WO2023211024A1 - 시험관 진화 기반 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법 - Google Patents

시험관 진화 기반 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법 Download PDF

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    • G—PHYSICS
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    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing hotspot-derived peptide-nucleic acid hybrid molecules based on in vitro evolution.
  • This application claims priority based on Korean Patent Application No. 10-2022-0052389, filed on April 27, 2022, and Korean Patent Application No. 10-2023-0044921, filed on April 5, 2023, All contents disclosed in the specification and drawings of the application are incorporated into this application.
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • hACE2 human angiotensin-converting enzyme 2
  • Viruses, including SARS-CoV-2 mutate to increase transmissibility, enhancing viral transmissibility over time and causing immune evasion. Since SARS-CoV-2 was first reported in 2019, many variants have emerged, with alpha (B.1.1.7), beta (B.1.351), and gamma (P) variants of concern (VOC).
  • the receptor binding domain (RBD) of the spike protein which contributes to specific hACE2 recognition, is known to contain many common mutations. In particular, some positional mutations located in binding hotspots (e.g. N501Y) were found to increase the binding affinity of RBD to the target hACE2, thereby increasing the infectivity of SARS-CoV-2.
  • affinity reagents can be an effective way to avoid viral infection by blocking specific interactions between the virus and host cells.
  • a number of neutralizing affinity reagents have been developed for SARS-CoV-2 to recognize various epitopes of the spike protein, some of which are known to partially overlap with the hACE2 contact surface.
  • the affinity reagent cannot specifically recognize the binding site, which inevitably reduces neutralization efficacy.
  • non-competitive affinity reagents can be administered together, and the US Food and Drug Administration (FDA) has issued emergency use authorization for antibody cocktails such as REGN-COV2 due to the rapid emergence of SARS-CoV-2 variants.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • the present inventors inspired by the improved receptor recognition of virus variants, invented a new creation of a receptor-mimicking synthetic reagent that can strongly interact with the target virus and its variants. Specifically, we focused on peptide motifs of host cell receptors that contribute significantly to the binding free energy at the center of the virus-receptor interface. Without a stable but insoluble transmembrane domain, short hotspot peptides cannot maintain optimal binding ability to target viruses. In this process, it was synergistically integrated with a soluble nucleic acid that could act not only as a structural stabilizer but also as a binding cooperator.
  • Hybrid ligands can be easily prepared by selectively isolating and amplifying aptamer-like scaffolds that maximize hotspot interactions from numerous hotspot peptide-binding random nucleic acids ( ⁇ 10 14 ), which can lead to strong binding to viral variants.
  • HOLD Hotspot-Oriented Ligand Display
  • the present invention was completed by confirming that the hotspot binding hACE2 mimetic had no change in binding ability and maintained binding resistance when recognizing various SARS-CoV-2 variants (Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron). .
  • the object of the present invention is a method for producing a target protein binding peptide-nucleic acid hybrid molecule comprising the following steps:
  • step (b) mixing and cultivating the target protein-coated magnetic beads and the peptide-nucleic acid hybrid of step (a);
  • Another object of the present invention is to provide a peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by the method of the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for neutralizing viruses containing a peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by the method of the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for suppressing or neutralizing a virus, comprising administering the peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by the method of the present invention to an individual in need thereof.
  • the present invention provides a method for preparing a target protein binding peptide-nucleic acid hybrid molecule comprising the following steps:
  • step (b) mixing and cultivating the target protein-coated magnetic beads and the peptide-nucleic acid hybrid of step (a);
  • the production method may be referred to as HOLD (Hotspot-Oriented Ligand Display), which refers to a method for producing a hotspot-derived peptide-nucleic acid hybrid molecule based on in vitro evolution.
  • HOLD Hotspot-Oriented Ligand Display
  • the HOLD can ensure that the peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by the above production method has a strong binding affinity to the RBD due to the synergistic effect between the hotspot peptide and the aptamer scaffold, and in particular, even when mutations occur in the RBD, the peptide-nucleic acid hybrid molecule is Nucleic acid hybrid molecules can maintain excellent binding force.
  • the peptide-nucleic acid hybrid molecule produced by the above manufacturing method is selected as the molecule that can most strongly bind to the RBD region of the virus instead of the receptor, using numerous randomly synthesized nucleic acid libraries based on in vitro evolution technology. It is a molecule.
  • the manufacturing method may be characterized as additionally comprising the following steps, but is not limited thereto:
  • step (d) selectively amplifying and replicating the nucleic acid portion of the peptide-nucleic acid hybrid molecule selected in step (c);
  • step (e) purifying the double-stranded DNA produced in step (d) into single-stranded DNA using nucleic acid hydrolase
  • step (f) preparing a new random nucleic acid library composed of the single-stranded DNA of step (e) and repeating the selection, amplification, and purification processes of steps (a) to (f).
  • the production method may further include the step of inducing 3D folding of the nucleic acid by heat denaturing and cooling the peptide-nucleic acid hybrid after step (a).
  • the hotspot peptide can be placed in the correct position and orientation, and a stable 3D aptamer scaffold can be fabricated that can maintain binding properties similar to or stronger than those of the receptor.
  • the selective amplification of the nucleic acid portion in step (d) is carried out by adding at the 5' end one selected from the group consisting of hexynyl, 5-octadiynyl, and alkyne.
  • Amplification may be performed using a forward primer to which the above functional groups are combined, but is not limited thereto. Since a functional group is attached to the forward primer, all amplified PCR products can be produced with a functional group attached to the 5' end, which allows site-specific binding through a click reaction, but is not limited to this. .
  • the hotspot-derived peptide refers to a peptide residue that is believed to be highly related to binding between a receptor and its target protein. Since the HOLD method of the present invention is not limited to the type of hotspot-derived peptide and can be applied universally, the type of hotspot-derived peptide that can be used is not limited. Therefore, various peptide regions known or to be known in the art to affect the binding between receptors and their target proteins can be used as hotspot peptides. In the present invention, hACE2-derived hotspot peptide or hACE2-derived RBD-binding peptide is used as a preferred embodiment of the hotspot-derived peptide, but is not limited thereto.
  • the hotspot-derived peptide may be an amino acid in the binding site between the receptor and its target protein, and may include all or part of the amino acids involved in the binding site in the target protein sequence; Alternatively, it may be all or part of the amino acids involved in the binding site in the receptor sequence.
  • the hotspot-derived peptide may be a peptide in which any functional group that can be used in a click chemical reaction is bound to the C-terminus or N-terminus of the isolated hotspot-derived peptide, for example, azido lysine, azidobutanoic acid ( Azidobutanoic acid, and at least one selected from the group consisting of Azinoacetic acid, azide, hexynyl, 5-Octadiynyl, and alkyne.
  • any functional group that can be used in a click chemical reaction is bound to the C-terminus or N-terminus of the isolated hotspot-derived peptide, for example, azido lysine, azidobutanoic acid ( Azidobutanoic acid, and at least one selected from the group consisting of Azinoacetic acid, azide, hexynyl, 5-Octadiynyl, and alkyne.
  • It may be a peptide to which a functional group is bound, preferably a peptide with azide bound (tagged) to the C-terminus or N-terminus, and more preferably an azide-tagged LGKGDFR (L351 to R357) peptide. Not limited.
  • the target protein includes a viral envelope protein, a growth factor protein, a cell membrane receptor, an antibody, an antigen protein, a protein region for the virus to bind to the receptor of the host cell, or a receptor-binding domain (RBD) region. It may be a protein, but is not limited thereto.
  • the envelope protein may be selected from the group consisting of spike protein, fiber protein, and envelope glycoprotein, but is not limited thereto.
  • the growth factor protein includes Epidermal growth factor, Fibroblast growth factor, Hepatocyte growth factor, Nerve growth factor, and insulin-like growth factor. It may be, but is not limited to, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived growth factor, or bone morphogenetic protein.
  • the cell membrane receptor may be any receptor to which viral proteins and growth factor proteins bind, and may be an independent receptor present in the cell membrane such as PD-1 and PD-L1, but is not limited thereto.
  • a hotspot peptide-nucleic acid hybrid molecule can be prepared for the development of a coronavirus treatment, and in this case, among the RBD contact residues of the receptor hACE2, seven residues from L351 to R357 (LGKGDFR, SEQ ID NO. 15) Amino acid fragments can be converted into hotspot-derived peptides.
  • the target protein may be a spike protein, preferably the receptor-binding domain (RBD) of the spike protein, but is not limited thereto. Therefore, the prepared hotspot peptide-nucleic acid hybrid molecule can inhibit the interaction between the RBD of SARS-CoV-2 and the hACE2 receptor.
  • an aptamer scaffold refers to a nucleic acid that is linked to a peptide, assists the function of the peptide, and can specifically and strongly bind to a specific molecule.
  • a peptide-supported aptamer scaffold also called a peptide-supported aptamer scaffold, it has a virus neutralizing function by combining with a hotspot-derived peptide, and the hybrid molecule of the peptide and the aptamer scaffold can bind to the target protein.
  • the random nucleic acid library may be a nucleic acid in which all functional groups that can be used in click chemistry are bound to the 5' end, for example, hexynyl, 5-octadiynyl, ), alkyne, Azido lysine, Azidobutanoic acid, and Azinoacetic acid, and at least one functional group selected from the group consisting of azide is combined It includes a single-stranded nucleic acid, preferably a nucleic acid with hexynyl bound to the 5' end, but is not limited thereto. Additionally, the hotspot-derived peptide and the functional group bound to the nucleic acid library can be interchanged. Additionally, the random nucleic acid library may be characterized as containing random nucleic acids having the following structure:
  • the functional groups include hexynyl, 5-octadiynyl, alkyne, Azido lysine, Azidobutanoic acid, Azinoacetic acid, And selected from the group consisting of azide,
  • N is A, T, C or G, and x is an integer from 25 to 100.
  • the length of the random nucleic acid library is minimized to precisely bind to a target protein with a diameter of 10 nm meters or less, and may be a length that satisfies the appropriateness for maximizing the diversity of the library, but specifically, the bases of the random nucleic acid library
  • the sequence numbers are 55 to 130, 55 to 110, 55 to 90, 55 to 80, 60 to 130, 60 to 110, 60 to 90, 60 to 80, 65 to 130, 65 to 110, 65 to 90, 65 to 80. , may be 65 to 75, or 70, but is not limited thereto.
  • x is 25 to 100, 25 to 80, 25 to 60, 25 to 50, 30 to 100, 30 to 80, 30 to 60, 30 to 50, 35 to 100, 35 to 80, 35 to 60, 35 It may be from 50 to 50, 35 to 45, or 40, but is not limited thereto.
  • the forward primer represented by SEQ ID NO: 1 and the reverse primer represented by SEQ ID NO: 2 were used, and the random nucleic acid library prepared by this method includes random nucleic acids with the following structural formula: GGAAGAGATGGCGAC -N 40 -AGCTGATCCTGATGG.
  • the hotspot-derived peptide and the single-stranded nucleic acid may be site-specifically bound by a click reaction, but are not limited thereto.
  • the click reaction may be, but is not limited to, a reaction in which the functional group of a hotspot-derived peptide and the functional group of a nucleic acid are combined within a short period of time by chemical cross-linking or copper-catalyzed cycloaddition.
  • the target protein may be a viral envelope protein, growth factor protein, cell membrane receptor, antibody, or antigen protein, but is not limited thereto.
  • the viral envelope protein may be selected from the group consisting of spike protein, fiber protein, and envelope glycoprotein, but is not limited thereto.
  • the virus includes coronavirus, influenza virus, hepatitis virus, human immunodeficiency virus (HIV), human papillomavirus, herpes virus, Ebolavirus, MERSvirus, Rotavirus, Hantavirus, Monkeypox virus, Adenovirus, Rabies virus, and Norovirus (Norovirus), but is not limited thereto.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HAV human papillomavirus
  • herpes virus Ebolavirus
  • MERSvirus Rotavirus
  • Hantavirus Monkeypox virus
  • Adenovirus Rabies virus
  • Norovirus Norovirus
  • the coronavirus is human coronavirus 229e (HCoV-229E), human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), human coronavirus NL63 (HCoV-NL63, It may be selected from the group consisting of New Haven coronavirus), human coronavirus HKU1, Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-Cov-2), and variants thereof,
  • the SARS-Cov-2 variant may be selected from the group consisting of alpha ( ⁇ ), beta ( ⁇ ), gamma ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and omicron ( ⁇ ) variants, but is not limited thereto.
  • coronavirus corresponds to a species of the virus genus included in the Nidovirus order, Coronaviridae, Coronaviridae, or Torovirinae. Coronaviruses are viruses enveloped in +ssRNA and a helical symmetric nucleopeside. Additionally, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the seventh coronavirus to infect humans so far, the others being human coronavirus 229e (HCoV-229E) and human coronavirus OC43 (HCoV-OC43).
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • SARS-CoV severe acute respiratory syndrome coronavirus
  • HKU human coronavirus HKU1
  • MERS-CoV Middle East respiratory syndrome coronavirus
  • SARS coronavirus a defined binding receptor domain on the spike (S) mediates attachment of the virus to its cellular receptor, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2).
  • ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
  • Some coronaviruses (particularly members of the betacoronavirus subgroup) also have short spike-like proteins called antibody esterases.
  • Coronaviruses can cause viral pneumonia or secondary bacterial pneumonia, and can also cause direct viral bronchitis or secondary bacterial bronchitis.
  • the human coronavirus discovered in 2003 is severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), which causes upper and lower respiratory tract infections.
  • SARS-CoV severe acute respiratory syndrome coronavirus
  • SARS-CoV-2 refers to a new coronavirus, which is an RNA virus and represents a variant of SARS and MERS.
  • SARS-CoV-2 shares approximately 79.7% sequence identity with SARS and approximately 50% with MERS.
  • ACE2 angiotensin
  • the variant of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 has the same meaning as the variant COVID-19 virus.
  • the above mutant viruses are divided into major mutant viruses (VOC, Variant of Concern) and other mutant viruses (VOI, Variant of Interest), and to prevent the use of names of regional origin and to facilitate communication, the Greek alphabet (alpha, beta, Mutant viruses are named (gamma, etc.).
  • the above-mentioned major mutant viruses refer to mutant viruses that have been confirmed to have increased transmissibility or negative epidemiological changes, increased pathogenicity or clinically confirmed changes in disease severity, or reduced effectiveness of diagnostics, vaccines, and treatments.
  • VOC is an omicron variant
  • alpha, beta, gamma, and delta variants were discovered in the UK in September 2020, and its classification system is B.1.1.7.
  • beta ( ⁇ ) variant of SARS-Cov-2 was discovered in South Africa in May 2020, and its classification system is B.1.351.
  • gamma ( ⁇ ) variant of SARS-Cov-2 was discovered in Brazil in November 2020, and its classification system is P.1.
  • delta ( ⁇ ) variant of SARS-Cov-2 was discovered in India in October 2020, and its classification system is B.1.617.2.
  • the omicron (o) variant of SARS-Cov-2 was discovered in many countries in November 2021, and its classification system is B.1.1.529.
  • the peptide-nucleic acid hybrid molecule may satisfy any of the following characteristics, but is not limited thereto: (a) nuclease resistance; and (b) serum stability. Additionally, it can neutralize viruses and provide electrostatic interactions between the RBD of the target protein, but is not limited thereto.
  • the peptide-nucleic acid hybrid molecule can be administered through various administration routes depending on the therapeutic purpose and formulation method, and is preferably administered intravenously, but is not limited thereto.
  • the peptide-nucleic acid hybrid molecule may be, but is not limited to, a hybrid ligand, a hotspot peptide binding aptamer scaffold, a receptor-mimetic hybrid ligand, or an hACE2-mimetic hybrid ligand.
  • the nucleic acid in the peptide-nucleic acid hybrid molecule is combined with a hotspot-derived peptide through a click reaction to produce a peptide-nucleic acid hybrid molecule.
  • the nucleic acid can be isolated in vitro by repeated cycles of selection and amplification from numerous other nucleic acid libraries site-specifically linked to the hotspot peptide, and can be converted into a peptide-nucleic acid hybrid molecule through repeated cycles of selection and amplification. Nucleic acids that can provide high binding affinity can be selected.
  • the nucleic acid can increase the binding affinity to the binding site (RBD) between the receptor of the peptide-nucleic acid hybrid molecule and its target protein, and can structurally stabilize, for example, the hACE2-derived RBD binding peptide, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid may be hexynyl modified ssDNA, an aptamer scaffold, or a hotspot peptide-supported aptamer scaffold, but is not limited thereto.
  • the peptide-nucleic acid hybrid molecule can exhibit excellent binding affinity to RBD even in competition with RBD binding affinity reagents, and can exhibit excellent binding affinity even when mutations occur in the binding site (RBD) of the target protein. .
  • the peptide-nucleic acid hybrid molecule exhibits strong binding affinity to the RBD of the VOC (variant of concern) of SARS-CoV-2 and can neutralize SARS-CoV-2, but is not limited thereto.
  • the RBD binding affinity reagent may be an RBD-binding nucleic acid aptamer, a macrocyclic peptide, or a monoclonal antibody, but is not limited thereto.
  • the VOC of SARS-CoV-2 may be, but is not limited to, alpha ( ⁇ ), beta ( ⁇ ), gamma ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and omicron ( ⁇ ) variants.
  • the present invention provides a peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by the method of the present invention.
  • the peptide-nucleic acid hybrid molecule can block the binding of the virus to the host cell receptor, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for neutralizing viruses comprising a peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by the method of the present invention.
  • the present invention provides a method for suppressing or neutralizing a virus, comprising administering a peptide-nucleic acid hybrid molecule prepared by the method of the present invention to an individual in need thereof.
  • a hotspot-derived peptide-nucleic acid hybrid molecule that can bind with high affinity and effectively block the binding between the virus and the receptor is rapidly produced and selected in response to various mutations of the virus among numerous candidate substances. can do. Therefore, it can be used very effectively in developing treatments for various virus mutations.
  • Figure 1a shows the role of the nucleic acid scaffold in inducing stable binding between the hotspot peptide and the viral RBD.
  • Figure 1b shows a schematic diagram of the in vitro evolution of a receptor-mimicking hybrid ligand composed of a hotspot peptide and an aptamer scaffold.
  • Figure 2a shows the results of analyzing contact residues between the hACE2 receptor and SARS-CoV-2 RBD.
  • Figure 2b shows the N501Y mutation in RBD resulting in higher binding affinity to hACE2.
  • Figure 2c shows the results of quantitative evaluation of RBD binding of hotspot peptide-bound Round 7 (R7) pools (random DNA library combined with hotspot peptides (light gray), R7 ssDNA pool without hotspot peptides (dark gray), and R7 ssDNA pool combined with hotspot peptide (green).
  • R7 ssDNA pools random DNA library combined with hotspot peptides (light gray), R7 ssDNA pool without hotspot peptides (dark gray), and R7 ssDNA pool combined with hotspot peptide (green).
  • Figure 3a shows the results of comparing the RBD binding fractions of R7-01, R7-02, R7-03, and hybrid random libraries.
  • Figure 3b shows the results of analyzing the RBD binding affinity characteristics of R7-02 (RBD and serum albumin coated beads (green and gray, respectively), bare beads (black)).
  • Figure 3c shows the results of analyzing the RBD binding affinity characteristics (K d value) of R7-01 and R7-03.
  • Figure 3d shows the energy-minimized structure of R7-02 bound to RBD through molecular docking simulation (LGKGDFR peptide (red), hACE2 (white), RBD (blue), aptamer scaffold (green)).
  • Figures 3e and 3f show hybrid ligands co-conjugated with RBD-binding nucleic acid aptamers (CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), macrocyclic peptides (Peptide 4), or monoclonal antibodies (P05Dhu, AM122). The results of culturing and competitive binding analysis are shown.
  • Figure 3g shows the equilibrium dissociation constant K d values of RBD-binding nucleic acid aptamers (CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), macrocyclic peptides (Peptide 4), or monoclonal antibodies (P05Dhu, AM122). It shows the results of the analysis.
  • Figure 4A shows a schematic diagram and listing of alpha, beta, gamma, delta, and omicron variants of concern (VOC).
  • Figure 4b shows the results of analyzing K d values for alpha, beta, gamma, delta, and omicron VOCs of R7-02.
  • Figure 4c shows the results of analyzing the RBD binding fraction of R7-02 and several types of RBD binders (Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu, and AM122) for wild type and omicron VOC.
  • Figure 4d shows the results of analyzing the binding fraction of R7-02 and several types of RBD binders (Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu, and AM122) to wild-type and omicron VOCs through flow cytometry.
  • Figure 5a shows the inhibitory effect of RBD-hACE2 binding through ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) of R7-02.
  • Figure 5b shows the results confirming the inhibition rate of RBD-hACE2 interaction of LGKGDFR peptide, R7-02 DNA domain, R7-02, random DNA library, and hACE2.
  • Figure 5c shows a schematic diagram of the pseudotyped SARS-CoV-2 based neutralization assay.
  • Figures 5d and 5f show the results of confocal microscopy observation of pseudotype SARS-CoV-2 infected hACE2-293T (Figure 5d: LGKGDFR peptide, R7-02 DNA domain, R7-02; Figure 5f: CoV2-RBD -1C, CoV2-6C3, Aptamer-1, Peptide 4, P05Dhu, AM122).
  • Figures 5E and 5G show the percentage of GFP-expressing pseudotype SARS-CoV-2 infected cells relative to total hACE2-293T cells (Figure 5E: LGKGDFR peptide, R7-02 DNA domain, R7-02; Figure 5G: CoV2 -RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1, Peptide 4, P05Dhu, AM122).
  • Figure 5h shows the results of analyzing the nuclease stability of R7-02.
  • DNA oligonucleotides were synthesized and purified by Bioneer (Korea). The sequences of all oligonucleotides used in the present invention are shown in Table 1 below. C-terminally-(4-azidobutanoyl(lysine))-tagged LGKGDFR peptide (with and without N-terminal FITC modification) was synthesized and purified by Peptron (Korea).
  • EDC (1-ethyl-3-(3-365 dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • 1M magnesium chloride solution human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2), bovine serum albumin ( bovine serum albumin (BSA), high glucose DMEM, Tween-20, dimethyl sulfoxide (DMSO), tris(3-hydroxypropyl-triazolylmethyl)amine (THPTA), and copper(II) sulfate pentahydrate were from Sigma-Aldrich. Purchased. L-Ascorbic acid sodium salt was purchased from Alfa Aesar.
  • Lambda exonuclease enzyme and 10x Lambda exonuclease buffer were purchased from Thermo Fisher Scientific. 1M Tris-HCl (pH 7.4) was purchased from Bioneer (Korea). 10x PBS, 8M urea solution, 10x TBE, and nuclease-free purified water were purchased from T&I (Korea). 1 ⁇ PBSMT was used as binding buffer (consisting of 1 ⁇ PBS containing 2.5mM MgCl 2 and 0.02% Tween-20 (v/v), pH 7.4).
  • SARS-CoV-2 RBDs of wild type, alpha (B.1.1.7), beta (B.1.351), gamma (P.1), and delta (B.1.617.2) were expressed and purified.
  • SARS-CoV-2 RBD from Omicron (B.1.1.529) was purchased from Abbexa (UK).
  • Alexa-488 labeled monoclonal RBD-binding antibody (P05DHu) and Alexa Fluor 488 microscale protein labeling kit were purchased from Invitrogen.
  • Monoclonal RBD-binding antibody (AM122) was purchased from ACROBiosystems.
  • a macrocyclic peptide (Peptide 4) with N-terminal chloroacetyl-modified D-tyrosine was linearly synthesized by Peptron (Korea). 1 mg of linear peptide 4 was cyclized by dissolving in 86 ⁇ L of DMSO with 3 ⁇ L of N, N-diisopropylethylamine and incubated at 60°C for 24 hours.
  • the formation of the peptide-ssDNA junction was confirmed through fluorescence after conjugation with the FITC-modified-azide-tagged LGKGDFR peptide.
  • 1 ⁇ L of reaction product ( ⁇ 50 ng), 7 ⁇ L of 8M urea and 1 ⁇ L of 6x loading dye were mixed and heat denatured at 95°C for 10 min. Denatured products were analyzed by electrophoresis on a 10% urea polyacrylamide gel at 300 V for 40 min in 1x TBE buffer and imaged with an Azure C600 (Azure Biosystems). Equal amounts of unconjugated hexynyl-modified ssDNA libraries were stained with 10,000x SYBR gold stain (Invitrogen) and imaged simultaneously.
  • the peptide-nucleic acid hybrid library was heat denatured at 95°C for 10 minutes and then rapidly cooled on ice to form the most stable 3D structure. Afterwards, the heat-treated hybrid library was incubated with RBD-coated beads for 1 hour at room temperature with gentle rotation.
  • the target RBD was immobilized on Dynabeads M-270 carboxylic acid (Invitrogen) via the EDC-NHS coupling process using the manufacturer's protocol, and then quantified with the NanoOrange protein quantitation kit (Thermo Fisher Scientific). .
  • the PCR-amplified dsDNA was purified using the QIAquick PCR purification kit (Qiagen) and then digested with Lambda exonuclease to generate a hexynyl-modified ssDNA pool for the next HOLD round.
  • ssDNA was purified by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation and quantified by UV-vis measurement at 260 nm.
  • the click reaction between the azide-tagged LGKGDFR peptide and the purified hexynyl-modified ssDNA pool was repeated for each round of HOLD.
  • VDC volume dilution challenge
  • the 100 ⁇ L PCR reaction mixture contained 5 units of Taq polymerase (T&I, Korea), 0.5 ⁇ L of 0.1 mM 5'-hexynyl-modified forward primer and 5'-phosphorylated reverse primer, and 8 ⁇ L of 10 mM dNTP ( T&I, Korea), 2 ⁇ L of 10x PCR buffer (T&I, Korea), 10 ⁇ L of collected hybrid ligand, and additional nuclease-free purified water (up to 100 ⁇ L).
  • the PCR reaction mixture was pre-denatured at 95°C for 600 seconds, followed by repeated cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 51°C for 30 seconds, and extension at 72°C for 60 seconds.
  • dsDNAs hexynyl-modified double-stranded DNAs
  • Qiagen QIAquick PCR purification kit
  • 2.5 ⁇ g of purified dsDNA was incubated with 5 units of lambda nuclease in 50 ⁇ L. (Thermo Fisher Scientific). After incubating the mixture for 10 min at 37°C and 10 min at 80°C, hexynyl-modified ssDNA was purified by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation and quantified by UV-vis measurement at 260 nm.
  • the relative binding abilities of the hybrid ligand pools were compared. Equal amounts of the peptide-nucleic acid hybrid library coupled with the hotspot peptide, the R7 ssDNA pool without the hotspot peptide, and the R7 ssDNA pool coupled with the hotspot peptide were heat denatured at 95°C for 10 min and then rapidly cooled on ice. After heat denaturation, the beads were challenged with RBD-coated magnetic beads for 1 hour at room temperature, followed by washing three times with 1 ⁇ PBSMT. The amount of RBD binding was analyzed by quantitative PCR (LightCycler 480, Roche).
  • Each PCR reaction contained 10 ⁇ L of Light cycler 480 SYBR green I master (Roche), 0.1 ⁇ L of 0.1mM forward and reverse primers, 2 ⁇ L of RBD binding ligand, and 7 ⁇ L of nuclease-free purified water. Based on the previously obtained standard curve, the threshold period was estimated as the amount of RBD-bound ligand.
  • the enriched pool was PCR amplified with forward and reverse primers containing adapter sequences, and the optimized number of PCR cycles was determined by pilot PCR.
  • These PCR products were purified using a gel extraction kit (Qiagen) and then sequenced by Illumina MiSeq Next Generation Sequencing at SYSGENLAB (Korea). Sequencing libraries were analyzed in 101-bp paired-end (PE) sequencing mode on an Illumina Novaseq6000 platform. Sequencing read quality was measured with the FastQC tool, and adapter sequences were removed with cutadapt trimmer with the -e 0.1 -j 20 options. Only matched-paired reads were used for further analysis. High-quality sequencing reads passed the fastq_quality_filter ( ⁇ Q30) of the FASTX toolkit (RRID:SCR_005534).
  • the DNA sequence of R7-02 was quantified with a 5′-hexynyl group for hotspot peptide conjugation and 3′-FAM for flow cytometry-based binding assays. synthesized. FAM labeled R7-02 in 1x PBSMT was heat denatured and rapidly cooled. After heat denaturation, various concentrations of R7-02 were challenged with RBD-coated beads with gentle rotation for 1 h at room temperature. Beads were washed twice with 1 ⁇ PBSMT to exclude non-specific binding, and then bead-bound R7-02 was collected with a DynaMag-2 magnet (Invitrogen).
  • the molecular structure of R7-02 in complex with RBD was constructed using molecular docking simulation.
  • the crystal structures of the hACE2-derived hotspot peptide, LGKGDFR, and the single RBD of the SARS-CoV-2 spike protein were obtained from the RCSB PDB databank (PDB ID: 6M0J) with a single site mutation (N501Y) in the RBD.
  • the secondary structure of the aptamer scaffold in R7-02 (Table 1) was predicted using the mfold web server, which was fed into RNAcomposer for 3D structure.
  • the peptide-nucleic acid hybrid structure of R7-02 was constructed by attaching a triazole-modified linker residue between the hexynyl-modified 5' end of the folded DNA and the butanamide-modified lysine C-terminus of the hotspot peptide.
  • Molecular docking simulations were subsequently performed to find the best fit of the hotspot peptide-binding aptamer scaffold to the RBD, constraining the hotspot peptide and RBD to determined positions.
  • the resulting structure was energy minimized using the AMBER14 force field utilizing the molecular dynamics simulation package OpenMM version 7.4.
  • R7-02 and the reported RBD-binding aptamers were modified with FAM and TAMRA, respectively. Specifically, after heat denaturation and rapid cooling, they were co-incubated with 5 nM RBD beads (final volume: 100 ⁇ L) with gentle rotation for 1 h at room temperature. The beads were washed three times, and after signal compensation, they were resuspended in 100 ⁇ L of 1x PBSMT for analysis with CytoFLEX S (Beckman Coulter). The competitive RBD-bound fraction was calculated as the ratio of the average fluorescence intensity with competition to the average fluorescence intensity without competition (free binding).
  • TAMRA-modified R7-02 was co-incubated with FAM-modified peptide or Alexa-488 modified RBD-antibody and analyzed in the same manner.
  • the binding fractions to wild-type and Omicron RBD were mixed with 10 nM of R7-02 and antibodies (P05DHu and AM122); and quantitatively measured at 100 nM of aptamer (Aptamer-1) and cyclic peptide (peptide 4).
  • the beads were washed three times and resuspended in 100 ⁇ L of 1x PBSMT.
  • the binding fraction of each binder to wild type and Omicron RBD was measured directly with CytoFLEX S (Beckman Coulter).
  • SARS-CoV-2 Inhibitor Screening Kit (ACROBiosystems) was used according to the manufacturer's protocol. Microplates were pre-coated with hACE2, after which various concentrations of R7-02 (1 pM to 1 ⁇ M) were added to the plates. HRP-conjugated SARS-CoV-2 wild type RBD was added immediately. After 1 hour of incubation at room temperature, the wells were washed three times and substrate was added to quantify RBD-hACE2 binding. The reaction was terminated by adding a stop solution, and the absorbance was measured at 450 nm with a microplate reader (Tecan).
  • IC 50 half-maximal inhibitory concentration
  • the hACE2-293T cell line was obtained from Takara (Japan). hACE2-293T cells were cultured in high-glucose DMEM (Sigma Aldrich) supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) and 1% sodium pyruvate (Sigma Aldrich) at 37°C in a 5% CO 2 atmosphere. Afterwards, passages 5-15 of hACE2-293T were used in the pseudotype SARS-CoV-2 neutralization assay.
  • hACE2-293T cells ( ⁇ 4 ⁇ 10 3 ) were pre-seeded in 96-well plates and cultured overnight. After 24 hours, 5 ⁇ L of GFP-reporting pseudotype SARS-CoV-2 (4 ⁇ 10 5 transduction units per mL, BPS bioscience) was incubated with 3 ⁇ M of R7-02 in 1x PBSM (1x PBS with 2.5mM magnesium). Pre-incubate for 30 minutes at room temperature. Cell culture medium was removed from pre-seeded hACE2-293T cells, and cells were washed twice with pre-warmed 1x PBSM.
  • FAM-labeled R7-02 was allowed to be digested by nucleases for up to 24 hours in 10% fetal bovine serum at 37°C.
  • R7-02 with phosphorothioate backbone introduction and other modifications such as 2'-O-methyl and 2'-F modifications; and other unmodified single-stranded DNA were tested together.
  • 4 ⁇ L of 10 ⁇ M sample was mixed with 10x PBS (4 ⁇ L), fetal bovine serum (4 ⁇ L), and nuclease-free water (28 ⁇ L).
  • Example 1 In vitro selection of receptor-mimetic hybrid ligands and hotspots
  • nucleic acids can provide a highly stable and water-soluble 3D scaffold capable of positioning hotspot peptides in the correct position and orientation, thereby maintaining receptor-like binding properties. This process is shown in Figure 1a.
  • FIG. 1a For specific RBD-hACE2 interactions, several hotspot peptides have been reported to be approximately 30 amino acids or less in length, but apart from the insoluble hACE2 transmembrane receptor, flexible motifs are present on the hotspot surface of the receptor-binding domain (RBD). cannot be strongly combined. It is well known that, with negligible immunogenicity, nucleic acids are exceptionally hydrophilic due to the polar nature of the phosphate backbone.
  • nucleic acids capable of structurally stabilizing hACE2-derived RBD binding peptides.
  • compact, highly soluble peptide stabilizers allow for high-dose intravenous administration for virus neutralization.
  • the role of nucleic acids can be further expanded as hotspot binding enhancers that allow them to cooperatively interact with target RBDs. In other words, there may be additional aptamer-like interactions centered on the monovalent peptide bond, which may further improve the hotspot binding ability of the hACE2-mimetic hybrid ligand.
  • Hotspot peptide-supported aptamer scaffolds can be isolated in vitro by repeated cycles of selection and amplification from a large number of different nucleic acids ( ⁇ 10 14 ) site-specifically linked to hotspot peptides. This is shown in Figure 1b.
  • the azide-tagged C-terminus of the peptide was site-specifically linked to the 5'-hexynyl terminus of a single-stranded DNA (ssDNA) library by high-efficiency copper-catalyzed cycloaddition. It can be conjugated (step 1 in Figure 1b).
  • ssDNA single-stranded DNA
  • the peptide-nucleic acid hybrid library was rapidly cooled for unique 3D folding of individual ssDNAs.
  • the RBD surface attracted the hotspot interactions of the hybrid ligand candidates, and magnetic separation led to the systematic separation of unbound peptide-DNA conjugates (steps 2–3 in Figure 1b).
  • RBD binding of the hotspot peptide-linked round 7 (R7) pool was quantitatively assessed in a relative binding assay.
  • random DNA libraries showed significantly lower levels of RBD binding.
  • the peptide-nucleic acid hybrid library hybrid random library
  • the binding fraction was only 0.38%, indicating that the hotspot peptide cannot bind strongly to the RBD without a stable scaffold.
  • the R7 pool slightly increased RBD binding, resulting in a binding fraction of 5.74%, which is likely due to its own aptamer binding effect.
  • the peptide-supported R7 pool dramatically improved its affinity for RBD, and its binding fraction (22.6%) was 59.37- and 3.94-fold more than that of the random DNA-peptide conjugate and the peptide-deficient R7 pool, respectively.
  • This significant improvement in RBD binding is due to the synergistic interaction between the hotspot peptide and the newly evolved aptamer scaffold.
  • the most optimal peptide-supported aptamer scaffold was identified in the R7 hybrid ligand pool using high-throughput sequencing and flow cytometry-based binding analysis. When more than 4 million DNAs were sequenced from the R7 pool, the three most abundant sequence families were found to occupy a high share (>18%). This is shown in Table 3 below (SEQ ID NOs: 16 to 22). Among the three sequence families, the most representative DNA sequence was synthesized with a 5'-hexynyl group for site-specific peptide binding and a 3'-FAM dye for flow cytometry-based binding analysis. For the 5'-linked hotspot peptides, the second most abundant DNA sequence (DNA domain of R7-02) was the strongest for RBD binding. In relative binding assays, the RBD binding fraction of R7-02 was approximately 5- and 8-fold greater than that of R7-01 and R7-03, respectively ( Figure 3A).
  • the most potent hybrid ligand, R7-02 showed high affinity and specificity for the RBD at the correct position for hACE2 to bind.
  • the K d of R7-02 was quantitatively measured, it was 5.702 nM for RBD ( Figure 3b, green), and the K d values of R7-01 (27.01 nM) and R7-03 (93.8 nM) were lower than those of R7-02. was much higher (Figure 3c).
  • R7-02 exhibited sustained and sustained binding to the target surface of the RBD ( Figures 3e and 3f).
  • hybrid ligands of hotspot peptides and aptamer scaffolds were synthesized with RBD-binding nucleic acid aptamers (CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), macrocyclic peptides (Peptide 4), or co-incubated with monoclonal antibodies (P05DHu and AM122). Most of these are known to block the binding interface between RBD and hACE2 ( Figure 3e). Additionally, the K d values of various RBD binders were confirmed under the same conditions for R7-02 ( Figure 3g).
  • the hotspot peptide-nucleic acid hybrid molecule (R7-02) was confirmed to strongly bind to all reported VOCs of SARS-CoV-2 due to its high variant resistance in binding. Although it initially evolved to bind to the wild-type RBD through the HOLD process, the binding ability of the hybrid ligand also allows recognition of the highly mutated RBD of VOC. This allows powerful interaction with RBD's hotspot interface. VOC was found to have several key mutations, including N501Y, which results in a high interaction with the lysine of the LGKGDFR peptide in the hybrid ligand, thereby improving binding to the hACE2 receptor and transduction into host cells (Figure 4a).
  • RBD-binding affinity reagents did not effectively inhibit RBD-hACE2 interaction because they were unable to block the precise hACE2 contact residues on the RBD surface.
  • hotspot-derived RBD binding of R7-02 demonstrated efficient inhibition of RBD in hACE2 binding, indicating great potential for SARS-CoV-2 neutralization.
  • SARS-CoV-2 neutralizing ability of the hotspot peptide-nucleic acid hybrid molecule was further confirmed.
  • a pseudotype SARS-CoV-2 expressing both the SARS-CoV-2 spike protein and green fluorescent protein (GFP) but lacking the self-replication function was prepared.
  • the neutralization efficiency of R7-02 was analyzed by fluorescence by measuring the fluorescence intensity of GFP expressed only in cells infected by pseudotype SARS-CoV-2 ( Figure 5c).
  • hACE2-overexpressing HEK-293T cell line (hACE2-293T) was pre-inoculated into microplates overnight and then challenged with pseudotyped SARS-CoV-2 (0.5 multiplicity of infection, MOI) for 6 h for viral infection.
  • MOI pseudotyped SARS-CoV-2
  • the viral infection rate of R7-02 was found to be significantly lower or similar ( Figures 5f and 5g). Meanwhile, it should be considered that, unlike the most commonly used neutralizing antibodies, the hybrid ligand of the present invention is completely synthetic. In other words, the present invention can confirm the effect of efficient infection inhibition even though it has a low molecular weight (20 kDa), which is one-tenth of the monoclonal antibody.
  • the chimeric structure of the peptide-aptamer hybrid ligand without additional modifications provides good new oligonucleotide modifications compared to well-known oligonucleotide modifications (e.g., phosphorothioate backbone, 2′-O-methyl, and 2′-F modifications) (Figure 5h). It showed clease resistance and serum stability, and showed great potential as a SARS-CoV-2 neutralizer.
  • well-known oligonucleotide modifications e.g., phosphorothioate backbone, 2′-O-methyl, and 2′-F modifications

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Abstract

본 발명은 시험관 진화 기반 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법 등에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 따르면, 수많은 후보물질 중 바이러스의 다양한 변이에 대응하여, 이들과 높은 친화도로 결합하고 바이러스와 수용체 사이의 결합을 효과적으로 차단할 수 있는 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 빠르게 제조 및 선별할 수 있다. 따라서, 다양한 바이러스 변이에 대응한 치료제 개발에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

시험관 진화 기반 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법
본 발명은 시험관 진화 기반 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법 등에 관한 것이다. 본 출원은 2022년 4월 27일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0052389호, 및 2023년 04월 05일에 출원된 한국특허출원 제10-2023-0044921호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
감염이 일어날 때, 많은 바이러스가 숙주 세포로 진입하는 동안 세포막 단백질을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 수천 개의 스파이크 단백질로 덮여 있으며 막 수용체인 인간 안지오텐신 전환 효소 2(hACE2)에 강하게 결합하여 막 융합이 일어난다. SARS-CoV-2를 포함한 바이러스는 전염성을 높이기 위해 돌연변이가 발생해 시간이 지남에 따라 바이러스 전파력을 강화시키고 면역 회피가 일어난다. SARS-CoV-2가 2019년에 처음 보고된 이후 현재까지 많은 변종이 등장했으며, 우려 변이(variant of concern, VOC)로 알파(B.1.1.7), 베타(B.1.351), 감마(P.1), 델타(B.1.617.2), 및 오미크론(B.1.1.529)이 서로 다른 대륙에서 독립적으로 발생하였다. 특정 hACE2 인식에 기여하는 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)은 많은 일반적인 돌연변이를 포함하는 것으로 알려져 있다. 특히 결합 핫스팟에 위치한 일부 위치 돌연변이(예: N501Y)는 표적 hACE2에 대한 RBD의 결합 친화성을 증가시켜 SARS-CoV-2의 전염성을 높이는 것으로 확인되었다.
변이체의 빈번한 발생은 항바이러스 예방 및 치료 연구에 큰 걸림돌이 될 수 있다. 친화성 시약(affinity reagents)의 사용은 바이러스와 숙주 세포 사이의 특정 상호작용을 차단함으로써 바이러스 감염 회피에 효과적인 방법이 될 수 있다. SARS-CoV-2에 대해 스파이크 단백질의 다양한 에피토프를 인식하기 위해 다수의 중화 친화성 시약이 개발되었으며, 그 중 일부는 hACE2 접촉 표면과 부분적으로 겹치는 것으로 알려져 있다. 그러나 회피 돌연변이는 스파이크 단백질의 구조적 변화를 일으키기 때문에 친화성 시약이 결합 부위를 특이적으로 인식하지 못하여 중화 효능이 저하될 수밖에 없다. 대안으로 비경쟁 친화성 시약을 함께 투여할 수 있으며, 미국 식품의약국(FDA)은 SARS-CoV-2 변종의 급속한 출현으로 REGN-COV2와 같은 항체 칵테일의 긴급 사용 승인을 발표하였다. 회피 돌연변이를 축적하며 바이러스 변이체는 숙주 세포 수용체와의 결합 상호 작용이 더욱 강화되고, 항체 혼합물에 대해 내성이 강화되는 경향이 있다. 따라서, 표적 바이러스에 대한 높은 친화성과 함께, 변이체에 대한 결합 내성을 고려하여 효과적이고 효율적인 중화제를 개발해야 한다.
이에 본 발명자들은 바이러스 변이체의 향상된 수용체 인식에 영감을 받아 표적 바이러스 및 그 변이체와 강력하게 상호 작용할 수 있는 수용체 모방 합성 시약의 생성을 새롭게 발명하였다. 구체적으로, 바이러스-수용체 인터페이스의 중심에서 결합 자유 에너지에 크게 기여하는 숙주 세포 수용체의 펩타이드 모티프에 집중하였다. 안정적이지만 불용성인 막투과 도메인이 없으면 짧은 핫스팟 펩타이드는 표적 바이러스에 대한 최적의 결합 능력을 유지할 수 없다. 이 과정에서 구조적 안정제 역할뿐만 아니라 결합 협력자(binding cooperator) 역할을 할 수 있는 가용성인 핵산과 상승적으로 통합하였다. 수많은 핫스팟 펩타이드 결합 무작위 핵산(~1014)에서 핫스팟 상호작용을 최대화하는 앱타머 유사 스캐폴드를 선택적으로 분리 증폭하여 하이브리드 리간드를 쉽게 제조할 수 있으며, 이는 바이러스 변이체에 대한 강한 결합으로 이어질 수 있다.
또한, 본 발명자들은 "HOLD(Hotspot-Oriented Ligand Display)"라고 하는 새로운 시험관 내 진화 기술을 사용하여 hACE2 유래 RBD 결합 펩타이드를 수집하여, SARS-CoV-2의 핫스팟과 직접 상호 작용하는 hACE2 수용체 모방 하이브리드 리간드를 성공적으로 만들었다. 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드 사이의 상승적 상호 작용은 보고된 친화성 시약(예: 펩타이드, 앱타머 또는 중화 항체)보다 RBD에 더 효과적으로 결합하여 SARS-CoV-2을 효율적으로 차단하였다. 아울러, 다양한 SARS-CoV-2 변종(Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron)을 인식할 때 핫스팟 결합 hACE2 모방체는 결합 능력에 변화가 없었으며 결합 내성을 유지한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는 표적 단백질 결합 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법:
(a) 핫스팟 유래 펩타이드, 및 무작위 핵산 라이브러리를 위치 특이적 결합하여 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계;
(b) 표적 단백질이 코팅된 자성 비드와 단계 (a)의 펩타이드-핵산 하이브리드를 혼합 배양하는 단계; 및
(c) 자석을 이용해서 표적 단백질에 결합하는 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 선별하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는 바이러스 중화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 억제 또는 중화 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 표적 단백질 결합 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법을 제공한다:
(a) 핫스팟 유래 펩타이드, 및 무작위 핵산 라이브러리를 위치 특이적 결합하여 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계;
(b) 표적 단백질이 코팅된 자성 비드와 단계 (a)의 펩타이드-핵산 하이브리드를 혼합 배양하는 단계; 및
(c) 자석을 이용해서 표적 단백질에 결합하는 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법을 HOLD(Hotspot-Oriented Ligand Display)라 칭할 수 있으며, 이는 시험관 진화 기반 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법을 의미하는 것이다. 상기 HOLD는 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드 간 상승 효과로 인해 상기 제조방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자가 RBD에 대한 강한 결합 친화성을 갖도록 할 수 있고, 특히 RBD에 돌연변이가 생기는 경우에도 펩타이드-핵산 하이브리드 분자가 우수한 결합력을 유지하도록 할 수 있다.
즉, 상기 제조방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 시험관 내 진화 기술을 기반으로, 무작위로 합성되는 수많은 핵산 라이브러리를 이용하여, 수용체 대신 바이러스의 RBD 부위에 가장 강력하게 결합할 수 있는 분자로 선별된 분자이다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(d) 상기 단계 (c)에서 선별된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 핵산 부분을 선택적으로 증폭하고 복제하는 단계;
(e) 상기 단계 (d)에서 생성된 이중 가닥 DNA를 핵산 가수분해효소를 이용하여 단일 가닥 DNA로 제조하여 정제하는 단계; 및
(f) 상기 단계 (e)의 단일 가닥 DNA로 구성된 새로운 무작위 핵산 라이브러리를 제조하여, 상기 단계 (a) 내지 (f)의 선별, 증폭, 및 정제 과정을 반복하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 상기 (a) 단계 이후, 펩타이드-핵산 하이브리드를 열 변성 및 냉각하여 핵산의 3D 폴딩을 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 단계를 통해 핫스팟 펩타이드를 올바른 위치와 방향으로 배치할 수 있으며, 수용체와 유사하거나 더욱 강한 결합 특성을 유지할 수 있는 안정적인 3D 압타머 스캐폴드가 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (d)의 핵산 부분의 선택적 증폭은 5' 말단에 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 정방향 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 정방향 프라이머에 작용기가 결합되므로, 증폭되는 모든 PCR 생산물(product)은 5'말단에 작용기가 붙어있는 형태로 제작할 수 있으며, 이로 인하여 클릭반응에 의한 위치 특이적 결합을 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 핫스팟(Hotspot) 유래 펩타이드는 수용체 및 이의 표적 단백질 사이의 결합과 매우 관련이 있는 것으로 여겨지는 펩타이드 잔기를 의미한다. 본 발명의 HOLD 방법은 핫스팟 유래 펩타이드 종류에 한정되지 않고 범용적으로 적용할 수 있으므로, 사용될 수 있는 핫스팟 유래 펩타이드의 종류는 제한되지 않는다. 따라서 당 분야에 있어서 수용체 및 이의 표적 단백질 사이의 결합에 영향을 미치는 것으로 알려진 또는 알려질 다양한 펩타이드 부위를 핫스팟 펩타이드로 활용할 수 있다. 본 발명에서는 상기 핫스팟 유래 펩타이드의 바람직한 일 구현예로 hACE2 유래 핫스팟 펩타이드, 또는 hACE2 유래 RBD 결합 펩타이드를 이용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 핫스팟 유래 펩타이드는 수용체 및 이의 표적 단백질 사이의 결합 부위의 아미노산일 수 있으며, 표적 단백질 서열 중 해당 결합 부위에 관여하는 아미노산 전부 또는 일부; 또는 수용체 서열 중 해당 결합 부위에 관여하는 아미노산 전부 또는 일부일 수 있다.
상기 핫스팟 유래 펩타이드는 단리 된 핫스팟 유래 펩타이드의 C 말단 또는 N 말단에 클릭 화학 반응에 사용될 수 있는 모든 작용기가 결합된 펩타이드일 수 있으며, 예를 들어, 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 및, 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 아자이드(azide), 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 펩타이드일 수 있으며, 바람직하게는 C 말단 또는 N 말단에 아자이드가 결합(태그)된 펩타이드일 수 있으며, 더 바람직하게 아자이드-태그 LGKGDFR(L351에서 R357) 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 단백질은 바이러스 외피 단백질, 성장인자 단백질, 세포막 수용체, 항체, 항원 단백질, 바이러스가 숙주세포의 수용체와 결합하기 위한 단백질 부위, 또는 RBD(receptor-binding domain) 부위를 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 외피 단백질은 스파이크 단백질, 섬유단백질(Fiber protein), 및 외피 당단백(Envelope Glycoprotein)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 성장인자 단백질은 표피생장인자(Epidermal growth factor), 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor), 간세포성장인자(Hepatocyte growth factor), 신경성장인자(Nerve growth factor), 인슐린 유사 성장인자(Insulin-like growth factor), 혈관 내피 성장인자 (Vascular endothelial growth factor), 혈소판 유래 성장인자 (Platelet-derived growth factor), 또는 뼈 형성 단백질(Bone morphogenetic protein) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 세포막 수용체는 바이러스 단백질 및 성장인자 단백질이 결합하는 모든 수용체일수 있으며, PD-1 및 PD-L1 등 세포막에 존재하는 독립적인 수용체일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현예로 코로나 바이러스 치료제 개발을 위하여 핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 제조할 수 있으며, 이 때 수용체인 hACE2의 RBD 접촉 잔기 중에서, L351에서 R357까지(LGKGDFR, 서열번호 15)의 7개 아미노산 단편을 핫스팟 유래 펩타이드로 할 수 있다. 상기 표적 단백질은 스파이크 단백질일 수 있으며 바람직하게, 스파이크 단백질의 RBD(receptor-binding domain)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서 제조된 핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 SARS-CoV-2의 RBD와 hACE2 수용체 사이의 상호작용을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 앱타머 스캐폴드는 펩타이드와 연결되어 해당 펩타이드의 기능을 보조하며, 특정 분자에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드라고도 불리며, 핫스팟 유래 펩타이드와 결합되어 바이러스 중화 기능을 가지고, 펩타이드와 앱타머 스캐폴드의 하이브리드 분자가 표적 단백질에 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 무작위 핵산 라이브러리는 5' 말단에 클릭 화학반응에 사용될 수 있는 모든 작용기가 결합된 핵산일 수 있으며, 예를 들어, 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 알카인(alkyne), 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 및, 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 단일 가닥 핵산을 포함하며, 바람직하게는 5' 말단에 헥시닐이 결합된 핵산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 핫스팟 유래 펩타이드와 핵산 라이브러리에 결합된 작용기는 상호 교환될 수 있다. 또한, 상기 무작위 핵산 라이브러리는 하기와 같은 구조를 갖는 무작위 핵산들을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
5'-작용기-정방향 프라이머-[Nx] -역방향 프라이머-3',
상기 작용기는 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 알카인(alkyne), 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이며,
여기에서 N 은 A, T, C 또는 G 이고, x 는 25 내지 100 의 정수.
상기 무작위 핵산 라이브러리의 길이는 10nm 미터 이하의 직경을 갖는 표적 단백질에 정교하게 결합하기 위해 최소화되며, 라이브러리의 다양성을 최대화하기 위한 적절성을 만족하는 길이일 수 있으나, 구체적으로, 상기 무작위 핵산 라이브러리의 염기서열 개수는 55 내지 130, 55 내지 110, 55 내지 90, 55 내지 80, 60 내지 130, 60 내지 110, 60 내지 90, 60 내지 80, 65 내지 130, 65 내지 110, 65 내지 90, 65 내지 80, 65 내지 75, 또는 70일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 x는 25 내지 100, 25 내지 80, 25 내지 60, 25 내지 50, 30 내지 100, 30 내지 80, 30 내지 60, 30 내지 50, 35 내지 100, 35 내지 80, 35 내지 60, 35 내지 50, 35 내지 45, 또는 40일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 일 구현예서는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머를 이용하였으며, 이러한 방법으로 제조된 무작위 핵산 라이브러리에는 다음과 같은 구조식의 무작위 핵산들이 포함된다: GGAAGAGATGGCGAC-N40-AGCTGATCCTGATGG.
본 발명에 있어서, 상기 핫스팟 유래 펩타이드 및 상기 단일 가닥 핵산은 클릭반응에 의해 위치 특이적 결합되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 클릭반응은 핫스팟 유래 펩타이드의 작용기와 핵산의 작용기가 서로 짧은 시간 안에 화학적으로 가교결합 또는 구리-촉매 첨가환화(cycloaddition)에 의해 결합되는 반응일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 단백질은 바이러스 외피 단백질, 성장인자 단백질, 세포막 수용체, 항체, 또는 항원 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 바이러스 외피 단백질은 스파이크 단백질, 섬유단백질(Fiber protein), 및 외피 당단백(Envelope Glycoprotein)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 코로나 바이러스(Coronavirus),　인플루엔자 바이러스(influenza　virus), 간염 바이러스(Hepatitis　virus), 인체면역결핍바이러스(HIV), 인간 유두종 바이러스(Human　Papillomavirus), 헤르페스 바이러스(Herpesvirus), 에볼라 바이러스(Ebolavirus), 메르스 바이러스 (MERS　virus), 로타 바이러스(Rotavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 원숭이두창 바이러스(Monkeypox virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 광견병바이러스(Rabies virus), 및 노로 바이러스(Norovirus)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 코로나 바이러스는 인간 코로나 바이러스 229e(HCoV-229E), 인간 코로나 바이러스 OC43(HCoV-OC43), 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스(SARS-CoV), 인간 코로나 바이러스 NL63(HCoV-NL63, 뉴헤븐 코로나 바이러스), 인간 코로나 바이러스 HKU1, 중동호흡기증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV), 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스 2(SARS-Cov-2), 및 이들의 변이종으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 SARS-Cov-2의 변이종은 알파(α), 베타(β), 감마(γ), 델타(δ), 및 오미크론(ο) 변이종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "코로나바이러스"는 니도바이러스목, 코로나바이러스과, 코로나바이러스아과 혹은 Torovirinae에 포함된 바이러스속인 종에 해당한다. 코로나바이러스는 +ssRNA와 나선형 대칭형 뉴클레오펩시드로 감싸진 바이러스이다. 또한, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 지금까지 사람을 감염시키는 7번째 코로나바이러스이고, 나머지는 인간 코로나바이러스 229e(HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 OC43(HCoV-OC43), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 인간 코로나바이러스 NL63(HCoV-NL63, 뉴헤븐 코로나바이러스), 인간 코로나바이러스 HKU1, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 이다. 코로나바이러스들의 전반적인 구조에 기여하는 단백질들은 스파이크, 외피 및 뉴클레오켑시드(Nucleocapsid)이다. SARS 코로나바이러스의 경우, 스파이크(spike(S)) 위에 있는 확정된 결합수용기 도메인이 바이러스의 부착부분을 이것의 세포 수용기인 안지오텐신 전환효소 2(ACE2)로 중재한다. 몇몇 코로나바이러스(특히, 베타코로나바이러스 하위집단 구성원)는 또한 항체 에스테라아제라고 불리는 단백질 같은 짧은 스파이크를 가진다. 코로나바이러스는 바이러스성 폐렴이나 2차적인 세균성 폐렴을 일으킬 수 있으며, 직접적인 바이러스성 기관지염이나 2차적인 세균성 기관지염도 일으킬 수 있다. 2003년에 발견된 인간 코로나바이러스는 중증급성호흡기증후군(SARS)를 일으키는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)로, 상부 및 하부 호흡기 감염을 유발한다.
또한, 본 발명에 있어서, 사용된 용어 "SARS-CoV-2"는, 신종 코로나바이러스를 지칭하는 것으로서, RNA 바이러스로서 사스와 메르스의 변종을 나타낸다. SARS-CoV-2는 사스와 약 79.7%의 서열 동일성을, 메르스와 약 50% 공유한다. 하지만, 사스와 메르스와는 대조적으로, 2019-nCoV의 스파이크 당단백질(spike glycoprotein)은 1 개의 RBD domain이 위로 돌출된 형태의 구조를 형성하며, 이로 인해 타겟 리셉터(receptor)인 ACE2(angiotensin)와 100 내지 1,000배 더 강력한 결합력을 나타낸다. 이러한 강력한 결합력은 세포 내로 침투를 더욱 더 용이하게 하여 전염력을 높이는 원인으로 작용한다.
또한, 본 발명에서 있어서, 상기 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-Cov-2)의 변이종은 코로나19 변이바이러스와 동일한 의미이다. 상기 변이 바이러스는 주요 변이바이러스[우려변이(VOC, Variant of Concern)]와 기타 변이바이러스(VOI, Variant of Interest)로 나뉘며, 지역유래 명칭의 사용 방지 및 원활한 소통을 위해 그리스 알파벳(알파, 베타, 감마 등)으로 변이바이러스를 명명하고 있다. 상기 주요 변이바이러스는 전파력 증가 혹은 역학적으로 부정적 변화가 확인되고, 병원성 증가 혹은 임상적으로 질환 중증도 변화가 확인되거나, 진단, 백신, 치료제 등의 유효성 저하가 확인된 변이 바이러스를 말한다. 현재 VOC는 오미크론 변이종이며, 과거에는 알파, 베타, 감마, 델타 변이종 등이 있었다. 구체적으로, SARS-Cov-2의 알파(α) 변이종은 2020년 9월 영국에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 B.1.1.7이다. 또한, 상기 SARS-Cov-2의 베타(β) 변이종은 2020년 5월 남아프리카 공화국에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 B.1.351이다. 또한, 상기 SARS-Cov-2의 감마(γ) 변이종은 2020년 11월 브라질에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 P.1이다. 또한, 상기 SARS-Cov-2의 델타(δ) 변이종은 2020년 10월 인도에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 B.1.617.2이다. 또한, 상기 SARS-Cov-2의 오미크론(o) 변이종은 2021년 11월 다수 국가에서 발견된 것으로, 계통 분류체계는 B.1.1.529이다.
본 발명에 있어서, 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 하기 특징 중 어느 하나를 만족할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: (a) 뉴클레아제 저항성; 및 (b) 혈청 안정성. 또한, 바이러스를 중화시킬 수 있고, 표적 단백질의 RBD 사이에서 정전기적 상호 작용을 제공할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 치료 목적 및 제제화 방법에 따라 다양한 투여 경로로 투여될 수 있고, 바람직하게는 정맥에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 하이브리드 리간드, 핫스팟 펩타이드 결합 앱타머 스캐폴드, 수용체-모방 하이브리드 리간드, 또는 hACE2-모방 하이브리드 리간드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자에서 상기 핵산은 핫스팟 유래 펩타이드와 클릭 반응으로 결합되어 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 제조하는데 사용된다. 또한, 상기 핵산은 핫스팟 펩타이드와 위치 특이적으로 연결된 수많은 다른 핵산 라이브러리에서 선택 및 증폭의 반복 주기에 의해 시험관 내에서 분리될 수 있으고, 선택 및 증폭의 반복 주기를 통해 펩타이드-핵산 하이브리드 분자로 보다 높은 결합력을 제공할 수 있는 핵산이 선별될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 수용체와 이의 표적 단백질 사이의 결합 부위(RBD)에 대한 결합력을 증가시킬 수 있으며, 예컨대 hACE2 유래 RBD 결합 펩타이드를 구조적으로 안정화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 핵산은 헥시닐 변형 ssDNA, 앱타머 스캐폴드, 또는 핫스팟 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 RBD 결합 친화성 시약과 경쟁에 있어서도 RBD와 우수한 결합력을 나타낼 수 있으며, 표적 단백질의 결합 부위(RBD)에 돌연변이가 생긴 경우에도 우수한 결합력을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 SARS-CoV-2의 VOC(variant of concern)의 RBD에 대한 강한 결합력을 나타내어 SARS-CoV-2를 중화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 RBD 결합 친화성 시약은 RBD-결합 핵산 앱타머, 마크로시클릭 펩타이드, 또는 단일 클론 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, SARS-CoV-2의 VOC는 알파(α), 베타(β), 감마(γ), 델타(δ), 및 오미크론(ο) 변이종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 제공한다. 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 바이러스와 숙주세포 수용체의 결합 차단시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는 바이러스 중화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 억제 또는 중화 방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 수많은 후보물질 중 바이러스의 다양한 변이에 대응하여, 이들과 높은 친화도로 결합하고 바이러스와 수용체 사이의 결합을 효과적으로 차단할 수 있는 핫스팟 유래 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 빠르게 제조 및 선별할 수 있다. 따라서, 다양한 바이러스 변이에 대응한 치료제 개발에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1a는 핫스팟 펩타이드와 바이러스 RBD와의 안정적인 결합을 유도하는 핵산 스캐폴드의 역할을 나타낸 것이다.
도 1b는 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드로 구성된 수용체 모방 하이브리드 리간드의 시험관 내 진화의 도식도를 나타낸 것이다.
도 2a는 hACE2 수용체와 SARS-CoV-2 RBD 사이의 접촉 잔기를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 hACE2에 더 높은 결합 친화도를 갖게 하는 RBD의 N501Y 돌연변이를 나타낸 것이다.
도 2c는 핫스팟 펩타이드 결합 라운드 7(R7) 풀의 RBD 결합을 정량적으로 평가한 결과를 나타낸 것이다(핫스팟 펩타이드와 결합된 무작위 DNA 라이브러리(밝은 회색), 핫스팟 펩타이드가 없는 R7 ssDNA 풀(진한 회색) 및 핫스팟 펩타이드와 결합된 R7 ssDNA 풀(녹색)).
도 3a는 R7-01, R7-02, R7-03, 및 하이브리드 무작위 라이브러리의 RBD 결합 분율 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 R7-02의 RBD 결합 친화도 특성을 분석한 결과를 나타낸 것이다(RBD 및 혈청 알부민 코팅 비드(각각 녹색 및 회색), 베어 비드(검은색)).
도 3c는 R7-01 및 R7-03의 RBD 결합 친화도 특성(Kd 값)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 분자 도킹 시뮬레이션을 통해 RBD에 결합된 R7-02의 에너지 최소화 구조를 나타낸 것이다(LGKGDFR 펩타이드(빨간색), hACE2(흰색), RBD(파란색), 앱타머 스캐폴드(녹색)).
도 3e 및 3f는 하이브리드 리간드를 RBD-결합 핵산 앱타머(CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), 마크로시클릭 펩타이드(Peptide 4), 또는 단일 클론 항체(P05Dhu, AM122)와 공동 배양하고, 경쟁적 결합을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3g는 RBD-결합 핵산 앱타머(CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), 마크로시클릭 펩타이드(Peptide 4), 또는 단일 클론 항체(P05Dhu, AM122)의 평형 해리 상수 Kd 값을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 알파, 베타, 감마, 델타 및 오미크론 VOC(variants of concern)의 돌연변이 도식도 및 목록을 나타낸 것이다.
도 4b는 R7-02의 알파, 베타, 감마, 델타 및 오미크론 VOC에 대한 Kd 값을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4c는 야생형 및 오미크론 VOC에 대해서 R7-02 및 여러 유형의 RBD 바인더(Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu 및 AM122)의 RBD 결합 분율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4d는 유세포 분석을 통해 야생형 및 오미크론 VOC에 대한 R7-02 및 여러 유형의 RBD 바인더(Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu 및 AM122)의 결합 분율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 R7-02의 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통한 RBD-hACE2 결합 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5b는 LGKGDFR 펩타이드, R7-02 DNA 도메인, R7-02, 무작위 DNA 라이브러리, 및 hACE2의 RBD-hACE2 상호작용 억제율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 슈도 타입 SARS-CoV-2 기반 중화 분석의 개략도를 나타낸 것이다.
도 5d 및 5f는 슈도 타입 SARS-CoV-2 감염 hACE2-293T를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다(도 5d: LGKGDFR 펩타이드, R7-02 DNA 도메인, R7-02; 도 5f: CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1, Peptide 4, P05Dhu, AM122).
도 5e 및 5g는 총 hACE2-293T 세포에 대한 GFP-발현 슈도 타입 SARS-CoV-2 감염 세포의 백분율을 나타낸 것이다(도 5e: LGKGDFR 펩타이드, R7-02 DNA 도메인, R7-02; 도 5g: CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1, Peptide 4, P05Dhu, AM122).
도 5h는 R7-02의 뉴클레아제 안정성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 실험 재료
DNA 올리고뉴클레오티드는 Bioneer(Korea)에서 합성 및 정제하였다. 본 발명에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기 표 1에 나타내었다. C-말단-(4-아지도부타노일(lysine))-태그 LGKGDFR 펩타이드(with and without N-말단 FITC 변형)는 Peptron(Korea)에서 합성 및 정제하였다. EDC(1-ethyl-3-(3-365 dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), NHS(N-hydroxysuccinimide), 1M 염화 마그네슘 용액, 인간 안지오텐신 전환 효소 2(human angiotensin-converting enzyme 2, hACE2), 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 고포도당 DMEM, 트윈-20, DMSO(dimethyl sulfoxide), THPTA(tris(3-hydroxypropyl-triazolylmethyl)amine) 및 황산구리 5수화물(copper(II) sulfate pentahydrate)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. L 아스코르브산 나트륨염(L-Ascrobic acid sodium salt)은 Alfa Aesar에서 구입하였다. 람다 엑소뉴클레아제 효소 및 10x 람다 엑소뉴클레아제 완충액은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. 1M Tris-HCl(pH 7.4)은 Bioneer(Korea)에서 구입하였다. 10x PBS, 8M 요소수(urea solution), 10x TBE 및 뉴클레아제-free 정제수는 T&I(Korea)에서 구입하였다. 1x PBSMT를 결합 완충액으로 사용하였다(2.5mM MgCl2 및 0.02% 트윈-20(v/v)을 함유하는 1x PBS, pH 7.4로 구성됨). 야생형, 알파(B.1.1.7), 베타(B.1.351), 감마(P.1) 및 델타(B.1.617.2)의 SARS-CoV-2 RBD를 발현 및 정제하였다. 오미크론(B.1.1.529)의 SARS-CoV-2 RBD는 Abbexa(영국)에서 구입하였다. Alexa-488 표지된 단클론 RBD-결합 항체(P05DHu) 및 Alexa Fluor 488 마이크로스케일 단백질 표지 키트는 Invitrogen에서 구입하였다. 단일 클론 RBD-결합 항체(AM122)는 ACROBiosystems에서 구입하였다. N-말단 클로로아세틸-변형 D-티로신(N-terminal chloroacetyl-modified D-tyrosine)이 있는 매크로시클릭 펩타이드(macrocyclic peptide, Peptide 4)는 Peptron(Korea)에서 선형 합성하였다. 1 mg의 선형 펩타이드 4를 3 μL의 N, N-디이소프로필에틸아민과 함께 86 μL의 DMSO에 용해시켜 고리화하고, 60℃에서 24시간 동안 배양하였다.
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2. 아자이드-태그 핫스팟 펩타이드(azide-tagged hotspot peptide)와 헥시닐 변형 ssDNA 사이의 위치 특이적 결합
초고효율 구리 촉매 알킨-아자이드 첨가 환화(cycloaddition)를 위해 50mM의 구리(II) 황산염 수용액 1μL와 150mM의 THPTA 수용액 1.67μL를 접합(conjugation) 10분 전에 미리 혼합하였다. DMSO 3 μL, 10x PBS 1 μL, 0.1 mM의 헥시닐 변형 ssDNA 수용액 3 μL, 2.5 mM 아자이드-태그 LGKGDFR 펩타이드 1 μL, 프리믹스 2.67 μL(구리(II) 황산염 및 THPTA), 및 500mM 아스코르브산 나트륨 수용액 1μL(신선하게 준비)를 순서대로 첨가하여 완전히 혼합하였다. 용액을 실온에서 밤새 진탕하고, 에탄올 침전으로 정제하였다.
3. 펩타이드-ssDNA 결합 하이브리드 라이브러리 확인
펩타이드-ssDNA 접합의 형성은 FITC-변형-아자이드-태그 LGKGDFR 펩타이드를 접합 후 형광을 통해 확인하였다. 반응 생성물(~50 ng) 1 μL, 8M 요소수 7 μL 및 6x 로딩 염료 1 μL를 혼합하고, 95℃에서 10분 동안 열 변성시켰다. 변성된 산물을 1x TBE 버퍼에서 40분 동안 300V로 10% 우레아 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 통해 분석하고, Azure C600(Azure Biosystems)으로 이미지화하였다. 같은 양의 접합되지 않은 헥시닐-변형 ssDNA 라이브러리를 10,000x SYBR 금 염색 염료(Invitrogen)로 염색하고 동시에 이미지화하였다.
4. HOLD (Hotspot-Oriented Ligand Display)
펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리를 95℃에서 10분 동안 열 변성시킨 다음, 가장 안정적인 3D 구조의 형성을 위해 얼음에서 급속 냉각하였다. 그 후, 열 처리된 하이브리드 라이브러리를 실온에서 1시간 동안 RBD 코팅 비드와 함께 부드러운 회전(gentle rotation)으로 배양하였다. RBD 코팅 비드를 준비할 때 제조업체의 프로토콜을 사용하여 EDC-NHS 커플링 프로세스를 통해 Dynabeads M-270 카르복실산(Invitrogen)에 표적 RBD를 고정한 다음, NanoOrange 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific)로 정량화하였다. 배양 후, 자기 비드를 1x PBSMT로 철저히 세척하여, 결합되지 않은 하이브리드 분자를 제거하고, 자기 비드-결합 하이브리드 리간드를 DynaMag-2 자석(Invitrogen)으로 선택적으로 분리하였다. 분리된 하이브리드 리간드 후보의 DNA 도메인만을 5'-헥시닐-변형 정방향 프라이머 및 5'-인산화 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다(상기 표 1). 최적의 PCR 사이클 수는 파일럿 PCR 프로세스에 의해 결정하였다. PCR로 증폭된 dsDNA를 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제한 다음, 람다 핵산가수분해효소(Lambda exonuclease)로 분해하여 다음 HOLD 라운드를 위한 헥시닐-변형 ssDNA 풀(pool)을 생성하였다. ssDNA를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, 260nm에서 UV-vis 측정으로 정량화하였다. 각 HOLD 라운드에 대해 동일한 형식의 하이브리드 라이브러리 풀을 제공하기 위해, 아자이드-태그 LGKGDFR 펩타이드와 정제된 헥시닐-변형 ssDNA 풀 사이의 클릭 반응을 매 라운드의 HOLD에 대해 반복하였다.
5. Volume dilution challenge
VDC(volume dilution challenge) 기술은 결합되지 않은 하이브리드 분자를 매우 효율적으로 제거하는 데 사용하였다. 비드 결합 하이브리드 라이브러리의 1시간 배양 및 후속 세척 후, 즉시 증가된 부피(100-500x)의 1x PBSMT로 희석하고 추가로 30분 동안 배양하여, 고율(high rate) 해리 상수(koff) 값으로 이 과정에서 쉽게 분리되는 하이브리드 분자를 제거하였다. VDC 후, 비드를 모으고 200 μL 1x PBSMT로 3회 세척하였다.
6. 고친화성 하이브리드 리간드를 풍부하게 하는 DNA 도메인 증폭
100 μL PCR 반응 혼합물은 5 unit의 태그 폴리머라제(Taq polymerase, T&I, Korea), 0.5 μL의 0.1 mM 5'-헥시닐-변형 정방향 프라이머 및 5'-인산화 역방향 프라이머, 8 μL의 10 mM dNTP (T&I, Korea), 10x PCR 버퍼(T&I, Korea) 2 μL, 수집된 하이브리드 리간드 10 μL, 및 추가 뉴클레아제-free 정제수(최대 100 μL)를 함유하였다. PCR 반응 혼합물을 95℃에서 600초 동안 사전 변성시킨 후, 95℃에서 30초 변성(denaturation), 51℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 60초 연장(extension)의 주기를 반복하였다. 5 μL의 PCR 혼합물을 수집하고 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 용해하여, 부산물이 최소화된 최적의 PCR 증폭 주기 수를 결정하였다(파일럿 PCR). HOLD의 모든 라운드에서 수집된 하이브리드 리간드의 DNA 도메인은 최적화된 사이클 수로 PCR 증폭되었다.
7. ssDNA 생성
PCR 증폭 후, 헥시닐-변형 이중 가닥 DNA(double-stranded DNAs, dsDNAs)를 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고, 정제된 dsDNA 2.5 μg을 50 μL에서 5 unit의 람다 핵산가수분해효소(Thermo Fisher Scientific)로 분해하였다. 혼합물을 37℃에서 10분, 80℃에서 10분 동안 배양한 후, 헥시닐-변형 ssDNA를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고, 260 nm에서 UV-vis 측정으로 정량화하였다.
8. R7 풀의 상대적 결합 분석
7 라운드의 HOLD 후, 하이브리드 리간드 풀의 상대적인 결합 능력을 비교하였다. 핫스팟 펩타이드와 결합된 동일한 양의 펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리, 핫스팟 펩타이드가 없는 R7 ssDNA 풀, 및 핫스팟 펩타이드와 결합된 R7 ssDNA 풀을 95°C에서 10분 동안 열 변성시킨 다음 얼음에서 급속 냉각하였다. 열 변성 후, 실온에서 1시간 동안 RBD 코팅된 자기 비드로 챌린지(challenge)하고, 이어서 1x PBSMT로 3회 세척하였다. RBD 결합량은 정량적 PCR(LightCycler 480, Roche)로 분석하였다. 각 PCR 반응에는 10μL의 Light cycler 480 SYBR green I master(Roche), 0.1μL의 0.1mM 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 2μL의 RBD 결합 리간드 및 7μL의 뉴클레아제-free 정제수를 포함하였다. 이전에 얻은 표준 곡선을 기반으로 임계값 주기는 RBD 결합 리간드의 양으로 추정하였다.
9. 고-처리량 시퀀싱(High-throughput sequencing)
7 라운드의 선택 후, 풍부한 풀은 어댑터 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머로 PCR 증폭되었고, 최적화된 PCR 사이클 수는 파일럿 PCR에 의해 결정되었다. 이러한 PCR 산물은 젤 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제한 후, SYSGENLAB(한국)의 Illumina MiSeq Next Generation Sequencing으로 시퀀싱하였다. 시퀀싱 라이브러리는 Illumina Novaseq6000 플랫폼에서 101-bp PE(paired-end) 시퀀싱 모드로 분석되었다. 시퀀싱 리드 품질은 FastQC tool로 측정되었으며, 어댑터 시퀀스는 -e 0.1 -j 20 옵션이 있는 cutadapt trimmer로 제거되었습니다. 완벽하게 일치하는 리드 쌍(matched-paired reads)만 추가 분석에 사용하였다. 고품질 시퀀싱 리드는 FASTX 툴킷(RRID:SCR_005534)의 fastq_품질_필터(≥Q30)를 통과하였다.
10. 하이브리드 리간드의 친화도 및 특이성 분석
야생형 RBD 및 그 변이체에 대한 하이브리드 리간드의 결합 친화도를 평가하기 위해, R7-02의 DNA 서열을 핫스팟 펩타이드 컨쥬게이션을 위한 5'-헥시닐 그룹 및 유세포 분석 기반 결합 분석을 위한 3'-FAM으로 합성하였다. 1x PBSMT의 FAM 라벨 R7-02는 열 변성 및 급속 냉각하였다. 열 변성 후, 다양한 농도의 R7-02를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 회전시키면서 RBD-코팅된 비드로 챌린지하였다. 비드를 1x PBSMT로 2회 세척하여 비특이적 결합을 배제한 다음, 비드 결합 R7-02를 DynaMag-2 자석(Invitrogen)으로 수집하였다. 수집된 비드를 1x PBSMT에 재현탁하고, CytoFLEX S(Beckman Coulter)를 사용하여 비드의 평균 형광을 측정하여 분석하였다. 각 측정에 대해, 15,000개의 경우를 분석하였다. 마지막으로, 비선형 회귀 분석(Prism 소프트웨어, GraphPad Prism 버전 9.3.1)을 사용하여 Kd를 계산하였다. 이들의 결합 특이성을 확인하기 위해, BSA로 코팅된 비드와 코팅되지 않은 비드(베어 비드)에 대해 유사한 특성화 과정을 동시에 수행하였다. 코팅되지 않은 비드를 준비할 때, Dynabeads M-270 카르복실산 비드는 실온에서 15분 동안 50mM Tris·HCl(pH 7.4)에서 Tris-차단되었다. 밀도가 높은 서열 패밀리(R7-01 및 R7-03) 및 보고된 RBD-결합 친화도 시약에 대해 유사한 특성화 프로세스를 수행하였다; Aptamer-1, CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Peptide 4, P05DHu 및 AM122.
11. RBD와 복합체를 이루는 R7-02의 분자 도킹 시뮬레이션
RBD에 대한 R7-02의 높은 결합 친화도를 분석하기 위해, 분자 도킹 시뮬레이션을 사용하여 RBD와 복합체를 이루는 R7-02의 분자 구조를 구축하였다. hACE2 유래 핫스팟 펩타이드, LGKGDFR 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 단일 RBD의 결정 구조는 RBD의 단일 부위 돌연변이(N501Y)가 있는 RCSB PDB 데이터뱅크(PDB ID: 6M0J)에서 얻었다. R7-02(표 1)에서 앱타머 스캐폴드의 2차 구조는 mfold 웹 서버를 사용하여 예측하였으며, 이는 3D 구조를 위해 RNAcomposer에 공급되었다. R7-02의 펩타이드-핵산 하이브리드 구조는 접힌 DNA의 헥시닐-변형 5' 말단과 핫스팟 펩타이드의 부탄아미드-변형 라이신 C-말단 사이에 트리아졸-변형 링커 잔기를 부착하여 구성하였다. 분자 도킹 시뮬레이션은 핫스팟 펩타이드와 RBD를 결정 위치로 제한하면서, RBD에 대한 핫스팟 펩타이드 결합 앱타머 스캐폴드의 가장 적합한 핏을 찾기 위해 후속적으로 수행하였다. 결과 구조는 분자 동역학 시뮬레이션 패키지 OpenMM 버전 7.4를 활용하는 AMBER14 역장(force field)을 사용하여 에너지를 최소화하였다.
12. 보고된 RBD-결합 친화성 시약을 사용한 경쟁적 결합 분석
경쟁적 결합 분석을 위해, R7-02 및 보고된 RBD-결합 앱타머를 각각 FAM 및 TAMRA로 변형하였다. 구체적으로, 열 변성 및 급속 냉각 후 실온에서 1시간 동안 부드럽게 회전하면서 5nM RBD 비드(최종 부피: 100μL)와 공동 배양하였다. 비드를 3회 세척하고, 신호 보상(signal compensation) 후 CytoFLEX S(Beckman Coulter)로 분석하기 위해 100 μL의 1x PBSMT에 재현탁하였다. 경쟁적 RBD-결합 분율은 경쟁이 없는(자유 결합) 평균 형광 강도에 대한 경쟁이 있는 평균 형광 강도의 비율로 계산하였다. 보고된 RBD-결합 고리형 펩타이드 및 항체와의 경쟁적 결합을 위해, TAMRA-변형 R7-02를 FAM-변형 펩타이드 또는 Alexa-488 변형 RBD-항체와 공동 배양하고, 동일한 방법으로 분석하였다.
13. 야생형과 오미크론 RBD 간의 결합 분율 비교
선택된 RBD 바인더(Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu 및 AM122)에서 SARS-CoV-2 변이체에 대한 결합 내성을 분석하기 위해, 야생형 및 Omicron RBD에 대한 결합 분율을 10nM의 R7-02 및 항체(P05DHu 및 AM122); 및 100 nM의 앱타머(Aptamer-1) 및 사이클릭 펩타이드(펩타이드 4)에서 정량적으로 측정하였다. 각각의 바인더와 함께 RBD-코팅 자기 비드를 1시간 동안 실온에서 부드러운 회전으로 배양한 후, 비드를 3회 세척하고 100 μL의 1x PBSMT에 재현탁시켰다. 야생형과 Omicron RBD에 대한 각 바인더의 결합 분율은 CytoFLEX S(Beckman Coulter)로 직접 측정하였다.
14. ELISA 기반 RBD-hACE2 결합 억제 시험
억제 효율을 특성화하기 위해, 제조업체의 프로토콜에 따라 SARS-CoV-2 억제제 스크리닝 키트(ACROBiosystems)를 사용하였다. 마이크로플레이트는 hACE2로 프리(pre)-코팅되어 있었고, 다양한 농도의 R7-02(1pM ~ 1μM)를 플레이트에 추가한 후. HRP-결합 SARS-CoV-2 야생형 RBD를 즉시 첨가하였다. 실온에서 1시간 배양 후, 웰을 3회 세척하고 기질을 첨가하여 RBD-hACE2 결합을 정량화하였다. 정지 용액(stop solution)을 첨가하여 반응을 종결시키고, 마이크로플레이트 판독기(Tecan)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. RBD-hACE2 결합의 R7-02-유래 억제에 대한 최대 억제 농도의 절반(IC50) 값은 시그모이드 용량 반응 비선형 회귀 분석(Prism 소프트웨어, GraphPad Prism 버전 9.3. 1)을 사용하여 하이브리드 리간드 농도의 로그 변환 후에 결정하였다. 동일한 방식으로, RBD-hACE2 상호작용 억제에서 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드 사이의 상승적 상호작용을 분석하기 위해 3 μM의 개별 리간드(LGKGDFR 펩타이드, R7-02의 DNA 도메인, 및 R7-02)를 첨가한 후 RBD-hACE2 억제를 비교하였다.
15. 세포 배양 및 샘플 준비
hACE2-293T 세포주는 Takara(일본)에서 입수하였다. hACE2-293T 세포는 37℃, 5% CO2 대기에서 10% 태아 소 혈청(Gibco) 및 1% 피루브산나트륨(Sigma Aldrich)이 보충된 고포도당 DMEM(Sigma Aldrich)에서 배양하였다. 그 후, hACE2-293T의 5-15 계대를 슈도 타입 SARS-CoV-2 중화 분석에 사용하였다.
16. 슈도 타입 SARS-CoV-2의 중화 분석
R7-02의 중화 능력을 확인하기 위해, 슈도 타입 SARS-CoV-2의 중화 분석을 수행하였다. hACE2-293T 세포(~4Х103)를 96-웰 플레이트에 미리 접종하고 밤새 배양하였다. 24시간 후, 5 μL의 GFP-리포팅 슈도 타입 SARS-CoV-2(mL당 4Х105 형질도입 단위, BPS bioscience)를 1x PBSM(2.5mM 마그네슘이 포함된 1x PBS)에서 3 μM의 R7-02와 실온에서 30분 동안 사전 배양하였다. 미리 접종된 hACE2-293T 세포에서 세포 배양 배지를 제거하고, 세포를 미리 데운 1x PBSM으로 두 번 세척하였다. 세척 후 슈도바이러스와 R7-02의 혼합물을 세포에 첨가하고, 37℃에서 6시간 동안 감염시켰다. 감염 후, 1X PBSM을 신선한 세포 배양 배지로 교체하고, 세포를 37℃에서 48시간 더 배양하였다. 마지막으로 공초점 현미경(Leica DMi8, 소스 파장: 488nm)을 사용하여 GFP 형광 이미지와 명시야 이미지를 관찰하였다. 전체 hACE2-293T 세포에 대한 GFP-발현 감염된 세포의 백분율은 CellProfiler 버전 4.2.1로 전산 분석하였다. 동일한 방법으로 다른 RBD 결합 리간드(aptamer-1, CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, P05DHu, AM122 및 펩타이드 4)의 중화 효능을 분석하였다.
17. 혈청 안정성 분석
혈청 안정성을 특성화하기 위해, 37℃, 10% 태아 소 혈청에서 최대 24시간 동안 뉴클레아제가 FAM-표지 R7-02를 분해하도록 하였다. 비교를 위해, 포스포로티오에이트 백본 도입, 및 2'-O-메틸 및 2'-F 변형과 같은 다른 변형이 있는 R7-02; 및 기타 변형되지 않은 단일 가닥 DNA를 함께 테스트하였다. 4 μL의 10 μM 샘플을 10x PBS(4 μL), 태아 소 혈청(4 μL), 및 뉴클레아제가 없는 물(28 μL)과 혼합하였다. 37℃에서 0, 0.5, 2, 4, 8, 18, 및 24시간 인큐베이션 후, 상이한 혼합물로부터의 각 분취량 5μL를 즉시 90℃에서 5분 동안 처리하고, 분석 전에 얼음에 보관하였다. 분취량은 1x TBE 완충액의 10% 우레아 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 통해 분석되었고, 10,000x SYBR 금 염색 염료(Invitrogen)로 염색한 후 Azure C600(Azure Biosystems)에 의해 이미지화 하였다.
[실시예]
실시예 1. 수용체-모방 하이브리드 리간드 및 핫스팟 유래 체외 선택
적절한 폴딩을 통해, 핵산은 핫스팟 펩타이드를 올바른 위치와 방향으로 배치하여 수용체와 유사한 결합 특성을 유지할 수 있는 매우 안정적이고 수용성인 3D 스캐폴드를 제공할 수 있다. 이 과정은 도 1a에 나타내었다. 특정 RBD-hACE2 상호작용의 경우, 몇 가지 핫스팟 펩타이드가 길이가 대략 30개 이하의 아미노산인 것으로 보고되어 있으나, 불용성 hACE2 막관통 수용체와는 별도로 유연한 모티프는 RBD(receptor-binding domain)의 핫스팟 표면에 강하게 결합할 수 없다. 무시할 수 있는 면역원성(immunogenicity)과 함께, 핵산은 인산염 백본의 극성 특성으로 인해 예외적으로 친수성이라는 것은 잘 알려져 있다. 더욱이 체계적으로 설계된 선택 및 증폭의 반복 주기는 hACE2-유래 RBD 결합 펩타이드를 구조적으로 안정화할 수 있는 고유한 핵산의 시험관 내 선택으로 이어질 수 있다. 다량의 불용성 도메인이 없으면, 컴팩트하고 가용성이 높은 펩타이드 안정제는 바이러스 중화를 위한 고용량 정맥 투여가 가능하다. 더욱이, 핵산의 역할은 표적 RBD와 협력적으로 상호작용하게 하는 핫스팟 결합 인핸서로서 더욱 확장될 수 있다. 즉, 1가 펩타이드 결합을 중심으로 추가 앱타머 유사 상호작용이 있을 수 있으며, hACE2-모방 하이브리드 리간드의 핫스팟 결합 능력을 더욱 향상시킬 수 있다.
핫스팟 펩타이드와 위치 특이적으로 연결된 수많은 다른 핵산(~1014)에서 핫스팟 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드는 선택 및 증폭의 반복 주기에 의해 시험관 내에서 분리될 수 있다. 이는 도 1b에 나타내었다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 초기에, 펩타이드의 아자이드-태그 C-말단은 고효율 구리-촉매 첨가환화(cycloaddition)에 의해 단일 가닥 DNA(ssDNA) 라이브러리의 5'-헥시닐 말단에 위치 특이적으로 접합될 수 있다(도 1b의 1단계). 정제 및 열 변성 후, 개별 ssDNA의 고유한 3D 폴딩을 위해 펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리를 급속 냉각시켰다. RBD-코팅 자기 비드를 도입하면 RBD 표면은 하이브리드 리간드 후보의 핫스팟 상호작용을 끌어당기고, 자기 분리는 결합되지 않은 펩타이드-DNA 접합체가 체계적으로 분리되도록 하였다(도 1b의 2-3단계). 그 후, 비드 결합 하이브리드 리간드의 DNA 도메인은 5'-헥시닐-변형 정방향 프라이머 및 5'-인산화 역방향 프라이머를 사용한 PCR에 의해 선택적으로 증폭되었다(도 1b, 4단계). 람다 핵산가수분해효소를 사용하여, 5'-헥시닐-변형 ssDNA를 생성하였고, 아자이드 태그 핫스팟 펩타이드와의 클릭 반응은 진화된 HOLD 과정의 다음 라운드를 위해 동일한 형식의 하이브리드 라이브러리 풀을 다시 제공한다(도 1b, 5단계).
실시예 2. SARS-CoV-2 RBD 결합 핫스팟 펩타이드, 및 hACE2 모방체 제조
hACE2의 RBD 접촉 잔기 중에서, L351에서 R357까지(LGKGDFR, 서열번호 15)의 7개 아미노산 단편을 SARS-CoV-2의 RBD와 강한 핫스팟 상호작용으로 인해 무작위 DNA 라이브러리와 융합되도록 선택하였다. 짧고 연속적인 사슬 내에서, 4개의 아미노산(K353, G354, D355 및 R357)은 초저온 전자 현미경(cryo-EM) 관찰에 의해 RBD 표면에 직접 접촉하는 것으로 확인하였다(도 2a). 상기 핫스팟 영역이 SARS-CoV-2 VOC(variants of concern)의 결합 친화력과 관련이 있다는 것이 중요한 것이다. RBD의 N501Y 돌연변이로 인해 VOC는 hACE2에 더 단단하고 강력하게 결합하는데, 이는 선택한 핫스팟 펩타이드의 중앙 아미노산인 hACE2의 K353이 치환된 티로신과 예상하지 못한 소수성 상호작용을 하기 때문이다(도 2b). 또한, 이 LGKGDFR 펩타이드는 2개의 소수성 및 2개의 양전하 아미노산을 포함하고 있으며, 이는 완전한 친수성 및 음전하 DNA의 성질을 제공할 수 없다. 따라서, 핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리는 SARS-CoV-2의 RBD에 대해 높은 친화도를 가지도록 진화하는 과정에서 매우 다양한 정전기적 상호 작용을 제공할 것이다.
점진적으로 증가된 엄격성(stringency)과 함께 7 라운드의 시험관 선택에서, 하이브리드 리간드 풀은 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드 간 상승 효과로 인해 RBD에 대한 강한 결합 친화성을 갖도록 성공적으로 강화되었다. 그 결과는 도 2c에 나타내었다. 또한, 각 라운드의 HOLD에서 파라미터는 하기 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2023005036-appb-img-000002
도 2c에 나타난 바와 같이, 상대적 결합 분석에서 핫스팟 펩타이드 연결 라운드 7(R7) 풀의 RBD 결합을 정량적으로 평가하였다. 핫스팟 펩타이드의 연결에도 불구하고, 무작위 DNA 라이브러리는 상당히 낮은 수준의 RBD 결합을 나타내었다. 펩타이드-핵산 하이브리드 라이브러리(Hybrid random library)가 RBD-코팅 자기 비드로 챌린지되었을 때, 결합 분율은 0.38%에 불과했으며 이는 핫스팟 펩타이드가 안정적인 스캐폴드 없이는 RBD에 강력하게 결합할 수 없음을 나타내는 것이다. LGKGDFR 펩타이드가 없는 경우, R7 풀은 RBD 결합을 약간 증가시켜 5.74%의 결합 분율을 나타냈는데, 이는 자체 앱타머 결합 효과 때문인 것으로 추정된다. 반면에, 펩타이드-지지 R7 풀은 RBD에 대한 친화력을 극적으로 향상시켰고, 이의 결합 분율(22.6%)은 랜덤 DNA-펩타이드 접합체 및 펩타이드-결핍 R7 풀보다 각각 59.37배 및 3.94배 더 증가하였다. 이러한 RBD 결합의 현저한 개선은 핫스팟 펩타이드와 새롭게 진화된 앱타머 스캐폴드 사이의 상승적 상호작용에 의한 것이다.
실시예 3. 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드의 식별 및 특성 확인
가장 최적의 펩타이드-지지 앱타머 스캐폴드는 고-처리량 시퀀싱 및 유세포 분석 기반 결합 분석을 사용하여 R7 하이브리드 리간드 풀에서 확인하였다. 400만 개 이상의 DNA가 R7 풀에서 시퀀싱되었을 때, 가장 풍부한 3개의 시퀀스 패밀리가 높은 점유율(>18%)을 차지하는 것으로 밝혀졌다. 이는 하기 표 3에 나타내었다(서열번호 16 내지 22). 3개의 서열 패밀리 중에서, 가장 대표적인 DNA 서열을 위치 특이적 펩타이드 결합을 위한 5'-헥시닐 그룹과 유세포 분석 기반 결합 분석을 위한 3'-FAM 염료로 합성하였다. 5'-연결 핫스팟 펩타이드의 경우 두 번째로 풍부한 DNA 서열(R7-02의 DNA 도메인)이 RBD 결합에서 가장 강했다. 상대적 결합 분석에서 R7-02의 RBD 결합 분율은 R7-01 및 R7-03보다 각각 약 5배 및 8배 더 컸다(도 3a).
Figure PCTKR2023005036-appb-img-000003
hACE2 모방체 역할을 하기 위해, 가장 강력한 하이브리드 리간드인 R7-02는 hACE2가 결합할 수 있는 올바른 위치에서 RBD에 대해 높은 친화성과 특이성을 나타냈다. R7-02의 Kd를 정량적으로 측정했을 때, RBD의 경우 5.702 nM이었고(도 3b, 녹색), R7-01(27.01 nM) 및 R7-03(93.8 nM)의 Kd 값은 R7-02보다 훨씬 높았다(도 3c).
또한, 분자 도킹 시뮬레이션을 실시하였고, 그 결과는 도 3d에 나타내었다.
도 3d에 나타난 바와 같이, RBD에 대한 R7-02의 높은 결합 친화력이 실제로 협동 결합 효과에 영향을 미친다고 예측하였다. 에너지 최소화 시뮬레이션 스냅샷에서 LGKGDFR 펩타이드(빨간색)는 원래 hACE2(흰색)와 RBD(파란색)의 결합 핫스팟에 정확하게 위치하며, 결합은 컨쥬게이트된 앱타머 스캐폴드(녹색)로 효과적으로 안정화된다. 3' 말단의 DNA 폴딩은 RBD의 루프 구조(A475-N487)(노란색 화살표)에 추가 결합 모티프를 제공하여, R7-02의 강력하고 특이적인 RBD 결합을 유도한다. RBD와 hACE2 사이의 인터페이스에서 R7-02의 정확한 위치는 생리학적 체액의 낮은 나노몰 농도에서 SARS-CoV-2 중화 가능성을 입증한다.
이전에 알려진 RBD 결합 친화성 시약과의 경쟁에서도 R7-02는 RBD의 표적 표면에 지속 가능한 유지된 결합을 나타냈다(도 3e 및 3f). RBD 결합 경쟁을 유도하기 위해, 핫스팟 펩타이드와 앱타머 스캐폴드의 하이브리드 리간드를 RBD-결합 핵산 앱타머(CoV2-RBD-1C, CoV2-6C3, Aptamer-1), 마크로시클릭 펩타이드(Peptide 4), 또는 단일 클론 항체(P05DHu 및 AM122)과 공동 배양하였다. 이들 중 대부분은 RBD와 hACE2 사이의 결합 인터페이스를 차단하는 것으로 알려져 있다(도 3e). 또한, R7-02에 대해 동일한 조건에서 다양한 RBD 바인더의 Kd 값을 확인하였다(도 3g).
경쟁적 결합을 평가하기 위해, 잠재적인 결합 경쟁자가 있거나 없는 R7-02의 RBD 결합 분율을 측정하고, RBD 결합의 감소를 다른 친화성 시약의 감소와 정량적으로 비교하였다(도 3f). RBD-결합 앱타머 또는 사이클릭 펩타이드와 1시간 동안 공동 배양한 후에도, R7-02는 RBD 결합을 유지할 수 있었고, 자유 결합에 대한 경쟁적 결합의 비율이 낮은 수준(약 6.8%) 감소하였다. 한편, 다른 모든 앱타머와 사이클릭 펩타이드의 RBD 결합은 경쟁적 결합과 자유 결합 사이의 비율이 최대 77.2% 감소하여 유의미하게 억제되었으며, 이는 단량체 앱타머와 사이클릭 펩타이드의 결합이 협동적 하이브리드 리간드와의 경쟁에 대해 제한적인 RBD 결합 위치를 차지하기에는 상대적으로 약하다는 것을 의미한다. 또한, 상이한 결합 위치로 인해, R7-02와 P05DHu 및 AM122 항체 간 경쟁은 무의미 하였다.
실시예 4. SARS-CoV-2 VOC(variants of concern)에 대한 hACE2 모방체의 결 합 내성
핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 분자(R7-02)는 결합에 있어서 변이체 내성이 크기 때문에, SARS-CoV-2의 보고된 모든 VOC에 강력하게 결합하는 것으로 확인하였다. 처음에는 HOLD 프로세스를 통해 야생형 RBD에 결합하도록 진화했지만, 하이브리드 리간드의 결합 능력은 VOC의 고도로 돌연변이된 RBD의 인식도 가능하다. 이로 인하여 RBD의 핫스팟 인터페이스와 강력하게 상호 작용할 수 있다. VOC는 하이브리드 리간드에서 LGKGDFR 펩타이드의 라이신과 높은 상호작용을 하는 N501Y를 포함하여 몇 가지 주요 돌연변이를 가짐으로써 hACE2 수용체에 대한 결합 및 숙주 세포로의 전달성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(도 4a).
R7-02의 5가지 VOC에 대한 결합을 정량적으로 평가했을 때, R7-02의 Kd 값(알파, 베타, 감마, 델타, 및 오미크론; 5.486 nM, 3.376 nM, 1.614 nM, 2.757 nM 및 1.209 nM)은 야생형 RBD(5.702nM)보다 낮은 바, 모든 변이체에 대한 R7-02의 결합 내성을 확인하였다(도 4b). 흥미롭게도, RBD 돌연변이가 가장 많은 Omicron은 R7-02에 의해 가장 강력하게 인식되는 반면, 선택된 여러 유형의 RBD 바인더(Aptamer-1, Peptide 4, P05DHu 및 AM122)는 심한 돌연변이에 의해 RBD 결합 능력을 잃었다(도 4c 및 4d).
이를 통해, SARS-CoV-2 VOC에 대한 R7-02의 결합 내성이 현저히 우수하다는 것을 확인하였다. 또한, 이는 핫스팟 펩타이드 유래 RBD 결합이 SARS-COV-2 VOC에 의한 개선된 hACE2 인식 메커니즘에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 5. RBD-hACE2 상호작용 억제 및 슈도 타입 SARS-CoV-2 중화
RBD에 대한 강한 결합으로 인해, 핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 SARS-CoV-2의 RBD와 hACE2 수용체 사이의 상호작용을 나노몰 농도에서도 효율적으로 억제하였다. 억제 효율의 특성화를 위해, R7-02의 농도를 1pM에서 1μM로 변화시키면서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였고, R7-02는 RBD-hACE2 결합 억제에 대해 138.9 nM의 절반-최대 억제 농도(half-maximal inhibitory concentration, IC50)를 나타내었다(도 5a).
한편, R7-02의 RBD 억제는 체계적으로 결합된 핫스팟 펩타이드와 시험관 내에서 진화된 앱타머 스캐폴드의 상승 효과에 의해 가이드되었다; R7-02의 개별 성분인 LGKGDFR 펩타이드와 앱타머 스캐폴드는 3μM 농도에서 각각 11.69%와 26.82%의 RBD-hACE2 상호작용 억제율을 보인 반면, R7-02의 전체 구조는 89.60%의 억제율을 보였다. aptameric behavior의 증거로서, DNA 스캐폴드 단독 실험군은 무작위 DNA 라이브러리(억제율 3.77%)에 비해 더 나은 억제 효율을 나타내었다(도 5b).
이전에는 여러 RBD-결합 친화성 시약이 RBD 표면의 정확한 hACE2 접촉 잔기를 차단할 수 없었기 때문에, RBD-hACE2 상호작용을 효과적으로 억제하지 못하였다. 대조적으로, R7-02의 핫스팟-유래 RBD 결합은 hACE2 결합에서 RBD의 효율적인 억제를 입증하여 SARS-CoV-2 중화에 대한 큰 잠재력을 나타내었다.
이에, 핫스팟 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 SARS-CoV-2 중화 능력을 추가로 확인하였다. 중화 분석을 위해, SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 녹색 형광 단백질(GFP)을 모두 발현하지만 자가 복제 기능이 없는 슈도 타입 SARS-CoV-2를 준비하였다. 슈도 타입 SARS-CoV-2에 의해 감염된 세포에서만 발현되는 GFP의 형광 강도를 측정하여 R7-02의 중화 효율을 형광으로 분석하였다(도 5c). 간략하게, hACE2-과발현 HEK-293T 세포주(hACE2-293T)를 밤새 마이크로플레이트에 미리 접종한 후, 바이러스 감염을 위해 6시간 동안 슈도 타입 SARS-CoV-2(0.5 다중 감염, MOI)로 챌린지하였다. 그 결과는 도 5d 및 5e에 나타내었다.
도 5d 및 5e에 나타낸 바와 같이, RBD 억제제가 없는 경우, hACE2-293T는 슈도 타입 SARS-CoV-2에 감염되었으며, 정량적으로 전체 세포의 58.4%가 성공적인 바이러스 감염의 증거로 강한 녹색 형광을 방출하였다. 한편, R7-02를 구성하는 핫스팟 펩타이드 또는 앱타머 스캐폴드가 있는 경우, RBD 결합 수준이 제한되어 슈도 타입 SARS-CoV-2의 감염율이 각각 22.0%와 12.6%로 감소하였다. 또한, 핫스팟 펩타이드 지지 앱타머 스캐폴드인 R7-02는 무시할 수 있는 녹색 형광을 보이며, 현저히 낮은 감염된 세포의 백분율(1.9%)을 나타내었다.
다양한 많은 RBD 바인더의 바이러스 감염율과 비교했을 때 R7-02의 바이러스 감염율이 상당히 낮거나 비슷한 것으로 나타났다(도 5f 및 5g). 한편, 가장 일반적으로 사용되는 중화 항체와 달리, 본 발명의 하이브리드 리간드는 완전히 합성된 것임을 고려해야 한다. 즉, 본 발명은 단클론 항체의 10분의 1 수준인 낮은 분자량(20 kDa)을 가지면서도 효율적인 감염 억제의 효과를 확인할 수 있다. 또한, 추가 변형 없이 펩타이드-앱타머 하이브리드 리간드의 키메라 구조는 잘 알려진 올리고뉴클레오티드 변형(예: 포스포로티오에이트 백본, 2'-O-메틸 및 2'-F 변형)(도 5h)에 비해 좋은 뉴클레아제 저항성 및 혈청 안정성을 보였으며, SARS-CoV-2 중화제로서의 큰 잠재력을 나타내었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (20)

  1. 하기 단계를 포함하는 표적 단백질 결합 펩타이드-핵산 하이브리드 분자 제조방법:
    (a) 핫스팟 유래 펩타이드, 및 무작위 핵산 라이브러리를 위치 특이적 결합하여 펩타이드-핵산 하이브리드를 제조하는 단계;
    (b) 표적 단백질이 코팅된 자성 비드와 단계 (a)의 펩타이드-핵산 하이브리드를 혼합 배양하는 단계; 및
    (c) 자석을 이용해서 표적 단백질에 결합하는 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 선별하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제조방법은 하기 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법:
    (d) 상기 단계 (c)에서 선별된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 핵산 부분을 선택적으로 증폭하고 복제하는 단계;
    (e) 상기 단계 (d)에서 생성된 이중 가닥 DNA를 핵산 가수분해효소를 이용하여 단일 가닥 DNA로 제조하여 정제하는 단계; 및
    (f) 상기 단계 (e)의 단일 가닥 DNA로 구성된 새로운 무작위 핵산 라이브러리를 제조하여, 상기 단계 (a) 내지 (f)의 선별, 증폭, 및 정제 과정을 반복하는 단계.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제조 방법은 상기 (a) 단계 이후, 펩타이드-핵산 하이브리드를 열 변성 및 냉각하여 핵산의 3D 폴딩을 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 핫스팟 유래 펩타이드는 C 말단 또는 N 말단에 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 및, 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 펩타이드이며,
    상기 (a) 단계의 무작위 핵산 라이브러리는 5' 말단에 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 단일 가닥 핵산을 포함하며,
    상기 핫스팟 유래 펩타이드 및 단일 가닥 핵산은 클릭반응에 의해 위치 특이적 결합되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 핫스팟 유래 펩타이드는 C 말단 또는 N 말단에 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 펩타이드이며,
    상기 (a) 단계의 무작위 핵산 라이브러리는 5' 말단에 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 및, 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 단일 가닥 핵산을 포함하며,
    상기 핫스팟 유래 펩타이드 및 단일 가닥 핵산은 클릭반응에 의해 위치 특이적 결합되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 (d) 단계의 핵산 부분의 증폭은 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 및 알카인(alkyne)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기가 결합된 정방향 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 무작위 핵산 라이브러리는 하기와 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 제조방법:
    5'-작용기-정방향 프라이머-[Nx] -역방향 프라이머-3',
    상기 작용기는 헥시닐(hexynyl), 5-옥타디이닐(5-Octadiynyl), 알카인(alkyne), 아지도 리신(Azido lysine), 아지도부탄산(Azidobutanoic acid), 아지도아세트산(Azinoacetic acid), 및 아자이드(azide)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이며,
    여기에서 N 은 A, T, C 또는 G 이고, x 는 25 내지 100의 정수.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 핫스팟 유래 펩타이드는 수용체 및 이의 표적 단백질 사이의 결합 부위의 아미노산인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표적 단백질은 바이러스 외피 단백질, 성장인자 단백질, 세포막 수용체, 항체, 또는 항원 단백질인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 바이러스 외피 단백질은 스파이크 단백질, 섬유단백질(Fiber protein), 및 외피 당단백(Envelope Glycoprotein)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 바이러스는 코로나 바이러스(Coronavirus), 인플루엔자 바이러스(influenza　virus), 간염 바이러스(Hepatitis　virus), 인체면역결핍바이러스(HIV), 인간 유두종 바이러스(Human　Papillomavirus), 헤르페스 바이러스(Herpesvirus), 에볼라 바이러스(Ebolavirus), 메르스 바이러스 (MERS　virus), 로타 바이러스(Rotavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 원숭이두창 바이러스(Monkeypox virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 광견병바이러스(Rabies virus), 및 노로 바이러스(Norovirus)로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 코로나 바이러스는 인간 코로나 바이러스 229E(HCoV-229E), 인간 코로나 바이러스 OC43(HCoV-OC43), 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스(SARS-CoV), 인간 코로나 바이러스 NL63(HCoV-NL63, 뉴헤븐 코로나 바이러스), 인간 코로나 바이러스 HKU1, 중동호흡기증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV), 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스 2(SARS-Cov-2), 및 이들의 변이종으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 수용체와 이의 표적 단백질 사이의 결합 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 하기 특징 중 어느 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는, 제조방법:
    (a) 뉴클레아제 저항성; 및
    (b) 혈청 안정성.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 바이러스를 중화시키는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자의 수용체와 이의 표적 단백질 사이의 결합 부위에 대한 결합력을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 펩타이드-핵산 하이브리드 분자는 바이러스와 숙주세포 수용체의 결합 차단용인, 펩타이드-핵산 하이브리드 분자.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 포함하는 바이러스 중화용 조성물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 펩타이드-핵산 하이브리드 분자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 억제 또는 중화 방법.
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