WO2023191384A1 - 항염증 및 항섬유화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

항염증 및 항섬유화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system

Definitions

  • the present invention relates to peptides with anti-inflammatory and anti-fibrotic activity and their uses. More specifically, the present invention relates to peptides having activity in the treatment, prevention, or amelioration of pulmonary inflammatory diseases or pulmonary fibrosis and their uses.
  • the human lungs occupy 6% of the body's volume and are composed of many small gas sacs, the alveoli.
  • the primary purpose of the lungs is to facilitate gas exchange with the systemic circulation.
  • cytokines and growth factors are released from the immune cells in the lungs, such as neutrophils, macrophages, neutrophils, and mast cells, and various lung cells. (growth factors) are secreted.
  • Inflammatory cytokines are known to be important mediators of inflammatory lung diseases.
  • Lung epithelial cells are stimulated by cytokines secreted by inflammatory cells, including interleukins, chemokines, colony stimulating factors and growth factors ( It plays an important role in this cytokine network at local inflammation sites by producing and secreting growth factors, etc.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the mucosa and submucosa of the airways are invaded by eosinophils, mast cells, and CD4+T cells, and these cells produce and secrete IL-4, IL-5, and IL-13. there is.
  • pulmonary fibrosis is known to be a very important cause of inflammatory response in the lungs. Most organs go through inflammation and healing processes after tissue damage. If the damage is minor, normal structure and function are maintained, but if there is continued damage, the tissue undergoes fibrosis during the healing process.
  • corticosteroids are most commonly used as anti-inflammatory drugs to reduce inflammation.
  • drugs that target immune responses or cytokines activate Th1 responses or suppress Th2 responses.
  • cytokine inhibitor, anti-IL-2, anti-IL-4, anti-IL-5, anti-IL-9, anti-IL-13, anti-PGD2, anti-TNF- ⁇ , mast cell inhibitor, PPAR- ⁇ promoter, anti-PGD2 -Treatments such as IgE and anti-CD23 are being developed.
  • these drugs cause side effects in actual clinical trials or have weak actual therapeutic effects, so the development of new drugs that are safer, show higher efficacy, and are more economical in cost is urgently needed.
  • Patent Document 1 WO 2011/029931
  • the present inventors have made research efforts to develop a peptide with anti-inflammatory activity, especially an activity capable of suppressing inflammation in the lung and inhibiting the progression of lung fibrosis.
  • the peptide of the present invention significantly alleviates the inflammatory response in the lung.
  • the present invention was completed by proving through lung cell and animal experiments that it effectively inhibits the progression of lung fibrosis.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing pulmonary inflammatory diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a functional food composition for improving or preventing lung inflammation.
  • Another object of the present invention is to provide a functional food composition for improving or preventing pulmonary fibrosis.
  • one aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of pulmonary inflammatory disease, which contains a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a functional food composition for improving or preventing lung inflammation comprising a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a functional food composition for improving or preventing lung fibrosis comprising a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • a peptide containing the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 1 is provided.
  • peptide refers to a linear molecule formed by linking amino acid residues to each other through peptide bonds.
  • the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention can be used without modification, but deletion or insertion of amino acid residues is possible within the range that does not affect the original activities of the peptide, such as anti-diabetic and anti-obesity activities. , substitution, or a combination of these can be used as a variant or fragment of an amino acid having a different sequence.
  • the peptide of the present invention can be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, etc., to the extent that its activity is not changed. .
  • the peptide of the present invention includes a peptide containing an amino acid sequence substantially identical to the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a variant or active fragment thereof.
  • the substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence having sequence identity of at least 75%, for example, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, and at least 97%, respectively, with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the peptide may additionally include a targeting sequence, a tag, a labeled residue, and an amino acid sequence prepared for the specific purpose of increasing half-life or peptide stability.
  • the peptide of the present invention may have N-terminal and/or C-terminal modifications induced to select a portion of the amino acid sequence and increase its activity. Through these N-terminal and/or C-terminal modifications, the stability of the peptide of the present invention can be significantly improved, for example, the half-life of the peptide can be increased when administered in vivo.
  • the term "stability" is meant to include not only in vivo stability, which protects the peptide of the present invention from attack by protein-cleaving enzymes in vivo, but also storage stability (e.g., storage stability at room temperature).
  • the N-terminal modification includes an acetyl group, a fluoreonylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, and a myristyl group at the N-terminus of the peptide. ), a stearyl group, and polyethylene glycol (PEG).
  • the C-terminal modification may be the binding of a hydroxyl group (-OH), amino group (-NH2), azide (-NHNH2), etc. to the C-terminus of the peptide, but is not limited thereto. .
  • Pheptide of the present invention can be produced by various methods widely known in the technical field to which the present invention pertains.
  • the peptide of the present invention can be synthesized using chemical synthesis methods known in the art, especially solid-phase synthesis techniques (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54 (1963); Stewart, et al. , Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)) or liquid phase synthesis technology (US Patent No. 5,516,891).
  • the peptide of the present invention has the activity of suppressing the expression of inflammatory cytokine genes, inflammatory cytokine proteins, or proteins related to inflammatory cytokine signaling in lung cells where an inflammatory response is induced.
  • the inflammatory cytokine gene whose expression is suppressed may be one or more selected from the group consisting of TNF ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, and COX-2 genes.
  • the inflammatory cytokine proteins or proteins involved in inflammatory cytokine signaling whose expression is suppressed include IL-1 ⁇ , IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, It may be one or more selected from the group consisting of p-AKT, p-ERK, and Myeloperoxidase.
  • Pheptide of the present invention inhibits the expression of fibrogenic genes in lung cells where an inflammatory response is induced.
  • the fibrosis gene whose expression is suppressed may be one or more selected from the group consisting of ⁇ -SMA, Collagen1A1, Fibronectin1, and Tenascin C genes.
  • the peptide of the present invention can reduce the number of neutrophils in lung tissue where an inflammatory response is induced.
  • the peptide of the present invention described above has the above-mentioned activity, it can exhibit excellent efficacy in treating, preventing, or improving inflammatory diseases of the lung.
  • composition for treating or preventing pulmonary inflammatory diseases 1.
  • a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of pulmonary inflammatory disease comprising a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the peptide of the present invention inhibits the expression of inflammatory cytokine genes, proteins, or signaling-related proteins in lung cells that induce an inflammatory response, and thus has excellent activity in the treatment or prevention of lung inflammatory diseases.
  • the lung inflammatory disease is asthma, allergic asthma, bronchitis, chronic bronchitis, acute bronchitis, bronchiolitis, diffuse panbronchiolitis, bronchiectasis, pleurisy, alveolitis, vasculitis, pneumonia, hypersensitivity pneumonitis, chronic obstructive pulmonary disease. It may be a disease selected from the group consisting of lung disease, pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, acute respiratory distress syndrome, acute lung injury, smoke inhalation lung injury, and heat-induced lung injury, but is not limited thereto.
  • the peptide inhibits the expression of inflammatory cytokine genes, inflammatory cytokine proteins, or proteins related to inflammatory cytokine signaling in lung cells in which an inflammatory response is induced. You can.
  • the inflammatory cytokine gene may be one or more selected from the group consisting of TNF ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, and COX-2 genes.
  • the inflammatory cytokine proteins or proteins involved in inflammatory cytokine signaling include IL-1 ⁇ , IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, and It may be one or more selected from the group consisting of myeloperoxidase.
  • the peptide in the pharmaceutical composition for treating or preventing pulmonary inflammatory diseases of the present invention, can inhibit the expression of fibrosis genes in lung cells in which an inflammatory response is induced.
  • the fibrosis gene may be one or more selected from the group consisting of ⁇ -SMA, Collagen1A1, Fibronectin1, and Tenascin C genes.
  • the peptide in the pharmaceutical composition for treating or preventing pulmonary inflammatory diseases of the present invention, can reduce the number of neutrophils in lung tissue where an inflammatory response is induced.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a therapeutically effective amount of the above-described peptide and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount sufficient for the peptide, which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, to achieve its activity or efficacy, for example, to achieve the efficacy of treating or preventing inflammatory diseases of the lung. It means sufficient amount.
  • the pharmaceutically acceptable carriers are commonly used in formulations and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Includes, but is not limited to, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include, but is not limited to, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed., 1995, Williams & Wilkins).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any route suitable for treating inflammatory diseases of the lung, for example, orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, It can be administered by intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, or transdermal administration.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be 0.0001 ⁇ g to 100 mg, 0.001 ⁇ g to 100 mg, 0.01 ⁇ g to 100 mg, 0.1 ⁇ g to 100 mg, or 1.0 ⁇ g to 1000 mg per day, but is not limited thereto. It can be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by those skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
  • a functional food composition for improving or preventing lung inflammation comprising a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the lung inflammation includes asthma, allergic asthma, bronchitis, chronic bronchitis, acute bronchitis, bronchiolitis, diffuse panbronchiolitis, bronchiectasis, pleurisy, alveolitis, vasculitis, pneumonia, hypersensitivity pneumonitis, chronic obstructive pulmonary disease, pulmonary fibrosis, and idiopathic pulmonary fibrosis. , cystic fibrosis, acute respiratory distress syndrome, acute lung injury, smoke inhalation lung injury, and heat-induced lung injury, but is not limited to this.
  • a functional food composition for improving or preventing pulmonary fibrosis comprising a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the peptide inhibits the expression of inflammatory cytokine genes, inflammatory cytokine proteins, or proteins related to inflammatory cytokine signaling in lung cells in which an inflammatory response is induced. It can be suppressed.
  • the inflammatory cytokine gene may be one or more selected from the group consisting of TNF ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, and COX-2 genes.
  • the inflammatory cytokine proteins or proteins involved in inflammatory cytokine signaling include IL-1 ⁇ , IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, and It may be one or more selected from the group consisting of myeloperoxidase.
  • the peptide in the functional food composition for improving or preventing lung inflammation or lung fibrosis of the present invention, can inhibit the expression of fibrosis genes in lung cells in which an inflammatory response is induced.
  • the fibrosis gene may be one or more selected from the group consisting of ⁇ -SMA, Collagen1A1, Fibronectin1, and Tenascin C genes.
  • the peptide in the functional food composition for improving or preventing lung inflammation or lung fibrosis of the present invention, can reduce the number of neutrophils in lung tissue where an inflammatory response is induced.
  • the peptide may be included in an appropriate amount within the range of 0.0001% by weight to 10% by weight based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the functional food composition of the present invention may include a foodologically effective amount of the peptide and a foodologically acceptable carrier.
  • the food composition of the present invention includes not only the peptide as the active ingredient, but also ingredients commonly added during food production, and may include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings, and flavoring agents.
  • examples of the above-mentioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, etc.; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides, etc.; and polysaccharides, such as common sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • flavoring agents natural flavoring agents, thaumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the ratio of the carbohydrate may generally be about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g, per 100 g of the food composition of the present invention, but is not limited thereto.
  • the functional food composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavors, colorants and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid, and salts thereof. , alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc. In addition, it may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, and vegetable drinks.
  • the functional food composition of the present invention when manufactured as a drink, in addition to the peptide, which is the active ingredient of the present invention, citric acid, high fructose corn syrup, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, Eucommia extract, jujube extract, licorice extract, etc. are added. May be included.
  • treatment of pulmonary inflammatory disease comprising administering a therapeutically effective amount of a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a pharmaceutical composition containing the peptide to a patient with pulmonary inflammatory disease.
  • preventive, or improvement methods are provided.
  • the use of the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is provided for treating, preventing, or improving pulmonary inflammatory disease.
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 described above for preparing a medicament or functional food composition for treating, preventing, or improving pulmonary inflammatory diseases.
  • the peptide of the present invention has the activity of suppressing the expression of inflammatory cytokine genes, inflammatory cytokine proteins, or proteins related to inflammatory cytokine signaling in lung cells in which an inflammatory response is induced. Additionally, the peptide can reduce the number of neutrophils in lung tissue where an inflammatory response is induced. Therefore, the peptide of the present invention can be used as an active substance useful for treating, preventing, or improving inflammatory diseases of the lung.
  • Figure 1 shows the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on gene expression of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, and IL-8 in MRC-5 cells induced an inflammatory response by LPS treatment. This is the result of measurement.
  • Figure 2 shows the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the gene expression of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, and COX-2 in A549 cells in which an inflammatory response was induced by LPS treatment. This is the result of measurement.
  • Figure 3 shows the results of measuring the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the expression of IL-1 ⁇ , IL-6, pJNK, and pERK in MRC-5 cells in which an inflammatory response was induced by LPS treatment.
  • Figures 4a and 4b show the treatment of the peptide of Preparation Example 1 on the expression of Phospho-PI3K, Phospho-AKT, Phospho-ERK, IL-1 ⁇ , IL-6, and COX2 in A549 cells in which an inflammatory response was induced by LPS treatment. This is the result of measuring the impact.
  • Figures 5a and 5b show the results of measuring the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the expression of IL-6 and IL-8 in MRC-5 cells in which an inflammatory response was induced by LPS treatment.
  • Figure 6 shows the results of measuring the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the expression levels of the fibrogenic genes ⁇ -SMA and Collagen1A1 genes in MRC-5 cells in which an inflammatory response was induced by LPS treatment.
  • Figure 7 shows the results of measuring the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the expression levels of the fibrotic genes ⁇ -SMA, Fibronectin1, Collagen1A1, and Tenascin C in MRC-5 cells treated with TGF- ⁇ 1.
  • Figure 8 shows the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the gene expression levels of inflammatory cytokines TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, and COX-2 in A549 cells treated with IL-1 ⁇ . This is the result of measurement.
  • Figures 9A, 9B, and 9C measure the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the expression levels of inflammatory cytokines IL-1 ⁇ , IL-6, and IL-8 in A549 cells treated with IL-1 ⁇ . This is one result.
  • Figures 10a and 10b show the results of measuring the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the total number of cells, number of neutrophils, and number of macrophages in bronchial lavage fluid of mice in which lung inflammation was induced by LPS. .
  • Figures 11a to 11d measure the effect of treatment with the peptide of Preparation Example 1 on the expression levels of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, and Myeloperoxidase (MPO) in bronchial lavage fluid of mice in which lung inflammation was induced by LPS. This is one result.
  • Figures 12a and 12b show the results of observation after H&E staining of lung tissue of mice in which lung inflammation was induced by LPS, the results of measuring the thickness of the alveolar wall, the results of measuring the total number of cells, and the number of alveoli. This is one result.
  • Figure 13a shows the results of measuring the body weight of a mouse with pulmonary fibrosis induced by BLM (Bleomycin), and Figure 13b shows the peptide of Preparation Example 1 for the number of macrophages and lymphocytes in the bronchial lavage fluid of the mouse. This is the result of measuring the effect of treatment, and Figures 13c and 13d show the results of observing the cells under a microscope in the bronchial lavage fluid of the mouse and measuring the total number of cells.
  • BLM Bleomycin
  • Figure 14a shows the results of observing H&E staining of lung tissue of mice in which pulmonary fibrosis was induced by BLM (Bleomycin), and Figure 14b shows the results of measuring the number of alveoli in each treatment group in the H&E-stained lung tissue photo. These are the results of measuring the total number of cells and the thickness of the alveolar walls.
  • Figure 15a shows the results observed by Trichrome staining of the lung tissue of mice with pulmonary fibrosis induced by BLM (Bleomycin), and Figure 15b shows the change in the amount of collagen in the remaining treatment groups with the amount of collagen in the normal group set to 100%. is expressed in %.
  • a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 shown in Table 1 below was synthesized using an automatic peptide synthesizer (Milligen 9050, Millipore, USA), followed by C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) (Waters Associates, USA). These synthesized peptides were purified using .
  • the column used was ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 mm ⁇ 100 mm, 1.7 ⁇ m, Waters Co, USA).
  • MRC-5 cells lung fibroblast cells
  • LPS Sigma Aldrich
  • LPS 5 ⁇ g/ml treated group negative control
  • LPS 5 ⁇ g/ml the peptide of Preparation Example 1 (10, 50, 100, 500 ⁇ M) treated group
  • LPS 5 ⁇ g/ml the peptide of Preparation Example 1 (10, 50, 100, 500 ⁇ M) treated group
  • LPS 5 ⁇ g/ml the peptide of Preparation Example 1 (10, 50, 100, 500 ⁇ M) treated group
  • LPS 5 ⁇ g/ml And for the Dexamethasone (DEX) 10 ⁇ M treatment group positive control group
  • RNA was extracted 24 hours after treatment with the active substances and drugs and RT-PCR was performed.
  • A549 cells (human alveolar basal epithelial cells) were seeded at 3 x 10 5 cells/well in a 6-well plate and used in the experiment. After culturing for 1 day in medium containing 10% FBS, the medium was replaced with medium without FBS and starvation was induced for 4 hours.
  • MRC-5 cells lung fibroblast cells
  • LPS Sigma Aldrich
  • LPS 5 ⁇ g/ml treated group negative control
  • LPS 5 ⁇ g/ml and the peptide of Preparation Example 1 (10, 50, 100, 500 ⁇ M) treated group
  • LPS 5 ⁇ g/ml ml and Dexamethasone (DEX) 10 ⁇ M treated group positive control
  • the cultured cells of each treatment group and control group were lysed by adding lysis buffer and then centrifuged at 4°C at 12,000 rpm for 30 minutes.
  • the obtained protein was quantified using the BCA Protein Assay kit (Sigma). Proteins were subjected to SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) and then electrotransferred to a membrane.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the secondary antibody was reacted at room temperature for 1 hour, washed again with PBS-T, and Western detection reagent (Elpis Biotech, Daejeon, Korea).
  • the antibodies used in the experiment were as follows: anti-IL-1 ⁇ antibody (Cell signaling technology (CST), USA), anti-IL-6 antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-pJNK antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) ), anti-pERK antibody (Cell signaling technology (CST), USA), anti- ⁇ -Actin antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA).
  • A549 cells (human alveolar basal epithelial cells) were seeded at 3 x 10 5 cells/well in a 6-well plate and used in the experiment. After culturing for 1 day with medium containing 10% FBS, the medium was replaced with medium without FBS and starvation was induced for 4 hours. Normal group where cells were not treated with anything, LPS (Sigma Aldrich) (5 ⁇ g/ml) treated group (negative control), LPS (5 ⁇ g/ml) and peptide of Preparation Example 1 (10, 50, 100, 500 ⁇ M) treated group.
  • LPS (5 ⁇ g/ml) and Dexamethasone (DEX) (10 ⁇ M) treatment group (positive control) cells were treated with the above-mentioned active substances and drugs and cultured for 24 hours.
  • the cultured cells of each treatment group and control group were lysed by adding lysis buffer and then centrifuged at 4°C at 12,000 rpm for 30 minutes.
  • the obtained protein was quantified using the BCA Protein Assay kit (Sigma). Proteins were subjected to SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) and then electrotransferred to a membrane.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the membrane to which the protein was attached was treated with 5% skim milk for blocking, and then the primary antibody was reacted overnight at 4°C. After washing with PBS-T, the secondary antibody was reacted at room temperature for 1 hour, washed again with PBS-T, and Western detection reagent (Elpis Biotech, Daejeon, Korea).
  • the antibodies used in the experiment were as follows: anti-IL-1 ⁇ antibody: (Cell signaling technology (CST), USA), anti-IL-6 antibody: (Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-COX2 antibody: (Santa Cruz Biotechnology , USA), anti-Phospho-PI3K antibody: (Cell signaling technology (CST), USA), anti-Phospho-AKT antibody: (Cell signaling technology (CST), USA), anti-Phospho-ERK antibody: (Cell signaling technology (CST), USA), anti- ⁇ -Actin antibody: (Santa Cruz Biotechnology, USA).
  • MRC-5 cells lung fibroblast cells
  • LPS Sigma Aldrich
  • LPS 5 ⁇ g/ml treated group negative control
  • LPS 5 ⁇ g/ml and the peptide of Preparation Example 1 (10, 50, 100, 500 ⁇ M) treated group
  • the culture medium was centrifuged at 4°C and 3,000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was used using the IL-6 Quantikine ELISA Kit (R&D systems) and IL-8 Quantikine ELISA kit (R&D systems) according to the instructions in the kit instructions. After performing ELISA analysis, absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader. As a result of the experiment, as shown in FIGS. 5A and 5B, when treated with LPS, the expression levels of IL-6 and IL-8 increased, but treatment with the peptide of Preparation Example 1 reduced IL-6 and IL-8. The expression level decreased in a concentration-dependent manner.
  • PCR was performed using a PCR machine (Eppendorf, Germany). The mRNA expression pattern was then determined by agarose gel electrophoresis. The base sequences of the primers used in the experiment are listed in Table 3 below.
  • PCR was performed using a PCR machine (Eppendorf, Germany). The mRNA expression pattern was then determined by agarose gel electrophoresis. The base sequences of the primers used in the experiment are listed in Table 4 below.
  • IL-1 ⁇ (2ng/ml) treated group negative control, NC
  • IL-1 ⁇ (2ng/ml) and the peptide of Preparation Example 1 10, 50, 100, Cells from the 500 ⁇ M) treatment group
  • IL-1 ⁇ (2 ng/ml) and Dexamethasone (DEX) (10 ⁇ M) treatment group positive control group
  • the culture medium was centrifuged at 4°C and 3,000 rpm for 10 minutes, and the obtained supernatant was assayed with IL-6 Quantikine ELISA Kit (R&D systems), IL-8 Quantikine ELISA Kit (R&D systems), and IL-1 ⁇ Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) was used to perform ELISA analysis according to the instructions in the kit instructions, and the absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader. As a result of the experiment, as shown in FIGS.
  • BALB/c mice Female/7W were used in animal experiments, and an acute lung inflammation model was established by injecting LPS.
  • the experiment was performed on 7-week-old BALB/c female mice, divided into 5 groups of 5 mice each, as shown in [Table 5] below.
  • LPS (10 ⁇ g/50 ⁇ l/mouse) was administered nasally to the G2-G5 groups, and 1 hour after LPS administration, the G3 and G4 groups were administered the peptide (0.5 mg, 1 mg) of Preparation Example 1 intranasally.
  • G5 positive control group was intraperitoneally administered Dexamethasone (100 ⁇ g). 24 hours after administration of the active substance and drug, the mouse was sacrificed to obtain bronchial lavage fluid and lung tissue, which were used in the next analysis.
  • peptide Peptide of Preparation Example 1
  • DEX Dexamethasone
  • IN intranasal administration
  • IP intraperitoneal administration.
  • BALF bronchial lavage fluid
  • bronchoalveolar lavage fluid BALF was collected by repeating the injection and withdrawal of 1ml of PBS twice through an IV catheter (BD, USA). did.
  • the collected BALF was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to separate the cells.
  • the separated cells were resuspended in 0.5 ml of PBS, diluted with trypan blue solution at a 1:1 ratio, and the total was measured using a hematocytometer. Cells were counted.
  • BALF bronchial lavage fluid
  • ELISA analysis was performed on pro-inflammatory proteins on the collected BALF.
  • the collected BALF was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was assayed with TNF- ⁇ Quantikine ELISA kit (R&D systems), IL-1 ⁇ Quantikine ELISA kit (R&D systems), IL-6 Quantikine ELISA kit (R&D systems), and Myeloperoxidase ( MPO) Quantikine ELISA Kit (R&D systems) was used to perform the analysis according to the instructions, and the absorbance was measured at 450 nm using a Microplate reader. As a result of the experiment, as can be seen in FIGS.
  • the expression levels of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, and Myeloperoxidase (MPO) increased by LPS administration, and the expression levels of the cytokines increased. It was reduced in a concentration-dependent manner by treatment with the peptide of Preparation Example 1.
  • Lung tissue obtained from mice subjected to animal experiments was washed with PBS at room temperature and then fixed with 4% paraformaldehyde (PBS dilution).
  • the fixed tissue was washed three times with PBS and dehydrated using an ethanol series with a concentration gradient of 70% to 100%.
  • the lung tissue samples were then embedded and cut into 4 ⁇ m thick slices.
  • the 4- ⁇ m-sized sliced specimen placed on a slide glass was dewaxed and hydrated in a gradient ethanol series, and then stained in hematoxlin solution for 1 minute and in Eosin solution for 10 seconds. After staining, the tissue slides were sequentially immersed in 90% and 100% ethanol, and finally, they were dipped in xylene twice for 5 minutes before mounting the tissue slides.
  • the graph in Figure 12b shows the results of measuring the thickness of the alveolar walls (the alveolar wall thickness of the normal group is set as 100%, and the degree of increase in thickness of the remaining treatment groups is expressed in %), and the results of measuring the number of cells in the stained lung photograph ( The number of cells in the normal group is set to 100%, and the increase in the number of cells in the remaining treatment group is expressed as a percentage), and the number of alveoli in the lung photograph was measured (the number of alveoli in the normal group was set to 100%) The increase and decrease in the number of alveoli in the remaining treatment groups are expressed as %, respectively.
  • mice Eight-week-old BALB/c male mice were divided into four groups of five, as shown in [Table 6] below.
  • BLM was induced once by administering Bleomycin solution (10ng/50 ⁇ l/mouse) through the oropharynx, and then from day 7, the peptide of Preparation Example 1 (1 mg/mouse) was administered intranasally three times a week for 14 days.
  • Pirfeninone (2mg/mouse) a positive control group, was administered orally three times a week for 14 days.
  • mice On the 21st day of BLM induction, mice were sacrificed to obtain bronchial lavage fluid and lung tissue, which were used in the following analysis.
  • BALF bronchial lavage fluid
  • bronchoalveolar lavage fluid BALF
  • the collected BALF was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to separate the cells.
  • the separated cells were resuspended in 0.5 ml of PBS, diluted with trypan blue solution at a 1:1 ratio, and the total was measured using a hematocytometer. Cells were counted.
  • Lung tissue obtained from mice subjected to animal experiments was washed with PBS at room temperature and then fixed with 4% paraformaldehyde (PBS dilution). The fixed tissue was washed three times with PBS and dehydrated using a 70% to 100% gradient ethanol series. The lung tissue samples were then embedded and cut into 4 ⁇ m thick slices. Sectioned specimens of 4 ⁇ m size placed on glass slides were dewaxed and hydrated in a gradient ethanol series and sequentially stained in hematoxlin solution for 1 minute and Eosin solution for 10 seconds. After staining, the tissue slides were sequentially immersed in 90% and 100% ethanol, and finally, they were dipped in xylene twice for 5 minutes before mounting the tissue slides.
  • PBS dilution paraformaldehyde
  • Figure 14a shows the results of observing H&E staining of lung tissue.
  • Figure 14b shows the results of measuring the number of alveoli in each treatment group in the stained lung tissue photograph, and the total number of cells in the stained lung tissue photograph (the total number of cells in the normal group was set as 100%, and the rest were treated The degree of increase in the total number of cells in the group is expressed as a percentage), and the thickness of the alveolar wall of each treatment group was measured in the stained lung tissue photo (the thickness of the alveolar wall in the normal group was set as 100%, and the thickness of the remaining treatment groups increased) degree is expressed in %).
  • Lung tissue obtained from mice subjected to animal experiments was washed with PBS at room temperature and then fixed with 4% paraformaldehyde (PBS dilution). The fixed tissue was washed three times with PBS and dehydrated using a 70% to 100% gradient ethanol series. The lung tissue samples were then embedded and cut into 4 ⁇ m thick slices. Thin sections of 4 ⁇ m size placed on glass slides were dewaxed and hydrated in a gradient ethanol series. Staining was performed for 10 minutes each in Weigert's iron hematoxlin, Biebrich scarlet-acid fuchsin solution, Phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution, and aniline blue solution.
  • FIG. 15a shows the results of collagen staining using Trichrome staining.
  • Figure 15b shows the change in the amount of collagen in the remaining treatment groups as a percentage, taking the amount of collagen in the normal group as 100%.
  • tablets were manufactured by tableting according to a conventional tablet manufacturing method.
  • a capsule was prepared by filling a gelatin capsule according to a typical capsule manufacturing method.
  • Vitamin A 70 mg
  • Vitamin E 1.0mg
  • Vitamin B6 0.5mg
  • Vitamin B12 0.2mg
  • composition ratio of the above vitamin and mineral mixture is a mixture of components relatively suitable for health food in a preferred embodiment, but the mixing ratio may be modified arbitrarily.
  • the above ingredients are mixed according to a typical health food manufacturing method, and then , granules can be manufactured and used to manufacture health food compositions according to conventional methods.
  • composition ratio is a preferred embodiment of mixing ingredients that are relatively suitable for beverages of preference, but the mixing ratio can be arbitrarily modified depending on regional and ethnic preferences such as demand class, country of demand, and intended use.

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Abstract

본 발명의 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제하는 활성을 갖는다. 또한, 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 폐의 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선에 유용한 활성물질로 사용될 수 있다.

Description

항염증 및 항섬유화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
[관련출원과의 상호인용]
본 출원은 2022년 03월 31일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0040544호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국특허출원 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
[기술분야]
본 발명은 항염증 및 항섬유화 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 폐 염증성 질환 또는 폐섬유증의 치료, 예방, 또는 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간의 폐는 신체의 6% 부피를 차지하고, 다수의 작은 가스낭인 폐포로 구성되어 있다. 폐의 일차적 목적은 전신 순환계와 가스 상호 교환을 촉진하는 것이다. 폐가 어떠한 원인에 의해서든 자극이 되어 염증반응(inflmmation response) 유발하게 되면 폐에서의 면역 세포인 호중구, 대식세포, 중성구, 비만세포 등의 세포와, 여러가지 폐 세포로부터 사이토카인(cytokine)이나 성장인자(growth factor)가 분비된다. 염증성 사이토카인은 염증성 폐질환의 중요한 매개물질로 알려져 있는데, 폐 상피세포는 염증세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 인터루킨(interleukin), 케모카인(chemokines), 콜로니 자극인자(colony stimulating factors)와 성장인자(growth factor)등을 생산하여 분비함으로써 국소 염증 부위에서이 사이토카인 네트워크에 중요한 역할을 한다.
폐에서의 염증성 질환으로서 대표적인 질환인 천식과 만성폐쇄성폐질환(COPD)은 모두 만성적인 기도 염증에 의해서 유발되는 질환이며, 전세계적으로 매우 흔하고, 그 유병율도 급증하고 있다. 천식 환자에서는 기도의 점막(mucosa)과, 점막하(submucosa)층에 호산구, 비만세포와 CD4+T 세포의 침범이 발생되며, 이들 세포는 IL-4, IL-5, IL-13를 생산 분비하고 있다. 또한, 폐의 섬유증은 폐에서의 염증반응이 매우 중요한 발병 원인이라고 알려져 있다. 대부분의 장기는 조직 손상후에 염증과 치유 과정을 거치게 되는데, 만약 손상이 작은 경우는 정상 구조와 기능을 유지하지만, 계속적인 손상이 있으면 치유 과정에서 조직이 섬유화되는 과정을 밟게 된다.
현재 사용되고 있는 폐 염증성 질환의 치료제로는 염증을 줄여주기 위한 항염증제로서 코르티코 스테로이드 제제가 가장 많이 사용되고 있으며, 그 외에도 면역반응이나 사이토카인을 표적으로 하는 약물로 Th1 반응을 활성화시키거나, Th2 반응을 억제시키는 치료제, 사이토카인 억제제로서 항 IL-2, 항 IL-4, 항 IL-5, 항 IL-9, 항 IL-13, 항 PGD2, 항 TNF-α, 비만세포 억제제, PPAR-γ 촉진제, 항-IgE, 항 CD23 등의 치료제가 개발되고 있다. 그러나, 이러한 약물들은 실제 임상에서 부작용이 발생하거나 실제 치료 효과가 미약하여, 보다 안전하고 높은 효능을 보이면서, 비용면에서 경제적인 새로운 약물의 개발이 절실한 실정이다.
[선행기술문헌]
[특허문헌 1] WO 2011/029931
본 발명자들은 항염증 활성 특히 폐에서의 염증을 억제하고 폐 섬유화로의 진전을 억제할 수 있는 활성을 갖는 펩타이드를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 본 발명의 펩타이드가 폐에서의 염증반응을 현저히 완화시켜 주고, 폐의 섬유화로의 진행도 효과적으로 억제한다는 것을 폐세포 및 동물실험을 통해 증명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 폐 염증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 폐의 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 펩타이드 및 이의 활성
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
본 명세서의 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 변형 없이 사용될 수 있으나, 상기 펩타이드가 가지는 본래의 활성, 예컨대 항당뇨 및 항비만 활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환, 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편을 사용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그 활성을 변화시키지 않는 범위내에서 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열이란 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 상기 펩타이드에는 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열이 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 및/또는 C-말단 변형이 유도된 것일 수 있다. 이러한 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 통해 본 발명의 펩타이드의 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 예를 들어, 펩타이드의 생체 내 투여 시 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기 용어 "안정성"은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보에서의 안정성 뿐만 아니라, 저장안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 포함하는 의미이다.
상기 N-말단 변형은 펩타이드의 N-말단에 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기가 결합한 것일 수 있다. 상기 C-말단 변형은 펩타이드의 C-말단에 히드록시기(hydroxyl group, -OH), 아미노기(amino group, -NH2), 아자이드(azide, -NHNH2) 등이 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 폡타이드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 널리 알려진 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성방법, 특히 고상 합성기술(solid-phasesynthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 염증반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제하는 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 발현이 억제되는 상기 염증성 사이토카인 유전자는 TNF α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 발현이 억제되는 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질은 IL-1β, IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, 및 Myeloperoxidase으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 폡타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 섬유화 유전자의 발현을 억제한다.
일 구현예에서, 상기 발현이 억제되는 섬유화 유전자는 α-SMA, Collagen1A1, Fibronectin1, 및 Tenascin C 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다.
상술한 본 발명의 펩타이드가 상기와 같은 활성을 가짐으로써 폐의 염증성 질환을 치료, 예방 또는 개선하는데에 매우 우수한 효능을 발휘할 수 있다.
2. 폐 염증성 질환 치료 또는 예방용 조성물
약학적 조성물
본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드는 상술한 바와 같이 염증 반응 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 단백질, 또는 신호전달 관련 단백질들의 발현을 억제하므로 우수한 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방 활성을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 폐 염증성 질환은 천식, 알러지성 천식, 기관지염, 만성 기관지염, 급성 기관지염, 세기관지염, 미만성 범세기관지염, 기관지 확장증, 흉막염, 폐포염, 혈관염, 폐렴, 과민성 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐손상, 연기 흡입 폐손상, 및 열에 의한 폐손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제할 수 있다.
상기 염증성 사이토카인 유전자는 TNFα, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질은 IL-1β, IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, 및 Myeloperoxidase으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 섬유화 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
상기 섬유화 유전자는 α-SMA, Collagen1A1, Fibronectin1, 및 Tenascin C유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 상술한 펩타이드의 치료학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다.
상기 용어 "치료학적 유효량"은 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 펩타이드가 그 활성 또는 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미하고, 예컨대, 폐의 염증성 질환의 치료 또는 예방의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed., 1995, Williams & Wilkins)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 폐의 염증성 질환을 치료하기 위한 적합한 모든 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육내 주입, 복강내 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 1일당 0.0001 μg 내지 100 mg, 0.001 μg 내지 100 mg, 0.01 μg 내지 100 mg, 0.1 μg 내지 100 mg, 또는 1.0 μg 내지 1000 mg 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
식품 조성물
본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 폐 염증은 천식, 알러지성 천식, 기관지염, 만성 기관지염, 급성 기관지염, 세기관지염, 미만성 범세기관지염, 기관지 확장증, 흉막염, 폐포염, 혈관염, 폐렴, 과민성 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐손상, 연기 흡입 폐손상, 및 열에 의한 폐손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환에 의한 폐 염증일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 폐 염증 또는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제할 수 있다.
상기 염증성 사이토카인 유전자는 TNF α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질은 IL-1β, IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, 및 Myeloperoxidase으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 폐 염증 또는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 섬유화 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
상기 섬유화 유전자는 α-SMA, Collagen1A1, Fibronectin1, 및 Tenascin C유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 폐 염증 또는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물에서, 상기 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물에서 펩타이드는 전체 조성물 중량에 대해 0.0001 중량% 내지 10 중량%의 범위내에서 적절한 양을 선택하여 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 상기 펩타이드의 식품학적 유효량 및 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 유효성분으로서 펩타이드 뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로오스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제, 타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 상술한 성분 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 기능성 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 펩타이드 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함될수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상술한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 폐 염증성 질환의 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상술한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 폐 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선하는 데 사용하는 용도(use)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 폐 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선하기 위한 의약(medicament) 또는 기능성 식품 조성물의 제조하기 위한 상술한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 용도를 제공한다.
상기 폐 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선 방법에는 상술한 본 발명의 펩타이드, 약학적 조성물에 관해 설명된 내용이 모두 동일하게 적용될 수 있으며, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 중복하여 기재하지 않는다.
본 발명의 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제하는 활성을 갖는다. 또한, 펩타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 폐의 염증성 질환의 치료, 예방, 또는 개선에 유용한 활성물질로 사용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 MRC-5 세포에서 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 IL-8의 유전자 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드로 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 2는 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 A549 세포에서 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드로 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 3은 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 MRC-5 세포에서 IL-1β, IL-6, pJNK, pERK의 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 A549 세포에서 Phospho-PI3K, Phospho-AKT, Phospho-ERK, IL-1β, IL-6, COX2의 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 MRC-5 세포에서 IL-6 및 IL-8의 발현에 대한 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 6은 LPS 처리에 의해 염증반응 유도된 MRC-5 세포에서 섬유화 유전자 α-SMA 및 Collagen1A1 유전자의 발현 수준에 대한, 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 7은 TGF-β1 처리한 MRC-5 세포에서 섬유화 유전자 α-SMA, Fibronectin1, Collagen1A1, 및 Tenascin C의 유전자의 발현 수준에 대한, 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 8은 IL-1β 처리한 A549 세포에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2의 유전자 발현 수준에 대한, 제조예 1의 펩타이드 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 9a, 도 9b 및 도 9c는 은 IL-1β 처리한 A549 세포에서 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, 및 IL-8의 발현 수준에 대한, 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 10a 및 도 10b는 LPS에 의해 폐 염증 유도된 마우스의 기관지세척액에서 총 세포수, 호중구(neutrophil)수, 대식세포(macrophage)의 수에 대한 제조예 1의 펩타이드 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 11a 내지 도 11d은 LPS에 의해 폐 염증 유도된 마우스의 기관지세척액에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, Myeloperoxidase(MPO)의 발현수준에 대한 제조예 1의 펩타이드의 처리의 영향을 측정한 결과이다.
도 12a 및 도 12b는 LPS에 의해 폐 염증 유도된 마우스의 폐조직의 H&E 염색후 관찰한 결과와, 폐포벽의 두께를 측정한 결과와, 총 세포의 수를 측정한 결과와, 폐포의 수를 측정한 결과이다.
도 13a는 BLM(Bleomycin)에 의해 폐 섬유증 유도된 마우스의 체중을 측정한 결과이고, 도 13b는 상기 마우스의 기관지세척액에서 대식세포(macrophage) 및 림프구(lymphocyte)의 수에 대한 제조예 1의 펩타이드를 처리한 영향을 측정한 결과이고, 도 13c 및 도 13d는 상기 마우스의 기관지세척액에서 세포들을 현미경으로 관찰한 결과 및 총 세포수를 측정한 결과이다.
도 14a는 BLM(Bleomycin)에 의해 폐 섬유증 유도된 마우스의 폐조직의 H&E 염색을 관찰한 결과이고, 도 14b는 상기 H&E 염색한 폐 조직사진에서 각처리 군의 폐포의 수를 측정한 결과와, 총 세포의 수를 측정한 결과와, 폐포벽의 두께를 측정한 결과이다.
도 15a는 BLM(Bleomycin)에 의해 폐 섬유증 유도된 마우스의 폐조직의 Trichrome 염색을 행하여 관찰한 결과이며, 도 15b는 정상군의 콜라겐의 양을 100% 로 하여 나머지 처리군의 콜라겐의 양의 변화를 %로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
제조예 1: 펩타이드의 제조
자동 펩타이드 합성기(Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기의 [표 1]에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(Waters Associates, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 ㎜ Х 100 ㎜, 1.7 ㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.
서열번호 펩타이드의 아미노산 서열
1 KYLLVHRPYYRR
이어서, 상기 제조한 서열번호 1의 펩타이드에 대한 효능을 평가하였다.
실험예 1 : LPS에 의해 유도된 염증성 사이토카인 유전자 발현의 억제
제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다.
1. MRC-5 세포
MRC-5 세포 (lung fibroblast cell)를 12-웰 플레이트에 3 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS(Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드(10, 50, 100, 500μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성대조군)에 대해, 활성물질 및 약물들을 처리하고 24시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 MRC-5 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)로 cDNA 로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머(primer)로 반응 혼합물을 준비한 후, PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용한 프라이머의 염기서열은 아래의 [표 2]에 기재하였다. 실험결과, 도 1에서 보여지는 바와 같이, 염증유도인자인 LPS 처리에 의해 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 IL-8의 유전자 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드로 처리할 경우 증가된 상기 유전자들의 발현이 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.
2. A549 세포
A549 세포(Human alveolar basal epithelial cell)를 6-웰 플레이트에 3 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS(Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드(10, 50, 100, 500μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)에 대해, 활성 물질 및 약물들을 처리하고 3시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 상기 처리군 A549 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)로 cDNA 로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머(primer)로 반응 혼합물을 준비한 후 PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용한 프라이머의 염기서열은 아래의 [표 2]에 기재하였다. 실험결과, 도 2에서 보여지는 바와 같이, 염증유도인자인 LPS 처리에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드로 처리할 경우 증가된 상기 유전자들의 발현이 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.
유전자 프라이머 서열(5' -> 3') 서열번호
TNF-α F AACATCCAACCTTCCCAAACG 2
R GACCCTAAGCCCCCAATTCTC 3
IL-1β F TTCGACACATGGGATAACGA 4
R TCTTTCAACACGCAGGACAG 5
IL-6 F AAA GAG GCA CTG CCA GAA AA 6
R ATC TGA GGT GCC CAT GCT AC 7
IL-8 F GAAGGTGCAGTTTTGCCAAG 8
R ACCCTCTGCACCCAGTTTTC 9
COX-2 F ATCATTCACCAGGCAAATTGC 10
R GGCTTCAGCATAAAGCGTTTG 11
GAPDH F GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT 12
R GGA GCC AAA AGG GTC ATC AT 13
실험예 2 : LPS에 의해 유도된 염증성 사이토카인 단백질 발현의 억제
제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 염증성 사이토카인 단백질들의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다.
1. 웨스턴 블로팅 분석 1: MRC-5 세포
MRC-5 세포(lung fibroblast cell)를 6-웰 플레이트에 2 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS (Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 24시간 배양하였다. 배양한 각 처리군 및 대조군의 세포에 용해버퍼를 첨가하여 용해시킨 후 4℃ 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 획득한 단백질을 BCA Protein Assay 키트(Sigma)를 사용하여 정량하였다. 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 수행한 후, 멤브레인(membrane)에 전기이동(electrotransfer)하였다. 단백질이 부착된 멤브레인을 5% 탈지유(skim milk)로 처리하여 블로킹(blocking)한 후, 1차 항체를 4℃에서 하룻밤(overnight) 반응시켰다. PBS-T로 세척한 다음 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고 다시 PBS-T로 세척한 후 Gel Doc(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 Western 검출 시약(Elpis Biotech, Daejeon, Korea)을 통해 시각화하였다. 실험에 사용한 항체는 다음과 같다: 항-IL-1β 항체(Cell signaling technology(CST), USA), 항-IL-6 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-pJNK 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-pERK 항체(Cell signaling technology(CST), USA), 항-β-Actin 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA). 실험결과, 도 3에서 보여지는 바와 같이, LPS를 처리한 경우 IL-1β, IL-6, pJNK, pERK의 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해, IL-1β, IL-6, pJNK, pERK의 발현이 농도 의존적으로 다시 감소하였다.
2. 웨스턴 블로팅 분석 2 : A549 세포
A549 세포(Human alveolar basal epithelial cells)를 6-웰 플레이트에 3 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS (Sigma Aldrich) (5μg/ml) 처리군(음성대조군), LPS (5μg/ml) 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, LPS (5μg/ml) 및 Dexamethasone (DEX) (10μM) 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 24시간 배양하였다. 배양한 각 처리군 및 대조군의 세포에 용해버퍼를 첨가하여 용해시킨 후 4℃ 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 획득한 단백질을 BCA Protein Assay 키트(Sigma)를 사용하여 정량하였다. 단백질은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)한 다음 멤브레인(membrane)에 전기이동(electrotransfer)하였다. 단백질이 부착된 멤브레인을 5% 탈지유(skim milk)로 처리하여 블로킹(blocking)한 후, 1차 항체를 4℃에서 하룻밤(overnight) 반응시켰다. PBS-T로 세척한 다음 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고 다시 PBS-T로 세척한 후 Gel Doc(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 Western 검출 시약(Elpis Biotech, Daejeon, Korea)을 통해 시각화하였다. 실험에 사용한 항체는 다음과 같다: 항-IL-1β 항체: (Cell signaling technology(CST), USA), 항-IL-6 항체: (Santa Cruz Biotechnology , USA), 항-COX2 항체: (Santa Cruz Biotechnology , USA), 항-Phospho-PI3K 항체: (Cell signaling technology(CST), USA), 항-Phospho-AKT 항체: (Cell signaling technology(CST), USA), 항-Phospho-ERK 항체: (Cell signaling technology(CST), USA), 항-β-Actin 항체: (Santa Cruz Biotechnology , USA). 실험결과, 도 4a 및 도 4b에서 보여지는 바와 같이, LPS를 처리한 경우 Phospho-PI3K, Phospho-AKT, Phospho-ERK, IL-1β, IL-6, COX2의 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 단백질들의 발현수준이 농도 의존적으로 감소하였다.
3. ELISA 분석
MRC-5 세포(lung fibroblast cell)를 12-웰 플레이트에 2 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS (Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 72시간 배양하였다. 세포 배양후 배양액을 4℃ 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 획득한 상등액에 대해 IL-6 Quantikine ELISA Kit (R&D systems) 및 IL-8 Quantikine ELISA kit (R&D systems)을 사용하여 키트 지시서의 사용방법에 따라 ELISA 분석을 수행한 뒤, Microplate reader를 이용하여 흡광도를 450nm 에서 측정하였다. 실험결과, 도 5a 및 도 5b에서 보여지는 바와 같이, LPS를 처리한 경우 IL-6 및 IL-8의 발현 수준이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 IL-6 및 IL-8의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소하였다.
실험예 3 : LPS에 의해 유도된 섬유화(fibrosis) 유전자 발현의 억제
제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 LPS에 의해 유도된 섬유화 유전자들의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다. MRC-5 세포(lung fibroblast cell)를 12-웰 플레이트에 2 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, LPS (Sigma Aldrich) 5μg/ml 처리군(음성 대조군), LPS 5μg/ml 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, LPS 5μg/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 3시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 MRC-5 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 cDNA로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머로 반응 혼합물을 준비한 후 PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용된 프라이머의 염기서열은 아래 표 3에 기재하였다.
유전자 프라이머 서열(5' -> 3') 서열번호
α-SMA F GGTGCTGTCTCTCTATGCCTCTGGA 14
R CCCATCAGGCAACTCGTAACTCTTC 15
Collagen1A1 F CATCACCTACCACTGCAAGAAC 16
R ACGTCGAAGCCGAATTCC 17
GAPDH F GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT 12
R GGA GCC AAA AGG GTC ATC AT 13
실험결과, 도 6에서 보여지는 바와 같이, LPS를 처리한 경우 α-SMA 및 Collagen1A1 유전자의 발현 수준이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 α-SMA 및 Collagen1A1 유전자의 발현 수준이 농도 의존적으로 다시 감소함을 확인하였다.
실험예 4 :TGF-β1에 의해 유도된 섬유화 유전자 발현의 억제
제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 TGF-β1에 의해 유도된 섬유화(fibrosis) 유전자들의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다. MRC-5 세포(lung fibroblast cell)를 12-웰 플레이트에 2 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, TGF-β1 5ng/ml 처리군(음성대조군), TGF-β1 5ng/ml 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, TGF-β1 5ng/ml 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 3시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 MRC-5 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 cDNA로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머로 반응 혼합물을 준비한 후 PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용된 프라이머의 염기서열은 아래 표 4에 기재하였다.
유전자 프라이머 서열(5' -> 3') 서열번호
α-SMA F GGTGCTGTCTCTCTATGCCTCTGGA 14
R CCCATCAGGCAACTCGTAACTCTTC 15
Fibronectin1 F GGATGCTCCTGCTGTCAC 18
R CTGTTTGATCTGGACCTGCAG 19
Collagen1A1 F CATCACCTACCACTGCAAGAAC 16
R ACGTCGAAGCCGAATTCC 17
Tenascin C F CCAGCGACCATCAACGCAGC 20
R GGGGCTTGTTCAGTGGATGCCT 21
GAPDH F GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT 12
R GGA GCC AAA AGG GTC ATC AT 13
실험결과, 도 7에서 보여지는 바와 같이, TGF-β1을 세포에 처리한 경우, α-SMA, Fibronectin1, Collagen1A1, 및 Tenascin C의 유전자의 발현이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해, 유전자들의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다.
실험예 5 :IL-1β에 의해 유도된 염증성 사이토카인 유전자 발현의 억제
제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 억제하는지에 대해서 실험하였다. A549 세포(Human alveolar basal epithelial cell)를 6-웰 플레이트에 3 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군, IL-1β(2ng/ml) 처리군(음성대조군), IL-1β (2ng/ml) 및 제조예 1의 펩타이드(10, 50, 100, 500μM) 처리군, IL-1β (2ng/ml) 및 Dexamethasone (DEX) 10μM 처리군(양성 대조군)에 대해, 활성 물질 및 약물들을 처리하고 3시간 후에 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA는 상기 각군의 A549 세포에서 easy-BLUETMTotal RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR premix (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)로 cDNA 로 변환시켰다. PCR premix(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)와 각 유전자에 대한 프라이머로 반응 혼합물을 준비한 후 PCR machine(Eppendorf, Germany)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이어서, 아가로스 겔 전기영동에 의해 mRNA 발현 패턴을 결정하였다. 실험에 사용한 프라이머의 염기서열은 [표 2]와 같다. 실험결과, 도 8에서 보여지는 바와 같이, IL-1β 처리에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자 발현 수준이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드로 처리할 경우 상기 유전자들의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.
실험예 6 :IL-1β에 의해 유도된 염증성 사이토카인 단백질 발현의 억제
제조예 1에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드가 폐세포에서 IL-1β에 의해 유도된 염증성 사이토카인 단백질의 발현을 억제하는지에 대해 실험하였다. A549 세포(Human alveolar basal epithelial cells)를 12-웰 플레이트에 2 x 105 세포/웰(well)로 시딩(seeding)하여 실험에 사용하였다. 10% FBS를 포함한 배지로 1일간 배양한 후에, FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하여 4시간 동안 기아상태(starvation)를 유도하였다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 정상군(NON), IL-1β (2ng/ml) 처리군(음성대조군, NC), IL-1β (2ng/ml) 및 제조예 1의 펩타이드 (10, 50, 100, 500 μM) 처리군, IL-1β (2ng/ml) 및 Dexamethasone (DEX) (10μM) 처리군(양성대조군)들의 세포들을 상기한 활성물질 및 약물들을 처리하고 72시간 배양하였다. 세포 배양후 배양액을 4℃ 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 획득한 상등액에 대해 IL-6 Quantikine ELISA Kit(R&D systems), IL-8 Quantikine ELISA Kit(R&D systems), IL-1β Quantikine ELISA Kit(R&D systems)을 사용하여 키트 지시서의 사용방법에 따라 ELISA 분석을 수행한 뒤, Microplate reader를 이용하여 흡광도를 450nm 에서 측정하였다. 실험결과, 도 9a, 도 9b 및 도 9c에서 보여지는 바와 같이, IL-1β를 처리한 경우, IL-1β, IL-6, 및 IL-8의 발현 수준이 증가하였으나, 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 IL-1β, IL-6 및 IL-8의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.
실험예 7 : LPS에 의해 유도된 급성 폐염증의 억제
1. 동물 실험
동물 실험에는 BALB/c 마우스 (Female/7W)를 이용하였으며, LPS를 주입하여 급성 폐 염증 모델(acute lung inflammation model)을 확립하였다. 7 주령 BALB/c 암컷 마우스를 5 마리씩 5 그룹으로 아래 [표 5]와 같이 나누어 실험을 수행하였다. 1일차에 G2-G5 그룹에 비강을 통해 LPS(10μg/50μl/mouse)를 투여하였고, LPS 투여 1시간 후에, G3 및 G4 그룹은 제조예 1의 펩타이드(0.5 mg, 1 mg)을 비강투여하였으며, G5 양성대조군은 Dexamethasone (100μg)을 복강투여하였다. 활성물질 및 약물을 투여하고 24 시간 경과 후 마우스를 희생하여 기관지 세척액(Bronchoalveolar Lavage Fluid) 및 폐조직을 얻고, 이를 다음 분석에 사용하였다.
그룹 성별 동물 수
및 번호		 테스트 그룹 LPS 펩타이드
/약물		 Dose
(mg/head)		 Dose amount
(mL/head)
G1 Female 5(1-5) 정상군 - - - -
G2 Female 5(6-10) 음성대조군 + - - -
G3 Female 5(11-15) 실험군 1 + 펩타이드(IN) 0.5mg 0.05 mL
G4 Female 5(16-20) 실험군 2 + 펩타이드(IN) 1mg 0.05 mL
G5 Female 5(21-25) 양성대조군 + DEX(IP) 100μg 0.05 mL
[표 5]에서 펩타이드: 제조예1의 펩타이드, DEX: Dexamethasone, IN: 비강투여(intranasal administration), IP: 복강투여(intraperitoneal administration).
2. 기관지세척액(BALF) 수득 및 세포의 계수
마우스를 마취한 후, 70% 에탄올로 시술 부위를 소독하였다. 이어서, 마우스의 아랫입술에서부터 흉부까지 피부를 절개하였으며, 기도를 열어준 뒤 IV catheter (BD, USA)를 통해 PBS 1ml의 주입 및 회수를 2회 반복하여 기관지세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)를 채취하였다. 채취된 BALF를 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 분리하고, 분리된 세포는 0.5 ml PBS에 재현탁한 뒤, 트립판 블루(trypan blue) 용액과 1:1 비율로 희석하고, hematocytometer를 이용하여 총 세포를 계수하였다. 남은 세포 현탁액에서 10 μl를 이용하여 슬라이드 글라스에 도말(smear) 하였고, different cell count를 위하여 Diff-Quik staining solution (Sysmex, Japan)으로 세포를 염색하였다. 염색이 끝난 후, 현미경을 통해 세포를 관찰 및 계수하였고, 총 세포수 대비 면역세포수를 환산하여 그래프로 나타내었다. 도 10a 및 도 10b에 나타낸 실험결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 호중구(neutrophil)수는 LPS 처리에 의해 증가하였고, 증가된 호중구의 수는 제조예 1의 펩타이드 처리에 의해 농도 의존적 방식으로 유의하게 감소하였다. 대식세포(macrophage)는 LPS 처리에 의해 유의적 증가가 없었으며, 제조예 1의 펩타이드 처리에 의해서도 증가 또는 감소가 없었다.
3. 기관지세척액(BALF)에서 친염증성 단백질의 발현 분석
상기 채취한 BALF에 대해 친염증성 단백질들에 대해 ELISA 분석을 수행하였다. 채취된 BALF를 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액에 대해 TNF-α Quantikine ELISA kit (R&D systems), IL-1β Quantikine ELISA kit (R&D systems), IL-6 Quantikine ELISA kit (R&D systems), Myeloperoxidase(MPO) Quantikine ELISA Kit (R&D systems)를 사용하여 사용 지침서에 따라 분석을 수행한 뒤, Microplate reader를 이용하여 흡광도를 450nm에서 측정하였다. 실험결과, 도 11a 내지 도 11d에서 알 수 있는 바와 같이, LPS 투여에 의해, TNF-α, IL-1β, IL-6, Myeloperoxidase(MPO)의 발현수준이 증가하였고, 증가한 상기 사이토카인의 발현수준이 제조예 1의 펩타이드의 처리에 의해 농도 의존적 방식으로 감소하였다.
4. 폐조직에서의 조직학적 변화 측정
동물실험을 수행한 마우스에서 얻은 폐조직을 상온에서 PBS로 세척한 후에, 4% paraformaldehyde (PBS dilution)으로 고정(fixation)하였다. 고정이 완료된 조직을 PBS로 3회 세척하고, 70% 내지 100%의 농도구배 에탄올 연속물(series)을 사용하여 탈수시켰다. 이어서, 폐조직 샘플을 포매(embedding)하고, 4μm 두께의 박편으로 절단하였다. 슬라이드 글라스에 위치된 4 μm 크기의 박편된 표본을 농도구배된 에탄올 연속물로 탈랍(dewaxing) 및 수화(hydration) 시키고, 차례로 hematoxlin 용액에서 1분, Eosin 용액에서 10초 동안 염색하였다. 염색이 끝나면 차례로 90%, 100% 에탄올에 조직 슬라이드를 담가주었으며, 마지막으로 자일렌(xylene)에 5분간, 2회 담근후에 조직 슬라이드의 마운팅(mounting)을 진행하였다.
폐조직의 H&E 염색을 관찰한 결과는 도 12a에 나타내었다.
도 12b의 그래프는 폐포벽의 두께를 측정한 결과(정상군의 폐포벽 두께를 100%로 하여 나머지 처리군의 두께의 증가정도를 %로 나타냄, 염색한 폐사진에서의 세포의 수를 측정한 결과(정상군의 세포의 수를 100%로 하여 나머지 처리군의 세포의 수의 증가정도를 %로 나타냄), 폐사진에서의 폐포의 수를 측정한 결과(정상군의 폐포의 수를 100%로 하여 나머지 처리군의 폐포의 수의 증가 및 감소를 %로 나타냄)를 각각 나타낸다.
실험예 8 : BLM 유도된 폐섬유증의 억제
1. BLM 유도 폐섬유증 동물 모델
8주령 BALB/c 수컷 마우스를 5 마리씩 4개의 그룹으로 아래 [표 6]와 같이 나누었다. 1 일차에 구강 인두를 통한 Bleomycin 용액(10ng/50μl/mouse)을투여하여 BLM 유도를 1회 진행한 후, 7일차 부터, 주 3회 14 일간 제조예 1의 펩타이드(1 mg/mouse)을 비강투여하였으며, 양성대조군인 Pirfeninone (2mg/mouse)는 주 3회 14일간 경구 투여하였다. BLM 유도 21일차에 마우스를 희생하여 기관지 세척액 및 폐조직을 얻고, 이를 다음 분석에 사용하였다.
그룹 성별 동물의 수
및 번호		 테스트 그룹 BLM 펩타이드
/약물		 Dose
(mg/head)		 Dose amount
(mL/head)
G1 Male 5 (1-5) 정상군 - - - -
G2 Male 5 (6-10) 음성대조군 + - - -
G3 Male 5 (11-15) 실험군 + 펩타이드(IN) 1 mg 0.05 mL
G4 Male 5 (16-20) 양성대조군 + Pirfeninone (Oral) 2 mg 0.1 mL
상기 [표 6]에서 펩타이드: 제조예1의 펩타이드, IN: 비강투여(intranasal administration), Oral : 경구투여.
2. 체중 변화
실험을 수행한 마우스의 체중을 측정한 결과를 도 13a에 나타내었다. BLM 유도 폐섬유화 마우스에서 체중이 감소하였으며, 제조예 1의 펩타이드를 투여한 경우 감소되었던 체중이 다시 회복되었다.
3. 기관지세척액(BALF) 수득 및 세포의 계수
실험을 수행한 마우스를 마취한 후, 70% 에탄올로 시술 부위를 소독하였다. 이어서, 마우스의 아랫입술에서부터 흉부까지 피부를 절개하였으며, 기도를 열어준 뒤 IV catheter (BD, USA)를 통해 PBS 1ml의 주입 및 회수를 2회 반복하여 기관지세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)를 채취하였다. 채취된 BALF를 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 분리하고, 분리된 세포는 0.5 ml PBS에 재현탁한 뒤, 트립판 블루(trypan blue) 용액과 1:1 비율로 희석하고, hematocytometer를 이용하여 총 세포를 계수하였다. 남은 세포 현탁액에서 10 μl를 이용하여 슬라이드 글라스에 도말(smear)하였고, different cell count를 위하여 Diff-Quik staining solution (Sysmex, Japan)으로 세포를 염색하였다. 염색이 끝난 후, 현미경을 통해 세포를 관찰 및 계수하였고, 총 세포수 대비 면역세포수를 환산하여 그래프로 나타내었다. 도 13b에 나타낸 실험결과에서 알 수 있는 바와 같이, 대식세포(macrophage) 및 림프구(lymphocyte)의 수는 BLM 처리에 의해 증가하였고, 증가된 대식세포 및 림프구의 수는 제조예 1의 펩타이드 처리에 의해 감소하였다. 도 13c 및 도 13d에는 세포들을 현미경으로 관찰한 결과 및 총 세포수를 측정한 결과를 나타내었다.
4. 폐조직에서의 조직학적 변화 측정- H&E 염색
동물실험을 수행한 마우스에서 얻은 폐조직을 상온에서 PBS로 세척한 후에, 4% paraformaldehyde (PBS dilution)으로 고정(fixation)하였다. 고정이 완료된 조직을 PBS로 3회 세척하고, 70% 내지 100%의 농도구배 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수시켰다. 이어서, 폐조직 샘플을 포매(embedding)하고, 4μm 두께의 박편으로 절단하였다. 슬라이드 글라스에 위치된 4 μm 크기의 박편된 표본을 농도 구배된 에탄올 시리즈로 탈랍(dewaxing) 및 수화(hydration)시키고, 차례로 hematoxlin 용액에서 1분 및 Eosin 용액에서 10초 동안 염색하였다. 염색이 끝나면 차례로 90%, 100% 에탄올에 조직 슬라이드를 담가주었으며, 마지막으로 자일렌(xylene)에 5분간, 2회 담근후에 조직 슬라이드의 마운팅(mounting)을 진행하였다.
도 14a에는 폐조직의 H&E 염색을 관찰한 결과를 나타내었다.
도 14b에는 염색한 폐 조직사진에서 각처리 군의 폐포의 수를 측정한 결과, 염색한 폐 조직 사진에서 총 세포의 수를 측정한 결과(정상군의 총 세포의 수를 100%로 하여 나머지 처리군의 총세포 수의 증가정도를 %로 타나냄), 염색한 폐 조직 사진에서 각 처리군의 폐포벽의 두께를 측정한 결과(정상군의 폐포벽 두께를 100%로 하여 나머지 처리군의 두께의 증가정도를 %로 나타냄)을 각각 보여준다.
5. 폐조직에서의 조직학적 변화 측정- Masson's Trichrome 염색
동물실험을 수행한 마우스에서 얻은 폐조직을 상온에서 PBS로 세척한 후에, 4% paraformaldehyde (PBS dilution)으로 고정(fixation)하였다. 고정이 완료된 조직을 PBS로 3회 세척하고, 70% 내지 100%의 농도구배 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수시켰다. 이어서, 폐조직 샘플을 포매(embedding)하고, 4μm 두께의 박편으로 절단하였다. 슬라이드 글라스에 위치된 4 μm 크기의 박편된 표본을 농도 구배된 에탄올 시리즈로 탈랍(dewaxing) 및 수화(hydration) 시켰다. Weigert's iron hematoxlin, Biebrich scarlet-acid fuchsin solution, Phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution, 및 아닐린블루 용액(aniline blue solution)에서 각각 10분씩 염색을 수행하였다. 염색 완료후, 1% 아세트산 용액에 2분간 조직 슬라이드를 담근 후 D.W로 세척하였다. 차례로 95%, 100% 에탄올에 조직 슬라이드를 담가주었으며, 마지막으로 자일렌(xylene)에 5분간, 2회 담근 후 조직 슬라이드의 마운팅(mounting)을 진행하였다. 도 15a는 Trichrome 염색법을 이용하여 콜라겐을 염색한 결과이다. 도 15b는 정상군의 콜라겐의 양을 100% 로 하여 나머지 처리군의 콜라겐의 양의 변화를 %로 나타내었다. BLM 처리에 의해 유도된 폐의 섬유화 정도를 콜라겐의 양의 변화를 통해서 확인한 결과, 제조예 1의 펩타이드 처리시 폐 조직내의 콜라겐 침착 정도가 뚜렷하게 감소하는 것을 확인하였다.
제조예 2: 약학적 조성물의 제조
2-1. 산제의 제조
본 발명의 펩타이드 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2-2. 정제의 제조
본 발명의 펩타이드 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
2-3. 캡슐제의 제조
본 발명의 펩타이드 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
2-4. 환의 제조
본 발명의 펩타이드 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4g이 되도록 제조하였다.
2-5. 과립의 제조
본 발명의 펩타이드 150 mg
대두추출물 50 mg
포도당 200 mg
전분 600 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 mg을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
제조예 3: 기능성 식품 조성물의 제조
3-1. 건강식품의 제조
본 발명의 펩타이드 500 μg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 mg
비타민 E 1.0mg
비타민 D 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2mg
비타민 C 10mg
비오틴 10mg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50mg
판토텐산 칼슘 0.5mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
3-2. 건강음료의 제조
본 발명의 펩타이드 500 μg
구연산 1000mg
올리고당 100g
매실농축액 2g
타우린 1g
정제수를 가하여 전체 900ml
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시할 수 있다.
상기에서는 본 출원의 대표적인 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 출원의 범위는 상기와 같은 특정 실시예만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 출원의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 폐 염증성 질환은 천식, 알러지성 천식, 기관지염, 만성 기관지염, 급성 기관지염, 세기관지염, 미만성 범세기관지염, 기관지 확장증, 흉막염, 폐포염, 혈관염, 폐렴, 과민성 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 급성 호흡곤란 증후군, 급성 폐손상, 연기 흡입 폐손상, 및 열에 의한 폐손상으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환인 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 폡타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 염증성 사이토카인 유전자, 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질의 발현을 억제하는 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인 유전자는 TNF α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 COX-2 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인 단백질 또는 염증성 사이토카인 신호전달에 관련된 단백질은 IL-1β, IL-6, COX2, IL-8, p-JNK, p-ERK, p-PI3K, p-AKT, p-ERK, 및 Myeloperoxidase으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 폡타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 세포에서 섬유화 유전자의 발현을 억제하는 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 섬유화 유전자는 α-SMA, Collagen1A1, Fibronectin1, 및 Tenascin C유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 폡타이드는 염증 반응이 유도되는 폐 조직에서 호중구의 수를 감소시키는 것인, 폐 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 염증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물.
  10. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증의 개선 또는 예방용 기능성 식품 조성물.
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