WO2023195367A1 - シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置、及び、プログラム - Google Patents

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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria, an apparatus for determining outer membrane detachment of cyanobacteria, and a program.
  • Photosynthetic microorganisms such as cyanobacteria and algae are attracting attention as tools for realizing next-generation material production systems with low environmental impact. Substance production by photosynthetic microorganisms is carried out in an environment of normal temperature and pressure, using water and carbon dioxide (CO 2 ) in the air with light as an energy source. Furthermore, with the recent development of genetic engineering technology, it has become possible to produce a wide range of chemical compounds using genetically modified photosynthetic microorganisms.Therefore, substance production using photosynthetic microorganisms is expected to be a next-generation technology that can achieve carbon neutrality. has been done.
  • Patent Document 1 a technology for improving protein productivity using a genetically modified strain of cyanobacteria in which the outer membrane is peeled from the cell wall (Patent Document 1) is extremely important for material production by photosynthetic microorganisms.
  • Patent Document 1 it is necessary to determine whether or not the outer membrane of cyanobacteria is detached from the cell wall, for example, by observing cells with an electron microscope or using complicated biochemical analysis techniques. Because of this, it is time-consuming.
  • the present disclosure provides a method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria, an apparatus for determining outer membrane detachment of cyanobacteria, and a program that can easily determine whether or not the outer membrane has detached from the cell wall. .
  • a method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria includes a measurement step of measuring fluorescence during irradiation of excitation light to a culture supernatant of cyanobacteria, and based on the wavelength range of the measured fluorescence, The method includes a determining step of determining whether the outer membrane of the cyanobacterium has peeled off from the cell wall.
  • the program according to one aspect of the present disclosure determines whether the outer membrane of the cyanobacteria has peeled off from the cell wall, based on the wavelength range of fluorescence measured when the culture supernatant of the cyanobacteria is irradiated with excitation light. This is a program that causes a computer to execute a method for determining.
  • the computer-readable recording medium includes, for example, a non-volatile recording medium such as a CD-ROM (Compact Disc-Read Only Memory).
  • FIG. 1 is a block diagram showing an example of the functional configuration of a cyanobacterial outer membrane exfoliation determination apparatus according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart illustrating an example of the flow of the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria according to the embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of fluorescence measurement of the culture supernatant of the adventitial membrane detachment strain.
  • FIG. 4 is a diagram showing the combination of the wavelength of excitation light irradiated onto the culture supernatant and the fluorescence of the measured wavelength.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of fluorescence measurement of the culture supernatant of the wild-type strain.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of fluorescence measurement of the culture supernatant of the outer membrane detachment strain and the culture supernatant of the wild strain.
  • Cyanobacteria also called cyanobacteria or blue-green algae
  • Cyanobacteria are a group of eubacteria that decompose water through photosynthesis to produce oxygen, and use the energy obtained to fix CO2 in the air.
  • cyanobacteria can also fix nitrogen (N 2 ) in the air.
  • N 2 nitrogen
  • cyanobacteria are known to grow quickly and have high light utilization efficiency, and in addition, they are easier to genetically manipulate than other algae species. Active research and development is underway.
  • examples of substance production by cyanobacteria include sucrose (Non-Patent Document 1), isobutanol (Non-Patent Document 2), fatty acids (Non-Patent Document 3), The production of amino acids (Non-Patent Document 4) and the like has also been reported.
  • Non-Patent Document 1 discloses that a genetically modified strain of Synechococcus elongatus in which genes involved in the sucrose biosynthesis pathway have been modified has improved sucrose productivity compared to the wild strain.
  • Non-Patent Document 2 describes the production of isobutanol using a genetically modified strain that overexpresses ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxidase (Rubisco), which was created by genetically engineering Synechococcus elongatus PCC7942. It has been disclosed that the sex of the strain was improved over that of the wild strain.
  • Rubisco ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxidase
  • Non-Patent Document 3 discloses that a genetically modified strain of Synechocystis sp. PCC6803 in which an acyl-acyl transport protein thioesterase gene has been introduced has improved fatty acid productivity compared to the wild strain.
  • Non-Patent Document 4 describes that the tryptophan productivity of a tryptophan overproducing strain isolated by subjecting the wild strain of Synechocystis sp. PCC 6803 to random mutagenesis and selection using amino acids itself It has been disclosed that this has been improved.
  • Non-Patent Document 5 the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii, a type of algae, was genetically engineered to produce a chimeric protein consisting of a 25 kDa Plasmodium falciparum surface protein (Pfs25) fused to the ⁇ subunit of cholera toxin (CtxB). It has been disclosed that genetically modified algae in which (CtxB-Pfs25) is produced intracellularly can be used as an oral vaccine for malaria.
  • Pfs25 Plasmodium falciparum surface protein fused to the ⁇ subunit of cholera toxin
  • the target substance is produced within the cells of the genetically modified strain of photosynthetic microorganisms, it is not secreted outside the cells and accumulates, or it is difficult to secrete outside the cells, so the cells are crushed. It is necessary to collect the desired substance by using the same method, which takes time and effort to produce the substance. Furthermore, since various substances exist within cells, it may be necessary to remove these substances and purify the target substance, which lowers the recovery rate of the target substance. Furthermore, each time a target substance is produced, it is necessary to prepare a new genetically modified strain, which is time-consuming and increases production costs. As described above, in the conventional techniques described above, the production efficiency of substances by photosynthetic microorganisms is still at a low level, and there is a desire to develop a technique with higher production efficiency.
  • the structure of the cell wall and cell membrane of cyanobacteria has low permeability to substances produced within the cell, and it is not easy to artificially modify the structure of the cell membrane and cell wall to improve the ability to secrete and produce substances.
  • substances with large molecular weights such as proteins (also referred to as high molecular weight compounds) are difficult to secrete outside cells, unlike substances with relatively small molecular weights such as amino acids (also referred to as low molecular weight compounds).
  • Non-Patent Document 6 Hikaru Kobata, Studies on molecular basis of cyanobacterial outer membrane function and its evolutionary relationship with primitive chloroplasts, PhD thesis, [Online], 2018.03.27, Internet: ⁇ URL: http://hdl .handle.net/10097/00122689>
  • Non-Patent Document 7 Seiji Kojima, Elucidation and application of membrane stabilization and substance permeation mechanisms derived from bacteria that function in the chloroplast surface membrane, Grants-in-Aid for Scientific Research, [Online] , 2018.04.23, Internet: ⁇ URL: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18H02117>).
  • Patent Document 1 describes a modified cyanobacterium in which the function of a protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall of cyanobacteria (hereinafter also referred to as binding-related protein) is suppressed or lost, and A method for producing proteins using modified cyanobacteria is disclosed.
  • the outer membrane of the cyanobacterium is peeled off from the cell wall while maintaining the ability to proliferate the cell, so by culturing the cell, the modified cyanobacterium can be produced intracellularly. The resulting protein is secreted to the outside of the cell, allowing for efficient protein production.
  • the present inventor developed a method for easily determining whether the outer membrane has peeled off from the cell wall as an evaluation index for determining whether the state of cyanobacterial cells is suitable for efficient substance production.
  • the present disclosure it is possible to easily determine whether the outer membrane of cyanobacteria has peeled off from the cell wall, based on the fluorescence measurement results of the culture supernatant of cyanobacteria. Therefore, according to the present disclosure, it is possible to determine whether or not the cyanobacteria are suitable for substance production by determining whether the outer membrane of the cyanobacteria has peeled off from the cell wall. can contribute to improving the productivity of materials.
  • a method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria includes a measurement step of measuring fluorescence during irradiation of excitation light to a culture supernatant of cyanobacteria, and based on the wavelength range of the measured fluorescence, The method includes a determining step of determining whether the outer membrane of the cyanobacterium has peeled off from the cell wall.
  • the fluorescence is measured when the culture supernatant is irradiated with the excitation light in a predetermined wavelength range;
  • the determination step it may be determined that the outer membrane of the cyanobacteria has peeled off from the cell wall when the fluorescence is measured in a wavelength range corresponding to the predetermined wavelength range.
  • the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria is to irradiate excitation light in a predetermined wavelength range and determine whether or not fluorescence in the wavelength range corresponding to the wavelength range is measured. It can be determined whether the outer membrane has peeled off from the cell wall. Therefore, the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria can more simply and accurately determine outer membrane detachment of cyanobacteria.
  • the predetermined wavelength range of the excitation light is 620 nm ⁇ 10 nm;
  • the wavelength range of the fluorescence corresponding to may be 645 nm ⁇ 10 nm.
  • the method for determining the detachment of the outer membrane of cyanobacteria is to irradiate excitation light in a predetermined wavelength range and measure the fluorescence in the wavelength range corresponding to the wavelength range. If it is determined that the cyanobacterium has peeled off and no fluorescence is measured, it can be determined that the outer membrane of the cyanobacteria has not peeled off. Therefore, the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria can more simply and accurately determine outer membrane detachment of cyanobacteria.
  • the fluorescence is measured when the culture supernatant is irradiated with the excitation light in a predetermined wavelength range;
  • the determination step it may be determined that the outer membrane of the cyanobacterium has peeled off from the cell wall when the intensity of the fluorescence in a wavelength range corresponding to the predetermined wavelength range is equal to or higher than a threshold value.
  • the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria is to irradiate excitation light in a predetermined wavelength range, and if the intensity of fluorescence in the wavelength range corresponding to the wavelength range is greater than or equal to a threshold value, cyanobacteria are detected.
  • the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria can more simply and accurately determine outer membrane detachment of cyanobacteria.
  • the predetermined wavelength range of the excitation light and the predetermined wavelength range of the excitation light are used. If the combination with the corresponding wavelength range of the fluorescence is at least one of the following (1) to (3), it may be determined that the outer membrane of the cyanobacterium has detached from the cell wall. .
  • the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria is to irradiate excitation light in a predetermined wavelength range, and if the intensity of fluorescence in the wavelength range corresponding to the wavelength range is greater than or equal to a threshold value, cyanobacteria are detected.
  • the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria can more simply and accurately determine outer membrane detachment of cyanobacteria.
  • the cyanobacterial outer membrane detachment determination device can easily determine whether the cyanobacterial outer membrane has detached from the cell wall based on the fluorescence measurement results of the cyanobacterial culture supernatant. . Therefore, the cyanobacterial outer membrane detachment determination device can determine whether the cyanobacterium is suitable for material production by determining whether the outer membrane of the cyanobacterium has detached from the cell wall. Therefore, it can contribute to improving the productivity of substances by cyanobacteria.
  • the program causes the computer to determine whether or not the outer membrane of the cyanobacteria has detached from the cell wall, based on the fluorescence measurement results of the cyanobacteria culture supernatant. Peeling can be easily determined.
  • each figure is not necessarily strictly illustrated.
  • substantially the same components are denoted by the same reference numerals, and overlapping explanations may be omitted or simplified.
  • the numerical range does not represent only a strict meaning, but includes a substantially equivalent range, for example, measuring the amount of protein (for example, number or concentration, etc.) or the range thereof.
  • both a bacterial body and a cell represent one individual cyanobacterium.
  • FIG. 1 is a block diagram showing an example of the functional configuration of a cyanobacterial outer membrane exfoliation determination apparatus according to the present embodiment.
  • the determination device 100 includes, for example, a measurement section 110, a control section 120, a storage section 130, an input reception section 140, and a display section 150.
  • the control unit 120 includes, for example, a determination unit 122.
  • the measurement unit 110 is, for example, a fluorescence spectrophotometer.
  • the specific configuration of the measurement unit 110 is similar to that of a general fluorescence spectrophotometer.
  • the measurement unit 110 measures fluorescence by irradiating excitation light onto a culture solution of cyanobacteria introduced into a measurement cell.
  • the measurement cell may be, for example, a spectroscopic cell or a flow cell. These cells may be made of quartz or acrylic, but quartz is more preferable.
  • the flow cell may be connected, for example, through piping to a culture tank in which cyanobacteria are cultured.
  • the piping may be connected to the culture tank via the dilution section and the liquid feeding section. After the start of the main culture, the culture supernatant may be sampled at predetermined intervals (for example, on a daily basis) and subjected to measurement. Sampling may be performed manually by a user or may be performed automatically.
  • the measurement unit 110 includes, for example, a control unit that controls the operation of the measurement unit 110, and the control unit controls the measurement unit 110 according to a control signal output from the control unit 120 of the determination device 100.
  • control the behavior of the measurement unit 110 includes the measurement unit 110, but may not include the measurement unit 110.
  • the measurement unit 110 is a measurement device, and the determination device 100 is connected to the measurement device via communication.
  • the control unit 120 performs information processing to control the operation of the determination device 100.
  • the control unit 120 is implemented, for example, by a microcomputer, but may also be implemented by a processor or a dedicated circuit.
  • the control unit 120 includes a determination unit 122.
  • the determination unit 122 is realized by a processor executing a program for performing the above information processing.
  • the determining unit 122 determines whether the outer membrane of the cyanobacteria has peeled off from the cell wall, based on the wavelength range of the fluorescence measured by the measuring unit 110.
  • the input accepting unit 140 accepts user operation input.
  • the input reception unit 140 is realized by a mouse, a microphone, a touch panel, or the like.
  • the display unit 150 is a display device that displays information to be presented to the user based on the control of the control unit 120.
  • the display unit 150 is realized by a liquid crystal panel or an organic EL (Electro Luminescence) panel.
  • FIG. 2 is a flowchart illustrating an example of the flow of the method for determining outer membrane detachment of cyanobacteria according to the embodiment.
  • the determination method is implemented by the determination device 100.
  • the measurement unit 110 of the determination device 100 measures fluorescence by irradiating excitation light onto the culture supernatant of cyanobacteria introduced into a measurement cell (S01). More specifically, in step S01, for example, the measurement unit 110 irradiates the culture supernatant with excitation light in a predetermined wavelength range and measures fluorescence.
  • the measurement unit 110 may irradiate the culture supernatant with excitation light in one predetermined wavelength range, or sequentially irradiate the culture supernatant with excitation light in two or more predetermined wavelength ranges. Good too.
  • the determination unit 122 of the determination device 100 determines whether the outer membrane of the cyanobacteria has peeled off from the cell wall, based on the wavelength range of the fluorescence measured by the measurement unit 110 (S02).
  • the determining unit 122 may determine that the outer membrane of the cyanobacteria has peeled off from the cell wall when fluorescence is measured in a wavelength range corresponding to a predetermined wavelength range.
  • the predetermined wavelength of the excitation light is 620 nm ⁇ 10 nm
  • the wavelength range of fluorescence corresponding to the predetermined wavelength range of the excitation light is 645 nm ⁇ 10 nm.
  • excitation light with a wavelength of 620 nm ⁇ 10 nm is irradiated to the culture supernatant of cyanobacteria whose outer membrane has not peeled off from the cell wall
  • excitation light in the wavelength range corresponding to the wavelength range for example, 645 nm ⁇ 10 nm
  • the wavelength range corresponding to the wavelength range is measured.
  • the determining unit 122 determines that the outer membrane of the cyanobacteria has peeled off from the cell wall when the intensity of fluorescence in a wavelength range corresponding to a predetermined wavelength range is equal to or higher than a threshold value. You may. In this case, the determining unit 122 determines that the combination of the predetermined wavelength range of the excitation light and the wavelength range of the fluorescence corresponding to the predetermined wavelength range of the excitation light is one of the following (1) to (3). If there is at least one, it may be determined that the outer membrane of the cyanobacterium has peeled off from the cell wall.
  • Excitation light wavelength range 280nm ⁇ 10nm, fluorescence wavelength range: 335nm ⁇ 10nm (2) Excitation light wavelength range: 275nm ⁇ 10nm, fluorescence wavelength range: 450nm ⁇ 10nm (3) Excitation light wavelength range: 360nm ⁇ 10nm, fluorescence wavelength range: 455nm ⁇ 10nm
  • the excitation light corresponds to the wavelength range in question. Fluorescence in each wavelength range is measured, but the intensity of the fluorescence is below the threshold.
  • the culture supernatant of cyanobacteria of the outer membrane-exfoliating type in which the outer membrane of cyanobacteria is detached from the cell wall, is irradiated with excitation light in at least one wavelength range of (1) to (3) above
  • Fluorescence in a wavelength range corresponding to the wavelength range is measured.
  • the intensity of the fluorescence in at least one of the above (1) to (3) is equal to or higher than the threshold value, it is determined that the outer membrane of the cyanobacterium has peeled off from the cell wall.
  • the threshold value may be a common threshold value for fluorescence in all the wavelength ranges of (1) to (3) above, or may be set for each fluorescence in each wavelength range.
  • Cyanobacteria also called blue-green algae or cyanobacteria, are a group of prokaryotes that perform photosynthesis while collecting light energy with chlorophyll and electrolyzing water to generate oxygen. Cyanobacteria are highly diverse, and include, for example, unicellular species such as Synechocystis sp. PCC 6803 and filamentous multicellular species such as Anabaena sp. PCC 7120.
  • thermophilic species such as Thermosynechococcus elongatus
  • marine species such as Synechococcus elongatus
  • freshwater species such as Synechocystis.
  • species such as Microcystis aeruginosa, which has gas vesicles and produces toxins
  • Gloeobacter violaceus which does not have thylakoid but has a protein called phycobilisome, which is a light-harvesting antenna on its plasma membrane, have unique characteristics.
  • phycobilisome which is a light-harvesting antenna on its plasma membrane
  • the cell surface layer of cyanobacteria is composed of, in order from the inside, a plasma membrane (also called an inner membrane), peptidoglycan, and an outer membrane, which is a lipid membrane that forms the outermost layer of the cell.
  • Peptidoglycan is composed of glucosamine and mannosamine.
  • Sugar chains are covalently bonded, and pyruvate is bound to these covalently bonded sugar chains.
  • peptidoglycan and covalently bonded sugar chains are collectively referred to as a cell wall.
  • SLH domain-retaining outer membrane proteins consist of a C-terminal region embedded in a lipid membrane (also called outer membrane) and an N-terminal SLH domain that protrudes from the lipid membrane. It is widely distributed among bacteria belonging to the class Negativicutes, which is a group of negative bacteria.
  • the region embedded in the lipid membrane ie, the outer membrane
  • the covalent sugar chains in peptidoglycan must be modified with pyruvate.
  • genes encoding SLH domain-retaining outer membrane proteins include slr1841 or slr1908 held by Synechocystis sp. PCC 6803, or oprB held by Anabaena sp. 90.
  • cell wall-pyruvate modification enzyme The enzyme that catalyzes the pyruvate modification reaction of covalent sugar chains in peptidoglycan (hereinafter referred to as cell wall-pyruvate modification enzyme) was identified in the Gram-positive bacterium Bacillus anthracis and named CsaB.
  • CsaB Gram-positive bacterium Bacillus anthracis
  • cyanobacteria whose genome sequences have been published, many species possess genes encoding homologous proteins with amino acid sequence identity of 30% or more with CsaB. Examples include slr0688 held by Synechocystis sp. PCC 6803 or synpcc7502_03092 held by Synechococcus sp. 7502.
  • cyanobacteria CO2 fixed through photosynthesis is converted into various amino acids through multi-step enzymatic reactions. Using these as raw materials, proteins are synthesized within the cytoplasm of cyanobacteria. Some of these proteins function within the cytoplasm, while others are transported from the cytoplasm to the periplasm and function within the periplasm. However, no case of active secretion of proteins outside the cell has been reported in cyanobacteria to date.
  • cyanobacteria Because cyanobacteria have a high photosynthetic ability, they do not necessarily need to take in organic matter from the outside as nutrients. Therefore, cyanobacteria have very few channel proteins in their outer membranes that allow organic substances to pass through, such as organic channel proteins (eg, Slr1270). For example, in Synechocystis sp. PCC 6803, organic channel proteins that allow organic substances to pass through account for only about 4% of the total protein content of the outer membrane. On the other hand, cyanobacteria produce ion channel proteins that allow inorganic ions to pass through, such as SLH domain-retaining outer membrane proteins (e.g., Slr1841), in order to take in inorganic ions necessary for growth into cells with high efficiency. It is abundant in the adventitia. For example, in Synechocystis sp. PCC 6803, ion channel proteins that permeate inorganic ions account for approximately 80% of the total protein content of the
  • Cyanobacteria whose outer membrane has been detached from the cell wall are, for example, cyanobacteria whose outer membrane has been temporarily detached from the cell wall due to drugs or external force (e.g., pressure or temperature).
  • it may be a modified cyanobacterium that has been genetically modified so that its outer membrane is detached from the cell wall.
  • the modified cyanobacteria means that the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria (so-called binding-related proteins) is 30% of the total amount of the proteins in the parent strain (so-called parent cyanobacteria).
  • Non-Patent Document 6 and Non-Patent Document 7 describe that when the slr1841 gene or slr0688 gene, which is a gene encoding a binding-related protein, is deleted, the ability of cells to proliferate is lost. has been done.
  • the modified cyanobacteria of the present disclosure suppresses the expression of genes encoding binding-related proteins, the ability of cells to proliferate is not impaired.
  • the modified cyanobacteria produced in this way have a partial reduction in the bond between the outer membrane and the cell wall (e.g., binding amount and strength), and the outer membrane is partially separated from the cell wall. This makes it easier to get rid of.
  • modified cyanobacteria do not require extraction operations for intracellularly produced substances, such as crushing the bacterial cells, so that the physiological activity and yield of the intracellularly produced substances are less likely to decrease. Furthermore, since the cell growth function of the modified cyanobacteria is not impaired, it is possible to repeatedly use the modified cyanobacteria even after recovering the substances secreted outside the microbial cells.
  • the following describes a cyanobacterium whose outer membrane has been modified so that its outer membrane partially detaches from the cell wall by suppressing the functions of at least one binding-related protein of an SLH domain-retaining outer membrane protein and a cell wall-pyruvate modifying enzyme. explain.
  • the parent cyanobacteria may be of the genus Synechocystis, Synechococcus, Anabaena, or Thermosynechococcus, among them Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus sp. PCC 7942, or Thermosynechococcus elongatus BP-1. Good too.
  • the parent strain may be a wild type of cyanobacteria, as long as it has not yet suppressed the total amount of binding-related proteins to 30% or more and 70% or less, or it may be a modified strain that is equivalent to the wild type. binding-related proteins.
  • Amino acid sequences of SLH domain-retaining outer membrane proteins and enzymes that catalyze the cell wall-pyruvate modification reaction (so-called cell wall-pyruvate modification enzymes) in these parent cyanobacteria, and base sequences of genes encoding their binding-related proteins.
  • cell wall-pyruvate modification enzymes in these parent cyanobacteria
  • base sequences of genes encoding their binding-related proteins. and the location of the gene on the chromosomal DNA or plasmid can be found in the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) and Cyanobase (http:/ /genome.microbedb.jp/cyanobase/).
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein and the cell wall-pyruvic acid modifying enzyme whose functions are suppressed in the modified cyanobacteria according to the present embodiment may be from any parent cyanobacterium as long as the parent cyanobacteria possesses them. They are not limited by the location of the genes encoding them (for example, on chromosomal DNA or on plasmids).
  • the parent cyanobacteria When the parent cyanobacteria is of the genus Cyanothece, it may be A0A3B8XX12_9CYAN, etc. If the parent cyanobacteria belongs to the genus Leptolyngbya, it may be A0A1Q8ZE23_9CYAN, etc. If the parent cyanobacterium belongs to the genus Calothrix, it may be A0A1Z4R6U0_9CYAN, and if the parent cyanobacterium belongs to the genus Nostoc, it may be A0A1C0VG86_9NOSO, etc.
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Crocosphaera, it may be B1WRN6_CROS5, and when the parent cyanobacterium belongs to the genus Pleurocapsa, it may be K9TAE4_9CYAN.
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein may be, for example, Slr1841 of Synechocystis sp. PCC 6803, NIES970_09470 of Synechococcus sp. NIES-970, or Anacy_3458 of Anabaena cylindrica PCC 7122.
  • the protein may be a protein having an amino acid sequence that is 50% or more identical to these SLH domain-retaining outer membrane proteins.
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein whose function is suppressed is, for example, one having an amino acid sequence of 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more of the above-mentioned SLH domain-retaining outer membrane protein. % or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and has the function of binding to covalent sugar chains of the cell wall. It may be a protein or a polypeptide.
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme may be Slr0688 etc. when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechocystis, and when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechococcus, it may be Syn7502_03092 or Synpcc7942_1529, etc. If the bacterium is of the genus Anabaena, it may be ANA_C20348 or Anacy_1623, etc. If the parent cyanobacterium is of the genus Microcystis, it may be CsaB (NCBI access ID: TRU80220), etc.
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Crocosphaera, it may be CsaB (NCBI access ID: WP_012361697.1), etc. If the parent cyanobacterium belongs to the genus Pleurocapsa, it may be CsaB (NCBI access ID: WP_036798735), etc. good.
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme may be, for example, Slr0688 of Synechocystis sp. PCC 6803, Synpcc7942_1529 of Synechococcus sp. PCC 7942, or Anacy_1623 of Anabaena cylindrica PCC 7122.
  • the protein may be a protein whose amino acid sequence is 50% or more identical to these cell wall-pyruvate modifying enzymes.
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme whose function is suppressed is, for example, one having an amino acid sequence of any of the above-mentioned cell wall-pyruvate modifying enzymes, and 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more. , more preferably consists of an amino acid sequence having an identity of 70% or more, even more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and modifies the covalent sugar chain of peptidoglycan of the cell wall with pyruvate. It may be a protein or polypeptide that has the function of catalyzing a reaction.
  • the means for suppressing the functions of these proteins is not particularly limited as long as it is a means normally used for suppressing the functions of proteins.
  • the means include, for example, deleting or inactivating the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein and the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme, inhibiting the transcription of these genes, and inhibiting the transcription of these genes.
  • the method may include inhibiting the translation of gene transcripts or administering an inhibitor that specifically inhibits these proteins.
  • the modified cyanobacteria may have a gene that expresses a protein involved in binding the outer membrane and the cell wall (so-called binding-related protein) deleted or inactivated.
  • binding-related protein a protein involved in binding the outer membrane and the cell wall
  • the expression of proteins involved in the binding between the cell wall and the outer membrane is suppressed, or the function of the protein is suppressed, so that the binding between the cell wall and the outer membrane (so-called binding) is suppressed. amount and binding strength) are partially reduced.
  • the outer membrane tends to partially detach from the cell wall.
  • a gene encoding an SLH domain-retaining outer membrane protein and a cell wall-pyruvate modifying enzyme for example, a gene encoding an SLH domain-retaining outer membrane protein and a cell wall-pyruvate modifying enzyme.
  • the transcription of at least one of the genes may be suppressed.
  • the parent cyanobacteria When the parent cyanobacteria is of the genus Cyanothece, it may be A0A3B8XX12_9CYAN, etc. If the parent cyanobacteria belongs to the genus Leptolyngbya, it may be A0A1Q8ZE23_9CYAN, etc. If the parent cyanobacterium belongs to the genus Calothrix, it may be A0A1Z4R6U0_9CYAN, and if the parent cyanobacterium belongs to the genus Nostoc, it may be A0A1C0VG86_9NOSO, etc.
  • the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is slr1841 of Synechocystis sp. PCC 6803, nies970_09470 of Synechococcus sp. NIES-970, anacy_3458 of Anabaena cylindrica PCC 7122, or these genes.
  • the genes may have 50% or more identical base sequences.
  • the amino acid sequences of a protein are 30% or more identical, it is said that the protein is likely to have the same function as the protein. Therefore, if the base sequences of genes encoding proteins are 30% or more identical, it is considered that there is a high possibility that a protein having the same function as the protein will be expressed.
  • the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein whose function is suppressed is, for example, one of the base sequences of the above-mentioned genes encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein and 40% or more, preferably A gene consisting of a base sequence having an identity of 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, and even more preferably 90% or more, and that share a cell wall. It may be a gene encoding a protein or polypeptide that has the function of binding to a conjugated sugar chain.
  • the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme may be slr0688, etc. when the parent cyanobacterium is of the genus Synechocystis, or may be syn7502_03092 or synpcc7942_1529, etc. when the parent cyanobacterium is of the genus Synechococcus.
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Anabaena, it may be ana_C20348 or anacy_1623, and if the parent cyanobacterium belongs to the genus Microcystis, it may be csaB (NCBI access ID: TRU80220), etc.
  • Cynahothece genus In the case of the Cynahothece genus, it may be csaB (NCBI access ID: WP_107667006.1), etc., and when the parent cyanobacteria is Spirulina genus, it may be csaB (NCBI access ID: WP_026079530.1), etc. If the parent cyanobacteria belongs to the genus Calothrix, it may be csaB (NCBI access ID: WP_096658142.1), etc. If the parent cyanobacterium belongs to the genus Nostoc, it may be csaB (NCBI access ID: WP_099068528.1), etc.
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Crocosphaera, it may be csaB (NCBI access ID: WP_012361697.1), etc. If the parent cyanobacterium belongs to the genus Pleurocapsa, it may be csaB (NCBI access ID: WP_036798735), etc. It may be.
  • the base sequences of these genes can be obtained from the NCBI database or Cyanobase mentioned above.
  • the gene encoding the cell wall-pyruvate modification enzyme may be slr0688 of Synechocystis sp. PCC 6803, synpcc7942_1529 of Synechococcus sp. PCC 7942, or anacy_1623 of Anabaena cylindrica PCC 7122.
  • the gene may have a base sequence that is 50% or more identical to these genes.
  • Synechocystis dCas9 strain was created by introducing a gene encoding dCas9 into cyanobacteria (see Comparative Example 1 of Patent Document 1). This Synechocystis dCas9 strain is called the wild strain.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of fluorescence measurement of the culture supernatant of the adventitial membrane detachment strain.
  • the vertical axis shows the wavelength (nm) of excitation light
  • the horizontal axis shows the wavelength (nm) of fluorescence.
  • the fluorescence intensity is color-coded so that the higher the intensity, the closer to black, and the lower the intensity, the closer to white. Measurements were performed three times, and representative data from the three measurements is shown.
  • FIG. 4 is a diagram showing the combination of the wavelength of excitation light irradiated onto the culture supernatant and the fluorescence of the measured wavelength.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of fluorescence measurement of the culture supernatant of the wild-type strain.
  • the fluorescence intensities of (A) to (C) above were extremely low. Further, when the excitation light in the wavelength range described in (D) above was irradiated, no fluorescence was measured.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of fluorescence measurement of the culture supernatant of the outer membrane detachment strain and the culture supernatant of the wild strain. Measurements were performed three times, and the graph shows the average value ⁇ standard deviation.
  • threshold value is just the threshold value in this embodiment, and is not limited to this example.
  • the threshold value of the fluorescence intensity in each wavelength range may be set as appropriate depending on the cyanobacterial species used, culture conditions, and the like.
  • the total amount of proteins involved in the binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30% or more and 70% or less of the total amount of the protein in the parent strain, so that the outer membrane and the cell wall are bonded together.
  • the binding is weakened and a protein produced within the bacterial cell leaks out of the bacterial cell
  • the present disclosure is not limited thereto.
  • the bond between the outer membrane and the cell wall may be weakened, or the outer membrane may be weakened.
  • the outer membrane may be weakened by adding an enzyme or a drug to the cyanobacteria culture solution.
  • the determination step determines whether or not the outer membrane of the cyanobacteria is detached from the cell wall based on the wavelength range of the measured fluorescence. It may be determined whether the culture supernatant of cyanobacteria is a culture solution of cyanobacteria from which the outer membrane has been peeled off.
  • the suitability of exfoliating the outer membrane of cyanobacteria may be determined based on the wavelength range of the measured fluorescence.
  • the degree of detachment of the outer membrane of cyanobacteria from the cell wall is judged to be appropriate if the fluorescence intensity is above a threshold value, and if the fluorescence intensity is below the threshold value, it is judged as appropriate.
  • the degree of peeling may be determined as negative.
  • the degree of detachment refers to the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and cell wall (also referred to as binding-related proteins) in the cyanobacteria relative to the total amount of proteins involved in the binding between the outer membrane and the cell wall in the parent strain (also referred to as the parent cyanobacteria). It may also be expressed as a ratio.
  • the fluorescence intensity corresponding to the degree of peeling may be calculated and set as the threshold value.
  • the culture supernatant in the measurement step, is irradiated with excitation light in a predetermined wavelength range to measure fluorescence, and in the determination step, the fluorescence is measured in a wavelength range corresponding to the predetermined wavelength range. If fluorescence is measured in the step, it is determined that the outer membrane of the cyanobacteria has peeled off from the cell wall, but in the determination step, the culture supernatant used for measurement is a culture solution of cyanobacteria with the outer membrane peeled off. It may be determined whether or not it is, or whether or not outer membrane exfoliation in cyanobacteria is appropriate or not may be determined.
  • the predetermined wavelength range of the excitation light is 620 nm ⁇ 10 nm
  • the wavelength range of fluorescence corresponding to the predetermined wavelength range of the excitation light is 645 nm ⁇ 10 nm.
  • the determination step it is determined whether the culture supernatant subjected to the measurement is a culture solution of cyanobacteria with the outer membrane peeled off. It may be determined whether or not the cyanobacteria are capable of exfoliating the outer membrane.
  • the cyanobacterial culture supernatant subjected to the measurement is a cyanobacterial culture supernatant whose outer membrane has been peeled off from the cell wall, or it may be determined whether or not the cyanobacteria culture supernatant is The suitability of adventitia peeling may also be determined.
  • the program determines whether the outer membrane of the cyanobacteria has detached from the cell wall based on the wavelength range of fluorescence measured by irradiating the culture supernatant of the cyanobacteria with excitation light.
  • This is a program that causes a computer to execute a method for measuring the culture supernatant of cyanobacteria, based on the wavelength range of fluorescence measured by irradiating the culture supernatant of cyanobacteria with excitation light.
  • It may be a program that causes a computer to execute a method for determining whether or not the culture supernatant of cyanobacteria has a membrane detached from the cell wall, or it may be a program that causes a computer to execute a method of determining whether the culture supernatant of cyanobacteria has been detached from the cell wall.
  • the program may be a program for causing a computer to execute a method for determining whether or not outer membrane exfoliation in cyanobacteria is appropriate based on the wavelength range of the measured fluorescence.
  • the intensity of the excitation light with respect to the first wavelength range is greater than or equal to the first intensity, A method, wherein the intensity of the fluorescence for a second wavelength range is greater than or equal to a second intensity.
  • the first wavelength range may be 620nm ⁇ 10nm, and the second wavelength range may be 645nm ⁇ 10nm.
  • the first wavelength range may be 280nm ⁇ 10nm, and the second wavelength range may be 335nm ⁇ 10nm.
  • the first wavelength range may be 275nm ⁇ 10nm, and the second wavelength range may be 450nm ⁇ 10nm.
  • the first wavelength range may be 360nm ⁇ 10nm, and the second wavelength range may be 455nm ⁇ 10nm.
  • One aspect of the present disclosure may be a device as described below.
  • a measurement unit that irradiates the culture supernatant with excitation light and measures fluorescence based on the irradiation; a determination unit that determines, based on the measured fluorescence, whether outer membranes of cyanobacteria contained in the culture supernatant have detached from cell walls of the cyanobacteria; including; The intensity of the excitation light with respect to the first wavelength range is greater than or equal to the first intensity, The intensity of the fluorescence in the second wavelength range is equal to or higher than the second intensity; Device.
  • the first wavelength range may be 280 nm ⁇ 10 nm, and the second wavelength range may be 335 nm ⁇ 10 nm.
  • the first wavelength range may be 275nm ⁇ 10nm, and the second wavelength range may be 450nm ⁇ 10nm.
  • the first wavelength range may be 360nm ⁇ 10nm, and the second wavelength range may be 455nm ⁇ 10nm.
  • the first wavelength range may be 620nm ⁇ 10nm, and the second wavelength range may be 645nm ⁇ 10nm.
  • the first intensity may be 1500 AU.
  • the present disclosure it is possible to easily determine whether the outer membrane of cyanobacteria has peeled off from the cell wall, so it is possible to easily determine whether the cyanobacteria are in a state suitable for substance production and also during the culture process. It is possible to quickly determine whether conditions suitable for material production are being maintained.

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Abstract

シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に蛍光を測定する測定ステップ（Ｓ０１）と、測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する判定ステップ（Ｓ０２）と、を含む。

Description

シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置、及び、プログラム
　本開示は、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置、及び、プログラムに関する。
　シアノバクテリア及び藻類等の光合成微生物は、低環境負荷な次世代の物質生産系を実現するためのツールとして注目を集めている。光合成微生物による物質生産は、常温常圧の環境下で行われ、光をエネルギー源として水と空気中の二酸化炭素（ＣＯ２）とを利用して行われる。さらに、近年の遺伝子操作技術の発展によって、遺伝子組み換え光合成微生物を用いて幅広い化合物種の生産が可能になったことから、光合成微生物による物質生産は、カーボンニュートラルを実現可能な次世代の技術として期待されている。
　このような光合成微生物による物質生産として、例えば、光合成微生物の代謝又は物質の生合成に関与する遺伝子を改変した遺伝子改変株による物質の生産性を向上させる技術が開示されている。当該技術により、例えば、スクロース（非特許文献１）、イソブタノール（非特許文献２）、脂肪酸（非特許文献３）、アミノ酸（非特許文献４）、及び、タンパク質（非特許文献５）等の生産性が向上される。
国際公開第２０２１／１００６４０号
Daniel C Ducat et al., "Rerouting Carbon Flux To Enhance Photosynthetic Productivity", Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, April 2012, Vol.78, No.8, pp.2660-2668 Shota Atsumi et al., "Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde", Nature Biotechnology, Nature Publishing Group, November 2009, Vol.27, No.12, pp.1177-1180 Xinyao Liu et al., "Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria", The Proceedings of the Natural Academy of Sciences(PNAS), National Academy of Sciences, April 2011, Vol.108, No.17, pp.6899-6904 Arnav Deshpande et al., "Combining random mutagenesis and metabolic engineering for enhanced tryptophan production in Synechocystis sp. strain PCC 6803", Applied Environmental Microbiology, May 2020, Vol.86, No.9, e02816-19 James A. Gregory et al., "Alga-Produced Cholera Toxin-Pfs25 Fusion Proteins as Oral Vaccines", Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, June 2013, Vol.79, No.13, pp.3917-3925
　例えば、シアノバクテリアの外膜を細胞壁から剥離させた遺伝子改変株によるタンパク質の生産性を向上させる技術（特許文献１）は、光合成微生物による物質生産に非常に重要である。しかしながら、特許文献１に記載の技術では、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを、例えば、細胞の電子顕微鏡観察、又は、煩雑な生化学的分析手法を用いて判定する必要があるため、手間がかかる。
　そこで本開示は、外膜が細胞壁から剥離しているか否かを簡便に判定することができるシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置、及び、プログラムを提供する。
　本開示の一態様に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に蛍光を測定する測定ステップと、測定された前記蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する判定ステップと、を含む。
　また、本開示の一態様に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定装置は、シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に蛍光を測定する測定部と、前記測定部により測定された前記蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する判定部と、を備える。
　また、本開示の一態様に係るプログラムは、シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に測定された蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する方法を、コンピュータに実行させるためのプログラムである。
　これら包括的又は具体的な態様は、システム、集積回路、コンピュータ読み取り可能な記録媒体で実現されてもよく、装置、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及びコンピュータ読み取り可能な記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、例えばＣＤ－ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ　Ｄｉｓｃ－Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）等の不揮発性の記録媒体を含む。
　本開示のシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置、及び、プログラムによれば、シアノバクテリアの外膜が剥離しているか否かを簡便に判定することができる。
図１は、実施の形態に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定装置の機能構成の一例を示すブロック図である。 図２は、実施の形態に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法のフローの一例を示すフローチャートである。 図３は、外膜剥離株の培養上清の蛍光測定の結果を示す図である。 図４は、培養上清に照射された励起光の波長と、測定された波長の蛍光との組み合わせを示す図である。 図５は、野生株の培養上清の蛍光測定の結果を示す図である。 図６は、外膜剥離株の培養上清、及び、野生株の培養上清の蛍光測定の結果を示すグラフである。
　（本開示の基礎となった知見）
　シアノバクテリア及び藻類などの光合成微生物は、低環境負荷な次世代の物質生産系を実現するためのツールとして注目を集めている。中でも、シアノバクテリアを用いた物質生産においては、効率的に、かつ、簡便に、シアノバクテリアの細胞、及び、その培養の状態を評価及び管理する手法が求められている。
　そこで本発明者は、物質の生産に使用する光合成微生物として、シアノバクテリアに着目した。シアノバクテリア（藍色細菌又は藍藻とも呼ばれる）は、真正細菌の一群であり、光合成により水を分解して酸素を産生し、得たエネルギーにより空気中のＣＯ２を固定する。なお、シアノバクテリアは、種によっては、空気中の窒素（Ｎ２）も固定できる。また、シアノバクテリアの特性として、生育が早く光利用効率が高いことが知られており、加えてその他の藻類種と比較して遺伝子操作が容易であるため、光合成微生物の中でもシアノバクテリアの利用に関して活発な研究開発が行われている。上述のように、シアノバクテリア（より具体的には、改変シアノバクテリア）による物質生産の例として、スクロース（非特許文献１）、イソブタノール（非特許文献２）、脂肪酸（非特許文献３）、及び、アミノ酸（非特許文献４）等の生産が報告されている。
　例えば、非特許文献１には、Synechococcus elongatusのスクロース生合成経路に関与する遺伝子が改変された遺伝子改変株によるスクロースの生産性が野生株よりも向上したことが開示されている。
　また、例えば、非特許文献２には、Synechococcus elongatus PCC7942を遺伝子操作して作製された、リブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシダーゼ（Rubisco）を過剰発現させた遺伝子改変株によるイソブタノールの生産性が野生株よりも向上したことが開示されている。
　また、例えば、非特許文献３には、Synechocystis sp. PCC6803にアシル－アシル輸送タンパク質チオエステラーゼ遺伝子を導入した遺伝子改変株による脂肪酸の生産性が野生株よりも向上したことが開示されている。
　また、非特許文献４には、Synechocystis sp. PCC 6803株の野生株にランダム突然変異誘発及びアミノ酸類自体を使用した選択に供して単離されたトリプトファン過剰産生株によるトリプトファンの生産性が野生株よりも向上したことが開示されている。
　また、非特許文献５では、藻類の一種であるChlamydomonas reinhardtiiの葉緑体を遺伝子操作して、コレラ毒素（CtxB）のβサブユニットに融合した２５ｋＤａのPlasmodium falciparum表面タンパク質（Pfs25）からなるキメラタンパク質（CtxB-Pfs25）を細胞内で産生させた遺伝子改変藻類を、マラリア用の経口ワクチンとして使用可能なことが開示されている。
　しかしながら、上述した従来技術では、光合成微生物の遺伝子改変株の細胞内で目的の物質が産生されても、細胞外に分泌されずに蓄積する、又は、細胞外に分泌されにくいため、細胞を破砕して目的の物質を回収する必要があり、物質の生産に手間がかかる。また、細胞内には様々な物質が存在するため、それらの物質を除去して、目的の物質を精製することが必要となる場合があり、目的の物質の回収率が低くなる。また、目的の物質の生産の度に、新たな遺伝子改変株を準備する必要があるため、手間がかかり、生産コストも嵩む。このように、上述した従来技術では、光合成微生物による物質の生産効率は未だ低いレベルであり、より生産効率の高い技術の開発が望まれている。
　シアノバクテリアの細胞壁及び細胞膜の構造は、細胞内で産生された物質の透過性が低く、細胞膜及び細胞壁の構造を人為的に改変して物質の分泌生産能力を向上させることは容易ではない。特に、タンパク質などの分子量の大きい物質（高分子化合物ともいう）は、アミノ酸などの比較的分子量の小さい物質（低分子化合物ともいう）とは異なり、細胞外に分泌されにくい。
　しかしながら、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との接着に関与し、かつ、細胞表層の構造的安定性に寄与するslr1841遺伝子又はslr0688遺伝子を欠損させると、シアノバクテリア細胞の増殖能力が失われることが記載されている（非特許文献６：木幡光, Studies on molecular basis of cyanobacterial outer membrane function and its evolutionary relationship with primitive chloroplasts, 博士論文,[オンライン], 2018.03.27,インターネット:<URL: http://hdl.handle.net/10097/00122689>、及び、非特許文献７：児島征司, 葉緑体表層膜で機能する細菌由来の膜安定化機構と物質透過機構の解明と応用, 科研費, [オンライン], 2018.04.23, インターネット:<URL: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18H02117>）。
　上記課題を解決する技術として、特許文献１には、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（以下、結合関連タンパク質ともいう）の機能が抑制又は喪失された改変シアノバクテリア及び当該改変シアノバクテリアによるタンパク質の製造方法が開示されている。特許文献１に記載の技術では、当該改変シアノバクテリアは、細胞の増殖能力を維持したまま、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているため、細胞を培養することで、細胞内で産生されたタンパク質が細胞外へ分泌され、効率良くタンパク質を製造することができる。
　しかしながら、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離すると物質の生産性が向上することがわかっているが、外膜が剥離しているか否かについては、電子顕微鏡観察、及び、煩雑な生化学的分析手法を用いて判定する必要があり、現時点で簡便な手法は開発されていない。
　そこで、本発明者は、シアノバクテリアの細胞の状態が効率的な物質生産に適した状態であるか否かの評価指標として、外膜が細胞壁から剥離しているか否かを簡便に判定する方法を鋭意検討した。その結果、シアノバクテリアの培養上清に励起光を照射して測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを簡便に判定することができることを見出した。
　したがって、本開示によれば、シアノバクテリアの培養上清の蛍光測定結果に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを簡便に判定することができる。そのため、本開示によれば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定することにより、物質生産に適したシアノバクテリアであるか否かを判定することができるため、シアノバクテリアによる物質の生産性の向上に貢献することができる。
　（本開示の概要）
　本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
　本開示の一態様に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に蛍光を測定する測定ステップと、測定された前記蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する判定ステップと、を含む。
　これにより、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、シアノバクテリアの培養上清の蛍光測定結果に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを簡便に判定することができる。そのため、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法によれば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定することにより、物質生産に適したシアノバクテリアであるか否かを判定することができるため、シアノバクテリアによる物質の生産性の向上に貢献することができる。
　例えば、本開示の一態様に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、前記測定ステップでは、予め定められた波長域の前記励起光の前記培養上清に対する照射時に前記蛍光を測定し、前記判定ステップでは、前記予め定められた波長域に対応する波長域において前記蛍光が測定された場合に、前記シアノバクテリアの前記外膜が前記細胞壁から剥離していると判定してもよい。
　これにより、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、予め定められた波長域の励起光を照射して、当該波長域に対応する波長域の蛍光が測定されるか否かによって、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定することができる。そのため、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、より簡便に、かつ、精度良く、シアノバクテリアの外膜剥離を判定することができる。
　例えば、本開示の一態様に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、前記励起光の前記予め定められた波長域は、６２０ｎｍ±１０ｎｍであり、前記励起光の前記予め定められた波長域に対応する前記蛍光の波長域は、６４５ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。
　これにより、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、予め定められた波長域の励起光を照射して、当該波長域に対応する波長域の蛍光が測定された場合に、シアノバクテリアの外膜が剥離していると判定し、蛍光が測定されない場合、シアノバクテリアの外膜が剥離していないと判定することができる。そのため、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、より簡便に、かつ、精度良く、シアノバクテリアの外膜剥離を判定することができる。
　例えば、本開示の一態様に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、前記測定ステップでは、予め定められた波長域の前記励起光の前記培養上清に対する照射時に前記蛍光を測定し、前記判定ステップでは、前記予め定められた波長域に対応する波長域における前記蛍光の強度が閾値以上である場合に、前記シアノバクテリアの前記外膜が前記細胞壁から剥離していると判定してもよい。
　これにより、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、予め定められた波長域の励起光を照射して、当該波長域に対応する波長域の蛍光の強度が閾値以上である場合に、シアノバクテリアの外膜が剥離していると判定し、蛍光の強度が閾値未満である場合に、シアノバクテリアの外膜が剥離していないと判定することができる。そのため、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、より簡便に、かつ、精度良く、シアノバクテリアの外膜剥離を判定することができる。
　例えば、本開示の一態様に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、前記判定ステップでは、前記励起光の前記予め定められた波長域と、前記励起光の前記予め定められた波長域に対応する前記蛍光の波長域との組み合わせが、下記の（１）～（３）の少なくとも１つである場合、前記シアノバクテリアの前記外膜が前記細胞壁から剥離していると判定してもよい。
（１）励起光の波長域：２８０ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：３３５ｎｍ±１０ｎｍ
（２）励起光の波長域：２７５ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：４５０ｎｍ±１０ｎｍ
（３）励起光の波長域：３６０ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：４５５ｎｍ±１０ｎｍ
　これにより、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、予め定められた波長域の励起光を照射して、当該波長域に対応する波長域の蛍光の強度が閾値以上である場合に、シアノバクテリアの外膜が剥離していると判定し、蛍光の強度が閾値未満である場合に、シアノバクテリアの外膜が剥離していないと判定することができる。そのため、シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法は、より簡便に、かつ、精度良く、シアノバクテリアの外膜剥離を判定することができる。
　また、本開示の一態様に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定装置は、シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に蛍光を測定する測定部と、前記測定部により測定された前記蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する判定部と、を備える。
　これにより、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置は、シアノバクテリアの培養上清の蛍光測定結果に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを簡便に判定することができる。そのため、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置は、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定することにより、物質生産に適したシアノバクテリアであるか否かを判定することができるため、シアノバクテリアによる物質の生産性の向上に貢献することができる。
　また、本開示の一態様に係るプログラムは、シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に測定された蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する方法を、コンピュータに実行させるためのプログラムである。
　これにより、プログラムは、シアノバクテリアの培養上清の蛍光測定結果に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かをコンピュータに判定させるため、当該コンピュータは、シアノバクテリアの外膜剥離を簡便に判定することができる。
　以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、材料、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本開示を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
　また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。
　また、以下において、数値範囲は、厳密な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば、タンパク質の量（例えば、数又は濃度等）又はその範囲を計測することなどを含む。
　また、本明細書では、菌体と細胞とは、いずれも１つのシアノバクテリアの個体を表している。
　（実施の形態）
　［１．シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置］
　まず、本実施の形態に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定装置（以下、単に、判定装置ともいう）について説明する。図１は、本実施の形態に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定装置の機能構成の一例を示すブロック図である。
　図１に示されるように、判定装置１００は、例えば、測定部１１０と、制御部１２０と、記憶部１３０と、入力受付部１４０と、表示部１５０とを備える。制御部１２０は、例えば、判定部１２２を備える。
　測定部１１０は、例えば、蛍光分光光度計である。測定部１１０の具体的な構成は、一般的な蛍光分光光度計と同様である。測定部１１０は、例えば、測定用のセルに導入されたシアノバクテリアの培養液に励起光を照射して蛍光を測定する。測定用のセルは、例えば、分光セルであってもよいし、フローセルであってもよい。これらのセルは、石英製であってもよいし、アクリル製であってもよいが、石英製であるのがより好ましい。フローセルは、例えば、シアノバクテリアが培養されている培養槽に配管を通じて連結されてもよい。配管は、希釈部と送液部とを介して培養槽に接続されてもよい。培養上清は、本培養の開始後、所定の間隔（例えば、日単位）でサンプリングされて、測定に供されてもよい。サンプリングは、ユーザにより手作業で行われてもよいし、自動で行われてもよい。
　図示していないが、測定部１１０は、例えば、測定部１１０の動作を制御する制御部を備えており、制御部は、判定装置１００の制御部１２０から出力される制御信号に従って、測定部１１０の動作を制御する。図１の例では、判定装置１００は、測定部１１０を備えるが、測定部１１０を備えなくてもよい。この場合、測定部１１０は、測定装置であり、判定装置１００は、測定装置と通信を介して接続される。
　制御部１２０は、判定装置１００の動作の制御を行うための情報処理を行う。制御部１２０は、例えば、マイクロコンピュータによって実現されるが、プロセッサ又は専用回路によって実現されてもよい。制御部１２０は、具体的には、判定部１２２を備える。判定部１２２は、プロセッサが上記情報処理を行うためのプログラムを実行することにより実現される。
　判定部１２２は、測定部１１０により測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する。
　なお、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かの判定は、測定に供されたシアノバクテリアの培養上清が、外膜が細胞壁から剥離したシアノバクテリアの培養上清であるか否かの判定であってもよい。判定部１２２の具体的な機能については、次項で説明する。
　記憶部１３０は、制御部１２０が実行する制御プログラムなどが記憶される記憶装置である。記憶部１３０は、例えば、半導体メモリによって実現される。
　入力受付部１４０は、ユーザの操作入力を受け付ける。入力受付部１４０は、具体的には、マウス、マイクロフォン、又は、タッチパネルなどによって実現される。
　表示部１５０は、制御部１２０の制御に基づいてユーザに提示する情報を表示する表示装置である。表示部１５０は、液晶パネル又は有機EL（Electro Luminescence）パネルによって実現される。
　［２．シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法］
　続いて、本実施の形態に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法について、図２を参照しながら説明する。図２は、実施の形態に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法のフローの一例を示すフローチャートである。
　当該判定方法は、判定装置１００により実施される。例えば、図２に示されるように、判定装置１００の測定部１１０は、例えば、測定用のセルに導入されたシアノバクテリアの培養上清に励起光を照射して蛍光を測定する（Ｓ０１）。より具体的には、ステップＳ０１では、例えば、測定部１１０は、予め定められた波長域の励起光を培養上清に照射して蛍光を測定する。測定部１１０は、予め定められた１つの波長域の励起光を培養上清に照射してもよいし、予め定められた２以上の波長域の励起光を順番に培養上清に照射してもよい。
　次に、判定装置１００の判定部１２２は、測定部１１０により測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する（Ｓ０２）。
　ステップＳ０２では、例えば、判定部１２２は、予め定められた波長域に対応する波長域において蛍光が測定された場合に、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定してもよい。この場合、励起光の予め定められた波長が６２０ｎｍ±１０ｎｍであり、励起光の予め定められた波長域に対応する蛍光の波長域は、６４５ｎｍ±１０ｎｍである。例えば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していないシアノバクテリアの培養上清に波長６２０ｎｍ±１０ｎｍの励起光が照射されても、当該波長域に対応する波長域（例えば、６４５ｎｍ±１０ｎｍ）の蛍光は測定されない。一方、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離している外膜剥離型のシアノバクテリアの培養上清に波長６２０ｎｍ±１０ｎｍの励起光が照射されると、当該波長域に対応する波長域（例えば、６４５ｎｍ±１０ｎｍ）の蛍光が測定される。
　また、ステップＳ０２では、例えば、判定部１２２は、予め定められた波長域に対応する波長域における蛍光の強度が閾値以上である場合に、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定してもよい。この場合、判定部１２２は、励起光の予め定められた波長域と、励起光の予め定められた波長域に対応する蛍光の波長域との組み合わせが、下記の（１）～（３）の少なくとも１つである場合、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定してもよい。
（１）励起光の波長域：２８０ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：３３５ｎｍ±１０ｎｍ
（２）励起光の波長域：２７５ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：４５０ｎｍ±１０ｎｍ
（３）励起光の波長域：３６０ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：４５５ｎｍ±１０ｎｍ
　例えば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していないシアノバクテリアの培養上清に上記の（１）～（３）の少なくとも１つの波長域の励起光が照射されると、当該波長域に対応する波長域の蛍光がそれぞれ測定されるが、その蛍光の強度は閾値以下である。また、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離している外膜剥離型のシアノバクテリアの培養上清に上記の（１）～（３）の少なくとも１つの波長域の励起光が照射されると、当該波長域に対応する波長域の蛍光がそれぞれ測定される。このとき、上記の（１）～（３）の少なくとも１つの蛍光の強度が閾値以上である場合、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定される。閾値は、上記の（１）～（３）の全ての波長域の蛍光に共通の閾値であってもよく、各波長域の蛍光ごとに設定されてもよい。
　［３．シアノバクテリア］
　続いて、シアノバクテリアについて説明する。シアノバクテリアは、藍藻又は藍色細菌とも呼ばれ、クロロフィルで光エネルギーを捕集し、得たエネルギーで水を電解して酸素を発生しながら光合成をおこなう原核生物の一群である。シアノバクテリアは、多様性に富んでおり、例えば、細胞形状ではSynechocystis sp. PCC 6803のような単細胞性の種及びAnabaena sp. PCC 7120のような多細胞が連なった糸状性の種がある。生育環境についても、Thermosynechococcus elongatusのような好熱性の種、Synechococcus elongatusのような海洋性の種、Synechocystisのような淡水性の種がある。また、Microcystis aeruginosaのようにガス小胞を持ち毒素を産生する種、及び、チラコイドを持たずに原形質膜に集光アンテナであるフィコビリソームと呼ばれるタンパク質を有するGloeobacter violaceusのように、独自の特徴をもつ種も多数挙げられる。
　シアノバクテリアの細胞表層は、内側から順に、原形質膜（内膜ともいう）、ペプチドグリカン、及び細胞最外層を形成する脂質膜である外膜で構成される。ペプチドグリカンにはグルコサミン及びマンノサミンなどで構成される。糖鎖が共有結合しており、また、これらの共有結合型の糖鎖にはピルビン酸が結合している本明細書では、ペプチドグリカンと共有結合型の糖鎖とを含めて細胞壁と呼ぶ。また、原形質膜（つまり、内膜）と外膜との間隙は、ペリプラズムと呼ばれ、タンパク質の分解又は立体構造の形成、脂質又は核酸の分解、若しくは、細胞外の栄養素の取り込み等に関与する様々な酵素が存在する。
　ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質（例えば、Slr1841）は、脂質膜（外膜ともいう）に埋め込まれたＣ末端側領域と、脂質膜から突き出したＮ末端側のＳＬＨドメインから成り、シアノバクテリア及びグラム陰性細菌の一群であるNegativicutes綱に属する細菌において広く分布している。脂質膜（つまり、外膜）に埋め込まれた領域は、親水性物質の外膜透過を可能にするためのチャネルを形成し、一方でＳＬＨドメインは細胞壁に結合する機能をもつ。ＳＬＨドメインが細胞壁に結合するためには、ペプチドグリカンにおける共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されている必要がある。ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子の例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr1841若しくはslr1908、又はAnabaena sp. 90が保持するoprBなどが挙げられる。
　ペプチドグリカンにおける共有結合型の糖鎖のピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（以下、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素という）は、グラム陽性菌であるBacillus anthracisにおいて同定され、CsaBと命名されている。ゲノム塩基配列が公開されているシアノバクテリアにおいて、多くの種がCsaBとアミノ酸配列の同一性が３０％以上となる相同タンパク質をコードする遺伝子を保持している。例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr0688又はSynechococcus sp. 7502が保持するsynpcc7502_03092などが挙げられる。
　シアノバクテリアでは、光合成により固定されたＣＯ２は多段階の酵素反応を経て各種アミノ酸に変換される。それらを原料として、シアノバクテリアの細胞質内でタンパク質が合成される。それらのタンパク質の中には、細胞質内で機能するタンパク質もあるし、細胞質からペリプラズムに輸送されてペリプラズム内で機能するタンパク質もある。しかしながら、細胞外にタンパク質を積極的に分泌するケースは、現在までシアノバクテリアにおいては報告されていない。
　シアノバクテリアは、高い光合成能力を有するため、必ずしも有機物を栄養分として外から取り込む必要がない。そのため、シアノバクテリアは、有機物チャネルタンパク質（例えば、Slr1270）のように、有機物を透過させるチャネルタンパク質を外膜に非常にわずかにしか有していない。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、有機物を透過させる有機物チャネルタンパク質は、外膜の総タンパク質量の約４％しか存在しない。一方、シアノバクテリアは、生育に必要な無機イオン類を高効率で細胞内に取り込むために、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質（例えば、Slr1841）のように、無機イオン類を透過させるイオンチャネルタンパク質を外膜に多く有する。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、無機イオンを透過させるイオンチャネルタンパク質は、外膜の総タンパク質量の約８０％を占める。
　このように、シアノバクテリアでは、外膜におけるタンパク質などの有機物を透過させるチャネルが非常に少ないため、菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に積極的に分泌することが難しいと考えられている。また、シアノバクテリアの細胞壁及び細胞膜の構造はタンパク質透過性を左右するが、細胞膜及び細胞壁構造を人為的に改変してタンパク質分泌生産能力を向上させることは容易ではない。例えば、非特許文献６及び非特許文献７には、外膜と細胞壁との接着に関与し、細胞表層の構造的安定性に寄与するslr1841遺伝子あるいはslr0688遺伝子を欠損させると、細胞の増殖能力が失われることが記載されている。
　［４．外膜剥離型のシアノバクテリア］
　続いて、外膜が細胞壁から剥離したシアノバクテリア（いわゆる、外膜剥離型のシアノバクテリア）について説明する。
　外膜が細胞壁から剥離したシアノバクテリア（いわゆる、外膜剥離型のシアノバクテリア）は、例えば、薬剤もしくは外力（例えば、圧力又は温度など）によって外膜が一時的に細胞壁から剥離した状態のシアノバクテリア、又は、外膜が細胞壁から剥離するように遺伝子改変された改変シアノバクテリアでもよい。ここで、改変シアノバクテリアとは、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（いわゆる、結合関連タンパク質）の総量が、親株（いわゆる、親シアノバクテリア）における当該タンパク質の総量の３０％以上７０％以下に抑制されている改変シアノバクテリアである。例えば、「結合関連タンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％に抑制されている」とは、親株における当該タンパク質の総量の７０％が喪失し、３０％に抑制されている状態のことを意味する。このように、改変シアノバクテリアは、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制されているため、外膜と細胞壁との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減して、外膜が細胞壁から部分的に離脱しやすくなる。上述したように、例えば、非特許文献６、及び、非特許文献７には、結合関連タンパク質をコードする遺伝子であるslr1841遺伝子又はslr0688遺伝子を欠損させると、細胞の増殖能力が失われることが記載されている。一方、本開示における改変シアノバクテリアは、結合関連タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制しているため、細胞の増殖能力が損なわれない。このように作製された改変シアノバクテリアは、細胞の増殖機能が損なわれることなく、外膜と細胞壁との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減し、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなっている。そのため、シアノバクテリアの菌体内（言い換えると、細胞内）で産生された所望の化合物、タンパク質及び代謝産物（以下、菌体内産生物質ともいう）は、外膜の外、つまり、菌体外に漏出しやすくなる。このような改変シアノバクテリアは、菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出操作が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性及び収率の低下が起こりにくい。また、改変シアノバクテリアは、細胞の増殖機能が損なわれていないため、菌体外に分泌された菌体内産生物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用することが可能である。
　以下、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの結合関連タンパク質の機能が抑制されることにより外膜が部分的に細胞壁から脱離するように改変されたシアノバクテリアについて説明する。
　改変シアノバクテリアの親微生物となる、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質の発現及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の発現の少なくとも１つを抑制する前のシアノバクテリア（本明細書において、「親株」又は「親シアノバクテリア」という）の種類は、特に制限はなく、あらゆる種類のシアノバクテリアであってもよい。例えば、親シアノバクテリアは、Synechocystis属、Synechococcus属、Anabaena属、又は、Thermosynechococcus属であってもよく、中でも、Synechocystis sp. PCC 6803、Synechococcus sp. PCC 7942、又は、Thermosynechococcus elongatus BP-1であってもよい。なお、親株は、結合関連タンパク質の総量を３０％以上７０％以下に抑制する前のシアノバクテリアであれば、野生のものであってもよいし、改変したものであって、野生のものと同等の結合関連タンパク質を有するものであってもよい。
　これらの親シアノバクテリアにおけるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（いわゆる、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素）のアミノ酸配列、それらの結合関連タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、及び、当該遺伝子の染色体DNA又はプラスミド上での位置は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）データベース（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）及びCyanobase（http://genome.microbedb.jp/cyanobase/）で確認することができる。
　なお、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアにおいて機能が抑制されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、親シアノバクテリアが保有している限り、いずれの親シアノバクテリアのものであってもよく、それらをコードする遺伝子の存在場所（例えば、染色体DNA上又はプラスミド上）により制限されるものではない。
　例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、親シアノバクテリアがSynechocystis属の場合、Slr1841、Slr1908、又は、Slr0042等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、NIES970_09470等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、Anacy_5815又はAnacy_3458等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、A0A0F6U6F8_MICAE等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothece属の場合、A0A3B8XX12_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがLeptolyngbya属の場合、A0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、A0A1Z4R6U0_9CYANが挙げられ、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、A0A1C0VG86_9NOSO等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、B1WRN6_CROS5等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、K9TAE4_9CYAN等であってもよい。
　より具体的には、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr1841、Synechococcus sp. NIES-970のNIES970_09470、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122 のAnacy_3458等であってもよい。また、これらのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　一般に、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、タンパク質の立体構造の相同性が高いため、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質としては、例えば、上記のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞壁の共有結合型の糖鎖と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
　また、例えば、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、親シアノバクテリアがSynechocystis属の場合、Slr0688等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、Syn7502_03092又はSynpcc7942_1529等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、ANA_C20348又はAnacy_1623等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、CsaB (NCBIのアクセスID：TRU80220)等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothece属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_107667006.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがSpirulina属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_026079530.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_096658142.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_099068528.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_012361697.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_036798735）等であってもよい。
　より具体的には、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr0688、Synechococcus sp. PCC 7942のSynpcc7942_1529、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122のAnacy_1623等であってもよい。また、これらの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　また、上述したとおり、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素としては、例えば、上記の細胞壁－ピルビン酸修飾酵素のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞壁のペプチドグリカンの共有結合型の糖鎖をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
　なお、本明細書において、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質の機能を抑制するとは、当該タンパク質の細胞壁との結合能力を抑制すること、当該タンパク質の外膜への輸送を抑制する若しくは喪失させること、又は、当該タンパク質が外膜に埋め込まれて機能する能力を抑制することである。
　なお、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の機能を抑制するとは、当該タンパク質が細胞壁の共有結合型の糖鎖をピルビン酸で修飾する機能を抑制することである。
　これらのタンパク質の機能を抑制する手段としては、タンパク質の機能の抑制に通常使用される手段であれば特に限定されない。当該手段は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させること、これらの遺伝子の転写を阻害すること、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又はこれらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することなどであってもよい。
　本実施の形態では、改変シアノバクテリアは、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（いわゆる、結合関連タンパク質）を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されていてもよい。これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞壁と外膜との結合に関与するタンパク質の発現が抑制されるため、又は、当該タンパク質の機能が抑制されるため、細胞壁と外膜との結合（いわゆる、結合量及び結合力）が部分的に低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。
　シアノバクテリアにおけるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの機能を抑制するために、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの転写を抑制してもよい。
　例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子は、親シアノバクテリアがSynechocystis属の場合、slr1841、slr1908、又は、slr0042等であってもよく、Synechococcus属の場合、nies970_09470等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、anacy_5815又はanacy_3458等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、A0A0F6U6F8_MICAE等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothece属の場合、A0A3B8XX12_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがLeptolyngbya属の場合、A0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、A0A1Z4R6U0_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、A0A1C0VG86_9NOSO等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、B1WRN6_CROS5等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、K9TAE4_9CYAN等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。
　より具体的には、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr1841、Synechococcus sp. NIES-970のnies970_09470、Anabaena cylindrica PCC 7122 のanacy_3458、又は、これらの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　上述したように、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、上記のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつ、細胞壁の共有結合型の糖鎖と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　また、例えば、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子は、親シアノバクテリアがSynechocystis属の場合、slr0688等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、syn7502_03092又はsynpcc7942_1529等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、ana_C20348又はanacy_1623等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、csaB (NCBIのアクセスID：TRU80220)等であってもよく、親シアノバクテリアがCynahothece属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_107667006.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがSpirulina属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_026079530.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_096658142.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_099068528.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_012361697.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_036798735）等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。
　より具体的には、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr0688、Synechococcus sp. PCC 7942のsynpcc7942_1529、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122 のanacy_1623であってもよい。また、これらの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　上述したように、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子としては、例えば、上記の細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、細胞壁のペプチドグリカンの共有結合型の糖鎖をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　以下の実施例にて本開示のシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、及び、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置について具体的に説明するが、本開示は以下の実施例にのみ何ら限定されるものではない。
　以下の実施例では、シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させる方法として、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現抑制を行い、改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を作製した（特許文献１の実施例２参照）。以下では、改変シアノバクテリアを外膜剥離株と呼ぶ。なお、本実施例で使用したシアノバクテリア種は、Synechocystis sp. PCC 6803（以下、単に、「シアノバクテリア」と呼ぶ）である。以下では、シアノバクテリアにdCas9をコードする遺伝子を導入したSynechocystis dCas9株を作製した（特許文献１の比較例１参照）。このSynechocystis dCas9株を野生株と呼ぶ。
　（１）シアノバクテリアの培養
　作製された外膜剥離株（Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株）及び野生株（Synechocystis dCas9株）を、それぞれ、初発菌体濃度OD730= 0.1となるように、1μg/mLのアンヒドロテトラサイクリン（aTC）を含むBG-11培地（表１参照）に接種した。この培養液12mLを、125mL容三角フラスコに分注し、光量100μmol/m2/sでの光照射及び30℃の条件下で3日間振盪培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）シアノバクテリアの培養上清の蛍光測定
　（２－１）外膜剥離株の培養上清について
　上記（１）で得られた3日目の外膜剥離株の培養液を、室温にて2,500 gで10分間遠心分離し、培養上清をMillex-GV Syringe Filter Unit, 0.22μm(Millipore)でろ過した。このろ過上清200μlをBG-11培地1800μlに添加することで10倍希釈し、石英製の分光セルに入れて蛍光測定に供した。蛍光測定には、FP-8500 蛍光分光光度計(日本分光社製)を用い、波長260～735nmの範囲内で、5nm刻みで励起光を照射し、各波長の励起光照射時の蛍光強度を波長275～750nmの範囲で記録した。
　測定結果を図３に示す。図３は、外膜剥離株の培養上清の蛍光測定の結果を示す図である。図３では、縦軸は、励起光の波長(nm)を示し、横軸は蛍光の波長(nm)を示す。また、蛍光強度は、高いほど黒色に近づき、低いほど白色に近づくように色分けされている。測定を3回行い、3回の測定のうち、代表的なデータを示している。また、図４は、培養上清に照射された励起光の波長と、測定された波長の蛍光との組み合わせを示す図である。
　図３に示されるように、外膜剥離株Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株の培養上清は、以下の（Ａ）～（Ｄ）に記載の波長域の励起光を照射したときに、各波長域の励起光に対応する波長域の蛍光が測定された。
（Ａ）励起光の波長域280±10nm、蛍光の波長域335±10nm
（Ｂ）励起光の波長域275±10nm、蛍光の波長域450±10nm
（Ｃ）励起光の波長域360±10nm、蛍光の波長域455±10nm
（Ｄ）励起光の波長域620±10nm、蛍光の波長域645±10nm
　（２－２）野生株の培養上清について
　上記（１）で得られた3日目の野生株の培養液を使用した点以外、上記（２－１）と同様に行った。測定結果を図５に示す。図５は、野生株の培養上清の蛍光測定の結果を示す図である。
　図５に示されるように、野生株Synechocystis dCas9株の培養上清は、下記の（Ａ）～（Ｃ）に記載の波長域の励起光を照射したときに、各波長域の励起光に対応する波長域の蛍光が測定された。
（Ａ）励起光の波長域280±10nm、蛍光の波長域335±10nm
（Ｂ）励起光の波長域275±10nm、蛍光の波長域450±10nm
（Ｃ）励起光の波長域360±10nm、蛍光の波長域455±10nm
（Ｄ）励起光の波長域620±10nm、蛍光の波長域645±10nm
　しかしながら、上記の（Ａ）～（Ｃ）の蛍光強度は、非常に低かった。また、上記（Ｄ）に記載の波長域の励起光を照射したときには、蛍光が測定されなかった。
　（２－３）測定結果の比較
　続いて、上記（２－２）及び（２―３）で測定された外膜剥離株の培養上清及び野生株の培養上清の蛍光測定の結果を比較する。図６は、外膜剥離株の培養上清、及び、野生株の培養上清の蛍光測定の結果を示すグラフである。測定は3回行い、グラフには平均値±標準偏差を示している。
　図６に示されるように、外膜剥離株の培養上清は、上記の（Ａ）～（Ｄ）のいずれの波長域の励起光を照射しても、各波長域に対応する波長域の蛍光が測定され、上記の（Ａ）～（Ｃ）で測定された蛍光の強度が野生株の培養上清よりも少なくとも3倍の強度で検出された。上記（Ｄ）について、外膜剥離株の培養上清は、蛍光が測定されたが、野生株の培養上清は、蛍光が測定されなかった。つまり、上記の（Ａ）～（Ｄ）のいずれの励起波長及び蛍光波長の組み合わせにおいても野生株の培養上清で測定された蛍光の強度は外膜剥離株の培養上清に比べて有意に低かった。
　（３）考察
　蛍光測定の結果、図６に示されるように、外膜剥離株の培養上清は、上記の（Ａ）～（Ｃ）に記載の波長域の励起光が照射されると、励起光の波長域に対応する波長域の蛍光は、野生株の培養上清に比べて少なくとも3倍の蛍光強度で検出された。したがって、例えば、上記（Ａ）の場合、測定された蛍光の強度が閾値（例えば、1500AU）以上であれば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定してもよいと考えられる。上記（Ｂ）の場合、測定された蛍光の強度が閾値（例えば、2000AU）以上であれば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定してもよいと考えられる。また、上記（Ｃ）の場合、測定された蛍光の強度が閾値（例えば、1500AU）以上であれば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定してもよいと考えられる。
　また、外膜剥離株の培養上清は、上記（Ｄ）の場合、蛍光が測定されれば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定してもよいと考えられる。
　したがって、上記の４つの少なくともいずれかの条件を満たす場合に、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定してもよいことが示唆される。
　なお、上記の閾値の例示は、あくまでも本実施例における閾値であり、この例に限定されない。各波長域の蛍光強度の閾値は、使用されるシアノバクテリア種、培養条件などの違いによって、適宜設定されてもよい。
　（他の実施の形態）
　以上、本開示に係るシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置及びプログラムについて、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。
　上記の実施の形態では、シアノバクテリアにおける外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％以上７０％以下に抑制させることにより、外膜と細胞膜との結合を弱めて菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に漏出させる例について説明したが、本開示は、これに限られない。例えば、シアノバクテリアに外力を加えることにより、外膜と細胞壁との結合を弱めてもよく、外膜を脆弱化させてもよい。また、シアノバクテリアの培養液に酵素又は薬剤を添加することにより、外膜を脆弱化させてもよい。
　上記の実施の形態では、判定ステップは、測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定するが、判定ステップは、測定に供されたシアノバクテリアの培養上清が、外膜が剥離したシアノバクテリアの培養液であるか否かを判定してもよい。
　なお、判定ステップは、測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアにおける外膜剥離の適否を判定してもよい。シアノバクテリアにおける外膜剥離の適否の判定では、例えば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していることを適と判定し、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していないことを否と判定してもよい。また、シアノバクテリアにおける外膜剥離の適否の判定では、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離している剥離度合いを蛍光強度が閾値以上であれば適と判定し、蛍光強度が閾値未満であれば剥離度合いを否と判定してもよい。なお、剥離度合いとは、親株（いわゆる、親シアノバクテリアともいう）における外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（いわゆる、結合関連タンパク質ともいう）の総量に対する、シアノバクテリアにおける当該タンパク質の総量の比で示されてもよい。剥離度合いに対応する蛍光強度を算出して、閾値として設定してもよい。
　また、上記の実施の形態では、測定ステップでは、予め定められた波長域の励起光を培養上清に照射して蛍光を測定し、判定ステップでは、予め定められた波長域に対応する波長域において蛍光が測定された場合に、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定するが、判定ステップでは、測定に供された培養上清が、外膜が剥離したシアノバクテリアの培養液であるか否かを判定してもよいし、シアノバクテリアにおける外膜剥離の適否を判定してもよい。この場合、励起光の予め定められた波長域は、６２０ｎｍ±１０ｎｍであり、励起光の予め定められた波長域に対応する蛍光の波長域は、６４５ｎｍ±１０ｎｍである。
　また、上記の実施の形態では、測定ステップでは、予め定められた波長域の励起光を培養上清に照射して蛍光を測定し、判定ステップでは、予め定められた波長域に対応する波長域における蛍光の強度が閾値以上である場合に、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定するが、判定ステップでは、測定に供された培養上清が、外膜が剥離したシアノバクテリアの培養液であるか否かを判定してもよいし、シアノバクテリアにおける外膜剥離の適否を判定してもよい。この場合、判定ステップでは、励起光の予め定められた波長域と、励起光の予め定められた波長域に対応する蛍光の波長域との組み合わせが、下記の（１）～（３）の少なくとも１つである場合、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離していると判定するが、判定ステップでは、測定に供された培養上清が、外膜が剥離したシアノバクテリアの培養液であるか否かを判定してもよいし、シアノバクテリアにおける外膜剥離の適否を判定してもよい。
（１）励起光の波長域：２８０ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：３３５ｎｍ±１０ｎｍ
（２）励起光の波長域：２７５ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：４５０ｎｍ±１０ｎｍ
（３）励起光の波長域：３６０ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：４５５ｎｍ±１０ｎｍ
　上記の実施の形態では、シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置１００は、判定部１２２は、測定部１１０により測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定するが、測定に供されたシアノバクテリアの培養上清が、外膜が細胞壁から剥離したシアノバクテリアの培養上清であるか否かの判定であってもよいし、シアノバクテリアにおける外膜剥離の適否を判定してもよい。
　上記の実施の形態では、プログラムは、シアノバクテリアの培養上清に励起光を照射して測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する方法を、コンピュータに実行させるためのプログラムであるが、シアノバクテリアの培養上清に励起光を照射して測定された蛍光の波長域に基づいて、測定に供された培養上清が、外膜が細胞壁から剥離したシアノバクテリアの培養上清であるか否かを判定する方法を、コンピュータに実行させるためのプログラムであってもよいし、シアノバクテリアの培養上清に励起光を照射して測定された蛍光の波長域に基づいて、シアノバクテリアにおける外膜剥離の適否を判定する方法を、コンピュータに実行させるためのプログラムであってもよい。
　（その他）
　本開示の一態様は、下記の様な方法であってよい。
　培養上清に励起光を照射し、前記照射に基づく蛍光を測定し、
　前記測定された蛍光に基づいて、前記培養上清に含まれる一または複数のシアノバクテリアにおいて、一または複数の外膜と一または複数の細胞壁は分離しているかどうかを判定し、
　第１波長域に対する前記励起光の強度は第１強度以上であり、
　第２波長域に対する前記蛍光の強度は第２強度以上である、方法。
　前記第１波長域は６２０ｎｍ±１０ｎｍ、前記第２波長域は６４５ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。前記第１波長域は２８０ｎｍ±１０ｎｍ、前記第２波長域は３３５ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。前記第１波長域は２７５ｎｍ±１０ｎｍ、前記第２波長域は４５０ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。前記第１波長域は３６０ｎｍ±１０ｎｍ、前記第２波長域は４５５ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。
　本開示の一態様は、下記の様な装置であってよい。
　培養上清に励起光を照射し、前記照射に基づく蛍光を測定する測定部と、
　前記測定された蛍光に基づいて、前記培養上清に含まれるシアノバクテリア（cyanobacteria）の外膜(outer membranes)が前記シアノバクテリアの細胞壁(cell walls) から剥離しているかどうかを判定する判定部とを含み、
　第１波長域に対する前記励起光の強度は第１強度以上であり、
　第２波長域に対する前記蛍光の強度は第２強度以上である、
　装置。
　前記第１波長域は２８０ｎｍ±１０ｎｍ、前記第２波長域は３３５ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。前記第１波長域は２７５ｎｍ±１０ｎｍ、前記第２波長域は４５０ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。前記第１波長域は３６０ｎｍ±１０ｎｍ、前記第２波長域は４５５ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。前記第１波長域は６２０ｎｍ±１０ｎｍ、前記第２波長域は６４５ｎｍ±１０ｎｍであってもよい。
　前記第１強度は１５００ＡＵであってもよい。
　本開示によれば、シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを簡便に判定することができるため、シアノバクテリアが物質生産に適した状態であるか否か、及び、培養過程でも物質生産に適した状態を維持しているか否かを迅速に把握することができる。
　１００　判定装置
　１１０　測定部
　１２０　制御部
　１２２　判定部
　１３０　記憶部
　１４０　入力受付部
　１５０　表示部

Claims (8)

  1. 　シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に蛍光を測定する測定ステップと、
    　測定された前記蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する判定ステップと、
    　を含む、
    　シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法。
  2. 　前記測定ステップでは、予め定められた波長域の前記励起光の前記培養上清に対する照射時に前記蛍光を測定し、
    　前記判定ステップでは、前記予め定められた波長域に対応する波長域において前記蛍光が測定された場合に、前記シアノバクテリアの前記外膜が前記細胞壁から剥離していると判定する、
    　請求項１に記載のシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法。
  3. 　前記励起光の前記予め定められた波長域は、６２０ｎｍ±１０ｎｍであり、
    　前記励起光の前記予め定められた波長域に対応する前記蛍光の波長域は、６４５ｎｍ±１０ｎｍである、
    　請求項２に記載のシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法。
  4. 　前記測定ステップでは、予め定められた波長域の前記励起光の前記培養上清に対する照射時に前記蛍光を測定し、
    　前記判定ステップでは、前記予め定められた波長域に対応する波長域における前記蛍光の強度が閾値以上である場合に、前記シアノバクテリアの前記外膜が前記細胞壁から剥離していると判定する、
    　請求項１に記載のシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法。
  5. 　前記判定ステップでは、前記励起光の前記予め定められた波長域と、前記励起光の前記予め定められた波長域に対応する前記蛍光の波長域との組み合わせが、下記の（１）～（３）の少なくとも１つである場合、前記シアノバクテリアの前記外膜が前記細胞壁から剥離していると判定する、
    （１）励起光の波長域：２８０ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：３３５ｎｍ±１０ｎｍ
    （２）励起光の波長域：２７５ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：４５０ｎｍ±１０ｎｍ
    （３）励起光の波長域：３６０ｎｍ±１０ｎｍ、蛍光の波長域：４５５ｎｍ±１０ｎｍ
    　請求項４に記載のシアノバクテリアの外膜剥離の判定方法。
  6. 　シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に蛍光を測定する測定部と、
    　前記測定部により測定された前記蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する判定部と、
    　を備える、
    　シアノバクテリアの外膜剥離の判定装置。
  7. 　シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に測定された蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する方法を、コンピュータに実行させるための、
    　プログラム。
  8. 　シアノバクテリアの培養上清に対する励起光の照射時に測定された蛍光の波長域に基づいて、前記シアノバクテリアの外膜が細胞壁から剥離しているか否かを判定する判定ステップを含む、
    　シアノバクテリアの外膜剥離の判定方法。
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