WO2023204256A1 - アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体、その製造方法及びアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体 - Google Patents

アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体、その製造方法及びアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体 Download PDF

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順規 大坂間
玲菜 土肥
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to an acetal-type releasable polyoxyethylene derivative, a method for producing the same, and an acetal-type releasable polyoxyethylene conjugate that is a conjugate with a biofunctional molecule.
  • biofunctional molecules chemically modified with water-soluble polymers such as PEG can be used to target endogenous molecules and receptors due to the formation of a hydration layer and the steric shielding effect of the active site. It is known that this may lead to a decrease in the interaction with biofunctional molecules, resulting in unfavorable effects such as a decrease in the pharmacological action of biofunctional molecules and changes in internal and intracellular dynamics.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose that human growth hormone (hGH) and interleukin 2 (IL-2), which are biofunctional molecules, are administered in a non-enzyme-dependent manner under physiological conditions, that is, under neutral conditions.
  • hGH human growth hormone
  • IL-2 interleukin 2
  • Patent Document 3 reports a compound in which a biologically functional molecule chemically modified with PEG temporarily cleaves a bond in a non-enzyme dependent manner to release a biologically functional molecule that is not chemically modified. Specifically, hydrolysis of a linker having an acetal structure that is hydrolyzed under acidic conditions is used as a trigger to cleave a carbamate bond, which is a temporary bond, by elimination of 1,4- or 1,6-benzyl, resulting in chemical modification. It has been reported that biofunctional molecules are released.
  • Patent Document 3 exemplify specific structures that are capable of releasing biofunctional molecules in a non-enzyme-dependent manner and that are capable of releasing biofunctional molecules under acidic conditions.
  • no prodrug technology has been described that releases biofunctional molecules at an appropriate rate in a non-enzyme-dependent manner under physiological conditions, i.e., neutral conditions around pH 7.4, to express pharmacological effects. .
  • the object of the present invention is to obtain a polyoxyethylene derivative having an acetal structure, which is characterized by converting a biofunctional molecule into a prodrug and gradually releasing the biofunctional molecule under physiological conditions, and a stable method for producing the same.
  • An object of the present invention is to provide an acetal type releasable polyoxyethylene conjugate.
  • B 1 is a hydrogen atom or -C(R 1 )(R 2 )OC(O)E 1
  • E 1 is a leaving group
  • P 1 is a polyoxyethylene derivative having a dehydroxyl group
  • w is an integer from 1 to 8
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 11 are each independently a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms or a hydrogen atom
  • R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are each independently an electron-withdrawing substituent, an electron-donating substituent or a hydrogen atom
  • m is 0 or 1.
  • R 1 and R 2 are hydrogen atoms
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 11 are each independently a hydrogen atom or a methyl group
  • a method for producing an acetal-type releasable polyoxyethylene derivative characterized by:
  • B 2 is a hydrogen atom or -C(R 1 )(R 2 )OC(O)NHD 1
  • D1 is a residue obtained by removing the amino group constituting the carbamate bond from the amino group contained in the biofunctional molecule
  • P2 is a polyoxyethylene derivative having a dehydroxylated group, or a combination of a polyoxyethylene derivative having a dehydroxylated group and a biofunctional molecule
  • w is an integer from 1 to 8
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 11 are each independently a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms or a hydrogen atom
  • R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are each independently an electron-withdrawing substituent, an electron-donating substituent or a hydrogen atom
  • m is 0 or 1.
  • the acetal-type releasable polyoxyethylene derivative of the present invention converts a biofunctional molecule into a prodrug and gradually hydrolyzes the acetal under physiological conditions to induce benzyl elimination, thereby gradually converting the biofunctional molecule into a prodrug. release and improve the pharmacological action of physiologically functional molecules modified with polyoxyethylene derivatives.
  • Patent Document 3 a specific structure that can release biofunctional molecules in a non-enzyme-dependent manner and can release biofunctional molecules under acidic conditions is exemplified, but under physiological conditions No specific structure has been described in which a biofunctional molecule can be released by benzyl elimination triggered by acetal hydrolysis under neutral conditions, that is, around pH 7.4.
  • the acetal structure in the compound of Patent Document 3 is generally used as a protecting group for a diol or carbonyl group, and it is known that its deprotection is carried out under acidic conditions. It is stable under neutral and basic conditions. Therefore, among the compounds of Patent Document 3, there is no suggestion of creating a compound that is hydrolyzed at an appropriate rate under physiological conditions, that is, neutral conditions, and releases physiologically functional molecules.
  • the production method of Patent Document 3 includes a step of coupling the phenolic hydroxyl group of a low molecular weight compound having an acetal structure and the hydroxyl group of PEG under basic conditions, but the acetal type releasable polyester according to the present invention
  • the acetal structure in the low molecular weight compound becomes unstable, making it difficult to obtain the acetal type releasable polyoxyethylene derivatives related to the present invention. It turned out to be difficult.
  • Figure 3 is the result of HPLC analysis of the purified PEGylated RNase described in Example 13. These are the results of a decomposition test using compounds of formulas (75), (76), (77) and (78) at 40°C in a heavy water buffer with pD 7.4. This is a base sequence of an aptamer having TNF ⁇ inhibitory activity.
  • A is the HPLC analysis result of purified PEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ) described in Comparative Example 3.
  • B is the HPLC analysis result of purified 2MPEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ) described in Example 25.
  • PEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ), 2MPEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ), and the 5′ end of the aptamer of SEQ ID NO: 1 were modified with a C6 amino linker. This is an evaluation result of TNF ⁇ inhibitory activity using NH 2 -C6-(Apt-TNF ⁇ ).
  • A is the HPLC analysis result of purified PEG(20k)-OCO-NH-insulin described in Comparative Example 4.
  • B is the HPLC analysis result of purified 2MPEG(20k)-OCO-NH-insulin described in Example 26.
  • A is the result of stability evaluation of PEG(20k)-OCO-NH-insulin in buffer solutions with various pHs.
  • B is the result of stability evaluation of 2MPEG(20k)-OCO-NH-insulin in buffer solutions with various pHs.
  • the present invention is characterized in that acetal is hydrolyzed under physiological conditions, and biofunctional molecules are gradually released through benzyl elimination.
  • physiological conditions as used herein means pH 6.0 to 8.0.
  • the release rate of biofunctional molecules under physiological conditions can be evaluated as the half-life of acetal in a pH 7.4 buffer.
  • the half-life of the acetal in a pH 7.4 buffer is preferably between 0.5 and 35 days.
  • half-life refers to the time required for acetal to be hydrolyzed and 1/2 equivalent to become aldehyde.
  • the present invention is an acetal type releasable polyoxyethylene derivative represented by the following formula (1), formula (2), formula (3) or formula (4), and characterized in that it is cleaved under physiological conditions. be.
  • B 1 is a hydrogen atom or -C(R 1 )(R 2 )OC(O)E 1
  • E 1 is a leaving group
  • P 1 is a polyoxyethylene derivative having a dehydroxyl group
  • w is an integer from 1 to 8
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 11 are each independently a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms or a hydrogen atom
  • R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are each independently an electron-withdrawing substituent, an electron-donating substituent or a hydrogen atom
  • m is 0 or 1.
  • B 1 is a hydrogen atom or -C(R 1 )(R 2 )OC(O)E 1 , Preferably it is a hydrogen atom.
  • E 1 is a leaving group
  • the leaving group include a succinimidyloxy group, a phthalimidyloxy group, a 4-nitrophenoxy group, and a 1-imidazolyl group.
  • P 1 is a polyoxyethylene derivative having a dehydroxyl group, specifically, an ether bond (- This is a residue excluding the hydroxy group (OH) that constitutes O-).
  • Polyoxyethylene includes both polyoxyethylene with a molecular weight distribution obtained by polymerization of ethylene oxide, and monodisperse polyoxyethylene in which oligooxyethylenes of a single molecular weight are bonded by a coupling reaction.
  • Preferred examples of P 1 are preferably the following residues depending on the number of Ws.
  • X 1 is a hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms, an amino group protected with a protective group, or a group capable of reacting with a biofunctional molecule
  • Z 1 is a divalent spacer or a single bond
  • n and l are each independently from 3 to 2,000
  • s is 0 or 1
  • t is 2 or 3
  • v is 0 or 2.
  • * represents the bonding point with the oxygen atom.
  • n and l represent the number of added moles of oxyethylene group represented by -(OCH 2 CH 2 )-, and each independently is 3 to 2,000, preferably 20 to 1,500, more preferably 40 to 1,000, and even more preferably 60 to 500, based on the number average molecular weight of the polyoxyethylene derivative determined by size exclusion chromatography, mass spectrometry, etc. It can be calculated by subtracting the molecular weight derived from molecules other than the polyoxyethylene chain represented by -(OCH 2 CH 2 ) n - and dividing it by the molecular weight 44 derived from the oxyethylene group.
  • Z1 is a divalent spacer or single bond that connects the polyoxyethylene group and X1 , and as a divalent spacer it is more stable than an acetal structure. There is no particular restriction if it is, but it is preferably an ether bond, ester bond, carbonate bond, urethane bond, amide bond, secondary amino group, or an alkylene group containing these, and the alkylene group has 1 to 24 carbon atoms. Examples include spacers (z1) to (z8) described in group (I).
  • q1 and q2 are each independently an integer of 1 to 12; for example, when it is desired to bond the terminal active carbonate group in a hydrophobic environment such as inside a protein, it is preferable that q1 and q2 are larger. , when bonding is desired in a hydrophilic environment, it is preferable that q1 and q2 are smaller.
  • Z 1 is an ether bond, ester bond, carbonate bond, urethane bond, amide bond, secondary amino group, or alkylene group containing these, and multiple identical structural units are bonded, the above structural unit The number is 2 or less.
  • X1 is a hydrocarbon group having 1 to 24 carbon atoms, an amino group protected with a protective group, or a group capable of reacting with a biofunctional molecule.
  • hydrocarbon groups include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, t-butyl group, pentyl group, isopentyl group, hexyl group, heptyl group, 2-ethylhexyl group, octyl group.
  • ⁇ examples include phenyl group, benzyl group, cresyl group, butylphenyl group, dodecylphenyl group, trityl group, etc., preferably a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, more preferably a methyl group or an ethyl group, still more preferably It is a methyl group.
  • the protecting group is a component that prevents or inhibits the reaction of a specific chemically reactive functional group in a molecule under certain reaction conditions.
  • Protecting groups will vary depending on the type of chemically reactable functional group being protected, the conditions used, and the presence of other functional groups or protecting groups in the molecule. Specific examples of protecting groups can be found in many popular texts, such as "Wuts, P. G. M.; Greene, T. W. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley - Interscience: New York, 2007.
  • the amino group protected with a protecting group includes, for example, an amino group protected with an acyl-based protecting group or a carbamate-based protecting group, or an azido group, and specific examples of the acyl-based protecting group or carbamate-based protecting group Examples include trifluoroacetyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, and 2-(trimethylsilyl)ethyloxycarbonyl group.
  • Groups that can react with biofunctional molecules include formyl group, epoxy group, maleimidyl group, vinyl sulfone group, acrylic group, sulfonyloxy group, carboxy group, dithiopyridyl group, ⁇ -haloacetyl group, alkynyl group, and allyl group. group, vinyl group, or azido group.
  • functional groups that can react with amino groups of biofunctional molecules to form covalent bonds include formyl groups, epoxy groups, maleimidyl groups, vinyl sulfone groups, acrylic groups, sulfonyloxy groups, and It is a carboxy group.
  • Functional groups that can react with thiol groups of biofunctional molecules to form covalent bonds include formyl groups, epoxy groups, maleimidyl groups, vinyl sulfone groups, acrylic groups, sulfonyloxy groups, carboxy groups, and dithiopyridyl groups. , ⁇ -haloacetyl group, alkynyl group, allyl group and vinyl group.
  • a functional group capable of reacting with an alkynyl group of a biofunctional molecule to form a covalent bond is an azide group.
  • Functional groups capable of forming a covalent bond by reacting with the azide group of the biofunctional molecule are alkynyl groups and functional groups containing triple bonds.
  • the group capable of reacting with the biofunctional molecule is a group represented by group (II), group (III), group (IV) or group (V). Note that "**" represents the bonding point with Z1 .
  • Group (II) Functional group capable of forming a covalent bond by reacting with an amino group of a biofunctional molecule
  • Group (III) Functional groups capable of forming covalent bonds by reacting with thiol groups of biofunctional molecules
  • Group (IV) Functional group capable of forming a covalent bond by reacting with an alkynyl group of a biofunctional molecule (c), (d) and (g) below
  • Y 1 and Y 3 are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, and specific hydrocarbon groups include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, and butyl group. , t-butyl group and pentyl group.
  • Y 2 is a halogen atom selected from chlorine, bromine, and iodine.
  • s is 0 or 1
  • t is 2 or 3
  • v is 0 or 2
  • preferred embodiments include the following formulas (p14) to (p19).
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 11 are each independently a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms or a hydrogen atom, and specifically Preferred hydrocarbon groups include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, t-butyl, phenyl, and benzyl, with hydrogen or methyl being more preferred.
  • R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are each independently an electron-withdrawing substituent, an electron-donating substituent or a hydrogen atom.
  • electron-withdrawing substituents include acyl groups having 2 to 5 carbon atoms, alkoxycarbonyl groups having 2 to 5 carbon atoms, carbamoyl groups having 2 to 5 carbon atoms, acyloxy groups having 2 to 5 carbon atoms, and acyl groups having 2 to 5 carbon atoms.
  • acylamino group C2-5 alkoxycarbonylamino group, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, C1-4 alkylsulfanyl group, C1-4 alkylsulfonyl group, carbon Six to ten arylsulfonyl groups, nitro groups, trifluoromethyl groups, and cyano groups, and preferred examples include acetyl groups, methoxycarbonyl groups, methylcarbamoyl groups, acetoxy groups, acetamido groups, methoxycarbonylamino groups, and fluorine atoms. , chlorine atom, bromine atom, iodine atom, methylsulfanyl group, phenylsulfonyl group, nitro group, trifluoromethyl group and cyano group.
  • the electron-donating substituent is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and preferable examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, and a t-butyl group.
  • Substituents having an electron-withdrawing property at the meta-position, ie, R 7 or R 8 , and electron-donating at the para-position and ortho-position, ie, R 6 , R 9 or R 10 of the phenyl group include those having 1 to 1 carbon atoms; 4 alkoxy group, aryl group having 6 to 10 carbon atoms, and aryloxy group having 6 to 10 carbon atoms, and preferred examples include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, t-butoxy group, and phenyl group. and phenoxy group.
  • m is 0, R 1 and R 2 are hydrogen atoms, and R 3 , R 4 , R 5 and R 11 are hydrogen atoms or More preferably, it is a methyl group having 1 carbon number, R 3 , R 4 and R 5 are hydrogen atoms, and R 11 is a methyl group.
  • a method for producing an acetal type releasable polyoxyethylene derivative according to the present invention will be explained.
  • a coupling product represented by the following formula (5) or formula (6) is produced by coupling a polyoxyethylene derivative and a hydroxybenzaldehyde derivative.
  • the coupling step of a polyoxyethylene derivative and a hydroxybenzaldehyde derivative is a step of obtaining a coupling product of formula (5) or (6) through a reaction step represented by reaction 1-1 or reaction 1-2. There may be a purification step after the reaction step.
  • the polyoxyethylene derivative used in the coupling reaction is a compound represented by formula (11), in which the detailed explanation of P 1 and w is the same as above, and E 2 is It is a leaving group or a hydrogen atom.
  • the leaving group is not particularly limited as long as it is reactive in the coupling reaction, but examples include chloro group, bromo group, iodo group, mesylate group, tosylate group, chloromethanesulfonate group, etc. or tosylate group is preferred, and mesylate group is more preferred.
  • the hydroxybenzaldehyde derivative is a compound represented by formula (12) or formula (13), in which the detailed explanations of R 6 to R 10 are as defined above.
  • an organic base such as potassium carbonate, potassium hydroxide, or sodium hydride.
  • the proportion of the hydroxybenzaldehyde derivative, organic base, and inorganic base to be used is not particularly limited, but is preferably at least equimolar to the chemically reactable functional group of the compound of formula (11).
  • an organic base may be used as a solvent.
  • Reaction 1-1 and Reaction 1-2 After the reaction steps of Reaction 1-1 and Reaction 1-2, it is preferable to remove impurities by-produced in the reaction, compounds remaining without being consumed in the reaction, and base catalyst in a purification step, and there are no particular restrictions on the purification method. However, it can be purified by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction, etc.
  • the acetalization step of reacting with a phenol having C(R 1 )(R 2 )-OH (B 1 , m, R 1 , and R 2 are as described above) is the reaction 2-1. It is a process of obtaining an acetal structure represented by formula (15), (16), (18) or formula (19) through the reaction process represented by any one of ⁇ 2-4, and a purification process is performed after the reaction process. There may be.
  • Reactions 2-1 to 2-4 involve combining the coupling product represented by formula (5) or formula (6) with the phenol represented by formula (14) or formula (17) in toluene, benzene, xylene,
  • the reaction is performed in an aprotic solvent such as acetonitrile, ethyl acetate, diethyl ether, t-butyl methyl ether, tetrahydrofuran, chloroform, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide or dimethylacetamide, or in the absence of a solvent in the presence of an acid catalyst to form the formula (
  • This is a step of obtaining an acetal structure of formula (15), (16), (18) or formula (19).
  • the acid catalyst may be an organic acid or an inorganic acid, and is not particularly limited, but specific examples include p-toluenesulfonic acid, pyridinium p-toluenesulfonate, methanesulfonic acid, 10-camphorsulfonic acid, and chloride. These include hydrogen, iodine, ammonium chloride, oxalic acid, and boron trifluoride diethyl ether complex.
  • a dehydrating agent may be added to the reaction system in order to eliminate water molecules generated in the reaction, and there is no particular restriction on the type of dehydrating agent as long as it does not interfere with the reaction, but for example, sodium sulfate , magnesium sulfate, alumina, silica gel or molecular sieve, preferably molecular sieve.
  • the purification method is not particularly limited. However, it can be purified by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction, etc.
  • the method may include a step of introducing a group capable of reacting with a biofunctional molecule into the deprotected amino group.
  • the conditions for the step of deprotecting the protecting group and the step of introducing a group capable of reacting with a biofunctional molecule into the deprotected amino group can be found in many general texts. For example, "Wuts, P. G. M.; Greene, T. W.
  • the step of introducing a group capable of reacting with a biofunctional molecule can be performed, for example, according to "Greg T. Hermanso, Bioconjugate Techniques, 3rd ed.”
  • the leaving group structure introduction step of introducing a leaving group structure in place of the terminal hydroxy group after the acetalization step or the step of introducing a group capable of reacting with a biofunctional molecule into the deprotected amino group?
  • formulas (15), (16), (18) and formula (19) the hydroxy groups in the polyoxyethylene derivatives are converted into succinimidyloxycarbonyloxy groups, phthalimidyloxycarbonyloxy groups, 4-
  • the conversion of the hydroxyl group is carried out by using a polyoxyethylene derivative represented by formula (15), (16), (18) or formula (19) and converting it into the respective leaving group listed in Table 1, for example.
  • the reagents can be dissolved in an aprotic solvent such as toluene, benzene, xylene, acetonitrile, ethyl acetate, diethyl ether, t-butyl methyl ether, tetrahydrofuran, chloroform, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide or dimethylacetamide, or in the absence of a solvent, triethylamine, Condensation in the presence of an organic base such as N-methylmorpholine, pyridine or 4-dimethylaminopyridine, or an inorganic base such as sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium acetate or potassium carbonate.
  • an organic base such as N-methylmorpholine, pyridine or 4-dimethyl
  • the proportions of the reagents and base catalysts listed in Table 1 are not particularly limited, but are at least equimolar to the hydroxyl group of the polyoxyethylene derivative of formula (15), (16), (18) or formula (19). is preferred. Furthermore, the reagents listed in Table 1 may be commercially available products, or may be produced using known reactions.
  • the purification method is not particularly limited, but It can be purified by extraction, recrystallization, adsorption treatment, reprecipitation, column chromatography, supercritical extraction, etc.
  • the acetal-type releasable polyoxyethylene conjugate in the present invention is obtained by reacting one -OC(O)E group of the acetal-type releasable polyethylene glycol derivative with an amino group contained in a biofunctional molecule, and is It is represented by formula (7), (8), (9) or (10).
  • B 2 is a hydrogen atom or -C(R 1 )(R 2 )OC(O)NHD 1
  • D1 is a residue obtained by removing the amino group constituting the carbamate bond from the amino group contained in the biofunctional molecule
  • P2 is a polyoxyethylene derivative having a dehydroxylated group, or a combination of a polyoxyethylene derivative having a dehydroxylated group and a biofunctional molecule
  • w is an integer from 1 to 8
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 11 are each independently a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms or a hydrogen atom
  • R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are each independently an electron-withdrawing or electron-donating substituent or a hydrogen atom
  • m is 0 or 1.
  • R 1 to R 11 and m are as defined above.
  • B 2 is a hydrogen atom or -C(R 1 )(R 2 )OC(O)NHD 1 , preferably a hydrogen atom.
  • D 1 is a residue of amino groups contained in the biofunctional molecule excluding the amino group constituting the carbamate bond.
  • the biofunctional molecule is not particularly limited, but it is a substance that is involved in the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of diseases in humans or other animals. Specifically, it includes proteins, peptides, nucleic acids, cells, viruses, etc., and suitable proteins or peptides include hormones, cytokines, antibodies, aptamers, enzymes, etc.
  • examples of cytokines include interferon type I, type II, and type III that regulate immunity, interleukins, tumor necrosis factors, and receptor antagonists thereof.
  • growth factors include erythropoietin, which is a hematopoietic factor, and granulocyte colony stimulating factor (GCSF), which is a stimulating factor.
  • blood coagulation factors include factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, Examples include factor X and factor XII.
  • Hormones include calcitonin, insulin, its analogs, exenatide, GLP-1, somatostatin, and human growth hormone.
  • antibodies include full-length antibodies and antibody fragments such as Fab and svFV; examples of aptamers include DNA aptamers and RNA aptamers; and examples of enzymes include superoxide dismutase and uricase.
  • Suitable proteins include interferons, interleukins, erythropoietin, GCSF, factor VIII, factor IX, human growth hormone, antibody fragments, and more preferably human growth hormone, interferons, GCSF, erythropoietin, or antibodies. Fragments (especially Fab) may be mentioned.
  • Suitable peptides include insulin, bivalirudin, teriparatide, exenatide, enfuvirtide, degarelix, mifamurtide, nesiritide, goserelin, glatiramer, octreotide, lanreotide, icatibant, dicotinide, pramlintide, romiplostim, calcitonin, oxytocin, leuprorelin, glucagon. More preferred examples include insulin, exenatide, and calcitonin (especially salmon calcitonin).
  • P 2 is a polyoxyethylene derivative having a dehydroxylated group, or a combination of a polyoxyethylene derivative having a dehydroxylated group and a biofunctional molecule.
  • polyoxyethylene derivative having a dehydroxyl group is the same as P 1 of the acetal type releasable polyoxyethylene derivative.
  • the conjugate of a polyoxyethylene derivative having a dehydroxylated group and a biofunctional molecule is a group in which X 1 of P 1 of the acetal-type releasable polyoxyethylene derivative is D 2 , and D 2 is a biofunctional molecule.
  • the details of the group capable of reacting with a biofunctional molecule are the same as the explanation for X1 of the acetal-type releasable polyoxyethylene derivative, and the biofunctional molecule is not particularly limited, but may be a group capable of reacting with a human or other animal.
  • Substances related to the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of diseases includes proteins, peptides, nucleic acids, cells, viruses, etc., and suitable proteins or peptides include hormones, cytokines, antibodies, aptamers, enzymes, etc.
  • biofunctional molecules in D2 are target-oriented biofunctional molecules, such as antibodies and aptamers, and examples of antibodies include antibody fragments such as Fab, Fab', and F(ab').
  • examples of aptamers include peptide aptamers, RNA aptamers, and DNA aptamers.
  • the method for producing the acetal type releasable polyoxyethylene conjugate of the present invention will be explained.
  • the acetal-type polyoxyethylene derivative and the biofunctional molecule are mixed in a water-soluble organic solvent such as acetonitrile, dimethyl sulfoxide, or N,N-dimethylformamide.
  • a purification step is performed to remove by-products.
  • Neutral or basic means pH 6.5 to pH 11.0, preferably pH 7.0 to pH 10.5, more preferably pH 7.0 to pH 10.0, particularly preferably pH 7.0 to pH 10.5.
  • the pH is 9.0.
  • Neutral or basic buffers are buffers that maintain a nearly constant pH (hydrogen ion index) even if a small amount of acid or base is added from the outside, or even if the concentration is changed by dilution. It is an aqueous solution that has a buffering effect to keep it neutral or basic.
  • a water-soluble organic solvent can also be added to the buffer.
  • the water-soluble organic solvent includes, for example, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, tetrahydrofuran, acetone, acetonitrile, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide, triethylamine, pyridine, or hexamethylphosphoric triamide.
  • acetonitrile is methanol, ethanol, propanol, isopropanol, tetrahydrofuran, acetone, acetonitrile, dimethylsulfoxide or N,N-dimethylformamide, more preferably acetonitrile, dimethylsulfoxide or N,N-dimethylformamide.
  • Specific methods for the purification step performed after the coupling step include ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reversed phase chromatography, or affinity chromatography.
  • neutral or basic conditions are pH 6.5 to pH 11.0, preferably pH 7.0 to 10.5, more preferably pH 7.0 to 10.0, particularly preferably pH 7. .0 to 9.0.
  • Example 1-1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, Dean-stark tube, and condenser tube, add NOF SUNBRIGHT MEH-20T (40 g, 2.0 mmol), toluene (120 g), and 2 ,6-di-tert-butyl-p-cresol (8 mg) was charged, and water was azeotropically removed with toluene. The mixture was cooled to 45°C, charged with chloroform (200g), cooled to 25°C, and charged with 4-hydroxybenzaldehyde (977mg, 8.0mmol) and triphenylphosphine (2.10g, 8.0mmol).
  • diisopropyl azodicarboxylate (1.51 g, 7.0 mmol) was added in three portions so that the internal temperature did not exceed 35°C.
  • methanol 224 mg, 7.0 mmol
  • the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (320 g), and hexane (240 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals.
  • Example 1-2 In a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and cooling tube, compound of formula (20) (1.0 g, 0.05 mmol) and 2,4-bis(hydroxymethyl)-p-cresol were added. (336 mg, 2.0 mmol), tetrahydrofuran (5.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1 mg), and after dissolving, add molecular sieve 5A (1.0 g) and p-toluenesulfonic acid monomer. Hydrate (11.4 mg, 0.06 mmol) was added and the reaction was carried out at 40°C for 4 hours.
  • N-methylmorpholine (12.1 mg, 0.12 mmol) was added, stirred for a while, filtered, and the filtrate was diluted with chloroform (10 g). After repeated washing with water using 20% saline (10 g) at pH 12, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (90 g) to which 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (18 mg) was added, and hexane (66 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals. I got it.
  • Example 1-3 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, a nitrogen blowing tube, and a stirrer was charged with the compound of formula (21) (250 mg, 0.0125 mmol) and dichloromethane (3.6 g), and after dissolving, pyridine (23.7 mg, 0.30 mmol) and p-nitrophenyl chloroformate (40.3 mg, 0.20 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours. After repeated water washing with 20% brine (2.5 g) at pH 12 to remove some impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Example 2-1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, Dean-stark tube, and condenser tube, add NOF SUNBRIGHT MEH-20T (40 g, 2.0 mmol), toluene (120 g), and 2, 6-di-tert-butyl-p-cresol (8 mg) was charged, and water was azeotropically removed with toluene. After cooling to 45°C and charging chloroform (200g), cooling to 25°C, and adding 3-fluoro-4-hydroxybenzaldehyde (1.12g, 8.0mmol) and triphenylphosphine (2.62g, 10.0mmol). I prepared it.
  • diisopropyl azodicarboxylate (1.84 g, 8.6 mmol) was added in three portions so that the internal temperature did not exceed 35°C.
  • methanol (276 mg, 8.6 mmol) was added, and after stirring for 30 minutes, the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (320 g), and hexane (240 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals.
  • Example 2-2 The compound of formula (23) (1.0 g, 0.05 mmol) and 2,4-bis(hydroxymethyl)-p-cresol were placed in a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and cooling tube. (336 mg, 2.0 mmol), tetrahydrofuran (5.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1 mg), and after dissolving, add molecular sieve 5A (1.0 g) and p-toluenesulfonic acid monomer. Hydrate (11.4 mg, 0.06 mmol) was added and the reaction was carried out at 40°C for 4 hours.
  • N-methylmorpholine (12.1 mg, 0.12 mmol) was added, stirred for a while, filtered, and the filtrate was diluted with chloroform (10 g). After repeated washing with water using 20% saline (10 g) at pH 12, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (90 g) to which 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (18 mg) was added, and hexane (66 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals. I got it.
  • Example 2-3 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, a nitrogen blowing tube, and a stirrer was charged with the compound of formula (24) (180 mg, 0.009 mmol) and dichloromethane (2.4 g), and after dissolving, pyridine (17.1 mg, 0.216 mmol) and p-nitrophenylchloroformate (29.0 mg, 0.144 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours. After repeated water washing with 20% saline (1.8 g) at pH 12 to remove some impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Example 3-1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, Dean-stark tube, and condenser tube, add NOF SUNBRIGHT MEH-20T (40 g, 2.0 mmol), toluene (120 g), and 2, 6-di-tert-butyl-p-cresol (8 mg) was charged, and water was azeotropically removed with toluene. After cooling to 45°C and charging chloroform (200g), cooling to 25°C, and adding 4-hydroxy-2-methoxybenzaldehyde (1.22g, 8.0mmol) and triphenylphosphine (2.62g, 10.0mmol). I prepared it.
  • diisopropyl azodicarboxylate (1.84 g, 8.6 mmol) was added in three portions so that the internal temperature did not exceed 35°C.
  • methanol (276 mg, 8.6 mmol) was added, and after stirring for 30 minutes, the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (320 g), and hexane (240 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals.
  • Example 3-2 The compound of formula (26) (1.0 g, 0.05 mmol), 2,4-bis(hydroxymethyl)-p- was placed in a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and cooling tube. Cresol (336 mg, 2.0 mmol), tetrahydrofuran (5.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1 mg) were charged and dissolved, followed by molecular sieve 5A (1.0 g) and p-toluenesulfonic acid. Monohydrate (11.4 mg, 0.06 mmol) was added and the reaction was carried out at 40°C for 4 hours.
  • N-methylmorpholine (12.1 mg, 0.12 mmol) was added, stirred for a while, filtered, and the filtrate was diluted with chloroform (10 g). After repeated washing with water using 20% saline (10 g) of pH 12 to remove some low-molecular impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (90 g) to which 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (18 mg) was added, and hexane (66 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals. I got it.
  • Example 3-3 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, and stirrer was charged with the compound of formula (27) (300 mg, 0.015 mmol) and dichloromethane (4.0 g), and after dissolving, pyridine (28.5 mg, 0.360 mmol) was charged. mmol) and p-nitrophenylchloroformate (48.4 mg, 0.240 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours. After repeated water washing with 20% saline (3.0 g) at pH 12 to remove some low-molecular impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Example 4-1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, Dean-stark tube, and condenser tube, add NOF SUNBRIGHT GL2-400HO (10 g, 0.25 mmol), toluene (30 g), and 2, 6-di-tert-butyl-p-cresol (2 mg) was charged, and water was azeotropically removed with toluene. After cooling to 45°C and charging chloroform (50g), cooling to 25°C, and charging 4-hydroxybenzaldehyde (244mg, 2.0mmol) and triphenylphosphine (524mg, 2.0mmol).
  • diisopropyl azodicarboxylate (76 mg, 1.75 mmol) was added in three portions so that the internal temperature did not exceed 35°C.
  • methanol 56 mg, 1.75 mmol was added, and after stirring for 30 minutes, the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (80 g) and hexane (60 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals.
  • Example 4-2 In a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and cooling tube, compound of formula (29) (1.0 g, 0.025 mmol) and 2,4-bis(hydroxymethyl)-p-cresol were added. (336 mg, 2.0 mmol), tetrahydrofuran (5.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1 mg), and after dissolving, add molecular sieve 5A (1.0 g) and p-toluenesulfonic acid monomer. Hydrate (17.1 mg, 0.09 mmol) was added and the reaction was carried out at 40°C for 4 hours.
  • N-methylmorpholine (12.1 mg, 0.12 mmol) was added, stirred for a while, filtered, and the filtrate was diluted with chloroform (20 g). After repeated washing with water using 20% saline (20 g) at pH 12, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (90 g) to which 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (18 mg) was added, and hexane (66 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals. I got it.
  • Example 4-3 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, a nitrogen blowing tube, and a stirrer was charged with the compound of formula (30) (250 mg, 0.00625 mmol) and dichloromethane (3.6 g), and after dissolving, pyridine (11.9 mg, 0.15 mmol) was charged. mmol) and p-nitrophenylchloroformate (20.3 mg, 0.10 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours. After repeated water washing with 20% brine (2.5 g) at pH 12 to remove some impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Example 5-1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, Dean-stark tube, and condenser tube, add NOF SUNBRIGHT PTE-200HO (10 g, 0.5 mmol), toluene (30 g), and 2, 6-di-tert-butyl-p-cresol (2 mg) was charged, and water was azeotropically removed with toluene. After cooling to 45°C and charging chloroform (50g), cooling to 25°C, and charging 4-hydroxybenzaldehyde (977mg, 8.0mmol) and triphenylphosphine (2.10g, 8.0mmol).
  • diisopropyl azodicarboxylate (1.51 g, 7.0 mmol) was added in three portions so that the internal temperature did not exceed 35°C.
  • methanol 224 mg, 7.0 mmol
  • the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (320 g), and hexane (240 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals.
  • Example 5-2 The compound of formula (32) (1.0 g, 0.05 mmol) and 2,4-bis(hydroxymethyl)-p-cresol were placed in a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and cooling tube. (1.34g, 8mmol), tetrahydrofuran (5.0g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1mg), and after dissolving, add molecular sieve 5A (1.0g) and p-toluenesulfonic acid monomer. Hydrate (45.6 mg, 0.24 mmol) was added and the reaction was carried out at 40°C for 4 hours.
  • N-methylmorpholine (48.4 mg, 0.48 mmol) was added, stirred for a while, filtered, and the filtrate was diluted with chloroform (10 g). After repeated washing with water using 20% saline (10 g) at pH 12, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (360 g) to which 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (18 mg) was added, and hexane (264 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals. I got it.
  • Example 5-3 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, a nitrogen blowing tube, and a stirrer was charged with the compound of formula (33) (250 mg, 0.0125 mmol) and dichloromethane (3.6 g), and after dissolving, pyridine (94.8 mg, 1.20 mmol) was charged. mmol) and p-nitrophenylchloroformate (161 mg, 0.80 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours.
  • Example 6-1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, Dean-stark tube, and condenser tube, add NOF SUNBRIGHT HGEO-400HO (10 g, 0.25 mmol), toluene (30 g), and 2, 6-di-tert-butyl-p-cresol (2 mg) was charged, and water was azeotropically removed with toluene. After cooling to 45°C and charging chloroform (50g), cooling to 25°C, and charging 4-hydroxybenzaldehyde (977mg, 8.0mmol) and triphenylphosphine (2.10g, 8.0mmol).
  • diisopropyl azodicarboxylate (1.51 g, 7.0 mmol) was added in three portions so that the internal temperature did not exceed 35°C.
  • methanol 224 mg, 7.0 mmol
  • the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (320 g), and hexane (240 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals.
  • Example 6-2 In a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and cooling tube, the compound of formula (35) (1.0 g, 0.025 mmol) and 2,4-bis(hydroxymethyl)-p-cresol were added. (1.34g, 8.0mmol), tetrahydrofuran (5.0g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1mg), and after dissolving, add molecular sieve 5A (1.0g) and p-toluenesulfonic acid. Monohydrate (45.6 mg, 0.24 mmol) was added, and the reaction was carried out at 40°C for 4 hours.
  • N-methylmorpholine (48.4 mg, 0.48 mmol) was added, stirred for a while, filtered, and the filtrate was diluted with chloroform (10 g). After repeated washing with water using 20% saline (10 g) of pH 12 to remove some low-molecular impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (360 g) to which 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (72 mg) was added, and hexane (264 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals. I got it.
  • Example 6-3 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, and stirrer was charged with the compound of formula (36) (250 mg, 0.00625 mmol) and dichloromethane (3.6 g), and after dissolving, pyridine (94.8 mg, 1.20 mmol) was charged. mmol) and p-nitrophenylchloroformate (161.2 mg, 0.80 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours. After washing with water repeatedly using 20% saline (2.5 g) at pH 12 to remove some low-molecular impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Example 7-1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, Dean-stark tube, and condenser tube, add NOF SUNBRIGHT DKH-20T (20 g, 1.0 mmol), toluene (60 g), and 2, 6-di-tert-butyl-p-cresol (4 mg) was charged, and water was azeotropically removed with toluene. The mixture was cooled to 45°C, charged with chloroform (100g), cooled to 25°C, and charged with 4-hydroxybenzaldehyde (977mg, 8.0mmol) and triphenylphosphine (2.10g, 8.0mmol).
  • diisopropyl azodicarboxylate (1.51 g, 7.0 mmol) was added in three portions so that the internal temperature did not exceed 35°C.
  • methanol 224 mg, 7.0 mmol
  • the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (320 g), and hexane (240 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals.
  • Example 7-2 In a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and cooling tube, compound of formula (38) (1.0 g, 0.05 mmol) and 2,4-bis(hydroxymethyl)-p-cresol were added. (672 mg, 4.0 mmol), tetrahydrofuran (5.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1 mg), and after dissolving, add molecular sieve 5A (1.0 g) and p-toluenesulfonic acid monomer. A hydrate (22.8 mg, 0.12 mmol) was added and the reaction was carried out at 40°C for 4 hours.
  • compound of formula (38) 1.0 g, 0.05 mmol
  • 2,4-bis(hydroxymethyl)-p-cresol were added. (672 mg, 4.0 mmol), tetrahydrofuran (5.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p
  • N-methylmorpholine (24.2 mg, 0.24 mmol) was added, stirred for a while, filtered, and the filtrate was diluted with chloroform (10 g). After repeated washing with water using 20% saline (10 g) at pH 12, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (180 g) to which 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (36 mg) was added, and hexane (132 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration. Obtained crystals.
  • Example 7-3 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, a nitrogen blowing tube, and a stirrer was charged with the compound of formula (39) (250 mg, 0.0125 mmol) and dichloromethane (3.6 g), and after dissolving, pyridine (47.4 mg, 0.60 mmol) was charged. mmol) and p-nitrophenylchloroformate (80.6 mg, 0.40 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours. After repeated washing with water using 20% saline (2.5 g) at pH 12, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Example 8-1 The compound of formula (20) (1.0 g, 0.05 mmol) was added to a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and condenser, as described in the literature (Freeman, J. H.; JAm. Chem. Soc. 1952). , 74, 6257-6260), 2,4-di(hydroxymethyl)phenol (336 mg, 2.0 mmol), tetrahydrofuran (5.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1 mg).
  • Example 8-2 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, and stirrer was charged with the compound of formula (45) (250 mg, 0.0125 mmol) and dichloromethane (3.6 g), and after dissolving, pyridine (23.7 mg, 0.30 mmol) was charged. mmol) and p-nitrophenylchloroformate (40.3 mg, 0.20 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours. After repeated water washing with 20% brine (2.5 g) at pH 12 to remove some impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Example 9-1 In a 300 mL four-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, Dean-stark tube, and condenser tube, add NOF SUNBRIGHT MEH-40T (40 g, 2.0 mmol), toluene (120 g), and 2, 6-di-tert-butyl-p-cresol (8 mg) was charged, and water was azeotropically removed with toluene. The mixture was cooled to 45°C, charged with chloroform (200g), cooled to 25°C, and charged with 2-hydroxybenzaldehyde (977mg, 8.0mmol) and triphenylphosphine (2.10g, 8.0mmol).
  • diisopropyl azodicarboxylate (1.51 g, 7.0 mmol) was added in three portions so that the internal temperature did not exceed 35°C.
  • methanol 224 mg, 7.0 mmol
  • the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in ethyl acetate (320 g), and hexane (240 g) was added to perform crystallization, followed by suction filtration to obtain crystals.
  • Example 9-2 The compound of formula (47) (1.0 g, 0.05 mmol) was added to a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, stirrer, and condenser, as described in the literature (Freeman, J. H.; JAm. Chem. Soc. 1952). , 74, 6257-6260), 2,4-di(hydroxymethyl)phenol (336 mg, 2.0 mmol), tetrahydrofuran (5.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (1.1 mg).
  • Example 9-3 A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, a nitrogen blowing tube, and a stirrer was charged with the compound of formula (48) (250 mg, 0.0125 mmol) and dichloromethane (3.6 g), and after dissolving, pyridine (23.7 mg, 0.30 mmol) was charged. mmol) and p-nitrophenylchloroformate (40.3 mg, 0.20 mmol), and the reaction was carried out at 25°C for 3 hours. After repeated water washing with 20% brine (2.5 g) at pH 12 to remove some impurities, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Example 10 A 20 mg/mL buffer solution of ⁇ -alanine was prepared using 0.1 M sodium phosphate buffer solution (pH 8.5). Charge the compound of formula (22) (70 mg, 0.0035 mmol) and a 20 mg/mL buffer solution of ⁇ -alanine (1.5 g) into a 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, and stirrer, and dissolve. Afterwards, the reaction was carried out at 25°C for 6 hours. After dissolving common salt (500 mg), extraction was performed using chloroform (3.0 g), and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. After diluting the filtrate with ethyl acetate (45 g), hexane (33 g) was added to perform crystallization, followed by filtration and drying under reduced pressure to obtain the compound of formula (50).
  • 0.1 M sodium phosphate buffer solution pH 8.5
  • Example 11 A 20 mg/mL buffer solution of ⁇ -alanine was prepared using 0.1 M sodium phosphate buffer solution (pH 8.5). A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, and stirrer was charged with the compound of formula (25) (70 mg, 0.0035 mmol) and a 20 mg/mL buffer solution of ⁇ -alanine (1.5 g), and dissolved. Afterwards, the reaction was carried out at 25°C for 6 hours. After dissolving common salt (500 mg), extraction was performed using chloroform (3.0 g), and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. After diluting the filtrate with ethyl acetate (45 g), hexane (33 g) was added to perform crystallization, followed by filtration and drying under reduced pressure to obtain the compound of formula (51).
  • Example 12 A 20 mg/mL buffer solution of ⁇ -alanine was prepared using 0.1 M sodium phosphate buffer solution (pH 8.5). A 50 mL three-necked flask equipped with a thermometer, a nitrogen blowing tube, and a stirrer was charged with the compound of formula (28) (14 mg, 0.0072 mmol) and a 20 mg/mL buffer solution of ⁇ -alanine (3.0 g). After dissolution, reaction was carried out at 25°C for 6 hours. After dissolving common salt (750 mg), extraction was performed using chloroform (4.5 g), and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and filtered. After diluting the filtrate with ethyl acetate (45 g), hexane (33 g) was added to perform crystallization, and after filtration, it was dried under reduced pressure to obtain the compound of formula (52).
  • FIG. 1 shows the amount of ⁇ -alanine adducts at arbitrary timing when the amount of ⁇ -alanine adducts after 0 hours of standing is taken as 100%.
  • the half-life (t1/2) calculated from is 3.6 days for the compound of formula (50), 31.5 days for the compound of formula (51), 0.55 days for the compound of formula (52), and 231 days for the compound of formula (53).
  • the compounds of the present invention represented by formulas (50), (51), and (52) are under physiological conditions compared with the prior invention, the compound represented by formula (53) and exemplified in Patent Document 3. It was shown to have the desired half-life below.
  • NOF ME-200MS ( ⁇ -methyl- ⁇ -[(methylsulfonyl)oxy]poly(oxyethylene), 10 g, 0.5 mmol) was placed in a four-neck flask equipped with a thermometer, nitrogen blowing tube, and stirrer. , 3-methyl-4-hydroxybenzaldehyde (272 mg, 2 mmol), potassium carbonate (0.69 g, 5 mmol), and acetonitrile (50 g) were charged, and the mixture was reacted at 80° C. for 6 hours. After the reaction, it was filtered, concentrated, and redissolved in dichloromethane (80 g).
  • Example 14-2 The compound of formula (54) (3.0 g, 0.15 mmol) and 2,4-bis(hydroxymethyl)-p-cresol (1.0 g, 6.0 mmol), tetrahydrofuran (15.0 g) and 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (3.3 mg), and after dissolving, add molecular sieve 5A (3.0 g) and p-toluenesulfonic acid monohydrate. hydrate (34.2 mg, 0.18 mmol) was added thereto, and the reaction was carried out at 40°C for 4 hours.
  • N-methylmorpholine (36.4 mg, 0.36 mmol) was added, stirred for a while, filtered, and the filtrate was diluted with toluene (33.0 g). After repeated washing with water using 20% brine (30 g) of pH 12, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in toluene containing 2,6-di-tert-butyl-p-cresol, and hexane was added to perform crystallization, followed by suction filtration and drying under reduced pressure to obtain the compound of formula (55). Obtained.
  • Example 14-3 In a three-necked flask equipped with a thermometer, a nitrogen blowing tube, and a stirrer, the compound of formula (55) (500 mg, 0.025 mmol), 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (0.5 mg), and toluene were added. (6.0 g) was charged, and after dissolving, triethylamine (38 mg, 0.375 mmol) and p-nitrophenylchloroformate (50.4 mg, 0.25 mmol) were charged, and the reaction was carried out at 60°C for 3 hours.
  • Example 15-1 In the same manner as in Example 14-1 except that 4-hydroxy-3,5-dimethylbenzaldehyde (300 mg, 2.0 mmol) was used instead of 3-methyl-4-hydroxybenzaldehyde, a product represented by formula (57) was prepared. The compound was obtained.
  • Example 15-2 A compound represented by formula (58) was obtained in the same manner as in Example 14-2, except that the compound represented by formula (57) (3.0 g, 0.15 mmol) was used instead of the compound represented by formula (54).
  • Example 15-3 A compound represented by formula (59) was obtained in the same manner as in Example 14-3, except that the compound represented by formula (58) (500 mg, 0.025 mmol) was used instead of the compound represented by formula (55).
  • Example 16-1 A compound represented by formula (60) was obtained in the same manner as in Example 14-1 except that 2-hydroxybenzaldehyde (244 mg, 2.0 mmol) was used instead of 3-methyl-4-hydroxybenzaldehyde.
  • Example 16-2 A compound represented by formula (61) was obtained in the same manner as in Example 14-2 except that the compound represented by formula (60) (3.0 g, 0.15 mmol) was used instead of the compound represented by formula (54).
  • Example 16-3 A compound represented by formula (62) was obtained in the same manner as in Example 14-3 except that the compound represented by formula (61) (500 mg, 0.025 mg) was used instead of the compound represented by formula (55).
  • Example 17-1 A compound represented by formula (63) was obtained in the same manner except that 2-hydroxy-6methoxybenzaldehyde (304 mg, 2.0 mmol) was used instead of 3-methyl-4-hydroxybenzaldehyde in Example 14-1. Ta.
  • Example 17-2 A compound represented by formula (64) was obtained in the same manner as in Example 14-2 except that the compound represented by formula (63) (3.0 g, 0.15 mmol) was used instead of the compound represented by formula (54).
  • Example 17-3 A compound represented by formula (65) was obtained in the same manner as in Example 14-3 except that the compound represented by formula (64) (500 mg, 0.025 mmol) was used instead of the compound represented by formula (55).
  • Example 18-1 A compound represented by formula (66) was obtained in the same manner as Example 17-1 except that NOF ME-050MS (2.5 g, 0.5 mmol) was used instead of NOF ME-200MS. Ta.
  • Example 18-2 A compound represented by formula (67) was obtained in the same manner except that compound (66) (0.75 g, 0.15 mmol) was used in place of compound (63) in Example 17-2.
  • Example 18-3 A compound represented by formula (68) was obtained in the same manner as in Example 17-3, except that the compound represented by formula (67) (125 mg, 0.025 mmol) was used instead of compound (64).
  • Example 19-1 A compound represented by formula (69) was obtained in the same manner as Example 17-1 except that NOF ME-020MS (1 g, 0.5 mmol) was used instead of NOF ME-200MS. .
  • Example 19-2 A compound represented by formula (70) was obtained in the same manner except that compound (69) (300 mg, 0.15 mmol) was used in place of compound (63) in Example 17-2.
  • Example 19-3 A compound represented by formula (71) was obtained in the same manner as in Example 17-3, except that the compound represented by formula (70) (50 mg, 0.025 mmol) was used instead of compound (64).
  • Example 20-1 A compound represented by formula (72) was prepared in the same manner as in Example 14-1 except that 4-hydroxy-2,6 dimethoxybenzaldehyde (364 mg, 2.0 mmol) was used instead of 3-methyl-4-hydroxybenzaldehyde. I got it.
  • Example 20-2 A compound represented by formula (73) was obtained in the same manner as in Example 14-2, except that the compound represented by formula (72) (3.0 g, 0.15 mmol) was used instead of the compound represented by formula (54).
  • Example 20-3 A compound represented by formula (74) was obtained in the same manner as in Example 14-3 except that the compound represented by formula (73) (500 mg, 0.025 mmol) was used instead of the compound represented by formula (55).
  • Example 21 A 20 mg/mL buffer solution of ⁇ -alanine was prepared using 0.1 M sodium phosphate buffer solution (pH 8.5).
  • the compound of formula (56) (74 mg, 0.0037 mmol) was dissolved in a 20 mg/mL ⁇ -alanine buffer solution (1.5 mL), and the reaction was carried out at 25° C. for 6 hours. After the reaction, the mixture was diluted with 0.1M sodium phosphate buffer (pH 8.5) containing 20% by weight of sodium chloride, and extracted using chloroform (3 g). The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then filtered. After diluting the filtrate with ethyl acetate (45 g), hexane (33 g) was added to perform crystallization, and after filtration, it was dried under reduced pressure to obtain the compound of formula (75).
  • Example 22 A compound of formula (76) was obtained in the same manner as in Example 21 except that the compound of formula (59) (74 mg, 0.0037 mmol) was used instead of the compound of formula (56).
  • Example 23 A compound of formula (77) was obtained in the same manner as in Example 21, except that the compound of formula (62) (74 mg, 0.0037 mmol) was used instead of the compound of formula (56).
  • Example 24 A compound of formula (78) was obtained in the same manner as in Example 21 except that the compound of formula (65) (74 mg, 0.0037 mmol) was used instead of the compound of formula (56).
  • FIG. 3 shows the amount of ⁇ -alanine adducts at arbitrary timing when the amount of ⁇ -alanine adducts after 0 hours of standing is taken as 100%.
  • the half-life (t1/2) calculated from the formula [Equation 1] described in the degradability test based on the approximate formula in the graph is 2.3 days for the compound of formula (75) and 30.1 days for the compound of formula (76). 23.1 days for the compound of formula (77) and 1.4 days for the compound of formula (78). In comparison, it was shown to have a targeted half-life under physiological conditions.
  • FIG. 5(A) shows the HPLC measurement results of fractionated PEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ).
  • Comparative example 3 was prepared in the same manner except that the compound of formula (28) (22.5 mg, 1.13 mmol) was used instead of SUNBRIGHT MENP-20T manufactured by NOF Corporation. 2MPEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ) was obtained in which the compound of 28) was combined with Apt-TNF ⁇ at a molar ratio of 1:1.
  • FIG. 5(B) shows the HPLC measurement results of the fractionated 2MPEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ).
  • Results are expressed as mean ⁇ standard error, P values were calculated by Student's t test, and a two-tailed P value of less than 0.05 was defined as a statistically significant difference.
  • TNF ⁇ inhibitory activity was confirmed for NH 2 -C6-(Apt-TNF ⁇ ) and 2MPEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ), while PEG(20k)-OCO-NH TNF ⁇ inhibitory activity could not be confirmed with -C6-(Apt-TNF ⁇ ).
  • 2MPEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ) of the present invention has a physiological It has been shown that functional substances can be released in a sustained manner and pharmacological activity can be improved.
  • Figure 6 uses PEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ), 2MPEG(20k)-OCO-NH-C6-(Apt-TNF ⁇ ), and NH 2 -C6-(Apt-TNF ⁇ ). This is an evaluation result of TNF ⁇ inhibitory activity.
  • ⁇ HPLC device Nexera (Shimadzu Corporation) ⁇ Column: Asahipack ES-502N 7C (7.5x100mm, 9um, Showa Denko) ⁇ Flow rate: 1mL/min ⁇ Analysis time: 30 minutes ⁇ Column temperature: 25°C ⁇ Injection volume: 50 ⁇ L ⁇ Detector: PDA (measurement wavelength: 280nm) ⁇ Mobile phase A: 10mM ammonium formate buffer (pH8.5) ⁇ Mobile phase B: 10mM ammonium formate buffer containing 0.25M ammonium sulfate (pH 8.5) ⁇ Gradient program (A/B): 100/0 (0 minutes) ⁇ 67/33 (20 minutes) ⁇ 0/100 (30 minutes)
  • Example 26 2MPEG(20k)-OCO-NH-insulin was obtained in the same manner as Comparative Example 4 except that the compound of formula (28) was used instead of SUNBRIGHT MENP-20T manufactured by NOF Corporation.
  • FIG. 7(B) shows the HPLC analysis results of purified 2MPEG(20k)-OCO-NH-insulin.
  • FIG. 8(A) shows the amount of PEG(20k)-OCO-NH-insulin at an arbitrary timing when the amount of PEG(20k)-OCO-NH-insulin after standing still for 0 hours is taken as 100%.
  • B) represents the amount of 2MPEG(20k)-OCO-NH-insulin at an arbitrary timing when the amount of 2MPEG(20k)-OCO-NH-insulin is taken as 100%.
  • the acetal-type releasable polyoxyethylene derivative of the present invention is capable of hydrolyzing the acetal structure under physiological conditions and gradually releasing biofunctional molecules. It can improve the pharmacological action of the molecule.

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Abstract

生理的条件下で開裂する、特定の構造を有するアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体により、生理的条件下で適切な速度で生体機能性分子を放出可能なアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体、その製造方法及びアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体を提供する。

Description

アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体、その製造方法及びアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体
　本発明は、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体、その製造方法及び生体機能性分子との結合体であるアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体に関する発明である。
　ホルモンやサイトカイン、酵素などの生体機能性分子などを用いた医薬品は、通常生体内へ投与されると腎臓における糸球体濾過や肝臓や脾臓などにおけるマクロファージによる取り込みによって、生体内から速やかに排出されてしまう。そのため血中半減期が短く、十分な薬理効果を得ることが困難であることが多い。この問題を解決するため、生体機能性分子にポリオキシエチレン（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーによって化学修飾する試みが行われている。その結果、分子量の増大や水和層の形成などにより生体機能性分子などの血中半減期を延長することが可能となる。また、これらの修飾により、生体機能性分子などの毒性や抗原性の低下、凝集性の改善などの効果が得られることも良く知られている。
　しかしながら、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーで化学修飾された生体機能性分子は、当該水溶性ポリマーによる水和層の形成や活性部位の立体的な遮蔽効果により、ターゲットとする生体内因性分子や受容体などとの相互作用が低下し、生体機能性分子本来の薬理作用の低下や、体内・細胞内動態の変化など好ましくない影響を与える場合があることが知られている。
　上記のような課題に対するアプローチとして、生体機能性分子に一時的結合を介して水溶性ポリマーを化学修飾し、生体内でこの一時的結合を開裂させて化学修飾されていない生体機能性分子を放出させる方法、すなわちプロドラッグ化の方法が用いられる。
　近年、水溶性ポリマーで修飾された生体機能性分子について、プロドラッグ化の方法を用いて生体機能性分子本来の薬理作用の低下や、体内・細胞内動態の変化を抑制可能な技術として、例えば特許文献１、２に記載の技術が知られている。これら特許文献１、２には、生体機能性分子であるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）やインターロイキン２（ＩＬ－２）を非酵素依存的で生理的条件下、すなわち中性条件下、において適度な速度で分解するリンカーを介してＰＥＧで修飾したＰＥＧ化ｈＧＨならびにＰＥＧ化ＩＬ－２がそれぞれの血中半減期を延長しつつ、リンカーの分解に伴い、生体機能性分子が放出されることでＰＥＧ化による薬理作用の低下を改善できることが報告されている。このことから、生体機能性分子の血中半減期を延長しつつ、かつ、生理的条件下において非酵素依存的に生体機能性分子を適度な速度で放出し、薬理作用を発現させるプロドラッグ化技術は重要である。
　特許文献３では、ＰＥＧで化学修飾された生体機能性分子が非酵素依存的に一時結合を開裂し、化学修飾されていない生体機能性分子を放出する化合物が報告されている。
　具体的には、酸性条件下で加水分解されるアセタール構造を有するリンカーの加水分解をトリガーとして１，４－または１，６－ベンジル脱離により一時結合であるカーバメート結合を開裂し、化学修飾されていない生体機能性分子を放出することが報告されている。
日本国特開2018-150311号公報 日本国特開2022-000043号公報 日本国特開2018-172648号公報
　特許文献３の実施例では、非酵素依存的に生体機能性分子を放出可能であり、酸性条件下で生体機能性分子を放出可能な具体的構造が例示されている。しかし、生理的条件下、すなわちｐＨ７．４付近の中性条件下で、非酵素依存的に生体機能性分子を適度な速度で放出し、薬理作用を発現させるプロドラッグ化技術は記載されていない。
　本発明の課題は、生体機能性分子をプロドラッグ化し、生理的条件下で徐々に生体機能性分子を放出することを特徴としたアセタール構造を有するポリオキシエチレン誘導体及びその安定的な製造方法ならびにアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体を提供することである。
　本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、生体機能性分子をプロドラッグ化し、生理的条件下で徐々にアセタールを加水分解させることでベンジル脱離を誘発し、生体機能性分子を放出することを特徴としたアセタール構造を有するポリオキシエチレン誘導体及びその安定的な製造方法ならびにアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体を見出した。
　すなわち本発明は以下の［１］～[６]に関する。
[１]　下記の式（１）、式（２）、式（３）または式（４）で表され、生理的条件下で開裂することを特徴とする、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式（１）、式（２）、式（３）及び式（４）中
　Ｂ１は水素原子または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）ＯＣ（Ｏ）Ｅ１であり、
　Ｅ１は脱離基であり、
　Ｐ１は、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体であり、
　ｗは１～８の整数であり、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ１１は，それぞれ独立して、炭素数１～１０の炭化水素基または水素原子であり、
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、電子求引性置換基、電子供与性置換基または水素原子であり、
　ｍは０または１である。）
［２］　ｍが０であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ１１がそれぞれ独立して水素原子またはメチル基であることを特徴とする、［１］のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体。
［３］　［１］または［２］に記載のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体を製造する方法であって、
　ポリオキシエチレン誘導体とヒドロキシベンズアルデヒド誘導体とをカップリングさせることによって、下記式（５）または式（６）で表されるカップリング生成物を得るカップリング工程、
　前記カップリング工程後に、酸性条件下で、前記式（５）または前記式（６）で表される前記カップリング生成物を、２位にヒドロキシメチル基を有し、かつ４位または６位に置換基（－ＣＨ＝ＣＢ１）ｍＣ（Ｒ１）（Ｒ２）－ＯＨ（Ｂ１、ｍ、Ｒ１、Ｒ２は前述のとおりである）を有するフェノールと反応させることで、アセタール構造体を得るアセタール化工程、および前記アセタール化工程後に、４位または６位の前記置換基の末端に脱離基構造（－ＯＣ（Ｏ）Ｅ１）を導入する脱離基構造導入工程を備えることを特徴とする、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式（５）または（６）中、Ｐ１、ｗ、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は前述したとおりである）
［４］　前記アセタール化工程と、前記脱離基構造導入工程との間に、前記式（５）及び（６）の前記カップリング生成物中の保護基で保護されたアミノ基の脱保護工程、及び前記脱保護工程後に脱保護されたアミノ基に生体機能性分子と反応可能な基を導入する工程を備えていることを特徴とする、［３］のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体の製造方法。
［５］　下記の式（７）、式（８）、式（９）または式（１０）で表され、生理的条件下で開裂することを特徴とする、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式（７）、式（８）、式（９）及び式（１０）中、
　Ｂ２は水素原子または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）ＯＣ（Ｏ）ＮＨＤ１であり、
　Ｄ１は、生体機能性分子に含まれるアミノ基から、カーバメート結合を構成するアミノ基を除いた残基であり、
　Ｐ２は、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体、または脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体および生体機能性分子の結合体であり、
　ｗは１～８の整数であり、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ１１は、それぞれ独立して、炭素数１～１０の炭化水素基または水素原子であり、
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、電子求引性置換基、電子供与性置換基または水素原子であり、
　ｍは０または１である。）
［６］　［５］に記載のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体を製造する方法であって、
　［１］または［２］のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体と生体機能性分子を、水溶性の有機溶媒が含まれていてもよい中性または塩基性の緩衝液中で反応させるカップリング工程、および
　前記カップリング工程後の中性または塩基性条件下での精製工程
を備えることを特徴とする、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体の製造方法。
　本発明のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体は、生体機能性分子をプロドラッグ化し、生理的条件下で徐々にアセタールを加水分解させることでベンジル脱離を誘発し、生体機能性分子を徐々に放出し、ポリオキシエチレン誘導体で修飾された生理機能性分子の薬理作用を改善できる。
　なお、特許文献３の実施例では、非酵素依存的に生体機能性分子を放出可能であり、酸性条件下で生体機能性分子を放出可能な具体的構造が例示されているものの、生理的条件下、すなわちｐＨ７．４付近の中性条件下で、アセタールの加水分解をトリガーとしたベンジル脱離による生体機能性分子の放出が可能な具体的な構造は記載されていない。
　ここで、特許文献３の化合物中のアセタール構造は、一般的にはジオールやカルボニル基の保護基として用いられるものであり、その脱保護は酸性条件下で行われることが知られており、中性や塩基性条件下では安定である。ゆえに、特許文献３の化合物中、生理的条件下、すなわち中性条件下で適切な速度で加水分解し、生理機能性分子を放出するような化合物の創出は示唆されていない。
　また、特許文献３の製造方法では、アセタール構造を有する低分子化合物のフェノール性水酸基とＰＥＧのヒドロキシ基とを塩基性条件下でカップリングする工程を含むが、本発明に関わるアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体の製造において、特許文献３と同様のカップリング工程を経由した場合、前記低分子化合物中のアセタール構造が不安定化し、本発明に関わるアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体を得ることが困難であることがわかった。
式（５０）、（５１）、（５２）及び（５３）の化合物を用いたｐＤ７．４の重水緩衝液中、４０℃における分解試験の結果である。 実施例１３に記載の精製されたＰＥＧ化ＲＮａｓｅのＨＰＬＣ分析の結果である。 式（７５）、（７６）、（７７）及び（７８）の化合物を用いたｐＤ７．４の重水緩衝液中、４０℃における分解試験の結果である。 ＴＮＦα阻害活性を有するアプタマーの塩基配列である。 Ａは比較例３に記載の精製されたＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）のＨＰＬＣ分析結果である。Ｂは実施例２５に記載の精製された２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）のＨＰＬＣ分析結果である。 ＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）、２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）および配列番号１のアプタマーの５’末端にＣ６アミノリンカーが修飾したＮＨ２－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）を用いたＴＮＦα阻害活性の評価結果である。 Ａは比較例４に記載の精製されたＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンのＨＰＬＣ分析結果である。Ｂは実施例２６に記載の精製された２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンのＨＰＬＣ分析結果である。 ＡはＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンの種々のｐＨを有する緩衝液中の安定性評価の結果である。Ｂは２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンの種々のｐＨを有する緩衝液中の安定性評価の結果である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、生理的条件下でアセタールが加水分解し、ベンジル脱離を経て、生体機能性分子が徐々に放出されることを特徴とする。本明細書中における「生理的条件下」とは、ｐＨ６．０～８．０である。
　また、生理的条件下における生体機能性分子の放出速度は、ｐＨ７．４の緩衝液中でのアセタールの半減期として評価することができる。ｐＨ７．４の緩衝液中でのアセタールの半減期は、０．５日～３５日であることが好ましい。ここで、「半減期」とはアセタールが加水分解され、１/２当量がアルデヒドとなるまでに要する時間を表す。
　特許文献３の実施例に例示された、アセタールに結合したフェニル基の３位にエーテル結合を介してポリオキシエチレン誘導体が導入された化合物では、生理的条件下での前記アセタール半減期は達成できなかった。これに対して、本発明者は、アセタールに結合したフェニル基の２位もしくは４位にエーテル結合を介してポリオキシエチレン誘導体が導入された化合物であれば、生理的条件下で適用した場合に前記アセタール半減期を達成可能であることを見いだした。
　すなわち、本発明は下記式（１）、式（２）、式（３）または式（４）で表され、生理的条件下で開裂することを特徴とするアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　式（１）、式（２）、式（３）及び式（４）中
　Ｂ１は水素原子または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）ＯＣ（Ｏ）Ｅ１であり、
　Ｅ１は脱離基であり、
　Ｐ１は、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体であり、
　ｗは１～８の整数であり、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ１１は，それぞれ独立して、炭素数１～１０の炭化水素基または水素原子であり、
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、電子求引性置換基、電子供与性の置換基または水素原子であり、
　ｍは０または１である。
　式（１）～（４）中、Ｒ１、Ｒ２及びＥ１の詳細は後述するが、Ｂ１は水素原子または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）ＯＣ（Ｏ）Ｅ１であり、好ましくは水素原子である。
　式（１）～（４）中、Ｅ１は脱離基であり、脱離基の好適例としては、スクシンイミジルオキシ基、フタルイミジルオキシ基、４－ニトロフェノキシ基、１－イミダゾリル基、ペンタフルオロフェノキシ基、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ基及び７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ基であり、より好ましくはスクシンイミジルオキシ基、４－ニトロフェノキシ基、１－イミダゾリル基、ペンタフルオロフェノキシ基であり、更に好ましくはスクシンイミジルオキシ基または４－ニトロフェノキシ基である。
　式（１）～（４）中、Ｐ１は、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体であり、具体的にはヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体（Ｐ１－ＯＨ）から、エーテル結合（－Ｏ－）を構成するヒドロキシ基（ＯＨ）を除いた残基である。ポリオキシエチレンは、エチレンオキシドの重合で得られる分子量分布を有するポリオキシエチレン、ならびに、単一分子量のオリゴオキシエチレンをカップリング反応で結合した単分散のポリオキシエチレンの両方を含む。
　Ｐ１の好適例は、Ｗの数に応じて、以下の残基であることが好ましい。
　ｗ＝１のとき、下式（ｐ１）または式（ｐ２）で表される残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（Ｘ１は炭素数１～２４の炭化水素基、保護基で保護されたアミノ基または生体機能性分子と反応可能な基であり、
Ｚ１は２価のスペーサーまたは単結合であり、
ｎ及びｌはそれぞれ独立して３～２，０００であり、
ｓは０または１であり、ｔは２または３であり、ｖは０または２である。）
　ｗ＝２のとき下式（ｐ３）または（ｐ４）で表される残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（Ｘ１、Ｚ１、ｎ、ｌ、ｓ及びｔは前記と同義である。）
　ｗ＝３のとき下式（ｐ５）で表される残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（ｎは前記と同義である。）
　ｗ＝４のとき下式（ｐ６）、（ｐ７）、（ｐ８）で表される残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（Ｘ１、Ｚ１、ｎ、ｌ、ｓ及びｔは前記と同義である。）
　ｗ＝５のとき下式（ｐ９）で表される残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　（ｎは前記と同義である。）
　ｗ＝６のとき下式（ｐ１０）で表される残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　（ｎは前記と同義である。）
　ｗ＝８のとき下式（ｐ１１）、（ｐ１２）、（ｐ１３）で表される残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　＊は、酸素原子との結合点を表す。
　式（ｐ１）～（ｐ１３）中、ｎ及びｌは－（ＯＣＨ２ＣＨ２）－で表されるオキシエチレン基の付加モル数を表し、それぞれ独立して３～２，０００であり、好ましくは２０～１，５００であり、より好ましくは４０～１，０００であり、更に好ましくは６０～５００であり、サイズ排除クロマトグラフィーや質量分析法などから求められるポリオキシエチレン誘導体の数平均分子量から、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－で表されるポリオキシエチレン鎖以外の分子に由来する分子量を引いた値を、オキシエチレン基に由来する分子量４４で割ることで算出できる。
　式（ｐ１）（ｐ２）（ｐ４）及び式（ｐ８）中、Ｚ１はポリオキシエチレン基とＸ１をつなぐ２価のスペーサーまたは単結合であり、２価のスペーサーとしてはアセタール構造よりも安定であれば特に制限は無いが、好ましくはエーテル結合、エステル結合、カーボネート結合、ウレタン結合、アミド結合、２級アミノ基もしくはこれらを含むアルキレン基であり、アルキレン基の炭素数は１～２４であり、例えば群（Ｉ）に記載される（ｚ１）～（ｚ８）のスペーサーが挙げられる。
群（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　式中、ｑ１及びｑ２はそれぞれ独立して１～１２の整数であり、例えば、末端の活性カーボネート基をタンパク質内部のような疎水性環境で結合させたい場合は、ｑ１及びｑ２は大きい方が好ましく、親水性環境で結合させたい場合は、ｑ１及びｑ２は小さい方が好ましい。ただし、Ｚ１がエーテル結合、エステル結合、カーボネート結合、ウレタン結合、アミド結合、２級アミノ基もしくはこれらを含むアルキレン基であって、複数の同一構造単位が結合している場合における前記構造単位の数は２以下である。
　式（ｐ１）（ｐ２）（ｐ４）及び式（ｐ８）中、Ｘ１は炭素数１～２４の炭化水素基、保護基で保護されたアミノ基または生体機能性分子と反応可能な基である。
　炭化水素基の具体的な例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、２－エチルヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基、ヘンエイコシル基、ドコシル基、トイコシル基、テトラコシル基、フェニル基、ベンジル基、クレジル基、ブチルフェニル基、ドデシルフェニル基及びトリチル基などが挙げられ、好ましくは炭素数１～１０の炭化水素基、より好ましくはメチル基またはエチル基であり、更に好ましくはメチル基である。
　ここで、保護基とは、ある反応条件下で分子中の特定の化学反応可能な官能基の反応を防止または阻止する成分である。保護基は、保護される化学反応可能な官能基の種類、使用される条件及び分子中の他の官能基もしくは保護基の存在により変化する。保護基の具体的な例は多くの一般的な成書に見出すことができるが、例えば「Ｗｕｔｓ,　Ｐ.　Ｇ.　Ｍ.；　Ｇｒｅｅｎｅ,　Ｔ.　Ｗ.　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ,　４ｔｈ　ｅｄ.；　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：　ＮｅｗＹｏｒｋ,　２００７」に記載されている。本発明において保護基で保護されたアミノ基としては、例えばアシル系保護基またはカルバメート系保護基で保護されたアミノ基、またはアジド基が挙げられ、アシル系保護基またはカーバメート系保護基の具体例としてはトリフルオロアセチル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基及び２－(トリメチルシリル)エチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
　また、生体機能性分子と反応可能な基としては、ホルミル基、エポキシ基、マレイミジル基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシ基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基、ビニル基、またはアジド基である。
　更に具体的には、生体機能性分子のアミノ基と反応して共有結合を形成することが可能な官能基は、ホルミル基、エポキシ基、マレイミジル基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基及びカルボキシ基である。生体機能性分子のチオール基と反応して共有結合を形成することが可能な官能基は、ホルミル基、エポキシ基、マレイミジル基、ビニルスルホン基、アクリル基、スルホニルオキシ基、カルボキシ基、ジチオピリジル基、α-ハロアセチル基、アルキニル基、アリル基及びビニル基である。生体機能性分子のアルキニル基と反応して共有結合を形成することが可能な官能基は、アジド基である。生体機能性分子のアジド基と反応して共有結合を形成することが可能な官能基はアルキニル基及び三重結合を含む官能基である。
　この態様の好適な実施形態において、生体機能性分子と反応可能な基は群（ＩＩ）、群（ＩＩＩ）、群（ＩＶ）または群（Ｖ）で示される基である。なお、「＊＊」はＺ１との結合点を表す。
　群（ＩＩ）：生体機能性分子のアミノ基と反応して共有結合を形成することが可能な官能基
　下記の（ａ）、（ｂ）、（ｅ）及び（ｆ）
　群（ＩＩＩ）：生体機能性分子のチオール基と反応して共有結合を形成することが可能な官能基
　下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）
　群（ＩＶ）：生体機能性分子のアルキニル基と反応して共有結合を形成することが可能な官能基
　下記の（ｃ）、（ｄ）及び（ｇ）
　群（Ｖ）：生体機能性分子のアジド基と反応して共有結合を形成することが可能な官能基
　下記の（ｉ）及び（ｊ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　式中、Ｙ１及びＹ３はそれぞれ独立して水素原子または炭素数１～５の炭化水素基であり、具体的な炭化水素基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、t-ブチル基及びペンチル基などが挙げられる。Ｙ２は塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子から選択されるハロゲン原子である。
式（ｐ２）、（ｐ４）及び式（ｐ８）において、ｓは０または１であり、ｔは２または３であり、ｖは０または２であり、好ましい実施形態は、下式（ｐ１４）～（ｐ１９）で表される残基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　式（ｐ１４）～（ｐ１９）中、Ｘ１、Ｚ１、ｎ及びｌは前述と同義である。
　式（１）～（４）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ１１は、それぞれ独立して、炭素数１～１０の炭化水素基または水素原子であり、具体的な炭化水素基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｔ－ブチル基、フェニル基及びベンジル基であり、水素原子またはメチル基がより好ましい。
　式（１）～（４）中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、電子求引性置換基、電子供与性置換基または水素原子である。電子求引性の置換基としては、炭素数２～５のアシル基、炭素数２～５のアルコキシカルボニル基、炭素数２～５のカルバモイル基、炭素数２～５のアシルオキシ基、炭素数２～５のアシルアミノ基、炭素数２～５のアルコキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１～４のアルキルスルファニル基、炭素数１～４のアルキルスルホニル基、炭素数６～１０のアリールスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基及びシアノ基であり、好ましい例としてはアセチル基、メトキシカルボニル基、メチルカルバモイル基、アセトキシ基、アセトアミド基、メトキシカルボニルアミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルファニル基、フェニルスルホニル基、ニトロ基、トリフルオロメチル基及びシアノ基が挙げられる。
　また、電子供与性の置換基としては、炭素数１～４のアルキル基であり、好ましい例としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基及びt-ブチル基が挙げられる。フェニル基のメタ位、すなわちＲ７またはＲ８、では電子求引性、パラ位及びオルト位、すなわちＲ６、Ｒ９またはＲ１０、では電子供与性である置換基としては、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数６～１０のアリール基及び炭素数６～１０のアリールオキシ基であり、好ましい例としてはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、t-ブトキシ基、フェニル基及びフェノキシ基が挙げられる。
　本発明のより好ましい様態として、式（１）～（４）中、ｍが０であり、Ｒ１及びＲ２が水素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ１１が水素原子または炭素数１のメチル基であり、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が水素原子であり、Ｒ１１がメチル基であることがより好ましい。
　次に、本発明におけるアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体の製造方法について説明する。本発明におけるアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体を製造するには、ポリオキシエチレン誘導体とヒドロキシベンズアルデヒド誘導体とをカップリングさせることによって、下記式（５）または式（６）で表されるカップリング生成物を得るカップリング工程、前記カップリング工程後に、酸性条件下で、前記式（５）または前記式（６）で表される前記カップリング生成物を、２位にヒドロキシメチル基を有し、かつ４位または６位に置換基（－ＣＨ＝ＣＢ１）ｍＣ（Ｒ１）（Ｒ２）－ＯＨ（Ｂ１、ｍ、Ｒ１、Ｒ２は前述のとおりである）を有するフェノールと反応させることで、アセタール構造体を得るアセタール化工程、および前記アセタール化工程後に、４位または６位の前記置換基の末端に脱離基構造（－ＯＣ（Ｏ）Ｅ１）を導入する脱離基構造導入工程を実施する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
（式（５）または（６）中、Ｐ１、ｗ、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は前述したとおりである）
　ポリオキシエチレン誘導体とヒドロキシベンズアルデヒド誘導体とのカップリング工程とは、反応１－１または反応１－２で表される反応工程を経て式（５）または（６）のカップリング生成物を得る工程であり、反応工程後に精製工程があってもよい。
（反応１－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
（反応１－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　カップリング反応に用いるポリオキシエチレン誘導体とは、式（１１）で表される化合物であり、式（１１）中、Ｐ１及びｗの詳細な説明は前述と同義であり、Ｅ２は、脱離基または水素原子である。脱離基としてはカップリング反応において反応性を有する基であれば特に制限は無いが、例えばクロロ基、ブロモ基、ヨード基、メシラート基、トシラート基、クロロメタンスルホナート基などが挙げられ、メシラート基またはトシラート基が好ましく、メシラート基がより好ましい。ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体とは式（１２）または式（１３）で表される化合物であり、式中Ｒ６～Ｒ１０の詳細な説明は前述と同義である。
　反応１－１及び反応１－２の式（１１）中、Ｅ２が脱離基の場合、式（１１）の化合物とヒドロキシベンズアルデヒド誘導体をトルエン、ベンゼン、キシレン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、t-ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドまたはジメチルアセトアミドなどの非プロトン性溶媒、もしくは無溶媒中、トリエチルアミン、N-メチルモルホリン、t-ブトキシカリウムまたはヘキサメチルジシラザンナトリウムなどの有機塩基、もしくは炭酸カリウム、水酸化カリウムまたは水素化ナトリウムなどの無機塩基の存在下でカップリングする反応である。ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体、有機塩基、無機塩基の使用割合は、特に制限はないが、式(１１)の化合物の化学反応可能な官能基に対して等モル以上が好ましい。また、有機塩基を溶媒として用いてもよい。
　反応１－１及び反応１－２の式（１１）中、Ｅ２が水素原子の場合、テトラヒドロフラン、ジオキサンまたはジクロロメタンなどの有機溶媒中、アゾジカルボン酸ジエチルまたはアゾジカルボン酸ジイソプロピルなどのアゾ試薬及びトリフェニルホスフィン、トリ－ｎ－オクチルホスフィンまたはトリブチルホスフィンなどのホスフィン存在下で式（１１）とヒドロキシベンズアルデヒド誘導体をカップリングする反応である。ヒドロキシベンズアルデヒド誘導体、アゾ試薬、ホスフィンの使用割合は、特に制限はないが、式(１１)の化合物の化学反応可能な官能基に対して等モル以上が好ましい。
　反応１－１及び反応１－２の反応工程後、反応で副生した不純物、また反応で消費されずに残存した化合物、塩基触媒を精製工程で除去を行うのが好ましく、精製方法は特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
　前記カップリング工程後に酸性条件下で式（５）または式（６）で表されるカップリング生成物を、２位にヒドロキシメチル基を有し、かつ４位または６位に置換基（－ＣＨ＝ＣＢ１）ｍＣ（Ｒ１）（Ｒ２）－ＯＨ（Ｂ１、ｍ、Ｒ１、Ｒ２は前述のとおりである）を有するフェノールと反応させるアセタール化工程とは、反応２－１～２－４のいずれかで表される反応工程を経て式（１５）、（１６）、（１８）または式（１９）で表されるアセタール構造体を得る工程であり、反応工程後に精製工程があってもよい。
（反応２－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
（反応２－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
（反応２－３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
（反応２－４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　式（１４）～（１９）中、Ｐ１、Ｂ１、ｍ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ１１の詳細は前記アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体中の説明と同義である。
　反応２－１～２－４は、式（５）または式（６）で表されるカップリング生成物と式（１４）または式（１７）で表される前記フェノールをトルエン、ベンゼン、キシレン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、t-ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドまたはジメチルアセトアミドなどの非プロトン性溶媒、もしくは無溶媒中、酸触媒存在下で反応させて式（１５）、（１６）、（１８）または式（１９）のアセタール構造体を得る工程である。酸触媒は有機酸または無機酸のいずれでもよく、特に制限は無いが、具体的な例を挙げればｐ－トルエンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム、メタンスルホン酸、１０－カンファースルホン酸、塩化水素、ヨウ素、塩化アンモニウム、シュウ酸及び三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体などである。さらに、反応で生じる水分子を排除するために反応系中に脱水剤を加えてもよく、脱水剤の種類としては、反応の妨げにならない脱水剤であれば特に制限は無いが、例えば硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、アルミナ、シリカゲルまたはモレキュラーシーブなどがあり、好ましくはモレキュラーシーブである。
　反応２－１～２－４の反応工程後、反応で副生した不純物、また反応で消費されずに残存した化合物、塩基触媒を精製工程で除去を行うのが好ましく、精製方法は特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
　特に前記アセタール化工程と、前記ヒドロキシ基に脱離基構造を導入する工程との間に、式（５）及び（６）中のカップリング生成物中の保護基で保護されたアミノ基の脱保護工程及び前記脱保護工程後に脱保護されたアミノ基への生体機能性分子との反応可能な基を導入する工程を備えていてもよい。前記保護基の脱保護工程及び脱保護されたアミノ基への生体機能性分子との反応可能な基を導入する工程の条件は、多くの一般的な成書に見出すことができ、脱保護工程は、例えば「Ｗｕｔｓ,　Ｐ.　Ｇ.　Ｍ.；　Ｇｒｅｅｎｅ,　Ｔ.　Ｗ.　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ,　４ｔｈ　ｅｄ.；　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：　ＮｅｗＹｏｒｋ,　２００７」に従って行うことができ、脱保護されたアミノ基へ生体機能性分子との反応可能な基を導入する工程は、例えば「Ｇｒｅｇ　Ｔ．　Ｈｅｒｍａｎｓｏ,　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ,　３ｒｄ　ｅｄ.」に従って行うことができる。
　前記アセタール化工程または前記脱保護されたアミノ基への生体機能性分子と反応可能な基を導入する工程後に、末端ヒドロキシ基の代わりに脱離基構造を導入する脱離基構造導入工程とは、式（１５）、（１６）、（１８）及び式（１９）で表されるポリオキシエチレン誘導体中のヒドロキシ基をスクシンイミジルオキシカルボニルオキシ基、フタルイミジルオキシカルボニルオキシ基、４－ニトロフェノキシカルボニルオキシ基、１－イミダゾリルカルボニルオキシ基、ペンタフルオロフェノキシカルボニルオキシ基、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシカルボニルオキシ基または７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシカルボニルオキシ基に変換する工程であり、反応工程後に精製工程があってもよい。
　ヒドロキシ基の変換は、式（１５）、（１６）、（１８）または式（１９）で表されるポリオキシエチレン誘導体と、例えば表１に記載されたそれぞれの脱離基へ変換するための試薬をトルエン、ベンゼン、キシレン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、t-ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドまたはジメチルアセトアミドなどの非プロトン性溶媒、もしくは無溶媒中、トリエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジンまたは４－ジメチルアミノピリジンなどの有機塩基、もしくは炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウムまたは炭酸カリウムなどの無機塩基の存在下で縮合することである。表１記載の試薬、塩基触媒の使用割合は、特に制限はないが、式(１５)、（１６）、（１８）または式（１９）のポリオキシエチレン誘導体のヒドロキシ基に対して等モル以上が好ましい。また、表１に記載の試薬は市販品を使用してもよく、公知の反応を使用して製造してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　脱離基構造導入工程における反応工程後、反応で副生した不純物、また反応で消費されずに残存した化合物、塩基触媒を精製工程で除去を行うのが好ましく、精製方法は特に制限されないが、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、超臨界抽出などで精製することができる。
　本発明におけるアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体は、前記アセタール型リリーサブルポリエチレングリコール誘導体の－ＯＣ（Ｏ）Ｅ１基と生体機能性分子に含まれるアミノ基とを反応させて得られ、下式（７）、（８）、（９）または（１０）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　式（７）、（８）、（９）及び式（１０）中、
　Ｂ２は水素原子または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）ＯＣ（Ｏ）ＮＨＤ１であり、
　Ｄ１は、生体機能性分子に含まれるアミノ基から、カーバメート結合を構成するアミノ基を除いた残基であり、
　Ｐ２は、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体、または脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体および生体機能性分子の結合体であり、
　ｗは１～８の整数であり、
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ１１は、それぞれ独立して、炭素数１～１０の炭化水素基または水素原子であり、
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、電子求引性または電子供与性の置換基または水素原子であり、
　ｍは０または１である。
　式（７）～（１０）中、Ｒ１～Ｒ１１、及びｍの詳細は前述と同義である。
　式（７）～（１０）中、Ｂ２は水素原子または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）ＯＣ（Ｏ）ＮＨＤ１であり、好ましくは水素原子である。
　式（７）～（１０）中、Ｄ１は生体機能性分子に含まれるアミノ基のうち、カーバメート結合を構成するアミノ基を除いた残基である。
　生体機能性分子としては、特に制限は無いが、ヒト又は他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防に関わる物質である。具体的にはタンパク質、ペプチド、核酸、細胞、ウィルスなどを含み、好適なタンパク質またはペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマー、酵素などが挙げられる。
　より具体的には、サイトカインとしては、免疫を調整するインターフェロンタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩや、インターロイキンや腫瘍壊死因子、それらの受容体アンタゴニストなどが挙げられる。成長因子としては、造血因子であるエリスロポエチンや刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）などが挙げられ、血液凝固因子としては、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子などが挙げられる。ホルモンとしては、カルシトニンやインスリン、そのアナログやエキセナチド、ＧＬＰ－１、そしてソマトスタチンやヒト成長ホルモンなどが挙げられる。抗体としては、完全長抗体、また抗体フラグメントとして、ＦａｂやｓｖＦＶなどが挙げられ、アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマーなどが挙げられ、酵素としては、スーパーオキシドディスムターゼやウリカーゼなどが挙げられる。
　好適なタンパク質としては、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、ＧＣＳＦ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ヒト成長ホルモン、抗体フラグメントなどが挙げられ、より好ましくは、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、ＧＣＳＦ、エリスロポエチン、または抗体フラグメント（特にＦａｂ）が挙げられる。
　好適なペプチドとしては、インスリン、ビバリルジン、テリパラチド、エキセナチド、エンフビルチド、デガレリクス、ミファムルチド、ネシリチド、ゴセレリン、グラチラマー、オクトレオチド、ランレオチド、イカチバント、ジコチニド、プラムリンチド、ロミプロスチム、カルシトニン、オキシトシン、リュープロレリン、グルカゴンが挙げられ、より好ましくは、インスリン、エキセナチド、カルシトニン（特にサーモンカルシトニン）が挙げられる。
　式（７）～（１０）中、Ｐ２は、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体、または脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体および生体機能性分子の結合体である。
　脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体の詳細な説明は、前記アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体のＰ１と同義である。
　また、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体および生体機能性分子の結合体とは、前記アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体のＰ１のＸ１をＤ２とした基であり、Ｄ２は生体機能性分子と反応可能な基と生体機能性分子との反応によって形成された基である。生体機能性分子と反応可能な基の詳細は、前記アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体のＸ１の説明と同義であり、生体機能性分子は、特に制限は無いが、ヒト又は他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防に関わる物質である。具体的にはタンパク質、ペプチド、核酸、細胞、ウィルスなどを含み、好適なタンパク質またはペプチドとしては、ホルモン、サイトカイン、抗体、アプタマー、酵素などが挙げられる。
　Ｄ２中の生体機能性分子の好適例は、標的志向性のある生体機能性分子であり、例えば抗体やアプタマーなどがあり、抗体としては抗体フラグメントであるＦａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２等が挙げられ、アプタマーとしてはペプチドアプタマー、ＲＮＡアプタマーまたはＤＮＡアプタマーが挙げられる。
本発明のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体の製造方法について説明する。本発明におけるポリオキシエチレン結合体を製造するには、前記アセタール型ポリオキシエチレン誘導体と生体機能性分子をアセトニトリル、ジメチルスルホキシドやＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドなどの水溶性の有機溶媒が含まれていてもよい中性または塩基性の緩衝液中で反応させて前記ポリオキシエチレン結合体を得るカップリング工程および前記カップリング工程後に塩基性条件下で未反応の前記ポリオキシエチレン誘導体、生体機能性分子または副生成物を除去する精製工程を実施する。中性または塩基性とは、ｐＨ６．５～ｐＨ１１．０であり、好ましくはｐＨ７．０～ｐＨ１０．５であり、より好ましくはｐＨ７．０～ｐＨ１０．０であり、特に好ましくはｐＨ７．０～ｐＨ９．０である。
　中性または塩基性の緩衝液とは、外から少量の酸や塩基を加えても，また，希釈して濃度を変えても，その影響を緩和してpH（水素イオン指数）をほぼ一定の中性または塩基性に保つ緩衝作用をもつ水溶液である。
　緩衝液には、水溶性の有機溶媒を添加することもできる。この場合、水溶性の有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、トリエチルアミン、ピリジンまたはヘキサメチルリン酸トリアミドがあげられ、好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドまたはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドであり、より好ましくはアセトニトリル、ジメチルスルホキシドまたはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドである。
　前記カップリング工程後に実施する精製工程の具体的な方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーなどがあげられる。
　前記精製工程では前記アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体中のアセタール構造が加水分解されにくい中性または塩基性条件下で未反応の前記ポリオキシエチレン誘導体、生体機能性分子または副生成物を除去でき、中性または塩基性条件とは、ｐＨ６．５～ｐＨ１１．０であり、好ましくはｐＨ７．０～１０．５であり、より好ましくはｐＨ７．０～１０．０であり、特に好ましくはｐＨ７．０～９．０である。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限られるものではない。
　下記実施例で得られた１Ｈ－ＮＭＲは、日本電子データム（株）製ＪＮＭ－ＥＣＰ４００またはＪＮＭ－ＥＣＡ６００から得た。測定にはφ５ｍｍチューブを用い、重水素化溶媒には、Ｄ２Ｏまたは内部標準物質としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を含有するＣＤＣｌ３、ｄ６－ＤＭＳＯを用いた。得られたアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体の分子量および末端官能基純度は、液体クロマトグラフィー（ＧＰＣおよびＨＰＬＣ）を用いて算出した。液体クロマトグラフィーのシステムは、ＧＰＣには東ソー（株）製「ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ　ＥｃｏＳＥＣ」を用い、ＨＰＬＣにはＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製「Ｔｈｅｒｍｏ　Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００」を用いた。
（実施例１－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機およびDean-stark管および冷却管を装備した300mLの4つ口フラスコに、日油社製SUNBRIGHT　MEH-20T(40g,　2.0mmol)、トルエン(120g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(8mg)を仕込み、水をトルエンで共沸除去した。45℃へ冷却し、クロロホルム(200g)を仕込んだ後、25℃まで冷却し、4－ヒドロキシベンズアルデヒド(977mg,　8.0mmol)、および、トリフェニルホスフィン(2.10g,　8.0mmol)を仕込んだ。しばらく攪拌させた後、内温が35℃度を越えないように、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(1.51g,　7.0mmol)を３分割して加えた。25℃にて1時間反応を行った後、メタノール(224mg,　7.0mmol)を添加し、30分攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル(320g)に溶解し、ヘキサン(240g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(64mg)を添加した酢酸エチル(320g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(16g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した。ヘキサン(160g)を用いて結晶洗浄し、ろ過後、減圧乾燥して式(２０)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　7.03(2H,　d,　arom.H),　7.83(2H,　d,　arom.H),　9.89(1H,　s,　－COH)
数平均分子量(Mn):　20,451
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
（実施例１－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２０)の化合物(1.0g,　0.05mmol)、2,4-ビス(ヒドロキシメチル)-p-クレゾール(336mg,　2.0mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(11.4mg,　0.06mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(12.1mg,　0.12mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(10g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(10g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(２１)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.27(1H,　t,－OH),　2.36(3H,　s,　－CH 3 ),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.68　(2H,　dd,　－CH 2 OH),　4.94(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.15(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.96(1H,　s,　－CH<),　6.77(1H,　s,　arom.H),　6.97(2H,　d,　arom.H),　7.04(1H,　s,　arom.H),　7.50(2H,　d,　arom.　H)
数平均分子量(Mn):　20,435
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
（実施例１－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２１)の化合物(250mg,　０.0125mmol)およびジクロロメタン(3.6g)を仕込み、溶解後、ピリジン(23.7mg,　0.30mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(40.3mg,　0.20mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(2.5g)を用いて水洗を繰り返し、一部の不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(２２)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.31(3H,　s,　－CH 3 ),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.96(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.16(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.35(2H,　dd,　－CH 2 OCO－),　5.98(1H,　s,　－CH<),　6.87(1H,　s,　arom.H)　6.94(2H,　d,　arom.H),　7.11(1H,　s,　arom.H),　7.26-7.29(2H,　m,　arom.H),　7.52(2H,　d,　arom.H),　8.24(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn):　20,204
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
（実施例２－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機およびDean-stark管および冷却管を装備した300mLの4つ口フラスコに日油社製SUNBRIGHT　MEH-20T(40g,　2.0mmol)、トルエン(120g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(8mg)を仕込み、水をトルエンで共沸除去した。45℃へ冷却し、クロロホルム(200g)を仕込んだ後、25℃まで冷却し、３－フルオロ－4－ヒドロキシベンズアルデヒド(1.12g,　8.0mmol)、および、トリフェニルホスフィン(2.62g,　10.0mmol)を仕込んだ。しばらく攪拌させた後、内温が35℃度を越えないように、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(1.84g,　8.6mmol)を３分割して加えた。25℃にて2時間反応を行った後、メタノール(276mg,　8.6mmol)を添加し、30分攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル(320g)に溶解し、ヘキサン(240g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(64mg)を添加した酢酸エチル(320g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(160g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した。ヘキサン(160g)を用いて結晶洗浄し、ろ過後、減圧乾燥して式(２３)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.30(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　7.13(1H,　t,　－CH<),　7.60-7.65(2H,　m,　arom.H),　9.86(1H,　s,　－COH)
数平均分子量(Mn):　20,201
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
（実施例２－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２３)の化合物(1.0g,　0.05mmol)、2,4-ビス(ヒドロキシメチル)-p-クレゾール(336mg,　2.0mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(11.4mg,　0.06mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(12.1mg,　0.12mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(10g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(10g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(２４)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.20(1H,　t,－OH),　2.29(3H,　s,　－CH 3 ),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.24(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　,　4.68(2H,　dd,　－CH 2 OH),　4.94(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.14(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.93(1H,　s,　－CH<),　6.77(1H,　s,　arom.H),　7.04(1H,　t,　arom.H),　7.06(1H,　s,　arom.H),　7.34-7.26(2H,　m,　arom.H)
数平均分子量(Mn):　20,445
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
（実施例２－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２４)の化合物(180mg,　０.009mmol)およびジクロロメタン(2.4g)を仕込み、溶解後、ピリジン(17.1mg,　0.216mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(29.0mg,　0.144mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(1.8g)を用いて水洗を繰り返し、一部の不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(２５)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.32(3H,　s,　－CH 3 ),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.24(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.96(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.15(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.34(2H,　dd,　－CH 2 OCO－),　5.96(1H,　s,　－CH<),　6.87(1H,　s,　arom.H),　7.01(1H,　t,　arom.H),　7.12(1H,　s,　arom.H),　7.26-7.36(4H,　m,　arom.H)　,　8.26(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn):　20,298
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
（実施例３－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機およびDean-stark管および冷却管を装備した300mLの4つ口フラスコに日油社製SUNBRIGHT MEH-20T(40g,　2.0mmol)、トルエン(120g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(8mg)を仕込み、水をトルエンで共沸除去した。45℃へ冷却し、クロロホルム(200g)を仕込んだ後、25℃まで冷却し、４－ヒドロキシ－２－メトキシベンズアルデヒド(1.22g,　8.0mmol)、および、トリフェニルホスフィン(2.62g,　10.0mmol)を仕込んだ。しばらく攪拌させた後、内温が35℃度を越えないように、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(1.84g,　8.6mmol)を３分割して加えた。25℃にて2時間反応を行った後、メタノール(276mg,　8.6mmol)を添加し、30分攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル(320g)に溶解し、ヘキサン(240g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(64mg)を添加した酢酸エチル(320g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(160g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した。ヘキサン(160g)を用いて結晶洗浄し、ろ過後、減圧乾燥して式(２６)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.21(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　6.50(1H,　d,　arom.H),　6.55(1H,　dd,　arom.H),　7.79(2H,　d,　arom.H),　10.3(1H,　s,　－COH)
数平均分子量(Mn):　20,216
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
（実施例３－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２６)の化合物(1.0g,　０.05mmol)、2,4-ビス(ヒドロキシメチル)-p-クレゾール(336mg,　2.0mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(11.4mg,　0.06mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(12.1mg,　0.12mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(10g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(10g)を用いて水洗を繰り返し行い、一部の低分子不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(２７)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H,　s,　－CH 3 ),　2.84(1H,　dd,－OH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.47(1H,　dd,　－CH 2 OH),　4.75(1H,　dd,　－CH 2 OH),　4.98(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.17(1H,　d,　－CH 2 O－),　6.20(1H,　s,　－CH<),　6.57-6.55(2H,　m,　arom.H),　6.78(1H,　s,　arom.H),　6.97(1H,　s,　arom.H),　7.58(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn):　20,215
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
（実施例３－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２７)の化合物(300mg,　0.015mmol)およびジクロロメタン(4.0g)を仕込み、溶解後、ピリジン(28.5mg,　0.360mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(48.4mg,　0.240mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(3.0g)を用いて水洗を繰り返し、一部の低分子不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(２８)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.31(3H,　s,　－CH 3 ),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.93(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.18(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.33(2H,　dd,　－CH 2 OCO－),　6.26(1H,　s,　－CH<),　6.52-6.54(2H,　m,　arom.H),　6.87(1H,　s,　arom.H),　7.10(1H,　s,　arom.H),　7.26-7.27(2H,　m,　arom.H),　7.59(1H,　d,　arom.H),　8.22(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn):　20,315
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
（実施例４－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機およびDean-stark管および冷却管を装備した300mLの4つ口フラスコに日油社製SUNBRIGHT　GL2-400HO(10g,　0.25mmol)、トルエン(30g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(2mg)を仕込み、水をトルエンで共沸除去した。45℃へ冷却し、クロロホルム(50g)を仕込んだ後、25℃まで冷却し、4－ヒドロキシベンズアルデヒド(244mg,　2.0mmol)、および、トリフェニルホスフィン(524mg,　2.0mmol)を仕込んだ。しばらく攪拌させた後、内温が35℃度を越えないように、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(376mg,　1.75mmol)を３分割して加えた。25℃にて2時間反応を行った後、メタノール(56mg,　1.75mmol)を添加し、30分攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル(80g)に溶解し、ヘキサン(60g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(16mg)を添加した酢酸エチル(80g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(40g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した。ヘキサン(40g)を用いて結晶洗浄し、ろ過後、減圧乾燥して式(２９)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(6H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-3.92(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.13(1H,　dd,　－CH 2 O－),　4.21(1H,　dd,　－CH 2 O－),　7.03(2H,　d,　arom.H),　7.83(2H,　d,　arom.H),　9.89(1H,　s,　－COH)
数平均分子量(Mn):　38,947
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
（実施例４－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２９)の化合物(1.0g,　0.025mmol)、2,4-ビス(ヒドロキシメチル)-p-クレゾール(336mg,　2.0mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1 mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(17.1mg,　0.09mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(12.1mg,　0.12mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(20g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(20g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(３０)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H,　s,　－CH 3 ),　2.35(1H,　t,－OH),　3.38(6H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-3.91(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.07(1H,　dd,　－CH 2 O－),　4.14(1H,　dd,　－CH 2 O－),　4.68　(2H,　dd,　－CH 2 OH),　4.94(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.15(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.96(1H,　s,　－CH<),　6.77(1H,　s,　arom.H),　6.97(2H,　d,　arom.H),　7.04(1H,　s,　arom.H),　7.50(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn):　39,110
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
（実施例４－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(３０)の化合物(250mg,　0.00625mmol)およびジクロロメタン(3.6g)を仕込み、溶解後、ピリジン(11.9mg,　0.15mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(20.3mg,　0.10mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(2.5g)を用いて水洗を繰り返し、一部の不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(9mg)を添加した酢酸エチル(45g)に残渣を溶解し、ヘキサン(33g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(9mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(33g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(３１)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H,　s,　－CH 3 ),　3.38(6H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-3.91(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.07(1H,　dd,　－CH 2 O－),　4.14(1H,　dd,　－CH 2 O－),　4.94(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.16(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.35(1H,　d,　－CH 2 OCO－),　5.98(1H,　s,　－CH<),　6.87(1H,　s,　arom.H)　6.94(2H,　d,　arom.H),　7.11(1H,　s,　arom.H),　7.26-7.29(2H,　m,　arom.H),　7.52(2H,　d,　arom.H),　8.24(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn):　39,456
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
（実施例５－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機およびDean-stark管および冷却管を装備した300mLの4つ口フラスコに日油社製SUNBRIGHT  PTE-200HO(10g,  0.5mmol)、トルエン(30g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(2mg)を仕込み、水をトルエンで共沸除去した。45℃へ冷却し、クロロホルム(50g)を仕込んだ後、25℃まで冷却し、4－ヒドロキシベンズアルデヒド(977mg,  8.0mmol)、および、トリフェニルホスフィン(2.10g,　8.0mmol)を仕込んだ。しばらく攪拌させた後、内温が35℃度を越えないように、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(1.51g,  7.0mmol)を３分割して加えた。25℃にて1時間反応を行った後、メタノール(224mg,  7.0mmol)を添加し、30分攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル(320g)に溶解し、ヘキサン(240g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(64mg)を添加した酢酸エチル(80g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(160g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した。ろ過後に得られた結晶をヘキサン(160g)を用いて結晶洗浄し、ろ過後、減圧乾燥して式(３２)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.41-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　7.03(8H,　d,　arom.H),　7.83(8H,　d,　arom.H),　9.89(4H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
（実施例５－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(３２)の化合物(1.0g,  0.05mmol)、2,4-ビス(ヒドロキシメチル)-p-クレゾール(1.34g,  8mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(45.6mg,  0.24mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(48.4mg,  0.48mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(10g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(10g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(360g)に残渣を溶解し、ヘキサン(264g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(72mg)を添加した酢酸エチル(360g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(264g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(３３)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.27(4H,　t,－OH),　2.36(12H,　s,　－CH 3 ),　3.41-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.68(8H,　dd,　－CH 2 OH),　4.94(4H,　d,　－CH 2 O－),　5.15(4H,　d,　－CH 2 O－),　5.96(4H,　s,　－CH<),　6.77(4H,　s,　arom.H),　6.97(8H,　d,　arom.H),　7.04(4H,　s,　arom.H),　7.50(8H,　d,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
（実施例５－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(３３)の化合物(250mg,  0.0125mmol)およびジクロロメタン(3.6g)を仕込み、溶解後、ピリジン(94.8mg,  1.20mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(161mg,  0.80mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(2.5g)を用いて水洗を繰り返し行い、一部の低分子不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(72mg)を添加した酢酸エチル(360g)に残渣を溶解し、ヘキサン(264g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(72mg)を添加した酢酸エチル(360g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(264g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(３４)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.31(12H,　s,　－CH 3 ),　3.41-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.96(4H,　d,　－CH 2 O－),　5.16(4H,　d,　－CH 2 O－),　5.35(8H,　dd,　－CH 2 OCO－),　5.98(4H,　s,　－CH<),　6.87(4H,　s,　arom.H),　6.94(8H,　d,　arom.H),　7.11(4H,　s,　arom.H),　7.26-7.29(8H,　m,　arom.H),　7.52(8H,　d,　arom.H),　8.24(8H,　d,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
（実施例６－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機およびDean-stark管および冷却管を装備した300mLの4つ口フラスコに日油社製SUNBRIGHT  HGEO-400HO(10g,　0.25mmol)、トルエン(30g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(2mg)を仕込み、水をトルエンで共沸除去した。45℃へ冷却し、クロロホルム(50g)を仕込んだ後、25℃まで冷却し、4－ヒドロキシベンズアルデヒド(977mg,  8.0mmol)、および、トリフェニルホスフィン(2.10g,  8.0mmol)を仕込んだ。しばらく攪拌させた後、内温が35℃度を越えないように、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(1.51g,  7.0mmol)を３分割して加えた。25℃にて1時間反応を行った後、メタノール(224mg,  7.0mmol)を添加し、30分攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル(320g)に溶解し、ヘキサン(240g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(64mg)を添加した酢酸エチル(320g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(160g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した。ヘキサン(160g)を用いて結晶洗浄し、ろ過後、減圧乾燥して式(３５)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
　2.98-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　7.03(16H,　d,　arom.H),　7.83(16H,　d,　arom.H),　9.89(8H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
（実施例６－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(３５)の化合物(1.0g,  0.025mmol)、2,4-ビス(ヒドロキシメチル)-p-クレゾール(1.34g,  8.0mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(45.6mg,  0.24mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(48.4mg,  0.48mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(10g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(10g)を用いて水洗を繰り返し行い、一部の低分子不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(72mg)を添加した酢酸エチル(360g)に残渣を溶解し、ヘキサン(264g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(72mg)を添加した酢酸エチル(360g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(264g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(３６)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.27(8H,　t,－OH),　2.36(24H,　s,　－CH 3 ),　2.98-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.68　(16H,　dd,　－CH 2 OH),　4.94(8H,　d,　－CH 2 O－),　5.15(8H,　d,　－CH 2 O－),　5.96(8H,　s,　－CH<),　6.77(8H,　s,　arom.H),　6.97(16H,　d,　arom.H),　7.04(8H,　s,　arom.H),　7.50(16H,　d,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
（実施例６－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(３６)の化合物(250mg,  0.00625mmol)およびジクロロメタン(3.6g)を仕込み、溶解後、ピリジン(94.8mg,  1.20mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(161.2mg,  0.80mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(2.5g)を用いて水洗を繰り返し行い、一部の低分子不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(72 mg)を添加した酢酸エチル(360g)に残渣を溶解し、ヘキサン(264g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(72mg)を添加した酢酸エチル(360g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(263g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(３７)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.31(24H,　s,　－CH 3 ),　2.98-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.96(8H,　d,　－CH 2 O－),　5.16(8H,　d,　－CH 2 O－),　5.35(16H,　dd,　－CH 2 OCO－),　5.98(8H,　s,　－CH<),　6.87(8H,　s,　arom.H),　6.94(16H,　d,　arom.H),　7.11(8H,　s,　arom.H),　7.26-7.29(16H,　m,　arom.H),　7.52(16H,　d,　arom.H),　8.24(16H,　d,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
（実施例７－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機およびDean-stark管および冷却管を装備した300mLの4つ口フラスコに日油社製SUNBRIGHT  DKH-20T(20g,  1.0mmol)、トルエン(60g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(4mg)を仕込み、水をトルエンで共沸除去した。45℃へ冷却し、クロロホルム(100g)を仕込んだ後、25℃まで冷却し、4－ヒドロキシベンズアルデヒド(977mg,  8.0mmol)、および、トリフェニルホスフィン(2.10g,　8.0mmol)を仕込んだ。しばらく攪拌させた後、内温が35℃度を越えないように、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(1.51g,  7.0mmol)を３分割して加えた。25℃にて1時間反応を行った後、メタノール(224mg,  7.0mmol)を添加し、30分攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル(320g)に溶解し、ヘキサン(240g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(64mg)を添加した酢酸エチル(320g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(160g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した。ヘキサン(160g)を用いて結晶洗浄し、ろ過後、減圧乾燥して式(３８)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.52-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　7.03(4H,　d,　arom.H),　7.83(4H,　d,　arom.H),　9.89(2H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
（実施例７－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(３８)の化合物(1.0g,  0.05mmol)、2,4-ビス(ヒドロキシメチル)-p-クレゾール(672mg,  4.0mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(22.8mg,  0.12mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(24.2mg,  0.24mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(10g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(10g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(36mg)を添加した酢酸エチル(180 g)に残渣を溶解し、ヘキサン(132g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(36mg)を添加した酢酸エチル(180g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(132g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(３９)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.27(2H,　t,－OH),　2.36(6H,　s,　－CH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.68(4H,　dd,　－CH 2 OH),　4.94(2H,　d,　－CH 2 O－),　5.15(2H,　d,　－CH 2 O－),　5.96(2H,　s,　－CH<),　6.77(2H,　s,　arom.H),　6.97(4H,　d,　arom.H),　7.04(2H,　s,　arom.H),　7.50(4H,　d,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
（実施例７－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(３９)の化合物(250mg,  0.0125mmol)およびジクロロメタン(3.6g)を仕込み、溶解後、ピリジン(47.4mg,  0.60mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(80.6mg,  0.40mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(2.5g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(36mg)を添加した酢酸エチル(180g)に残渣を溶解し、ヘキサン(132g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(36mg)を溶解添加した酢酸エチル(180g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(132g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(４０)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.31(6H,　s,　－CH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.96(2H,　d,　－CH 2 O－),　5.16(2H,　d,　－CH 2 O－),　5.35(4H,　dd,　－CH 2 OCO－),　5.98(2H,　s,　－CH<),　6.87(2H,　s,　arom.H),　6.94(4H,　d,　arom.H),　7.11(2H,　s,　arom.H),　7.26-7.29(4H,　m,　arom.H),　7.52(4H,　d,　arom.H),　8.24(4H,　d,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
（比較例１－１）
　温度計、窒素吹き込み管、攪拌機および冷却管を装備した50mLの三つ口フラスコに3-ヒドロキシベンズアルデヒド（2.00g,  16.4mmol）、オルトギ酸トリメチル（3.48g,  32.8mmol）、メタノール（17g）を仕込み、pトルエンスルホン酸一水和物（0.312mg,  1.64mmol）を加えて25℃にて2時間反応を行った。水酸化ナトリウムを加えてしばらく撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタンに溶解し、5wt%炭酸水素ナトリウム水溶液、25wt%食塩水の順で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧留去して式(４１)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準TMS);　δ(ppm):
3.33(6H,　s,　-OCH 3 ),　5.35(1H,　s,　-CH<),　6.81(1H,　d,　arom.H),　6.95(1H,　d,　arom.H),　7.23-7.26(1H,　m,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
（比較例１－２）
　温度計、窒素吹き込み管、攪拌機および冷却管を装備した50mLの三つ口フラスコに文献（Freeman,  J.  H.;  JAm. Chem.  Soc.  1952,  74,  6257-6260）に従い合成した2,4-ジ（ヒドロキシメチル）フェノール（50.0mg,  0.324mmol）、式（４１）の化合物（217mg,  1.29mmol）、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール（7.14mg,　0.0324mmol）、無水硫酸ナトリウム（1g）およびシクロペンチルメチルエーテル（10g）を仕込み、p-トルエンスルホン酸一水和物（4.10mg,  0.0212mmol）を加えて40℃にて2時間反応を行った。N-メチルモルホリンを加えてしばらく撹拌した後、濾過を行った。10wt%食塩水で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧留去して式(４２)の化合物を得た。
1H-NMR(d6-DMSO,　内部標準TMS);　δ(ppm):
4.42(2H,　d,　-CH 2 OH),　4.93(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.10(1H,　t,　-CH2OH),　5.15(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.01(1H,　s,　-CH<),　6.80-7.21(7H,　m,　arom.H),　9.53(1H,　bs,　>C-OH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
（比較例１－３）
　温度計、窒素吹き込み管、攪拌機および冷却管を装備した50mLの三つ口フラスコに式（４２）の化合物（37.0mg,  0.141mmol）、日油社製ME-200MS（α－メチル－ω－［（メチルスルホニル）オキシ］ポリ(オキシエチレン）,705mg,  0.0353mmol）、炭酸カリウム（97.0mg,　0.705mmol）およびアセトニトリル（3.5g）を仕込み、80℃にて4時間反応を行った。濾過後、溶媒を減圧留去し、残渣をジクロロメタンに溶解した。10wt%食塩水で洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧留去し、残渣をトルエン（50g）に溶解した。ヘキサン（50g）を添加して晶析を行い、濾過後、減圧乾燥して式(４３)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　-OCH 3 ),　3.52-4.18(m,　-(OCH 2 CH 2 )n-),　4.62(2H,　s,　-CH 2 OH),　4.98(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.18(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.95(1H,　s,　-CH<),　6.87-7.34(7H,　m,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
（比較例１－４）
　温度計、窒素吹き込み管、攪拌機および冷却管を装備した50mLの三つ口フラスコに式（４３）の化合物（300mg,  0.0150mmol）、炭酸ジ(N-スクシンイミジル)（46.0mg,  0.180 mmol）、トリエチルアミン（21.0mg,  0.208mmol）およびジクロロメタン（5g）を仕込み、25℃にて12時間反応を行った。濾過後、5wt%食塩水で洗浄し、有機層の溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル（6g）に溶解し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過を行った。酢酸エチル(44g)を加えた後、ヘキサン（50g）を添加して晶析を行い、濾過後、減圧乾燥して式(４４)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準TMS);　δ(ppm):
2.85(4H,　s,　-COCH 2 CH 2 CO-),　3.38(3H,　s,　-OCH 3 ),　3.52-4.18(m,　-(OCH 2 CH 2 )n-),　5.00(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.18(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.25(2H,　s,　-CH 2 OCO-),　5.97(1H,　s,　-CH<),　6.96-7.35(7H,　m,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
（実施例８－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２０)の化合物(1.0g,  0.05mmol)、文献（Freeman,　J.  H.;  JAm.  Chem.  Soc.  1952,  74,　6257-6260）に従い合成した2,4-ジ（ヒドロキシメチル）フェノール(336mg,  2.0mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(11.4mg,  0.06mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(12.1mg,  0.12mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(10g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(10g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(４５)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.62(2H,　s,　-CH 2 OH),　5.00(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.18(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.25(2H,　s,　-CH 2 OCO-),　5.97(1H,　s,　-CH<),　6.96-7.35(7H,　m,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
（実施例８－２）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(４５)の化合物(250mg,  0.0125mmol)およびジクロロメタン(3.6g)を仕込み、溶解後、ピリジン(23.7mg,  0.30mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(40.3mg,  0.20mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(2.5g)を用いて水洗を繰り返し、一部の不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(４６)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.62(2H,　s,　-CH 2 OH),　5.00(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.18(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.25(2H,　s,　-CH 2 OCO-),　5.97(1H,　s,　-CH<),　6.96-7.35(11H,　m,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
（実施例９－１）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機およびDean-stark管および冷却管を装備した300mLの4つ口フラスコに日油社製SUNBRIGHT  MEH-40T(40g,  2.0mmol)、トルエン(120g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(8mg)を仕込み、水をトルエンで共沸除去した。45℃へ冷却し、クロロホルム(200g)を仕込んだ後、25℃まで冷却し、2－ヒドロキシベンズアルデヒド(977mg,  8.0mmol)、および、トリフェニルホスフィン(2.10g,　8.0mmol)を仕込んだ。しばらく攪拌させた後、内温が35℃度を越えないように、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(1.51g,  7.0mmol)を３分割して加えた。25℃にて1時間反応を行った後、メタノール(224mg,  7.0mmol)を添加し、30分攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸エチル(320g)に溶解し、ヘキサン(240g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(64mg)を添加した酢酸エチル(320g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(160g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した。ヘキサン(160g)を用いて結晶洗浄し、ろ過後、減圧乾燥して式(４７)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　9.89(1H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
（実施例９－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した50mLの3つ口フラスコに式(４７)の化合物(1.0g,  0.05mmol)、文献（Freeman,　J.  H.;  JAm.  Chem.  Soc.  1952,  74,　6257-6260）に従い合成した2,4-ジ（ヒドロキシメチル）フェノール(336mg,  2.0mmol)、テトラヒドロフラン(5.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(1.1mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(1.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(11.4mg,  0.06mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(12.1mg,  0.12mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、クロロホルム(10g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(10g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析する操作を繰り返し行い、低分子不純物を除去した後、減圧乾燥して式(４８)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.96(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.16(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.25(2H,　dd,　－CH 2 OH),　5.97(1H,　s,　-CH<),　6.96-7.35(7H,　m,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
（実施例９－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(４８)の化合物(250mg,  0.0125mmol)およびジクロロメタン(3.6g)を仕込み、溶解後、ピリジン(23.7mg,  0.30mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(40.3mg,  0.20mmol)を仕込んで、25℃にて3時間反応を行った。pH12の20％食塩水(2.5g)を用いて水洗を繰り返し、一部の不純物を除去した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に残渣を溶解し、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行った後、吸引ろ過して結晶を得た。さらに、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(18mg)を添加した酢酸エチル(90g)に得られた結晶を溶解後、ヘキサン(66g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(４９)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.96(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.16(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.35(2H,　dd,　－CH 2 OCO－),　5.97(1H,　s,　-CH<),　6.96-7.35(11H,　m,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
（実施例１０）
　０.1Mリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH8.5)を用い、β-アラニンの20mg/mL緩衝溶液を調製した。温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２２)の化合物(70mg,  0.0035mmol)およびβ-アラニンの20mg/mL緩衝溶液(1.5g)を仕込み、溶解後、25℃にて6時間反応を行った。食塩(500mg)を溶解させた後、クロロホルム(3.0g)を用いて抽出を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。酢酸エチル(45g)を用いてろ液を希釈後、ヘキサン(33g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(５０)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H,　s,　－CH 3 ),　2.48(2H,　t,　－CH 2 COOH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.39-3.45(2H,　m,　－CH 2 NH－),　3.52-4.17(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.92(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.08(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.15(2H,　dd,　－CH 2 OCONH－),　5.96(1H,　s,　－CH<),　6.79(1H,　s,　arom.H),　6.96(2H,　d,　arom.H),　7.04(1H,　s,　arom.H),　7.50(2H,　d,　arom.H),
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
（実施例１１）
　０.1Mリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH8.5)を用い、β-アラニンの20mg/mL緩衝溶液を調製した。温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２５)の化合物(70mg,  0.0035mmol)およびβ-アラニンの20mg/mL緩衝溶液(1.5g)を仕込み、溶解後、25℃にて6時間反応を行った。食塩(500mg)を溶解させた後、クロロホルム(3.0g)を用いて抽出を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。酢酸エチル(45g)を用いてろ液を希釈後、ヘキサン(33g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(５１)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H,　s,　－CH 3 ),　2.50(2H,　t,　－CH 2 COOH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.25(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　3.41-3.45(2H,　m,　－CH 2 NH－),　4.91(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.08(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.14(2H,　dd,　－CH 2 OCONH－),　5.94(1H,　s,　－CH<),　6.79(1H,　s,　arom.H),　7.03-7.06(2H,　m,　arom.H),　7.30-7.34(2H,　m,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
（実施例１２）
　０.1Mリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH8.5)を用い、β-アラニンの20mg/mL緩衝溶液を調製した。温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(２８)の化合物(14 mg,  0.0072mmol)およびβ-アラニンの20mg/mL緩衝溶液(3.0g)を仕込み、溶解後、25℃にて6時間反応を行った。食塩(750mg)を溶解させた後、クロロホルム(4.5g)を用いて抽出を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。酢酸エチル(45g)を用いてろ液を希釈後、ヘキサン(33g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(５２)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H,　s,　－CH 3 ),　2.47(2H,　t,　－CH 2 COOH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.37-3.43(2H,　m,　－CH 2 NH－),　3.52-4.21(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.89(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.05(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.14(2H,　dd,　－CH 2 OCONH－),　6.22(1H,　s,　－CH<),　6.52-7.57(5H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
（比較例２）
　０.１Mリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH8.5)を用い、β-アラニンの20mg/mL緩衝溶液を調製した。温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した50mLの3つ口フラスコに式(４４)の化合物(143mg,  0.0072mmol)およびβ-アラニンの20mg/mL緩衝溶液(3.0g)を仕込み、溶解後、25℃にて6時間反応を行った。食塩(750mg)を溶解させた後、クロロホルム(4.5g)を用いて抽出を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。酢酸エチル(45g)を用いてろ液を希釈後、ヘキサン(33g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(５３)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.47(2H,　t,　－CH 2 COOH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.37-3.43(2H,　m,　－CH 2 NH－),　3.52-4.21(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.89(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.05(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.14(2H,　dd,　－CH 2 OCONH－),　6.22(1H,　s,　－CH<),　6.52-7.57(7H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
（分解性試験）
　式(５０)、(５１)、(５２)および(５３)の化合物(20mg)をそれぞれpD 7.4のリン酸ナトリウム重水緩衝液(0.7mL)に溶解後、40℃の恒温槽で静置し、任意のタイミングでNMR測定を行った。図1は、静置0時間のβアラニン付加体量を100%とした時の任意のタイミングにおけるβアラニン付加体量を表す。グラフの近似式をもとに計算式　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000082
（ｌｎはネイピア数を底とする対数であり、λは近似式中のネイピア数の冪指数と－１の積である。）
から算出した半減期（ｔ１／２）は、式(５０)の化合物は3.6日、式(５１)の化合物は31.5日、式(５２)の化合物は0.55日、式(５３)の化合物は231日であり、式（５０）、（５１）および（５２）で表される本発明の化合物は先行発明である式（５３）で表される特許文献３に例示の化合物と比較して生理条件下で目的とした半減期を有することが示された。
（実施例１３）
　式(２２)の化合物を用い、RNase  A（Roche製、 RNase  A  from  bovine　pancreas、Mw＝13,700）の修飾を行った。0.1Mホウ酸緩衝液（ｐＨ＝8.5）を用い、RNase  Aの10mg/mL緩衝溶液を調製し、RNase  Aの10mg/mL緩衝溶液(636.3　μＬ)および0.1Mホウ酸緩衝液(863.7　μＬ)を混合後、式（２２）の化合物(6.0mg)を加え、20℃で20時間反応を行った。反応溶液をフィルターろ過後、下記条件にて陽イオン交換カラムを用いたHPLC測定を実施した。ＵＶにて溶出液をモニターしながら分取し、式（２２）の化合物が1か所修飾された純度96.1％のmono  PEG  RNase  Aを得た。図2は分取したmono  PEG  RNase  AのHPLC測定結果である。
・ＨＰＬＣ装置：Thermo Ultimate3000
・カラム：TSKgel SP-5PW（7.5x75mm,  10um；  東ソー株式会社）
・流速：1mL／分
・分析時間：25分(平衡化含む)
・カラム温度：25℃
・注入量：20　μＬ
・検出器：PDA（測定波長：  280nm）
・移動相Ａ：5mM  リン酸ナトリウム緩衝液  (pH8.5)
・移動相Ｂ：5mM  リン酸ナトリウム緩衝液＋0.5mol/L  NaCl  (pH8.5)
・グラジエントプログラム(A/B)：100/0(-15分)→100/0(0分)→33/67(10分)
（実施例１４－１）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した4つ口フラスコに日油社製 ME-200MS(α-メチル-ω-[(メチルスルホニル)オキシ]ポリ(オキシエチレン), 10g,  0.5mmol)、3-メチル-4-ヒドロキシベンズアルデヒド(272mg, 2mmol)、炭酸カリウム(0.69g, 5mmol)およびアセトニトリル(50g)を仕込み80℃にて6時間反応を行った。反応後、ろ過、濃縮し、ジクロロメタン(80g)に再溶解した。その後、1重量%の炭酸カリウムおよび10重量%の食塩を含む水溶液を加え、窒素雰囲気下、25℃で10分間撹拌した。撹拌後、10分間静置し、有機層を回収した。回収した有機層に硫酸マグネシウムを加え窒素雰囲気下、25℃で10分間撹拌した後、吸引ろ過した。得られたろ液を濃縮した後、酢酸エチルに溶解し、ヘキサンを加えて窒素雰囲気下、25℃で結晶を析出させた。析出した結晶を吸引ろ過で回収し、減圧乾燥して式（５４）の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H, s,　－CH 3 ),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　6.93(1H,　d,　arom.H),　7.69(2H,　d,　arom.H),　9.85(1H,　s,　 －CHO)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
（実施例１４－２）
　温度計、窒素吹込み管、撹拌機および冷却管を装備した3つ口フラスコに式(５４)の化合物(3.0g,　0.15mmol)、2,4-ビス(ヒドロキシメチル)-p-クレゾール(1.0g,　6.0mmol)、テトラヒドロフラン(15.0g)および2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(3.3mg)を仕込み、溶解後、モレキュラーシーブ5A(3.0g)およびp-トルエンスルホン酸一水和物(34.2mg,　0.18mmol)を加えて、40℃にて4時間反応を行った。N-メチルモルホリン(36.4mg, 0.36 mmol)を加えてしばらく攪拌し、ろ過後、トルエン(33.0g)を用いてろ液を希釈した。pH12の20％食塩水(30g)を用いて水洗を繰り返し行った後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を減圧留去した。2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾールを添加したトルエンに残渣を溶解し、ヘキサンを添加して晶析を行った後、吸引ろ過し、減圧乾燥して式(５５)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.23(3H,　s,　－CH 3 ),　2.28(3H,　s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.62(2H,　s,　-CH 2 OH),　4.95(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.16(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.92(1H,　s,　-CH<),　6.8-7.3(5H, arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
（実施例１４－３）
　温度計、窒素吹込み管および撹拌機を装備した3つ口フラスコに式(５５)の化合物(500mg,　0.025mmol)、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(0.5mg)およびトルエン(6.0g)を仕込み、溶解後、トリエチルアミン(38mg,　0.375mmol)およびp-ニトロフェニルクロロホルメート(50.4mg,　0.25mmol)を仕込んで、60℃にて3時間反応を行った。反応後、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール(20mg)を添加した酢酸エチル(100g)とアセトニトリル(1.25g)の混合溶媒で希釈し、ヘキサン(50g)を添加して結晶を析出させた後、吸引ろ過して結晶を得た。得られた結晶を減圧乾燥して式(５６)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.23(3H,　s,　－CH 3 ),　 2.31(3H,　s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.24(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.96(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.15(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.34(2H,　dd,　－CH 2 OCO－),　5.96(1H,　s,　－CH<),　6.8-7.4(5H, arom.H),　　8.23(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn)：20,223
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
（実施例１５－１）
　実施例１４－１の3-メチル-4-ヒドロキシベンズアルデヒドの代わりに4-ヒドロキシ-3,5-ジメチルベンズアルデヒド(300mg,　2.0mmol)を用いた以外は同様にして、式（５７）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.36(6H,　s),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　7.54(2H,　s,　arom.H),　9.88(1H,　s,　－CHO)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
（実施例１５－２）
　実施例１４－２の式（５４）の化合物の代わりに式（５７）の化合物(3.0g,　0.15mmol)を用いた以外は同様にして、式（５８）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H, s,　－CH 3 ), 2.36(6H, s), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.68(2H,　s,　-CH 2 OH),　4.95(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.16(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.89(1H,　s,　-CH<),　6.8-7.3(4H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
（実施例１５－３）
　実施例１４－３の式（５５）の化合物の代わりに式（５８）の化合物(500mg,　0.025mmol)を用いた以外は同様にして、式（５９）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H,　s,　－CH 3 ),　2.36(6H, s),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.68(2H,　s,　-CH 2 O-),　4.95(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.16(1H,　d,　-CH 2 O-),　5.89(1H,　s,　-CH<),　6.8-7.3(4H,　arom.H), 8.23(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn)：20,072
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
（実施例１６－１）
　実施例１４－１の3-メチル-4-ヒドロキシベンズアルデヒドの代わりに2-ヒドロキシベンズアルデヒド(244mg,　2.0mmol)を用いた以外は同様にして、式（６０）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　6.9-7.8(4H,　arom.H),　10.52(1H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
（実施例１６－２）
　実施例１４－２の式（５４）の化合物の代わりに式（６０）の化合物(3.0g,　0.15mmol)を用いた以外は同様にして、式（６１）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H, s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.49(1H,　d,　-CH 2 OH), 4.78(1H,　d,　-CH 2 OH),　4.99(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.19(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.32(1H,　s,　-CH<),　6.8-7.7(6H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
（実施例１６－３）
　実施例１４－３の式（５５）の化合物の代わりに式（６１）の化合物(500mg,　0.025mg)を用いた以外は同様にして、式（６２）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H,　s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.22(2H,　m,　-CH 2 O-),　4.95(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.16(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.37(1H,　s,　-CH<),　6.8-7.3(8H,　arom.H),　8.23(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn)：19,942
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
（実施例１７－１）
　実施例１４－１の3-メチル-4-ヒドロキシベンズアルデヒドの代わりに2-ヒドロキシ-6メトキシベンズアルデヒド(304mg,　2.0mmol)を用いた以外は同様にして、式（６３）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　6.6-7.8(3H,　arom.H),　10.53(1H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
（実施例１７－２）
　実施例１４－２の式（５４）の化合物の代わりに式（６３）の化合物(3.0g,　0.15mmol)を用いた以外は同様にして、式（６４）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H,　s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.49(1H,　d,　-CH 2 OH),　4.78(1H,　d,　-CH 2 OH),　4.90(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.15(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.8-7.7(5H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
（実施例１７－３）
　実施例１４－３の式（５５）の化合物の代わりに式（６４）の化合物(500mg,　0.025mmol)を用いた以外は同様にして、式（６５）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.30(3H,　s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.22(2H,　m,　-CH 2 O-),　4.95(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.16(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.6-7.1(5H,　arom.H),　8.23(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn)：20,915
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
（実施例１８－１）
　実施例１７－１の日油社製ME-200MSの代わりに日油社製ME-050MS(2.5g,　0.5mmol)を用いた以外は同様にして、式（６６）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　6.6-7.8(3H,　arom.H),　10.53(1H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
（実施例１８－２）
　実施例１７－２の化合物（６３）の代わりに式（６６）の化合物(0.75g,　0.15mmol)を用いた以外は同様にして、式（６７）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H,　s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.49(1H,　d,　-CH 2 OH), 4.78(1H,　d,　-CH 2 OH),　4.90(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.15(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.8-7.7(5H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
（実施例１８－３）
　実施例１７－３の化合物（６４）の代わりに式（６７）で表される化合物(125mg,　0.025mmol)を用いた以外は同様にして式（６８）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.30(3H, s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.22(2H,　m,　-CH 2 O-),　4.95(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.16(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.6-7.1(5H,　arom.H),　8.23(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn)：5,400
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
（実施例１９－１）
　実施例１７－１の日油社製ME-200MSの代わりに日油社製ME-020MS(1g,　0.5mmol)を用いた以外は同様にして、式（６９）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　6.6-7.8(3H,　arom.H),　10.53(1H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
（実施例１９－２）
　実施例１７－２の化合物（６３）の代わりに式（６９）の化合物(300mg,　0.15mmol)を用いた以外は同様にして、式（７０）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.29(3H,　s,　－CH 3 ), 3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.49(1H,　d,　-CH 2 OH), 4.78(1H,　d,　-CH 2 OH),　4.90(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.15(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.8-7.7(5H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
（実施例１９－３）
　実施例１７－３の化合物（６４）の代わりに式（７０）で表される化合物(50mg,　0.025mmol)を用いた以外は同様にして式（７１）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.30(3H,　s,　－CH 3 ),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH2CH2)n－),　4.22(2H,　m,　-CH 2 O-),　4.95(1H,　d,　-CH 2 OCH<),　5.16(1H,　d,　-CH 2 O-),　6.6-7.1(5H,　arom.H),　8.23(2H,　d,　arom.H)
数平均分子量(Mn)：2,615
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
（実施例２０－１）
　実施例１４－１の3-メチル-4-ヒドロキシベンズアルデヒドの代わりに4-ヒドロキシ-2,6ジメトキシベンズアルデヒド(364mg,　2.0mmol)を用いた以外は同様にして、式（７２）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.23(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　6.12(2H,　arom.H),　10.35(1H,　s,　－COH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
（実施例２０－２）
　実施例１４－２の式（５４）の化合物の代わりに式（７２）の化合物(3.0g,　0.15mmol)を用いた以外は同様にして、式（７３）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H,　s,　－CH 3 ),　2.84(1H,　dd,－OH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.47(1H,　dd,　－CH 2 OH),　4.75(1H,　dd,　－CH 2 OH),　4.98(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.17(1H,　d,　－CH 2 O－),　6.20(1H,　s,　－CH<),　6.57-6.55(2H,　m,　arom.H),　6.78(1H,　s,　arom.H),　6.97(1H,　s,　arom.H),　7.58(2H,　d,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
（実施例２０－３）
　実施例１４－３の式（５５）の化合物の代わりに式（７３）の化合物(500mg,　0.025mmol)を用いた以外は同様にして、式（７４）で表される化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.31(3H,　s,　－CH 3 ),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)n　OCH 3 ),　3.52-4.17(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.93(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.18(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.33(2H,　dd,　－CH 2 OCO－),　6.26(1H,　s,　－CH<),　6.52-6.54(2H,　m,　arom.H),　6.87(1H,　s,　arom.H),　7.10(1H,　s,　arom.H),　7.26-7.27(2H,　m,　arom.H),　7.59(1H,　d,　arom.H),　8.22(2H,　d,　arom.H)　
数平均分子量(Mn):20,560
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
（実施例２１）
　０.１Mリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH8.5)を用い、β-アラニンの20mg/mL緩衝溶液を調製した。式(５６)の化合物(74mg,　0.0037mmol)をβ-アラニンの20mg/mL緩衝溶液(1.5mL)に溶解し、25℃にて6時間反応を行った。反応後、20重量％食塩を含む０．１Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)で希釈し、クロロホルム(3g)を用いて抽出を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過した。酢酸エチル(45g)を用いてろ液を希釈後、ヘキサン(33g)を添加して晶析を行い、ろ過後、減圧乾燥して式(７５)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.23(3H,　s,　－CH 3 ), 2.28(3H,　s,　－CH 3 ),　2.47(2H,　t,　－CH 2 COOH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.37-3.43(2H,　m,　－CH 2 NH－),　3.52-4.21(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.89(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.05(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.14(2H,　dd,　－CH 2 OCONH－),　5.93(1H,　s,　－CH<),　6.8-7.7(5H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
（実施例２２）
　実施例２１の式（５６）の化合物の代わりに式（５９）の化合物(74mg,　0.0037mmol)を用いた以外は同様にして、式(７６)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H,　s,　－CH 3 ), 2.31(6H,　s),　2.52(2H,　t,　－CH 2 COOH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ), 3.52-4.21(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－), 3.93-3.97(2H,　m,　－CH 2 NH－),　4.92(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.09(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.13(2H,　dd,　－CH 2 OCONH－),　5.89(1H,　s,　－CH<),　6.8-7.2(4H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
（実施例２３）
　実施例２１の式（５６）の化合物の代わりに式（６２）の化合物(74mg,　0.0037mmol)を用いた以外は同様にして、式(７７)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H,　s,　－CH 3 ),　2.43(2H,　t,　－CH 2 COOH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.37-3.43(2H,　m,　－CH 2 NH－),　3.52-4.21(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.92(1H,　d,　－CH 2 O－),　4.97(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.19(2H,　dd,　－CH 2 OCONH－),　6.32(1H,　s,　－CH<),　6.8-7.7(6H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
（実施例２４）
　実施例２１の式（５６）の化合物の代わりに式（６５）の化合物(74mg,　0.0037mmol)を用いた以外は同様にして、式(７８)の化合物を得た。
1H-NMR(CDCl3,　内部標準　TMS);　δ(ppm):
2.28(3H,　s,　－CH 3 ),　2.47(2H,　t,　－CH 2 COOH),　3.38(3H,　s,　－(OCH2CH2)nOCH 3 ),　3.52-4.21(m,　－(OCH 2 CH 2 )n－),　4.89(1H,　d,　－CH 2 O－),　5.03(2H,　dd,　－CH 2 OCONH－), 5.14(1H,　d,　－CH 2 O－),　6.53(1H,　s,　－CH<),　6.8-7.7(5H,　arom.H)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
（分解性試験２）
　式(７５)、(７６)、(７７)および(７８)の化合物(20mg)をそれぞれpD7.4のリン酸ナトリウム重水緩衝液(0.7mL)に溶解後、40℃の恒温槽で静置し、任意のタイミングでNMR測定を行った。図3は、静置0時間のβアラニン付加体量を100%とした時の任意のタイミングにおけるβアラニン付加体量を表す。
　グラフの近似式をもとに分解性試験に記載した計算式［数１］から算出した半減期（ｔ１／２）は、式(７５)の化合物は2.3日、式(７６)の化合物は30.1日、式(７７)の化合物は23.1日、式(７８)の化合物は1.4日であり、本発明の化合物は、先行発明である式（５３）で表される特許文献３に例示の化合物と比較して、生理条件下で目的とした半減期を有することが示された。
（比較例３）
　日油社製ＳＵＮＢＲＩＨＧＴ　ＭＥＮＰ－２０Ｔ(22.5mg,　1.13mmol)および国際公開２０１９／２０３９０４号でＴＮＦα阻害活性を有し、かつＰＥＧ化によりＴＮＦα阻害活性が低下することが報告されている配列番号１で表されるアプタマーの５’末端にＣ６アミノリンカーを持つ化合物ＮＨ２－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）(1.8mg, 141.8nmol)を１００ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）１２５μLに溶解し、窒素雰囲気下、40℃で24時間反応させた。反応後、反応溶液をフィルターろ過後、下記条件にて逆相カラムを用いたHPLC測定を実施した。260nmにて溶出液をモニターしながら分取した溶液を限外ろ過にてＰＢＳに置換し、純度98.9％、ＧＰＣのピークトップ分子量33,101の式（２８）の化合物がＡｐｔ－ＴＮＦαと１：１のモル比で結合したＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）を得た。図5（Ａ）は分取したＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）のHPLC測定結果である。
・ＨＰＬＣ装置：Thermo Ultimate3000
・カラム：Xbridge Oligonucleotide BEH C18 (4.6x50mm,　2.5um,　Waters社)
・流速：1mL／分
・分析時間：25分(平衡化含む)
・カラム温度：35℃
・注入量：30μＬ
・検出器：UV（測定波長：  260nm）
・移動相Ａ：25mMヘキサフルオロイソプロパノール-15mMジブチルアミン/水
・移動相Ｂ：25mMヘキサフルオロイソプロパノール-15mMジブチルアミン/メタノール
・グラジエントプログラム(A/B)：70/30(0分)→10/90(20分)→10/90(30分)
（実施例２５）
　比較例３の日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＭＥＮＰ－２０Ｔの代わりに式（２８）の化合物(22.5mg,　1.13mmol)を用いた以外は同様にして、純度84.7％、ＧＰＣのピークトップ分子量30,632の式（２８）の化合物がＡｐｔ－ＴＮＦαと１：１のモル比で結合した２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）を得た。図5（Ｂ）は分取した２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）のＨＰＬＣ測定結果である。
（ＰＥＧ化アプタマーのＴＮＦα阻害活性の評価）
　生細胞濃度が４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＮＦ－ｋＢ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ，　ＨＥＫ２９３細胞（ＢＰＳ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）を９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに８０μＬ添加し、２２時間培養した。その後、それぞれのウェルに５μＭ　ＮＨ２－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）溶液、５００ｎＭ　ＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）溶液または５００ｎＭ　２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）溶液を独立したウェルそれぞれに１０μＬ添加した。添加後、５０ｎｇ／ｍＬ　ＴＮＦα溶液を１０μＬずつ添加し、０．５時間培養後、ルシフェラーゼ活性をＢｉｏ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて測定した。
　活性は、ＴＮＦα処理なしの系を０％、ＴＮＦα処理ありの系を１００％として相対値として算出した。
　結果は、平均値±標準誤差として表され、Ｐ値はスチューデントのｔ検定によって計算し、両側Ｐ値が０．０５未満であることを統計的に有意差があると定義した。
　評価の結果、ＮＨ２－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）および２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）ではＴＮＦα阻害活性を確認できた一方で、ＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）ではＴＮＦα阻害活性を確認できなかった。このことから、本発明の２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）は既存技術であるＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）と比較して、生理機能性物質を徐放でき、薬理活性を改善し得ることが示された。
　図６はＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）、２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）およびＮＨ２－Ｃ６－（Ａｐｔ－ＴＮＦα）を用いたＴＮＦα阻害活性の評価結果である。
（比較例４）
　０．２Mホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）に溶解した２９ｍｇ／ｍＬインスリン溶液０．２５ｍＬをアセトニトリルに溶解した１００ｍｇ／ｍＬの日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＭＥＮＰ－２０Ｔ溶液０．２５ｍＬに添加し、窒素雰囲気下、２５℃で３時間反応させた。反応後、限外ろ過により溶液を１０ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ９．０）に交換した後、下記条件にて陰イオン交換クロマトグラフィーによりＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンを得た。図７（Ａ）は精製したＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンのＨＰＬＣ分析結果である。
・ＨＰＬＣ装置：Nexera(株式会社島津製作所)
・カラム：Asahipack　ES-502N　7C　(7.5x100mm,　9um,　昭和電工)
・流速：1mL／分
・分析時間：30分
・カラム温度：25℃
・注入量：50μＬ
・検出器：PDA（測定波長：　280nm）
・移動相Ａ：10mMギ酸アンモニウム緩衝液(pH8.5)
・移動相Ｂ：0.25M硫酸アンモニウム含有10mMギ酸アンモニウム緩衝液(pH8.5)
・グラジエントプログラム(A/B)：100/0(0分)→67/33(20分)→0/100(30分)
（実施例２６）
　比較例４の日油社製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＭＥＮＰ－２０Ｔの代わりに式（２８）の化合物を用いた以外は同様にして２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンを得た。図７（Ｂ）は精製した２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンのＨＰＬＣ分析結果である。
（ＰＥＧ化インスリンの安定性評価）
　比較例４で調製した０．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリン１００μＬまたは実施例２６で調製した０．５ｍｇ／ｍＬの２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリン１００μＬを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００μＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μＬ、１００ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬまたは１００ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ９．０）１００μＬと混合した後、２５℃で静置し、任意のタイミングでＨＰＬＣ分析を行った。
　ＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンは、いずれの測定ｐＨにおいても時間経過に伴うＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンの減少は確認できなかった。一方で、２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンは、すべての測定ｐＨにおいて時間経過にともない２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンが減少し、特にｐＨ６．０では減少速度が大きく、インスリンの顕著な増加が確認された。以上から、本発明の２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリンは時間経過によりアセタールが加水分解して、インスリンを放出することが示された。さらに、アセタール構造の加水分解は中性～塩基性条件で抑制できることが示された。
　図８（Ａ）は静置０時間のＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリン量を１００％とした時の任意のタイミングにおけるＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリン量を表し、図８（Ｂ）は２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリン量を１００％とした時の任意のタイミングにおける２ＭＰＥＧ（２０ｋ）－ＯＣＯ－ＮＨ－インスリン量を表す。
　本発明のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体は、生理的条件下でアセタール構造が加水分解し、生体機能性分子を徐々に放出することが可能となり、ポリオキシエチレン誘導体で修飾された生体機能性分子の薬理作用を改善し得る。
　本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　本出願は、２０２２年４月２２日出願の日本特許出願（特願２０２２－０７０６６９）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
 

Claims (6)

  1. 　下記の式（１）、式（２）、式（３）または式（４）で表され、生理的条件下で開裂することを特徴とする、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    （式（１）、式（２）、式（３）及び式（４）中
    　Ｂ１は水素原子または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）ＯＣ（Ｏ）Ｅ１であり、
    　Ｅ１は脱離基であり、
    　Ｐ１は、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体であり、
    　ｗは１～８の整数であり、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ１１は，それぞれ独立して、炭素数１～１０の炭化水素基または水素原子であり、
    　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立して、電子求引性置換基、電子供与性置換基または水素原子であり、
    　ｍは０または１である。）
  2. 　ｍが０であり、Ｒ１およびＲ２が水素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ１１がそれぞれ独立して水素原子またはメチル基であることを特徴とする、請求項１に記載のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体。
  3. 　請求項１または２に記載のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体を製造する方法であって、
    　ポリオキシエチレン誘導体とヒドロキシベンズアルデヒド誘導体とをカップリングさせることによって、下記式（５）または式（６）で表されるカップリング生成物を得るカップリング工程、
    　前記カップリング工程後に、酸性条件下で、前記式（５）または前記式（６）で表される前記カップリング生成物を、２位にヒドロキシメチル基を有し、かつ４位または６位に置換基（－ＣＨ＝ＣＢ１）ｍＣ（Ｒ１）（Ｒ２）－ＯＨ（Ｂ１、ｍ、Ｒ１、Ｒ２は前述のとおりである）を有するフェノールと反応させることで、アセタール構造体を得るアセタール化工程、および
    　前記アセタール化工程後に、４位または６位の前記置換基の末端に脱離基構造（－ＯＣ（Ｏ）Ｅ１）を導入する脱離基構造導入工程
    を備えることを特徴とする、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    （式（５）または（６）中、Ｐ１、ｗ、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は前述したとおりである）
  4. 　前記アセタール化工程と、前記脱離基構造導入工程との間に、前記式（５）及び（６）の前記カップリング生成物中の保護基で保護されたアミノ基の脱保護工程、及び前記脱保護工程後に脱保護されたアミノ基に生体機能性分子と反応可能な基を導入する工程を備えていることを特徴とする、請求項３に記載のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体の製造方法。
  5. 　下記の式（７）、式（８）、式（９）または式（１０）で表され、生理的条件下で開裂することを特徴とする、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    （式（７）、式（８）、式（９）及び式（１０）中、
    　Ｂ２は水素原子または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）ＯＣ（Ｏ）ＮＨＤ１であり、
    　Ｄ１は、生体機能性分子に含まれるアミノ基から、カーバメート結合を構成するアミノ基を除いた残基であり、
    　Ｐ２は、脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体、または脱ヒドロキシ基を有するポリオキシエチレン誘導体および生体機能性分子の結合体であり、
    　ｗは１～８の整数であり、
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ１１は、それぞれ独立して、炭素数１～１０の炭化水素基または水素原子であり、
    　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ独立して、電子求引性置換基、電子供与性置換基または水素原子であり、
    　ｍは０または１である。）
  6. 　請求項５に記載のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体を製造する方法であって、
    　請求項１または２記載のアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体と生体機能性分子を、水溶性の有機溶媒が含まれていてもよい中性または塩基性の緩衝液中で反応させるカップリング工程、および
    　前記カップリング工程後の中性または塩基性条件下での精製工程
    を備えることを特徴とする、アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体の製造方法。
PCT/JP2023/015663 2022-04-22 2023-04-19 アセタール型リリーサブルポリオキシエチレン誘導体、その製造方法及びアセタール型リリーサブルポリオキシエチレン結合体 Ceased WO2023204256A1 (ja)

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