WO2023182520A1 - 免疫学的分析方法、複合体、複合体の製造方法及び免疫学的分析用試薬 - Google Patents

免疫学的分析方法、複合体、複合体の製造方法及び免疫学的分析用試薬 Download PDF

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俊明 植本
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    • G01N2458/30—Electrochemically active labels

Definitions

  • the present disclosure relates to an immunological analysis method, a complex, a method for producing the complex, and a reagent for immunological analysis.
  • Patent Document 1 describes an immunological analysis method that utilizes a biotin-avidin reaction to detect a signal emitted by a labeling substance bound to an antibody.
  • the affinity of antibodies to antigens is one of the factors that affects detection sensitivity. If the antibody has insufficient affinity for the antigen, the antibody tends to dissociate after binding to the antigen, and the necessary detection sensitivity may not be obtained. Furthermore, when immunological analysis is performed using a combination of multiple antibodies against antigens, the position of the antigen recognition site is also a factor that affects whether measurement is possible or not and detection sensitivity. Therefore, the present disclosure provides an immunological analysis method, a complex, a method for producing the complex, and an immunological analysis reagent that can obtain good detection sensitivity without using an antibody with sufficient affinity for the antigen. The task is to do so.
  • Means for solving the above problems include the following embodiments.
  • An immunological analysis method comprising the step of binding an antibody to an antigen, wherein the antibody is contained in a complex including a structure in which a plurality of antibodies are bound via a scaffold compound and a labeling substance.
  • the scaffold compound is a biotin-binding protein.
  • the binding via the scaffold compound is binding via biotin.
  • the step of binding the antibody to the antigen includes a step of binding the antigen to the first antibody, and a step of binding the second antibody to the antigen bound to the first antibody, and the second antibody
  • ⁇ 7> A complex comprising a structure in which multiple antibodies are bound via a scaffold compound and a labeling substance.
  • ⁇ 8> A step of mixing an antibody bound to a compound capable of binding to a scaffold compound and a scaffold compound bound to a labeling substance, or mixing an antibody bound to a compound capable of binding to a scaffold compound and a labeling substance and a scaffold compound.
  • An immunological analysis reagent comprising the complex according to ⁇ 7>.
  • an immunological analysis method a complex, a method for producing the complex, and an immunological analysis reagent that can obtain good detection sensitivity without using an antibody having sufficient affinity for an antigen.
  • a numerical range indicated using " ⁇ " indicates a range that includes the numerical values written before and after " ⁇ " as the minimum value and maximum value, respectively.
  • the upper or lower limit stated in one numerical range may be replaced by the upper or lower limit of another numerical range described step by step, and , may be replaced with the values shown in the examples.
  • the amount of each component in the material means the total amount of the multiple substances present in the material, unless otherwise specified.
  • the immunological analysis method of the present disclosure includes a step of binding an antibody to an antigen, and the antibody is included in a complex including a structure in which multiple antibodies are bound via a scaffold compound and a labeling substance.
  • the method of the present disclosure in addition to obtaining good detection sensitivity without using antibodies with high affinity, it is possible to consider more combinations of antibodies when considering an immunological analysis method. be able to. Therefore, for example, the development of immunological analysis reagents can be efficiently progressed.
  • the method for carrying out the immunological analysis method of the present disclosure is not particularly limited as long as it is a method of detecting a signal emitted by a labeling substance using an antigen-antibody reaction.
  • electrochemiluminescence immunoassay uses an electrochemiluminescent substance as a labeling substance
  • enzyme immunoassay uses an enzyme as a labeling substance
  • radiation uses a radioisotope as a labeling substance.
  • Immunoassay RIA
  • chemiluminescent immunoassay CIA
  • fluorescence immunoassay FIA
  • bioluminescent substance that uses a bioluminescent substance as a labeling substance.
  • bioluminescent immunoassay BLIA
  • the immunological analysis method of the present disclosure is preferably performed by electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA).
  • the complex used in the immunological analysis method of the present disclosure includes a structure in which multiple antibodies are bound via a scaffold compound.
  • a structure can be produced, for example, by using a scaffold compound that has multiple sites that can bind directly or indirectly to antibodies, and binding the sites of the scaffold compound to multiple antibodies.
  • the scaffold compound may be a compound derived from a living body or a compound obtained by synthesis.
  • the scaffold compound may be a biotin-binding protein.
  • a biotin-binding protein has four sites in its molecule that bind to biotin. Therefore, by using a biotin-binding protein as a scaffold compound and an antibody bound to biotin as an antibody, a complex in which multiple antibodies are cross-linked with the biotin-binding protein is formed.
  • biotin-binding proteins include streptavidin and avidin, and among these, streptavidin is preferred because of its low nonspecific binding.
  • the method of binding the antibody and scaffold compound is not particularly limited. Examples include the biotin-avidin method, physical adsorption, a method using hydrogen bonds, a method using van der Waals bonds, and a method using a crosslinking agent. Among these, a method of bonding without going through a complicated process is desirable.
  • the complex contains a labeling substance.
  • the manner in which the complex contains a labeling substance is not particularly limited.
  • the labeling substance may be bound to either or both of the scaffold compound and the antibody.
  • the labeling substance may be directly bonded to either or both of the scaffold compound or the antibody, or may be bonded via an organic molecular chain or the like.
  • a labeling substance refers to a substance involved in the generation of a signal used for detection.
  • the labeling substance may be a substance that spontaneously emits a signal, or may be a substance that indirectly generates a signal.
  • the type of labeling substance is not particularly limited, and known labeling substances such as electrochemiluminescent substances, enzymes, radioisotopes, chemiluminescent substances, fluorescent substances, and bioluminescent substances can be used without particular restriction.
  • labeling substance is an electrochemiluminescent substance
  • specific examples of the electrochemiluminescent substance include metal complexes such as ruthenium complexes and osmium complexes.
  • the molecular weight of the labeling substance is preferably smaller than the molecular weight of the antibody to which the labeling substance is bound. Specifically, the molecular weight of the labeling substance is preferably 150,000 or less, more preferably 10,000 or less, even more preferably 5,000 or less, and even more preferably 2,000 or less. Most preferred.
  • the labeling substance preferably has a size that does not create a steric hindrance when forming a complex with multiple antibodies.
  • the step of binding the antibody to the antigen in the method of the present disclosure includes the steps of binding the antigen to the first antibody, and the step of binding the second antibody to the antigen bound to the first antibody, and the step of binding the second antibody to the antigen bound to the first antibody, It may be included in a complex. That is, the method of the present disclosure may be a sandwich method.
  • the first antibody is preferably bound to an insoluble carrier.
  • the complex can be immobilized on the insoluble carrier via the first antibody and the antigen, and the signal emitted by the labeling substance contained in the complex can be efficiently detected. I can do it.
  • a method for detecting a signal emitted by a labeling substance can be selected depending on the type of labeling substance. For example, when the labeling substance is an electrochemiluminescent substance, a voltage is applied to the labeling substance to cause it to emit light through an electrochemical reaction, and the luminescence intensity is detected.
  • Examples of the form of the insoluble carrier to which the first antibody is bound include particles, immunoplates, membranes, etc., and can be selected depending on the method of performing immunological analysis.
  • the insoluble carrier is preferably particles, and more preferably magnetic particles (hereinafter also referred to as magnetic particles).
  • the average particle diameter can be selected, for example, from the range of 0.5 ⁇ m to 10 ⁇ m, preferably 1 ⁇ m to 5 ⁇ m, and more preferably 2.5 ⁇ m to 4 ⁇ m.
  • the above average particle diameter is the arithmetic mean value of the maximum diameters measured for 50 randomly selected particles by observing the particles with a scanning electron microscope or the like.
  • the insoluble carrier when the insoluble carrier is a magnetic particle, the insoluble carrier may be a particle made entirely of a magnetic material, or may be a particle partially made of a magnetic material. Examples of particles partially made of a magnetic material include particles having a core particle and a magnetic layer containing a magnetic material and covering the core particle.
  • the magnetic particles have core particles containing resin.
  • the type of resin is not particularly limited and can be selected from known resins.
  • Examples of the magnetic substance contained in the magnetic layer include metals and metal oxides having magnetism, such as metals corresponding to periods 4 to 6 and groups 8 to 10 in the periodic table, lanthanoids, iron oxide magnetic substances, etc. , can be selected without any particular restrictions.
  • the method of binding the first antibody to the magnetic particles is not particularly limited.
  • the first antibody may be bound via a functional group such as an epoxy group, an amino group, a mercapto group, a carboxy group, or an acid anhydride group arranged on the surface of the magnetic particles.
  • a functional group can be placed on the surface of the magnetic particles using a silane compound or the like.
  • the methods of the present disclosure may include steps other than binding the antibody to the antigen in the biological sample.
  • it may include a step of removing free antigens or antibodies in the biological sample.
  • the method of the present disclosure can be applied, for example, to testing a sample collected from a living body. Specifically, it can be applied to detecting or measuring the concentration of a substance to be tested (antigen) contained in a sample.
  • the type of sample collected from a living body is not particularly limited, and blood, serum, plasma, lymph fluid, urine, feces, ascites, pleural fluid, cerebrospinal fluid, etc. can be used.
  • the substance to be tested contained in the sample is not particularly limited as long as it can be an antigen.
  • the method of the present disclosure can achieve good detection sensitivity without using antibodies with high affinity for the antigen.
  • the method of the present disclosure can achieve good detection sensitivity even when the dissociation constant of the antibody for the antigen is 1.00 ⁇ 10 ⁇ 8 or more.
  • the dissociation constant of an antibody for an antigen is a value obtained by dividing the dissociation rate constant (Kd) by the association rate constant (Ka), and it can be determined that the smaller the dissociation constant, the higher the affinity of the antibody for the antigen.
  • the dissociation constant of an antibody for an antigen is measured by the method described in the Examples.
  • the timing of forming the antibody complex is not particularly limited as long as it is before the step of binding the antibody to the antigen.
  • the time at which the antibody complex is formed may or may not be sequential in time with the step of binding the antibody to the antigen.
  • An example of a case where the time of forming an antibody complex is not temporally continuous with the step of binding the antibody to an antigen is when the antibody is included in the complex during the reagent manufacturing stage.
  • the complex of the present disclosure is a complex that includes a structure in which a plurality of antibodies are bound via a scaffold compound and a labeling substance.
  • the complex of the present disclosure is used as an antibody in an immunological analysis method, good detection sensitivity can be obtained without using an antibody with high affinity for the antigen.
  • the method for producing a complex of the present disclosure includes a step of mixing an antibody bound to a compound capable of binding to a scaffold compound and a scaffold compound bound to a labeling substance, or a step of mixing an antibody bound to a compound capable of binding to a scaffold compound and a labeling substance bound to the scaffold compound.
  • the step includes mixing the antibody and the scaffold compound.
  • the compound capable of binding to the scaffold compound may be biotin, and the scaffold compound may be a biotin-binding protein. That is, the above method includes a step of mixing an antibody bound to biotin and a biotin-binding protein bound to a labeling substance, or a step of mixing an antibody bound to a labeling substance and biotin and a biotin-binding protein. It may be.
  • a complex in which a labeling substance is bound to a scaffold compound can be obtained, for example, by mixing an antibody bound to biotin and a biotin-binding protein as a scaffold compound bound to a labeling substance, and binding the biotin and the biotin-binding protein. You can get it by doing this.
  • a complex in which a labeling substance is bound to an antibody can be obtained, for example, by mixing an antibody to which a labeling substance and biotin are bound, and a biotin-binding protein as a scaffold compound, and then binding the biotin and the biotin-binding protein. be able to.
  • Binding of biotin or a labeling substance to an antibody or a biotin-binding protein can be carried out, for example, by attaching a functional group such as an NHS ester group or a sulfoNHS ester group bound to biotin or a labeling substance to the primary amino acid of the antibody or biotin-binding protein. It can be carried out by reacting with a group.
  • a functional group such as an NHS ester group or a sulfoNHS ester group bound to biotin or a labeling substance
  • the reagent for immunological analysis of the present disclosure includes the above-described complex of the present disclosure.
  • the reagent of the present disclosure is used as a reagent for an immunological analysis method, good detection sensitivity can be obtained without using an antibody with high affinity for the antigen.
  • the reagent of the present disclosure may be a combination (reagent kit) of a reagent containing the complex and a reagent containing other components.
  • reagents containing other components include calibrators, standard antigens, reagents containing antibody-binding beads, etc., sample dilution solutions, reaction solutions, BF washing solutions, luminescent electrolytes, and the like.
  • the reagent of the present disclosure may be used in the immunological analysis method of the present disclosure described above.
  • ⁇ Example 1> (Preparation of antibodies)
  • a mouse-derived anti-AFP monoclonal antibody (hereinafter referred to as the first antibody) which uses ⁇ -fetoprotein (AFP) as an antigen and reacts with AFP regardless of the presence or absence of sugar chains was prepared and used.
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • a rat-derived antibody that specifically reacts with AFP whose sugar chain has been cleaved with endoglycosidase F3 (Endo F3, EC3.2.1.96), which is a sugar chain-cleaving enzyme, was used.
  • Three types of AFP monoclonal antibodies (hereinafter referred to as second antibody A, second antibody B, and second antibody C) were produced and used.
  • the dissociation constant (KD) as an indicator of the affinity of the produced antibody for the antigen was measured using BIACORE T200 and BIACORE T200 Evaluation software (manufactured by Cytiva). HBS-EP buffer (manufactured by Cytiva) was used for the measurement, and the flow rate was 30 ⁇ L/min.
  • the dissociation rate constant and the association rate constant were determined by kinetic analysis of the 1:1 binding model, and KD (M) was calculated by dividing the dissociation rate constant by the association rate constant. The results are shown in Table 1.
  • the plate was washed three times with the same solution, and then 1 mL of the same solution was added to obtain a stock solution containing magnetic particles bound to the first antibody.
  • This stock solution was added to diluent A at a final concentration of 1.5 mg/mL to obtain a suspension of magnetic particles bound to the first antibody.
  • the concentration of the second antibody was determined from absorbance using a spectrophotometer.
  • the number of biotin bound to one antibody molecule was determined using Pierce Biotin Quantitation Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific). The results are shown in Table 2.
  • the absorbance at 455 nm was measured, and the number of bonds of the ruthenium complex to streptavidin was determined, assuming that the molar extinction coefficient of ruthenium was 13,700.
  • the number of ruthenium complexes bound per streptavidin molecule was 3.6.
  • Streptavidin bound to a ruthenium complex was added to diluted solution A at a final concentration of 25 ⁇ g/mL, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes to mix uniformly.
  • a second antibody bound to biotin was added at a final concentration of 5 ⁇ g/mL, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes to prepare a complex.
  • second antibody A bound to a biotin complex Three types were analyzed: second antibody A bound to a biotin complex, streptavidin bound to a ruthenium complex, and a mixture thereof.
  • the mixture was mixed so that the final concentration of streptavidin bound to a ruthenium complex was 1000 ⁇ g/mL and the final concentration of second antibody A bound to biotin was 200 ⁇ g/mL, and elution was performed. It was diluted appropriately with liquid.
  • a gel filtration marker kit manufactured by Oriental Yeast, molecular weight 12,400 to 290,000
  • a corresponds to second antibody A bound to biotin
  • b corresponds to streptavidin bound to a ruthenium complex
  • c corresponds to a mixture of these.
  • the dotted line in FIG. 1B indicates the peak of the molecular weight marker.
  • the molecular weights of the markers are 12,400, 32,000, 67,000, 142,000 and 290,000 in order from the right.
  • AFP antigen derived from the liver cancer cell line HepG2 (manufactured by Meridian) was added to an antigen dilution solution (50mM HEPES, 150mM NaCl, 10mM EDTA3Na, 1.0% BSA, 0.01% Tween20, 0.05% ProClin300, pH7.2). It was diluted and used as a measurement sample. The concentration of AFP was determined using Mutus Wako AFP-L3 manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries.
  • the antigen concentration of the sample used for each measurement was adjusted by adjusting the antigen concentration to 2000 ng/mL based on the measured value of Mutus Wako AFP-L3 and serially diluting it with an antigen diluent.
  • the blank sample was an antigen dilution solution.
  • Electrochemiluminescence analysis was performed using a fully automatic electrochemiluminescence immunoassay device Picolumi III (manufactured by Sekisui Medical). First, 10 ⁇ L of a measurement sample was dispensed into a reaction tube designated by the apparatus. Subsequently, a sample treatment solution (10mM MES, 0.1% BSA, 20 ⁇ g/mL Endo F3 (manufactured by GenScript), 0.05% ProClin300, pH 5.5) was added to the reaction tube, and the tube was allowed to stand at 37°C for 15 minutes. (Glycan cleavage treatment).
  • 25 ⁇ L of the magnetic particle suspension is dispensed into a reaction tube, and an antigen-antibody reaction is performed at 28° C. for about 4.8 minutes (first reaction).
  • BF separation is performed using a BF cleaning solution specified by the apparatus, and unreacted samples are removed.
  • 100 ⁇ L of the complex solution is added, and an antigen-antibody reaction is performed at 28° C. for about 3 minutes (second reaction: sandwich formation).
  • BF separation is performed using a BF washing solution specified by the device, and unreacted second antibody is removed.
  • the magnetic particles after the reaction were suspended in a substrate (tripropylamine) solution specified for the device, and electrochemiluminescence was generated at a predetermined location in the device.
  • Electrochemiluminescence immunoassay was performed in the same manner as in Example 1 except that a second antibody to which a ruthenium complex was directly bound was used instead of the complex.
  • the concentration of the second antibody was 2 ⁇ g/mL.
  • the concentration of the second antibody bound to the ruthenium complex was calculated using a BCA assay (Micro BCA protein assay, manufactured by Thermo Fisher Scientific). At the same time, the absorbance at 455 nm was measured, and the number of bonds of the ruthenium complex to one antibody molecule was determined, assuming that the molar extinction coefficient of ruthenium was 13,700. The results are shown in Table 3.
  • FIGS. 2 to 4 Graphs comparing the results of electrochemiluminescence immunoassay conducted in Example 1 and Comparative Example 1 are shown in FIGS. 2 to 4.
  • 2A and 2B are graphs showing the results when using second antibody A
  • FIGS. 3A and 3B are graphs showing the results when using second antibody B
  • FIGS. 4A and 4B are graphs showing the results when using second antibody B.
  • 2 is a graph showing the results when using Antibody C.
  • the solid line indicates Example 1 (with complex formation)
  • the dotted line indicates Comparative Example 1 (without complex formation).
  • Example 1 in which the analysis was conducted with the second antibody included in the complex, is different from Comparative Example 1, in which the analysis was conducted without the second antibody in the complex.
  • the detection sensitivity was higher compared to When second antibody A and second antibody B were used, in Comparative Example 1, no antigen concentration-dependent increase in counts was observed up to 30 ng/mL, and accurate measurement was not possible.
  • Example 1 a concentration-dependent increase in counts was confirmed from 1 ng/mL, and accurate measurements were possible.
  • second antibody C which has a smaller dissociation constant than second antibody A and second antibody B, was used, a concentration-dependent increase in counts from 1 ng/mL was confirmed in Comparative Example 1, but this value was lower than that in Example 1. It was about half of that.
  • Electrochemiluminescence was carried out in the same manner as in Example 1, except that the second antibody was reacted with the antigen in an unconjugated state (sandwich formation), and then the ruthenium complex was bound to the second antibody via streptavidin. Immunological analysis was performed.
  • a sample treatment solution (10mM MES, 0.1% BSA, 20 ⁇ g/mL Endo F3 (manufactured by GenScript), 0.05% ProClin300, pH 5.5) was added to the reaction tube, and the tube was allowed to stand at 37°C for 15 minutes. (Glycan cleavage treatment).
  • Comparative Example 2 in which a labeling substance was bound to the second antibody after binding to the antigen via streptavidin, was superior to Comparative Example 1, in which the second antibody was directly bound to a ruthenium complex.
  • the detection sensitivity was also low.
  • the specific count after blanking when the reaction molar ratio is 1:20 is the same as the value when the reaction molar ratio is 1:10 when the antigen concentration is low (1 ng/mL). It went below. It was also found that the S/N ratio was smaller when the reaction molar ratio was 1:20 than when the reaction molar ratio was 1:10, and the S/N ratio was worse.

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Abstract

抗体を抗原に結合させる工程を含み、前記抗体は、複数の抗体が足場化合物を介して結合した構造及び標識物質を含む複合体に含まれている、免疫学的分析方法。

Description

免疫学的分析方法、複合体、複合体の製造方法及び免疫学的分析用試薬
　本開示は、免疫学的分析方法、複合体、複合体の製造方法及び免疫学的分析用試薬に関する。
　生体試料の免疫学的分析方法として、発光物質等の標識物質を結合させた抗体を生体試料中の抗原に結合させ、標識物質が発するシグナルの検出結果に基づいて抗原の濃度を測定する手法が種々存在する。
　例えば、特許文献１にはビオチン・アビジン反応を利用して抗体に結合させた標識物質の発するシグナルを検出する免疫学的分析方法が記載されている。
特開２０１０－１０７２０７号公報
　抗原抗体反応を利用する免疫学的分析方法では、抗原に対する抗体の親和性が検出感度に影響する要因のひとつである。抗原に対する抗体の親和性が充分ではない場合は、抗原に結合した後に抗体が解離しやすく、必要な検出感度が得られない場合がある。
　また、抗原に対する抗体を複数組み合わせて免疫学的分析を行う場合には、抗原認識部位の位置なども測定可否、検出感度に影響する要因となっている。
　そこで本開示は、抗原に対して充分な親和性を持つ抗体を用いなくても良好な検出感度が得られる免疫学的分析方法、複合体、複合体の製造方法及び免疫学的分析試薬を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するための手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞抗体を抗原に結合させる工程を含み、前記抗体は、複数の抗体が足場化合物を介して結合した構造及び標識物質を含む複合体に含まれている、免疫学的分析方法。
＜２＞前記足場化合物はビオチン結合性タンパク質である、＜１＞に記載の免疫学的分析方法。
＜３＞前記足場化合物を介した結合が、ビオチンを介した結合である＜２＞に記載の免疫学的分析方法。
＜４＞前記抗体の前記抗原に対する解離定数が１．００×１０－８以上である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の免疫学的分析方法。
＜５＞前記抗体を抗原に結合させる工程は、第１抗体に抗原を結合させる工程と、第１抗体に結合した抗原に第２抗体を結合させる工程と、を含み、第２抗体が前記複合体に含まれている、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の免疫学的分析方法。
＜６＞電気化学発光免疫測定法である、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の免疫学的分析方法。
＜７＞複数の抗体が足場化合物を介して結合した構造及び標識物質を含む、複合体。
＜８＞足場化合物と結合しうる化合物が結合した抗体と標識物質が結合した足場化合物とを混合する工程、又は、足場化合物と結合しうる化合物及び標識物質が結合した抗体と足場化合物とを混合する工程を含む、＜７＞に記載の複合体の製造方法。
＜９＞＜７＞に記載の複合体を含む、免疫学的分析用試薬。
　本開示によれば、抗原に対して充分な親和性を持つ抗体を用いなくても良好な検出感度が得られる免疫学的分析方法、複合体、複合体の製造方法及び免疫学的分析試薬が提供される。
実施例で行ったゲルろ過ＨＰＬＣの結果を示すグラフである。 実施例で行ったゲルろ過ＨＰＬＣの結果を示すグラフである。 第２抗体Ａを使用したときの電気化学発光免疫測定結果（抗原濃度：０ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 第２抗体Ａを使用したときの電気化学発光免疫測定結果（抗原濃度：０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 第２抗体Ｂを使用したときの電気化学発光免疫測定結果（抗原濃度：０ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 第２抗体Ｂを使用したときの電気化学発光免疫測定結果（抗原濃度：０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 第２抗体Ｃを使用したときの電気化学発光免疫測定結果（抗原濃度：０ｎｇ／ｍＬ～２０００ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。 第２抗体Ｃを使用したときの電気化学発光免疫測定結果（抗原濃度：０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
　本開示において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
　本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値または下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値または下限値に置き換えてもよく、また、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
　本開示において、材料中の各成分の量は、材料中の各成分に該当する物質が複数存在する場合は、特に断らない限り、材料中に存在する複数の物質の合計量を意味する。
＜免疫学的分析方法＞
　本開示の免疫学的分析方法は、抗体を抗原に結合させる工程を含み、前記抗体は、複数の抗体が足場化合物を介して結合した構造及び標識物質を含む複合体に含まれている。
　本発明者らの検討の結果、抗原に結合させる抗体が上述したような複合体に含まれた状態であると、抗原に対し、高い親和性を持つ抗体を用いなくても良好な検出感度が得られることがわかった。その理由は、例えば、下記のように考えられる。
　抗原と結合している抗体が複合体に含まれた状態であると、抗原に結合している抗体の近傍に同じ複合体に含まれる別の抗体が存在する。このため、抗原に結合している抗体が解離しても、その抗体又は近傍の別の抗体が抗原に再結合する確率が、従来の抗体を単体で抗原に結合させる場合に比べて高い。この再結合性の高さが抗原に対する抗体の親和性が不充分な点を補い、検出感度の向上に寄与すると考えられる。
　本開示の方法によれば、高い親和性を持つ抗体を用いなくても良好な検出感度が得られることに加え、免疫学的分析方法を検討する際に、より多くの抗体の組み合わせを検討することができる。このため、例えば、免疫学的分析試薬の開発を効率的に進めることができる。
　本開示の免疫学的分析方法を実施する手法は、抗原抗体反応を利用して標識物質が発するシグナルを検出する手法であれば特に制限されない。
　具体的には、標識物質として電気化学発光物質を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、標識物質として酵素を利用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、標識物質として放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、標識物質として化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、標識物質として蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、標識物質として生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）等が挙げられる。
　これらの中でも、本開示の免疫学的分析方法は電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）により実施することが好ましい。
　本開示の免疫学的分析方法で使用する複合体は、複数の抗体が足場化合物を介して結合した構造を含む。かかる構造は、例えば、足場化合物として抗体と直接又は間接に結合しうる部位を複数持つものを使用し、足場化合物の前記部位を複数の抗体と結合させて作製することができる。
　足場化合物は生体由来の化合物であっても、合成して得られる化合物であってもよい。
　ある実施態様では、足場化合物はビオチン結合性タンパク質であってもよい。ビオチン結合性タンパク質は、ビオチンと結合する部位を分子中に４つ持つ。このため、足場化合物としてビオチン結合性タンパク質を用い、抗体としてビオチンを結合させた抗体を用いることで、複数の抗体がビオチン結合性タンパク質で架橋された状態の複合体が形成される。
　ビオチン結合性タンパク質としてはストレプトアビジン及びアビジンが挙げられ、これらの中でも非特異結合が少ないストレプトアビジンが好ましい。
　抗体と足場化合物の結合方法は、特に制限されない。例えば、ビオチン－アビジン法、物理吸着、水素結合を用いる方法、ファンデルワールス結合を用いる方法、架橋剤を用いる方法等が挙げられる。これらの中でも煩雑な工程を経ず、結合する方法が望ましい。
　複合体は、標識物質を含む。複合体に標識物質が含まれる態様は、特に制限されない。例えば、標識物質は足場化合物と抗体のいずれか又は両方に結合していてもよい。
　標識物質は、足場化合物又は抗体のいずれか又は両方と直接結合していても、有機分子鎖等を介して結合していてもよい。
　本開示において標識物質とは、検出に用いるシグナルの発生に関わる物質を意味する。標識物質は自発的にシグナルを発する物質であってもよく、間接的にシグナルを発生させる物質であってもよい。
　標識物質の種類は特に制限されず、電気化学発光物質、酵素、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光発光物質、生物発光物質等の公知の標識物質を特に制限なく使用できる。
　標識物質が電気化学発光物質である場合、電気化学発光物質として具体的にはルテニウム錯体、オスミウム錯体等の金属錯体が挙げられる。
　複合体の形成しやすさの観点からは、標識物質の分子量は、標識物質を結合させる抗体の分子量よりも小さいことが好ましい。具体的には、標識物質の分子量は１５０，０００以下であることが好ましく、１０，０００以下であることがより好ましく、５，０００以下であることがさらに好ましく、２，０００以下であることが最も好ましい。
　標識物質は、複数の抗体と複合体を形成するときに立体的に障害にならない大きさであることが好ましい。
　本開示の方法における抗体を抗原に結合させる工程は、第１抗体に抗原を結合させる工程と、第１抗体に結合した抗原に第２抗体を結合させる工程と、を含み、第２抗体が前記複合体に含まれているものであってもよい。すなわち、本開示の方法はサンドイッチ法であってもよい。
　検出感度の観点からは、第１抗体は、不溶性担体に結合した状態であることが好ましい。第１抗体が不溶性担体に結合した状態であると、第１抗体及び抗原を介して複合体を不溶性担体に固定することができ、複合体に含まれる標識物質の発するシグナルを効率よく検出することができる。
　標識物質の発するシグナルを検出する方法は、標識物質の種類に応じて選択できる。
　例えば、標識物質が電気化学発光物質である場合は、標識物質に電圧を印加して電気化学反応により発光させ、発光強度を検出する。
　第１の抗体が結合している不溶性担体の形態としては粒子、イムノプレート、メンブレン等が挙げられ、免疫学的分析を実施する手法に応じて選択できる。
　作業性の観点からは、不溶性担体は粒子であることが好ましく、磁性を有する粒子（以下、磁性粒子ともいう）であることがより好ましい。
　不溶性担体が粒子である場合の平均粒子径は、例えば、０．５μｍ～１０μｍの範囲から選択でき、好ましくは１μｍ～５μｍであり、より好ましくは２．５μｍ～４μｍである。上記平均粒子径は、粒子を走査型電子顕微鏡等で観察し、無作為に選択した５０個について測定した最大径の算術平均値である。
　不溶性担体が磁性粒子である場合、不溶性担体は全体が磁性体からなる粒子であっても、一部が磁性体からなる粒子であってもよい。一部が磁性体からなる粒子としては、コア粒子と、磁性体を含み、コア粒子を被覆する磁性層と、を有する粒子が挙げられる。
　磁性粒子の比重を小さくして測定試料中の分散性を高める観点からは、磁性粒子は樹脂を含むコア粒子を有することが好ましい。樹脂の種類は特に制限されず、公知の樹脂から選択できる。
　磁性層に含まれる磁性体としては、周期表における第４～６周期かつ第８～１０族に該当する金属、ランタノイド、酸化鉄系磁性体等の、磁性を有する金属及び金属酸化物が挙げられ、特に制限なく選択できる。
　磁性粒子に第１抗体を結合する方法は、特に制限されない。例えば、磁性粒子の表面に配置したエポキシ基、アミノ基、メルカプト基、カルボキシ基、酸無水物基等の官能基を介して第１抗体を結合させてもよい。磁性粒子の表面への官能基の配置は、シラン化合物等を用いて行うことができる。
　必要に応じ、本開示の方法は抗体を生体試料中の抗原に結合させる工程以外の工程を含んでもよい。
　例えば、生体試料中に遊離した状態の抗原又は抗体を除去する工程を含んでもよい。
　本開示の方法は、例えば、生体より採取した試料の検査に適用できる。具体的には、試料に含まれる検査対象物質（抗原）の検出又は濃度の測定に適用できる。
　生体より採取する試料の種類は特に制限されず、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、糞便、腹水、胸水、脳脊髄液等を使用できる。
　試料に含まれる検査対象物質は、抗原となりうる物質であれば特に制限されない。
　本開示の方法は、抗原に対し、高い親和性を持つ抗体を用いなくても良好な検出感度を達成できる。例えば、抗体の抗原に対する解離定数が１．００×１０－８以上である場合にも本開示の方法は良好な検出感度を達成できる。
　抗体の抗原に対する解離定数は、解離速度定数（Ｋｄ）を結合速度定数（Ｋａ）で割って得られる値であり、解離定数が小さいほど抗原に対する抗体の親和性が高いと判断できる。抗体の抗原に対する解離定数は、実施例に記載した方法で測定される。
　本開示の方法において、抗体の複合体を形成する時期は、抗体を抗原に結合させる工程の前であれば特に制限されない。
　例えば、抗体の複合体を形成する時期は、抗体を抗原に結合させる工程と時間的に連続していても連続していなくてもよい。
　抗体の複合体を形成する時期が抗体を抗原に結合させる工程と時間的に連続していない場合としては、試薬の製造段階で抗体を複合体に含まれた状態にする場合が挙げられる。
＜複合体及びその製造方法＞
　本開示の複合体は、複数の抗体が足場化合物を介して結合した構造及び標識物質を含む、複合体である。
　本開示の複合体を免疫学的分析方法の抗体として用いると、抗原に対し、高い親和性を持つ抗体を用いなくても良好な検出感度が得られる。
　本開示の複合体の詳細及び好ましい態様は、上述した本開示の方法で使用される複合体の詳細及び好ましい態様と同様である。
　本開示の複合体の製造方法は、足場化合物と結合しうる化合物が結合した抗体と標識物質が結合した足場化合物とを混合する工程、又は、足場化合物と結合しうる化合物及び標識物質が結合した抗体と足場化合物とを混合する工程を含む。
　上記方法において、足場化合物と結合し得る化合物はビオチンであってもよく、足場化合物はビオチン結合性タンパク質であってもよい。
　すなわち、上記方法は、ビオチンが結合した抗体と標識物質が結合したビオチン結合性タンパク質とを混合する工程、又は、標識物質及びビオチンが結合した抗体とビオチン結合性タンパク質とを混合する工程を含むものであってもよい。
　標識物質が足場化合物に結合した状態の複合体は、例えば、ビオチンが結合した抗体と、標識物質が結合した足場化合物としてのビオチン結合性タンパク質とを混合し、ビオチンとビオチン結合性タンパク質を結合させることで得ることができる。
　標識物質が抗体に結合した状態の複合体は、例えば、標識物質及びビオチンが結合した抗体と、足場化合物としてのビオチン結合性タンパク質とを混合し、ビオチンとビオチン結合性タンパク質を結合させることで得ることができる。
　ビオチン又は標識物質の抗体又はビオチン結合性タンパク質への結合は、例えば、ビオチン又は標識物質に結合させたＮＨＳエステル基、スルホＮＨＳエステル基等の官能基を抗体又はビオチン結合性タンパク質の第１級アミノ基と反応させて実施できる。
＜免疫学的分析用試薬＞
　本開示の免疫学的分析用試薬は、上述した本開示の複合体を含む。
　本開示の試薬を免疫学的分析方法の試薬として用いると、抗原に対し、高い親和性を持つ抗体を用いなくても良好な検出感度が得られる。
　本開示の試薬に含まれる複合体の詳細及び好ましい態様は、上述した本開示の方法で使用される複合体の詳細及び好ましい態様と同様である。
　本開示の試薬は、複合体を含む試薬と他の成分を含む試薬との組み合わせ（試薬キット）であってもよい。他の成分を含む試薬としては、キャリブレーター、標準抗原、抗体結合ビーズ等を含む試薬、検体希釈液、反応用溶液、ＢＦ洗浄液、発光電解液などが挙げられる。
　本開示の試薬は、上述した本開示の免疫学的分析方法に用いるものであってもよい。
　以下、実施例に基づいて本開示を説明するが、本開示はこれらの実施例に制限されるものではない。
＜実施例１＞
（抗体の作製）
　磁性粒子に結合させる抗体として、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）を抗原とし、糖鎖の有無にかかわらずＡＦＰに反応するマウス由来抗ＡＦＰモノクローナル抗体（以下、第１抗体という）を作製し、使用した。
　第１抗体に結合したＡＦＰに結合させる抗体として、糖鎖切断酵素であるＥｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ　Ｆ３（Ｅｎｄｏ　Ｆ３，ＥＣ３．２．１．９６）にて糖鎖を切断したＡＦＰに特異的に反応するラット由来抗ＡＦＰモノクローナル抗体３種（以下、第２抗体Ａ、第２抗体Ｂ及び第２抗体Ｃという）を作製し、使用した。
　作製した抗体の抗原に対する親和性の指標としての解離定数（ＫＤ）を、ＢＩＡＣＯＲＥ　Ｔ２００及びＢＩＡＣＯＲＥ　Ｔ２００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｗａｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ製）を用いて測定した。測定にはＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（Ｃｙｔｉｖａ製）を使用し、流速は３０μＬ／ｍｉｎとした。１：１　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｅｌのカイネティクス解析により解離速度定数と結合速度定数を求め、解離速度定数を結合速度定数で割ることでＫＤ（Ｍ）を算出した。結果を表１に示す。
（第１抗体の磁性粒子への結合）
　積水メディカル製の磁性粒子（平均粒子径３μｍ、樹脂製コア粒子が磁性層で被覆され、表面にエポキシ基をもつ）の分散液３０ｍｇを分取し、磁石を用いて磁性粒子を集磁して溶媒を除去した。次いで、ＰＢＳ－１（１４０ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４，１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．８）１ｍＬを磁性粒子に加えて混合攪拌し、磁性粒子を洗浄した。その後、再び磁石を用いて集磁して溶媒を除去した。ＰＢＳ－１で１ｍｇ／ｍＬに調製した第１抗体１ｍＬを、磁性粒子に添加し、回転ローターにて２５℃で７２時間回転攪拌した。その後、ＰＢＳ－１にて磁性粒子を３回洗浄した。
　希釈液Ａ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ３Ｎａ，２０％　Ｎ１０２（日油製），０．１％　ＢＳＡ，２００μｇ／ｍＬ　マウス由来ＩｇＧ，０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．０５％　ＰｒｏＣｌｉｎ３００，ｐＨ７．２）１ｍＬを磁性粒子に添加し、回転ローターにて２５℃で２４時間回転攪拌した。同液で３回洗浄し、次いで同液を１ｍＬ加えて、第１抗体が結合した磁性粒子を含む原液とした。この原液を、希釈液Ａに終濃度が１．５ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、第１抗体が結合した磁性粒子の懸濁液を得た。
（第２抗体へのビオチンの結合）
　第２抗体の濃度を２ｍｇ／ｍＬ（１３．３μＭ, ＰＢＳ－１で希釈）に調節し、モル比で第２抗体の２０倍量（２６７μＭ）のＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）と反応させた。反応は２５℃で３０分間行った。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で透析することにより、未反応のＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎを除去して、ビオチンが結合した第２抗体の溶液を得た。透析は４℃, １００倍量で２回行った。
　透析後、分光光度計を用いて吸光度より第２抗体の濃度を決定した。抗体１分子に結合したビオチンの数を、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｔｉｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて決定した。結果を表２に示す。
（ルテニウム錯体が結合したストレプトアビジンの作製）
　標識物質として、ビス（２，２’－ビピリジン）［４’－メチル－４－（４－ＮＨＳ－４－オキソブチル）－２，２’ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）ビス（ヘキサフルオロホスファート）（以下、ルテニウム錯体ＮＨＳという、東京化成製）を使用した。
　組み換え体ストレプトアビジン（富士フィルム和光純薬）をＰＢＳ－１に溶液置換した。溶液置換したストレプトアビジンに対して、ルテニウム錯体ＮＨＳをモル比で１：５となるように添加し、２５℃で３０分間静置して反応させた。２Ｍ グリシン溶液を６％（ｗ／ｗ）添加して２５℃で３０分間静置して、反応を停止させた。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で透析することにより、ルテニウム錯体結合グリシンを除去してルテニウム錯体が結合したストレプトアビジンの溶液を得た。透析は４℃, １００倍量で２回行った。
　ＢＣＡアッセイ（Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製)にてルテニウム標識ストレプトアビジンの濃度を測定した。同時に４５５ｎｍの吸光度を測定し、ルテニウムのモル吸光係数＝１３７００として、ストレプトアビジンに対するルテニウム錯体の結合数を決定した。ストレプトアビジン１分子あたりのルテニウム錯体の結合数は３．６個であった。
（複合体の作製）
　希釈液Ａに、終濃度が２５μｇ／ｍＬとなるようにルテニウム錯体が結合したストレプトアビジンを添加し、室温で５分間攪拌して均一に混合した。次いで、ビオチンが結合した第２抗体を終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で５分間攪拌して、複合体を作製した。
（ゲルろ過ＨＰＬＣ解析）
　ルテニウム錯体が結合したストレプトアビジンとビオチンが結合した第２抗体の混合により複合体が形成されることを確認するため、ゲルろ過ＨＰＬＣ解析を行った。
　分析には島津汎用ＨＰＬＣ　ＬＣ－２０Ａシリーズ（島津製作所製）にＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー製）を接続して使用し、溶離液の組成は２５ｍＭ　リン酸緩衝液，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．２として、流速は１ｍＬ／ｍｉｎに設定し、２８０ｎｍの吸光度で測定試料を検出した。
　分析対象は、ビオチン錯体を結合した第２抗体Ａ、ルテニウム錯体が結合したストレプトアビジン、これらの混合物の３種とした。
　混合物の調整は、検出量を増やすため、ルテニウム錯体が結合したストレプトアビジンの終濃度を１０００μｇ／ｍＬとし、ビオチンを結合した第２抗体Ａの終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるように混合し、溶離液で適宜希釈した。
　分子量確認のため、ゲルろ過マーカーキット（オリエンタル酵母製、分子量１２，４００～２９０，０００）を使用した。結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
　図１Ａ中のａはビオチンを結合した第２抗体Ａ、ｂはルテニウム錯体が結合したストレプトアビジン、ｃはこれらの混合物にそれぞれ相当する。
　図１Ｂ中の点線は分子量マーカーのピークを示す。マーカーの分子量は、右側から順に１２，４００、３２，０００、６７，０００、１４２，０００及び２９０，０００である。
　図１Ａ及び図１Ｂに示すように、第２抗体Ａ（分子量：約１５０，０００）がストレプトアビジン（分子量：約６０，０００）を介して結合してなる複合体に相当するピーク（使用したカラムで分離ができない画分、分子量＞５００，０００）が存在し、混合物に複合体が含まれることが確認された。
（測定試料の調製）
　肝癌細胞株ＨｅｐＧ２由来のＡＦＰ抗原（Ｍｅｒｉｄｉａｎ製）を、抗原希釈液（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ３Ｎａ，１．０％　ＢＳＡ，０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．０５％　ＰｒｏＣｌｉｎ３００，ｐＨ７．２）にて希釈し、測定試料とした。ＡＦＰの濃度は富士フィルム和光純薬のミュータスワコー ＡＦＰ－Ｌ３にて決定した。ミュータスワコー ＡＦＰ－Ｌ３の測定値をもとに抗原濃度を２０００ｎｇ／ｍＬに調節し、抗原希釈液で段階希釈することで、各測定に使用する試料の抗原濃度を調節した。ブランク試料は抗原希釈液とした。
（電気化学発光免疫分析）
　全自動電気化学発光免疫装置ピコルミＩＩＩ（積水メディカル製）を用いて電気化学発光分析を行った。
　まず、装置指定の反応管に測定試料１０μＬを分注した。続いて試料処理液（１０ｍＭ　ＭＥＳ，０．１％　ＢＳＡ，２０μｇ／ｍＬ　Ｅｎｄｏ　Ｆ３（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ製），０．０５％　ＰｒｏＣｌｉｎ３００，ｐＨ５．５）を反応管に添加し、３７℃で１５分間静置した（糖鎖切断処理）。
　測定装置の所定の場所に、装置指定の容器に入れた第１抗体が結合した磁性粒子の懸濁液と、複合体の溶液をそれぞれセットした。糖鎖切断処理が完了した測定試料を装置指定の場所にセットして、測定をスタートさせた。
　測定では、磁性粒子懸濁液２５μＬが反応管に分注され、２８℃で約４．８分間、抗原抗体反応を行われる（第１反応）。次に、装置指定のＢＦ洗浄液でＢＦ分離が行われ、未反応の試料が除去される。次に、複合体の溶液が１００μＬ投入され、２８℃で約３分間の抗原抗体反応が行われる（第２反応：サンドイッチ形成）。その後、装置指定のＢＦ洗浄液でＢＦ分離が行われ、未反応の第２抗体が除去される。
　反応後の磁性粒子を装置指定の基質（トリプロピルアミン）溶液に懸濁し、装置所定の場所にて電気化学発光を生じさせた。
＜比較例１＞
　複合体の代わりに、ルテニウム錯体を直接結合した第２抗体を使用したこと以外は実施例１と同様にして、電気化学発光免疫分析を行った。第２抗体の濃度は２μｇ／ｍＬとした。
（ルテニウム錯体の第２抗体への結合）
　第２抗体をＰＢＳ－１に溶液置換し、２ｍｇ／ｍＬとなるように濃度を調節した。ルテニウム錯体ＮＨＳを、第２抗体とのモル比が１：１０となるように添加し、２５℃で３０分間静置して反応させた。２Ｍ　グリシン溶液を６％（ｗ／ｗ）となるように添加し、２５℃で３０分間静置して、反応を停止させた。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で透析することによりルテニウム錯体が結合したグリシンを除去して、ルテニウム錯体が結合した第２抗体の溶液を得た。
　ＢＣＡアッセイ（Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にて、ルテニウム錯体を結合した第２抗体の濃度を算出した。同時に４５５ｎｍの吸光度を測定し、ルテニウムのモル吸光係数＝１３７００として、抗体１分子に対するルテニウム錯体の結合数を決定した。結果を表３に示す。
　実施例１と比較例１で実施した電気化学発光免疫分析の結果を比較したグラフを図２～４に示す。
　図２Ａ及び図２Ｂは第２抗体Ａを使用したときの結果を示すグラフであり、図３Ａ及び図３Ｂは第２抗体Ｂを使用したときの結果を示すグラフであり、図４Ａ及び４Ｂは第２抗体Ｃを使用したときの結果を示すグラフである。
　各図において、実線は実施例１（複合体形成あり）を示し、点線は比較例１（複合体形成なし）を示す。
　図２～４に示すように、第２抗体が複合体に含まれた状態で分析を実施した実施例１は第２抗体が複合体に含まれていない状態で分析を実施した比較例１に比べて検出感度が高かった。
　第２抗体Ａ及び第２抗体Ｂを使用した場合、比較例１は、３０ｎｇ／ｍＬまで抗原濃度依存的なカウント上昇がみられず、正確な測定ができていなかった。一方、実施例１は、１ｎｇ／ｍＬから濃度依存的なカウント上昇が確認され、正確な測定ができていた。
　解離定数が第２抗体Ａ及び第２抗体Ｂよりも小さい第２抗体Ｃを使用した場合、比較例１でも１ｎｇ／ｍＬから濃度依存的なカウント上昇が確認されたが、その値は実施例１の半分程度であった。
＜比較例２＞
　第２抗体を複合体化しない状態で抗原と反応させ（サンドイッチ形成）、その後にルテニウム錯体をストレプトアビジンを介して第２抗体に結合させたこと以外は実施例１と同様にして、電気化学発光免疫分析を行った。
　装置指定の反応管に測定試料３０μＬを分注した。続いて試料処理液（１０ｍＭ　ＭＥＳ，０．１％　ＢＳＡ，２０μｇ／ｍＬ　Ｅｎｄｏ　Ｆ３（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ製），０．０５％　ＰｒｏＣｌｉｎ３００，ｐＨ５．５）を反応管に添加し、３７℃で１５分間静置した（糖鎖切断処理）。測定装置の所定の場所に、装置指定の容器に入れた第１抗体が結合した磁性粒子の懸濁液と、２０μｇ／ｍＬのルテニウム錯体を結合したストレプトアビジン溶液（溶媒は希釈液Ａ）をセットした。
　糖鎖切断処理が完了した測定試料に、２５μｇ／ｍＬのビオチンが結合した第２抗体Ａの溶液（溶媒は希釈液Ａ）を２５μＬ添加して、装置指定の場所にセットして測定をスタートさせた。
　測定では、スタートから１．２分間、抗原と第２抗体とを反応させる（第１反応）。次いで、磁性粒子懸濁液２５μＬが反応管に分注され、２８℃で約４．８分間、抗原と第１抗体とを反応させる（第２反応、サンドイッチ形成）。次いで、装置指定のＢＦ洗浄液でＢＦ分離が行われ、未反応の抗原及び第２抗体が除去される。次いで、ルテニウム標識ストレプトアビジン溶液が１００μＬ投入され、２８℃で約３分間、第２抗体に結合したビオチンとストレプトアビジンの結合反応が行われる（第３反応）。次いで、装置指定のＢＦ洗浄液でＢＦ分離が行われ、未反応のルテニウム標識ストレプトアビジンが除去される。
　生成された複合体を装置指定の基質（トリプロピルアミン）溶液に懸濁し、装置所定の場所にて電気化学発光を生じさせた。第２抗体として第２抗体Ａを使用したときの結果を表４に示す。表４の各抗原濃度に示したカウントは、測定より得られたカウントからブランクカウントを差し引いたカウント（特異カウント）である。表中の「ブランクカウント」は抗原濃度が０ｎｇ／ｍＬのときの測定値である。
　表４に示すように、抗原と結合した後の第２抗体にストレプトアビジンを介して標識物質を結合させた比較例２は、ルテニウム錯体を直接結合させた第２抗体を使用した比較例１よりも検出感度が低かった。
＜比較例３＞
　比較例１に記載した方法で、ルテニウム錯体を結合した第２抗体の濃度を変化させて（５μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬ）測定試料を調製した。第２抗体としては第２抗体Ｂを使用した。
　調製した測定試料を用いて、比較例１と同様にして電気化学発光免疫分析を行った。結果を表５に示す。表中の「ブランク引き後」はカウントからブランクカウントを差し引いて得られる特異カウント値であり、「Ｓ／Ｎ比」はカウントをブランクカウントで除して得られる値である。
　表５に示すように、ブランク引き後の特異カウントは第２抗体の濃度を変化させても大きく変化せず、ブランクカウントのみが上昇した。またＳ／Ｎ比は第２抗体濃度が高くなるほど数値が小さくなり、Ｓ／Ｎ比が悪化することがわかった。
＜比較例４＞
　比較例１に記載した方法で、第２抗体に対するルテニウム錯体の結合数を変化させて測定試料を調製した。具体的には、第２抗体とルテニウム錯体ＮＨＳの反応モル比を１：１０又は１：２０とした。抗体１分子に対するルテニウム錯体の結合数は６．４個又は１０．２個であった。第２抗体としては第２抗体Ｂを使用した。
　調製した測定試料を用いて、比較例１と同様にして電気化学発光免疫分析を行った。第２抗体の濃度は５μｇ／ｍＬで固定した。結果を表６に示す。
　表６に示すように、反応モル比を１：２０としたときのブランク引き後の特異カウントは、抗原濃度が低い（１ｎｇ／ｍＬ）ときに反応モル比を１：１０としたときの値を下回った。またＳ／Ｎ比は、反応モル比を１：２０としたときの方が反応モル比を１：１０としたときよりも数値が小さくなり、Ｓ／Ｎ比が悪化することがわかった。
　比較例１と実施例１の結果から、第２抗体が複合体に含まれた状態であることは、免疫学的分析の検出感度の向上に寄与することがわかった。また、第２抗体の抗原に対する親和性が充分でなくても検出感度の向上効果が得られることがわかった。
　比較例２～４の結果から、抗原に結合した後の第２抗体に標識物質を結合すること、測定試料中の第２抗体の濃度を増やすこと、及び第２抗体に対する標識物質の結合数を増やすことは、免疫学的分析の検出感度の向上に大きく寄与しないことがわかった。この理由としては、比較例２～４で検討した方策では抗体の抗原に対する親和性の低さが充分に補われないことが考えられる。
　日本国特許出願第２０２２－０５０８００号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。

Claims (9)

  1. 　抗体を抗原に結合させる工程を含み、前記抗体は、複数の抗体が足場化合物を介して結合した構造及び標識物質を含む複合体に含まれている、免疫学的分析方法。
  2. 　前記足場化合物はビオチン結合性タンパク質である、請求項１に記載の免疫学的分析方法。
  3. 　前記足場化合物を介した結合が、ビオチンを介した結合である請求項２に記載の免疫学的分析方法。
  4. 　前記抗体の前記抗原に対する解離定数が１．００×１０－８以上である、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の免疫学的分析方法。
  5. 　前記抗体を抗原に結合させる工程は、第１抗体に抗原を結合させる工程と、第１抗体に結合した抗原に第２抗体を結合させる工程と、を含み、第２抗体が前記複合体に含まれている、請求項１に記載の免疫学的分析方法。
  6. 　電気化学発光免疫測定法である、請求項１に記載の免疫学的分析方法。
  7. 　複数の抗体が足場化合物を介して結合した構造及び標識物質を含む、複合体。
  8. 　足場化合物と結合しうる化合物が結合した抗体と標識物質が結合した足場化合物とを混合する工程、又は、足場化合物と結合しうる化合物及び標識物質が結合した抗体と足場化合物とを混合する工程を含む、請求項７に記載の複合体の製造方法。
  9. 　請求項７に記載の複合体を含む、免疫学的分析用試薬。
     
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