WO2023190829A1 - 生産物の製造方法、及び生産物 - Google Patents

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淳史 稲田
真一 中居
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a product, which involves culturing cells, and in which the rate of alkali addition and the pH of the aqueous alkali solution are controlled.
  • the invention further relates to a product manufactured by the above-described manufacturing method.
  • Cell culture is carried out for the purpose of increasing the number of cells with useful properties, making the cells produce products, etc.
  • U.S. Pat. A method is described that includes establishing a mammalian cell culture expressing a modified protein, maintaining the mammalian cell during a production phase, and contacting the cell culture with monensin.
  • US Pat. No. 5,002,302 describes a fed-batch method for culturing mammalian cells that includes controlling pH using a pH set point, in which mammalian cells are seeded in a culture medium at a first pH.
  • a first culture step comprising culturing the cells at a first pH, wherein the pH set point is maintained at the first pH; and culturing the cells at a second pH that is higher than the first pH.
  • a second culture stage comprising: a second culture stage in which the set point is maintained at a second pH; the second culture stage is at least 0.1 pH unit higher than the first pH;
  • a method is described having a duration of at least 6 hours.
  • Patent Document 3 describes a method for culturing immortalized human blood cells, preferably cells originating from myeloid leukemia or a suspension of cells derived therefrom, which provides high productivity and high cell survival. A method is described that provides rate and growth rate and high batch-to-batch consistency and can be scaled up without changing these parameters.
  • the ATF (Alternating tangential flow filtration) method which is commonly used in perfusion culture, has a backwashing effect in which the liquid flows back from the secondary side of the membrane to the primary side, resulting in less membrane clogging compared to the TFF (Tangential flow filtration) method. Rishi Hateful. However, as development to improve productivity progresses, cell density increases, and membrane clogging has become a problem even in the ATF method. A common measure to suppress membrane clogging is to increase the membrane area, but there are problems in that the area of commercially available membranes is small and the equipment becomes large.
  • An object of the present invention is to provide a method that can suppress membrane clogging in a method for producing products by cell culture. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a product manufactured by the above method.
  • a method for producing a product comprising culturing cells,
  • the cell density during production of the product is perfusion culture of 80 x 10 6 cells/mL or more and 300 x 10 6 cells/mL, and the period of perfusion culture is 13 days or more and 500 days or less,
  • the daily alkali addition rate X [mol/L/day] is controlled within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.029.
  • the pH of the alkaline aqueous solution is 7 ⁇ pH ⁇ 13. The method of manufacturing the product.
  • ⁇ 2> The method for producing the product according to ⁇ 1>, wherein the cell density in the perfusion culture is 100 ⁇ 10 6 cells/mL or more and 300 ⁇ 10 6 cells/mL or less.
  • ⁇ 3> The method for producing a product according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the period of the perfusion culture is 18 days or more and 500 days or less.
  • ⁇ 4> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the culture period for producing the product is 5 days or more and 450 days or less.
  • ⁇ 5> During at least 13 days or more of the above perfusion culture period, the daily alkali addition rate X [mol/L/day] is controlled within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.008.
  • the method for producing the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4> is any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • ⁇ 6> Any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, in which the daily alkali addition rate X [mol/L/day] is 0 during at least 13 days or more of the perfusion culture period.
  • ⁇ 7> During 50% or more of the perfusion culture period, the daily alkali addition rate X [mol/L/day] is controlled within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.029.
  • ⁇ 8> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the continuous separation method of the cell culture solution in the perfusion culture is membrane filtration.
  • the membrane filtration is alternating tangential flow filtration called ATF.
  • Y [L/m 2 /hour] which is the flux during filtration, satisfies 0 ⁇ Y ⁇ 10.
  • ⁇ 11> The method for producing the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein the average pH of the culture solution during the culture is 6.7 to 7.2.
  • ⁇ 12> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>, wherein the minimum pH of the culture solution during the culture is 6.6 or higher.
  • ⁇ 13> Any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, wherein the pH of the culture solution during the culture is controlled by automatically adding an alkaline aqueous solution while measuring the pH in the culture solution in-line. Method of manufacturing the product described.
  • ⁇ 14> In the above perfusion culture, after the cell density reaches the target cell density of 80 ⁇ 10 6 cells/mL or more, the culture solution containing the cells is taken out, so that the cell density is adjusted to the above target cell density ⁇ 40%.
  • the method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13> wherein the product is collected during a period in which the cell density is maintained within ⁇ 40% of the target cell density.
  • the cell density is reduced by removing the culture medium containing cells at least once per day.
  • the method for producing the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13> which comprises adjusting the target cell density to within ⁇ 10%.
  • ⁇ 16> Production of the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 15>, wherein the dissolved CO 2 concentration during the period when the cell density is maintained at 80 ⁇ 10 6 cells/mL or more is 60 to 180 mmHg.
  • Method. ⁇ 17> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 16>, wherein the alkali is NaHCO 3 and/or Na 2 CO 3 .
  • ⁇ 18> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 17>, wherein the alkali is NaHCO 3 .
  • ⁇ 19> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 18>, wherein the concentration Z [mol/L] of the alkaline aqueous solution is 0 ⁇ Z ⁇ 5.
  • ⁇ 20> The method for producing the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 19>, wherein the pH of the medium added in perfusion culture is 7.0 to 8.0.
  • the pH of the culture solution decreases when culturing without adding an alkali, control the pH of the culture solution by supplying a medium to which an alkali has been added, ⁇ 1> to ⁇ 20 >The method for manufacturing the product described in any one of >.
  • ⁇ 22> ⁇ 1> to ⁇ 21 including supplying a medium to which 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 to 2.0 mol/L of alkali has been added when the pH of the culture solution is below 6.85.
  • an antifoaming agent containing dimethicone is added, From ⁇ 1>, where X [mol/L/day], which is the addition rate of the alkali, and B [g/L/day], which is the addition rate of the dimethicone, satisfy B ⁇ -0.79X+0.0228.
  • ⁇ 24> The method for producing the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 23>, wherein alkali addition is not performed during the entire period of the perfusion culture.
  • ⁇ 25> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 24>, wherein the cells are animal cells.
  • ⁇ 26> The method for producing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 25>, wherein the cells are CHO cells.
  • ⁇ 27> The method for producing the product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 26>, wherein the product is an antibody.
  • ⁇ 28> A product manufactured by the method for manufacturing a product according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 27>.
  • membrane clogging in perfusion culture can be suppressed.
  • FIG. 1 shows a cell culture device.
  • the entire apparatus shown in FIG. 1 is a cell culture apparatus.
  • FIG. 2 shows the relationship between the alkali addition rate and the number of days from the start of culture until membrane clogging.
  • FIG. 3 shows the relationship between alkali addition rate and fine particle density.
  • FIG. 4 shows the relationship between alkali addition rate and LDH.
  • FIG. 5 shows the relationship between the alkali addition rate, dimethicone addition rate, and the number of days from the start of culture until membrane clogging.
  • a numerical range indicated using “ ⁇ ” means a range that includes the numerical values listed before and after “ ⁇ " as the minimum and maximum values, respectively.
  • the present invention is a method for producing a product, the method comprising culturing cells,
  • the cell density during production of the product is perfusion culture of 80 x 10 6 cells/mL or more and 300 x 10 6 cells/mL or less, and the period of perfusion culture is 13 days or more and 500 days or less,
  • the daily alkali addition rate X [mol/L/day] is controlled within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.029.
  • the pH of the alkaline aqueous solution is 7 ⁇ pH ⁇ 13. It relates to a method for manufacturing products. According to the present invention, membrane clogging in perfusion culture can be suppressed.
  • productivity can be improved particularly in perfusion culture using membranes such as ATF/TFF.
  • the addition of alkali per day refers to the addition of alkali that is directly added to the culture solution as an aqueous alkali solution separately from the culture medium, and does not include alkali in the culture medium added to the culture tank during perfusion culture. Even if it were, it does not fall under the category of alkali addition here.
  • addition of an alkali is intended to be added directly to the culture solution.
  • the cell density during production of the product is 80 ⁇ 10 6 cells/mL or more, preferably 80 ⁇ 10 6 to 300 ⁇ 10 6 cells/mL, and 90 ⁇ 10 6 to 300 It is more preferably ⁇ 10 6 cells/mL, even more preferably 100 ⁇ 10 6 to 300 ⁇ 10 6 cells/mL, even more preferably 110 ⁇ 10 6 to 300 ⁇ 10 6 cells/mL. , more preferably 120 ⁇ 10 6 to 300 ⁇ 10 6 cells/mL. It is sometimes written as M instead of 106 . Particularly, when the cell density is set to 120 ⁇ 10 6 to 300 ⁇ 10 6 cells/mL, membrane clogging becomes noticeable, and the effects of the present invention are significantly obtained.
  • the culture solution containing the cells is taken out, so that the cell density can be adjusted to the above-mentioned level.
  • the target cell density is maintained within ⁇ 40%, and the product can be collected during the period in which the cell density is maintained within ⁇ 40% of the target cell density.
  • the cell density is reduced by removing the culture medium containing cells at least once per day. The above target cell density can be adjusted within ⁇ 10%.
  • the method for culturing cells is perfusion culture.
  • Perfusion culture is a culture method in which fresh medium is supplied into a cell culture medium and a portion of the medium in which the cells are cultured is removed. By performing this perfusion culture, waste products discharged from the cells can be removed from the culture tank.
  • perfusion culture while continuously supplying a culture medium to a culture tank, cells in the culture solution can be continuously separated and a solution can be collected.
  • a typical perfusion culture begins with a batch culture lasting one or two days, after which fresh feed medium is continuously, stepwise, and/or intermittently added to the culture, and spent medium is simultaneously removed. .
  • methods such as sedimentation, centrifugation or filtration can also be used to separate cells and remove spent medium while maintaining viable cell density.
  • the advantage of perfusion culture is that the culture in which the protein of interest is produced is maintained for a longer period of time than in batch or fed-batch culture methods.
  • Perfusion may be continuous, stepwise, intermittent, or a combination thereof. Preferably, it has a continuous form.
  • the animal cells may be maintained in culture and the spent medium that is removed may be substantially free of cells or have far fewer cells than the culture. Products expressed by cell culture can be retained or recovered in culture by selection of membrane pore size.
  • the method for continuous separation of cell culture fluid in perfusion culture is preferably membrane filtration, more preferably alternating tangential flow filtration (ATF).
  • Y [L/m 2 /hour], which is the flux during filtration, preferably satisfies 0 ⁇ Y ⁇ 10, more preferably 0 ⁇ Y ⁇ 5, and still more preferably 0 ⁇ Y ⁇ 2.
  • the flux during filtration is the amount of culture solution that permeates the membrane per unit time and unit filtration area, and is defined by the following formula.
  • the perfusion ratio is not particularly limited, but is generally 0.3vvd to 5.0vvd, preferably 0.5vvd to 2.0vvd, and more preferably 0.5vvd to 1.4vvd.
  • vvd means the amount of cell culture solution to be replaced with fresh medium per volume of cell culture solution for one day, that is, volume of supply medium/volume of culture solution/Day.
  • the product can be removed from the culture solution by using a pump from the secondary side of the filtration membrane, but other available liquid delivery means may also be used.
  • the extracted culture solution is subjected to treatments such as recovery of products and removal of dead cells. Further, the extracted culture solution may be partially discarded after processing such as product recovery and removal of dead cells, or may be returned to the culture container. If a loss of culture solution occurs due to the above treatment, it can be compensated for by, for example, supplying a fresh medium to the culture container.
  • the culture medium containing cells is removed at least once per day to adjust the cell density to the target cell density. It can be adjusted within ⁇ 10%.
  • a portion of the culture solution is removed together with the cells to reduce the density of living cells. This is called cell bleeding.
  • the volume of the culture solution can be maintained by adding a medium. Once a day or more includes cases where cell bleeding is performed continuously and automatically.
  • the period of perfusion culture (this period is the culture period from the start of perfusion and includes the period before cells reach high density) is not particularly limited, but is generally one day. 1000 days or more, preferably 7 days or more and 1000 days or less, more preferably 18 days or more and 500 days, still more preferably 25 days or more and 200 days, even more preferably 30 days or more and 100 days. It is as follows. Perfusion may be started 2 days after seeding on day 0.
  • the culture period for producing a product with a cell density of 80 ⁇ 10 6 cells/mL or more is preferably 5 days or more and 990 days or less, and may be 5 days or more and 450 days or less, and more preferably 10 days.
  • the period is not less than 450 days, more preferably not less than 15 days and not more than 190 days, and even more preferably not less than 20 days and not more than 90 days.
  • the daily alkali addition rate X is controlled within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.029 during at least 13 days or more of the perfusion culture period. , preferably within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.015, more preferably within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.0127, and even more preferably within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.008.
  • the daily alkali addition rate X may be 0 during at least 13 days or more of the perfusion culture period.
  • X is 0, it means that alkali is not added from a line separate from the medium supply.
  • the alkali addition rate X [mol/L/day] is controlled within the range of 0 ⁇ X ⁇ 0.029.
  • the alkali is not particularly limited, but is preferably Na 2 CO 3 , NaOH or NaHCO 3 , more preferably NaHCO 3 and/or Na 2 CO 3 , particularly preferably NaHCO 3 .
  • the alkali can be added as an aqueous solution (eg, an aqueous Na2CO3 , NaOH or NaHCO3 aqueous solution).
  • the cell culture medium to which NaHCO 3 is added tends to have a lower viscosity. That is, it is particularly preferable to use NaHCO 3 because it can be said that NaHCO 3 has a weaker effect of gelling the culture solution than Na 2 CO 3 and can easily suppress membrane clogging.
  • the time to start adding alkali is after 7 days from the start of culture, preferably after 6 days, and more preferably after 5 days.
  • the pH of the alkaline aqueous solution to be added is 7 ⁇ pH ⁇ 13, preferably 7.5 ⁇ pH ⁇ 12, more preferably 7.5 ⁇ pH ⁇ 10, and even more preferably 8 ⁇ pH ⁇ 10. It is.
  • pH of an aqueous alkali solution is measured at the point when the alkali is dissolved in water. pH can be measured using a commonly available pH sensor. For example, there are pH meters (Seven Excellence, Seven Direct, Five Easy) manufactured by Mettler TOLEDO.
  • the concentration Z [mol/L] of the aqueous alkali solution to be added is preferably 0 ⁇ Z ⁇ 5, more preferably 0 ⁇ Z ⁇ 3, and even more preferably 0 ⁇ Z ⁇ 2.
  • N [mol/L] of alkali By adding N [mol/L] of alkali to the culture medium when the culture solution pH falls below a certain value M, membrane clogging can be suppressed and antibody quality can be improved. That is, if the pH of the culture solution decreases when culturing is performed without adding an alkali, the pH of the culture solution can be controlled by supplying a medium to which an alkali has been added.
  • the denominator of N is the volume of the medium after preparation. At this time, prepare a new medium with increased alkali, and use a heat welder to connect the container containing the old medium (the medium being supplied to the culture tank) and the tube connected to the culture tank, and connect it to the container containing the new medium. Reconnect aseptically and start supplying.
  • an alkali may be added aseptically to a container containing a medium connected to a culture tank.
  • a certain value M of the culture solution pH is 6.85, preferably 6.80, and more preferably 6.75.
  • the amount of alkali added to the medium, N [mol/L], is 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 to 2.0 mol/L, preferably 2.0 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1.0 mol/L. , more preferably 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 to 2.0 ⁇ 10 ⁇ 1 mol/L.
  • the alkali added to the culture medium here does not mean the alkali added directly to the culture solution, but refers to the alkali added to the culture medium before being supplied to the culture tank. For example, when the pH of the culture solution falls below 6.85, a medium supplemented with 1.0 ⁇ 10 ⁇ 3 to 2.0 mol/L of alkali can be supplied.
  • the pH of the culture solution decreases when culturing without directly adding alkali to the culture solution, it is possible to control the pH of the culture solution by supplying a medium with increased pH. can.
  • This pH-enhanced medium may be prepared in advance, or preparation may begin when a change in the pH of the culture solution is observed.
  • the feeding medium can be switched to a medium with increased pH and perfusion culture can be performed. Preferably within 12 hours, more preferably within 6 hours, even more preferably within 3 hours, even more preferably within 1 hour, even more preferably within 30 minutes, even more preferably 5 minutes.
  • the amount of the solution is preferably 0.5 to 10 times the amount of the culture solution.
  • the alkali added to the medium is not particularly limited, but is preferably Na 2 CO 3 , NaOH or NaHCO 3 , more preferably NaHCO 3 and/or Na 2 CO 3 , particularly preferably NaHCO 3 .
  • the pH of the medium added in perfusion culture is preferably 7.0 to 8.0, more preferably 7.0 to 7.8, and even more preferably 7.0 to 7.6. .
  • the pH of the culture medium can be measured using a commonly available pH sensor after being stored for one day under 5% CO2 and 37°C incubation. For example, there are pH meters (Seven Excellence, Seven Direct, Five Easy) manufactured by Mettler TOLEDO.
  • the average pH of the culture solution during cultivation is 6.7 to 7.2, more preferably 6.8 to 7.0.
  • the minimum pH of the culture solution during cultivation is 6.6 or higher, more preferably 6.7 or higher, and even more preferably 6.8 or higher.
  • the pH of the culture solution during cultivation can be controlled by automatically adding an alkaline aqueous solution while measuring the pH in the culture solution in-line.
  • an antifoaming agent can be added in perfusion culture.
  • silicone type is preferable, and dimethicone is particularly preferable.
  • the antifoaming component of the antifoaming agent preferably contains polydimethylsiloxane, and more preferably contains finely powdered silica in polydimethylsiloxane.
  • the antifoaming agent for example, HyClone ADCF Antifoam Agent manufactured by Cytiva can be used.
  • X [mol/L/day] which is the addition rate of alkali and B [g/L/day] which is the addition rate of dimethicone per day are preferably B ⁇ -0.79X+0 Satisfies .0228. At this time, B does not take a negative value. Therefore, X ⁇ 0.0288.
  • the denominator of B is the volume of the culture solution contained in the culture tank and ATF. By satisfying this relationship, membrane clogging can be suppressed more effectively.
  • FIG. 1 shows an example of a cell culture device that can be used in culturing cells in the present invention.
  • the culture container 14 is a container containing a culture solution containing cells. Cells are cultured in a culture solution inside the culture container 14.
  • a culture medium is supplied from the culture medium supply pipe 1 to the culture container.
  • An antifoaming agent for suppressing foaming is supplied from the antifoaming agent supply pipe 2 to the culture container.
  • Alkali is supplied from the alkali supply pipe 3 to the culture container. If alkali is not added, the alkali supply pipe 3 may be omitted.
  • Carbon dioxide (CO 2 ) and air are introduced from the air supply pipe 4 to the top of the culture solution inside the culture container.
  • Oxygen (O 2 ) and/or air is sent from the sparger air supply piping 5, and the oxygen and/or air is introduced into the culture solution through the sparger 15 with a pore diameter of 20 ⁇ m.
  • the sparger 15 allows the dissolved oxygen concentration in the culture solution to be adjusted.
  • the sparger is not particularly limited, but for example, a sparger that has a gas release part with an average pore diameter of 1 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less (an example is a pore diameter of 20 ⁇ m) and that releases a gas containing 30% by volume or more of oxygen may be used. I can do it.
  • the exhaust pipe 6 is a pipe for exhausting air, and an exhaust filter (not shown) may be connected to the end thereof.
  • the sampling tube 7 is a pipe for collecting the culture solution (sampling) or extracting the culture solution (cell bleed). If cell bleed is performed automatically and continuously, separate piping may be installed (not shown).
  • a pH sensor 8 is mounted so as to be in contact with the culture solution.
  • a dissolved oxygen sensor 9 is mounted so as to be in contact with the culture solution.
  • Pressure sensors 10, 11 and 13 can be provided in the cell culture device.
  • a hollow fiber membrane 12 is installed in the cell culture device.
  • a stirring member having stirring blades 16 may be provided inside the culture container 14. By rotating the stirring blade 16, the culture solution inside the culture container 14 is stirred, and the homogeneity of the culture solution is maintained. When the culture solution is stirred by the stirring blade 16, the bubbles released by the sparger are also stirred.
  • the position of the stirring member having the stirring blade, the size of the stirring blade, etc. are not particularly limited, and are designed depending on the cell type used, the amount of culture solution, the amount of oxygen to be supplied, the position, number, size of the sparger, etc. do it. Furthermore, in order to quickly stir the bubbles coming out of the sparger and to suppress coalescence of the bubbles, it is preferable that the stirring blade 16 be arranged at a position close to the sparger.
  • the cell suspension extracted from the culture container may be passed through a separation membrane to be separated into a cell-containing liquid and a permeated liquid.
  • This operation can be performed using a cell culture device.
  • the cell suspension extracted from the culture container is divided into a cell-containing liquid having a higher cell concentration than the cell suspension and a permeate liquid having a lower cell concentration than the cell suspension. Separated.
  • Cell concentration can be measured using Vi-CELL XR, a live/dead cell analyzer manufactured by Beckman Coulter.
  • the membrane separation treatment step described above is preferably tangential filtration, more preferably Alternating tangential flow (ATF) filtration or tangential flow filtration. Most preferably, it is an initial flow filtration.
  • filters that can perform alternating tangential flow filtration include SuATF10-S02PES and F2RF02PES manufactured by Repligen.
  • a medium used for normal animal cell culture a medium used for normal animal cell culture can be used.
  • CD OptiCHO manufactured by ThermoFisher
  • Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM
  • Eagle's minimum essential medium MEM
  • RPMI-1640 medium RPMI-1641 medium
  • F-12K medium Ham's F12 medium
  • Iscobb's modified Dulbecco's medium a medium used for normal animal cell culture.
  • IMDM IMDM
  • McCoy 5A medium McCoy 5A medium
  • Leibovitz L-15 medium EX-CELL 300 series
  • EX-CELL 300 series JRH Biosciences
  • CHO-S-SFMII Invitrogen
  • CHO-SF Sigma-Aldrich
  • CD-CHO Invitrogen
  • IS CHO-V Irvine Scientific
  • PF-ACF-CHO Sigma-Aldrich
  • Serum such as fetal calf serum (FCS) may or may not be added to the medium.
  • the medium may be supplemented with additional components such as amino acids, salts, sugars, vitamins, hormones, growth factors, buffers, antibiotics, lipids, trace elements, hydrolysates of plant proteins, etc. Protein-free media can also be used.
  • the culture temperature is generally 30°C to 40°C, preferably 32°C to 39°C, more preferably 36°C to 38°C, and the culture temperature may be changed during culture. Cultivation can be carried out in an atmosphere with a CO 2 concentration of 0 to 40% by volume, preferably 2 to 25% by volume, and more preferably 3 to 20% by volume.
  • the amount of culture solution is preferably 0.5 L or more, more preferably 50 L or more, and still more preferably 200 L or more.
  • the stirring rotation speed is not particularly limited, but the stirring power per unit volume is generally 10 to 300 kW/m 3 , preferably 20 to 200 kW/m 3 , and more Preferably it is 30 to 100 kW/m 3 .
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution can be set appropriately and is not particularly limited, but is generally 10 to 100%, preferably 30 to 90%. Further, the dissolved CO 2 concentration during the period when the cell density is maintained at 80 ⁇ 10 6 cells/mL or more is preferably 60 to 180 mmHg, more preferably 80 to 160 mmHg, and still more preferably 100 to 140 mmHg. It is.
  • Cell culture can be performed using a cell culture device having the configuration described above in this specification.
  • Cell culture devices include fermenter type tank culture device, air lift type culture device, culture flask type culture device, spinner flask type culture device, microcarrier type culture device, fluidized bed type culture device, holofiber type culture device, roller Either a bottle type culture device or a filled tank type culture device may be used.
  • the culture container is preferably a single-use culture tank from the viewpoint of homogenizing the culture environment.
  • the viscosity of the culture solution for producing a product with a cell density of 80 ⁇ 10 6 cells/mL or more is preferably 1.2 mPa ⁇ s or more and less than 15 mPa ⁇ s, more preferably 1.4 mPa ⁇ s or more. less than 12 mPa ⁇ s, more preferably 1.6 mPa ⁇ s or more and less than 10 mPa ⁇ s, particularly preferably 1.6 mPa ⁇ s or more and less than 5 mPa ⁇ s, and most preferably 1.6 mPa ⁇ s or more and less than 3 mPa ⁇ s. less than s.
  • the types of cells in the present invention are not particularly limited, but include animal cells, plant cells, eukaryotic cells such as yeast, prokaryotic cells such as Bacillus subtilis, and Escherichia coli.
  • the cells are preferably animal cells (more preferably mammalian cells) or insect cells, most preferably mammalian cells.
  • the cells may be primary cells or established cell lines.
  • Examples of cells include Chinese hamster ovary (CHO) cells, HEK cells (Human Embryonic Kidney-derived cells), BHK cells, 293 cells, C127 cells, myeloma cells (NS0 cells, etc.), PerC6 cells, SP2/0 cells, hybridoma cells, Examples include COS cells (African green monkey kidney-derived cells), 3T3 cells, HeLa cells, Vero cells (African green monkey kidney epithelial cells), MDCK cells (canine kidney tubular epithelial cell-derived cells), PC12 cells, WI38 cells, etc. .
  • the cells may be stem cells, such as embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • CHO cells HEK cells, BHK cells, and hybridomas are preferred, CHO cells and HEK cells are more preferred, and CHO cells are most preferred.
  • CHO cells are widely used for the production of recombinant proteins such as cytokines, clotting factors, and antibodies. It is preferable to use CHO cells deficient in dihydrofolate reductase (DHFR), and as the DHFR deficient CHO cells, for example, CHO-DG44 can be used.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the cell survival rate is preferably higher, preferably 85% or higher, more preferably 90% or higher, particularly preferably 95% or higher, and most preferably 99% or higher.
  • These cells may be cells into which a foreign gene encoding a protein (for example, an antibody, etc.) to be expressed is introduced.
  • the cells are preferably cells that produce antibodies.
  • Expression vectors can be used to introduce foreign genes encoding proteins to be expressed into cells.
  • the protein to be expressed is encoded by introducing into cells an expression vector containing DNA encoding the protein to be expressed, an expression control sequence (e.g., enhancer, promoter, terminator, etc.), and optionally a selection marker gene. Cells into which foreign genes have been introduced can be produced. There are no particular limitations on the expression vector, and it can be appropriately selected and used depending on the cell type, purpose, etc.
  • any promoter can be used as long as it can function in mammalian cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrovirus promoter metallothionein promoter
  • heat shock promoter SR ⁇ promoter
  • Moloney murine leukemia virus promoter SR ⁇ promoter
  • Moloney murine leukemia virus promoter SR ⁇ promoter
  • Moloney murine leukemia virus promoter Moloney murine leukemia virus promoter.
  • enhancer of the human CMV IE gene may be used together with the promoter.
  • selectable marker genes include drug resistance genes (neomycin resistance gene, dihydrofolate reductor (DHFR) gene, puromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, hygromycin resistance gene, cycloheximide resistance gene, etc.), or fluorescent genes ( A gene encoding green fluorescent protein GFP, etc.) can be used.
  • drug resistance genes neomycin resistance gene, dihydrofolate reductor (DHFR) gene, puromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, hygromycin resistance gene, cycloheximide resistance gene, etc.
  • fluorescent genes A gene encoding green fluorescent protein GFP, etc.
  • the method for introducing the expression vector into cells is not particularly limited, and for example, the calcium phosphate method, electroporation method, liposome method, gene gun method, lipofection method, etc. can be used.
  • the method for producing a product according to the present invention includes culturing cells using a cell culture device and producing a product from the cells. According to the present invention, there is provided a product manufactured by the method for manufacturing a product according to the present invention.
  • the type of product is not particularly limited, but it is preferably a protein, and more preferably a recombinant protein.
  • Products include, for example, recombinant polypeptide chains, recombinant secreted polypeptide chains, antigen-binding proteins, antibodies (e.g., human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, mouse antibodies, bispecific antibodies, etc.), Fc fusion proteins, fragments. Examples include immunized immunoglobulins, single chain antibodies (scFv), and the like.
  • adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, etc. may also be used.
  • the product is preferably an antibody, more preferably a human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, or mouse antibody.
  • Fragmented immune immunoglobulins include Fab, F(ab')2, Fv, and the like.
  • the class of the antibody is also not particularly limited, and may be any class such as IgG such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, IgA, IgD, IgE, and IgM, but IgG and IgM are preferred when used as a medicine.
  • Human antibodies include all antibodies that have one or more variable and constant regions derived from human immunoglobulin sequences. In one embodiment, all variable and constant domains are derived from human immunoglobulin sequences (fully human antibody).
  • Humanized antibodies are designed such that when administered to a human subject, humanized antibodies are less likely to elicit an immune response and/or induce a severe immune response compared to non-human species antibodies. has a sequence that differs from that of an antibody derived from a non-human species by one or more amino acid substitutions, deletions, and/or additions such that the antibody has a lower sequence.
  • certain amino acids within the heavy and/or light chain framework and constant domains of a non-human species antibody are mutated to produce a humanized antibody.
  • a constant domain from a human antibody is fused to a variable domain of a non-human species.
  • a chimeric antibody is an antibody in which a variable region and a constant region of different origins are linked.
  • an antibody consisting of the heavy chain and light chain variable regions of a mouse antibody and the heavy and light chain constant regions of a human antibody is a mouse-human heterologous chimeric antibody.
  • a recombinant vector that expresses a chimeric antibody can be created by linking the DNA encoding the variable region of a mouse antibody with the DNA encoding the constant region of a human antibody and incorporating this into an expression vector. By culturing recombinant cells transformed with the above vector and expressing the integrated DNA, chimeric antibodies produced during the culture can be obtained.
  • Bispecific antibodies are antibodies that recognize two different antigen specificities. Bispecific antibodies exist in various forms. Bispecific antibodies can be produced by linking two immunoglobulin molecules using a cross-linking agent such as N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithiol) propionate or S-acetylmercaptosuccinic acid anhydride. Several methods have been reported, including a method in which Fab fragments of immunoglobulin molecules are linked together. Furthermore, expression can also be achieved by introducing a gene encoding a bispecific antibody into cells.
  • a cross-linking agent such as N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithiol) propionate or S-acetylmercaptosuccinic acid anhydride.
  • Fc fusion protein refers to a protein having an Fc region, and includes antibodies.
  • Fabs are monovalent fragments with VL, VH, CL and CH1 domains.
  • F(ab')2 is a bivalent fragment with two Fab fragments connected by a disulfide bridge in the hinge region.
  • Fv fragments have the single-armed VL and VH domains of an antibody.
  • a single chain antibody (scFv) is an antibody in which the VL and VH regions are joined via a linker (e.g., a synthetic sequence of amino acid residues) to form a continuous protein chain, where the linker is long enough to fold onto itself to form a monovalent antigen binding site.
  • Antibodies include, but are not particularly limited to, anti-IL-6 receptor antibodies, anti-IL-6 antibodies, anti-glypican-3 antibodies, anti-CD3 antibodies, anti-CD20 antibodies, anti-GPIIb/IIIa antibodies, anti-TNF antibodies, and anti-CD25 antibodies.
  • Antibodies include anti-EGFR antibodies, anti-Her2/neu antibodies, anti-RSV antibodies, anti-CD33 antibodies, anti-CD52 antibodies, anti-IgE antibodies, anti-CD11a antibodies, anti-VEGF antibodies, and anti-VLA4 antibodies.
  • the product may be collected by simply collecting the culture solution, or by collecting a liquid obtained by removing at least a portion of the cells from the culture solution using, for example, a filter or a centrifuge, and known methods may be used. Can be used without any particular restrictions. If it is desired to improve the purity of the product, change the solvent or change the form, for example into a powder, the culture solution or the liquid described above can be subjected to further processing.
  • a portion of the culture solution may be collected during perfusion, or a filter or centrifuge may be used to remove at least a portion of the cells from the culture solution during perfusion. It is also possible to collect
  • the product can be purified by purification treatment.
  • the resulting product can be purified to high purity.
  • the product may be separated and purified using conventional separation and purification methods used for proteins. For example, by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. can be separated and purified, but is not limited to these.
  • the concentration of the product obtained above can be measured by absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or the like.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the product is an antibody
  • the antibody titer can also be measured with a commercially available analytical instrument such as Roche's Cedex Bio.
  • chromatography examples include protein A columns and protein G columns.
  • chromatography other than affinity chromatography examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reversed phase chromatography, and adsorption chromatography. These chromatography can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC (high performance liquid chromatography) or FPLC (fast protein liquid chromatography). I can.
  • the product can be modified or peptides can be partially removed by treating the product with an appropriate polypeptide modification enzyme before or after purification.
  • polypeptide-modifying enzymes used include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, and glucosidase.
  • the products produced according to the present invention can be used, for example, in biopharmaceuticals, regenerative medicine, and the like.
  • CHO-DG44 cells IgG1 cells
  • IgG4 cells CHO-DG44 cells that express IgG4 are obtained.
  • Construction of the vector and introduction into cells were performed according to Example 2 of Japanese Translated Patent Publication No. 2016-517691.
  • CHO cells producing monoclonal antibodies were prepared as described above and used in the following experiments.
  • CHO cells that produce antibodies are grown by perfusion culture to 120 x 10 6 cells/mL, cell bleeding is started when the cell density of 120 x 10 6 cells/mL is reached, and the hollow fiber membrane is grown. The number of days of clogging was evaluated. Details are as follows.
  • the pH in the culture tank was read so that the pH in the culture tank became 7.0, and when the pH fell below 7.0, 1.0 mol/L NaHCO 3 aqueous solution was automatically added to start pH control. .
  • the cell culture solution was continuously filtered using ATF2 manufactured by Repligen while the culture medium was continuously supplied at a perfusion ratio of 0.8 vvd, and a recovered solution was collected. Furthermore, on the 5th day, the perfusion ratio was changed to 1.6 vvd. Furthermore, on the 6th day, the addition rate of simethicone in the antifoaming agent was set to 7.2 mg/day/L.
  • the pH of the culture solution decreases, and an aqueous alkaline solution begins to be automatically added to the culture solution.
  • days 9 to 11 when the cell density reached 120 x 10 6 cells/mL, cell bleeding was performed while withdrawing a portion of the culture medium to maintain the cell density at 120 x 10 6 cells/mL. Ta. Culture was continued until membrane clogging occurred and ATF could no longer operate.
  • ⁇ Evaluation method> Measurement of Cell Density and Viability The culture solution in the culture tank was taken out and measured using Cell Viability Analyzer Vi-cell XR manufactured by Beckman Coulter. Note that the Vi-cell software used was Vi-cell XR2.04, and the parameters at the time of measurement were set as follows.
  • Min diameter 6 ⁇ m
  • Max diameter 50 ⁇ m
  • Dilution When the cell concentration was 10 ⁇ 10 6 cells/mL or less, the sample was not diluted and the dilution was set to 1. When the cell concentration was higher than 10 ⁇ 10 6 cells/mL, the sample was diluted 10 times and the dilution was set to 10.
  • Cell sharpness 100
  • Minimum circularity 0 Decluster degree: Medium
  • the culture solution in the culture tank was extracted and diluted 10,000 times with ISOTON from Beckman Coulter.
  • the particle size distribution of the diluted culture solution from 1.46 to 20 ⁇ m was measured using a precision particle size distribution analyzer Multisizer 4e manufactured by Beckman Coulter.
  • LDH Lactate dehydrogenase
  • Antibody charge was evaluated by measuring the above antibody recovery solution using cation exchange high performance liquid chromatography (HPLC).
  • Mannose 5 (M5) was evaluated by digesting the antibody in the obtained antibody recovery solution with peptide-N-glycosidase F to cut out the N-glycan chain, which was fluorescently labeled with 2-aminobenzamide.
  • the M5 of the treated antibody was measured using a C18 (ODS) reverse phase HPLC column.
  • Evaluation of membrane clogging S: When the number of days from the start of culture until clogging is 30 days or more, the number of days from the start of perfusion until clogging is 28 days or more, and the number of days from the start of cell bleeding until clogging is 20 days or more.
  • A When the number of days from the start of culture until clogging is 20 to 29 days, the number of days from the start of perfusion until clogging is 18 to 27 days, and the number of days from the start of cell bleeding until clogging is 10 to 19 days. .
  • B When the number of days from the start of culture until clogging is 15 to 19 days, the number of days from the start of perfusion until clogging is 13 to 17 days, and the number of days from the start of cell bleeding until clogging is 5 to 9 days.
  • C The number of days from the start of culture until clogging is 14 days or less, the number of days from the start of perfusion until clogging is 12 days or less, and the number of days from the start of cell bleeding until clogging is 4 days or less.
  • the peak area ratio is the ratio of the chromatographic peak area of the Acidic component or the chromatographic peak area of the Basic component to the total peak area of all chromatographic peaks.
  • M5 peak area ratio X is 0% ⁇ X ⁇ 5%
  • B: M5 peak area ratio X is 5% ⁇ X ⁇ 6%
  • C: M5 peak area ratio X is 6% ⁇ X
  • the peak area ratio refers to the ratio of the chromatographic peak area of the M5 (Mannose 5) component to the total chromatographic peak area.
  • FIG. 2 shows the relationship between the alkali addition rate and the number of days until membrane clogging in Examples 1 to 3, 5, and 7 to 9. The results in FIG. 2 show that membrane clogging can be suppressed by lowering the alkali addition rate.
  • FIG. 3 shows the relationship between the alkali addition rate and the fine particle density in Examples 1 to 3, 5, and 7 to 9.
  • the particle density was defined as the cumulative number of cells with a density of 1 to 6 ⁇ m.
  • Microparticles are dregs/debris derived from cells (14 ⁇ m) and are an indicator of cell damage. The results in FIG. 3 show that cell damage can be suppressed by lowering the alkali addition rate.
  • FIG. 4 shows the relationship between the alkali addition rate and LDH in Examples 1 to 3, 5, and 7 to 9.
  • LDH is an enzyme component that leaks from damaged cells and is commonly used as an indicator of cell damage. The results in FIG. 4 show that cell damage can be suppressed by lowering the alkali addition rate.
  • FIG. 5 shows the relationship between the alkali addition rate, antifoaming agent addition rate, and number of days until membrane clogging in Examples 1 to 9 and 11 and Comparative Example 1.

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Abstract

本発明の課題は、細胞培養による生産物の製造方法において、膜詰まりを抑制することができる方法、並びに上記方法により製造される生産物を提供することである。本発明によれば、細胞を培養することを含む、生産物の製造方法であって、生産物の生産時における細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの灌流培養であり、灌流培養の期間は１３日以上５００日以下であり、上記灌流培養の期間のうち少なくとも１日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．０２９の範囲で制御され、添加されるアルカリ水溶液のｐＨは、７＜ｐＨ＜１３である、生産物の製造方法が提供される。

Description

生産物の製造方法、及び生産物
　本発明は、細胞を培養することを含む、生産物の製造方法であって、アルカリ添加速度およびアルカリ水溶液のｐＨを制御した方法に関する。本発明はさらに、上記した製造方法により製造される生産物に関する。
　細胞の培養は、有用な性質を有する細胞を増加させるため、細胞に生産物を生産させるため等の目的で行われている。例えば、特許文献１には、哺乳類細胞培養プロセスの間の、免疫グロブリンのＦｃ領域を含有する組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量の調節方法であって、バイオリアクター中の無血清培地において、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養を確立すること、産生フェーズの間、哺乳動物細胞を維持すること、及び細胞培養をモネンシンと接触させることを含む、方法が記載されている。
　また、特許文献２には、ｐＨ設定点を使用してｐＨを制御することを含む、哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階であって、ｐＨ設定点が第一ｐＨに維持される第一培養段階と；第一ｐＨより高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階であって、設定点が第二ｐＨに維持される第二培養段階とを含み、第二ｐＨが第一ｐＨよりも少なくとも０．１ｐＨ　単位高く、第二培養段階が少なくとも６時間の持続期間を有する、方法が記載されている。
　さらに、特許文献３には、不死化ヒト血液細胞、好ましくは骨髄性白血病を起源とする細胞またはそれに由来する細胞の懸濁物を培養するための方法であって、高い生産性、高い細胞生存率および増殖速度ならびに高いバッチ間の一貫性を提供し、これらのパラメーターを変更することなくスケールアップすることができる方法が記載されている。
特表２０１６－５３４７３２号公報 特表２０２１－５０３９１６号公報 特表２０１４－５０００３２号公報
　灌流培養で一般的に用いられるＡＴＦ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）方式は、膜の２次側から１次側に液が逆流する逆洗効果により、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）方式と比べて膜詰まりしにくい。しかし、生産性向上の開発が進むにつれて細胞密度の高密度化が進み、ＡＴＦ方式においても膜詰まりが課題となっている。膜詰まりを抑制するための一般的な対策は、膜面積を増大することであるが、市販されている膜の面積は小さいこと、および装置が大型化するという問題がある。
　本発明は、細胞培養による生産物の製造方法において、膜詰まりを抑制することができる方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに、本発明は、上記方法により製造される生産物を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ｐＨ制御に用いるアルカリ水溶液のｐＨおよび添加速度を制御することによって、膜詰まりを抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　細胞を培養することを含む、生産物の製造方法であって、
生産物の生産時における細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの灌流培養であり、灌流培養の期間は１３日以上５００日以下であり、
上記灌流培養の期間のうち少なくとも１日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．０２９の範囲で制御され、添加されるアルカリ水溶液のｐＨは、７＜ｐＨ＜１３である、
生産物の製造方法。
＜２＞　上記灌流培養における細胞密度が１００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、＜１＞に記載の生産物の製造方法。
＜３＞　上記灌流培養の期間が１８日以上５００日以下である、＜１＞又は＜２＞に記載の生産物の製造方法。
＜４＞　生産物の生産のための培養の期間が、５日以上４５０日以下である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜５＞　上記灌流培養の期間のうち少なくとも１３日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．００８の範囲で制御される、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜６＞　上記灌流培養の期間のうち少なくとも１３日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が０である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜７＞　上記灌流培養の期間のうち５０％以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．０２９の範囲で制御される、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜８＞　上記灌流培養における細胞培養液の連続分離方法が、膜濾過である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜９＞　上記膜濾過が、ＡＴＦと称される交互接線流濾過である、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１０＞　濾過時の流束であるＹ［Ｌ／ｍ２／ｈｏｕｒ］が、０＜Ｙ≦１０である、＜８＞又は＜９＞に記載の生産物の製造方法。
＜１１＞　上記培養中の培養液の平均ｐＨが６．７～７．２である、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１２＞　上記培養中の培養液の最低ｐＨが６．６以上である、＜１＞から＜１１＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１３＞　上記培養中の培養液のｐＨが、培養液中のｐＨをインラインで測定しながら、自動でアルカリ水溶液を添加することにより制御される、＜１＞から＜１２＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１４＞　上記灌流培養において、細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である目標細胞密度に到達した後に、細胞を含む培養液を取り出すことにより、細胞密度を、上記目標細胞密度±４０％以内に維持し、細胞密度が上記目標細胞密度±４０％以内に維持された期間において、生産物を回収する、＜１＞から＜１３＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１５＞　上記灌流培養において、細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である目標細胞密度に到達した後に、１日につき少なくとも１度以上細胞を含む培養液を取り出すことにより、細胞密度を、上記目標細胞密度±１０％以内に調整することを含む、＜１＞から＜１３＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１６＞　上記細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上に維持される期間の溶存ＣＯ２濃度が６０～１８０ｍｍＨｇである、＜１＞から＜１５＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１７＞　上記アルカリがＮａＨＣＯ３および／またはＮａ２ＣＯ３である、＜１＞から＜１６＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１８＞　上記アルカリがＮａＨＣＯ３である、＜１＞から＜１７＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜１９＞　上記アルカリ水溶液の濃度Ｚ［ｍｏｌ／Ｌ］が、０＜Ｚ＜５である、＜１＞から＜１８＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２０＞　灌流培養において添加される培地のｐＨが７．０～８．０である、＜１＞から＜１９＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２１＞　アルカリを添加せずに培養を行う場合において培養液のｐＨが低下する場合には、アルカリを追加した培地を供給することにより、培養液のｐＨを制御する、＜１＞から＜２０＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２２＞　培養液のｐＨが６．８５を下回ったときに、１．０×１０－３～２．０ ｍｏｌ／Ｌのアルカリを追加した培地を供給することを含む、＜１＞から＜２１＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２３＞　上記灌流培養においてジメチコンを含有する消泡剤が添加され、
上記アルカリの添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］と、上記ジメチコンの添加速度であるＢ［ｇ／Ｌ／ｄａｙ］とが、Ｂ＜－０．７９Ｘ＋０．０２２８を満たす、＜１＞から＜２２＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２４＞　上記灌流培養の全期間において、アルカリ添加を行わない、＜１＞から＜２３＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２５＞　上記細胞が動物細胞である、＜１＞から＜２４＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２６＞　上記細胞がＣＨＯ細胞である、＜１＞から＜２５＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２７＞　上記生産物が抗体である、＜１＞から＜２６＞の何れか一に記載の生産物の製造方法。
＜２８＞　＜１＞から＜２７＞の何れか一に記載の生産物の製造方法により製造される、生産物。
　本発明によれば、灌流培養における膜詰まりを抑制することができる。
図１は、細胞培養装置を示す。図１に示す装置全体が、細胞培養装置である。 図２は、アルカリ添加速度と培養開始からの膜詰まりまでの日数との関係を示す。 図３は、アルカリ添加速度と微粒子密度との関係を示す。 図４は、アルカリ添加速度とＬＤＨとの関係を示す。 図５は、アルカリ添加速度とジメチコン添加速度と培養開始からの膜詰まりまでの日数との関係を示す。
　以下において、本発明の内容について詳細に説明する。本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
　本発明は、細胞を培養することを含む、生産物の製造方法であって、
生産物の生産時における細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下の灌流培養であり、灌流培養の期間は１３日以上５００日以下であり、
上記灌流培養の期間のうち少なくとも１日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．０２９の範囲で制御され、添加されるアルカリ水溶液のｐＨは、７＜ｐＨ＜１３である、
生産物の製造方法に関するものである。本発明によれば、灌流培養における膜詰まりを抑制することができる。本発明によれば、特にＡＴＦ／ＴＦＦ等の膜を用いた灌流培養において生産性を向上させることができる。
　ここで１日あたりのアルカリ添加とは、培養液中にアルカリ水溶液として培地とは別に直接添加されるアルカリ添加のことを意味し、灌流培養時に培養槽に添加される培地中に仮にアルカリを含んでいたとしても、ここでいうアルカリ添加には該当しない。また本明細書において、培地に添加する等の記載がない場合、アルカリ添加は直接培養液中に添加することを意図する。
　本発明においては、生産物の生産時における細胞密度は、８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、８０×１０６～３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましく、９０×１０６～３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがさらに好ましく、１００×１０６～３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがさらに好ましく、１１０×１０６～３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがさらに好ましく、１２０×１０６～３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがさらに好ましい。１０６の代わりにＭと表記することもある。特に、細胞密度を１２０×１０６～３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることで膜詰まりは顕著に表れるようになり、本発明の効果が顕著に得られる。
　好ましくは、本発明においては、後記する灌流培養において、細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である目標細胞密度に到達した後に、細胞を含む培養液を取り出すことにより、細胞密度を、上記目標細胞密度±４０％以内に維持し、細胞密度が上記目標細胞密度±４０％以内に維持された期間において、生産物を回収することができる。
　好ましくは、上記灌流培養において、細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である目標細胞密度に到達した後に、１日につき少なくとも１度以上細胞を含む培養液を取り出すことにより、細胞密度を、上記目標細胞密度±１０％以内に調整することができる。
　本発明において、細胞を培養する方法の様式は、灌流培養である。灌流培養は、新鮮な培地を細胞培養液中へ供給し、細胞を培養している培地の一部を除去する培養法である。この灌流培養を行うことによって細胞から排出される老廃物を培養槽から取り除くことができる。灌流培養としては、培養槽に培地を連続供給しながら、培養液内の細胞を連続分離した液を回収することができる。
　灌流培養によれば、一般的に、高い生細胞密度を達成することが可能である。典型的な灌流培養は、１日間又は２日間続くバッチ培養で始まり、その後、培養物に新鮮な供給培地を連続的、段階的、及び／又は断続的に添加し、使用済み培地を同時に除去する。灌流培養においては、沈降、遠心分離又はろ過などの方法を用いて細胞を分離し、生細胞密度を維持しながら使用済み培地を除去することもできる。 灌流培養の利点は、目的タンパク質が生産される培養が、バッチ培養法又はフェドバッチ培養よりも長期間維持されることである。
  灌流は、連続的、段階的、断続的又はこれらの組み合わせの何れの形態でもよい。好ましくは、連続的な形態がよい。動物細胞は、培養物中に保持され、除去される使用済みの培地は、細胞を実質的に含まないか、又は培養物よりもはるかに少ない細胞を有していてもよい。細胞培養によって発現される生産物は膜孔径の選択により、培養物中に保持又は回収することができる。
　灌流培養における細胞培養液の連続分離方法は、好ましくは膜濾過であり、より好ましくは交互接線流濾過（Alternating Tangential Flow Filtration：ＡＴＦ）である。
　濾過時の流束であるＹ［Ｌ／ｍ２／ｈｏｕｒ］は、好ましくは０＜Ｙ≦１０であり、より好ましくは０＜Ｙ≦５であり、さらに好ましくは０＜Ｙ≦２である。
　濾過時の流束とは、単位時間、単位ろ過面積あたりに膜を透過する培養液量のことであり、以下式で定義される。
　灌流比は特に限定されないが、一般的には０．３ｖｖｄ～５．０ｖｖｄであり、好ましくは０．５ｖｖｄ～２．０ｖｖｄであり、より好ましくは０．５ｖｖｄ～１．４ｖｖｄである。ｖｖｄは、１日間の細胞培養液体積あたりの細胞培養液を新鮮培地へ交換する量を意味し、つまり供給培地のｖｏｌｕｍｅ／培養液のｖｏｌｕｍｅ／Ｄａｙである。
　培養液から生産物を取り出すための方法は、ろ過膜の２次側からポンプで引き抜くことができるが、利用可能な他の送液手段を用いてもよい。抜き出された培養液は、例えば、生産物の回収、死細胞の除去等の処理が行われる。また抜き出された培養液は、生産物の回収、死細胞の除去等の処理後に、一部廃却してもよいし、培養容器へ戻してもよい。上記処理により培養液のロスが発生した場合、例えば、培養容器に新鮮培地を供給することにより補うことができる。
　灌流培養において、細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である目標細胞密度に到達した後に、１日につき少なくとも１度以上細胞を含む培養液を取り出すことにより、細胞密度を、上記目標細胞密度±１０％以内に調整することができる。
　この培養中の生細胞密度が過剰にならないよう、培養液の一部を細胞ごと抜き取ることにより生細胞密度を減らすことをセルブリーディング（セルブリード）といい、抜き出した培養液と同量の新鮮な培地を加えることで培養液の量を維持することができる。１日に１度以上とは、連続的に自動的にセルブリードする場合も含む。
　灌流培養の期間（この期間は、灌流を開始し始めてからの培養期間であり、細胞が高密度になる前の期間も含む期間である。）は、特に限定されないが、一般的には１日以上１０００日以下であり、好ましくは７日以上１０００日以下であり、より好ましくは１８日以上５００日以下であり、さらに好ましくは２５日以上２００日以下であり、さらに好ましくは３０日以上１００日以下である。灌流は、播種を０日目として、２日後から開始してもよい。
　細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である生産物の生産のための培養の期間は、好ましくは５日以上９９０日以下であり、５日以上４５０日以下でもよく、より好ましくは１０日以上４５０日以下であり、さらに好ましくは１５日以上１９０日以下であり、さらに好ましくは２０日以上９０日以下である。
　本発明においては、灌流培養の期間のうち少なくとも１３日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．０２９の範囲で制御され、好ましくは０≦Ｘ＜０．０１５の範囲で制御され、より好ましくは０≦Ｘ＜０．０１２７、より好ましくは０≦Ｘ＜０．００８の範囲で制御される。
　本発明においては、灌流培養の期間のうち少なくとも１３日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が０であってもよい。Ｘが０である場合とは、培地供給とは別のラインからのアルカリの添加を行わないことを意味する。
　本発明においては、好ましくは、灌流培養の期間のうち５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％）の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．０２９の範囲で制御される。
　アルカリとしては、特に限定されないが、好ましくはＮａ２ＣＯ３、ＮａＯＨまたはＮａＨＣＯ３であり、より好ましくはＮａＨＣＯ３および／またはＮａ２ＣＯ３であり、特に好ましくはＮａＨＣＯ３である。アルカリは、水溶液（例えば、Ｎａ２ＣＯ３水溶液、ＮａＯＨ水溶液またはＮａＨＣＯ３水溶液）として添加することができる。
　Ｎａ２ＣＯ３またはＮａＨＣＯ３をそれぞれ細胞培養液に添加する場合、ＮａＨＣＯ３を添加した細胞培養液の方が粘度が低くなる傾向がある。即ち、ＮａＨＣＯ３の方がＮａ２ＣＯ３よりも培養液をゲル化させる作用が弱く、膜詰まりを抑制しやすいと言えることから、ＮａＨＣＯ３を使用することが特に好ましい。
　アルカリの添加開始時期は培養開始から７日以降であり、好ましくは６日以降であり、更に好ましくは５日以降である。
　添加されるアルカリ水溶液のｐＨは、７＜ｐＨ＜１３であり、好ましくは７．５＜ｐＨ＜１２であり、より好ましくは７．５＜ｐＨ＜１０であり、さらに好ましくは８＜ｐＨ＜１０である。
　アルカリ水溶液のｐＨ測定は、アルカリが水に溶解した時点で測定する。ｐＨの測定は一般的に市販されているｐＨセンサで測定可能である。例えば、Ｍｅｔｔｌｅｒ　ＴＯＬＥＤＯ社のｐＨメータ（Ｓｅｖｅｎ　Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ、Ｓｅｖｅｎ　Ｄｉｒｅｃｔ、Ｆｉｖｅ　Ｅａｓｙ）がある。
　添加されるアルカリ水溶液の濃度Ｚ［ｍｏｌ／Ｌ］は、好ましくは０＜Ｚ＜５であり、より好ましくは０＜Ｚ＜３であり、さらに好ましくは０＜Ｚ＜２である。
　灌流培養の全期間において、アルカリを全く添加せずに培養することも可能である。しかしアルカリを添加しないことで培養液ｐＨが低くなり産生物の品質が悪化することもある（表３）。このような場合、産生物の品質を維持しつつ、かつ膜詰まりを促進させないようにする手法が求められる。
　培養液ｐＨがある値Ｍを下回ったときに、アルカリを培地にＮ［ｍｏｌ／Ｌ］追加することで、膜詰まりを抑制しかつ抗体品質を良化することができる。即ち、アルカリを添加せずに培養を行う場合において培養液のｐＨが低下する場合には、アルカリを追加した培地を供給することにより、培養液のｐＨを制御することができる。Ｎの分母は調液後の培地体積である。このときアルカリを増やした培地を新規に調液し、旧培地（培養槽へ供給中の培地）が入った容器と培養槽に繋がるチューブを熱溶接機を使って、新培地が入った容器と無菌的に繋ぎかえて供給を開始する。または培養槽と接続されている培地が入った容器に、無菌的にアルカリを追加してもよい。培養液ｐＨのある値Ｍは６．８５であり、好ましくは６．８０であり、更に好ましくは６．７５である。
　培地に追加するアルカリの量であるＮ［ｍｏｌ／Ｌ］は、１．０×１０－３～２．０ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは２．０×１０－３～１．０ｍｏｌ／Ｌであり、更に好ましくは１．０×１０－２～２．０×１０－１ｍｏｌ／Ｌである。ここでの培地に追加するアルカリは、培養液中に直接添加するアルカリではなく、培養槽へ供給される前の培地に追加されるアルカリを意味する。一例としては、培養液のｐＨが６．８５を下回ったときに、１．０×１０－３～２．０ ｍｏｌ／Ｌのアルカリを追加した培地を供給することができる。
　このようにアルカリを直接培養液中に添加せずに培養を行う場合において培養液のｐＨが低下する場合には、ｐＨを高めた培地を供給することにより、培養液のｐＨを制御することができる。このｐＨを高めた培地は、事前に準備してもよいし、培養液のｐＨに変化がみられたときに準備を始めることもできる。ｐＨがＭを下回り始めて２４時間以内に、供給培地をｐＨを高めた培地に切り替えて、灌流培養を行うことができる。好ましくは、１２時間以内であり、より好ましくは６時間以内であり、更に好ましくは３時間以内であり、更に好ましくは１時間以内であり、更に好ましくは３０分以内であり、更に好ましくは５分以内である。
　調液量は培養液量に対して、０．５～１０倍量であることが好ましい。培地に追加するアルカリとしては、特に限定されないが、好ましくはＮａ２ＣＯ３、ＮａＯＨまたはＮａＨＣＯ３であり、より好ましくはＮａＨＣＯ３および／またはＮａ２ＣＯ３であり、特に好ましくはＮａＨＣＯ３である。
　灌流培養において添加される培地のｐＨは、好ましくは７．０～８．０であり、より好ましくは、７．０～７．８であり、さらに好ましくは、７．０～７．６である。　
　培地のｐＨは５％ＣＯ２かつ３７℃インキュベート下で１日保管した後、一般的に市販されているｐＨセンサで測定可能である。例えば、Ｍｅｔｔｌｅｒ　ＴＯＬＥＤＯ社のｐＨメータ（Ｓｅｖｅｎ　Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ、Ｓｅｖｅｎ　Ｄｉｒｅｃｔ、Ｆｉｖｅ　Ｅａｓｙ）がある。
　好ましくは、培養中の培養液の平均ｐＨは６．７～７．２であり、より好ましくは６．８～７．０である。
　好ましくは、培養中の培養液の最低ｐＨは６．６以上であり、より好ましくは、６．７以上であり、さらに好ましくは、６．８以上である。
　好ましくは、培養中の培養液のｐＨは、培養液中のｐＨをインラインで測定しながら、自動でアルカリ水溶液を添加することにより制御することができる。
　好ましくは、灌流培養においては、消泡剤を添加することができる。消泡剤の消泡成分としては、シリコーン系が好ましく、ジメチコンが特に好ましい。消泡剤の消泡成分としては、ポリジメチルシロキサンを含むものが好ましく、より好ましくはポリジメチルシロキサンに微粉末シリカを含むものである。消泡剤としては、例えば、Ｃｙｔｉｖａ社製　ＨｙＣｌｏｎｅ　ＡＤＣＦ　Ａｎｔｉｆｏａｍ　Ａｇｅｎｔを使用することができる。さらに好ましくは、アルカリの添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］と、１日あたりのジメチコンの添加速度であるＢ［ｇ／Ｌ／ｄａｙ］とは、好ましくは、Ｂ＜－０．７９Ｘ＋０．０２２８を満たす。このときＢは負の値にはならない。そのためＸ≦０．０２８８となる。
Ｂの分母は培養槽、ＡＴＦに含まれる培養液の体積である。
この関係を満たすことにより、膜詰まりを、より効果的に抑制することができるようになる。
　本発明における細胞の培養において用いることができる細胞培養装置の一例を図１に示す。図１においては、培養容器１４は、細胞を含む培養液を収容する容器である。培養容器１４の内部における培養液において細胞が培養される。
　培地供給配管１からは培地が、培養容器に供給される。
　消泡剤供給配管２からは発泡を抑制するための消泡剤が、培養容器に供給される。
　アルカリ供給配管３からはアルカリが、培養容器に供給される。アルカリ添加をしない場合は、アルカリ供給配管３はなくてもよい。
　送気配管４からは二酸化炭素（ＣＯ２）および空気が、培養容器の内部の培養液の上部に導入される。
　スパージャー送気配管５からは酸素（Ｏ２）及び／または空気が送られ、酸素及び／または空気は、孔径２０μｍのスパージャー１５を介して培養液に導入される。スパージャー１５により、培養液内の溶存酸素濃度を調節することができる。スパージャーとしては、特に限定されないが、例えば、ガス放出部の平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり（一例としては孔径２０μｍ）、酸素を３０体積％以上含むガスを放出するスパージャーを使用することができる。
　排気管６は、排気のためのパイプであり、その末端には排気フィルター（図には示されていない）が接続していてもよい。
　サンプリング管７は、培養液を採取（サンプリング）したり、培養液を抜き出す（セルブリード）ためのパイプである。自動で連続的にセルブリードする場合は別途配管設置してもよい(図示せず)。
　ｐＨセンサー８が、培養液に接触するように装着されている。
　溶存酸素センサー９が、培養液に接触するように装着されている。
　細胞培養装置には、圧力センサー１０、１１及び１３を設けることができる。
　細胞培養装置には、中空糸膜１２が設置されている。
　培養容器１４の内部には、撹拌羽根１６を有する撹拌部材が設けられていてもよい。撹拌羽根１６を回転させることで、培養容器１４の内部の培養液が撹拌され、培養液の均質性が保たれる。撹拌羽根１６により培養液が撹拌されることにより、スパージャーにより放出される泡も撹拌される。撹拌羽根を有する撹拌部材の位置、撹拌羽根のサイズ等は、特に限定されず、使用する細胞種、培養液の量、供給する酸素の量、スパージャーの位置、数、サイズ等に応じて設計すればよい。また、スパージャーから出る泡を素早く撹拌し、泡の合一を抑制させるためには、スパージャーから近い位置に撹拌羽根１６が配置されることが好ましい。
　本発明においては、培養容器から抜き出した細胞懸濁液を分離膜に通過させて、細胞含有液と透過液とに分離してもよい。この操作は、細胞培養装置を用いて行うことができる。この操作においては、培養容器中から抜き出した細胞懸濁液は、上記細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する細胞含有液と、上記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する透過液とに分離される。細胞濃度はＢｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ製　生死細胞アナライザー　Ｖｉ－ＣＥＬＬ　ＸＲによって測定することができる。
　上記した膜分離処理工程は、タンジェンシャルフィルトレーションであることが好ましく、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ（ＡＴＦ）ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎやＴａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎであることがより好ましく、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎであることが最も好ましい。Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ　ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを行えるフィルターとしては、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製のＳｕＡＴＦ１０－Ｓ０２ＰＥＳや、Ｆ２　ＲＦ０２ＰＥＳ等がある。
　細胞培養に用いる培地としては、通常の動物細胞の培養で使用されている培地を用いることができる。例えば、ＣＤ　ＯｐｔｉＣＨＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ－１５培地、及びＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＣＨＯ－ＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＣＤ－ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＩＳ  ＣＨＯ－Ｖ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＦ－ＡＣＦ－ＣＨＯ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）などを使用することができる。又は自作培地を用いてもよい。
　培地には牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加してもよいし、血清を添加しなくてもよい。 培地には、アミノ酸、塩、糖類、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素、植物タンパク質の加水分解物などの追加成分を補充してもよい。タンパク質不含培地を用いることもできる。
　培養温度は、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは３２℃～３９℃であり、より好ましくは３６℃～３８℃であり、培養中に培養温度を変更してもよい。
  培養は、ＣＯ２濃度が０～４０体積％、好ましくは２～２５体積％、さらに好ましくは３～２０体積％の雰囲気下で行うことができる。
　培養液の量は、好ましくは０．５Ｌ以上であり、より好ましくは５０Ｌ以上であり、さらに好ましくは２００Ｌ以上である。
　培養においては、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加えることができる。培養液の攪拌を行う場合、攪拌回転数は特に限定されないが、単位体積当たりの攪拌動力は、一般的には１０～３００ｋＷ／ｍ３であり、好ましくは２０～２００ｋＷ／ｍ３であり、より好ましくは３０～１００ｋＷ／ｍ３である。
　培養液における溶存酸素濃度は適宜設定することができ、特に限定されないが、一般的には１０～１００％であり、好ましくは３０～９０％である。
　また、細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上に維持される期間の溶存ＣＯ２濃度は、好ましくは６０～１８０ｍｍＨｇであり、より好ましくは、８０～１６０ｍｍＨｇであり、さらに好ましくは、１００～１４０ｍｍＨｇである。
　細胞培養は、本明細書において上記した構成を有する細胞培養装置を用いて行うことができる。細胞培養装置としては、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、又は充填槽型培養装置等のいずれでもよい。培養容器は、培養環境の均質化等の観点からは、シングルユース培養槽であることが好ましい。
　細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である生産物の生産のための培養液の粘度は、好ましくは１．２ｍＰａ・ｓ以上１５ｍＰａ・ｓ未満であり、より好ましくは１．４ｍＰａ・ｓ以上１２ｍＰａ・ｓ未満であり、さらに好ましくは１．６ｍＰａ・ｓ以上１０ｍＰａ・ｓ未満であり、特に好ましくは１．６ｍＰａ・ｓ以上５ｍＰａ・ｓ未満であり、最も好ましくは１．６ｍＰａ・ｓ以上３ｍＰａ・ｓ未満である。
　本発明における細胞の種類は特に限定されないが、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。細胞は、好ましくは、動物細胞（より好ましくは哺乳類細胞）、又は昆虫細胞であり、哺乳類細胞が最も好ましい。細胞としては、初代細胞でも株化細胞でもよい。
　細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ細胞（Human Embryonic Kidney 由来細胞）、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ミエローマ細胞（ＮＳ０細胞など）、ＰｅｒＣ６細胞、ＳＰ２／０細胞、ハイブリドーマ細胞、ＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来細胞）、３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞）、ＰＣ１２細胞、ＷＩ３８細胞などを挙げることができる。細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞であってもよい。上記の中でも、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ハイブリドーマが好ましく、より好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞であり、最も好ましくはＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞は、組換えタンパク質、例えば、サイトカイン、凝固因子、及び抗体の産生に広く使用されている。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を欠損したＣＨＯ細胞を使用することが好ましく、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞としては、例えば、ＣＨＯ－ＤＧ４４を使用することができる。
　細胞の生存率としては、高い方が好ましいが、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
　これらの細胞は、発現させたいタンパク質（例えば、抗体など）をコードする外来遺伝子を導入した細胞であってもよい。細胞としては、抗体を産生する細胞であることが好ましい。発現させたいタンパク質をコードする外来遺伝子を細胞に導入するためには、発現ベクターを使用することができる。発現させたいタンパク質をコードするＤＮＡと、発現調節配列（例えば、エンハンサー、プロモーター及びターミネーターなど）と、所望により選択マーカー遺伝子とを含む発現ベクターを細胞に導入することにより、発現させたいタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した細胞を作製することができる。発現ベクターとしては特に限定はなく、細胞の種類、用途などに応じて適宜選択して使用することができる。
  プロモーターとしては、哺乳動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）のプロモーター及びエンハンサー等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
  選択マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクター（ＤＨＦＲ）遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子など）、又は蛍光遺伝子（緑色蛍光タンパクＧＦＰなどをコードする遺伝子）などを用いることができる。
  細胞に発現ベクターを導入する方法は、特に限定はなく、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、ジーンガン法及びリポフェクション法などを用いることができる。
　本発明による生産物の製造方法は、細胞培養装置を用いて細胞を培養して上記細胞から生産物を産生させることを含む。
　本発明によれば、本発明による生産物の製造方法により製造される生産物が提供される。
  本発明において、生産物の種類は特に限定されないが、好ましくはタンパク質であり、より好ましくは組み換えタンパク質である。生産物としては、例えば、組み換えポリペプチド鎖、組み換え分泌ポリペプチド鎖、抗原結合タンパク質、抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、バイスペシフィック抗体など）、Ｆｃ融合タンパク質、断片化免疫イムノグロブリン、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。また、他にもアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスなどであってもよい。
　生産物は、好ましくは抗体であり、より好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はマウス抗体である。断片化免疫イムノグロブリンとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどが挙げられる。抗体のクラスも特に限定されるものではなく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどいずれのクラスでもよいが、医薬として用いる場合はＩｇＧ及びＩｇＭが好ましい。
  ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される１つ又は複数の可変及び定常領域を有する全ての抗体を含む。一実施形態では、可変及び定常ドメインの全てが、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される（完全ヒト抗体）。
  ヒト化抗体は、ヒト対象に投与されたときに、非ヒト種抗体と比較して、ヒト化抗体が免疫反応を誘発する可能性が低くなるように、及び／又は重篤な免疫反応の誘発がより少なくなるように、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加により非ヒト種から誘導された抗体の配列と異なる配列を有する。一例では、非ヒト種抗体の重鎖及び／又は軽鎖のフレームワーク及び定常ドメイン内のある特定のアミノ酸は、ヒト化抗体を産生するように変異している。別の例では、ヒト抗体からの定常ドメインは、非ヒト種の可変ドメインに融合される。
  キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス・ヒト異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。上記ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産されるキメラ抗体を取得できる。
  バイスペシフィック抗体とは、２つの異なる抗原特異性を認識する抗体である。様々な形態のバイスペシフィック抗体が存在する。バイスペシフィック抗体を作製する方法としては、２つのイムノグロブリン分子をN-サクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオール) プロピオネート又はS-アセチルメルカプトサクシニックアシッドアンハイドライドなどの架橋剤を用いて結合して作製する方法、イムノグロブリン分子のFabフラグメントどうしを結合して作製する方法などが報告されている。また、バイスペシフィック抗体をコードする遺伝子を細胞に導入することにより、発現させることも可能である。
  Ｆｃ融合タンパク質とは、Ｆｃ領域を有するタンパク質を示し、抗体を含む。
  Ｆａｂは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価断片である。
  Ｆ（ａｂ’）２は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を有する二価断片である。
  Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインを有する。
  一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して接合して、連続したタンパク質鎖を形成する抗体であり、ここでリンカーは、タンパク質鎖をそれ自身に折り重ね、一価抗原結合部位を形成させるのに十分な長さである。
　抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗ＩＬ－６レセプター抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗グリピカン－３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＶＬＡ４抗体などが挙げられる。
　生産物の回収は、単に培養液を回収してもよいし、例えば、フィルタ又は遠心分離機を用い、培養液から細胞の少なくとも一部を除いた液体を回収してもよく、公知の方法が特に制限なく用いられる。生産物の純度を向上したり、溶媒を変更したり、例えば粉末状にするなど形態を変更したい場合には、培養液又は上記液体をさらなる処理に供することができる。
　また、灌流しながら培養液の一部を回収する、又は、灌流しながら灌流中の培養液の一部に対してフィルター又は遠心分離機を用い、培養液から細胞の少なくとも一部を除いた液体を回収することも可能である。 
　生産物は、精製処理により精製することができる。得られた生産物は、高い純度にまで精製することができる。生産物の分離及び精製は通常のタンパク質で使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外ろ過、塩析、透析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択及び組み合わせることにより、生産物を分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。上記で得られた生産物の濃度測定は、吸光度測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。また、生産物が抗体である場合、抗体の力価（Ｔｉｔｅｒ）は、Ｒｏｃｈｅ社のＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏなどの市販の分析機器で測定することもできる。
  アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；高速液体クロマトグラフィー）又はＦＰＬＣ（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
  なお、生産物には、精製前又は精製後に適当なポリペプチド修飾酵素を作用させることにより、生産物を修飾したり、部分的にペプチドを除去することもできる。ポリペプチド修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
　本発明により製造される生産物は、例えばバイオ医薬品及び再生医療等において用いることができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜抗体産生細胞の樹立＞
　ＩｇＧ１及びIｇＧ４をコードする核酸配列を含むベクターを構築し、構築したベクターをＣＨＯ－ＤＧ４４細胞へ導入することにより、ＩｇＧ１を発現させるＣＨＯ－ＤＧ４４細胞（ＩｇＧ１細胞）とＩｇＧ４を発現させるＣＨＯ－ＤＧ４４細胞（ＩｇＧ４細胞）を作製した。ベクターの構築及び細胞への導入は、特表２０１６－５１７６９１号公報の実施例２に準じて行った。上記により、モノクローナル抗体を産生するＣＨＯ細胞を準備し、以下の実験において使用した。
＜細胞培養＞
　実施例及び比較例においては、図１に示す細胞培養装置を用いて実験を行った。概要としては、灌流培養により抗体を産生するＣＨＯ細胞を１２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬまで増殖させ、１２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に到達した時点よりセルブリードを開始し、中空糸膜の詰まり日数等を評価した。詳細は以下の通りである。
　２Ｌガラス培養槽（製品名、ＡＢＬＥ社製）に１Ｌの培地を投入した。培地はＣＤ　ＯｐｔｉＣＨＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で、この培地にポロキサマー（ポロキサマー－１８８）を０．９質量％加えた。
　０日目に細胞を０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した。
　撹拌回転数１５０ｒｐｍ、上面からは空気（Ａｉｒ）３８ｍＬ／分＋ＣＯ２２ｍＬ／分、下面からは培養液中の酸素濃度が８０％になるように培養槽に設置されたスパージャーからＯ２を自動制御により供給した。
　培養槽中のｐＨが７．０になるよう培養槽中のｐＨを読み取って、ｐＨが７．０を下回ったときに自動で１．０ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３水溶液を添加し、ｐＨ制御を開始した。
　播種後２日目に培養した後、灌流比０．８ｖｖｄで培地を連続供給しながら、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製ＡＴＦ２で細胞培養液を連続濾過し回収液を回収した。
　更に５日目に灌流比１．６ｖｖｄに変更した。
　更に６日目に消泡剤中のシメチコンの添加速度を７．２ｍｇ／ｄａｙ／Ｌとした。
　更に７日目に培養液のｐＨが下がり、培養液中にアルカリ水溶液が自動添加され始める。
　更に９から１１日目に、細胞密度が１２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに到達したら、細胞密度が１２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで維持されるよう培養液の一部を引き抜きながら、セルブリードを行った。
　膜詰まりが発生し、ＡＴＦが動作できなくなるまで培養を継続した。
　使用する培地、シメチコンの添加速度、ｐＨ制御等を、下記表に記載の通り変更して複数の実験を行った。
＜評価方法＞
（１）細胞密度、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙの測定
　培養槽内の培養液を抜き取り、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＣｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｖｉ－ｃｅｌｌ　ＸＲを用い測定した。なおＶｉ－ｃｅｌｌソフトはＶｉ－ｃｅｌｌ　ＸＲ２．０４を用い、測定時のパラメータは以下のように設定した。
　Ｍｉｎ　ｄｉａｍｅｔｅｒ：６μｍ、　Ｍａｘ　ｄｉａｍｅｔｅｒ：５０μｍ
　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ：細胞濃度が１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下のときは、サンプル希釈せず、Ｄｉｌｕｔｉｏｎを１とした。
　細胞濃度が１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬより高いときは、サンプルを１０倍希釈し、Ｄｉｌｕｔｉｏｎを１０とした。
　Ｃｅｌｌ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：７５％、　Ｃｅｌｌ　ｓｈａｒｐｎｅｓｓ：１００
　Ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｐоｔ　ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：７５％
　Ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓｐоｔ　ａｒｅａ：５％
　Ｍｉｎｉｍｕｍ　ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ：０
　Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒ　ｄｅｇｒｅｅ：Ｍｅｄｉｕｍ
（２）ｐＨ，溶存ＣＯ２の測定
培養槽内の培養液を抜き取り、ＳＩＥＭＥＮＳ社のＲＡＰＩＤＬａｂ　３４８ＥＸを用い測定した。生産期において溶存ＣＯ２は１２０ｍｍＨｇとなるように、送気配管の二酸化炭素（ＣＯ２）流量を調整した。
（３）微粒子（デブリ）密度の測定
　培養槽内の培養液を抜き取り、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＩＳＯＴＯＮで１００００倍希釈した。上記希釈培養液をＢｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社の精密粒度分布測定装置　Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ　４ｅで１．４６～２０μｍの粒度分布を測定した。
（４）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）測定
　培養液を抜き取り、３００Ｇ／５分で細胞と上清を分離した。上清をＲｏｃｈｅ社のＣｅｄｅｘ　Ｂｉｏで測定した。
（５）抗体品質の測定
　培養槽内の培養液を抜き取り、Ｃｙｔｉｖａ社のＷｈａｔｍａｎ　（Ｐｏｒｅ　Ｓｉｚｅ０．２μｍ，２５ｍｍ　Ｄｉａｍｅｔｅｒ）で細胞を濾過する。ｐＨ６．０で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ　Ｓｕｒｅカラムに上記培養上清を負荷し、ｐＨ３．２で抗体を溶出させた。
　抗体電荷の評価は、上記の抗体回収液を陽イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で測定した。
　マンノース５（Ｍ５）の評価は、得られた抗体回収液の抗体をペプチド-Ｎ-グリコシダーゼＦで消化処理することでＮ型糖鎖を切り出し、２－アミノベンズアミドで蛍光標識した。
　上記処理した抗体のＭ５をＣ１８（ＯＤＳ）逆相ＨＰＬＣカラムで測定した。
（６）評価の基準
　各々の評価の基準を以下に示す。
膜詰まりの評価：
Ｓ：培養開始からの詰まるまでの日数が３０日以上であり、灌流開始からの詰まるまでの日数が２８日以上であり、セルブリード開始から詰まるまでの日数が２０日以上である場合。
Ａ：培養開始からの詰まるまでの日数が２０～２９日であり、灌流開始からの詰まるまでの日数が１８～２７日であり、セルブリード開始から詰まるまでの日数が１０～１９日である場合。
Ｂ：培養開始からの詰まるまでの日数が１５～１９日であり、灌流開始からの詰まるまでの日数が１３～１７日であり、セルブリード開始から詰まるまでの日数が５～９日である場合。
Ｃ：培養開始からの詰まるまでの日数が１４日以下であり、灌流開始からの詰まるまでの日数が１２日以下であり、セルブリード開始から詰まるまでの日数が４日以下である場合。
抗体電荷の評価：
Ａ：Ａｃｉｄｉｃピークの面積の割合Ｘが１４％≦Ｘ≦２２％、Ｂａｓｉｃピークの面積の割合Ｘが１１％≦Ｘ≦１９％の両方を満たすこと。
Ｂ：Ａｃｉｄｉｃピークの面積の割合Ｘが１０％≦Ｘ＜１４％あるいは２２％＜Ｘ≦２６％であること、およびＢａｓｉｃピークの面積の割合Ｘが６％≦Ｘ＜１１％あるいは１９％＜Ｘ≦２３％であることのうちのいずれか１つ以上に該当すること。
Ｃ：Ａｃｉｄｉｃピークの面積の割合ＸがＸ＜１０％あるいは２６％＜Ｘであること、およびＢａｓｉｃピークの面積の割合ＸがＸ＜６％あるいは２３％＜Ｘであることのうちのいずれか１つ以上に該当すること。
ピークの面積の割合とは、全クロマトグラフィのピーク面積の合計に対するＡｃｉｄｉｃ成分のクロマトグラフィのピーク面積あるいはＢａｓｉｃ成分のクロマトグラフィのピーク面積の割合のことである。
抗体のＭ５の評価：
Ａ：Ｍ５のピーク面積の割合Ｘが０％≦Ｘ≦５％
Ｂ：Ｍ５のピーク面積の割合Ｘが５％＜Ｘ≦６％
Ｃ：Ｍ５のピーク面積の割合Ｘが６％＜Ｘ
ピーク面積の割合とは、全クロマトグラフィのピーク面積の合計に対するＭ５（Ｍａｎｎｏｓｅ５）成分のクロマトグラフィのピーク面積の割合のことである。
＜測定および評価の結果＞
　測定及び評価の結果を表２および表３に示す。
　表３に示す通り、実施例５、１０、１１においては、製造される抗体の品質が良好であることが確認できた。
　実施例1～３、５及び７～９における、アルカリ添加速度と膜詰まりまでの日数との関係を図２に示す。図２の結果から、アルカリ添加速度を低くすることにより、膜詰まりを抑制できることが分かる。
　実施例１～３、５及び７～９における、アルカリ添加速度と微粒子密度との関係を図３に示す。微粒子密度は１～６μｍの細胞密度の累積個数とした。微粒子は、細胞（１４μｍ）由来のカス／破片であり、細胞ダメージの指標である。図３の結果から、アルカリ添加速度を低くすることにより、細胞ダメージを抑制できることが分かる。
　実施例１～３、５及び７～９における、アルカリ添加速度とＬＤＨとの関係を図４に示す。ＬＤＨは、ダメージを受けた細胞から漏洩する酵素成分であり、細胞ダメージの指標として一般的に用いられている。図４の結果から、アルカリ添加速度を低くすることにより、細胞ダメージを抑制できることが分かる。
　また、実施例１～９、１１及び比較例１における、アルカリ添加速度と消泡剤添加速度と膜詰まりまでの日数との関係を図５に示す。消泡剤添加速度が高く、アルカリ添加速度が高いほど、膜詰まりしやくすくなることが分かる。アルカリの添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］と、消泡剤であるジメチコンの添加速度であるＢ［ｇ／Ｌ／ｄａｙ］とが、Ｂ＜－０．７９Ｘ＋０．０２２８を満たす領域が、膜詰まりの評価がＳである領域である。
１　培地供給配管
２　消泡剤供給配管
３　アルカリ供給配管
４　送気配管
５　スパージャー送気配管６　排気管
７　サンプリング管
８　ｐＨセンサー
９　溶存酸素センサー
１０　圧力センサー
１１　圧力センサー
１２　中空糸膜
１３　圧力センサー
１４　培養容器
１５　スパージャー
１６　撹拌羽根

Claims (28)

  1. 細胞を培養することを含む、生産物の製造方法であって、
    生産物の生産時における細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの灌流培養であり、灌流培養の期間は１３日以上５００日以下であり、
    前記灌流培養の期間のうち少なくとも１日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．０２９の範囲で制御され、添加されるアルカリ水溶液のｐＨは、７＜ｐＨ＜１３である、
    生産物の製造方法。
  2. 前記灌流培養における細胞密度が１００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上３００×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の生産物の製造方法。
  3. 前記灌流培養の期間が１８日以上５００日以下である、請求項１又は２に記載の生産物の製造方法。
  4. 生産物の生産のための培養の期間が、５日以上４５０日以下である、請求項１から３の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  5. 前記灌流培養の期間のうち少なくとも１３日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．００８の範囲で制御される、請求項１から４の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  6. 前記灌流培養の期間のうち少なくとも１３日以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が０である、請求項１から５の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  7. 前記灌流培養の期間のうち５０％以上の期間において、１日あたりのアルカリ添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］が、０≦Ｘ＜０．０２９の範囲で制御される、請求項１から６の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  8. 前記灌流培養における細胞培養液の連続分離方法が、膜濾過である、請求項１から７の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  9. 前記膜濾過が、ＡＴＦと称される交互接線流濾過である、請求項１から８の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  10. 濾過時の流束であるＹ［Ｌ／ｍ２／ｈｏｕｒ］が、０＜Ｙ≦１０である、請求項８又は９に記載の生産物の製造方法。
  11. 前記培養中の培養液の平均ｐＨが６．７～７．２である、請求項１から１０の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  12. 前記培養中の培養液の最低ｐＨが６．６以上である、請求項１から１１の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  13. 前記培養中の培養液のｐＨが、培養液中のｐＨをインラインで測定しながら、自動でアルカリ水溶液を添加することにより制御される、請求項１から１２の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  14. 前記灌流培養において、細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である目標細胞密度に到達した後に、細胞を含む培養液を取り出すことにより、細胞密度を、前記目標細胞密度±４０％以内に維持し、細胞密度が前記目標細胞密度±４０％以内に維持された期間において、生産物を回収する、請求項１から１３の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  15. 前記灌流培養において、細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である目標細胞密度に到達した後に、１日につき少なくとも１度以上細胞を含む培養液を取り出すことにより、細胞密度を、前記目標細胞密度±１０％以内に調整することを含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  16. 前記細胞密度が８０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上に維持される期間の溶存ＣＯ２濃度が６０～１８０ｍｍＨｇである、請求項１から１５の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  17. 前記アルカリがＮａＨＣＯ３および／またはＮａ２ＣＯ３である、請求項１から１６の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  18. 前記アルカリがＮａＨＣＯ３である、請求項１から１７の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  19. 前記アルカリ水溶液の濃度Ｚ［ｍｏｌ／Ｌ］が、０＜Ｚ＜５である、請求項１から１８の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  20. 灌流培養において添加される培地のｐＨが７．０～８．０である、請求項１から１９の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  21. アルカリを添加せずに培養を行う場合において培養液のｐＨが低下する場合には、アルカリを追加した培地を供給することにより、培養液のｐＨを制御する、請求項１から２０の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  22. 培養液のｐＨが６．８５を下回ったときに、１．０×１０－３～２．０ ｍｏｌ／Ｌのアルカリを追加した培地を供給することを含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  23. 前記灌流培養においてジメチコンを含有する消泡剤が添加され、
    前記アルカリの添加速度であるＸ［ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙ］と、前記ジメチコンの添加速度であるＢ［ｇ／Ｌ／ｄａｙ］とが、Ｂ＜－０．７９Ｘ＋０．０２２８を満たす、請求項１から２２の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  24. 前記灌流培養の全期間において、アルカリ添加を行わない、請求項１から２３の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  25. 前記細胞が動物細胞である、請求項１から２４の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  26. 前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１から２５の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  27. 前記生産物が抗体である、請求項１から２６の何れか一項に記載の生産物の製造方法。
  28. 請求項１から２７の何れか一項に記載の生産物の製造方法により製造される、生産物。
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