate and establish a long arm region deleted cell line from the 2767-4 cell population that has been RNP-introduced for deletion of the long arm region, the RNP-introduced 2767-4 cell population is per well of a 96-well plate. 96 wells were seeded so as to contain 10 cells, and approximately 960 cells were sorted. After culturing for 7 to 9 days, cells were collected sequentially from wells in which proliferation was observed, genomic DNA was extracted, and some of the cells were continuously cultured.
  • PCR primers that specifically detect the deletion of the long arm of chromosome 21 using the resulting genomic DNA as a template, Re-21q tel R3 (SEQ ID NO: 8) and 21q-01 F (SEQ ID NO: 9), Amplification was performed by the PCR method.
  • expected amplification products were obtained in 5 wells out of 96 wells (well numbers 59, 64, 66, 71 and 78) (Fig. 9).
  • lanes 2 to 17 of each gel show the results of clones of loci with different 96-well numbers.
  • no specific amplification product was detected in all 5 wells (well numbers 59, 64, 66, 71 and 78) (Fig.
  • a trisomy cell line was used to confirm that the cell populations of well numbers 59, 64, 66, 71, and 78 contained a population in which the entire length of the long arm of chromosome 21 was deleted. In the case, it was decided to clone the chromosome 21 long arm deletion cell. Since the well number 59-derived cell population (cell population 59) is a population formed from about 10 cells, 150 cells were seeded per plate in a 96-well plate for single cloning. Colonies that arose after 10 days were picked. The pick-up method was the same as the technique using the proteinase K solution described above.
  • Example 10 Verification of Trisomy Chromosome 21 Long Arm Deletion by Chromosome Analysis by DAPI Staining
  • a subclone of cell population 59 obtained in Example 9 is identified by a cytogenetic method with chromosome 21 long arm deletion. Therefore, DAPI chromosome analysis was performed. After each subclone was expanded and cultured on a 6-cm dish, a Carnoy-fixed floating specimen was prepared and spread on a slide glass. The procedure from expansion culture to Carnoy fixation was the same as the procedure performed for the G-band chromosome analysis described above.
  • gRNA-13p-T142 5'- AGAACTGAAGCATCACTCAC-3' (SEQ ID NO: 3) + (TGG)
  • gRNA-13p-TeloT3 5'-AGAAGCGAATCCTGCTTGCA-3' (SEQ ID NO: 4) + (GGG)
  • genomic DNA was extracted, and using this genome as a template, a forward primer specific to the vicinity of the centromere of the short arm of human chromosome 13 13p-T142R (5'-TGACAGGCATCCATGGGAAC-3' (SEQ ID NO: 11)) and human chromosome 13 short arm telomere vicinity-specific reverse primer Re-Chr13p tel F2 (5'-CTCAGACCCGGAGCTTTCTC-3' (SEQ ID NO: 12)) Amplification was performed by the PCR method using. For PCR amplification, the amount of template DNA used for one reaction was 100 ng, 10 ng, and 1 ng.
  • the expected amplification product (approximately 245 bp) was confirmed in 100 ng and 10 ng of genomic DNA after one week (Fig. 13).
  • a DNA ladder marker Gene ladder wide 2
  • Lane 1 shows PCR results using wild-type 201B7-derived DNA.
  • Lane 3 to Lane 5 (After 48H; 100 ng, 10 ng, 1 ng) show the analysis results using genomic DNA collected 48 hours after introduction of the gRNA combination for deletion of the short arm of chromosome 13 into 201B7. show. 48 hours after the introduction of RNP, when template DNAs of 100 ng, 10 ng, and 1 ng of DNA were used, a specific sequence generated when the short arm of chromosome 13 was deleted as intended was observed.
  • a PCR result was obtained indicating that Lanes 3 to 8 show genomic DNA collected 48 hours (After 48H) and 1 week (After 1 week) after introduction of the combination of gRNAs for deleting the short arm of chromosome 13 into 201B7.
  • the analysis results are shown. It was suggested that deletion of the short arm of chromosome 13 occurred in 1 or more cells (0.0067%) out of about 15000 cells (0.0067%) corresponding to 100 ng of DNA 48 hours after RNP introduction.
  • the culture was continued for a further week, and the DNA obtained after growing the cells was used as a template DNA to perform detection specific to deletion of the short arm of chromosome 13.
  • 100 ng and 10 ng of the template DNA were used, the expected results were obtained. As many specific recombinant bands were detected. This suggested that deletion of the short arm of chromosome 13 occurred in more than 1 cell (0.067%) out of about 1500 cells (corresponding to 10 ng of DNA).
  • Example 12 Acquisition of human chromosome 13 short arm deleted clone and determination of short arm region deletion by PCR method For isolation and establishment, the RNP-introduced 201B7 cell population for deletion of the short arm region was seeded in 96 wells so that 10 cells per well of a 96 well plate, and about 960 cells were selected. After culturing for 7 to 9 days, cells were collected sequentially from wells in which proliferation was observed. The cells were collected by washing with 100 ⁇ L of 1 mM EDTA-added PBS, adding 100 ⁇ L of 1 mM EDTA-added PBS, allowing to stand at 37° C. for 5 minutes, and then removing the supernatant.
  • the cells were suspended in 25 ⁇ L of PBS containing Y-27632. 15 ⁇ L of the cell solution was subcultured in a 96-well plate, 10 ⁇ L was mixed with 10 ⁇ L of proteinase K solution, incubated overnight at 55° C., and then heated at 95° C. for 3 minutes to extract genomic DNA.
  • the Proteinase K solution used was a mixture of 471 ⁇ L of sterilized water, 25 ⁇ L of ExTaq buffer (TAKARA), and 4 ⁇ L of 10 mg/mL Proteinase K (Fujifilm Wako).
  • forward primer 13p-T142R (5'-TGACAGGCATCCATGGGAAC-3' (SEQ ID NO: 11)) specific to the vicinity of the human chromosome 13 short arm telomere and specific to the vicinity of the human chromosome 13 short arm telomere Amplification was performed by PCR using a reverse primer Re-Chr13p tel F2 (5'-CTCAGACCCGGAGCTTTCTC-3' (SEQ ID NO: 12)).
  • the expected amplification product (245 bp) was confirmed when cell-derived DNA at loci 4B, 4C, 5C, 6E, 6F, 6H, 7D, 8G, 10A, 10C, and 11D on the 96-well plate was used as a template.
  • Fig. 14 As a positive control (PC), DNA derived from a cell population 48 hours after RNP introduction was used as a template.
  • Lane 1 shows a DNA size index marker, Gene ladder wide 2 (Nippon Gene).
  • 13p-T142F (5′ -GGCTCCATCCCATGTGAGAG-3' (SEQ ID NO: 13)) and a forward primer near the telomere of human chromosome 13 short arm, Chr13p tel F2 (5'-AGAACTGAAGCATCACTCACTGG-3' (SEQ ID NO: 14)) by PCR method. Amplified and assessed for the presence of the chromosome 21 short arm inversion. As a result, when DNA derived from the 4C and 5C loci was used, no amplified product specific to the appearance of the short-arm inversion on chromosome 13 was detected.
  • Example 13 Acquisition of human chromosome 13 short arm deleted clone and determination of short arm region deletion by PCR method From the results of Example 12, the cell population at the 5C locus (cell population 5C) has the full length of the short arm of chromosome 13 It was suggested that there is a population in which is deleted. Based on this result, it was decided to clone cells in which the short arm of chromosome 13 was deleted. Since the 5C locus-derived cell population is a population formed from about 10 cells, 150 cells per plate were seeded in a 96-well plate for single cloning. Colonies that arose after 10 days were picked. The pick-up method was the same as the procedure using Proteinase K solution described above.
  • a forward primer 13p-T142R (5'-TGACAGGCATCCATGGGAAC-3' (SEQ ID NO: 11)) specific to the vicinity of the human chromosome 13 short arm telomere and the vicinity of the human chromosome 13 short arm telomere Amplification was performed by PCR using a specific reverse primer Re-Chr13p tel F2 (5'-CTCAGACCCGGAGCTTTCTC-3' (SEQ ID NO: 12)).
  • Example 14 Verification by G-band chromosomal analysis for deletion of the short arm of chromosome 13 For subclones of the cell population 5C obtained in Example 13, deletion of the short arm of chromosome 13 is identified by a cytogenetic method , G-band chromosome analysis by the GTG method was performed. Of the 12 subclones, 2 subclones (#4-2, #10-8) were expanded and cultured in a 6 cm dish for 11 to 13 days. Metaphase Arresting Solution (Genial Genetic Solutions) and Chromosome Resolution Additive (Genial Genetic Solutions) were added to the cells in logarithmic growth phase to a final concentration of 0.25 ⁇ g/mL and 0.1 ⁇ L/mL, respectively.
  • a motorized upright microscope AxioImager Z2 (CarlZeiss microscopy) equipped with a CoolCube1m CCD camera (MetaSystems) and Metafer Slide Scanning System software (MetaSystems) were used to search for metaphase cells, and randomly selected 20 cells were subjected to Ikaros G-band chromosome analysis was performed with Karyotyping System software (MetaSystems). Compared to wild-type 201B7 cells with a normal karyotype, both #4-2 and #10-8 showed partial deletion of the long arm, which is thought to have occurred due to the intended deletion of the short arm, in all 20 analyzed cells. Associated chromosome 13 del(13)(p11.2) was detected (FIG. 18).
  • Example 15 Introduction of gRNA into a human iPS cell line for deletion of the long arm of human chromosome 13 As in Example 11, for the long arm of human chromosome 13, A gRNA that specifically cleaves can be designed and introduced into a disomy human iPS cell line or a trisomy iPS cell line to delete the entire long arm region.
  • Example 16 Acquisition of human chromosome 13 long arm deletion clone and determination of short arm region deletion by PCR method As in Example 12, in Example 15 of human chromosome 13, toward deletion of human chromosome 13 long arm Human chromosome 13 long arm deletion cell line was detected by PCR method using primers that can specifically detect long arm deletion in cells into which gRNA was introduced into disomy human cell lines and trisomy human cell lines. It is possible to examine to what extent they appear in the cell population.
  • Example 17 Acquisition of human chromosome 13 long arm deleted clone and determination of long arm region deletion by PCR method
  • cells obtained from each well using a specific probe indicating long arm deletion Clones can be selected by the PCR method to obtain a single clone with deletion of the long arm of human chromosome 13.
  • Example 18 Verification by G-band chromosome analysis for deletion of chromosome 13 long arm
  • the deletion of chromosome 13 long arm of the produced subclone is identified by a cytogenetic method. Therefore, the Carnoy-fixed floating specimen prepared in the same manner as in Example 5 was developed on a slide glass, trypsinized with an ice-cold 0.05% trypsin solution for 20 to 50 seconds, and then stained with a 2% Giemsa staining solution. dyed.
  • Metaphase cells were searched using an electric upright microscope AxioImager Z2 (CarlZeiss microscopy) equipped with a CoolCube 1m CCD camera (MetaSystems) and Metafer Slide Scanning System software (MetaSystems). typing G-band chromosomal analysis of subclones can be performed with System software (MetaSystems).
  • Example 19 Verification by m-Band chromosome analysis for deletion of chromosome 13 long arm
  • structural abnormalities such as breakpoints regarding chromosomal structural abnormalities in the deletion of the long arm of chromosome 13 of the produced subclones
  • mBand chromosomal analysis of generated subclones is performed to identify the details of .
  • a Carnoy-fixed floating specimen prepared in the same manner as in Example 5 is developed on a slide glass, and stained using Human mBAND Probes XCyte 21 (MetaSystems) according to the protocol attached to the product. Metaphase cells are searched in the same manner as in Example 5, and mBand chromosome analysis of subclones can be performed on randomly selected cells using Isis FISH Imaging System software (MetaSystems).
  • Example 20 Evaluation of improvement in efficiency of deletion of human chromosome 21 short arm in human trisomy 21 iPS cell line '(SEQ ID NO: 15) + (AGG)) and gRNA-21p-T94 (5'-CTGTGGACGTATTAACTTAC-3' (SEQ ID NO: 16) + (TGG)) that cleaves near the centromere of the short arm of human chromosome 21 into human iPS cells It was introduced into strain 201B7 and human trisomy 21 iPS cell line 2767-4 by electroporation.
  • gRNA-21p-TeloT6 2.5 ⁇ L of 200 ⁇ M gRNA-21p-T94 and 5 ⁇ L of 200 ⁇ M tracRNA were mixed in the same microtube and heated at 95° C. for 3 minutes. After heating, the temperature was returned to room temperature. After this, it was performed in the same manner as the CRISPR-Cas9-RNP electroporation procedure described in Example 2.
  • the target sequences of each gRNA are as follows.
  • gRNA-21p-TeloT6 5'-AGACTGTAGCCTTGACCCAG-3' (SEQ ID NO: 15) + (AGG)
  • gRNA-21p-T94 5'-CTGTGGACGTATTAACTTAC-3' (SEQ ID NO: 16) + (TGG)
  • the amount of template DNA used for one reaction was 100 ng, 10 ng, and 1 ng.
  • KOD One (registered trademark) PCR Master Mix manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used as the DNA polymerase, and the reaction conditions were 35 cycles of denaturation at 98°C for 10 seconds, annealing at 65°C for 5 seconds, and extension at 68°C for 5 seconds. Amplified products were detected by ethidium bromide staining after electrophoresis on a 2% agarose gel. The names and sequences of the primers are shown below.
  • a DNA ladder marker, Gene ladder wide 2 was set in Lane 1 from the left. Lanes 2 to 4 (After 48H; 100 ng, 10 ng, 1 ng) show analysis results using genomic DNA collected 48 hours after the introduction of the combination of gRNAs for deleting the short arm of chromosome 21. 48 hours after RNP introduction, a specific sequence (21 A PCR result was obtained that an amplification product specific to deletion of chromosome No. 3 short arm) appeared.
  • an amplification product specific to deletion of the short arm of chromosome 21 was detected only when the amount of template DNA used was 100 ng (upper). This suggested that deletion of the short arm of chromosome 21 occurred at a frequency of 1 cell or more (0.0067%) in about 15000 cells (corresponding to 100 ng of template DNA). On the other hand, in 2767-4 cells, an amplification product specific to deletion of the short arm of chromosome 21 was detected when the amounts of template DNA used were 100 ng and 10 ng (bottom).
  • the present invention provides a method for producing human cells that retain a human artificial chromosome vector that does not contain non-human cell components, so it will be a useful technology for safe cell pharmaceutical production for regenerative medicine and gene therapy. There is expected.

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Abstract

ヒト細胞を用いて安全性の高いヒト人工染色体ベクターを作製するための方法を提供する。　一対の相同ヒト染色体を含むダイソミーヒト細胞、又は相同ヒト染色体のトリソミーを含むトリソミーヒト細胞において、前記ダイソミーの２つの染色体のうち１つの染色体、又は前記トリソミーの３つの染色体のうち１つ若しくは２つの染色体から長腕及び短腕の内在遺伝子を実質的に削除し、それによって内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、並びにテロメアを有するヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を含有する細胞集団を作製し、さらに、前記細胞集団から前記ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を回収することを含む、ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞の作製方法、並びに、そのヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞。

Description

ヒト細胞内でヒト人工染色体ベクターを作製する方法
　本発明は、正常又は異数性ヒト細胞などのヒト細胞内で、ヒト染色体に由来し、かつ内在遺伝子を実質的に含まないヒト人工染色体ベクターが形成されたヒト細胞を作製する方法に関する。
　本発明はまた、上記ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞に関する。
　従来の人工染色体ベクターである細菌染色体ベクター（ＢＡＣ）や酵母染色体ベクター（ＹＡＣ）は、導入遺伝子（若しくはトランスジーン）のサイズに制限があり、メガベース（Ｍｂ）サイズの染色体又はその断片を導入することが困難であるし、また、宿主ゲノムに組み込まれるため、導入遺伝子の消失がしばしば起こる。これらのベクターの代替として、マウス人工染色体ベクターやヒト人工染色体ベクターが本発明者らによって開発され、例えばヒトタンパク質（例えば、ヒト抗体など）を産生することができるマウスが作出された（特許文献１）。
　ヒト人工染色体ベクターは、ヒト染色体を改変して作製された、ヒトセントロメア、セントロメア近傍の（内在遺伝子の多くが削除された）長腕断片、及びテロメアを含み、さらに外来遺伝子を挿入するための部位特異的組み換え酵素認識部位を含む。このようなベクターの作製は、ヒト線維芽細胞をマウスＡ９細胞と融合し、さらに、ヒト染色体を、相同組み換えにより改変可能なニワトリＤＴ４０細胞に導入し、さらに、該ＤＴ４０細胞内で出来る限り多くの内在遺伝子領域を除去して、ヒト染色体ベクターを作製することを含む（特許文献１、非特許文献１及び２）。
　ヒト細胞内での染色体改変に関して、特許文献２及び３には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集を用いてヒト細胞などの哺乳動物細胞内での部位特異的ＤＮＡ切断と相同組み込みのための方法が記載されている。
　特許文献３にはまた、ヒト細胞由来微小核細胞を用いてヒト人工染色体ベクター保持細胞を作製する方法が記載されている。この方法もまた、特許文献１に記載のようにヒト細胞からマウスＡ９細胞、さらにニワトリＤＴ４０細胞を介してヒト染色体ベクターを作製したのち、該ベクターを、微小核細胞融合法（ＭＭＣＴ（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ））によってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、さらにヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に導入することを含む。
　しかしながら、ヒト人工染色体ベクターを再生医療や遺伝子治療などを含む先進医療に利用することができるようにするための研究開発はこれまで行われていない。
特開２００７－２９５８６０号公報 米国特許第８８９５３０８号 国際公開ＷＯ２０２０／０７５８２３Ａ１
Ｋａｔｏｈ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４；３２１（２）：２８０－２９０ Ｋａｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．２０１１；１８（４）：３８４－３９３ Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１３；３３９（６１２１）：８１９－８２３ Ｋｏｔｉｎｉ，Ａ．Ｇ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０２０；８７：２５－３２
　上記先行技術文献では、ヒト臨床応用が可能なレベルで安全性が確保された手法として、ゼノフリー（すなわち、ヒト以外の動物由来成分不含有）環境でのヒト人工染色体ベクターの作製は不可能であった。また、ヒト染色体における内在遺伝子領域を実質的に除いた、又は好ましくは全て除いたヒト染色体ベクターの作製は示されていない。
　さらにまた、ヒト人工染色体ベクターが再生医療に使用された例はなく、このベクターを使用する場合、安全性の高いゼノフリー環境での医薬品製造が課題となる。従って、従来法でヒト人工染色体を作製しようとする場合には、マウス細胞やニワトリ細胞を使用するため、ベクター構築の際にマウスやニワトリ由来の異物の混入を完全に防ぐことはかなり難しいと考えられる。
　また、これまで、ヒト人工染色体の作製方法において必要とされていたモノソミー化により生ずるヘテロ不全のために二倍体のヒト細胞ではヒト人工染色体を構築することが困難であると考えられてきた。
　本発明者らは、非ヒト動物細胞でなくヒト細胞を用いて安全性の高いヒト人工染色体ベクターを作製するための方法を今回見出した。
　本発明は、以下の特徴を包含する。
[１]　一対の相同ヒト染色体を含むダイソミーヒト細胞、又は相同ヒト染色体のトリソミーを含むトリソミーヒト細胞において、前記ダイソミーの２つの染色体のうち１つの染色体、又は前記トリソミーの３つの染色体のうち１つ若しくは２つの染色体から長腕及び短腕の内在遺伝子を実質的に削除し、それによって内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、並びにテロメアを有するヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を含有する細胞集団を作製し、さらに、前記細胞集団から前記ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を回収することを含む、ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞の作製方法。
[２]　前記ダイソミーヒト細胞又はトリソミーヒト細胞がハプロ不全を有する場合、前記回収されたヒト細胞がハプロ不全遺伝子を２コピー含む、[１]に記載の方法。
[３]　前記ヒト人工染色体ベクターに、部位特異的ＤＮＡ挿入配列を挿入することをさらに含む、[１]又は[２]に記載の方法。
[４]　前記ヒト人工染色体ベクターに、外来遺伝子又はＤＮＡを挿入することをさらに含む、[１]～[３]のいずれかに記載の方法。
[５]　前記トリソミーヒト細胞が、トリソミーヒト患者由来の細胞、又はダイソミー細胞から人工的に作製したトリソミー細胞である、[１]～[４]のいずれかに記載の方法。
[６]　前記ヒト細胞が、体細胞、前駆細胞又は幹細胞である、[１]～[５]のいずれかに記載の方法。
[７]　一対の相同ヒト染色体及び、それと相同な１つのヒト染色体由来ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞であって、前記ヒト人工染色体ベクターが、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、及びテロメアを有する、ヒト細胞。
[８]　一本のヒト染色体及び、それと相同なヒト染色体由来の１つ若しくは２つのヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞であって、前記ヒト人工染色体ベクターが、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、及びテロメアを有する、かつ、前記細胞がハプロ不全遺伝子２コピーを含む、ヒト細胞。
[９]　前記ヒト細胞が、[１]～[６]のいずれかに記載の方法によって作製されるヒト細胞である、[７]又は[８]に記載のヒト細胞。
[１０]　前記ヒト人工染色体ベクターが、部位特異的ＤＮＡ挿入配列を含む、[７]～[９]のいずれかに記載のヒト細胞。
[１１]　前記ヒト人工染色体ベクターが、外来遺伝子若しくはＤＮＡを含む、[７]～[１０]のいずれかに記載のヒト細胞。
[１２]　前記ヒト細胞が、体細胞、前駆細胞若しくは幹細胞である、[７]～[１１]のいずれかに記載のヒト細胞。
[１３]　前記幹細胞が、ｉＰＳ細胞又は間葉系幹細胞である、[１２]に記載のヒト細胞。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-185959号の開示内容を包含する。
　本発明により、非ヒト細胞を使用又は経由することなく、ヒト人工染色体ベクターをヒト細胞（ヒトｉＰＳ細胞を含む）に導入することが可能になったことから、非ヒト動物細胞成分を含まないヒト人工染色体ベクター保有ヒト細胞の作製が可能である。
この図は、ヒト２１番染色体長腕上の全遺伝子領域削除用テロメアガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の切断活性評価の結果を示す。図中、レーン１は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパクからなるリボヌクレオプロテイン複合体（「ＲＮＰ」）導入細胞由来ＤＮＡのＰＣＲ産物に対して、Ｔ７Ｅを加えた結果を示す。レーン２は、ＲＮＰ導入細胞由来ＤＮＡのＰＣＲ産物に対して、Ｔ７Ｅを加えなかった結果を示す。レーン３は、ＲＮＰ非導入細胞由来ＤＮＡのＰＣＲ産物に対してＴ７Ｅを加えた結果を示す。レーン４は、ＲＮＰ非導入細胞由来ＤＮＡのＰＣＲ産物に対してＴ７Ｅを加えなかった結果を示す。並びに、レーン５は、ＤＮＡサイズ指標マーカー（図中「Ｍａｒｋｅｒ」）、Ｇｅｎｅ　ｌａｄｄｅｒ　ｗｉｄｅ　２を示す。実施例２の結果である。 この図は、ヒト２１番染色体長腕削除のためにヒトｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７）にガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を導入して得られたＰＣＲ増幅産物の分析結果を示す。レーン１は、ＤＮＡラダーマーカー、Ｇｅｎｅ　ｌａｄｄｅｒ　ｗｉｄｅ　２である。レーン２は、未処理の野生型２０１Ｂ７細胞由来ＤＮＡ（図中「２０１Ｂ７　ｗｔ」）を用いたＰＣＲ結果を示す。レーン３からレーン８は、２０１Ｂ７に対して、２１番染色体長腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、４８時間後、及び１週間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果である。１週間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた場合においても、ＤＮＡ１０ｎｇ分に相当する細胞数１５００個程度のサンプル量を用いた際に、２１番染色体長腕削除に特異的な増幅産物が検出されたことを示す。図中、「１００ｎｇ」、「１０ｎｇ」、「１ｎｇ」は、それぞれ鋳型ＤＮＡ使用量を示す。実施例３の結果である。 この図は、ヒト２１番染色体長腕削除細胞集団における長腕領域削除判定をＰＣＲ法による増幅産物について行った結果を示す。レーン１は、ＤＮＡサイズ指標マーカーを示す。レーン２～９，１１～１３において示される６Ｆ以外の座位由来のＤＮＡについて染色体長腕削除特異的な増幅産物は得られなかったが、６Ｆ座位由来のＤＮＡについてのレーン１０には目的の増幅産物（２４５ｂｐ）が得られたことを示す。ＰＣは陽性対照である。実施例４の結果である。 この図は、ヒト２１番染色体長腕削除細胞集団における長腕領域削除判定において、６Ｆ座位由来ＤＮＡを用いたときには、２１番染色体長腕逆位の出現に特異的な増幅産物は検出されなかったことを示す。実施例４の結果である。 この図は、２１番染色体長腕全長が削除された６Ｆ座位の細胞集団について、ＰＣＲ法により、４９サブクローン中１２サブクローン（＃３，＃１０，＃１４，＃１８，＃１９，＃２１，＃２２，＃２７，＃２９，＃３２，＃３７，＃３８）において目的の増幅産物（２４５ｂｐ）が確認された結果を示す。図中、「２０１Ｂ７」は未処理の２０１Ｂ７細胞を使用した場合の結果を示し、ＮＣは陰性対照を示し、ＰＣは陽性対照を示す。実施例５の結果である。 この図は、ヒト２１番トリソミーｉＰＳ細胞株（２７６７－４）における２１番染色体長腕削除特異的増幅産物をＰＣＲ法で確認した結果を示す。２１番染色体長腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、４８時間後、及び１週間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果である。１週間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた場合においても、ＤＮＡ１ｎｇ分に相当する細胞数１５０個程度のサンプル量を用いた際に、２１番染色体長腕削除に特異的な増幅産物が検出されたことを示す。図中、「２０１Ｂ７　ｗｔ」は、未処理のダイソミー２０１Ｂ７細胞由来ＤＮＡを用いたことを示す。実施例６の結果である。 この図は、ダイソミー株（２０１Ｂ７）を用いた時に、２１番長腕削除を示さない染色体がヒトｉＰＳ細胞内に存在することをＧ－Ｂａｎｄ法で確認した結果を示す。実施例７の結果である。 この図は、＃１０クローンを用いた時に、２１番染色体長腕削除を示す染色体断片（？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３））がヒトｉＰＳ細胞内に存在することをＧ－Ｂａｎｄ法で確認した結果を示す。＃１０クローンにおいては、野生型２０１Ｂ７細胞と比較し、２１番染色体長腕削除が見られる染色体断片が観察された。実施例７の結果である。 この図は、＃２９クローンを用いた時に、２１番染色体長腕削除を示す染色体断片（？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３）がヒトｉＰＳ細胞内に存在することをＧ－Ｂａｎｄ法で確認した結果を示す。＃２９クローンにおいては、野生型２０１Ｂ７と比較し、２１番染色体長腕削除が見られる染色体断片が観察された。実施例７の結果である。 この図は、ダイソミー株（２０１Ｂ７）を用いた時に、長腕が削除されていない２１番染色体がヒトｉＰＳ細胞内に存在することをｍＢａｎｄ法で確認した結果を示す。図中、白色矢頭（大）が２１番染色体長腕の上半分（ｑ１１．２～ｑ２２．１）の染色（ピンク色）、白色矢頭（小）は、２１番染色体長腕の下半分（ｑ２２．１～ｑ２２．３）の染色（緑色）を示す。図中、黒色矢印は２１番染色体の一方の相同染色体を示し、黒色矢頭は２１番染色体の他方の相同染色体を示す。実施例８の結果である。 この図は、＃１０クローンを用いた時に、２１番染色体長腕削除を示す染色体断片がヒトｉＰＳ細胞内に存在することをｍＢａｎｄ法で確認した結果を示す。図中、白色矢頭（大）及び白色矢頭（小）は、図８－１での説明と同じである。＃１０クローンにおいては、野生型２０１Ｂ７（図８－１）と比較し、２１番染色体長腕削除が見られる染色体断片が観察された。実施例８の結果である。 この図は、＃２９クローンを用いた時に、２１番染色体長腕削除を示す染色体断片がヒトｉＰＳ細胞内に存在することをｍＢａｎｄ法で確認した結果を示す。図中、白色矢頭（大）及び白色矢頭（小）は、図８－１での説明と同じである。＃２９クローンにおいては、野生型２０１Ｂ７（図８－１）と比較し、２１番染色体長腕削除が見られる染色体断片が観察された。実施例８の結果である。 この図は、ヒト２１番トリソミーｉＰＳ細胞株におけるヒト２１番染色体長腕削除細胞集団における長腕領域削除判定をＰＣＲ法による増幅産物について行った結果を示す。９６ウェル番号５９、６４、６６、７１、７８座位由来のＤＮＡについて染色体長腕削除特異的な増幅産物が得られたことを示す。実施例９の結果である。 この図は、ヒト２１番トリソミーｉＰＳ細胞株におけるヒト２１番染色体長腕削除細胞集団における長腕領域削除判定をＰＣＲ法による増幅産物について行った結果を示す。９６ウェル番号５９、６４、６６、７１、７８座位由来のＤＮＡについて染色体長逆位に特異的な増幅産物が得られなかったことを示す。 この図は、ヒト２１番染色体長腕削除細胞集団について、２６サブクローン中４サブクローン（＃８、１７、２４、２６）において目的の増幅産物（２４５ｂｐ）が確認されたことを示す。実施例９の結果である。 この図は、トリソミー株（２７６７－４）を用いた時に、２１番染色体長腕削除を示す染色体断片がヒトｉＰＳ細胞内に存在することをＤＡＰＩ染色法で確認した結果を示す。＃２６のクローンにおいては、正常２１番染色体（図中、左端及び中央）と比較し、２１番染色体長腕削除が見られる染色断片（図中、右端）が観察された。実施例１０の結果である。 この図は、正常核型ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）に対して、１３番染色体短腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、４８時間後、及び１週間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果である。１週間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた場合においても、ＤＮＡ１０ｎｇ分に相当する細胞数１５００個程度のサンプル量を用いた際に、１３番染色体短腕削除に特異的な増幅産物が検出されたことを示す。実施例１１の結果である。 この図は、正常核型ｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７）におけるヒト１３番染色体長腕削除細胞集団における短腕領域削除判定をＰＣＲ法による増幅産物について行った結果を示す。９６ウェル番号４Ｃ、５Ｃ座位を含む、１１の座位由来ＤＮＡ（４Ｂ～８Ｇ、１０Ａ、１０Ｃ、１１Ｄまで）についてヒト１３番染色体短腕削除特異的な増幅産物が得られたことを示す。実施例１２の結果である。 この図は、正常核型ｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７）におけるヒト１３番染色体短腕削除細胞集団における短腕領域削除判定をＰＣＲ法による増幅産物について行った結果を示す。９６ウェル番号４Ｃ、５Ｃ座位由来のＤＮＡについて染色体短腕逆位特異的な増幅産物が得られなかったことを示す。実施例１２の結果である。 この図は、正常核型ｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７）におけるヒト１３番染色体長腕削除サブクローンにおける９６ウェル（ｗｅｌｌ）番号＃４、１０、２２、２３、２５、３１、３９、４７、５２、６２、６３座位由来のＤＮＡについて染色体短腕削除特異的な増幅産物が得られたことを示す。実施例１３の結果である。 この図は、正常核型ｉＰＳ細胞株（２０１Ｂ７）におけるヒト１３番染色体長腕削除サブクローンにおける９６ウェル番号＃４座位由来のサブクローン＃２、４、５由来のＤＮＡについて染色体短腕削除特異的な増幅産物が得られたことを示す。実施例１３の結果である。 この図は、ダイソミー株（２０１Ｂ７）を用いた時に、１３番短腕削除を示す染色体断片及び染色体がヒトｉＰＳ細胞内に存在することをＧ－Ｂａｎｄ法で確認した結果を示す。＃４－２（細胞集団５Ｃのサブクローン＃４のサブクローン＃２）、＃１０－８（細胞集団５Ｃのサブクローン＃１０のサブクローン＃８）のサブクローンにおいては、正常１３番染色体（図中「野生型２０１Ｂ７」）と比較し、１３番染色体短腕削除が見られる染色体断片（ｄｅｌ（１３）（ｐ１１．２）：矢印で示す）が観察されたことを示す。実施例１４の結果である。 この図は、ヒト２１番染色体短腕削除のためにガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が導入されたｉＰＳ細胞株における２１番染色体短腕削除特異的な増幅産物の存在をＰＣＲ法で確認した結果を示す。レーン２からレーン７は、２１番染色体短腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、４８時間後、及び１週間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果である。レーン１は、ＤＮＡラダーマーカー（図中「Ｍａｒｋｅｒ」）である。図中、「１００ｎｇ」、「１０ｎｇ」、「１ｎｇ」は、それぞれ鋳型ＤＮＡ使用量を示す。上段は、ダイソミーヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞（図中「２０１Ｂ７」）を使用した場合の結果を示し、下段は、トリソミーヒトｉＰＳ細胞株である２７６７－４細胞（図中「２７６７－４」）を使用した場合の結果を示す。トリソミー細胞株を使用することにより２１番染色体短腕削除効率が上がることがわかった。
　本発明をさらに詳細に説明する。
１．ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞の作製方法
　本発明は、第１の態様において、一対の相同ヒト染色体を含むダイソミーヒト細胞、又は相同ヒト染色体のトリソミーを含むトリソミーヒト細胞において、前記ダイソミーの２つの染色体のうち１つの染色体、又は前記トリソミーの３つの染色体のうち１つ若しくは２つの染色体から長腕及び短腕の内在遺伝子を実質的に削除し、それによって内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、並びにテロメアを有するヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を含有する細胞集団を作製し、さらに、前記細胞集団から前記ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を回収することを含む、ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞の作製方法を提供する。
　上記方法において使用可能なヒト染色体は、ヒト１番～２２番染色体及び性染色体（Ｘ及びＹ）のいずれであってもよく、また、上記トリソミーは、ヒト１番～２２番染色体及び性染色体のいずれかのトリソミーである。
　本明細書中の「ダイソミー」は、一対の相同なヒト染色体であり、正常な染色体の対であってもよいし、或いは、対立遺伝子の一方の遺伝子に突然変異を有するため、該遺伝子から作られるタンパク質の量が不足して機能が不全となる現象、いわゆるハプロ不全、に関与する遺伝子（「ハプロ不全遺伝子」と称する。）を含むヒト染色体の対であってもよい。
　本明細書中の「トリソミー」は、一対の相同染色体の他に相同な染色体をさらに１本余分に含む異数性染色体異常を示すヒト細胞をいう。このような染色体異常は、ヒトでは、例えば２１番トリソミー、１９番トリソミー、１８番トリソミー、１６番トリソミー、１３番トリソミー、７番トリソミーなどが知られており、例えば２１番トリソミーでは、ヒト細胞内に相同な２１番染色体が３本含まれている。
　本発明の方法は、ヒト細胞において、対象（若しくは、目的）の一対の相同ヒト染色体を含むダイソミーの２つの染色体のうちの１本の染色体から、或いは、対象（若しくは、目的）のトリソミーの３つの染色体のうち１つ若しくは２つの染色体から、ヒト人工染色体ベクターを作製することを含むことを特徴とする。このベクターは、ヒトセントロメア及びテロメアを有するが、長腕及び短腕は実質的に内在遺伝子を含まない。ここで「実質的に」とは、本発明のヒト細胞を治療などに使用した場合に染色体異常を引き起こすような原因遺伝子を除く１若しくは複数の遺伝子、例えば３０以下、２０以下、１０以下、５以下又は２以下の遺伝子を含み得ることを意味している。しかしながら、本発明では、治療上の安全性を考慮すると、上記ベクターは、長腕及び短腕の全ての内在遺伝子を含まないことが好ましい。
[ヒト細胞からのヒト人工染色体ベクターの作製]
＜ダイソミー若しくはトリソミーヒト細胞＞
　ダイソミーヒト細胞は、上記のとおり、対象（若しくは、目的）の一対の相同染色体を含む細胞であってもよいし、或いは、ハプロ不全遺伝子を含むヒト細胞であってもよい。
　トリソミーヒト細胞は、例えば、上記のようなトリソミーヒト患者由来の細胞株、トリソミーヒト患者由来細胞から作製された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、或いは、ヒト正常細胞にヒト染色体の１つを導入して人工的に作製された人工トリソミーヒト細胞などを含む。ヒト細胞は、場合により、ハプロ不全遺伝子を含んでもよい。
　上記トリソミーヒト患者由来の細胞は、非限定的に、例えばダウン症患者線維芽細胞株、例えばＪＣＲＢ９０４４　Ｄｅｔｒｏｉｔ　５３２（皮膚由来）、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－５４ＴＭ　Ｄｅｔｒｏｉｔ　５３２（皮膚由来）、ＣＯＲＩＥＬＬ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ＧＭ０２７６７（線維芽細胞由来）などを含む。
　上記トリソミーヒト患者由来細胞から作製されたｉＰＳ細胞は、非限定的に、例えばダウン症患者線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、例えばＡＴＣＣ－ＤＹＰ０７３０　ＩＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（ＡＣＳ－１００３ＴＭ）（この細胞は、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－５４ＴＭ　Ｄｅｔｒｏｉｔ　５３２（ヒトダウン症細胞株）をＯｃｔ４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４及びＭｙｃ遺伝子の発現下でリプログラミング（初期化）することによって作製された。）、ＳＫＩＰ００１６４４：ＮＤ５００２６（ＳＫｉＰ　Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｓｅａｒｃｈ）などである
　本明細書において、ｉＰＳ細胞は、以下の公知の手法によって作製することができる。具体的には、上記のｉＰＳ細胞は、体細胞（これには体性幹細胞を含む。）に、ある特定のリプログラミング因子（ＤＮＡ又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養し、さらに継代培養することによって約３～５週間でコロニーを生成する。リプログラミング因子は、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせ；或いは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ；１２６：６６３－６７６（２００６）；ＷＯ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１－１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ；１３１：８６１－８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３１８：１９１７－１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ；Ｒｅｓ．１８，６００－６０３（２００８））。
　上記培養は、例えば、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、リプログラミング因子発現ベクター導入体細胞（約１０４～１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養することを含む。この場合、フィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ；１３１：８６１－８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ハムＦ－１２培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、それらの混合培地などであり、ヒトｉＰＳ細胞用培地は、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社、日本）などを使用することができる。フィーダー細胞は必ずしも必要ではない。
　上記人工トリソミーヒト細胞の作製には、例えばＨ．Ｎａｗａｔａら（ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　２０１１；６（９）：ｅ２５３１９；Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｒｉｓｏｍｙ　Ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　８　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）、Ｋ．Ｈｉｒａｍａｔｓｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９　Ｊａｎ　８；５０８（２）：６０３－６０７．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｉｓｏｇｅｎｉｃ　ｔｒｉｓｏｍｙ　ｐａｎｅｌ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｖｉａ　ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）などに記載される方法を使用することができる。Ｎａｗａｔａらの方法は、個別のヒト染色体を含むマウスＡ９細胞からをコルセミド処理して誘導し、その後遠心分離などの方法で精製されたヒト染色体含有微小核細胞を、微小核細胞融合法（ＭＭＣＴ；Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を用いてヒト細胞と融合し、当該ヒト染色体をヒト細胞内に導入することを含む。本発明の方法では、非ヒト動物由来の細胞成分のコンタミネーションを回避することが重要であるため、Ｎａｗａｔａらの方法での微小核細胞の作製法に代えて、本発明者らが開発した方法、すなわちヒト細胞を、微小核形成誘導剤（例えば微小管重合阻害剤）を含有する培地中で培養してヒト細胞由来微小核細胞を作製する方法（ＷＯ２０２０／０７５８２３）を使用することが好ましく、この方法によってヒト染色体のいずれかを含む微小核細胞を作製し、Ｎａｗａｔａらの方法と同様にＭＭＣＴ法を用いてヒト細胞と融合してトリソミーヒト細胞を作製することができる。トリソミーヒト細胞は、例えば核型（Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）解析によって同定することができる。
＜ヒト人工染色体ベクターの作製＞
　上記ダイソミー若しくはトリソミーヒト細胞からヒト人工染色体ベクターを作製する方法について説明する。
　本発明の方法では、例えば、ダイソミーヒト細胞内の染色体のうち１つの染色体、又はトリソミーヒト細胞内のトリソミーを構成する３つの相同染色体のうち１つ若しくは２つの染色体を、例えばゲノム編集（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）、テロメア切断法、部位特異的組み換え酵素／該酵素認識部位系による組み換え法などの手法を用いて、長腕及び短腕の内在遺伝子の実質的な削除を行い、場合により外来遺伝子搭載用の部位特異的ＤＮＡ挿入配列（例えば、部位特異的組み換え酵素認識配列）、またさらに場合により外来遺伝子若しくはＤＮＡを挿入することができる。
　上記部位特異的組み換え酵素が認識する部位に関して、ある種の酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でＤＮＡの組み換えを起こす現象が知られており、本発明におけるヒト人工染色体ベクターでは、このような酵素とその酵素の認識部位からなる系を利用して、目的とする外来遺伝子若しくはＤＮＡを挿入することができる。このような系として、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ酵素と、その認識部位であるｌｏｘＰ配列の系（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系；Ｂ．Ｓａｕｅｒ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；１９９３，２２５：８９０－９００）、出芽酵母由来のＦｌｐ酵素と、その認識部位であるＦＲＴ（Ｆｌｐ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔａｒｇｅｔ）配列の系（Ｆｌｐ／ＦＲＴ系）、ストレプトミセスファージ由来のφＣ３１インテグレースと、その認識部位であるφＣ３１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、Ｒ４インテグレースと、その認識部位であるＲ４ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、ＴＰ９０１－１インテグレースと、その認識部位であるＴＰ９０１－１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、Ｂｘｂ１インテグレースと、その認識部位であるＢｘｂ１ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列の系、などを挙げることができるが、ＤＮＡ配列挿入部位として機能しうるのであれば、上記の系に限定されないものとする。このような部位特異的組み換え酵素の認識部位の挿入のためには、公知の方法、例えば、ジーンターゲティング若しくは相同組み換え法、ゲノム編集などが利用できる。ゲノム編集では、下記に示すような例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、外来遺伝子若しくはＤＮＡの配列を含むドナーベクターと一緒に用いることによって該外来遺伝子若しくはＤＮＡの配列を標的部位にノックインすることができる。
　上記外来遺伝子若しくはＤＮＡは、例えばヒトの病気や障害などの治療に有用なヒト遺伝子若しくはＤＮＡ、場合により、レポーター遺伝子（例えばＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰなどの蛍光タンパク質をコードする遺伝子）、選択マーカー遺伝子（例えばＮｅｏＲ、ＡｍｐＲ、ＢＳＲなどの薬剤耐性遺伝子）などを含んでよい。例えば、染色体異常や遺伝性疾患の治療に有望な再生医療や遺伝子治療で使用し得るような任意のヒト外来遺伝子若しくはＤＮＡである。
　本明細書で使用される「ヒト細胞」は、例えば体細胞、前駆細胞、幹細胞、及びそれらの細胞に由来する細胞を含み、当該細胞類には、培養細胞、株化細胞、継代細胞、人工的に誘導された細胞（例えばｉＰＳ細胞）などが含まれる。細胞の種類は限定されないものとし、例えば皮膚細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、腸細胞、腎細胞、筋細胞、神経細胞、骨髄細胞などが挙げられる。ヒト幹細胞の例は、組織幹細胞（自己複製能を有し組織内の細胞に分化できる。）、体性幹細胞（生体内の複数の細胞に分化できる。例えば間葉系幹細胞）などである。好ましい細胞の例は、ヒト由来の体細胞、前駆細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞などの幹細胞などである。間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、脂肪組織などから得ることができる。
　ダイソミー若しくはトリソミーヒト細胞において、ゲノム編集によって染色体の１つ若しくは２つをヒト人工染色体ベクターに変換する方法について以下に説明する。
　ゲノム編集は、例えばＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒヌクレアーゼ）、ＺＦＮ（Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼ）などの人工切断酵素、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなどを使用してゲノムＤＮＡの編集や遺伝子改変を行う技術である。本発明の方法では、ゲノム編集の任意の技術を使用することができるが、好ましくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの使用がよい。
　上記システムのうち特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、細菌や古細菌のウイルスやプラスミドに対する適応免疫機構から発見されたが、ベクターの構築が比較的簡便であり、複数の遺伝子を同時に改変することが可能である（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７，３３７（６０９６）：８１６－８２１，２０１２；Ｓａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４）：３４７－３５５，２０１４）。このシステムは、ゲノム上の二本鎖ＤＮＡを切断するＣａｓ９ヌクレアーゼと、ゲノム上の標的配列を認識する約２０塩基対の配列をもつガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ又は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ）＋ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ））とを含む。細胞内でこれらを共発現させることにより、ｇＲＮＡが標的配列近傍のＰＡＭ配列を認識して標的ゲノムＤＮＡと特異的に結合し、Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列（ＮＧＧ（Ｎ＝Ｃ，Ｇ，Ａ若しくはＴ））の５’側上流で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。現在最も使用されているＣａｓ９タンパク質はＳｐＣａｓ９型であり、ＰＡＭ配列がＮＧＧであることから変異導入位置の制約が少ない。本発明では、ガイドＲＮＡが標的とするヒト染色体の長腕及び短腕上の部位は、内在遺伝子領域を削除することを可能にする部位である。
　そのような部位は、例えばヒト２１番染色体の長腕の場合、例えばＮＣ＿００００２１．９，　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　２１，ＧＲＣｈ３８．ｐ１３　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ：ヌクレオチド番号１３，０８４，３１５～４６，６７０，３０６の領域が削除されるような部位、及び、短腕の場合、ＮＣ＿００００２１．９，Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　２１，ＧＲＣｈ３８．ｐ１３　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ：ヌクレオチド番号５，０１１，８９４～１０，５４０，５０１の領域が削除されるような部位、すなわち、長腕では１３，０８４，３１５及び４６，６７０，３０６の各部位、並びに、短腕では５，０１１，８９４及び１０，５４０，５０１の各部位である。
　ヒト２１番染色体長腕及びヒト１３番染色体短腕の切断用ガイドＲＮＡ配列及びその標的配列は、非限定的に、例えば以下の配列である。なお、配列に関し、ＲＮＡの場合、チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）である。また、標的配列は、配列番号１～４の各配列の３’末端に表示のＰＡＭ配列が結合されたヌクレオチド配列である。なお、ＰＡＭ配列は細胞内で付加される。
　ヒト２１番染色体長腕の場合：
　　gRNA(Cen近傍): 5’-GACAGGTAAGGATTACTAGG-3’（配列番号１）+(AGG)-PAM
　　gRNA(Tel近傍): 5’-TAAAGATGTGCTCCTTCCCG-3’（配列番号２）+(AGG)-PAM
　ヒト１３番染色体短腕の場合：
　　gRNA(Cen近傍): 5’-AGAACTGAAGCATCACTCAC-3’（配列番号３）+(TGG)-PAM
　　gRNA(Tel近傍): 5’-AGAAGCGAATCCTGCTTGCA-3’（配列番号４）+(GGG)-PAM
　ヒト２１番染色体短腕の切断用ガイドＲＮＡ配列及びその標的配列は、非限定的に、例えば以下の配列である。なお、配列に関し、ＲＮＡの場合、チミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）である。また、標的配列は、配列番号１５及び１６の各配列の３’末端に表示のＰＡＭ配列が結合されたヌクレオチド配列である。
　ヒト２１番染色体長腕の場合：
　　gRNA(Tel近傍): 5’-AGACTGTAGCCTTGACCCAG-3’（配列番号１５）+(AGG)-PAM
　　gRNA(Cen近傍): 5’-CTGTGGACGTATTAACTTAC-3’（配列番号１６）+(TGG)-PAM
　上記配列の「Cen」及び[Tel]はそれぞれ「セントロメア」、「テロメア」を表す。
　上記のゲノム編集によって、ヒト細胞内で、ヒトセントロメア及びテロメアを保持し、並びに内在遺伝子が実質的に削除された長腕部分及び短腕部分を含むヒト人工染色体ベクターを形成することができる。具体的な方法及び手順は、後述の実施例に記載されている。
　さらにまた、ヒト２１番染色体及び１３番染色体以外のヒト染色体の場合にも、後述の実施例に記載されるようにヒト２１番染色体及び１３番染色体の場合と同様に例えばゲノム編集などの方法によって長腕及び短腕から内在遺伝子を削除し、それによってヒト人工染色体ベクターを形成することができる。ヒト染色体のゲノム配列情報は、米国ＮＣＢＩなどのデータベースから入手可能である。
　目的のヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞は、例えば、一対の相同ヒト染色体及びそれと相同な１つのヒト染色体由来ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞であって、前記ヒト人工染色体ベクターが、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、及びテロメアを有する、ヒト細胞である。
　或いは、目的のヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞は、例えば、一本のヒト染色体及び、それと相同なヒト染色体由来の１つ若しくは２つのヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞であって、前記ヒト人工染色体ベクターが、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、及びテロメアを有する、かつ、前記細胞がハプロ不全遺伝子２コピーを含む、ヒト細胞である。
　上記人工染色体ベクターの長腕及び短腕部分にはさらに、例えばゲノム編集や部位特異的組み換え技術を用いて、部位特異的ＤＮＡ挿入配列及び／又は外来遺伝子若しくはＤＮＡを挿入することができる。
　上記の方法で作製された、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、並びにテロメアを有するヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を含有する細胞集団から目的のヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を回収する。
　目的の人工染色体ベクターを含むヒト細胞クローンを単離するために、上記細胞集団を培養しコロニーを分離する。ヒト細胞の培養条件として、培地は動物細胞、例えばＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地などを使用できる。ｉＰＳ細胞などの分化多能性幹細胞の培養では霊長類ＥＳ細胞用培地の使用が好ましい。培地には、アミノ酸類、ビタミン類、無機塩類、微量元素（Ｃｕ，Ｆｅ，Ｚｎなど）、ヌクレオシドや塩基類、エネルギー代謝用物質（グルコース、ガラクトース、Ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａなど）、抗生物質、サイトカイン（成長因子、ホルモンなど）、サプリメント、脂質、必要により血清（牛胎児血清など）などを適宜選択して含むことができる。無血清培地の場合、血清を代替血清（ヒト血清アルブミンなど）に替える以外、上記の培地成分を含む培地を使用することができる。培地のｐＨは、ヒト細胞の培養では通常ｐＨ７．４が使用できる。また、培養温度は、通常、３７℃である。培養日数については、例えば５日以上であり適切な日数を選択する。クローニングのための培養には、通常、固体培養、例えばアガー又はアガロース培地が使用される。培養は、ペトリ皿、マルティウエルプレート、フラスコなどの容器を用いて、大気中５～７％ＣＯ２の存在下で行うことができる。培養に関しては、例えばＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ，Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ　、ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｉｘ　Ｅｄ．，２０１０，Ａ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に詳細に記載されている。
　培地上に出現したコロニーのそれぞれについて、核酸（ＤＮＡ）を分離し、後述の実施例に記載するように、ＰＣＲにより遺伝子増幅して長腕及び短腕の内在遺伝子の削除を同定する、核型解析を行って染色体の破壊を確認するなどの分析を行い、目的の上記ヒト人工染色体ベクターを含むコロニーを分離することができる。さらに、該コロニーをさらに固体培養して純粋化したのち、例えば上記の培養成分を含む液体培地中で培養することによって目的の細胞クローンを増殖し単離することができる。
　核型解析は、細胞の分裂周期Ｇ期の染色体標本（Ｇ－ｂａｎｄ染色体解析）及び／又は分裂周期Ｍ期の染色体標本（ｍ－ｂａｎｄ染色体解析；例えばコルヒチン、コルセミドなどの有糸分裂阻害剤を使用する）について、例えばギムザ染色法、ＦＩＳＨ法を用いて、染色体に特徴的なバンドパターンや形状などをもとに各染色体を同定し、倍数性、異数性及び転座の有無など染色体の構造、形状などの異常などの解析を行うことができる。
２．ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞
　本発明はまた、第２の態様において、下記のヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を提供する。
（１）一対の相同ヒト染色体及びそれと相同な１つのヒト染色体由来ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞であって、前記ヒト人工染色体ベクターが、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、及びテロメアを有する、ヒト細胞。
（２）一本のヒト染色体及び、それと相同なヒト染色体由来の１つ若しくは２つのヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞であって、前記ヒト人工染色体ベクターが、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、及びテロメアを有する、かつ、前記細胞がハプロ不全遺伝子２コピーを含む、ヒト細胞。
　ハプロ不全については、上記セクション１で説明したとおりであり、ヒト染色体がハプロ不全遺伝子を含む場合、該染色体を含む細胞が生存維持するためにハプロ不全遺伝子を２コピー含むことが必要である。このため、上記（２）のヒト細胞は、ハプロ不全遺伝子２コピーを含む。このような場合、ハプロ不全遺伝子が１つのヒト染色体に例えば転座により２コピー含むヒト細胞であってもよいし、或いは、ハプロ不全の責任遺伝子を明らかにし、責任遺伝子を補正するための遺伝子若しくはＤＮＡを搭載した外来遺伝子ベクターを作製し、このベクターを、上記の目的のヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞内に導入して、細胞内にハプロ不全遺伝子２コピーを含むようにしてもよい。このようなベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスなど）、プラスミドベクターなどヒトにおいて使用可能なベクターであることがよい。
　上記ヒト細胞は、例えば、上記セクション１及び後述の実施例に記載の方法によって作製することができる。
　上記ヒト人工染色体ベクターは、部位特異的ＤＮＡ挿入配列を含むことができるし、或いは、該ベクターは、任意の外来遺伝子若しくはＤＮＡを含んでもよい。場合によりさらにレポーター遺伝子及び選択マーカー遺伝子の少なくとも１つを含むことができる。これらの遺伝子の例は、上記セクション１に記載されている。ヒト細胞は、例えば遺伝子治療などに有用なヒト由来の外来遺伝子若しくはＤＮＡを含むヒト人工染色体ベクターを含むことができる。
　遺伝子治療には、非限定的に、ゲノム遺伝子の突然変異によりタンパク質機能の低下や不全を解決する治療法、がんや神経変性疾患などの後天性疾患に対する治療法などが含まれる。
　本発明のヒト細胞は、例えば上記セクション１に記載されるような細胞であり、体細胞又は幹細胞である。好ましいヒト由来の幹細胞は、ｉＰＳ細胞又は間葉系幹細胞である。
　上記ヒト人工染色体ベクターを含むｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞などのヒト由来幹細胞は、それらの細胞からの分化誘導によって各種の前駆細胞や分化細胞を作製することができるため、遺伝子治療／再生医療に有用である。このような前駆細胞や分化細胞、或いは、その他の細胞もまた、本発明のヒト細胞に含まれる。
　下記の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが本発明の技術的範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］ヒト２１番染色体長腕上の全遺伝子領域削除用ガイドＲＮＡの設計
　本実施例では、ヒト２１番染色体における長腕（ｃｈｒ２１：１２，９１５，８０８－４６，６９９，９８３位）において、セントロメアと最も近接する、被翻訳遺伝子であるＰＯＴＥＤ（ｃｈｒ２１：１３，６０９，７７７－１３，６４５，８２３位）、及び、テロメアと最も近接する、被翻訳遺伝子であるＰＲＭＴ２（ｃｈｒ２１：４６，６３５，１５６－４６，６６５，６８５位）間の全遺伝子領域を削除することを目的として、ＰＯＴＥＤ遺伝子開始点（ｃｈｒ２１：１３，６０９，７７７位）と、セントロメア下流、長腕開始点（ｃｈｒ２１：１２，９１５，８０８位）の間、及び、ＰＲＭＴ２遺伝子終了点（ｃｈｒ２１：４６，６６５，６８５位）とテロメア配列開始点（ｃｈｒ２１：４６，６９９，９８３位）の間に、配列特異的にＤＮＡ二重鎖切断可能なＣｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９を形成しうる、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を設計した。ゲノムデータベースの版は現在利用可能な最新版である、ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８に準ずる。セントロメア近傍を切断するｇＲＮＡとしてｇＲＮＡ－２１ｑ－０１を設計した。また、テロメア近傍を切断するｇＲＮＡとしてｇＲＮＡ－２１ｑ－ＴｅｌｏＴ９を設計した。各ｇＲＮＡの標的配列は以下のとおりである。
　　gRNA-21q-01：5’- GACAGGTAAGGATTACTAGGAGG -3’（配列番号5）
　　gRNA-21q-TeloT9：5’- TAAAGATGTGCTCCTTCCCGAGG -3’（配列番号6）
　これらの配列を標的としうるｇＲＮＡについて、米国Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．にて提供される、Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９　ｃｒＲＮＡにおけるｃｒＲＮＡＸＴ人工合成サービスにて作製した。
［実施例２］ヒト２１番染色体長腕上の全遺伝子領域削除用テロメアガイドＲＮＡの切断活性評価
　ｇＲＮＡ－２１ｑ－ＴｅｌｏＴ９にて指定する標的配列を含むｃｒＲＮＡが標的配列特異的に切断活性を有することを検証するために、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７（理化学研究所バイオリソース研究センター細胞材料開発室、ＨＰＳ００６３株）に対して、下記の手法にてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパクからなるリボヌクレオプロテイン複合体（「ＲＮＰ」）の導入を実施し、Ｔ７エンドヌクレアーゼ解析を行った。まず、ｇＲＮＡ－２１ｑ－ＴｅｌｏＴ９にてｃｒＲＮＡＸＴ製品について、２００μＭ（終濃度）とするように超純水にて溶解した。次にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパク複合体（「ＲＮＰ」）を形成させるために、５μＬの２００μＭ　ｇＲＮＡ－２１ｑ－ＴｅｌｏＴ９と５μＬの２００μＭ　ｔｒａｃＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を混合し、９５℃にて３分間、加熱した。加熱後、室温に戻した。また、ＰＢＳ１０．５μＬとガイドＲＮＡ６μＬ、Ｃａｓ９酵素８．５μＬを添加し、緩やかにピペッティングを行い、混合した。これを室温で１５分間、静置し、ＲＮＰを形成させた。細胞については、２０１Ｂ７を６－Ｗｅｌｌプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）にＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（リプロセル社）とｉＭａｔｒｉｘ－５１１　Ｓｉｌｋ（マトリクソーム社製）を用いて培養した。事前に、１０μＭ　Ｙ－２７６３２（ＦｕｊｉｆｉｌｍＷａｋｏ社）を培養液中に添加した。細胞は、１時間、３７℃にて培養した。その後、導入細胞として、２０１Ｂ７細胞を２×１０６個の細胞を回収し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、１０ｍＬで懸濁後、７００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ間遠心し、細胞を洗浄した。２０１Ｂ７へのＲＮＰ導入には、エレクトロポーレーションを用い、機器としてネッパジーン株式会社製品、スーパーエレクトロポレーターＮＥＰＡ２１を用いて行った。エレクトロポーレーション条件は、Ｐｏｒｉｎｇ　Ｐｕｌｓｅとして、Ｖｏｌｔａｇｅ　１５０Ｖ、Ｐｕｌｓｅ　Ｌｅｎｇｔｈ　５．０ｍｓｅｃ、Ｐｕｌｓｅ　Ｉｎｔｅｒｖａｌ　５０．０ｍｓｅｃ、Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　Ｐｕｌｓｅｓ　２、Ｄｅｃａｙ　Ｒａｔｅ　１０％、Ｐｏｌａｒｉｔｙ　＋／－、また、Ｓｅｔ　Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして、Ｖｏｌｔａｇｅ　２０．０Ｖ、Ｐｕｌｓｅ　Ｌｅｎｇｔｈ　５０．０ｍｓｅｃ、Ｐｕｌｓｅ　Ｉｎｔｅｒｖａｌ　５０．０ｍｓｅｃ、Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　Ｐｕｌｓｅｓ　５、Ｄｅｃａｙ　Ｒａｔｅ　４０％、Ｐｏｌａｒｉｔｙ　＋／－に設定した。上述の細胞について、細胞沈殿を残し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭの上清を除去し、ＲＮＰ溶液を加え、混合し、ＮＥＰＡキュベット電極セットへ移した。エレクトロポーレーション後、２０１Ｂ７を、１０μＭ　Ｙ－２７６３２及びｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ　４．８μＬを添加した２ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地にて６ｗｅｌｌプレート１ｗｅｌｌに播種した。エレクトロポーレーションから１日後に、通常のＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地に交換した。エレクトロポーレーションから２日後に、エレクトロポーレーションされた２０１Ｂ７細胞由来ゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムを鋳型とし、Ｒｅ－２１ｑ　ｔｅｌ　Ｆ３及びＲｅ－２１ｑ　ｔｅｌ　Ｒ３を用いてＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲ増幅は約１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用し、行った。ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは東洋紡社製ＫＯＤ　Ｏｎｅ（登録商標）ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用い、反応条件は、変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃５秒、伸長６８℃５秒を３５サイクル行った。増幅産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色して検出した。その結果、期待される長さ（５０７ｂｐ）付近の増幅産物が検出された。増幅産物をＴ７　Ｅｎｄｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（ニッポンジーン社）を使用してＴ７エンドヌクレアーゼ解析を行った。プライマーはＮＣＢＩのデータベースより入手した塩基配列をもとにＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓを用い作製した。プライマーの名称及び、配列は以下で示した。
　　Re-21q tel F3 : 5’- AACTGAGCCCCTTTCTTCGG -3’（配列番号7）
　　Re-21q tel R3 : 5’- AGGATTCTCTGCTCCCCCAT -3’（配列番号8）
　Ｔ７エンドヌクレアーゼ解析については下記の手法にて行った。
　増幅産物を含むＰＣＲ溶液をサーマルサイクラーにて、増幅産物の変性、アニーリング操作を行った。増幅産物８μＬにて１Ｍ　ＮａＣｌ１μＬを添加し、反応条件は、変性９５℃５分、アニーリング９５℃→８５℃　２℃／秒、８５℃→２５℃　０．１℃／秒で行った。ここに、基質ＤＮＡ断片９μＬ、Ｔ７　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ　１μＬ（Ｔ７Ｅ）で混和し、３７℃で１時間反応させた。反応産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色し検出した。その結果、期待される長さ（切断前：５０７ｂｐ付近、切断後：３６４ｂｐ付近、１４３ｂｐ付近）の反応産物が検出された（図１）。図１のレーン１（ＲＮＰ＋，Ｔ７Ｅ＋）には、ＲＮＰ導入細胞由来ＤＮＡのＰＣＲ産物に対して、Ｔ７Ｅを加えた結果を示す。レーン２（ＲＮＰ＋，Ｔ７Ｅ－）には、ＲＮＰ導入細胞由来ＤＮＡのＰＣＲ産物に対して、Ｔ７Ｅを加えなかった結果を示す。レーン３（ＲＮＰ－，Ｔ７Ｅ＋）には、ＲＮＰ非導入細胞由来ＤＮＡのＰＣＲ産物に対してＴ７Ｅを加えた結果を示す。レーン４（ＲＮＰ－，Ｔ７Ｅ－）には、ＲＮＰ非導入細胞由来ＤＮＡのＰＣＲ産物に対してＴ７Ｅを加えた結果を示す。レーン５（Ｍａｒｋｅｒ）には、ＤＮＡサイズ指標マーカー、Ｇｅｎｅ　ｌａｄｄｅｒ　ｗｉｄｅ　２（ニッポンジーン社）を示す。ここから、ｇＲＮＡ－２１ｑ－ＴｅｌｏＴ９切断効率は約１２．１９％であったため、これを使用することとした。一方で、ｇＲＮＡ－２１ｑ－０１については、切断活性効率を評価せずに用いた。
［実施例３］ヒト２１番染色体長腕削除のための、ヒトｉＰＳ細胞株へのｇＲＮＡ導入
　実施例１及び実施例２にて、設計、切断活性評価を実施したヒト２１番染色体長腕のテロメア近傍を切断するｃｒＲＮＡＸＴ、ｇＲＮＡ－２１ｑ－ＴｅｌｏＴ９とヒト２１番染色体長腕セントロメア近傍を切断するｇＲＮＡ－２１ｑ－０１をヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７に、エレクトロポーレーションにより導入した。方法として、まずは、２．５μＬのｇＲＮＡ－２１ｑ－ＴｅｌｏＴ９と２．５μＬの２００μＭ　ｇＲＮＡ－２１ｑ－０１と５μＬの２００μＭ　ｔｒａｃＲＮＡを同一マイクロチューブ内にて混合し、９５℃にて３分間、加熱した。加熱後、室温に戻した。この後は実施例２にて記載したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ＲＮＰエレクトロポーレーションの手法と同様に実施した。次に、ＲＮＰを導入されたヒトｉＰＳ細胞を２日間（４８時間）及び１週間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムを鋳型とし、ヒト２１番染色体長腕セントロメア近傍特異的なフォワードプライマー２１ｑ－０１　Ｆ（5’- GTGCAACTGTCAGACCAAAACA -3’（配列番号９））及びヒト２１番染色体長腕テロメア近傍特異的なリバースプライマーＲｅ－２１ｑ　ｔｅｌ　Ｒ３（配列番号８）を用いてＰＣＲ法で増幅を行った。ＰＣＲ増幅は１反応に用いる鋳型ＤＮＡの量を１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇとした。ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは東洋紡社製ＫＯＤ　Ｏｎｅ（登録商標）ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用い、反応条件は、変性９８℃１０秒、アニーリング６５℃５秒、伸長６８℃５秒を３５サイクル行った。ヒト２１番染色体長腕セントロメア近傍特異的なフォワードプライマーについて、プライマーの名称及び、配列番号９の配列は以下で示した。
　　21q-01 F：　5’- GTGCAACTGTCAGACCAAAACA -3’（配列番号９）
　増幅産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色して検出した。１週間後のゲノムＤＮＡでは、１００ｎｇ、１０ｎｇにおいて期待される増幅産物（約２４５ｂｐ）が確認された（図２）。レーン１（Ｍａｒｋｅｒ）には、ＤＮＡラダーマーカー、Ｇｅｎｅ　ｌａｄｄｅｒ　ｗｉｄｅ　２を設定した。レーン２（２０１Ｂ７　ｗｔ）は、未処理の野生型２０１Ｂ７由来ＤＮＡを用いたＰＣＲ結果を示す。レーン３からレーン５（Ａｆｔｅｒ　４８Ｈ；１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ）は、２０１Ｂ７に対して、２１番染色体長腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、４８時間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果を示す。ＲＮＰ導入後、４８時間後においては、ＤＮＡ　１００ｎｇ分、１０ｎｇ分、１ｎｇ分の鋳型ＤＮＡを用いた場合、いずれにおいても、２１番染色体長腕が目的通りに削除された際に生じる特異的な配列（２１番染色体長腕削除特異的増幅産物）が出現したとのＰＣＲ結果を得た。増幅産物が検出された鋳型ＤＮＡ使用量から、２１番染色体長腕の削除効率を算出することができる。１ｎｇの鋳型ＤＮＡ（約１５０細胞分の鋳型ＤＮＡ）を使用した場合に２１番染色体長腕削除特異的増幅産物が検出されたことから、１５０細胞のうち少なくとも１細胞において２１番染色体長腕の削除が生じたと考えられる。このことから、最小の鋳型ＤＮＡ使用量である１ｎｇ分については、ＤＮＡ　１ｎｇに相当する約１５０細胞において１細胞以上の頻度で、２１番染色体長腕の削除が生じたと示唆された。レーン６からレーン８（Ａｆｔｅｒ　１　ｗｅｅｋ；１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ）は、２０１Ｂ７に対して、２１番染色体長腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、１週間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果を示す。ＲＮＰ導入後、４８時間後においては、ＤＮＡ１００ｎｇ分、１０ｎｇ分、１ｎｇ分のＤＮＡに相当する約１５０細胞中の１細胞以上（０．６７％）において、２１番染色体長腕の削除が生じたと示唆された。さらに１週間培養を継続し、細胞を増殖させたのちのＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、２１番染色体長腕削除特異的な検出を実施したところ、１００ｎｇ、１０ｎｇ量の鋳型ＤＮＡを用いた場合に、期待通りの特異的組み換えバンドが検出された。このことから約１５００細胞中の１細胞以上（０．０６７％）において、２１番染色体長腕の削除が生じたと示唆された。
［実施例４］ヒト２１番染色体長腕削除クローンの獲得とＰＣＲ法による長腕領域削除判定
　実施例２において長腕領域削除にむけたＲＮＰ導入２０１Ｂ細胞集団より、長腕領域削除細胞株を単離、樹立するために、長腕領域削除用ＲＮＰ導入２０１Ｂ７細胞集団を９６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌあたり１０個細胞が入るように、９６ｗｅｌｌ分播種し、およそ９６０個細胞の選別を行った。７～９日間培養し、増殖の見られたｗｅｌｌから順次、細胞を回収した。回収方法は、１ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したＰＢＳ１００μＬで洗浄し、１ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したＰＢＳを１００μＬ加えて３７℃で５分静置した後、上清を除いた。さらに、ＰＢＳ　１００μＬで洗浄した後、Ｙ－２７６３２を添加したＰＢＳ２５μＬで懸濁した。その細胞液中１５μＬを９６ｗｅｌｌプレートに継代し、１０μＬをＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液１０μＬで混合し、５５℃で一晩保温したのち９５℃で３分間加熱することで、ゲノムＤＮＡを抽出した。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液は、４７１μＬの滅菌水、２５μＬのＥｘＴａｑバッファー（ＴＡＫＡＲＡ社）、及び４μＬの１０ｍｇ／ｍＬ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ　Ｗａｋｏ社）を混合したものを用いた。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として２１番染色体長腕削除を特異的に検出するＰＣＲプライマーである、Ｒｅ－２１ｑ　ｔｅｌ　Ｒ３（配列番号８）、及び２１ｑ－０１　Ｆ（配列番号９）を用いて、ＰＣＲ法で増幅を行った。結果として、レーン１０に示される、９６ｗｅｌｌプレート６Ｆ座位の細胞由来ＤＮＡを鋳型にした場合に、想定される増幅産物（２４５ｂｐ）が確認された（図３）。陽性対照（ＰＣ）として、ＲＮＰ導入後、４８時間後の細胞集団由来のＤＮＡを鋳型として用いた。レーン１（Ｍａｒｋｅｒ）は、ＤＮＡサイズ指標マーカー、Ｇｅｎｅ　ｌａｄｄｅｒ　ｗｉｄｅ　２（ニッポンジーン社）を示す。レーン１の右から順番にレーン２～９，１１～１３において示される６Ｆ以外の座位由来のＤＮＡを用いた場合には、染色体長腕削除特異的な増幅産物は得られなかった。
　一方で、２１番染色体長腕削除において生ずると想定された２１番染色体長腕逆位を特異的に検出する、ヒト２１番染色体長腕セントロメア近傍特異的なリバースプライマーである２１ｑ－０１　Ｒ（配列番号１０）、及びヒト２１番染色体長腕テロメア近傍特異的なフォワードプライマー、Ｒｅ－２１ｑ　ｔｅｌ　Ｆ３（配列番号７）を用いてＰＣＲ法で増幅し、２１番染色体長腕逆位の存在を評価した。その結果、６Ｆ座位由来ＤＮＡを用いた場合では、２１番染色体長腕逆位の出現に特異的な増幅産物は検出されなかった（図４）。ヒト２１番染色体長腕セントロメア近傍特異的なリバースプライマーは、プライマーの名称及び、配列番号１０の配列は以下で示した。
　　21q-01 R：　5’-TGCCTGACTGAAAAGATGAGT -3’（配列番号１０）
［実施例５］ヒト２１番染色体長腕削除クローンの獲得とＰＣＲ法による長腕領域削除判定
　実施例４の結果より、６Ｆ座位の細胞集団（細胞集団６Ｆ）には、２１番染色体長腕全長が削除された集団が存在することが示唆された。この結果から、２１番染色体長腕を削除された細胞をクローン化することとした。６Ｆ座位由来細胞集団は１０個程度の細胞から形成された集団であるため、シングルクローン化するために、９６ｗｅｌｌプレートに１プレート当たり１５０個の細胞を播種した。１０日後に生じたコロニーをピックアップした。ピックアップ方法は、上述のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液を用いる手法と同一であった。９６ｗｅｌｌプレートから得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２１番染色体長腕削除を検出できるプライマーＲｅ－２１ｑ　ｔｅｌ　Ｒ３（配列番号８）、及び２１ｑ－０１　Ｆ（配列番号９）を用いて、ＰＣＲ法で増幅を行った。その結果４９サブクローン中１２サブクローンにおいて期待される増幅産物（２４５ｂｐ）が確認された（図５）。このことから、２０１Ｂ７を用いた際の、ヒト２１番染色体長腕削除効率は、最初から順を追って考えると、１０細胞を９６ｗｅｌｌに播種して、９６ｗｅｌｌ中１ｗｅｌｌについてヒト２１番染色体長腕削除特異的なＰＣＲ増幅産物が確認され、さらに、サブクローニングによって４９個のサブクローニングをスクリーニングし、最終的に１２サブクローン（図中のレーン＃３～＃３８）では、２１番染色体長腕削除特異的なＰＣＲ増幅産物が得られていたことから、ＲＮＰ導入した２０１Ｂ７を１週間培養した集団における２１番染色体削除効率は、０．０３％であると結論付けた。
[実施例６]ヒト２１番トリソミーｉＰＳ細胞株におけるヒト２１番染色体長腕削除効率改善に関する評価
　ヒト細胞は通常、２１番染色体を２本持つダイソミーであるが、２１番染色体を３本もつトリソミー症候群である、ヒトＤｏｗｎ症患者由来ｉＰＳ細胞株２７６７－４を用いて２１番染色体長腕削除を実施した。実施例２と同様に、エレクトロポーレーション法による２１番染色体長腕削除用ＲＮＰの導入及び、ＲＮＰ導入４８時間後、１週間後にＤＮＡ回収を行い、ＰＣＲ法にて２１番染色体長腕削除特異的増幅産物の有無を検証した。その結果、２１番トリソミー細胞株２７６７－４を用いた場合、４８時間後（Ａｆｔｅｒ　４８Ｈ）、１週間後（Ａｆｔｅｒ　１　ｗｅｅｋ）に取得したＲＮＰ導入細胞由来ＤＮＡについて１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ分の鋳型ＤＮＡを用いた際において期待される増幅産物（２４５ｂｐ）が確認された（図６）。一方で、ダイソミー株である２０１Ｂ７を用いた場合は、ＲＮＰ導入４８時間後に取得したＲＮＰ導入細胞由来ＤＮＡについて１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ分の鋳型ＤＮＡを用いた際において期待される増幅産物（２４５ｂｐ）が確認された（図２）。しかしながら、ＲＮＰ導入細胞由来ＤＮＡについて１ｎｇ分の鋳型ＤＮＡを用いた際において期待される増幅産物は見られなかった（図２）。この結果より、トリソミー細胞株を用いた場合の２１番染色体長腕削除細胞の出現頻度は、およそ１５０個あたり１個であった。また、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を用いた場合２１番染色体長腕削除細胞の出現頻度はおよそ１５００個あたり１個であった。このことから、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７と比較してトリソミー細胞株を用いた際の２１番染色体長腕削除効率は、１０倍の効率であると示唆された。
［実施例７］２１番染色体長腕削除に対するＧ－ｂａｎｄ染色体解析による検証
　実施例４において得られた細胞集団６Ｆのサブクローンについて２１番染色体長腕削除を細胞遺伝学的手法にて同定するため、ＧＴＧ法によるＧ－ｂａｎｄ染色体解析を実施した。１２サブクローンのうち２サブクローン（＃１０、＃２９）について１１～１３日間にかけて６ｃｍディッシュに拡大培養した。対数増殖期の細胞にＭｅｔａｐｈａｓｅ　Ａｒｒｅｓｔｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｅｎｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）とＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａｄｄｉｔｉｖｅ（Ｇｅｎｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を、それぞれ最終濃度が０．２５μｇ／ｍＬ及び０．１μＬ／ｍＬとなるよう培養液中に適量加え、９０分、３７℃にて培養した。細胞を回収後、０．０７５Ｍ　ＫＣｌ、５ｍＬで懸濁し、１５分、室温にて低張液処理した。１５００ｒｐｍ、５分間遠心後、上清を除去し、酢酸とメタノールが１：３となるように混合したカルノア液、５ｍＬで懸濁してカルノア固定浮遊標本を作製した。カルノア固定浮遊標本をスライドガラスに展開し、氷冷した０．０５％トリプシン溶液で２０～５０秒、トリプシン処理したのち、２％ギムザ染色液にてギムザ染色した。ＣｏｏｌＣｕｂｅ１ｍ　ＣＣＤカメラ（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）を備えた電動正立顕微鏡ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＺ２（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ社）及びＭｅｔａｆｅｒ　Ｓｌｉｄｅ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）にて分裂中期細胞を検索し、ランダムに選択した２０細胞を対象に、Ｉｋａｒｏｓ　Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）にてＧ－ｂａｎｄ染色体解析を実施した。正常核型である野生型２０１Ｂ７と比較して、＃１０、＃２９ともに、解析した２０細胞全てにおいて、目的通りの長腕削除により生じたと考えられる長腕の部分欠失を伴う２１番染色体、？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３）が検出された。他方の２１番染色体長腕端部には付加セグメントを伴う派生２１番染色体、ｄｅｒ（２１）が検出され、付加セグメントに見られたＧ－ｂａｎｄの縞模様により、？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３）で削除された染色体領域、２１ｑ１１．２～ｑ２２．３がｄｅｒ（２１）において逆位挿入（又は転座）されていることが示唆された。また、それ以外の染色体数的異常、及び構造異常は検出されなかった（図７－１～図７－３）。
［実施例８］２１番染色体長腕削除に対するｍＢａｎｄ染色体解析による検証
　実施例５において検出された染色体構造異常、？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３）及びｄｅｒ（２１）について、切断点など構造異常の詳細を同定するため、２サブクローン（＃１０、＃２９）のｍＢａｎｄ染色体解析を実施した。実施例５にて作製したカルノア固定浮遊標本をスライドガラスに展開し、Ｈｕｍａｎ　ｍＢＡＮＤ　Ｐｒｏｂｅｓ　ＸＣｙｔｅ　２１（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、製品に付属のプロトコルに基づき染色処理を実施した。実施例５と同様に分裂中期細胞を検索し、ランダムに選択した３細胞を対象に、Ｉｓｉｓ　ＦＩＳＨ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）にてｍＢａｎｄ染色体解析を実施した。＃１０、＃２９ともに、解析した３細胞全てにおいて、実施例５で検出された？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３）及びｄｅｒ（２１）と同様のＤＡＰＩ像を持つ染色体が検出され、同時に染色処理した野生型２０１Ｂ７の正常２１番染色体に見られたｍＢａｎｄシグナルとの比較により、？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３）は染色体領域、２１ｑ１１．２～ｑ２２．３が欠失しており、またｄｅｒ（２１）は長腕端部に染色体領域、２１ｑ１１．２～ｑ２２．３が逆位で付加していることが確認された（図８－１～図８－３）。なお、図中、上段は２本の２１番染色体のｍＢａｎｄ染色体解析の結果を示し、中段及び下段はそれぞれ各染色体の詳細な結果を示す。この結果より、ｄｅｒ（２１）において検出された染色体構造異常は、？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３）で削除された染色体領域、２１ｑ１１．２～ｑ２２．３が、２１番染色体長腕の端部に逆位挿入又は転座したことで生じた構造異常、？ｉｎｓ（２１；２１）（ｑ２２．３；ｑ２２．３ｑ１１．２）であり、２１番染色体長腕削除によって生ずると想定された？ｄｅｌ（２１）（ｑ１１．２ｑ２２．３）が得られたと結論付けた。
［実施例９］ヒト２１番トリソミーｉＰＳ細胞株（２７６７－４）におけるヒト２１番染色体長腕削除効率改善によるヒト２１番染色体長腕削除クローンの獲得とＰＣＲ法による長腕領域削除判定
　実施例３と同様に、長腕領域削除にむけてＲＮＰ導入した２７６７－４細胞集団より、長腕領域削除細胞株を単離、樹立するために、ＲＮＰ導入した２７６７－４細胞集団を９６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌあたり１０個細胞が入るように、９６ｗｅｌｌ分播種し、およそ９６０個細胞の選別を行った。７～９日間培養し、増殖の見られたｗｅｌｌから順次、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを抽出し、一部を継続して培養した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として２１番染色体長腕削除を特異的に検出するＰＣＲプライマーである、Ｒｅ－２１ｑ　ｔｅｌ　Ｒ３（配列番号８）、及び２１ｑ－０１　Ｆ（配列番号９）を用いて、ＰＣＲ法で増幅を行った。その結果、９６ｗｅｌｌ中５ｗｅｌｌ（ウェル番号５９、６４、６６、７１、７８）で期待される増幅産物が得られた（図９）。なお、図中、各ゲルのレーン２～１７は９６ウェル番号の異なる座位のクローンの結果を示す。同様に２１番染色体長腕逆位の判定を行ったところ５ｗｅｌｌ（ウェル番号５９、６４、６６、７１、７８）全てで特異的な増幅産物は検出されなかった（図１０）。この結果より、トリソミー細胞株である２７６７－４ではヒト２１番染色体長腕の削除効率は、９６　ｗｅｌｌ　中５ｗｅｌｌの確率であった。実施例３より、ダイソミー株である２０１Ｂ７を用いた際のヒト２１番染色体長腕の削除効率は、９６ｗｅｌｌ中１ｗｅｌｌであった。このことから、トリソミー細胞株を用いた際には、２１番染色体長腕削除効率は、５倍上昇したと言えた。
　次に、この結果より、ウェル番号５９、６４、６６、７１、７８の細胞集団には、２１番染色体長腕全長が削除された集団が存在することを確認するため、トリソミー細胞株を用いた場合における、２１番染色体長腕削除細胞をクローン化することとした。ウェル番号５９由来細胞集団（細胞集団５９）は１０個程度の細胞から形成された集団であるため、シングルクローン化するために、９６ｗｅｌｌプレートに１プレート当たり１５０個細胞を播種した。１０日後に生じたコロニーをピックアップした。ピックアップ方法は、上述のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液を用いる手法と同一であった。９６ｗｅｌｌプレートから得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２１番染色体長腕削除を検出できるプライマーＲｅ－２１ｑ　ｔｅｌ　Ｒ３（配列番号８）、及び２１ｑ－０１　Ｆ（配列番号９）を用いて、ＰＣＲ法で増幅を行った。その結果２６サブクローン中４サブクローン（＃８、１７、２４、２６）において期待される増幅産物（２４５ｂｐ）が確認された（図１１）。なお、図中、「＃６Ｆ　＃２９」はダイソミー細胞株である２０１Ｂ７細胞の細胞集団６Ｆのサブクローン＃２９を使用した場合の結果を示す。このことから、２７６７－４細胞を用いた際の、ヒト２１番染色体長腕削除効率は、最初から順を追って考えると、１０細胞を９６ｗｅｌｌに播種して、９６ｗｅｌｌ中５ｗｅｌｌについてヒト２１番染色体長腕削除特異的なＰＣＲ増幅産物が確認され、さらに、サブクローニングによって２６個のサブクローンをスクリーニングし、最終的に４サブクローンでは、２１番染色体長腕削除特異的なＰＣＲ増幅産物が得られたことから、ＲＮＰ導入した２７６７－４を１週間培養した集団における２１番染色体削除効率は、０．０８％であると結論付けた。
［実施例１０］トリソミー２１番染色体長腕削除に対するＤＡＰＩ染色による染色体解析による検証
　実施例９において得られた細胞集団５９のサブクローンについて２１番染色体長腕削除を細胞遺伝学的手法にて同定するため、ＤＡＰＩ染色体解析を実施した。各サブクローンを６ｃｍディッシュに拡大培養したのち、カルノア固定浮遊標本を作製し、スライドガラスに展開した。拡大培養からカルノア固定法までの手法は、上述のＧ－ｂａｎｄ染色体解析で実施した手法と同一であった。ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色法として、ＤＡＰＩ（同仁化学社）１μｇ／ｍＬを添加したＳｌｏｗＦａｄｅＴＭ　Ｇｏｌｄ　ａｎｔｉｆａｄｅ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を染色体標本上に塗り、カバーグラスにて封入した。検鏡により、ランダムに選択した２０細胞を対象にＱ－ｂａｎｄ染色体解析を実施した。実施例５と同様に、本手法により、２１番染色体長腕削除により生じると想定される染色体異常を検出し、評価した。サブクローン＃５９－２６（細胞集団５９のサブクローン２６）においては、由来元であるトリソミー細胞株２７６７－４と比較して、正常２１番染色体を二本、及び、目的通りの長腕削除により生じたと考えられる長腕の部分欠失を伴う２１番染色体を認めた（図１２）。
[実施例１１]ヒト１３番染色体短腕削除のための、ヒトｉＰＳ細胞株へのｇＲＮＡ導入
　ヒト１３番染色体短腕のテロメア近傍を切断するｃｒＲＮＡＸＴ、ｇＲＮＡ－１３ｐ－ＴｅｌｏＴ３（5’- AGAAGCGAATCCTGCTTGCA -3’（配列番号４）+(GGG)）とヒト１３番染色体短腕セントロメア近傍を切断するｇＲＮＡ－１３ｐ－Ｔ１４２（5’- AGAACTGAAGCATCACTCAC -3’（配列番号３）+(TGG)）をヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７に、エレクトロポーレーションにより導入した。方法として、まずは、２．５μＬのｇＲＮＡ－１３ｐ－ＴｅｌｏＴ３と２．５μＬの２００μＭ　ｇＲＮＡ－１３ｐ－Ｔ１４２と５μＬの２００μＭ　ｔｒａｃＲＮＡを同一マイクロチューブ内にて混合し、９５℃にて３分間、加熱した。加熱後、室温に戻した。この後は実施例２にて記載したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ＲＮＰエレクトロポーレーションの手法と同様に実施した。各ｇＲＮＡの標的配列は以下のとおりである。
　　gRNA-13p-T142：5’- AGAACTGAAGCATCACTCAC -3’（配列番号３）+(TGG)
　　gRNA-13p-TeloT3：5’- AGAAGCGAATCCTGCTTGCA -3’（配列番号４）+(GGG)
　次に、ＲＮＰを導入されたヒトｉＰＳ細胞を２日間（４８時間）及び１週間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムを鋳型とし、ヒト１３番染色体短腕セントロメア近傍特異的なフォワードプライマー１３ｐ－Ｔ１４２Ｒ（5’-TGACAGGCATCCATGGGAAC -3’（配列番号１１））及びヒト１３番染色体短腕テロメア近傍特異的なリバースプライマーＲｅ－Ｃｈｒ１３ｐ　ｔｅｌ　Ｆ２（5’-CTCAGACCCGGAGCTTTCTC -3’（配列番号１２））を用いてＰＣＲ法で増幅を行った。ＰＣＲ増幅は１反応に用いる鋳型ＤＮＡの量を１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇとした。ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは東洋紡社製ＫＯＤ　Ｏｎｅ（登録商標）ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用い、反応条件は、変性９８℃１０秒、アニーリング６５℃５秒、伸長６８℃５秒を３５サイクル行った。増幅産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色して検出した。プライマーの名称及び、配列は以下で示した。
　　13p-T142R：5’-TGACAGGCATCCATGGGAAC -3’（配列番号１１）
　　Re-Chr13p tel F2：5’-CTCAGACCCGGAGCTTTCTC -3’（配列番号１２）
　１週間後のゲノムＤＮＡでは、１００ｎｇ、１０ｎｇにおいて期待される増幅産物（約２４５ｂｐ）が確認された（図１３）。左からレーン１には、ＤＮＡラダーマーカー、Ｇｅｎｅ　ｌａｄｄｅｒ　ｗｉｄｅ　２を設定した。レーン２は、野生型２０１Ｂ７由来ＤＮＡを用いたＰＣＲ結果を示す。レーン３からレーン５（Ａｆｔｅｒ　４８Ｈ；１００ｎｇ，１０ｎｇ，１ｎｇ）は、２０１Ｂ７に対して、１３番染色体短腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、４８時間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果を示す。ＲＮＰ導入後、４８時間後においては、ＤＮＡ１００ｎｇ分、１０ｎｇ分、１ｎｇ分の鋳型ＤＮＡを用いた場合、いずれにおいても、１３番染色体短腕が目的通りに削除された際に生じる特異的な配列が出現したとのＰＣＲ結果を得た。レーン３からレーン８は、２０１Ｂ７に対して、１３番染色体短腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、４８時間後（Ａｆｔｅｒ　４８Ｈ）、１週間後（Ａｆｔｅｒ　１　ｗｅｅｋ）に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果を示す。ＲＮＰ導入後、４８時間後においては、ＤＮＡ１００ｎｇ分のＤＮＡに相当する約１５０００細胞中の１細胞以上（０．００６７％）において、１３番染色体短腕の削除が生じたと示唆された。さらに１週間培養を継続し、細胞を増殖させたのちのＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、１３番染色体短腕削除特異的な検出を実施したところ、１００ｎｇ、１０ｎｇ量の鋳型ＤＮＡを用いた場合に、期待通りの特異的組み換えバンドが検出された。このことから約１５００細胞（ＤＮＡ１０ｎｇ分のＤＮＡに相当）中の１細胞以上（０．０６７％）において、１３番染色体短腕の削除が生じたと示唆された。
［実施例１２］ヒト１３番染色体短腕削除クローンの獲得とＰＣＲ法による短腕領域削除判定
　実施例１１において短腕領域削除に向けたＲＮＰ導入２０１Ｂ細胞集団より、短腕領域削除細胞株を単離、樹立するために、短腕領域削除用ＲＮＰ導入２０１Ｂ７細胞集団を９６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌあたり１０個細胞が入るように、９６ｗｅｌｌ分播種し、およそ９６０個細胞の選別を行った。７～９日間培養し、増殖の見られたｗｅｌｌから順次、細胞を回収した。回収方法は、１ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したＰＢＳ１００μＬで洗浄し、１ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したＰＢＳを１００μＬ加えて３７℃で５分静置した後、上清を除いた。さらに、ＰＢＳ１００μＬで洗浄した後、Ｙ－２７６３２を添加したＰＢＳ２５μＬで懸濁した。その細胞液中１５μＬを９６ｗｅｌｌプレートに継代し、１０μＬをＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液１０μＬで混合し、５５℃で一晩保温したのち９５℃で３分間加熱することで、ゲノムＤＮＡを抽出した。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液は、４７１μＬの滅菌水、２５μＬのＥｘＴａｑバッファー（ＴＡＫＡＲＡ社）、及び４μＬの１０ｍｇ／ｍＬ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ　Ｗａｋｏ社）を混合したものを用いた。得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト１３番染色体短腕セントロメア近傍特異的なフォワードプライマー１３ｐ－Ｔ１４２Ｒ（5’-TGACAGGCATCCATGGGAAC -3’（配列番号１１））及びヒト１３番染色体短腕テロメア近傍特異的なリバースプライマーＲｅ－Ｃｈｒ１３ｐ　ｔｅｌ　Ｆ２（5’-CTCAGACCCGGAGCTTTCTC -3’（配列番号１２））を用いてＰＣＲ法で増幅を行った。
　結果として、９６ｗｅｌｌプレート４Ｂ、４Ｃ、５Ｃ，６Ｅ，６Ｆ，６Ｈ，７Ｄ，８Ｇ、１０Ａ、１０Ｃ、１１Ｄ座位の細胞由来ＤＮＡを鋳型にした場合に、想定される増幅産物（２４５ｂｐ）が確認された（図１４）。陽性対照（ＰＣ）として、ＲＮＰ導入後、４８時間後の細胞集団由来のＤＮＡを鋳型として用いた。レーン１（Ｍａｒｋｅｒ）は、ＤＮＡサイズ指標マーカー、Ｇｅｎｅ　ｌａｄｄｅｒ　ｗｉｄｅ　２（ニッポンジーン社）を示す。
　一方で、１３番染色体短腕削除において生ずると想定された１３番染色体短腕逆位を特異的に検出する、ヒト１３番染色体短腕セントロメア近傍特異的なリバースプライマーである１３ｐ－Ｔ１４２Ｆ（5’-GGCTCCATCCCATGTGAGAG -3’（配列番号１３））、及びヒト１３番染色体短腕テロメア近傍特異的なフォワードプライマー、Ｃｈｒ１３ｐ　ｔｅｌ　Ｆ２（5’-AGAACTGAAGCATCACTCACTGG -3’（配列番号１４））を用いてＰＣＲ法で増幅し、２１番染色体短腕逆位の存在を評価した。その結果、４Ｃ、５Ｃ座位由来ＤＮＡを用いた場合では、１３番染色体短腕逆位の出現に特異的な増幅産物は検出されなかった。一方で、６Ｅ座位由来ＤＮＡを用いた場合では、１３番染色体短腕逆位の出現に特異的な増幅産物は検出された（図１５）。プライマーの名称及び、配列番号９の配列は以下で示した。
　　13p-T142F：5’-GGCTCCATCCCATGTGAGAG -3’（配列番号１３）
　　Chr13p tel F2：5’-AGAACTGAAGCATCACTCACTGG -3’（配列番号１４）
[実施例１３]ヒト１３番染色体短腕削除クローンの獲得とＰＣＲ法による短腕領域削除判定
　実施例１２の結果より、５Ｃ座位の細胞集団（細胞集団５Ｃ）には、１３番染色体短腕全長が削除された集団が存在することが示唆された。この結果から、１３番染色体短腕が削除された細胞をクローン化することとした。５Ｃ座位由来細胞集団は１０個程度の細胞から形成された集団であるため、シングルクローン化するために、９６ｗｅｌｌプレートに１プレート当たり１５０個細胞を播種した。１０日後に生じたコロニーをピックアップした。ピックアップ方法は、上述のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液を用いる手法と同一であった。９６ｗｅｌｌプレートから得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト１３番染色体短腕セントロメア近傍特異的なフォワードプライマー１３ｐ－Ｔ１４２Ｒ（5’-TGACAGGCATCCATGGGAAC -3’（配列番号１１））及びヒト１３番染色体短腕テロメア近傍特異的なリバースプライマーＲｅ－Ｃｈｒ１３ｐ　ｔｅｌ　Ｆ２（5’-CTCAGACCCGGAGCTTTCTC -3’（配列番号１２））を用いてＰＣＲ法で増幅を行った。
　その結果、９６サブクローン中１１サブクローン（表示の＃４～＃６３）において期待される増幅産物（２４５ｂｐ）が確認された（図１６）。なお、図１６中、「５Ｃ　Ｍａｓｓ」はシングルクローン化されていない細胞集団５Ｃを使用した場合の結果を示す。このことから、２０１Ｂ７を用いた際の、ヒト１３番染色体短腕削除効率は、最初から順を追って考えると、１０細胞を９６ｗｅｌｌに播種して、９６ｗｅｌｌ中１ｗｅｌｌについてヒト１３番染色体短腕削除特異的なＰＣＲ増幅産物が確認され、さらに、サブクローニングによって９個のサブクローンをスクリーニングし、最終的に３サブクローン（＃２、４、５）では、１３番染色体短腕削除特異的なＰＣＲ増幅産物が得られていたことから（図１７）、ＲＮＰ導入した２０１Ｂ７を１週間培養した集団における１３番染色体削除効率は、０．００１１％であると結論付けた。なお、図１７中、「５Ｃ　＃４」は細胞集団５Ｃのサブクローン＃４のさらなるシングルクローン化がされていない細胞集団を使用した場合の結果を示す。
［実施例１４］１３番染色体短腕削除に対するＧ－ｂａｎｄ染色体解析による検証
　実施例１３において得られた細胞集団５Ｃのサブクローンについて１３番染色体短腕削除を細胞遺伝学的手法にて同定するため、ＧＴＧ法によるＧ－ｂａｎｄ染色体解析を実施した。１２サブクローンのうち２サブクローン（＃４－２、＃１０－８）について１１～１３日間にかけて６ｃｍディッシュに拡大培養した。対数増殖期の細胞にＭｅｔａｐｈａｓｅ　Ａｒｒｅｓｔｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｅｎｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）とＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａｄｄｉｔｉｖｅ（Ｇｅｎｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を、それぞれ最終濃度が０．２５μｇ／ｍＬ及び０．１μＬ／ｍＬとなるよう培養液中に適量加え、９０分、３７℃にて培養した。細胞を回収後、０．０７５Ｍ　ＫＣｌ、５ｍＬで懸濁し、１５分、室温にて低張液処理した。１５００ｒｐｍ、５分間遠心後、上清を除去し、酢酸とメタノールが１：３となるように混合したカルノア液、５ｍＬで懸濁してカルノア固定浮遊標本を作製した。カルノア固定浮遊標本をスライドガラスに展開し、氷冷した０．０５％トリプシン溶液で２０～５０秒、トリプシン処理したのち、２％ギムザ染色液にてギムザ染色した。ＣｏｏｌＣｕｂｅ１ｍ　ＣＣＤカメラ（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）を備えた電動正立顕微鏡ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＺ２（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ社）及びＭｅｔａｆｅｒ　Ｓｌｉｄｅ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）にて分裂中期細胞を検索し、ランダムに選択した２０細胞を対象に、Ｉｋａｒｏｓ　Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）にてＧ－ｂａｎｄ染色体解析を実施した。正常核型である野生型２０１Ｂ７細胞と比較して、＃４－２、＃１０－８ともに、解析した２０細胞全てにおいて、目的通りの短腕削除により生じたと考えられる長腕の部分欠失を伴う１３番染色体ｄｅｌ（１３）（ｐ１１．２）が検出された（図１８）。
［実施例１５］ヒト１３番染色体長腕削除のための、ヒトｉＰＳ細胞株へのｇＲＮＡ導入
　実施例１１と同様に、ヒト１３番染色体の長腕について、セントロメア近傍、或いは、テロメア側近傍について、特異的に切断するｇＲＮＡを設計し、ダイソミーヒトｉＰＳ細胞株やトリソミーｉＰＳ細胞株へと導入し、長腕領域全長を削除することができる。
［実施例１６］ヒト１３番染色体長腕削除クローンの獲得とＰＣＲ法による短腕領域削除判定
　実施例１２と同様に、ヒト１３番染色体の実施例１５において、ヒト１３番染色体長腕削除に向けたｇＲＮＡをダイソミーヒト細胞株やトリソミーヒト細胞株に対して導入した細胞に対して、長腕削除を特異的に検出可能なプライマーを用いたＰＣＲ法により、ヒト１３番染色体長腕削除細胞株が細胞集団にどの程度出現しているかを調べることができる。
［実施例１７］ヒト１３番染色体長腕削除クローンの獲得とＰＣＲ法による長腕領域削除判定
　実施例１３と同様に、長腕削除を示す特異的なプローブを用いて、各ウェルから取得した細胞クローンをＰＣＲ法により選別し、ヒト１３番染色体長腕削除シングルクローンを取得できる。
［実施例１８］１３番染色体長腕削除に対するＧ－ｂａｎｄ染色体解析による検証
　実施例７の記載と同様に、作製されたサブクローンの１３番染色体長腕削除を細胞遺伝学的手法にて同定するため、実施例５と同様に調製されたカルノア固定浮遊標本をスライドガラスに展開し、氷冷した０．０５％トリプシン溶液で２０～５０秒、トリプシン処理したのち、２％ギムザ染色液にてギムザ染色した。ＣｏｏｌＣｕｂｅ１ｍ　ＣＣＤカメラ（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）を備えた電動正立顕微鏡ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＺ２（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ社）及びＭｅｔａｆｅｒ　Ｓｌｉｄｅ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）にて分裂中期細胞を検索し、ランダムに選択した細胞を対象に、Ｉｋａｒｏｓ　Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）にて、サブクローンのＧ－ｂａｎｄ染色体解析を実施することができる。
［実施例１９］１３番染色体長腕削除に対するｍ－Ｂａｎｄ染色体解析による検証
　実施例８の記載と同様に、作製されたサブクローンの１３番染色体長腕削除における染色体構造異常について切断点など構造異常の詳細を同定するため、作製されたサブクローンのｍＢａｎｄ染色体解析を実施する。実施例５と同様に作製されたカルノア固定浮遊標本をスライドガラスに展開し、Ｈｕｍａｎ　ｍＢＡＮＤ　Ｐｒｏｂｅｓ　ＸＣｙｔｅ　２１（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、製品に付属のプロトコルに基づき染色処理を実施する。実施例５と同様に分裂中期細胞を検索し、ランダムに選択した細胞を対象に、Ｉｓｉｓ　ＦＩＳＨ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ社）にて、サブクローンのｍＢａｎｄ染色体解析を実施することができる。
［実施例２０］ヒト２１番トリソミーｉＰＳ細胞株におけるヒト２１番染色体短腕削除効率改善に関する評価
　ヒト２１番染色体短腕のテロメア近傍を切断するｃｒＲＮＡＸＴ、ｇＲＮＡ－２１ｐ－ＴｅｌｏＴ６（5’-AGACTGTAGCCTTGACCCAG -3’（配列番号１５）+(AGG)）とヒト２１番染色体短腕セントロメア近傍を切断するｇＲＮＡ－２１ｐ－Ｔ９４（5’-CTGTGGACGTATTAACTTAC -3’（配列番号１６）+(TGG)）をヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７及びヒト２１番トリソミーｉＰＳ細胞株２７６７－４に、エレクトロポーレーションにより導入した。方法として、まずは、２．５μＬのｇＲＮＡ－２１ｐ－ＴｅｌｏＴ６と２．５μＬの２００μＭ　ｇＲＮＡ－２１ｐ－Ｔ９４と５μＬの２００μＭ　ｔｒａｃＲＮＡを同一マイクロチューブ内にて混合し、９５℃にて３分間、加熱した。加熱後、室温に戻した。この後は実施例２にて記載したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ＲＮＰエレクトロポーレーションの手法と同様に実施した。各ｇＲＮＡの標的配列は以下のとおりである。
　　gRNA-21p-TeloT6：5’-AGACTGTAGCCTTGACCCAG -3’（配列番号１５）+(AGG)
　　gRNA-21p-T94：5’-CTGTGGACGTATTAACTTAC -3’（配列番号１６）+(TGG)
　次に、ＲＮＰを導入されたヒトｉＰＳ細胞を２日間（４８時間）及び１週間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムを鋳型とし、ヒト２１番染色体短腕セントロメア近傍特異的なフォワードプライマーＲｅ２１ｐ－Ｔ９４Ｒ（5’-ACCATTAGAGGACTCTGTCAGTG -3’（配列番号１８））及びヒト２１番染色体短腕テロメア近傍特異的なリバースプライマーＣｈｒ２１ｐ－ａｒｍ　ｔｅｌｏ　Ｆ７（5’-TGTGCAACCAGCTTTGGAAC -3’（配列番号１７））を用いてＰＣＲ法で増幅を行った。ＰＣＲ増幅は１反応に用いる鋳型ＤＮＡの量を１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇとした。ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは東洋紡社製ＫＯＤ　Ｏｎｅ（登録商標）ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用い、反応条件は、変性９８℃１０秒、アニーリング６５℃５秒、伸長６８℃５秒を３５サイクル行った。増幅産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイド染色して検出した。プライマーの名称及び、配列は以下で示した。
　　Chr21p-arm telo F7：5’-TGTGCAACCAGCTTTGGAAC-3’（配列番号１７）
　　Re21p-T94R：5’-ACCATTAGAGGACTCTGTCAGTG -3’（配列番号１８）
　１週間後のゲノムＤＮＡでは、１００ｎｇ、１０ｎｇにおいて期待される増幅産物（約６８０ｂｐ）を検出した（図１９）。上段の図では、ダイソミーである２０１Ｂ７細胞に対する解析結果を示す。下段の図では、トリソミーである２７６７－４細胞に対する解析結果を示す。左からレーン１には、ＤＮＡラダーマーカー、Ｇｅｎｅ　ｌａｄｄｅｒ　ｗｉｄｅ　２を設定した。レーン２からレーン４（Ａｆｔｅｒ　４８Ｈ；１００ｎｇ，１０ｎｇ，１ｎｇ）は、２１番染色体短腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、４８時間後に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果を示す。ＲＮＰ導入後、４８時間後では、鋳型ＤＮＡ使用量１００ｎｇにおいては、２０１Ｂ７細胞と２７６７－４細胞のいずれにおいても、２１番染色体短腕が目的通りに削除された際に生じる特異的な配列（２１番染色体短椀削除特異的増幅産物）が出現したとのＰＣＲ結果を得た。ダイソミーの２０１Ｂ７細胞においては、鋳型ＤＮＡ使用量１０ｎｇ及び１ｎｇでは、２１番染色体短腕削除特異的な配列は検出されなかった（上段）。一方、トリソミーの２７６７－４細胞においては、鋳型ＤＮＡ使用量１０ｎｇでも、２１番染色体短腕削除特異的な配列は検出された（下段）。このことから、トリソミーの２７６７－４細胞においては、約１５００細胞（鋳型ＤＮＡ１０ｎｇに相当）に１細胞以上の頻度で、２１番染色体短腕の削除が生じたと示唆された。
　レーン５からレーン７は、２１番染色体短腕削除用ｇＲＮＡの組み合わせを導入後から、１週間後（Ａｆｔｅｒ　１　ｗｅｅｋ；１００ｎｇ，１０ｎｇ，１ｎｇ）に回収したゲノムＤＮＡを用いた解析結果を示す。ダイソミーの２０１Ｂ７細胞においては、鋳型ＤＮＡ使用量が１００ｎｇでのみ２１番染色体短腕削除特異的な増幅産物が検出された（上段）。このことから、約１５０００細胞（鋳型ＤＮＡ１００ｎｇ分に相当）中に１細胞以上（０．００６７％）の頻度で２１番染色体短腕の削除が生じたと示唆された。一方、２７６７－４細胞においては、鋳型ＤＮＡ使用量が１００ｎｇ及び１０ｎｇで２１番染色体短腕削除特異的な増幅産物が検出された（下段）。このことから、トリソミーの２７６７－４細胞においては、約１５００細胞（鋳型ＤＮＡ１０ｎｇに相当）中に１細胞以上（０．０６７％）の頻度で、２１番染色体短腕の削除が生じたと示唆された。このことから、ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７と比較してトリソミー細胞株を用いた際の２１番染色体短腕削除効率は、１０倍の効率であると示唆された。
　本発明は、非ヒト細胞成分を含まないヒト人工染色体ベクターを保持するヒト細胞を作製する方法を提供するため、再生医療や遺伝子治療のための安全な細胞医薬品製造などに有用な技術となることが期待される。
配列番号７～１４：プライマー
配列番号１５及び１６：プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　一対の相同ヒト染色体を含むダイソミーヒト細胞、又は相同ヒト染色体のトリソミーを含むトリソミーヒト細胞において、前記ダイソミーの２つの染色体のうち１つの染色体、又は前記トリソミーの３つの染色体のうち１つ若しくは２つの染色体から長腕及び短腕の内在遺伝子を実質的に削除し、それによって内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、並びにテロメアを有するヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を含有する細胞集団を作製し、さらに、前記細胞集団から前記ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞を回収することを含む、ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞の作製方法。
  2. 　前記ダイソミーヒト細胞又はトリソミーヒト細胞がハプロ不全を有する場合、前記回収されたヒト細胞がハプロ不全遺伝子を２コピー含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ヒト人工染色体ベクターに、部位特異的ＤＮＡ挿入配列を挿入することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記ヒト人工染色体ベクターに、外来遺伝子若しくはＤＮＡを挿入することをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記トリソミーヒト細胞が、トリソミーヒト患者由来の細胞、又はダイソミー細胞から人工的に作製したトリソミー細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記ヒト細胞が、体細胞、前駆細胞又は幹細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　一対の相同ヒト染色体及び、それと相同な１つのヒト染色体由来ヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞であって、前記ヒト人工染色体ベクターが、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、及びテロメアを有する、ヒト細胞。
  8. 　一本のヒト染色体及び、それと相同なヒト染色体由来の１つ若しくは２つのヒト人工染色体ベクターを含むヒト細胞であって、前記ヒト人工染色体ベクターが、内在遺伝子を実質的に含まない長腕及び短腕部分、ヒトセントロメア、及びテロメアを有する、かつ、前記細胞がハプロ不全遺伝子２コピーを含む、ヒト細胞。
  9. 　前記ヒト細胞が、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法によって作製されるヒト細胞である、請求項７又は８に記載のヒト細胞。
  10. 　前記ヒト人工染色体ベクターが、部位特異的ＤＮＡ挿入配列を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載のヒト細胞。
  11. 　前記ヒト人工染色体ベクターが、外来遺伝子若しくはＤＮＡを含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載のヒト細胞。
  12. 　前記ヒト細胞が、体細胞、前駆細胞若しくは幹細胞である、請求項７～１１のいずれか１項に記載のヒト細胞。
  13. 　前記幹細胞が、ｉＰＳ細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１２に記載のヒト細胞。
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