WO2023190300A1 - 生産物の生産方法、及び生産物 - Google Patents

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cells
culture solution
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淳史 稲田
弘 作山
直人 高橋
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Fujifilm Corp
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a product, which includes culturing cells so as to satisfy predetermined conditions during the product production period after reaching a target viable cell density.
  • the invention further relates to a product produced by the production method described above.
  • Cell culture is carried out for the purpose of increasing the number of cells with useful properties, making the cells produce products, and so on.
  • U.S. Pat. (iii) maintaining the perfusion culture at a second perfusion rate until the bispecific antibody product concentration in the bioreactor is , a method for producing a bispecific antibody product is described that includes a step of being kept below a threshold value.
  • US Pat. No. 5,001,000 describes an integrated continuous method for manufacturing a therapeutic protein drug substance, comprising: (i) a liquid culture medium containing a substantially cell-free recombinant therapeutic protein; supplying a liquid culture medium to be fed into a first multi-column chromatography system (MCCS1); (ii) using MCCS1 to capture the recombinant therapeutic protein in the liquid culture medium; (iii) the eluate of MCCS1 containing MCCS2 is continuously fed into a second multi-column chromatography system (MCCS2); A method is described that includes purifying and polishing the protein to be a therapeutic protein drug substance.
  • MCCS1 multi-column chromatography system
  • US Pat. No. 5,001,002 describes a method for controlling the perfusion rate of a perfusion bioreactor, comprising: a) measuring the viable cell density of cells growing in culture using a biomass capacitance probe; and b) A method is described that includes dynamically adjusting a target perfusion rate to take into account viable cell density, wherein cells grow to high cell density during perfusion.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a product by cell culture that can reduce the amount of mannose 5-modified antibody in the product. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a product produced by the above method.
  • the present inventors found that by culturing cells so as to satisfy predetermined conditions during the product production period after reaching the target viable cell density, The inventors have discovered that the above problems can be solved, and have completed the present invention.
  • a method for producing a product comprising culturing cells in a culture container,
  • the above culture is a perfusion culture method
  • formulas (1) to (5) are satisfied,
  • the variation in VCD during the production period is ⁇ 20% or less with respect to the average viable cell density during the production period
  • the variation in VCV during the production period is ⁇ 20% or less with respect to the average value of VCV during the production period, How products are produced.
  • Gln-C indicates the glutamine concentration [mmol/L] in the culture solution
  • Gluc-C indicates the glucose concentration [g/L] in the culture solution
  • NH4-C indicates the ammonia concentration [mmol/L] in the culture solution
  • VCD indicates viable cell density [ ⁇ 10 6 cells/mL]
  • VCV indicates VCD ⁇ /6 ⁇ Cd 3 [ ⁇ 10 6 ⁇ m 3 /mL]
  • Cd indicates the average diameter [ ⁇ m] of living cells.
  • ⁇ 2> Production of the product according to ⁇ 1>, wherein the culture solution is bled so that the variation in VCD during the production period is ⁇ 20% or less with respect to the average viable cell density during the production period.
  • Method. ⁇ 3> The method for producing a product according to ⁇ 2>, wherein in the bleeding, the culture solution is bled while the capacitance of the culture solution is measured in-line.
  • ⁇ 5> The production according to ⁇ 3> or ⁇ 4>, wherein the variation in the capacitance of the culture solution measured in-line is ⁇ 20% or less with respect to the average value of capacitance during the production period. How things are produced.
  • the above bleeding is (i) Setting a target capacitance; (ii) setting a weight control value for the culture vessel; (iii) Measuring the capacitance of the culture medium at a cycle of 0.1 seconds or less; (iv) When the capacitance of the culture solution exceeds the above target, the pump that withdraws the culture solution should be operated at a speed of 0.3 vvd to 3 vvd (where vvd is the volume of the culture solution drawn/the volume of the culture solution).
  • the method for producing the product according to any one of ⁇ 3> to ⁇ 5> comprising: ⁇ 7> The method for producing the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, which satisfies formula (6) during the production period.
  • LDH indicates the concentration of lactate dehydrogenase in the culture solution [U/L]
  • VCD indicates viable cell density [ ⁇ 10 6 cells/mL].
  • ⁇ 8> The method for producing the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the cells are animal cells.
  • ⁇ 9> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the cells are cells that produce proteins.
  • the cell is a cell that produces an antibody.
  • ⁇ 11> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein the cells are CHO cells.
  • ⁇ 12> A product produced by the method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>.
  • the amount of mannose 5 in the product can be reduced.
  • FIG. 1 shows a cell culture device.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the change in VCV in Example 1.
  • FIG. 3 shows the results of measuring changes in capacitance data (also referred to as Cp) in Example 1.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the change in the mannose 5 ratio in Example 1.
  • a numerical range indicated using “ ⁇ ” means a range that includes the numerical values listed before and after “ ⁇ " as the minimum and maximum values, respectively.
  • the method for producing a product of the present invention includes culturing cells in a culture container, the culture is a perfusion culture method, and during the production period of the product after reaching a target viable cell density, the formula ( 1) to (5) are satisfied, the variation in VCD during the production period is ⁇ 20% or less with respect to the average viable cell density during the production period, and the variation in VCV during the production period is within the range of VCV during the production period.
  • the method for producing a product of the present invention can reduce the amount of mannose 5-modified antibody in the product by satisfying the above conditions.
  • Gln-C indicates the glutamine concentration [mmol/L] in the culture solution
  • Gluc-C indicates the glucose concentration [g/L] in the culture solution
  • NH4-C indicates the ammonia concentration [mmol/L] in the culture solution
  • VCD indicates viable cell density [ ⁇ 10 6 cells/mL]
  • VCV indicates VCD ⁇ /6 ⁇ Cd 3 [ ⁇ 10 6 ⁇ m 3 /mL]
  • Cd indicates the average diameter [ ⁇ m] of living cells.
  • Preferred embodiments of formula (1) are the following formulas (1A) and (1B). 0.1 ⁇ Gln-C ⁇ 2.0 Formula (1A) 0.2 ⁇ Gln-C ⁇ 1.5 Formula (1B)
  • Preferred embodiments of formula (2) are the following formulas (2A) and (2B). 1.0 ⁇ Gluc-C ⁇ 6.0 Formula (2A) 1.5 ⁇ Gluc-C ⁇ 5.0 Formula (2B)
  • Preferred embodiments of formula (3) are the following formulas (3A) and (3B). 1.5 ⁇ NH4-C ⁇ 7.0 Formula (3A) 2.0 ⁇ NH4-C ⁇ 6.0 Formula (3B)
  • Preferred embodiments of formula (4) are the following formulas (4A) and (4B). 80 ⁇ VCD ⁇ 250 Formula (4A) 100 ⁇ VCD ⁇ 220 Formula (4B)
  • Preferred embodiments of formula (5) are the following formulas (5A) and (5B). 0.8 ⁇ 10 5 ⁇ VCV ⁇ 3.0 ⁇ 10 5 formula (5A) 1.0 ⁇ 10 5 ⁇ VCV ⁇ 2.5 ⁇ 10 5 formula (5B)
  • the variation in VCD during the production period is less than ⁇ 20% relative to the average viable cell density during the production period, but more preferably, the variation in VCD during the production period is less than ⁇ 20% relative to the average viable cell density during the production period.
  • the variation in VCD during the production period is ⁇ 15% or less, more preferably the variation in VCD during the production period is ⁇ 12% or less with respect to the average viable cell density during the production period, and particularly preferably the variation in VCD during the production period is ⁇ 8% or less of the average viable cell density in the cell.
  • the lower limit of the variation in VCD during the production period is not particularly limited and may be 0% or more, but when daily fluctuations in cell proliferation are taken into account, variations of 0.1% or more actually occur.
  • the variation in VCV during the production period is ⁇ 20% or less with respect to the average value of VCV during the production period, more preferably ⁇ 15% or less with respect to the average value of VCV during the production period, More preferably, it is ⁇ 12% or less with respect to the average value of VCV during the production period, and particularly preferably, it is ⁇ 8% or less with respect to the average value of VCV during the production period.
  • the lower limit of the variation in VCV during the production period is not particularly limited and may be 0% or more, but when daily fluctuations in cell proliferation are taken into account, variations of 0.1% or more actually occur.
  • the concentration of glutamine in the culture solution [mmol/L], represented by Gln-C, can be measured using the filtrate after removing the culture solution from the culture container and removing cells by filtration. Measurement of glutamine concentration in the filtrate can be performed using a commercially available analyzer such as Nova biomedical's Bioprofile FLEX2.
  • the frequency of measurement of glutamine concentration is not particularly limited, but can be performed, for example, once a day.
  • the glucose concentration [g/L] in the culture medium, indicated by Gluc-C, can be measured by extracting the culture medium from the culture container and removing cells by filtration, using the filtrate. Measurement of glucose concentration in the filtrate can be performed using a commercially available analyzer such as Nova biomedical's Bioprofile FLEX2.
  • the frequency of measurement of glucose concentration is not particularly limited, but can be performed, for example, once a day.
  • the ammonia concentration [mmol/L] in the culture solution can be measured by removing the culture solution from the culture container and removing cells by filtration using the filtrate. Measuring the ammonia concentration in the filtrate can be performed using a commercially available analyzer such as Nova biomedical's Bioprofile FLEX2.
  • the frequency of measurement of ammonia concentration is not particularly limited, but can be performed, for example, once a day.
  • VCD viable cell density [ ⁇ 10 6 cells/mL] indicated by VCD can be measured by a conventional method by extracting the culture solution from the culture container.
  • VCD ⁇ /6 ⁇ Cd 3 [ ⁇ 10 6 ⁇ m 3 /mL] is further calculated as VCV.
  • Cd indicates the average diameter [ ⁇ m] of living cells.
  • the density of living cells and the average diameter of living cells can be measured using a commercially available measurement device such as Beckman Coulter's Cell Viability Analyzer Vi-cell XR, and as an example, the Vi-cell software is Vi-cell XR2. 04, the parameters at the time of measurement are Min diameter set to 6 ⁇ m and Max diameter set to 50 ⁇ m. Furthermore, measurement parameters can be set as follows. Cell brightness: 85% Cell sharpness: 100 Viable cell spot brightness: 75% Viable cell spot area: 5% Minimum circularity: 0 Decluster degree: Medium
  • sample used for measurement may be used without being diluted, or the sample may be used after dilution.
  • the frequency of measuring the density of living cells and the average diameter of living cells is not particularly limited, but can be performed, for example, once a day.
  • the variation in VCD during the production period is the variation rate (percentage) that indicates how much the VCD value measured during the production period fluctuated relative to the average value of VCD during the production period, that is, the average viable cell density.
  • the average value of VCD during the production period is determined by extracting the culture solution from the culture tank every day during the production period and measuring the VCD value using Beckman Coulter's Cell Viability Analyzer Vi-cell XR etc. It can be determined by adding up the number of days and dividing it by the number of culture days during the production period.
  • the fluctuation in VCV during the production period is a fluctuation rate (percentage) indicating how much the VCV value measured during the production period fluctuates with respect to the average value of VCV during the production period.
  • the culture solution can be bled so that the variation in VCD during the production period is ⁇ 20% or less with respect to the average viable cell density during the production period.
  • Bleeding means removing a portion of the culture medium along with the cells to reduce the density of living cells during culture so that the density of living cells does not become excessive.
  • fresh medium can be added in the same amount as the removed culture medium.
  • the variation in VCD during the production period is less than ⁇ 15% relative to the average viable cell density during the production period, and even more preferably, the variation in VCD during the production period is less than or equal to the average viable cell density during the production period.
  • the variation in VCD during the production period is preferably ⁇ 8% or less with respect to the average viable cell density during the production period.
  • the lower limit of the variation in VCD during the production period is not particularly limited and may be 0% or more, but when daily fluctuations in cell proliferation are taken into account, variations of 0.1% or more actually occur.
  • Bleeding can be carried out as long as the culture solution containing cells can be removed from the culture container, and the method is not particularly limited.
  • piping for draining the culture solution is installed in the culture solution.
  • the culture solution can be inserted and drained from the culture vessel through the above-mentioned piping.
  • the culture solution may be bled while the capacitance of the culture solution is measured in-line.
  • In-line measurement refers to measuring some kind of measurement value that indicates the state of the culture solution while culturing cells.
  • a capacitance sensor may be inserted into the culture solution, and the capacitance of the culture solution may be measured in-line while culturing.
  • bleeding may be automatically controlled.
  • Automatically controlling means automatically controlling the start and stop of bleeding based on some kind of measured value indicating the state of some kind of culture solution.
  • the start and stop of bleeding can be automatically controlled based on the measured value of the capacitance of the culture solution.
  • bleeding may be performed so that the variation in the capacitance of the culture solution measured in-line is within ⁇ 20% of the average value of capacitance during the production period.
  • the fluctuation in the capacitance of the culture solution measured in-line is more preferably ⁇ 15% or less with respect to the average value of capacitance during the production period, and even more preferably, the variation in capacitance during the production period is It is ⁇ 12% or less with respect to the average value, particularly preferably ⁇ 8% or less with respect to the average value of capacitance during the production period.
  • the lower limit of the variation in capacitance of the culture solution is not particularly limited and may be 0% or more, but when daily fluctuations in cell proliferation are taken into account, variations of 0.1% or more actually occur.
  • An example of breeding is (i) Setting a target capacitance; (ii) setting a weight control value for the culture vessel; (iii) Measuring the capacitance of the culture medium at a cycle of 0.1 seconds or less; (iv) When the capacitance of the culture solution exceeds the above target, operate the pump that draws out the culture solution at a speed of 0.3 vvd to 3 vvd (where vvd is the volume of the culture solution drawn/the volume of the culture solution). (means volume/day); (v) Automatically supplying the culture medium to the culture container while measuring the mass of the culture solution so that the variation in the volume of the culture solution is within 10%; and (vi) The capacitance of the culture solution is adjusted to the above target. If it falls below 0.01% or more, stop the pump that draws out the culture solution. It can be carried out by a process including.
  • formula (6) is satisfied during the production period.
  • LDH indicates the concentration of lactate dehydrogenase in the culture solution [U/L]
  • VCD indicates viable cell density [ ⁇ 10 6 cells/mL].
  • formula (6) More preferred embodiments of formula (6) are the following formulas (6A) and (6B). 2 ⁇ LDH/VCD ⁇ 35 Formula (6A) 2 ⁇ LDH/VCD ⁇ 30 Formula (6B)
  • the concentration of lactate dehydrogenase in the culture solution [U/L], represented by LDH, can be measured using the filtrate after removing the culture solution from the culture container and removing cells by filtration. Measuring the concentration of lactate dehydrogenase in the filtrate can be performed using a commercially available analyzer such as Roche's Cedex Bio. Although the frequency of measuring the concentration of lactate dehydrogenase is not particularly limited, it can be performed, for example, once a day.
  • FIG. 1 shows an example of a cell culture device that can be used in culturing cells in the present invention.
  • a culture container 10 is a container containing a culture solution containing cells. Cells are cultured in a culture solution inside the culture container 10.
  • Oxygen and air are sent from the sparger air supply piping 1, and the oxygen and air are introduced into the culture solution through the sparger 11 with a pore diameter of 20 ⁇ m.
  • the sparger 11 allows the dissolved oxygen concentration in the culture solution to be adjusted.
  • the sparger is not particularly limited, but for example, a sparger that has a gas release portion with an average pore diameter of 1 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less and that releases a gas containing 30 volume % or more of oxygen can be used.
  • Air and carbon dioxide are introduced from the air supply pipe 2 to the top of the culture solution inside the culture container.
  • a culture medium is supplied from the culture medium supply pipe 3 to the culture container.
  • the culture medium supply pipe 3 is provided with a culture medium supply pump 15 .
  • the exhaust pipe 4 is a pipe for exhausting air, and an exhaust filter 5 is connected to the end thereof.
  • the sampling tube 6 is a pipe for collecting (sampling) the culture solution.
  • the bleeding pipe 7 is a pipe for extracting (bleeding) the culture solution.
  • a capacitance sensor 8 is mounted so as to be in contact with the culture solution in the culture container.
  • a dissolved oxygen sensor 9 is mounted so as to be in contact with the culture solution in the culture container.
  • a stirring member having stirring blades 12 may be provided inside the culture container 10. By rotating the stirring blade 12, the culture solution inside the culture container 10 is stirred, and the homogeneity of the culture solution is maintained. When the culture solution is stirred by the stirring blade 12, the bubbles released by the sparger are also stirred.
  • the position of the stirring member having the stirring blade, the size of the stirring blade, etc. are not particularly limited, and are designed depending on the cell type used, the amount of culture solution, the amount of oxygen to be supplied, the position, number, size of the sparger, etc. do it. Further, in order to quickly stir the bubbles coming out of the sparger and to suppress coalescence of the bubbles, it is preferable that the stirring blade 12 be arranged at a position close to the sparger.
  • a perfusion device 13 is connected to the bottom of the culture container 10. Further, the culture solution inside the culture container 10 passes through a perfusion device 13 , and the permeate containing cell products is taken out from the culture container 10 by a delivery pump 16 . The flow of permeate is indicated by arrow 14.
  • the viable cell density of the culture solution is preferably 50 ⁇ 10 6 to 300 ⁇ 10 6 cells/mL, more preferably 80 ⁇ 10 6 to 250 ⁇ 10 6 cells/mL, and 100 ⁇ 10 6 to 250 ⁇ 10 6 cells/mL. More preferably, it is ⁇ 10 6 to 220 ⁇ 10 6 cells/mL. It is sometimes written as M instead of 106 .
  • the cell suspension extracted from the culture container may be passed through a separation membrane to be separated into a cell-containing liquid and a permeated liquid.
  • This operation can be performed using a perfusion device.
  • the cell suspension extracted from the culture container is divided into a cell-containing liquid having a higher cell density than the cell suspension and a permeate liquid having a lower cell density than the cell suspension. Separated.
  • Cell density can be measured using Vi-CELL XR, a live and dead cell analyzer manufactured by Beckman Coulter.
  • the above membrane separation treatment step is preferably tangential filtration, more preferably Alternating tangential flow (ATF) or tangential flow, and most preferably Alternating tangential flow.
  • ATF Alternating tangential flow
  • filters that can perform alternating tangential flow include SuATF10-S02PES and F2 RF02PES manufactured by Repligen.
  • a medium used for normal animal cell culture a medium used for normal animal cell culture can be used.
  • CD OptiCHO manufactured by ThermoFisher
  • Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM
  • Eagle's minimum essential medium MEM
  • RPMI-1640 medium RPMI-1641 medium
  • F-12K medium Ham's F12 medium
  • Iscobb's modified Dulbecco's medium a medium used for normal animal cell culture.
  • IMDM IMDM
  • McCoy 5A medium McCoy 5A medium
  • Leibovitz L-15 medium EX-CELL 300 series
  • EX-CELL 300 series JRH Biosciences
  • CHO-S-SFMII Invitrogen
  • CHO-SF Sigma-Aldrich
  • CD-CHO Invitrogen
  • IS CHO-V Irvine Scientific
  • PF-ACF-CHO Sigma-Aldrich
  • Serum such as fetal calf serum (FCS) may or may not be added to the medium.
  • the medium may be supplemented with additional components such as amino acids, salts, sugars, vitamins, hormones, growth factors, buffers, antibiotics, lipids, trace elements, hydrolysates of plant proteins, etc. Protein-free media can also be used.
  • the pH of the medium varies depending on the cells to be cultured, but is generally pH 6.0 to 8.0, preferably pH 6.4 to 7.6, and more preferably pH 6.7 to 7.4.
  • the culture temperature is generally 30°C to 40°C, preferably 32°C to 39°C, more preferably 36°C to 38°C, and the culture temperature may be changed during culture. Cultivation can be carried out in an atmosphere with a CO 2 concentration of 0 to 40% by volume, preferably 2 to 25% by volume, and more preferably 3 to 20% by volume.
  • the amount of culture solution is preferably 1 L or more, more preferably 50 L or more, and even more preferably 200 L or more.
  • the culture period is not particularly limited, but is generally from 12 hours to 90 days, preferably from 1 day to 80 days, more preferably from 1 day to less than 70 days, and even more preferably from 5 days to 65 days. It is particularly preferably 7 days or more and less than 60 days. In the present invention, the culture period is preferably 14 days or longer.
  • the stirring rotation speed is not particularly limited, but the stirring power per unit volume is generally 10 to 300 kW/m 3 , preferably 20 to 200 kW/m 3 , and more preferably. is 30 to 100kW/ m3 .
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution can be set as appropriate and is not particularly limited, but generally it is 20 to 150% when the saturated dissolved oxygen concentration in a 37°C solution in 1 atm air is taken as 100%. , preferably 30 to 120%, more preferably 50 to 100%.
  • Cell culture can be performed using a cell culture device having the configuration described above in this specification.
  • Cell culture devices include fermenter type tank culture device, air lift type culture device, culture flask type culture device, spinner flask type culture device, microcarrier type culture device, fluidized bed type culture device, holofiber type culture device, roller Either a bottle type culture device or a filled tank type culture device may be used.
  • the culture container is preferably a single-use culture tank from the viewpoint of homogenizing the culture environment.
  • the cell culture device may be a single-use culture tank from the viewpoint of homogenizing the culture environment.
  • the viscosity of the culture solution is preferably 1.2 mPa ⁇ s or more and less than 15 mPa ⁇ s, more preferably 1.4 mPa ⁇ s or more and less than 12 mPa ⁇ s, particularly preferably 1.6 mPa ⁇ s or more and less than 10 mPa ⁇ s. It is.
  • a pH adjuster may be added during culturing.
  • the daily amount of the pH adjuster added to the culture tank is preferably 8 mmol/day/L or less, more preferably 7 mmol/day/L or less.
  • the pH adjuster is not particularly limited, but is preferably an aqueous Na 2 CO 3 solution, an aqueous NaOH solution or an aqueous NaHCO 3 solution, more preferably an aqueous NaHCO 3 solution.
  • the pH adjuster may be added alone or mixed with the medium or antifoaming agent. In order to avoid local pH fluctuations in the culture medium due to the addition of the pH adjuster, it is preferable to add the pH adjuster mixed with the culture medium.
  • the method of culturing cells is perfusion culture.
  • Perfusion culture is a culture method in which fresh medium is added and used medium is removed at the same time. With perfusion culture, it is generally possible to achieve high viable cell densities.
  • a typical perfusion culture begins with a batch culture startup lasting one or two days, followed by continuous, stepwise, and/or intermittent addition of fresh feed medium to the culture and simultaneous removal of spent medium. do.
  • methods such as sedimentation, centrifugation or filtration can be used to remove spent medium while maintaining viable cell density.
  • the advantage of perfusion culture is that the culture in which the protein of interest is produced is maintained for a longer period of time than in batch or fed-batch culture methods.
  • Perfusion may be continuous, stepwise, intermittent, or a combination thereof. Preferably, it has a continuous form.
  • the animal cells may be maintained in culture and the spent medium that is removed may be substantially free of cells or have far fewer cells than the culture. Products expressed by cell culture can be retained or recovered in culture by selection of membrane pore size.
  • the number of days for perfusion culture is preferably 5 days or more and 150 days or less, more preferably 10 days or more and 100 days or less, and even more preferably 20 days or more and 90 days or less. It is preferable to culture for 5 days or more because the number of cells obtained increases, and when the cells produce a product, the amount of product produced increases. It is preferable to limit the number of days of culture to 150 days or less from the viewpoint of preventing clogging of the filtration membrane used in perfusion culture and preventing contamination.
  • the perfusion ratio is not particularly limited, but is generally 0.3vvd to 5.0vvd, preferably 0.5vvd to 3.0vvd, and more preferably 0.8vvd to 2.5vvd.
  • VVD in the perfusion ratio means volume of culture solution withdrawn/volume of culture solution in culture container/day.
  • the perfusion ratio referred to here is the same as "(iv) When the capacitance of the culture solution exceeds the above target, the pump that withdraws the culture solution should be operated at a speed of 0.3vvd to 3vvd" in an example of bleeding. are different parameters.
  • the culture solution can usually be removed from the culture container using a pump, but other available liquid feeding means may also be used.
  • the culture solution extracted from the culture container is subjected to treatments such as recovery of products and removal of dead cells.
  • the culture fluid extracted from the culture container may be partially discarded or returned to the culture container after processing such as collecting products and removing dead cells. If medium loss occurs due to the above treatment, it can be compensated for by, for example, supplying fresh medium to the culture container.
  • the types of cells in the present invention are not particularly limited, but include animal cells, plant cells, eukaryotic cells such as yeast, prokaryotic cells such as Bacillus subtilis, and Escherichia coli.
  • the cells are preferably animal cells (more preferably mammalian cells) or insect cells, most preferably mammalian cells.
  • the cells may be primary cells or established cell lines.
  • Examples of cells include Chinese hamster ovary (CHO) cells, HEK cells (Human Embryonic Kidney-derived cells), BHK cells, 293 cells, C127 cells, myeloma cells (NS0 cells, etc.), PerC6 cells, SP2/0 cells, hybridoma cells, Examples include COS cells (African green monkey kidney-derived cells), 3T3 cells, HeLa cells, Vero cells (African green monkey kidney epithelial cells), MDCK cells (canine kidney tubular epithelial cell-derived cells), PC12 cells, WI38 cells, etc. .
  • the cells may be stem cells, such as embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • CHO cells HEK cells, BHK cells, and hybridomas are preferred, CHO cells and HEK cells are more preferred, and CHO cells are most preferred.
  • CHO cells are widely used for the production of recombinant proteins such as cytokines, clotting factors, and antibodies. It is preferable to use CHO cells deficient in dihydrofolate reductase (DHFR), and as the DHFR deficient CHO cells, for example, CHO-DG44 can be used.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the cell survival rate is preferably higher, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, particularly preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • These cells may be cells into which a foreign gene encoding a protein (for example, an antibody, etc.) to be expressed is introduced.
  • the cells are preferably cells that produce antibodies.
  • Expression vectors can be used to introduce foreign genes encoding proteins to be expressed into cells.
  • the protein to be expressed is encoded by introducing into cells an expression vector containing DNA encoding the protein to be expressed, an expression control sequence (e.g., enhancer, promoter, terminator, etc.), and optionally a selection marker gene. Cells into which foreign genes have been introduced can be produced. There are no particular limitations on the expression vector, and it can be appropriately selected and used depending on the cell type, purpose, etc.
  • any promoter can be used as long as it can function in mammalian cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrovirus promoter metallothionein promoter
  • heat shock promoter SR ⁇ promoter
  • Moloney murine leukemia virus promoter SR ⁇ promoter
  • Moloney murine leukemia virus promoter SR ⁇ promoter
  • Moloney murine leukemia virus promoter Moloney murine leukemia virus promoter.
  • enhancer of the human CMV IE gene may be used together with the promoter.
  • selectable marker genes include drug resistance genes (neomycin resistance gene, DHFR gene, puromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, hygromycin resistance gene, cycloheximide resistance gene), or fluorescent genes (encoding green fluorescent protein GFP, etc.). Genes that can be used for this purpose can be used.
  • the method for introducing the expression vector into cells is not particularly limited, and for example, the calcium phosphate method, electroporation method, liposome method, gene gun method, lipofection method, etc. can be used.
  • the method for producing a product according to the present invention includes culturing cells using a cell culture device and producing a product from the cells. According to the present invention, there is provided a product produced by the method for producing a product according to the present invention.
  • the type of product is not particularly limited, but preferably a recombinant protein.
  • Products include, for example, recombinant polypeptide chains, recombinant secreted polypeptide chains, antigen-binding proteins, antibodies (e.g., human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, mouse antibodies, bispecific antibodies, etc.), Fc fusion proteins, fragments. Examples include immunized immunoglobulins, single chain antibodies (scFv), and the like.
  • adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, etc. may also be used.
  • the product is preferably an antibody, more preferably a human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, or mouse antibody.
  • Fragmented immune immunoglobulins include Fab, F(ab')2, Fv, and the like.
  • the class of the antibody is also not particularly limited, and may be any class such as IgG such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, IgA, IgD, IgE, and IgM, but IgG and IgM are preferred when used as a medicine.
  • Human antibodies include all antibodies that have one or more variable and constant regions derived from human immunoglobulin sequences. In one embodiment, all variable and constant domains are derived from human immunoglobulin sequences (fully human antibody).
  • Humanized antibodies are designed such that when administered to a human subject, humanized antibodies are less likely to elicit an immune response and/or induce a severe immune response compared to non-human species antibodies. has a sequence that differs from that of an antibody derived from a non-human species by one or more amino acid substitutions, deletions, and/or additions such that the antibody has a lower sequence.
  • certain amino acids within the heavy and/or light chain framework and constant domains of a non-human species antibody are mutated to produce a humanized antibody.
  • a constant domain from a human antibody is fused to a variable domain of a non-human species.
  • a chimeric antibody is an antibody in which a variable region and a constant region of different origins are linked.
  • an antibody consisting of the heavy chain and light chain variable regions of a mouse antibody and the heavy and light chain constant regions of a human antibody is a mouse-human heterologous chimeric antibody.
  • a recombinant vector that expresses a chimeric antibody can be created by linking the DNA encoding the variable region of a mouse antibody with the DNA encoding the constant region of a human antibody and incorporating this into an expression vector. By culturing recombinant cells transformed with the above vector and expressing the integrated DNA, chimeric antibodies produced during the culture can be obtained.
  • Bispecific antibodies are antibodies that recognize two different antigen specificities. Bispecific antibodies exist in various forms. Bispecific antibodies can be produced by linking two immunoglobulin molecules using a cross-linking agent such as N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithiol) propionate or S-acetylmercaptosuccinic acid anhydride. Several methods have been reported, including a method in which Fab fragments of immunoglobulin molecules are linked together. Furthermore, expression can also be achieved by introducing a gene encoding a bispecific antibody into cells.
  • a cross-linking agent such as N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithiol) propionate or S-acetylmercaptosuccinic acid anhydride.
  • Fc fusion protein refers to a protein having an Fc region, and includes antibodies.
  • Fabs are monovalent fragments with VL, VH, CL and CH1 domains.
  • F(ab')2 is a bivalent fragment with two Fab fragments connected by a disulfide bridge in the hinge region.
  • Fv fragments have the single-armed VL and VH domains of an antibody.
  • a single chain antibody (scFv) is an antibody in which the VL and VH regions are joined via a linker (e.g., a synthetic sequence of amino acid residues) to form a continuous protein chain, where the linker is long enough to fold onto itself to form a monovalent antigen binding site.
  • Antibodies include, but are not particularly limited to, anti-IL-6 receptor antibodies, anti-IL-6 antibodies, anti-glypican-3 antibodies, anti-CD3 antibodies, anti-CD20 antibodies, anti-GPIIb/IIIa antibodies, anti-TNF antibodies, and anti-CD25 antibodies.
  • Antibodies include anti-EGFR antibodies, anti-Her2/neu antibodies, anti-RSV antibodies, anti-CD33 antibodies, anti-CD52 antibodies, anti-IgE antibodies, anti-CD11a antibodies, anti-VEGF antibodies, and anti-VLA4 antibodies.
  • the product may be collected by simply collecting the culture solution, or by collecting a liquid obtained by removing at least a portion of the cells from the culture solution using, for example, a filter or a centrifuge, and known methods may be used. Can be used without any particular restrictions. If it is desired to improve the purity of the product, change the solvent or change the form, for example into a powder, the culture solution or the liquid described above can be subjected to further processing.
  • a portion of the culture solution may be collected during perfusion, or a filter or centrifuge may be used to remove at least a portion of the cells from the culture solution during perfusion. It is also possible to collect
  • the product can be purified by purification treatment.
  • the resulting product can be purified to high purity.
  • the product may be separated and purified using conventional separation and purification methods used for proteins. For example, by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. can be separated and purified, but is not limited to these.
  • the concentration of the product obtained above can be measured by absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or the like.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the product is an antibody
  • the antibody titer can also be measured with a commercially available analytical instrument such as Roche's Cedex Bio.
  • chromatography examples include protein A columns and protein G columns.
  • chromatography other than affinity chromatography examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reversed phase chromatography, and adsorption chromatography. These chromatography can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC (high performance liquid chromatography) or FPLC (fast protein liquid chromatography). I can.
  • the product can be modified or peptides can be partially removed by treating the product with an appropriate polypeptide modification enzyme before or after purification.
  • polypeptide-modifying enzymes used include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, and glucosidase.
  • the products produced according to the present invention can be used, for example, in biopharmaceuticals, regenerative medicine, and the like.
  • a vector containing a nucleic acid sequence encoding IgG1 was constructed, and the constructed vector was introduced into CHO-DG44 cells to produce CHO-DG44 cells (IgG1 cells) that express IgG1. Construction of the vector and introduction into cells were performed according to Example 2 of Japanese Translated Patent Publication No. 2016-517691. CHO cells producing monoclonal antibodies were prepared as described above and used in the following experiments.
  • the cell culture solution was continuously filtered using ATF2 manufactured by Repligen while the culture medium was continuously supplied at a perfusion ratio of 0.8 vvd, and a recovered solution was collected. Furthermore, on the 5th day, the perfusion ratio was changed to 1.5vvd. Thereafter, when the cell density reached 120 ⁇ 10 6 cells/mL, cell bleeding was performed while withdrawing a portion of the culture medium so that the cell density was maintained at 120 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • the culture conditions (medium, cell bleed conditions, etc.) used at this time were set as shown in Table 1, and Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 and 2 were carried out.
  • the media A to C listed in Table 1 are commercially available media to which glutamine and glucose are added in the amounts listed in Table 1. Thereafter, the culture was continued for 10 days or more, and the evaluation described below was performed.
  • 500 L culture put 500 L of culture medium into the culture tank Hypeforma 500 manufactured by Themo Fisher, set the stirring rotation speed to 150 rpm, and set the upper surface air to 4.75 L/min + CO 2 0.25 L/min.
  • the culture was carried out under the same conditions as the 1.3L culture except that ATF10 manufactured by Repligen was used.
  • ⁇ Automatic cell bleed control method When cell bleed was performed under automatic control, cell bleed was continuously performed automatically while monitoring the capacitance of the culture solution using a FUTURA sensor manufactured by ABER. Specifically, the following method was used. (1) Set the target capacitance. (2) Set the weight control value of the culture tank. (3) Measure the capacitance of the culture solution at a cycle of 0.1 seconds or less. (4) When the capacitance of the culture solution exceeds the target, operate the pump that draws out the culture solution at a speed of 0.3vvd to 3vvd. (5) The culture medium is automatically supplied into the culture tank while measuring the weight of the culture tank so that the volume of the culture solution is kept approximately constant. (6) When the capacitance of the culture solution falls below the target by 0.01% or more, stop the pump that draws out the culture solution.
  • ⁇ Measurement and evaluation method> Measurement of viable cell density, average diameter of living cells, and viability
  • the culture solution in the culture tank was taken out and measured using Cell Viability Analyzer Vi-cell XR manufactured by Beckman Coulter. Note that the Vi-cell software used was Vi-cell XR2.04, and the parameters at the time of measurement were set as follows. Min diameter: 6 ⁇ m Max diameter: 50 ⁇ m Dilution: When the cell density was 100 ⁇ 10 5 cells/mL or less, the sample was not diluted, and the measurement was performed at a dilution of 1. When the cell density was 100 ⁇ 10 5 cells/mL or more, the sample was diluted 10 times, and the measurement was performed at a dilution of 10.
  • Mannose 5 of antibodies was evaluated as an evaluation standard for Examples and Comparative Examples.
  • the N-type sugar chain profile containing mannose 5 was measured by the following method.
  • the antibody in the obtained antibody recovery solution was digested with peptide-N-glycosidase F to cut out the N-type sugar chain. Thereafter, the excised sugar chain was fluorescently labeled with 2-aminopyridine, and mannose 5 was quantitatively analyzed by reverse-phase HPLC (high performance liquid chromatography) to calculate the peak of mannose 5 relative to the total peak area.
  • the case where the mannose 5 was less than 4% was evaluated as A
  • the case where it was between 4 and 7% was evaluated as B
  • the case where it exceeded 7% was evaluated as C.

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Abstract

本発明の課題は、細胞培養による生産物の生産方法において、生産物におけるマンノース５の量を低減することができる方法、並びに上記方法により生産される生産物を提供することである。本発明によれば、培養容器内で細胞を培養することを含む生産物の生産方法であって、灌流培養方式であり、目標生細胞密度に到達後の生産物の生産期間において、式（１）～（５）を満たし、生産期間中のＶＣＤの変動が、生産期間中の平均生細胞密度に対して±２０％以下であり、生産期間中のＶＣＶの変動が、生産期間中のＶＣＶの平均値に対して±２０％以下である方法が提供される。 ０≦Ｇｌｎ－Ｃ≦２．５　式（１） ０．５≦Ｇｌｕｃ－Ｃ≦８．０　式（２） １．０≦ＮＨ４－Ｃ≦８．０　式（３） ５０≦ＶＣＤ≦３００　式（４） ０．６×１０５≦　ＶＣＶ≦４．０×１０５　式（５） 式中の記号の意味は本明細書に定義した通りである。

Description

生産物の生産方法、及び生産物
　本発明は、目標となる生細胞密度に到達した後の生産物の生産期間において所定の条件を満たすようにして細胞を培養することを含む、生産物の生産方法に関する。本発明はさらに、上記した生産方法により生産される生産物に関する。
　細胞の培養は、有用な性質を有する細胞を増加させるため、細胞に生産物を生産させるため等の目的で行われている。
　例えば、特許文献１には、（ｉ）灌流バイオリアクター中に二重特異性抗体製品を発現することができる少なくとも１つの哺乳動物細胞を供給する工程、（ｉｉ）設定値の生細胞密度に達するまで、第１の灌流量で哺乳動物細胞培養物を増殖させる工程、及び（ｉｉｉ）第２の灌流量で灌流培養を維持する工程であって、バイオリアクター中の二重特異性抗体製品濃度が、閾値未満に保たれる工程を含む、二重特異性抗体製品の生産方法が記載されている。
　特許文献２には、治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法であって、（ｉ） 実質的に細胞を含有しない組換え治療用タンパク質を含む液体培養培地を、液体培養培地が第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に送り込まれるように供給すること；（ｉｉ）ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換え治療用タンパク質が捕獲し、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液が第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に送り込まれること；ならびに、（ｉｉｉ） ＭＣＣＳ２を用いて組換え治療用タンパク質を、ＭＣＣＳ２から出てくる溶出液が治療用タンパク質原薬であるように、精製およびポリッシュすることを含む方法が記載されている。
　特許文献３には、灌流バイオリアクターの灌流速度を制御する方法であって、ａ）バイオマス静電容量プローブを使用して培養において増殖している細胞の生細胞密度を測定すること、およびｂ）生細胞密度を考慮して目標灌流速度を動的に調整することを含み、細胞が灌流の間に高細胞密度まで増殖する、方法が記載されている。
特表２０２１－５０５１８２号公報 特開２０２０－０３３３６４号公報 特表２０２０－５３３９８３号公報
　細胞培養により生産される抗体のうち、糖鎖部分が５つのマンノースで糖鎖修飾された抗体（マンノース５修飾抗体）は薬効が不十分であるため、医薬品の薬効を高めるという観点からマンノース５の量を低減することが求められている。一方、精製工程によりマンノース５修飾抗体を分離及び除去することは難しく、培養工程において細胞からのマンノース５修飾抗体の産生を抑えることが望ましい。本発明は、細胞培養による生産物の生産方法において、生産物におけるマンノース５修飾抗体の量を低減することができる方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに、本発明は、上記方法により生産される生産物を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、目標となる生細胞密度に到達した後の生産物の生産期間において所定の条件を満たすようにして細胞を培養することによって、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　培養容器内で細胞を培養することを含む、生産物の生産方法であって、
上記培養が灌流培養方式であり、
目標となる生細胞密度に到達した後の生産物の生産期間において、式（１）～（５）を満たし、
上記生産期間中のＶＣＤの変動が、上記生産期間中の平均生細胞密度に対して±２０％以下であり、
上記生産期間中のＶＣＶの変動が、上記生産期間中のＶＣＶの平均値に対して±２０％以下である、
生産物の生産方法。
０≦Ｇｌｎ－Ｃ≦２．５　　　　　　式（１）
０．５≦Ｇｌｕｃ－Ｃ≦８．０　　　式（２）
１．０≦ＮＨ４－Ｃ≦８．０　　　　式（３）
５０≦ＶＣＤ≦３００　　　　　　　式（４）
０．６×１０５≦ＶＣＶ≦４．０×１０５　式（５）
式中、
Ｇｌｎ－Ｃは、培養液中のグルタミン濃度［ｍｍоｌ／Ｌ］を示し、
Ｇｌｕｃ－Ｃは、培養液中のグルコース濃度［ｇ／Ｌ］を示し、
ＮＨ４－Ｃは、培養液中のアンモニア濃度［ｍｍоｌ／Ｌ］を示し、
ＶＣＤは、生細胞密度［×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］を示し、
ＶＣＶは、ＶＣＤ×π／６×Ｃｄ３［×１０６μｍ３／ｍＬ］を示し、
Ｃｄは、生細胞の平均径［μｍ］を示す。
＜２＞　上記生産期間中のＶＣＤの変動が、上記生産期間中の平均生細胞密度に対して±２０％以下となるように、培養液をブリーディングする、＜１＞に記載の生産物の生産方法。
＜３＞　上記ブリーディングにおいて、培養液の静電容量をインライン計測しながら培養液をブリーディングする、＜２＞に記載の生産物の生産方法。
＜４＞　上記ブリーディングが自動で制御されている、＜３＞に記載の生産物の生産方法。
＜５＞　上記インライン計測される培養液の静電容量の変動が、上記生産期間中の静電容量の平均値に対して±２０％以下である、＜３＞又は＜４＞に記載の生産物の生産方法。
＜６＞　上記ブリーディングが、
（ｉ）ターゲットとなる静電容量を設定すること；
（ｉｉ）培養容器の重量制御値を設定すること；
（ｉｉｉ）培養液の静電容量を０．１秒以下の周期で測定すること；
（ｉｖ）培養液の静電容量が上記ターゲットを越えたら、培養液を引き抜くポンプが０．３ｖｖｄ～３ｖｖｄの速度で運転すること（ここで、ｖｖｄは、引き抜かれる培養液の体積/ 培養液の体積/ｄａｙを意味する）；
（ｖ）培養液の液量の変動が１０％以内になるよう、培養液の質量を測定しながら、培養容器に培地を自動供給すること；および
（ｖｉ）培養液の静電容量が上記ターゲットを０．０１％以上下回ったら、培養液を引き抜くポンプを停止すること、
を含む、＜３＞から＜５＞の何れか一に記載の生産物の生産方法。
＜７＞　上記生産期間において、式（６）を満たす、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載の生産物の生産方法。
２≦ＬＤＨ／ＶＣＤ≦４０　　式（６）
式中、ＬＤＨは、培養液中の乳酸脱水素酵素の濃度［Ｕ／Ｌ］を示し、
ＶＣＤは、生細胞密度［×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］を示す。
＜８＞　細胞が動物細胞である、＜１＞から＜７＞のいずれか一に記載の生産物の生産方法。
＜９＞　細胞が、タンパク質を産生する細胞である、＜１＞から＜８＞のいずれか一に記載の生産物の生産方法。
＜１０＞　細胞が、抗体を産生する細胞である、＜１＞から＜９＞のいずれか一に記載の生産物の生産方法。
＜１１＞　細胞が、ＣＨＯ細胞である、＜１＞から＜１０＞のいずれか一に記載の生産物の生産方法。
＜１２＞　＜１＞から＜１１＞のいずれか一に記載の生産物の生産方法により生産される生産物。
　本発明によれば、細胞培養による生産物の生産方法において、生産物におけるマンノース５量を低減することができる。
図１は、細胞培養装置を示す。 図２は、実施例１におけるＶＣＶの推移を測定した結果を示す。 図３は、実施例１における静電容量データ（Ｃｐとも表記する）の推移を測定した結果を示す。 図４は、実施例１におけるマンノース５比率の推移を測定した結果を示す。
　以下において、本発明の内容について詳細に説明する。本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
　本発明の生産物の生産方法は、培養容器内で細胞を培養することを含み、培養が灌流培養方式であり、目標となる生細胞密度に到達した後の生産物の生産期間において、式（１）～（５）を満たし、生産期間中のＶＣＤの変動が、生産期間中の平均生細胞密度に対して±２０％以下であり、生産期間中のＶＣＶの変動が、生産期間中のＶＣＶの平均値に対して±２０％以下である方法である。本発明の生産物の生産方法は、上記の条件を満たすことにより、生産物におけるマンノース５修飾抗体量を低減することができる。
０≦Ｇｌｎ－Ｃ≦２．５　　　　　　式（１）
０．５≦Ｇｌｕｃ－Ｃ≦８．０　　　式（２）
１．０≦ＮＨ４－Ｃ≦８．０　　　　式（３）
５０≦ＶＣＤ≦３００　　　　　　　式（４）
０．６×１０５≦ＶＣＶ≦４．０×１０５　式（５）
式中、
Ｇｌｎ－Ｃは、培養液中のグルタミン濃度［ｍｍоｌ／Ｌ］を示し、
Ｇｌｕｃ－Ｃは、培養液中のグルコース濃度［ｇ／Ｌ］を示し、
ＮＨ４－Ｃは、培養液中のアンモニア濃度［ｍｍоｌ／Ｌ］を示し、
ＶＣＤは、生細胞密度［×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］を示し、
ＶＣＶは、ＶＣＤ×π／６×Ｃｄ３［×１０６μｍ３／ｍＬ］を示し、
Ｃｄは、生細胞の平均径［μｍ］を示す。
　式（１）について、好ましい態様としては、以下の式（１Ａ）および（１Ｂ）である。
　０．１≦Ｇｌｎ－Ｃ≦２．０　　　　式（１Ａ）
　０．２≦Ｇｌｎ－Ｃ≦１．５　　　　式（１Ｂ）
　式（２）について、好ましい態様としては、以下の式（２Ａ）および（２Ｂ）である。
　１．０≦Ｇｌｕｃ－Ｃ≦６．０　　　式（２Ａ）
　１．５≦Ｇｌｕｃ－Ｃ≦５．０　　　式（２Ｂ）
　式（３）について、好ましい態様としては、以下の式（３Ａ）および（３Ｂ）である。
　１．５≦ＮＨ４－Ｃ≦７．０　　　　式（３Ａ）
　２．０≦ＮＨ４－Ｃ≦６．０　　　　式（３Ｂ）
　式（４）について、好ましい態様としては、以下の式（４Ａ）および（４Ｂ）である。
　８０≦ＶＣＤ≦２５０　　　　　　　式（４Ａ）
　１００≦ＶＣＤ≦２２０　　　　　　式（４Ｂ）
　式（５）について、好ましい態様としては、以下の式（５Ａ）および（５Ｂ）である。
　０．８×１０５≦ＶＣＶ≦３．０×１０５　　式（５Ａ）
　１．０×１０５≦ＶＣＶ≦２．５×１０５　　式（５Ｂ）
　生産期間中のＶＣＤの変動は、生産期間中の平均生細胞密度に対して±２０％以下であるが、より好ましくは、生産期間中のＶＣＤの変動は生産期間中の平均生細胞密度に対して±１５％以下であり、さらに好ましくは生産期間中のＶＣＤの変動は生産期間中の平均生細胞密度に対して±１２％以下であり、特に好ましくは生産期間中のＶＣＤの変動は生産期間中の平均生細胞密度に対して±８％以下である。生産期間中のＶＣＤの変動の下限は特に限定されず、０％以上であればよいが、日々の細胞増殖の変動を考慮すると実質０．１％以上の変動は生じる。
　生産期間中のＶＣＶの変動は、生産期間中のＶＣＶの平均値に対して±２０％以下であるが、より好ましくは、生産期間中のＶＣＶの平均値に対して±１５％以下であり、さらに好ましくは、生産期間中のＶＣＶの平均値に対して±１２％以下であり、特に好ましくは、生産期間中のＶＣＶの平均値に対して±８％以下である。生産期間中のＶＣＶの変動の下限は特に限定されず、０％以上であればよいが、日々の細胞増殖の変動を考慮すると実質０．１％以上の変動は生じる。
　Ｇｌｎ－Ｃで示される培養液中のグルタミン濃度［ｍｍоｌ／Ｌ］は、培養中の培養液を培養容器から抜き取り、細胞を濾過により除去した後の濾液を用いて測定することができる。濾液におけるグルタミン濃度の測定は、Ｎｏｖａ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅ　ＦＬＥＸ２などの市販の分析装置を用いて行うことができる。グルタミン濃度の測定の頻度は特に限定されないが、例えば、１日１回行うことができる。
　Ｇｌｕｃ－Ｃで示される培養液中のグルコース濃度［ｇ／Ｌ］は、培養中の培養液を培養容器から抜き取り、細胞を濾過により除去した後の濾液を用いて測定することができる。濾液におけるグルコース濃度の測定は、Ｎｏｖａ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅ　ＦＬＥＸ２などの市販の分析装置を用いて行うことができる。グルコース濃度の測定の頻度は特に限定されないが、例えば、１日１回行うことができる。
　ＮＨ４－Ｃで示される培養液中のアンモニア濃度［ｍｍоｌ／Ｌ］は、培養中の培養液を培養容器から抜き取り、細胞を濾過により除去した後の濾液を用いて測定することができる。濾液におけるアンモニア濃度の測定は、Ｎｏｖａ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅ　ＦＬＥＸ２などの市販の分析装置を用いて行うことができる。アンモニア濃度の測定の頻度は特に限定されないが、例えば、１日１回行うことができる。
　ＶＣＤで示される生細胞密度［×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］は、培養中の培養液を培養容器から抜き取り、常法により測定することができる。本発明においてはさらに、ＶＣＶとして、ＶＣＤ×π／６×Ｃｄ３［×１０６μｍ３／ｍＬ］を計算する。ここで、Ｃｄは、生細胞の平均径［μｍ］を示す。
　生細胞密度および生細胞の平均径は、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＣｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｖｉ－ｃｅｌｌ　ＸＲなどの市販の測定装置を用いて測定することができ、一例として、Ｖｉ－ｃｅｌｌソフトはＶｉ－ｃｅｌｌ　ＸＲ２．０４を用い、測定時のパラメータとして、Ｍｉｎ　ｄｉａｍｅｔｅｒを６μｍ、Ｍａｘ　ｄｉａｍｅｔｅｒを５０μｍと設定して測定することができる。また、測定のパラメータは以下のように設定することができる。
　Ｃｅｌｌ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：８５％
　Ｃｅｌｌ　ｓｈａｒｐｎｅｓｓ：１００
　Ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｐоｔ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：７５％
　Ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｐоｔ　ａｒｅａ：５％
　Ｍｉｎｉｍｕｍ　ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ：０
　Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒ　ｄｅｇｒｅｅ：Ｍｅｄｉｕｍ
　なお、測定時のサンプルは希釈せずに使用してもよいし、希釈後のサンプルを使用してもよい。生細胞密度および生細胞の平均径の測定の頻度は特に限定されないが、例えば、１日１回行うことができる。
　生産期間中のＶＣＤの変動とは、生産期間中において測定したＶＣＤ値が、生産期間中のＶＣＤの平均値、すなわち平均生細胞密度に対してどれだけ変動したかを示す変動率（百分率）である。
　生産期間中のＶＣＤの平均値は、生産期間中、毎日培養槽内の培養液を抜き取り、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＣｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｖｉ－ｃｅｌｌ　ＸＲ等を用い測定したＶＣＤの値を、生産期間中の培養日数分足し算し、それを生産期間中の培養日数で除すことにより求めることができる。
　生産期間中のＶＣＶの変動とは、生産期間中において測定したＶＣＶ値が、生産期間中のＶＣＶの平均値に対してどれだけ変動したかを示す変動率（百分率）である。
　生産期間中のＶＣＶの平均値は、生産期間中、毎日培養槽内の培養液を抜き取り、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＣｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｖｉ－ｃｅｌｌ　ＸＲ等を用い測定したＶＣＤと細胞の平均径Ｃｄの値から、ＶＣＶ＝ＶＣＤ×（π／６×Ｃｄ３）の式によりＶＣＶ［×１０６μｍ３／ｍｌ］を計算し、そのＶＣＶの値を生産期間中の培養日数分足し算し、それを生産期間中の培養日数で除すことにより求めることができる。
　本発明においては、好ましくは、生産期間中のＶＣＤの変動が、生産期間中の平均生細胞密度に対して±２０％以下となるように、培養液をブリーディングすることができる。ブリーディングとは、培養中の生細胞密度が過剰にならないよう、培養液の一部を細胞ごと抜き取り、生細胞密度を減らすことを意味する。培養液量を維持するため、抜き取った培養液と同量の新鮮な培地を加えることができる。
　より好ましくは、生産期間中のＶＣＤの変動は生産期間中の平均生細胞密度に対して±１５％以下であり、さらに好ましくは生産期間中のＶＣＤの変動は生産期間中の平均生細胞密度に対して±１２％以下であり、特に好ましくは生産期間中のＶＣＤの変動は生産期間中の平均生細胞密度に対して±８％以下である。生産期間中のＶＣＤの変動の下限は特に限定されず、０％以上であればよいが、日々の細胞増殖の変動を考慮すると実質０．１％以上の変動は生じる。
　ブリーディングは、細胞を含む培養液を培養容器から取り出すことができればよく、その方法は特に限定されないが、例えば、図１に示すように、培養液の中に、培養液を排出するための配管を挿入し、上記の配管を通じて培養液を培養容器から排出することができる。
　好ましくは、ブリーディングにおいては、培養液の静電容量をインライン計測しながら培養液をブリーディングしてもよい。インライン計測とは、細胞培養を行いながら培養液の状態を示す何らかの測定値を測定することである。静電容量をインライン計測するためには、例えば、図１に示すように、静電容量センサーを培養液に挿入し、培養しながら培養液の静電容量をインライン計測すればよい。
　好ましくは、ブリーディングは自動で制御されていてもよい。自動で制御とは、何らかの培養液の状態を示す何らかの測定値に基づいて、ブリーディングの開始や停止を自動で制御することを意味する。例えば、培養液の静電容量の測定値に基づいて、ブリーディングの開始及び停止を自動で制御することができる。
　好ましくは、インライン計測される培養液の静電容量の変動が、生産期間中の静電容量の平均値に対して±２０％以下となるように、ブリーディングを行ってもよい。インライン計測される培養液の静電容量の変動は、より好ましくは、生産期間中の静電容量の平均値に対して±１５％以下であり、さらに好ましくは、生産期間中の静電容量の平均値に対して±１２％以下であり、特に好ましくは生産期間中の静電容量の平均値に対して±８％以下である。培養液の静電容量の変動の下限は特に限定されず、０％以上であればよいが、日々の細胞増殖の変動を考慮すると実質０．１％以上の変動は生じる。
　ブリーディングの一例としては、
（ｉ）ターゲットとなる静電容量を設定すること；
（ｉｉ）培養容器の重量制御値を設定すること；
（ｉｉｉ）培養液の静電容量を０．１秒以下の周期で測定すること；
（ｉｖ）培養液の静電容量が上記ターゲットを越えたら、培養液を引き抜くポンプを０．３ｖｖｄ～３ｖｖｄの速度で運転すること（ここで、ｖｖｄは、引き抜かれる培養液の体積/ 培養液の体積/ｄａｙを意味する）；
（ｖ）培養液の液量の変動が１０％以内になるよう、培養液の質量を測定しながら、培養容器に培地を自動供給すること；および
（ｖｉ）培養液の静電容量が上記ターゲットを０．０１％以上下回ったら、培養液を引き抜くポンプを停止すること、
を含む工程により行うことができる。
 本発明においては、好ましくは、生産期間において、式（６）を満たす。
２≦ＬＤＨ／ＶＣＤ≦４０　　式（６）
式中、ＬＤＨは、培養液中の乳酸脱水素酵素の濃度［Ｕ／Ｌ］を示し、
ＶＣＤは、生細胞密度［×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］を示す。
　式（６）について、より好ましい態様としては、以下の式（６Ａ）および（６Ｂ）である。
２≦ＬＤＨ／ＶＣＤ≦３５　　式（６Ａ）
２≦ＬＤＨ／ＶＣＤ≦３０　　式（６Ｂ）
　ＬＤＨで示される培養液中の乳酸脱水素酵素の濃度［Ｕ／Ｌ］は、培養中の培養液を培養容器から抜き取り、細胞を濾過により除去した後の濾液を用いて測定することができる。濾液における乳酸脱水素酵素の濃度の測定は、Ｒｏｃｈｅ社のＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏなどの市販の分析装置を用いて行うことができる。乳酸脱水素酵素の濃度の測定の頻度は特に限定されないが、例えば、１日１回行うことができる。
　本発明における細胞の培養において用いることができる細胞培養装置の一例を図１に示す。図１においては、培養容器１０は、細胞を含む培養液を収容する容器である。培養容器１０の内部における培養液において細胞が培養される。
　スパージャー給気配管１からは酸素及び空気が送られ、酸素及び空気は、孔径２０μｍのスパージャー１１を介して培養液に導入される。スパージャー１１により、培養液内の溶存酸素濃度を調節することができる。スパージャーとしては、特に限定されないが、例えば、ガス放出部の平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、酸素を３０体積％以上含むガスを放出するスパージャーを使用することができる。
　給気配管２からは空気及び二酸化炭素が、培養容器の内部の培養液の上部に導入される。
　培地供給配管３からは培地が、培養容器に供給される。培地供給配管３には、培地供給ポンプ１５が設けられている。
　排気配管４は、排気のための配管であり、その末端には排気フィルター５が接続している。
　サンプリング管６は、培養液を採取（サンプリング）するための配管である。
　ブリーディング管７は、培養液を抜き出す（ブリーディング）ための配管である。
　静電容量センサー８が、培養容器内の培養液に接触するように装着されている。
　溶存酸素センサー９が、培養容器内の培養液に接触するように装着されている。
　培養容器１０の内部には、撹拌羽根１２を有する撹拌部材が設けられていてもよい。撹拌羽根１２を回転させることで、培養容器１０の内部の培養液が撹拌され、培養液の均質性が保たれる。撹拌羽根１２により培養液が撹拌されることにより、スパージャーにより放出される泡も撹拌される。撹拌羽根を有する撹拌部材の位置、撹拌羽根のサイズ等は、特に限定されず、使用する細胞種、培養液の量、供給する酸素の量、スパージャーの位置、数、サイズ等に応じて設計すればよい。また、スパージャーから出る泡を素早く撹拌し、泡の合一を抑制させるためには、スパージャーから近い位置に撹拌羽根１２が配置されることが好ましい。
　培養容器１０の下部には、灌流装置１３が接続されている。また、培養容器１０の内部の培養液は、灌流装置１３を通過し、細胞の生産物を含む透過液は、送出ポンプ１６により培養容器１０から取り出される。透過液の流れを矢印１４で示す。
　本発明においては、培養液の生細胞密度が５０×１０６～３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましく、８０×１０６～２５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがより好ましく、１００×１０６～２２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがさらに好ましい。１０６の代わりにＭと表記することもある。
　本発明においては、培養容器から抜き出した細胞懸濁液を分離膜に通過させて、細胞含有液と透過液とに分離してもよい。この操作は、灌流装置を用いて行うことができる。この操作においては、培養容器中から抜き出した細胞懸濁液は、上記細胞懸濁液よりも高い細胞密度を有する細胞含有液と、上記細胞懸濁液よりも低い細胞密度を有する透過液とに分離される。細胞密度はＢｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ製　生死細胞アナライザー　Ｖｉ－ＣＥＬＬ　ＸＲによって測定することができる。
　上記した膜分離処理工程は、タンジェンシャルフィルトレーションであることが好ましく、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ（ＡＴＦ）やＴａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　であることがより好ましく、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗであることが最も好ましい。Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗを行えるフィルターとしては、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製のＳｕＡＴＦ１０－Ｓ０２ＰＥＳや、Ｆ２　ＲＦ０２ＰＥＳ等がある。
　細胞培養に用いる培地としては、通常の動物細胞の培養で使用されている培地を用いることができる。例えば、ＣＤ　ＯｐｔｉＣＨＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ－１５培地、及びＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＣＨＯ－ＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＣＤ－ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＩＳ  ＣＨＯ－Ｖ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＦ－ＡＣＦ－ＣＨＯ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）などを使用することができる。又は自作培地を用いてもよい。
  培地には牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加してもよいし、血清を添加しなくてもよい。 培地には、アミノ酸、塩、糖類、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素、植物タンパク質の加水分解物などの追加成分を補充してもよい。タンパク質不含培地を用いることもできる。
　培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．０～８．０であり、好ましくはｐＨ６．４～７．６であり、より好ましくはｐＨ６．７～７．４である。
  培養温度は、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは３２℃～３９℃であり、より好ましくは３６℃～３８℃であり、培養中に培養温度を変更してもよい。
  培養は、ＣＯ２濃度が０～４０体積％、好ましくは２～２５体積％、さらに好ましくは３～２０体積％の雰囲気下で行うことができる。
　培養液の量は、好ましくは１Ｌ以上であり、より好ましくは５０Ｌ以上であり、さらに好ましくは２００Ｌ以上である。
  培養期間は特に限定されないが、一般的には１２時間～９０日間であり、好ましくは１日間から８０日間であり、より好ましくは１日以上７０日未満であり、さらに好ましくは５日以上６５日未満であり、特に好ましくは７日以上６０日未満である。本発明においては、培養期間が１４日以上であることが好ましい。
　培養においては、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加えることができる。培養の攪拌を行う場合、攪拌回転数は特に限定されないが、単位体積当たりの攪拌動力は、一般的には１０～３００ｋＷ／ｍ３であり、好ましくは２０～２００ｋＷ／ｍ３であり、より好ましくは３０～１００ｋＷ／ｍ３である。
　培養液における溶存酸素濃度は適宜設定することでき、特に限定されないが、一般的には１気圧の空気における３７℃液中の飽和溶存酸素濃度を１００％としたときに、２０～１５０％であり、好ましくは３０～１２０％、より好ましくは５０～１００％である。
  細胞培養は、本明細書において上記した構成を有する細胞培養装置を用いて行うことができる。細胞培養装置としては、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、又は充填槽型培養装置等のいずれでもよい。培養容器は、培養環境の均質化等の観点からは、シングルユース培養槽であることが好ましい。細胞培養装置は、培養環境の均質化等の観点からは、シングルユース培養槽でもよい。
　培養液の粘度は、好ましくは１．２ｍＰａ・ｓ以上１５ｍＰａ・ｓ未満であり、より好ましくは１．４ｍＰａ・ｓ以上１２ｍＰａ・ｓ未満であり、特に好ましくは１．６ｍＰａ・ｓ以上１０ｍＰａ・ｓ未満である。
　本発明においては、培養中に、ｐＨ調整剤を添加してもよい。ろ過フィルタ流路詰まりの点から、培養槽に添加するｐＨ調整剤の１日当たりの添加量は、好ましくは８ｍｍｏｌ／ｄａｙ／Ｌ以下であり、より好ましくは７ｍｍｏｌ／ｄａｙ／Ｌ以下である。ただし、ｐＨ調整剤を添加しなくてもよい。
　ｐＨ調整剤としては特に限定されないが、Ｎａ２ＣＯ３水溶液、ＮａＯＨ水溶液またはＮａＨＣＯ３水溶液が好ましく、より好ましくはＮａＨＣＯ３水溶液である。ｐＨ調整剤は、単独で添加してもよいし、培地や消泡剤に混ぜて添加してもよい。ｐＨ調整剤の添加による培養液中の局所的なｐＨの変動を避けるためには、ｐＨ調整剤は培地に混ぜて添加するのが好ましい。
　本発明において、細胞を培養する方法の様式は、灌流培養である。
  灌流培養は、新鮮な培地を添加し、同時に使用済み培地を除去する培養法である。灌流培養によれば、一般的に、高い生細胞密度を達成することが可能である。典型的な灌流培養は、１日間又は２日間続くバッチ培養スタートアップで始まり、その後、培養物に新鮮な供給培地を連続的、段階的、及び／又は断続的に添加し、使用済み培地を同時に除去する。灌流培養においては、沈降、遠心分離又はろ過などの方法を用いて、生細胞密度を維持しながら使用済み培地を除去することができる。 灌流培養の利点は、目的タンパク質が生産される培養が、バッチ培養法又はフェドバッチ培養よりも長期間維持されることである。
  灌流は、連続的、段階的、断続的又はこれらの組み合わせの何れの形態でもよい。好ましくは、連続的な形態がよい。動物細胞は、培養物中に保持され、除去される使用済みの培地は、細胞を実質的に含まないか、又は培養物よりもはるかに少ない細胞を有していてもよい。細胞培養によって発現される生産物は膜孔径の選択により、培養物中に保持又は回収することができる。
　灌流培養の日数は５日以上１５０日以下が好ましく、１０日以上１００日以下がより好ましく、２０日以上９０日以下が更に好ましい。培養日数を５日以上にすることは、得られる細胞数が多くなること、及び細胞が生産物を生産する場合には生産物の生産量が大きくなることから好ましい。培養日数を１５０日以下にすることは、灌流培養で使用される濾過膜の目詰まり防止や、コンタミを防止する観点で好ましい。
　灌流比は特に限定されないが、一般的には０．３ｖｖｄ～５．０ｖｖｄであり、好ましくは０．５ｖｖｄ～３．０ｖｖｄであり、より好ましくは０．８ｖｖｄ～２．５ｖｖｄである。灌流比におけるｖｖｄは、引き抜かれる培養液の体積/ 培養容器内の培養液の体積/ｄａｙを意味する。なお、ここでいう灌流比は、ブリーディングの一例における「（ｉｖ）培養液の静電容量が上記ターゲットを越えたら、培養液を引き抜くポンプを０．３ｖｖｄ～３ｖｖｄの速度で運転すること」とは異なるパラメータである。
　培養容器からの培養液の抜き出しは、通常、ポンプを用いて行うことができるが、利用可能な他の送液手段を用いてもよい。培養容器から抜き出された培養液は、例えば、生産物の回収、死細胞の除去等の処理が行われる。培養容器から抜き出された培養液は、生産物の回収、死細胞の除去等の処理後に、一部廃却してもよいし、培養容器へ戻してもよい。上記処理により培地のロスが発生した場合、例えば、培養容器に新鮮培地を供給することにより補うことができる。
　本発明における細胞の種類は特に限定されないが、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。細胞は、好ましくは、動物細胞（より好ましくは哺乳類細胞）、又は昆虫細胞であり、哺乳類細胞が最も好ましい。細胞としては、初代細胞でも株化細胞でもよい。
　細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ細胞（Human Embryonic Kidney 由来細胞）、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ミエローマ細胞（ＮＳ０細胞など）、ＰｅｒＣ６細胞、ＳＰ２／０細胞、ハイブリドーマ細胞、ＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来細胞）、３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞）、ＰＣ１２細胞、ＷＩ３８細胞などを挙げることができる。細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞であってもよい。上記の中でも、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ハイブリドーマが好ましく、より好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞であり、最も好ましくはＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質、例えば、サイトカイン、凝固因子、及び抗体の産生に広く使用されている。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を欠損したＣＨＯ細胞を使用することが好ましく、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞としては、例えば、ＣＨＯ－ＤＧ４４を使用することができる。
　細胞の生存率としては、高い方が好ましいが、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
　これらの細胞は、発現させたいタンパク質（例えば、抗体など）をコードする外来遺伝子を導入した細胞であってもよい。細胞としては、抗体を産生する細胞であることが好ましい。発現させたいタンパク質をコードする外来遺伝子を細胞に導入するためには、発現ベクターを使用することができる。発現させたいタンパク質をコードするＤＮＡと、発現調節配列（例えば、エンハンサー、プロモーター及びターミネーターなど）と、所望により選択マーカー遺伝子とを含む発現ベクターを細胞に導入することにより、発現させたいタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した細胞を作製することができる。発現ベクターとしては特に限定はなく、細胞の種類、用途などに応じて適宜選択して使用することができる。
  プロモーターとしては、哺乳動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）のプロモーター及びエンハンサー等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
  選択マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、又は蛍光遺伝子（緑色蛍光タンパクＧＦＰなどをコードする遺伝子）などを用いることができる。
  細胞に発現ベクターを導入する方法は、特に限定はなく、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、ジーンガン法及びリポフェクション法などを用いることができる。
　本発明による生産物の製造方法は、細胞培養装置を用いて細胞を培養して上記細胞から生産物を産生させることを含む。
　本発明によれば、本発明による生産物の生産方法により生産される生産物が提供される。
  本発明において、生産物の種類は特に限定されないが、好ましくは組み換えタンパク質である。生産物としては、例えば、組み換えポリペプチド鎖、組み換え分泌ポリペプチド鎖、抗原結合タンパク質、抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、バイスペシフィック抗体など）、Ｆｃ融合タンパク質、断片化免疫イムノグロブリン、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。また、他にもアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスなどであってもよい。
　生産物は、好ましくは抗体であり、より好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はマウス抗体である。断片化免疫イムノグロブリンとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどが挙げられる。抗体のクラスも特に限定されるものではなく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどいずれのクラスでもよいが、医薬として用いる場合はＩｇＧ及びＩｇＭが好ましい。
  ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される１つ又は複数の可変及び定常領域を有する全ての抗体を含む。一実施形態では、可変及び定常ドメインの全てが、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される（完全ヒト抗体）。
  ヒト化抗体は、ヒト対象に投与されたときに、非ヒト種抗体と比較して、ヒト化抗体が免疫反応を誘発する可能性が低くなるように、及び／又は重篤な免疫反応の誘発がより少なくなるように、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加により非ヒト種から誘導された抗体の配列と異なる配列を有する。一例では、非ヒト種抗体の重鎖及び／又は軽鎖のフレームワーク及び定常ドメイン内のある特定のアミノ酸は、ヒト化抗体を産生するように変異している。別の例では、ヒト抗体からの定常ドメインは、非ヒト種の可変ドメインに融合される。
  キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス・ヒト異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。上記ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産されるキメラ抗体を取得できる。
  バイスペシフィック抗体とは、２つの異なる抗原特異性を認識する抗体である。様々な形態のバイスペシフィック抗体が存在する。バイスペシフィック抗体を作製する方法としては、２つのイムノグロブリン分子をN-サクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオール) プロピオネート又はS-アセチルメルカプトサクシニックアシッドアンハイドライドなどの架橋剤を用いて結合して作製する方法、イムノグロブリン分子のFabフラグメントどうしを結合して作製する方法などが報告されている。また、バイスペシフィック抗体をコードする遺伝子を細胞に導入することにより、発現させることも可能である。
  Ｆｃ融合タンパク質とは、Ｆｃ領域を有するタンパク質を示し、抗体を含む。
  Ｆａｂは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価断片である。
  Ｆ（ａｂ’）２は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を有する二価断片である。
  Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインを有する。
  一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して接合して、連続したタンパク質鎖を形成する抗体であり、ここでリンカーは、タンパク質鎖をそれ自身に折り重ね、一価抗原結合部位を形成させるのに十分な長さである。
　抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗ＩＬ－６レセプター抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗グリピカン－３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＶＬＡ４抗体などが挙げられる。
　生産物の回収は、単に培養液を回収してもよいし、例えば、フィルタ又は遠心分離機を用い、培養液から細胞の少なくとも一部を除いた液体を回収してもよく、公知の方法が特に制限なく用いられる。生産物の純度を向上したり、溶媒を変更したり、例えば粉末状にするなど形態を変更したい場合には、培養液又は上記液体をさらなる処理に供することができる。
　また、灌流しながら培養液の一部を回収する、又は、灌流しながら灌流中の培養液の一部に対してフィルター又は遠心分離機を用い、培養液から細胞の少なくとも一部を除いた液体を回収することも可能である。 
　生産物は、精製処理により精製することができる。得られた生産物は、高い純度にまで精製することができる。生産物の分離及び精製は通常のタンパク質で使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外ろ過、塩析、透析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択及び組み合わせることにより、生産物を分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。上記で得られた生産物の濃度測定は、吸光度測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。また、生産物が抗体である場合、抗体の力価（Ｔｉｔｅｒ）は、Ｒｏｃｈｅ社のＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏなどの市販の分析機器で測定することもできる。
  アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；高速液体クロマトグラフィー）又はＦＰＬＣ（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
  なお、生産物には、精製前又は精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させることにより、生産物を修飾したり、部分的にペプチドを除去することもできる。ポリペプチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
　本発明により生産される生産物は、例えばバイオ医薬品及び再生医療等において用いることができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜抗体産生細胞の樹立＞
　ＩｇＧ１をコードする核酸配列を含むベクターを構築し、構築したベクターをＣＨＯ－ＤＧ４４細胞へ導入することにより、ＩｇＧ１を発現させるＣＨＯ－ＤＧ４４細胞（ＩｇＧ１細胞）を作製した。ベクターの構築及び細胞への導入は、特表２０１６－５１７６９１号公報の実施例２に準じて行った。上記により、モノクローナル抗体を産生するＣＨＯ細胞を準備し、以下の実験において使用した。
＜細胞培養＞
　実施例及び比較例においては、図１に示す細胞培養装置を用いて実験を行った。
　Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製の全容３Ｌの培養槽（Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標））に１．３Ｌの培地を投入した。上記の培地に０．５×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＣＨＯ細胞を播種した。撹拌回転数１６０ｒｐｍで、上面からは、空気３８ｍＬ／分とＣＯ２　２ｍＬ／分を、下面からは培養液中の酸素濃度が８０％になるように培養槽に設置されたスパージャーからＯ２を自動制御し供給した。
　播種後２日目に培養した後、灌流比０．８ｖｖｄで培地を連続供給しながら、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製ＡＴＦ２で細胞培養液を連続濾過し回収液を回収した。
　更に５日目に灌流比１．５ｖｖｄに変更した。
　その後、細胞密度が１２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに到達したら、細胞密度が１２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで維持されるよう培養液の一部を引き抜きながら、セルブリードを行った。
　このときに使用する培養条件（培地、セルブリード条件等）を、表１に記載の通りに設定して、実施例１～６並びに比較例１及び２を行った。なお、表１に記載の培地Ａ～Ｃはそれぞれ市販の培地に、グルタミンおよびグルコースを表１に記載の量になるように添加した培地である。
　以降、１０日間以上にわたり培養を継続し、後記する評価を行った。
　５０Ｌ培養の場合には、培養槽のＴｈｅｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製Ｈｙｐｅｆｏｒｍａ５０に５０Ｌの培地を投入すること、撹拌回転数を２５０ｒｐｍとすること、上面　空気０．４７５Ｌ／分＋ＣＯ２　０．０２５Ｌ／分とすること、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製ＡＴＦ４を使用すること以外は、１．３Ｌ培養と同条件で培養を実施した。
　５００Ｌ培養の場合には、培養槽のＴｈｅｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製Ｈｙｐｅｆｏｒｍａ５００に５００Ｌの培地を投入すること、撹拌回転数を１５０ｒｐｍとすること、上面　空気４．７５Ｌ／分＋ＣＯ２　０．２５Ｌ／分とすること、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製ＡＴＦ１０を使用すること以外は、１．３Ｌ培養と同条件で培養を実施した。
＜セルブリードの自動制御方法＞
　セルブリードを自動制御で行う場合は、ＡＢＥＲ社製のＦＵＴＵＲＡセンサーを用いて、培養液の静電容量を監視しながら連続的にセルブリードを自動で行った。具体的には以下の方法で実施した。
（１）ターゲットとなる静電容量を設定する。
（２）培養槽の重量制御値を設定する。
（３）培養液の静電容量を０．１ｓ以下の周期で測定する。
（４）培養液の静電容量がターゲットを越えたら、培養液を引き抜くポンプを０．３ｖｖｄ～３ｖｖｄの速度で運転する。
（５）培養液の液量は概ね一定に保たれるよう、培養槽の重量を測定しながら、培養槽内に培地が自動供給される。
（６）培養液の静電容量がターゲットを０．０１％以上下回ったら、培養液を引き抜くポンプを停止する。
＜測定および評価方法＞
（１）生細胞密度、生細胞の平均径およびバイアビリティの測定
　培養槽内の培養液を抜き取り、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＣｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｖｉ－ｃｅｌｌ　ＸＲを用い測定した。なおＶｉ－ｃｅｌｌソフトはＶｉ－ｃｅｌｌ　ＸＲ２．０４を用い、測定時のパラメータは以下のように設定した。
　Ｍｉｎ　ｄｉａｍｅｔｅｒ：６μｍ
　Ｍａｘ　ｄｉａｍｅｔｅｒ：５０μｍ
　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ：細胞密度が１００×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下ではサンプルは希釈せず、Ｄｉｌｕｔｉｏｎは１で測定した。細胞密度が１００×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上ではサンプルを１０倍希釈し、Ｄｉｌｕｔｉｏｎは１０で測定した。
　Ｃｅｌｌ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：８５％
　Ｃｅｌｌ　ｓｈａｒｐｎｅｓｓ：１００
　Ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｐоｔ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：７５％
　Ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｐоｔ　ａｒｅａ：５％
　Ｍｉｎｉｍｕｍ　ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ：０
　Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒ　ｄｅｇｒｅｅ：Ｍｅｄｉｕｍ
　上記方法で１日１回測定した。
（２）Ｇｌｎ、Ｇｌｕｃ、ＮＨ４濃度の測定
　培養液を抜き取り、Ｃｙｔｉｖａ社のＷｈａｔｍａｎ　（Ｐｏｒｅ　Ｓｉｚｅ０．２μｍ，２５ｍｍ　Ｄｉａｍｅｔｅｒ）で細胞を濾過した後、濾液をＮｏｖａ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅ　ＦＬＥＸ２で測定した。
　上記方法で１日１回測定した。
（３）ＬＤＨの測定
　培養液を抜き取り、　Ｃｙｔｉｖａ社のＷｈａｔｍａｎ　（Ｐｏｒｅ　Ｓｉｚｅ０．２μｍ，２５ｍｍ　Ｄｉａｍｅｔｅｒ）　で細胞を濾過した後、濾液をＲｏｃｈｅ社のＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏで測定した。
　上記方法で１日１回測定した。
（４）力価（Ｔｉｔｅｒ）の測定
　培養液を抜き取り、　Ｃｙｔｉｖａ社のＷｈａｔｍａｎ　（Ｐｏｒｅ　Ｓｉｚｅ０．２μｍ，２５ｍｍ　Ｄｉａｍｅｔｅｒ）　で細胞を濾過した後、濾液をＲｏｃｈｅ社のＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏで測定した。
　上記方法で１日１回測定した。
（５）マンノース５（Ｍ５）の測定
　実施例および比較例の評価基準として抗体のマンノース５の評価を行った。マンノース５を含むＮ型糖鎖プロファイルの測定は以下の方法で行った。得られた抗体回収液の抗体をペプチド-Ｎ-グリコシダーゼＦで消化処理することでＮ型糖鎖を切り出した。その後、切り出された糖鎖を、２－アミノピリジンにより蛍光標識後、逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）でマンノース５を定量分析し、全ピーク面積に対するマンノース５のピークを算出した。
　マンノース５が４％未満である場合を評価Ａ、４～７％である場合を評価Ｂ、７％を越える場合を評価Ｃとした。
　実施例１におけるＶＣＶ、静電容量データおよびマンノース５比率の推移を測定した結果を図２～４に示す。
　各実施例及び各比較例の測定結果を表２及び表３に示す。
１　スパージャー給気配管
２　給気配管
３　培地供給配管
４　排気配管
５　排気フィルター
６　サンプリング管
７　ブリーディング管
８　静電容量センサー
９　溶存酸素センサー
１０　培養容器
１１　スパージャー
１２　撹拌羽根
１３　灌流装置
１４　矢印
１５　培地供給ポンプ
１６　送出ポンプ

Claims (12)

  1. 培養容器内で細胞を培養することを含む、生産物の生産方法であって、
    前記培養が灌流培養方式であり、
    目標となる生細胞密度に到達した後の生産物の生産期間において、式（１）～（５）を満たし、
    前記生産期間中のＶＣＤの変動が、前記生産期間中の平均生細胞密度に対して±２０％以下であり、
    前記生産期間中のＶＣＶの変動が、前記生産期間中のＶＣＶの平均値に対して±２０％以下である、
    生産物の生産方法。
    ０≦Ｇｌｎ－Ｃ≦２．５　　　　　　式（１）
    ０．５≦Ｇｌｕｃ－Ｃ≦８．０　　　式（２）
    １．０≦ＮＨ４－Ｃ≦８．０　　　　式（３）
    ５０≦ＶＣＤ≦３００　　　　　　　式（４）
    ０．６×１０５≦ＶＣＶ≦４．０×１０５　式（５）
    式中、
    Ｇｌｎ－Ｃは、培養液中のグルタミン濃度［ｍｍоｌ／Ｌ］を示し、
    Ｇｌｕｃ－Ｃは、培養液中のグルコース濃度［ｇ／Ｌ］を示し、
    ＮＨ４－Ｃは、培養液中のアンモニア濃度［ｍｍоｌ／Ｌ］を示し、
    ＶＣＤは、生細胞密度［×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］を示し、
    ＶＣＶは、ＶＣＤ×π／６×Ｃｄ３［×１０６μｍ３／ｍＬ］を示し、
    Ｃｄは、生細胞の平均径［μｍ］を示す。
  2. 前記生産期間中のＶＣＤの変動が、前記生産期間中の平均生細胞密度に対して±２０％以下となるように、培養液をブリーディングする、請求項１に記載の生産物の生産方法。
  3. 前記ブリーディングにおいて、培養液の静電容量をインライン計測しながら培養液をブリーディングする、請求項２に記載の生産物の生産方法。
  4. 前記ブリーディングが自動で制御されている、請求項３に記載の生産物の生産方法。
  5. 前記インライン計測される培養液の静電容量の変動が、前記生産期間中の静電容量の平均値に対して±２０％以下である、請求項３又は４に記載の生産物の生産方法。
  6. 前記ブリーディングが、
    （ｉ）ターゲットとなる静電容量を設定すること；
    （ｉｉ）培養容器の重量制御値を設定すること；
    （ｉｉｉ）培養液の静電容量を０．１秒以下の周期で測定すること；
    （ｉｖ）培養液の静電容量が前記ターゲットを越えたら、培養液を引き抜くポンプを０．３ｖｖｄ～３ｖｖｄの速度で運転すること（ここで、ｖｖｄは、引き抜かれる培養液の体積/ 培養液の体積/ｄａｙを意味する）；
    （ｖ）培養液の液量の変動が１０％以内になるよう、培養液の質量を測定しながら、培養容器に培地を自動供給すること；および
    （ｖｉ）培養液の静電容量が前記ターゲットを０．０１％以上下回ったら、培養液を引き抜くポンプを停止すること、
    を含む、請求項３から５の何れか一項に記載の生産物の生産方法。
  7. 前記生産期間において、式（６）を満たす、請求項１から６のいずれか一項に記載の生産物の生産方法。
    ２≦ＬＤＨ／ＶＣＤ≦４０　　式（６）
    式中、ＬＤＨは、培養液中の乳酸脱水素酵素の濃度［Ｕ／Ｌ］を示し、
    ＶＣＤは、生細胞密度［×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］を示す。
  8. 細胞が動物細胞である、請求項１から７のいずれか一項に記載の生産物の生産方法。
  9. 細胞が、タンパク質を産生する細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の生産物の生産方法。
  10. 細胞が、抗体を産生する細胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の生産物の生産方法。
  11. 細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の生産物の生産方法。
  12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の生産物の生産方法により生産される生産物。
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