WO2023190938A1 - α－アミラーゼ変異体 - Google Patents

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amino acid
substitution
acid residue
position corresponding
amylase
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真緒 釋
貴大 日置
彰人 川原
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Kao Corp
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    • C11D2111/14—Hard surfaces

Definitions

  • the present invention relates to mutants of ⁇ -amylase.
  • ⁇ -amylase is used in a wide range of industrial fields, including the starch industry, brewing industry, textile industry, pharmaceutical industry, and food industry.It is also known for its suitability for blending into cleaning agents, and is used as an ingredient to remove starchy stains. It is blended into dishwashing agents for automatic dishwashers, laundry detergents, etc.
  • ⁇ -amylase useful for cleaning agents examples include ⁇ -amylase AP1378 derived from Bacillus sp. KSM-1378 (FERM BP-3048) strain (Patent Document 1), and ⁇ -amylase derived from Bacillus licheniformis. In addition to Termamil and Duramil (registered trademark), ⁇ -amylase AA560 derived from Bacillus sp. DSM12649 strain (Patent Document 2), ⁇ -amylase SP722 derived from Bacillus sp.
  • SP722 strain (Patent Document 3) SEQ ID NO: 4), ⁇ -amylase CspAmy2 derived from the genus Cytophaga (Patent Document 4), A and B domains of ⁇ -amylase AAI10 derived from the genus Bacillus, and ⁇ -amylase chimera derived from Alicyclobacillus species.
  • LABM SEQ ID NO: 13 of Patent Document 5
  • these ⁇ -amylases have been modified to improve their functions for specific uses, and for example, mutants with improved stability in detergents have been reported (Patent Document 6).
  • mutations do not necessarily produce similar effects, and it is necessary to spend a lot of effort on each parent enzyme, especially in order to obtain multiple mutants with significantly improved specific properties. be.
  • the above ⁇ -amylase for detergents is also required to have improved stability in detergents that are acidic or contain chelating agents, particularly detergents that are acidic and contain chelating agents.
  • Patent Document 1 International Publication No. 94/26881
  • Patent Document 2 International Publication No. 00/60060
  • Patent Document 3 International Publication No. 06/002643
  • Patent Document 4 International Publication No. 2014/164777
  • Patent Document 5 Japanese Patent Publication No. 2018-516553
  • Patent Document 6 International Publication No. 98/044126
  • the present invention relates to the following. 1) ⁇ -Amylase A having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, ⁇ -amylase having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 B. ⁇ -amylase C having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8; ⁇ -amylase having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 D, or ⁇ -amylase variants A1, B1, C1, D1 and E1 each having ⁇ -amylase E having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 as a parent amylase, , A1 to E1 each contain deletions of two amino acid residues selected from positions corresponding to positions 178 to 181 according to the numbering of SEQ ID NO: 1, and 178, 181 according to the numbering of SEQ ID NO: 2, An ⁇ -amylase variant comprising substitution of amino acid residues at three or more positions selected
  • substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 with H substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 with E or Q, and amino acid residue at the position corresponding to position 239
  • substitution of residue to Q b) substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 to H, substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 to E or Q, and position 239 c)
  • D1 substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 with H, substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 with E or Q, amino acid at the position corresponding to position
  • the present invention relates to providing an ⁇ -amylase that exhibits excellent stability at low pH and/or in the presence of a chelating agent.
  • the present inventors have discovered that when certain common amino acid modifications are made to various detergent amylases, a remarkable stabilizing effect is brought about at low pH and/or in the presence of a chelating agent.
  • an ⁇ -amylase variant that has improved stability at low pH and/or in the presence of a chelating agent compared to the parent ⁇ -amylase.
  • a chelating agent compared to the parent ⁇ -amylase.
  • amylase (EC3.2.1.1; ⁇ -D-(1 ⁇ 4)-glucan glucanohydrolase) refers to starch and other linear or branched 1,4-glycoside oligosaccharides. Alternatively, it refers to a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of polysaccharides.
  • ⁇ -Amylase activity can be determined by measuring the amount of reducing ends produced by enzymatic decomposition of starch. In addition, without being limited thereto, it can also be determined by measuring the release of pigments due to enzymatic decomposition of pigment-crosslinked starches such as Phadebas (Soininen, K., M. Ceska, and H. Adlercreutz. "Comparison between a new chromogenic ⁇ -amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine.” Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation 30.3 (1972): 291-297.)
  • the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software GENETYX Ver. It is calculated by performing an analysis using a search homology program of 12 with Unit size to compare (ktup) set to 2.
  • amino acid residue refers to the 20 types of amino acid residues that make up proteins, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L ), lysine (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W) , tyrosine (Tyr or Y) and valine (Val or V).
  • amino acid positions and variants are described using the officially recognized IUPAC one-letter amino acid abbreviations as follows.
  • the amino acid at a given position is expressed as [amino acid, position].
  • the threonine at position 226 is designated as "T226.”
  • Amino acid "substitutions” are expressed as [original amino acid, position, substituted amino acid].
  • substitution of alanine for threonine at position 226 is designated as "T226A.”
  • Amino acid “deletions” are expressed as [original amino acid, position, ⁇ ].
  • the deletion of serine at position 181 is designated "S181 ⁇ ”.
  • Variants containing multiple modifications are denoted by an additive sign (“+”).
  • R170Y+G195E represents the substitution of arginine at position 170 with tyrosine and the substitution of glycine at position 195 with glutamic acid, respectively.
  • the different modifications are separated by a slash ("/"), for example "R170Y/E” represents substitution of arginine at position 170 with tyrosine or glutamic acid.
  • operable linkage between a control region such as a promoter and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region. means. Procedures for "operably linking" genes and control regions are well known to those skilled in the art.
  • upstream and downstream with respect to a gene refer to upstream and downstream of the gene in the direction of transcription.
  • a gene located downstream of a promoter means that the gene is located on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand
  • upstream of the gene means that the gene is located on the 5' side of the promoter in the DNA sense strand. means the area on the side.
  • the term "inherent” used with respect to the function, property, or trait of a cell is used to indicate that the function, property, or trait originally exists in the cell.
  • the term “foreign” is used to describe a function, property, or trait that is not native to the cell but is introduced from outside.
  • a “foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide that is introduced into a cell from outside.
  • the foreign gene or polynucleotide may be derived from the same type of organism as the cell into which it is introduced, or may be derived from a different type of organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
  • the variant of the present invention has ⁇ -amylase A having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and ⁇ -amylase A having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • ⁇ -amylase B having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • ⁇ -amylase C having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10
  • ⁇ -amylase D having a parent amylase
  • ⁇ -amylase E having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, respectively, as a parent amylase, ⁇ -amylase variants A1, B1, C1, D1 and E1, in which A1 to E1 each contain a deletion of two amino acid residues selected from positions corresponding to positions 178-181 in the numbering of SEQ ID NO: 1, and the numbering in SEQ ID NO: 2 It contains at least the following amino acid residue substitutions at three or more positions selected from positions corresponding to positions 178, 181, 238, 239, 240, 126, 129, and 201.
  • substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 with H substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 with E or Q, and amino acid residue at the position corresponding to position 239
  • substitution of residue to Q b) substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 to H, substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 to E or Q, and position 239 c)
  • D1 substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 with H, substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 with E or Q, amino acid at the position corresponding to position
  • a "mutant” is a deletion of two amino acid residues selected from the positions corresponding to positions 178-181 in the numbering of SEQ ID NO: 1 in the amino acids constituting the parent ⁇ -amylases A to E. , at least three or more positions selected from the positions corresponding to positions 178, 181, 238, 239, 240, 126, 129 and 201 in SEQ ID NO: 2, at least the amino acid residues a) to e) above. It refers to a polypeptide having ⁇ -amylase activity in which the substitutions are made in combination.
  • Deletion and substitution of amino acid residues at such predetermined positions are modifications to improve stability at low pH and/or in the presence of chelating agents, and therefore the mutant has a higher level of stability compared to the parent ⁇ -amylase. and have improved stability at low pH and/or in the presence of chelating agents.
  • Parent ⁇ -amylase means a reference ⁇ -amylase that is modified to provide a variant of the present invention, and in the present invention, a reference ⁇ -amylase that has at least 90% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • ⁇ -amylase A having sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • ⁇ -amylase B having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • ⁇ -amylase C having sequence identity
  • ⁇ -amylase D having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, or at least 90% to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.
  • Such parent amylase may be a native (wild type) polypeptide or a variant thereof.
  • ⁇ -Amylase A consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 is ⁇ -amylase LABM derived from the A and B domains of ⁇ -amylase AAI10 derived from the genus Bacillus and the C domain of ⁇ -amylase from Alicyclobacillus species. .
  • ⁇ -amylase B consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 is ⁇ -amylase CspAmy2 derived from the genus Cytophaga.
  • ⁇ -Amylase C consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8 is ⁇ -amylase AA560 derived from Bacillus sp. DSM12649 strain.
  • ⁇ -amylase D consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 is ⁇ -amylase SP722 derived from Bacillus sp. SP722 strain.
  • ⁇ -Amylase E consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 12 is ⁇ -amylase AP1378 derived from Bacillus sp. KSM-1378 (FERM BP-3048) strain.
  • the parent ⁇ -amylase has at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 97% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 or 12. , more preferably at least 98%, more preferably at least 99% sequence identity.
  • the amino acid residue modification sites are two locations selected from positions corresponding to positions 178-181 in SEQ ID NO: 1. Deletion of amino acid residues and substitution of amino acid residues at three or more positions selected from positions corresponding to positions 178, 181, 238, 239, 240, 126, 129, and 201 in SEQ ID NO: 2. It is.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence constituting ⁇ -amylase YR288 (International Publication No.
  • SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence constituting the ⁇ -amylase YR288 (International Publication No. 2022/017728), and SEQ ID NO: This is an amino acid sequence constituting ⁇ -amylase in which the amino acid residues corresponding to R178 and T180 in the amino acid sequence shown by No. 1 are deleted (R178 ⁇ +T180 ⁇ ).
  • FIG. 1 shows an alignment of the amino acid sequences shown by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequences of the parent ⁇ -amylases A, B, C, D, and E.
  • SEQ ID NO: 2 also shows the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 and the two positions corresponding to positions 178 and 180 in SEQ ID NO: 1 in the parent ⁇ -amylases A, B, C, D, and E.
  • An alignment of the amino acid sequence of ⁇ -amylase with deleted amino acid residues is shown.
  • amino acid residues at positions corresponding to positions 178-181 in the numbering of SEQ ID NO: 1, 178, 181, 238, 239, 240, 126, 129 and The correspondence between the amino acid residues at the position corresponding to position 201 is shown in Table 1 below.
  • the "corresponding position" on the amino acid sequence is defined by aligning the target sequence and the reference sequence (in the present invention, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2) to give maximum homology. It can be determined by Alignment of amino acid sequences can be performed using known algorithms and procedures are known to those skilled in the art. For example, alignment can be performed using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, J.D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) with default settings. Alternatively, Clustal W2 or Clustal omega, which are revised versions of Clustal W, can also be used.
  • Clustal W, Clustal W2 and Clustal omega are, for example, European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]), Japanese DNA data operated by the National Institute of Genetics It can be used on the website of DDBJ Bank (DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html]).
  • a position of the target sequence aligned to an arbitrary position of the reference sequence by the above-mentioned alignment is considered to be a "corresponding position" to the arbitrary position.
  • amino acid sequence alignment can further fine-tune the amino acid sequence alignment obtained above to optimize it.
  • Such optimal alignment is preferably determined by taking into consideration the similarity of amino acid sequences, the frequency of inserted gaps, and the like.
  • Amino acid sequence similarity here refers to the ratio (%) of the number of positions where identical or similar amino acid residues exist in both sequences to the total number of amino acid residues when two amino acid sequences are aligned.
  • Similar amino acid residues refer to amino acid residues among the 20 types of amino acids constituting proteins that have similar properties to each other in terms of polarity and charge and that cause so-called conservative substitutions.
  • Such groups of similar amino acid residues are well known to those skilled in the art and are, for example, arginine and lysine or glutamine; glutamic acid and aspartic acid or glutamine; serine and threonine or alanine; glutamine and asparagine or arginine; leucine. and isoleucine, but are not limited to these.
  • mutants A1, B1, C1, D1 and E1 of the present invention the deletion of two amino acid residues selected from positions corresponding to positions 178-181 in SEQ ID NO: 1 is preferably 178 ⁇ +180 ⁇ , 179 ⁇ +180 ⁇ , 178 ⁇ +179 ⁇ , 178 ⁇ +181 ⁇ , 179 ⁇ +181 ⁇ , etc., and 178 ⁇ +180 ⁇ is more preferable.
  • mutants A1, B1, C1, D1, and E1 of the present invention three or more positions selected from positions corresponding to positions 178, 181, 238, 239, 240, 126, 129, and 201 in SEQ ID NO: 2.
  • substitution of an amino acid residue at a position means replacing the amino acid at the position with a specific amino acid, and for A1, B1, C1, D1 and E1, at least the following a) to e) are performed. This includes aspects. Note that the amino acid residues may be substituted at 3 or more locations, but from the viewpoint of stability at low pH and/or in the presence of a chelating agent, it may be at 4 or more, 5 or more, or 6 or more locations. .
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 178 in the numbering of SEQ ID NO: 2 in the corresponding parent amylase A, B, C, D or E is H
  • the amino acid residue at position 181 is
  • the amino acid residue at the corresponding position is E or Q
  • the amino acid residue corresponding to position 238 is F
  • the amino acid residue corresponding to position 239 is Q
  • the amino acid residue corresponding to position 240 is F.
  • the amino acid residues before and after the substitution are the same, but such embodiments are also included in the variants of the present invention.
  • substitutions of one or more amino acid residues selected from positions corresponding to positions 126, 129 and 201 may be performed in combination, It is preferable from the viewpoint of improving stability at low pH and/or in the presence of a chelating agent.
  • the substitutions include substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 126 with Y (126Y), substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 129 with I (129I), and substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 129 with I (129I), Substitution of an amino acid residue with L or Y at position (201L/Y) may be mentioned.
  • the mutant has at least 80%, preferably at least 85%, and more preferably at least 85% of the amino acid sequence of the parent amylase.
  • ⁇ -amylases having an identity of at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99%.
  • the variant may include any number of conservative amino acid substitutions as long as it retains the above-mentioned properties as a variant.
  • Variants of the invention can be produced using a variety of mutagenesis techniques known in the art. For example, a polynucleotide encoding an amino acid residue to be modified in a parent ⁇ -amylase gene (reference ⁇ -amylase gene) encoding the standard amino acid sequence is mutated into a polynucleotide encoding the modified amino acid residue. Furthermore, it can be produced by expressing a mutant from the mutant gene.
  • the polynucleotide encoding the variant of the present invention may be in the form of single-stranded or double-stranded DNA, RNA, or artificial nucleic acid, or may be cDNA or chemically synthesized DNA without introns.
  • various mutagenesis techniques known in the art can be used as means for mutating the amino acid residues of the parent ⁇ -amylase.
  • a polynucleotide that encodes the amino acid sequence of a parent ⁇ -amylase hereinafter also referred to as a parent gene
  • the nucleotide sequence that encodes the amino acid residue to be mutated is mutated into the nucleotide sequence that encodes the amino acid residue after the mutation.
  • Introduction of a desired mutation into a parent gene can basically be performed using various site-directed mutagenesis methods well known to those skilled in the art.
  • the site-directed mutagenesis method can be performed by any method such as inverse PCR method or annealing method.
  • Commercially available site-directed mutagenesis kits e.g., Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, QuickChange Multi Site-Directed Mutag) enesis Kit, etc.
  • site-directed mutagenesis kits e.g., Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, QuickChange Multi Site-Directed Mutag
  • Site-specific mutation introduction into a parent gene can most commonly be performed using a mutation primer containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • the mutation primer anneals to a region containing a nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated in the parent gene, and replaces the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated with the mutated amino acid. It may be designed to include a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding a residue. Those skilled in the art can appropriately recognize and select the nucleotide sequences (codons) encoding the amino acid residues before and after mutation based on standard textbooks.
  • site-directed mutagenesis is performed by splicing by overlap extension (SOE), which amplifies DNA fragments on the upstream and downstream sides of the mutation site using two complementary primers containing the nucleotide mutation to be introduced, respectively.
  • SOE overlap extension
  • a method of linking them together by PCR (Gene, 1989, 77(1): p61-68) can also be used.
  • Template DNA containing the parent gene can be prepared by extracting genomic DNA from the above-mentioned ⁇ -amylase-producing microorganism by a conventional method, or by extracting RNA and synthesizing cDNA by reverse transcription.
  • a corresponding nucleotide sequence may be chemically synthesized based on the amino acid sequence of the parent ⁇ -amylase and used as the template DNA.
  • a DNA sequence containing the base sequence encoding ⁇ -amylase A (LABM) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is SEQ ID NO: 3
  • ⁇ -amylase B CspAmy2
  • the DNA sequence containing the encoding base sequence is SEQ ID NO: 5
  • the DNA sequence containing the base sequence encoding ⁇ -amylase C (AA560) consisting of the amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 8 is SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 10 is The DNA sequence containing the base sequence encoding ⁇ -amylase D (SP722) consisting of the amino acid sequence shown is shown in SEQ ID NO: 9
  • the base sequence encoding ⁇ -amylase E AP13778 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the DNA sequence containing this is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the mutation primer can be produced by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids R4esearch, 1989, 17:7059-7071). Such primer synthesis can also be carried out using, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer (manufactured by ABI, etc.).
  • a polynucleotide encoding a mutant of the present invention having a desired mutation can be obtained. I can do it.
  • the polynucleotide encoding the variant of the present invention may include single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA, or other artificial nucleic acids.
  • the DNA, cDNA and RNA may be chemically synthesized.
  • the polynucleotide may also include an untranslated region (UTR) nucleotide sequence.
  • UTR untranslated region
  • the polynucleotide may be codon-optimized depending on the species of the transformant for producing the mutant polypeptide of the present invention. Information on codons used by various organisms is available from Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]).
  • the obtained polynucleotide encoding the variant of the present invention can be incorporated into a vector.
  • the type of vector containing the polynucleotide is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid, phage, phagemid, cosmid, virus, YAC vector, or shuttle vector.
  • the vector is preferably, but not limited to, a vector that can be amplified in a bacterium, preferably a bacterium of the genus Bacillus (for example, Bacillus subtilis or a mutant strain thereof), and more preferably a vector capable of amplifying the introduced gene in a bacterium of the genus Bacillus.
  • shuttle vectors which are vectors that can be replicated in both Bacillus bacteria and other organisms, can be suitably used for recombinant production of the mutants of the present invention.
  • preferred vectors include, but are not limited to, pHA3040SP64, pHSP64R or pASP64 (Patent No. 3492935), pHY300PLK (an expression vector capable of transforming both Escherichia coli and Bacillus subtilis; Jpn J Genet, 1985, 60: Shuttle vectors such as pAC3 (Nucleic Acids Res, 1988, 16:8732); Examples include plasmid vectors that can be used to transform bacteria belonging to the genus Bacillus.
  • plasmid vectors derived from E. coli eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • E. coli eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • the above-mentioned vector may include a DNA region containing a DNA replication initiation region or an origin of replication.
  • a promoter region, a terminator region, or an expressed protein for initiating transcription of the gene is placed upstream of the polynucleotide encoding the mutant of the present invention (i.e., the mutant gene).
  • a control sequence such as a secretion signal region for secretion into the protein may be operably linked.
  • operably linked between a gene and a control sequence means that the gene and the control region are arranged such that the gene can be expressed under the control of the control region.
  • control sequences such as the promoter region, terminator, secretion signal region, etc. are not particularly limited, and commonly used promoters and secretion signal sequences can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
  • suitable examples of control sequences that can be incorporated into vectors include Bacillus sp.
  • Examples include the cellulase gene promoter and secretion signal sequence of the KSM-S237 strain.
  • the vector of the present invention may further incorporate a marker gene (for example, a drug resistance gene for ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.) for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced. You can leave it there.
  • a marker gene for example, a drug resistance gene for ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.
  • a gene encoding a required nutrient synthesizing enzyme may be incorporated into the vector as a marker gene.
  • a gene related to the metabolism may be incorporated into the vector as a marker gene.
  • An example of such a metabolism-related gene is an acetamidase gene for utilizing acetamide as a nitrogen source.
  • the above-mentioned linkage of the polynucleotide encoding the variant of the present invention with the control sequence and the marker gene can be performed using methods known in the art such as the SOE (splicing by overlap extension)-PCR method (Gene, 1989, 77:61-68). This can be done by the following method. Procedures for introducing ligated fragments into vectors are well known in the art.
  • the transformation of the present invention can be carried out by introducing into a host a vector containing a polynucleotide encoding the mutant of the present invention, or by introducing a DNA fragment containing a polynucleotide encoding the mutant of the present invention into the genome of the host. cells can be obtained.
  • Examples of host cells include microorganisms such as bacteria and filamentous fungi.
  • bacteria include Escherichia coli, bacteria belonging to the genus Staphylococcus, genus Enterococcus, genus Listeria, and genus Bacillus. Bacteria of the genus Bacillus (eg, Bacillus subtilis Marburg No. 168 (Bacillus subtilis strain 168) or mutant strains thereof) are preferred.
  • Examples of Bacillus subtilis mutants include J. subtilis mutants. Biosci. Bioeng. , 2007, 104(2): 135-143, and the protease 9-deficient strain KA8AX, as well as Biotechnol. Lett. , 2011, 33(9): 1847-1852, the D8PA strain is a protease octad-deficient strain with improved protein folding efficiency.
  • filamentous fungi include Trichoderma, Aspergillus, and Rhizopus.
  • a method for introducing the vector into the host methods commonly used in the field, such as protoplast method and electroporation method, can be used. By selecting a strain into which the introduction has been properly carried out using marker gene expression, auxotrophy, etc. as indicators, it is possible to obtain the desired transformant into which the vector has been introduced.
  • a fragment in which a polynucleotide encoding a mutant of the present invention, a control sequence, and a marker gene are linked can be directly introduced into the host genome.
  • a DNA fragment is constructed by adding sequences complementary to the host's genome to both ends of the above-mentioned ligated fragment by SOE-PCR method, etc., and this is introduced into the host to create a gap between the host genome and the DNA fragment.
  • a polynucleotide encoding the variant of the present invention is introduced into the genome of the host.
  • the thus obtained transformant into which the polynucleotide encoding the mutant of the present invention or the vector containing the same has been introduced is cultured in an appropriate medium, the gene encoding the protein on the vector will be expressed.
  • the mutants of the present invention are produced.
  • the medium used for culturing the transformant can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of microorganism of the transformant.
  • the mutant of the present invention may be expressed from a polynucleotide encoding the mutant of the present invention or a transcription product thereof using a cell-free translation system.
  • Cell-free translation system is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which reagents such as amino acids necessary for protein translation are added to a suspension obtained by mechanically disrupting host cells. It is composed of
  • mutants of the present invention produced in the above-mentioned culture or cell-free translation system can be produced by conventional methods used for protein purification, such as centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. Isolation or purification can be achieved by using these alone or in appropriate combinations.
  • the gene encoding the ⁇ -amylase variant of the present invention and the secretion signal sequence are operably linked on the vector in the transformant, the produced protein will be secreted outside the cell. Can be easily recovered from culture. Proteins recovered from the culture may be further purified by known means.
  • the variants of the invention thus obtained have improved stability at low pH and/or in the presence of chelating agents compared to the parent ⁇ -amylase.
  • "Improved stability at low pH and/or in the presence of a chelating agent” means improved maintenance of ⁇ -amylase activity in a low pH environment and/or in the presence of a chelating agent compared to the parent ⁇ -amylase. means ability.
  • low pH refers to weak acidity, that is, pH 4 to 7, preferably pH 4.5 to 6.5
  • stability in a low pH environment refers to a cleaning composition with a pH of about 4 to 7. This means that ⁇ -amylase activity is maintained in the cleaning water having a pH of about 4 to 7, which is prepared by dissolving or diluting the cleaning composition in water.
  • chelating agent examples include chelating agents that can be incorporated into the cleaning composition, such as aminocarboxylic acid chelating agents, phosphonic acid chelating agents, hydroxycarboxylic acid chelating agents, and polycarboxylic acid chelating agents, which will be described later. .
  • Stability at such low pH and/or in the presence of chelating agents can be assessed using methods well known in the art. For example, an enzyme solution is added to a cleaning composition with a pH of 4 to 7 containing a chelating agent, and ⁇ -amylase activity is measured before and after treatment for a predetermined period of time, and the activity value of the sample before treatment is taken as the initial activity. The residual activity (%) can be determined by calculating the ratio of the activity value to the initial activity.
  • the mutant of the present invention is useful as an enzyme for blending in various cleaning compositions, and is particularly suitable for low-temperature cleaning at 40°C or lower, and is useful as an enzyme for blending in cleaning compositions that are acidic and contain a chelating agent. .
  • the amount of the variant of the present invention incorporated into the detergent composition is not particularly limited as long as the protein exhibits activity, but for example, preferably 1 mg or more, more preferably 10 mg or more per 1 kg of the detergent composition. , more preferably 50 mg or more, and preferably 5000 mg or less, more preferably 1000 mg or less, and even more preferably 500 mg or less. Further, the amount is preferably 1 to 5000 mg, more preferably 10 to 1000 mg, and even more preferably 50 to 500 mg.
  • the detergent composition can also contain various enzymes in addition to the mutants of the present invention.
  • examples include hydrolase, oxidase, reductase, transferase, lyase, isomerase, ligase, synthetase, and the like.
  • amylase protease, cellulase, keratinase, esterase, cutinase, lipase, pullulanase, pectinase, mannanase, glucosidase, glucanase, cholesterol oxidase, peroxidase, laccase, etc.
  • protease, cellulase, amylase, etc. lipase is preferred.
  • Proteases include commercially available Alcalase, Esperase, Everlase, Savinase, Kannase, Progress Uno (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ, EFFECTENZ, EXCELLENZ (registered trademark; DuPont), Lav ergy (registered trademark; BASF), and KAP ( Kao), etc.
  • cellulases include Celluclean, Carezyme (registered trademark; Novozymes), KAC, alkaline cellulase produced by Bacillus sp. Examples include alkaline cellulase (Kao) and the like.
  • amylase examples include Termamyl, Duramyl, Stainzyme, Stainzyme Plus, Amplify Prime (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ, EFFECTENZ (registered trademark; DuPont), and KAM (Kao).
  • lipase examples include Lipolase and Lipex (registered trademark; Novozymes).
  • Known detergent components can be blended into the detergent composition, and examples of the known detergent components include the following.
  • the surfactant is blended in the cleaning composition in an amount of 0.5 to 60% by mass, particularly 10 to 45% by mass for powdered cleaning compositions, and 20 to 90% for liquid cleaning compositions. It is preferable to mix % by mass. Furthermore, when the detergent composition of the present invention is a laundry detergent or a detergent for automatic dishwashers, the surfactant is generally blended in an amount of 1 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
  • surfactant used in the cleaning composition examples include one or a combination of anionic surfactants, nonionic surfactants, amphoteric surfactants, and cationic surfactants. Preferred are anionic surfactants and nonionic surfactants.
  • anionic surfactants include sulfate ester salts of alcohols having 10 to 18 carbon atoms, sulfate ester salts of alkoxylated alcohols having 8 to 20 carbon atoms, alkylbenzene sulfonates, paraffin sulfonates, and ⁇ -olefin sulfones.
  • Preferred are acid salts, internal olefin sulfonates, ⁇ -sulfo fatty acid salts, ⁇ -sulfo fatty acid alkyl ester salts, or fatty acid salts.
  • a linear alkylbenzene sulfonate having an alkyl chain of 10 to 14 carbon atoms, more preferably 12 to 14 carbon atoms, and an internal olefin having an alkylene chain of 12 to 20 carbon atoms, more preferably 16 to 18 carbon atoms
  • One or more anionic surfactants selected from sulfones are preferred, and as counterions, alkali metal salts and amines are preferred, with sodium and/or potassium, monoethanolamine, and diethanolamine being particularly preferred.
  • alkali metal salts and amines are preferred, with sodium and/or potassium, monoethanolamine, and diethanolamine being particularly preferred.
  • Nonionic surfactants include polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) ether, alkyl polyglycoside, polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) phenyl ether, polyoxyalkylene sorbitan fatty acid (8 to 20 carbon atoms) 22) Ester, polyoxyalkylene glycol fatty acid (carbon number 8 to 22) ester, and polyoxyethylene polyoxypropylene block polymer are preferred.
  • 4 to 20 moles of alkylene oxide such as ethylene oxide or propylene oxide are added to an alcohol having 10 to 18 carbon atoms [HLB value (calculated by Griffin method) of 10.5 to 15. 0, preferably 11.0 to 14.5] are preferred.
  • Divalent metal ion scavenger used in the cleaning composition of the present invention include condensed phosphates such as tripolyphosphates, pyrophosphates, and orthophosphates, aluminosilicates such as zeolites, and synthetic layered crystalline silicates. salts, nitrilotriacetate, ethylenediaminetetraacetate, citrate, isocitrate, polyacetal carboxylate, and the like.
  • crystalline aluminosilicate is particularly preferred, and among A-type, X-type, and P-type zeolites, A-type is particularly preferred.
  • the synthetic zeolite preferably has an average primary particle size of 0.1 to 10 ⁇ m, particularly 0.1 to 5 ⁇ m.
  • Alkaline agent is blended in an amount of 0.01 to 80% by weight, preferably 1 to 40% by weight.
  • examples include alkali metal carbonates such as sodium carbonate, which are collectively referred to as dense ash and light ash, and amorphous alkali metal silicates such as JIS No. 1, No. 2, and No. 3.
  • alkali metal carbonates such as sodium carbonate, which are collectively referred to as dense ash and light ash
  • amorphous alkali metal silicates such as JIS No. 1, No. 2, and No. 3.
  • These inorganic alkaline agents are effective in forming particle skeletons during detergent drying, and can yield detergents that are relatively hard and have excellent fluidity.
  • alkalis other than these include sodium sesquicarbonate and sodium hydrogen carbonate, and phosphates such as tripolyphosphate also act as alkaline agents.
  • sodium hydroxide and mono-, di-, or triethanolamine can be used as alkaline agents used in liquid detergents, and can also be
  • Anti-restaining agent is blended in an amount of 0.001 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
  • anti-recontamination agents used in the cleaning composition of the present invention include polyethylene glycol, carboxylic acid polymers, polyvinyl alcohol, and polyvinylpyrrolidone.
  • carboxylic acid polymers have the ability to prevent recontamination, as well as the ability to capture metal ions and disperse solid particle stains from clothing into the washing bath.
  • the carboxylic acid polymer is a homopolymer or copolymer of acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, etc.
  • the preferred copolymer is a copolymer of the above monomers and maleic acid, and those with a molecular weight of several thousand to 100,000 are suitable. preferable.
  • polymers such as polyglycidylate, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose, and aminocarboxylic acid-based polymers such as polyaspartic acid also have metal ion scavenging agents, dispersing agents, and re-fouling prevention abilities. Therefore, it is preferable.
  • Bleaching agent Bleaching agents such as hydrogen peroxide and percarbonate are preferably blended in an amount of 1 to 10% by mass.
  • a bleaching activator such as tetraacetylethylenediamine (TAED) or the one described in JP-A-6-316700 can be added.
  • Fluorescent agent examples include biphenyl type fluorescent agents (eg, Tinopal CBS-X, etc.) and stilbene type fluorescent agents (eg, DM type fluorescent dye, etc.).
  • the fluorescent agent is preferably blended in an amount of 0.001 to 2% by mass.
  • Chelating agent A chelating agent is blended, for example, to make stains easier to clean and to reduce water hardness during cleaning.
  • chelating agents include aminocarboxylic acid chelating agents, phosphonic acid chelating agents, hydroxycarboxylic acid chelating agents, polyhydric carboxylic acid chelating agents, and the like.
  • aminocarboxylic acid chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), methylglycinediacetic acid (MGDA), and triethylenetetraminehexaacetic acid.
  • Examples include acetic acid (TTHA), glutamic acid diacetic acid (GLDA), hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA), dihydroxyethylglycine (DHEG), aspartic acid diacetic acid (ASDA), ethylenediamine succinic acid (EDDS), and salts thereof.
  • phosphonic acid-based chelating agents include hydroxyethylidene diphosphonic acid (HEDP), nitrilotrimethylenephosphonic acid (NTMP), phosphonobutanetricarboxylic acid (PBTC), ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid (EDTMP), and salts thereof. It will be done.
  • hydroxycarboxylic acid chelating agent examples include citric acid, malic acid, tartaric acid, gluconic acid, lactic acid, and salts thereof.
  • polyhydric carboxylic acid chelating agents include succinic acid, oxalic acid, glutaric acid, adipic acid, fumaric acid, malonic acid, and salts thereof.
  • Buffers Buffers are blended to create a buffer system capable of maintaining a low pH of the cleaning solution.
  • buffers include mixtures of organic acids and their salts, such as mixtures of polycarboxylic acids and their salts, preferably mixtures of citric acid and citrate salts.
  • the detergent composition includes builders, softeners, reducing agents (such as sulfites), foam inhibitors (such as silicones), fragrances, and antibacterial and antifungal agents that are known in the field of laundry detergents. (Proxel [trade name], benzoic acid, etc.) and other additives can be included.
  • a cleaning composition can be produced according to a conventional method by combining the protein of the present invention obtained by the above method and the above-mentioned known cleaning ingredients.
  • the form of the detergent can be selected depending on the application, and can be, for example, liquid, powder, granule, paste, solid, etc.
  • the cleaning composition thus obtained can be used as a laundry detergent, a dishwashing agent, a bleaching agent, a hard surface cleaning agent, a drain cleaning agent, a denture cleaning agent, a disinfectant cleaning agent for medical instruments, etc.
  • laundry detergents and dishwashing agents preferred are laundry detergents and more preferred are laundry detergents (laundry laundry detergents), hand-washing dishwashing agents, and automatic dishwashing detergents.
  • the cleaning composition is suitable for use at low temperatures (eg, 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, 25°C or lower, and 5°C or higher, 10°C or higher, 15°C or higher).
  • the present invention further discloses the following aspects. ⁇ 1> ⁇ -amylase A having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, ⁇ -amylase A having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 amylase B, ⁇ -amylase C, having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8; ⁇ -amylase C, having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10; ⁇ -amylase mutants A1, B1, C1, D1 and E1 each having ⁇ -amylase E having at least 90% sequence identity to amylase D or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 as a parent amylase.
  • A1 to E1 contain deletions of two amino acid residues selected from positions corresponding to positions 178-181 in SEQ ID NO: 1, and 178 and 181 in SEQ ID NO: 2. , 238, 239, 240, 126, 129 and 201 positions, the ⁇ -amylase variant comprising at least the following a) to e): .
  • substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 with H substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 with E or Q, and amino acid residue at the position corresponding to position 239
  • substitution of residue to Q b) substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 to H, substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 to E or Q, and position 239 c)
  • D1 substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 178 with H, substitution of the amino acid residue at the position corresponding to position 181 with E or Q, amino acid at the position corresponding to position
  • substitutions for D1 include substitution of an amino acid residue with H at the position corresponding to position 178 in the numbering of SEQ ID NO: 2, substitution of an amino acid residue with E or Q at the position corresponding to position 181, 238 4 substitutions: substitution of an amino acid residue with F at a position corresponding to position 239, and substitution of an amino acid residue with Q at a position corresponding to position 239,
  • substitutions for E1 include substitution with amino acid residue H at the position corresponding to position 178 in the numbering of SEQ ID NO: 2, substitution with amino acid residue with E or Q at the position corresponding to position 181, and substitution of an amino acid residue with Q at a position corresponding to position 239
  • substitutions for E1 include substitution with amino acid residue H at the position corresponding to position 178 in the numbering of SEQ ID NO: 2, substitution with amino acid residue E or Q at the position corresponding to position 181, and substitution with amino acid residue E or Q at position 238.
  • Substitution for E1 is substitution with amino acid residue H at the position corresponding to position 178 in the numbering of SEQ ID NO: 2, substitution with amino acid residue E or Q at the position corresponding to position 181 , substitution of an amino acid residue with F at a position corresponding to position 238, substitution of an amino acid residue with Q at a position corresponding to position 239, and substitution of an amino acid residue with F at a position corresponding to position 240.
  • the ⁇ -amylase variant of ⁇ 2> which has 5 substitutions.
  • ⁇ 4> In a) to e) above, ⁇ 1 further comprises substitution of an amino acid residue at one or more positions selected from positions corresponding to positions 126, 129, and 201 in SEQ ID NO: 2.
  • ⁇ 5> The ⁇ -amylase variant of ⁇ 4>, wherein the amino acid residues after substitution at positions corresponding to positions 126, 129, and 201 of the ⁇ -amylase are 126Y, 129I, and 201L/Y, respectively.
  • ⁇ 6> A polynucleotide encoding any variant of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • ⁇ 7> A vector or DNA fragment comprising the polynucleotide according to ⁇ 6>.
  • ⁇ 8> A transformed cell containing the vector or DNA fragment according to ⁇ 7>.
  • ⁇ 9> The transformed cell of ⁇ 8> which is a microorganism.
  • a cleaning composition comprising the variant according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • the cleaning composition of ⁇ 10> which is a clothing cleaning agent or a dishwashing agent.
  • the cleaning composition of ⁇ 11> which is a powder or liquid.
  • the cleaning composition of ⁇ 11> or ⁇ 12> which is weakly acidic, preferably having a pH of 4 to 7.
  • chelating agent is an aminocarboxylic acid chelating agent, a phosphonic acid chelating agent, a hydroxycarboxylic acid chelating agent, or a polycarboxylic acid chelating agent.
  • Plasmid pHY-LABM was constructed by transforming Bacillus subtilis using the In-Fusion reaction solution.
  • plasmids pHY-Cspamy2, pHY-AA560, pHY-SP722, and pHY-AP1378 described in Japanese Patent Application No. 2021-112712 were used to express Cspamy2, AA560, SP722, and AP1378.
  • the primer pair Cspamy2_178-180del_fw/Cspamy2_178-180del _rv (SEQ ID NO: 19 and 20), AA560_181-183del_fw/AA560_181-183del_rv (SEQ ID NO: 21 and 22), SP722_181-183del_fw/SP722_181-183del_rv (SEQ ID NO: 23 and 24), AP1378_181-183del_fw/AP PCR and In -Fusion reaction was performed.
  • Bacillus subtilis was transformed using the In-Fusion reaction solution, and the plasmids pHY-Cspamy2 R178 ⁇ T180 ⁇ , pHY-AA560 R181 ⁇ D183 ⁇ , pHY-SP722 R181 ⁇ D183 ⁇ , pHY-AP1378 R181 ⁇ T183 ⁇ was constructed.
  • FIG. 1 shows an alignment of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and five parent ⁇ -amylases created using SEQ ID NO: 12, and FIG. 2 shows an alignment of SEQ ID NO: 2 and the five two-amino acid deleted ⁇ -amylases described above.
  • Residues corresponding to positions 126, 129, 178, 181, 201, 238, 239, and 240 are shown in red triangles using the numbering of SEQ ID NO: 2, and the amino acid residue numbers in SEQ ID NO: 2 are shown above. is listed.
  • the ⁇ -amylase variants shown in Tables 2-1 and 2-2 containing substitutions at selected positions from these residues were constructed using the methods described above.

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Abstract

低温で優れたデンプン分解活性を示し、さらに低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で優れた安定性を示すα－アミラーゼを提供する。　配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＡ、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＢ、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＣ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＤ、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＥをそれぞれ親アミラーゼとするα－アミラーゼ変異体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１であって、当該Ａ１～Ｅ１がそれぞれ配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置から選択される２箇所のアミノ酸残基の欠失を含み、かつ配列番号２の番号付けで１７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される３箇所以上におけるアミノ酸残基の置換であって、少なくとも下記のａ）～ｅ）を含む、α－アミラーゼ変異体。　ａ）Ａ１について、１７８Ｈ、１８１Ｅ又は１８１Ｑ、及び２３９Ｑ　ｂ）Ｂ１について、１７８Ｈ、１８１Ｅ又は１８１Ｑ、及び２３９Ｑ　ｃ）Ｃ１について、１７８Ｈ、１８１Ｅ又は１８１Ｑ、２３８Ｆ及び２３９Ｑ　ｄ）Ｄ１について、１７８Ｈ、１８１Ｅ又は１８１Ｑ、２３８Ｆ及び２３９Ｑから選択される３箇所以上　ｅ）Ｅ１について、１７８Ｈ、１８１Ｅ又は１８１Ｑ、２３８Ｆ、２３９Ｑ及び２４０Ｆから選択される３箇所以上

Description

α－アミラーゼ変異体
　本発明は、α－アミラーゼの変異体に関する。
　α－アミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗浄剤への配合適性が知られており、デンプン質の汚れを除去する成分として自動食器洗浄機用の食器洗浄剤や衣料用洗剤等へ配合されている。
　洗浄剤用として有用なα－アミラーゼとしては、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ－３０４８）株由来のα－アミラーゼＡＰ１３７８（特許文献１）、バチルス リケニフォルミス由来のα－アミラーゼであるターマミルやデュラミル（登録商標）の他、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＤＳＭ１２６４９株由来のα－アミラーゼＡＡ５６０（特許文献２）、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＳＰ７２２株由来のα－アミラーゼＳＰ７２２（特許文献３の配列番号４）、サイトファーガ属由来のα－アミラーゼＣｓｐＡｍｙ２（特許文献４）、バチルス属由来のα－アミラーゼＡＡＩ１０のＡ及びＢドメインとアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のα－アミラーゼキメラ体であるＬＡＢＭ（特許文献５の配列番号１３）等が知られている。また、これらのα－アミラーゼについては、特定の用途に向けて機能が改善するように改変され、例えば洗剤中における安定性が向上した変異体等が報告されている（特許文献６）。
　しかしながら、親酵素が異なる場合、変異により同様の効果が得られるとは限らず、特に特定の性質が大幅に向上した多重変異体の取得には各親酵素に合わせて多大な労力をかける必要がある。
　一方、近年、低ｐＨ環境での洗浄が洗浄品に対して優しく、一般的に使用されるアルカリ性組成物ほど強力ではないため、ガラス、模様付き食器などの洗浄品を長い間新しい見た目に保つ効果があること、また、布地の悪臭を減少させ、布地上の汚れを捕捉する傾向のあるカルシウム石鹸の放出を助け、ｐＨ反応性の染みに対する性能を向上させ、及び更には布地の感触に対して利益を齎すこと等が知られている。また、食器洗浄剤においては、主な洗浄対象である食器類を洗浄する以外に、ステンレス製や樹脂製のシンク廻りの洗浄にも用いられるため、水垢汚れに対する洗浄力を発揮するクエン酸などのキレート剤を高濃度で配合される場合がある。よって、斯かる洗剤にα－アミラーゼなどの酵素を添加することで、より洗浄性が向上することが期待できると考えられる。
　したがって、上記の洗浄剤用α－アミラーゼについても、酸性又はキレート剤を含む洗剤、特に酸性且つキレート剤を含む洗剤中における安定性の向上が求められている。
　　〔特許文献１〕国際公開第９４／２６８８１号
　　〔特許文献２〕国際公開第００／６００６０号
　　〔特許文献３〕国際公開第０６／００２６４３号
　　〔特許文献４〕国際公開第２０１４／１６４７７７号
　　〔特許文献５〕特表２０１８－５１６５５３号公報
　　〔特許文献６〕国際公開第９８／０４４１２６号
　本発明は、以下に係るものである。
　１）配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＡ、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＢ、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＣ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＤ、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＥをそれぞれ親アミラーゼとするα－アミラーゼ変異体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１であって、当該Ａ１～Ｅ１がそれぞれ配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置から選択される２箇所のアミノ酸残基の欠失を含み、かつ配列番号２の番号付けで１７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される３箇所以上におけるアミノ酸残基の置換であって、少なくとも下記のａ）～ｅ）を含む、α－アミラーゼ変異体。
　ａ）Ａ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換
　ｂ）Ｂ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換
　ｃ）Ｃ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　ｄ）Ｄ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　ｅ）Ｅ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　２）１）の変異体をコードするポリヌクレオチド。
　３）２）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
　４）３）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
　５）１）の変異体を含む洗浄剤組成物。
配列番号１及び配列番号２と５つの親α－アミラーゼのアライメント。 配列番号２と５つの２アミノ酸欠失α－アミラーゼのアライメント。
発明の詳細な説明
　本発明は、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で優れた安定性を示すα－アミラーゼを提供することに関する。
　本発明者らは、多様な洗剤用アミラーゼに対して、共通する特定のアミノ酸改変を行った場合に、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で顕著な安定化効果を齎すことを見出した。
　本発明によれば、親α－アミラーゼと比して低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で安定性が向上したα－アミラーゼ変異体を提供することができる。斯かるα－アミラーゼ変異体を用いることにより、低ｐＨ、さらにはキレート剤存在下でも安定したデンプン汚れ除去効果を発揮する洗浄が可能となる。
　本明細書において、「アミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．１；α－Ｄ－（１→４）－グルカングルカノヒドロラーゼ）とは、デンプンならびに他の直鎖又は分岐１，４－グリコシドオリゴ糖若しくは多糖類の加水分解を触媒する酵素群を意味する。α－アミラーゼ活性は、デンプンの酵素的分解による還元末端の生成量を測定することによって決定することができる。また、これに限定されず、例えばＰｈａｄｅｂａｓのような色素架橋デンプンの酵素的分解による色素の遊離を測定することによっても決定することができる（Soininen, K., M. Ceska, and H. Adlercreutz. "Comparison between a new chromogenic α-amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine." Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation 30.3 (1972): 291-297.）。　
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記を用いて、以下のように表記される。
　所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置２２６のスレオニンは、「Ｔ２２６」と示される。
　アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置２２６のスレオニンのアラニンへの置換は、「Ｔ２２６Ａ」と示される。
　アミノ酸の「欠失」に関しては、[元のアミノ酸、位置、Δ]で表記される。例えば、位置１８１でのセリンの欠失は「Ｓ１８１Δ」と示される。
　複数の改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）によって表記される。例えば、「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０のアルギニンのチロシンへの置換と位置１９５のグリシンのグルタミン酸への置換を表す。
　１つの位置で異なる改変を導入可能である場合、異なる改変はスラッシュ（「／」）によって分けられ、例えば、「Ｒ１７０Ｙ／Ｅ」は、位置１７０のアルギニンのチロシン又はグルタミン酸への置換を表す。
　本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。　
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。
　本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
＜変異体＞
　本発明の変異体は、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＡ、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＢ、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＣ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＤ、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＥをそれぞれ親アミラーゼとするα－アミラーゼ変異体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１であって、当該Ａ１～Ｅ１がそれぞれ配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置から選択される２箇所のアミノ酸残基の欠失を含み、かつ配列番号２の番号付けで１７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される３箇所以上の位置において、少なくとも下記のアミノ酸残基の置換を含むものである。
　ａ）Ａ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換
　ｂ）Ｂ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換
　ｃ）Ｃ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　ｄ）Ｄ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　ｅ）Ｅ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　すなわち、「変異体」は、親α－アミラーゼＡ～Ｅを構成するアミノ酸において、配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置から選択される２箇所のアミノ酸残基の欠失と、配列番号２の番号付けで１７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される３箇所以上の位置において、少なくとも上記ａ）～ｅ）のアミノ酸残基の置換が組み合わせて行われたα－アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。
　斯かる所定位置のアミノ酸残基の欠失及び置換は、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で安定性を向上させるための改変であり、したがって、当該変異体は、親α－アミラーゼと比して低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での向上した安定性を有する。
　「親α－アミラーゼ」とは、本発明の変異体をもたらすために改変が行われる基準α－アミラーゼを意味し、本発明においては、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＡ、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＢ、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＣ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＤ、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＥである。
　斯かる親アミラーゼは、天然（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＡは、バチルス属由来α－アミラーゼＡＡＩ１０のＡ及びＢドメインとアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種のα－アミラーゼＣドメイン由来のα－アミラーゼＬＡＢＭである。
　配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＢは、サイトファーガ属由来のα－アミラーゼＣｓｐＡｍｙ２である。
　配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＣは、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＤＳＭ１２６４９株由来のα－アミラーゼＡＡ５６０である。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＤは、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＳＰ７２２株由来のα－アミラーゼＳＰ７２２である。
　配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＥは、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ－３０４８）株由来のα－アミラーゼＡＰ１３７８である。
　親α－アミラーゼとしては、斯かる配列番号４、６、８、１０又は１２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。
　本発明の変異体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１において、アミノ酸残基の改変部位（変異位置）は、配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置から選択される２箇所のアミノ酸残基の欠失と、配列番号２の番号付けで １７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される３箇所以上の位置におけるアミノ酸残基の置換である。
　ここで、配列番号１は、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいて、ＷＰ＿１００３４６３６２．１として登録されているα－アミラーゼＹＲ２８８（国際公開第２０２２／０１７７２８）を構成するアミノ酸配列であり、配列番号２は、当該配列番号１で示されるアミノ酸配列において、Ｒ１７８及びＴ１８０に対応するアミノ酸残基が欠失した（Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ）α－アミラーゼを構成するアミノ酸配列である。
　図１に、配列番号１で示されるアミノ酸配列及び配列番号２で示されるアミノ酸配列と、上記親αアミラーゼＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥのアミノ酸配列のアライメントを示した。また、図２には配列番号２で示されるアミノ酸配列と、上記親α－アミラーゼＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥにおいて、配列番号１の番号付けで１７８位及び１８０位に相当する２箇所のアミノ酸残基が欠失したα－アミラーゼのアミノ酸配列のアライメントを示した。
　親α－アミラーゼＡ～Ｅについて、配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置のアミノ酸残基、配列番号２の番号付けで１７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置のアミノ酸残基の対応関係を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明において、アミノ酸配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（本発明においては配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
　当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとスレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の変異体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１において、配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置から選択される２箇所のアミノ酸残基の欠失としては、好ましくは１７８Δ＋１８０Δ、１７９Δ＋１８０Δ、１７８Δ＋１７９Δ、１７８Δ＋１８１Δ、１７９Δ＋１８１Δ等が挙げられ、１７８Δ＋１８０Δがより好ましい。
　本発明の変異体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１において、配列番号２の番号付けで１７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される３箇所以上の位置で行われるアミノ酸残基の「置換」は、当該位置にあるアミノ酸を特定のアミノ酸に置き換えることを意味し、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１について、少なくとも以下のａ）～ｅ）の態様を含むものである。
　なお、アミノ酸残基の置換箇所は３箇所以上であり得るが、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性の点から、４個所以上、５個所以上、６箇所以上であっても良い。
　ａ）Ａ１においては、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換（１７８Ｈ）、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換（１８１Ｅ又は１８１Ｑ）及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換（２３９Ｑ）の３置換（１７８Ｈ＋１８１Ｅ又は１８１Ｑ＋２３９Ｑ）。
　ｂ）Ｂ１においては、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換（１７８Ｈ）、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換（１８１Ｅ又は１８１Ｑ）及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換（２３９Ｑ）の３置換（１７８Ｈ＋１８１Ｅ又は１８１Ｑ＋２３９Ｑ）。
　ｃ）Ｃ１においては、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換（１７８Ｈ）、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換（１８１Ｅ又は１８１Ｑ）、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換（２３８Ｆ）、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換（２３９Ｑ）の中から選択される３箇所以上の置換。例えば１７８Ｈ＋１８１Ｅ又は１８１Ｑ＋２３８Ｆ＋２３９Ｑの４置換。
　ｄ）Ｄ１においては、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換（１７８Ｈ）、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換（１８１Ｅ又は１８１Ｑ）、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換（２３８Ｆ）、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換（２３９Ｑ）の中から選択される３箇所以上の置換。例えば１７８Ｈ＋１８１Ｅ又は１８１Ｑ＋２３８Ｆ＋２３９Ｑの４置換。
　ｅ）Ｅ１においては、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換（１７８Ｈ）、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換（１８１Ｅ又は１８１Ｑ）、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換（２３８Ｆ）、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換（２３９Ｑ）、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の中から選択される３箇所以上の置換。例えば１７８Ｈ＋１８１Ｅ又は１８１Ｑ＋２３９Ｑ＋２４０Ｆの４置換、１７８Ｈ＋１８１Ｅ＋２３８Ｆ＋２３９Ｑ＋２４０Ｆの５置換。
　なお、上記のａ）～ｅ）において、それぞれ対応する親アミラーゼＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ又はＥにおける、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置のアミノ酸残基がＨ、１８１位に相当する位置のアミノ酸残基がＥ又はＱ、２３８位に相当するアミノ酸残基がＦ、２３９位に相当するアミノ酸残基がＱ、又は２４０位に相当するアミノ酸残基がＦである場合には、置換前後のアミノ酸残基が同一となるが、斯かる態様も本発明の変異体に包含される。
　上記ａ）～ｅ）のアミノ酸残基の置換には、これらに加えて、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される１以上のアミノ酸残基の置換を更に組み合わせて行うことも、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性向上の点から好ましい。
　当該置換としては、１２６位に相当する位置でのアミノ酸残基のＹへの置換（１２６Ｙ）、１２９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＩへの置換（１２９Ｉ）、２０１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＬ又はＹへの置換（２０１Ｌ／Ｙ）が挙げられる。
　例えば、Ａ１、Ｂ１、Ｃ１においては、上記のアミノ酸残基の置換にさらに１２６Ｙ＋１２９Ｉの２置換、又は２０１Ｌ／Ｙの１置換を付加したものが好適に挙げられ、
　Ｄ１においては、上記のアミノ酸残基の置換にさらに１２６Ｙ又は２０１Ｌ／Ｙの１置換を付加したものが好適に挙げられる。
　なお、当該変異体は、洗浄性能、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性向上の点から、親アミラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくともは８５％、より好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくともは９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するα－アミラーゼであるのが好ましい。
　また、変異体は、上記変異体としての性質を保持する限り、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。
＜本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド＞
　本発明の変異体は、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して製造することができる。例えば、その基準アミノ酸配列をコードする親α－アミラーゼ遺伝子（基準α－アミラーゼ遺伝子）内の改変対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、改変後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子から変異体を発現させることにより、製造することができる。
　本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
　本発明において、親α－アミラーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親α－アミラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
　親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
　親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
　親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したα－アミラーゼを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親α－アミラーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＡ（ＬＡＢＭ）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号３に、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＢ（ＣｓｐＡｍｙ２）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号５に、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＣ（ＡＡ５６０）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号７に、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＤ（ＳＰ７２２）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号９に、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼＥ（ＡＰ１３７８）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号１１に示した。
　変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
　当該本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
＜ベクター又はＤＮＡ断片＞
　得られた本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
　上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド（すなわち変異体遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。なお、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
　上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ　ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列等が挙げられる。
　あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
　上記本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。　
＜形質転換細胞＞
　本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
　宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。
　宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
　あるいは、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
　斯くして得られた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明の変異体が生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
　あるいは、本発明の変異体は、無細胞翻訳系を使用して本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
　上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明の変異体は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で本発明のα－アミラーゼ変異体をコードする遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたタンパク質は細胞外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
　斯くして得られる本発明の変異体は、親α－アミラーゼと比して、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での向上した安定性を有する。
　「低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での向上した安定性」とは、親α－アミラーゼと比して向上した、低ｐＨ環境下及び／又はキレート剤存在下でのα－アミラーゼ活性の維持能力を意味する。
　ここで、低ｐＨとは、弱酸性、すなわちｐＨ４～７、好ましくはｐＨ４．５～６．５を指し、低ｐＨ環境下での安定性とは、ｐＨが約４～７の洗浄剤組成物中でα－アミラーゼ活性が維持されること、及び洗浄剤組成物を水に溶解又は希釈して調製したｐＨ約４～７の洗浄水中でα－アミラーゼ活性が維持されることを意味する。
　キレート剤としては、後述する、アミノカルボン酸系キレート剤、ホスホン酸系キレート剤、ヒドロキシカルボン酸系キレート剤及び多価カルボン酸系キレート剤等の洗浄剤組成物に配合され得るキレート剤が挙げられる。
　斯かる低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、キレート剤を含むｐＨ４～７の洗浄用組成物に酵素溶液を添加して、所定時間処理の前後でα－アミラーゼ活性を測定し、処理前のサンプルの活性値を初発活性として、処理後の活性値の初発活性に対する割合を残存活性（％）とすることで求めることができる。
　本発明の変異体は、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に４０℃以下の低温洗浄に適し、酸性かつキレート剤を配合した洗浄剤組成物への配合用酵素として有用である。
　洗浄剤組成物中への本発明の変異体の配合量は、当該タンパク質が活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは５０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また１～５０００ｍｇであるのが好ましく、１０～１０００ｍｇであるのがより好ましく、５０～５００ｍｇであるのがより好ましい。
　洗浄剤組成物は、本発明の変異体以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明のタンパク質とは異なるアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
　プロテアーゼとしては市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｕｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）、またＫＡＰ（花王）、等が挙げられる。
　セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。
　アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ　Ｐｌｕｓ、Ａｍｐｌｉｆｙ　Ｐｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。
　リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）等が挙げられる。
　洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
（１）界面活性剤
　界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。
　洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
　陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８～２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、α－スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０～１４の、より好ましくは１２～１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキレン鎖の炭素数が１２～２０の、より好ましくは１６～１８の内部オレフィンスルホンから選ばれる一種以上の陰イオン性界面活性剤が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。内部オレフィンスルホン酸は例えばＷＯ２０１７/０９８６３７を参照することができる。
　非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４～２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５～１５．０、好ましくは１１．０～１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
（２）二価金属イオン捕捉剤
　二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。本発明の洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。
（３）アルカリ剤
　アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
（４）再汚染防止剤
　再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
（５）漂白剤
　例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。
（６）蛍光剤
　洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としては、ビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。
（７）キレート剤
　キレート剤は、例えば、汚れの易洗浄化や、洗浄時の水硬度の低減のために配合される。
　斯かるキレート剤としては、アミノカルボン酸系キレート剤、ホスホン酸系キレート剤、ヒドロキシカルボン酸系キレート剤、多価カルボン酸系キレート剤等が挙げられる。
　アミノカルボン酸系キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、アスパラギン酸二酢酸（ＡＳＤＡ）、エチレンジアミンコハク酸（ＥＤＤＳ）及びこれらの塩等が挙げられる。
　ホスホン酸系キレート剤としては、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）、ホスホノブタントリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）及びこれらの塩等が挙げられる。
　ヒドロキシカルボン酸系キレート剤としては、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、乳酸及びこれらの塩等が挙げられる。
　多価カルボン酸系キレート剤としては、コハク酸、シュウ酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マロン酸及びこれらの塩等が挙げられる。
（８）緩衝剤
　緩衝剤は、洗浄液の低ｐＨを維持可能な緩衝系を生成するために配合される。斯かる緩衝剤としては、有機酸とその塩との混合物、例えばポリカルボン酸とその塩の混合物、好ましくは、クエン酸とクエン酸塩の混合物が挙げられる。
（９）その他の成分
　洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。
　洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明のタンパク質及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
　斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤（ランドリー用洗濯洗剤）、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
　また、当該洗浄剤組成物は、低温（例えば、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上）での使用に適する。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＡ、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＢ、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＣ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＤ、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＥをそれぞれ親アミラーゼとするα－アミラーゼ変異体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１であって、当該Ａ１～Ｅ１がそれぞれ配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置から選択される２箇所のアミノ酸残基の欠失を含み、かつ配列番号２の番号付けで１７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される３箇所以上におけるアミノ酸残基の置換であって、少なくとも下記のａ）～ｅ）を含む、α－アミラーゼ変異体。
　ａ）Ａ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換
　ｂ）Ｂ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換
　ｃ）Ｃ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　ｄ）Ｄ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　ｅ）Ｅ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
　＜２＞Ｃ１についての置換が、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の４置換であり、
　Ｄ１についての置換が、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の４置換であり、
　Ｅ１についての置換が、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基Ｈへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の中から選択される４箇所以上の置換である、＜１＞のα－アミラーゼ変異体。
　＜３＞Ｅ１についての置換が、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基Ｈへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の５置換である、＜２＞のα－アミラーゼ変異体。
　＜４＞前記ａ）～ｅ）において、配列番号２の番号付けで１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換をさらに含む、＜１＞～＜３＞のいずれかのα－アミラーゼ変異体。
　＜５＞前記α－アミラーゼの１２６、１２９及び２０１の各位置に相当する位置の置換後のアミノ酸残基がそれぞれ１２６Ｙ、１２９Ｉ及び２０１Ｌ／Ｙである、＜４＞のα－アミラーゼ変異体。
　＜６＞＜１＞～＜５＞のいずれかの変異体をコードするポリヌクレオチド。
　＜７＞＜６＞に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
　＜８＞＜７＞に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
　＜９＞微生物である、＜８＞の形質転換細胞。
　＜１０＞＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の変異体を含む洗浄剤組成物。
　＜１１＞衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜１０＞の洗浄剤組成物。
　＜１２＞粉末又は液体である、＜１１＞の洗浄剤組成物。
　＜１３＞弱酸性、好ましくはｐＨ４～７である、＜１１＞又は＜１２＞の洗浄剤組成物。
　＜１４＞キレート剤を含む、＜１１＞～＜１３＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
　＜１５＞キレート剤が、アミノカルボン酸系キレート剤、ホスホン酸系キレート剤、ヒドロキシカルボン酸系キレート剤又は多価カルボン酸系キレート剤である＜１４＞の洗浄剤組成物。
（１）鋳型α－アミラーゼ発現プラスミドの構築
　人工遺伝子合成したＬＡＢＭ遺伝子（配列番号３）を鋳型としてプライマーペアＬＡＢＭ＿ｆｗ／ＬＡＢＭ＿ｒｖ（配列番号１５及び１６）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。国際公開第２００６／０６８１４８の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアＳ２３７ｔ＿ｆｗ／Ｓ２３７ｓ＿ｒｖ（配列番号１３及び１４）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いて枯草菌を形質転換してプラスミドｐＨＹ－ＬＡＢＭを構築した。また、Ｃｓｐａｍｙ２、ＡＡ５６０、ＳＰ７２２、ＡＰ１３７８の発現には特願２０２１－１１２７１２に記載のプラスミドｐＨＹ－Ｃｓｐａｍｙ２、ｐＨＹ－ＡＡ５６０、ｐＨＹ－ＳＰ７２２及びｐＨＹ－ＡＰ１３７８を用いた。
　さらに、これら５つのプラスミドをそれぞれ鋳型として、配列番号１の番号付けで１７８及び１８０位に相当する位置を欠失させた。具体的には、ｐＨＹ－ＬＡＢＭを鋳型としてプライマーペアＬＡＢＭ＿１８１－１８３ｄｅｌ＿ｆｗ／ＬＡＢＭ＿１８１－１８３ｄｅｌ＿ｒｖ（配列番号１７及び１８）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲＭａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。その後上記と同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行い、枯草菌を形質転換することでプラスミドｐＨＹ－ＬＡＢＭ　Ｒ１８１Δ　Ｄ１８３Δを構築した。同様に、Ｃｓｐａｍｙ２、ＡＡ５６０、ＳＰ７２２及びＡＰ１３７８についても、それぞれｐＨＹ－Ｃｓｐａｍｙ２、ｐＨＹ－ＡＡ５６０、ｐＨＹ－ＳＰ７２２及びｐＨＹ－ＡＰ１３７８を鋳型として、プライマーペアＣｓｐａｍｙ２＿１７８―１８０ｄｅｌ＿ｆｗ／Ｃｓｐａｍｙ２＿１７８―１８０ｄｅｌ＿ｒｖ（配列番号１９及び２０）、ＡＡ５６０＿１８１－１８３ｄｅｌ＿ｆｗ／ＡＡ５６０＿１８１－１８３ｄｅｌ＿ｒｖ（配列番号２１及び２２）、ＳＰ７２２＿１８１－１８３ｄｅｌ＿ｆｗ／ＳＰ７２２＿１８１－１８３ｄｅｌ＿ｒｖ（配列番号２３及び２４）、ＡＰ１３７８＿１８１－１８３ｄｅｌ＿ｆｗ／ＡＰ１３７８＿１８１－１８３ｄｅｌ＿ｒｖ（配列番号２５及び２６）を用いてＰＣＲ及びＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いて枯草菌を形質転換し、プラスミドｐＨＹ－Ｃｓｐａｍｙ２　Ｒ１７８Δ　Ｔ１８０Δ、ｐＨＹ－ＡＡ５６０　Ｒ１８１Δ　Ｄ１８３Δ、ｐＨＹ－ＳＰ７２２　Ｒ１８１Δ　Ｄ１８３Δ、ｐＨＹ－ＡＰ１３７８　Ｒ１８１Δ　Ｔ１８３Δを構築した。
（２）α－アミラーゼ変異体発現プラスミドの構築
　上記に記載のｐＨＹ－ＬＡＢＭ　Ｒ１８１Δ　Ｄ１８３Δ、ｐＨＹ－Ｃｓｐａｍｙ２　Ｒ１７８Δ　Ｔ１８０Δ、ｐＨＹ－ＡＡ５６０　Ｒ１８１Δ　Ｄ１８３Δ、ｐＨＹ－ＳＰ７２２　Ｒ１８１Δ　Ｄ１８３Δ又はｐＨＹ－ＡＰ１３７８　Ｒ１８１Δ　Ｔ１８３Δを鋳型として、以下に示す方法でα－アミラーゼ変異体を構築した。５'末端にリバースプライマーとの相補配列を１５塩基有し変異配列を含むフォワードプライマー、及び変異配列の直前の塩基を５'末端とするリバースプライマーを変異導入用プライマー対として用いてＰＣＲを行った。複数断片を連結する場合、それぞれのＰＣＲ産物を用いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。ＰＣＲ産物又はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いて枯草菌をプロトプラスト法により形質転換して目的のα－アミラーゼ変異体発現プラスミドを保持する形質転換体を取得した。
　ＧＥＮＥＴＹＸ　ｖｅｒ．１２を用いて作成した、配列番号１及び配列番号２と５つの親α－アミラーゼのアライメントを図１に、配列番号２と上記５つの２アミノ酸欠失α－アミラーゼのアライメントを図２に示す。配列番号２の番号付けを用いて１２６、１２９、１７８、１８１、２０１、２３８、２３９、２４０位に相当する残基を赤の三角形で示しており、上に配列番号２でのアミノ酸残基番号を記載した。これらの残基から選択される位置での置換を含む、表２－１及び表２－２に示すα－アミラーゼ変異体を上記に記載の方法で構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（３）酵素生産培養
　１０ｐｐｍテトラサイクリンを添加したＬＢ培地５００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに（１）で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、３２℃、１５００ｒｐｍで一晩培養した。翌日、培養液２０μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）５００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに植菌し、３２℃、１５００ｒｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収し酵素溶液とした。
（４）キレート剤存在下でのアミラーゼ変異体安定性評価
　表２記載の変異体及び各親酵素のキレート剤存在下での保存安定性を評価した。ＡＡＴＣＣ　Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ　ＷＩＴＨＯＵＴ　Ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒを１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）で１０倍希釈したものにイオン交換水で５倍希釈した培養上清を添加し、５０℃で１０分～１時間インキュベートした後にイオン交換水にて１０倍希釈したものを用いて活性測定を行った。また、安定性の比較のために、Ｔｅｒｍａｍｙｌ　３００Ｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をイオン交換水で２００ｐｐｍになるように希釈した溶液についても同様の評価を行った。用いて５０℃処理前のサンプルの活性値を初発活性として、５０℃処理による単位時間（ｈ）当たりの失活速度を算出し、そこから半減期（ｈ）を計算した。各変異体の半減期（ｈ）を親ポリペプチド又はＴｅｒｍａｍｙｌの半減期（ｈ）で割ることで相対安定性を求めた。表３－１及び表３－２にその結果を示す。いずれの変異体も親ポリペプチド及びＴｅｒｍａｍｙｌと比較して安定性が向上していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（５）弱酸性希釈洗剤中でのアミラーゼ変異体安定性評価
　ＡＡＴＣＣ　Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ　ＷＩＴＨＯＵＴ　Ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒを２０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）で１０倍希釈したものにイオン交換水で５倍希釈した培養上清を添加し、５０℃で３０分～１８時間インキュベートした後に５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にて１０倍希釈したものを用いて活性測定を行った。その後（４）と同様の方法で変異体の相対安定性を求めた。表４－１及び表４－２にその結果を示す。いずれの変異体も親ポリペプチド及びＴｅｒｍａｍｙｌと比較して安定性が向上していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (14)

  1. 　配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＡ、配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＢ、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＣ、配列番号１０で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＤ、又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα－アミラーゼＥをそれぞれ親アミラーゼとするα－アミラーゼ変異体Ａ１、Ｂ１、Ｃ１，Ｄ１及びＥ１であって、当該Ａ１～Ｅ１がそれぞれ配列番号１の番号付けで１７８－１８１位に相当する位置から選択される２箇所のアミノ酸残基の欠失を含み、かつ配列番号２の番号付けで１７８、１８１、２３８、２３９、２４０、１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される３箇所以上におけるアミノ酸残基の置換であって、少なくとも下記のａ）～ｅ）を含む、α－アミラーゼ変異体。
    　ａ）Ａ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換
    　ｂ）Ｂ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換
    　ｃ）Ｃ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
    　ｄ）Ｄ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
    　ｅ）Ｅ１について、１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の中から選択される３箇所以上の置換
  2. 　Ｃ１についての置換が、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の４置換であり、
    　Ｄ１についての置換が、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＨへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、及び２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換の４置換であり、
    　Ｅ１についての置換が、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基Ｈへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の中から選択される４箇所以上の置換である、請求項１に記載のα－アミラーゼ変異体。
  3. 　Ｅ１についての置換が、配列番号２の番号付けで１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基Ｈへの置換、１８１位に相当する位置でのアミノ酸残基のＥ又はＱへの置換、２３８位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換、２３９位に相当する位置でのアミノ酸残基のＱへの置換、及び２４０位に相当する位置でのアミノ酸残基のＦへの置換の５置換である、請求項２に記載のα－アミラーゼ変異体。
  4. 　前記ａ）～ｅ）において、配列番号２の番号付けで１２６、１２９及び２０１位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のα－アミラーゼ変異体。
  5. 　前記α－アミラーゼの１２６、１２９及び２０１の各位置に相当する位置の置換後のアミノ酸残基がそれぞれ１２６Ｙ、１２９Ｉ及び２０１Ｌ／Ｙである、請求項４に記載のα－アミラーゼ変異体。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
  7. 　請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
  8. 　請求項７に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
  9. 　微生物である、請求項８に記載の形質転換細胞。
  10. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の変異体を含む洗浄剤組成物。
  11. 　衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項１０に記載の洗浄剤組成物。
  12. 　粉末又は液体である、請求項１１に記載の洗浄剤組成物。
  13. 　弱酸性である、請求項１１又は１２に記載の洗浄剤組成物。
  14. 　キレート剤を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
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