WO2023219172A1 - 加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法 - Google Patents

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
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    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01002—Glutaminase (3.5.1.2)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a processed vegetable protein-containing composition, and more specifically to a method for producing a vegetable protein-containing composition that has been processed to increase the amount of free glutamic acid.
  • Non-Patent Document 1 Processing that uses endo-type proteases to cleave proteins is said to be effective in imparting various properties to food materials containing protein, such as improving digestibility and reducing allergens.
  • the occurrence of bitter taste in food is an issue in the development of food processing technology. This bitter taste is caused by bitter peptides produced by hydrolyzing proteins in foods.
  • a protein is a chain of 100 to 1000 amino acids, which is folded regularly and exists as a spherical mass. There are many hydrophilic amino acids on the outside of the spherical lump, and many hydrophobic amino acids on the inside. When the protein is hydrolyzed, this lump-like structure is destroyed and the hydrophobic amino acids that were on the inside are destroyed. The portion containing a large amount of is cleaved and exposed as a bitter peptide, which causes bitterness (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 soybean protein (Fujipro F) was treated with protease derived from Bacillus licheniformis to create a protein hydrolyzate, and then this protein hydrolyzate was treated with B. It has been confirmed that ⁇ -glutamylation can be performed with glutaminase derived from C. amyloliquefaciens, and that this reduces bitterness (Non-Patent Document 2).
  • glutaminase treatment has been proposed as a treatment to reduce the bitterness of certain protein hydrolysates, but because glutaminase has narrow substrate specificity, the effect of improving the amount of glutamic acid released is limited, and there is still no improvement yet. There is room for
  • an object of the present invention is to provide a processing technique that increases the amount of free glutamic acid in a protein hydrolyzate.
  • the present inventors have discovered that the amount of free glutamic acid can be dramatically increased by treating a vegetable protein-containing composition with a proteolytic enzyme and protein glutaminase.
  • the present invention was completed through further studies based on this knowledge.
  • Item 1 A method for producing a processed vegetable protein-containing composition, comprising the step of treating the vegetable protein-containing composition with a proteolytic enzyme and protein glutaminase.
  • Item 2. Item 2. The production method according to Item 1, wherein the protease is a protease and/or a peptidase.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 4. 4.
  • Item 5. Item 5.
  • Item 9. Item 9. The production method according to Item 7 or 8, wherein the bacterial protease is selected from the group consisting of Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, and proteases derived from these Geobacillus genus.
  • Item 10. 10 The production method according to any one of Items 2, 3, and 7 to 9, wherein the protease is a bacterial protease or a filamentous fungus peptidase.
  • Item 11. Item 11.
  • Item 15 A vegetable protein-containing food or drink obtained by the production method according to any one of Items 1 to 14.
  • a processing technique that increases the amount of free glutamic acid in a protein hydrolyzate.
  • the method for producing a processed vegetable protein-containing composition of the present invention includes a step of treating a vegetable protein-containing composition with a proteolytic enzyme and a protein glutaminase (enzyme treatment step). It is characterized by Since the enzyme treatment step can improve (increase) the amount of free glutamic acid in the composition containing vegetable protein, a composition containing vegetable protein that has been processed to increase the amount of free glutamic acid can be obtained.
  • enzyme treatment step can improve (increase) the amount of free glutamic acid in the composition containing vegetable protein, a composition containing vegetable protein that has been processed to increase the amount of free glutamic acid can be obtained.
  • Vegetable protein-containing composition The vegetable protein-containing composition used in the present invention contains vegetable protein and water, and is typically a composition for consumption. There are no particular restrictions on the properties of the vegetable protein-containing composition, and examples include fluid properties such as liquid, slurry, and paste (hereinafter, vegetable protein-containing compositions with fluid properties will be referred to as liquid, slurry, and paste). (also collectively referred to as "liquid, etc.”), and solid forms.
  • plant protein-containing compositions prepared from non-organized protein materials include (i) plant protein materials (specifically, plant organs of plants from which plant proteins are derived; Liquids obtained by dispersing dry powders of (hereinafter the same shall apply hereinafter) in water, etc., including at least one of materials that have an increased protein content by removing at least a portion of components other than proteins from organs. (ii) The vegetable protein material is crushed and dispersed in water, and if necessary, insoluble matter originating from the skin of the plant material is removed by any means such as centrifugation, filtration, straining bag, or sieve. (iii) Liquid, etc. that is obtained by removing components other than vegetable protein from the liquid, etc.
  • Examples include liquids obtained by mixing a dry powder prepared from any of the liquids in (v) to (iii) with water; examples of liquids prepared from structured protein materials include (v) swollen with water; Examples include structured vegetable protein materials.
  • the structured vegetable protein material used in the preparation of the specific example (v) above is a food material generally known as a meat substitute (pseudo meat).
  • a typical example of a textured vegetable protein material is a material obtained by extruding a raw material mixture containing vegetable protein and water using an extruder or the like, drying or freezing it, and forming a meat-like texture.
  • the "meat" imitated by the textured vegetable protein material refers to the muscle of animals that are edible. It is used in a sense that also includes the person's own body.
  • the shape of the structured vegetable protein material includes granular and fibrous shapes.
  • Granular shapes include lump shapes of various sizes such as small grains (minced), large grains, and block shapes (sizes increase in the order of small grains, large grains, and block shapes); flake shapes, fillet shapes, and slices. Examples include flat shapes of various sizes (flake-type, fillet-type, and slice-type in increasing order) such as molds.
  • structured vegetable protein materials include granular vegetable protein and fibrous vegetable protein.
  • Granular vegetable protein and fibrous vegetable protein both refer to those defined in the "Japanese Agricultural Standards for Vegetable Protein.”
  • the structured vegetable protein material used in the present invention is limited to the granular vegetable protein and fibrous vegetable protein defined above as long as it is a meat-like textured material as described above. isn't it.
  • characteristics other than the type of vegetable protein and the content ratio of vegetable protein e.g., properties, moisture content, particle size, temperature, raw materials other than food additives, Food additives, texture, water retention, foreign matter, content
  • their measurement methods can comply with the characteristics and measurement methods defined in the "Japanese Agricultural Standards for Vegetable Proteins.”
  • the content of vegetable protein contained in the textured vegetable protein material is not particularly limited, but for example, 20% by weight or more, 25% by weight. or 30% by weight or more. From the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, the content is preferably 35% by weight or more, more preferably 40% by weight or more, and still more preferably 45% by weight or more.
  • the upper limit of the content range is not particularly limited, but is, for example, 90% by weight or less, preferably 80% by weight or less, more preferably 70% by weight or less, even more preferably 60% by weight or less, even more preferably 55% by weight or less. Can be mentioned.
  • liquid vegetable protein-containing composition is vegetable milk.
  • content of vegetable protein material in a vegetable protein-containing composition refers to a vegetable protein-containing composition prepared using a non-organized vegetable protein material. This is the proportion of the dry weight of the components constituting the plant organs contained in the composition, and in the case of a plant protein-containing composition prepared using a structured plant protein material, This refers to the proportion of the dry weight of the protein material.
  • the vegetable protein-containing composition is a liquid consisting only of components derived from plant organs and water, as in the specific examples (i) to (iv) above, “vegetable protein material” "content” refers to the proportion of the dry weight of the liquid, etc.
  • the "content of vegetable protein material” refers to the content of the vegetable protein material excluding the additives. Refers to the proportion of dry weight of a part. Furthermore, if the vegetable protein-containing composition is a swollen product consisting only of a structured vegetable protein material and water, as in the specific example (v) above, the “content of the vegetable protein material” is , refers to the percentage of dry weight of the composition. When the vegetable protein-containing composition is a swollen material containing the specific example (v) above and an additive, the "content of vegetable protein material” is the dry weight of the portion of the swollen material excluding the additive. Refers to the proportion of
  • vegetable proteins include, but are not limited to, legumes such as soybeans, peas, lentils, chickpeas, black beans, fava beans, mung beans, lupine beans, and kidney beans; wheat, barley, oats, Grains such as sorghum, rice, rye, buckwheat, millet, millet, teff, corn, and potato; almonds, coconuts, peanuts, cashews, hazelnuts, pecans, macadamia nuts, pistachios, walnuts, Brazil nuts, pili nuts, chestnuts, sesame, and pine nuts Nuts such as nuts; proteins (natural proteins) contained in seeds such as hemp seeds (industrial hemp), chia seeds, chia, amaranth, canary seeds, flaxseed; Examples include chemically partially degraded proteins; chemically modified proteins using various reagents, and synthetic peptides.
  • the above-mentioned vegetable proteins may be used alone or in combination.
  • proteins from beans are preferred, and proteins from soybeans, peas, lentils, chickpeas, fava beans, mung beans, and lupin beans are more preferred, and proteins from lupine beans are more preferred.
  • proteins from soybeans and peas include protein from soybeans and peas.
  • the content of vegetable protein in the vegetable protein-containing composition is not particularly limited, but when the vegetable protein-containing composition is prepared from a non-organized protein material, for example, 0.01 to 50% by weight, 0.05% by weight. -40% by weight, or 0.1-30% by weight, preferably 0.25-25% by weight, or 0.35-15% by weight, more preferably 0.45-10% by weight, or 0.6-9 % by weight, for example 1 to 70% by weight, preferably 5 to 50% by weight, more preferably 10 to 30% by weight, even more preferably when the vegetable protein-containing composition is prepared from a structured protein material. 15 to 25% by weight.
  • the content of the vegetable protein material in the vegetable protein-containing composition is not particularly limited, but when the vegetable protein-containing composition is prepared from a non-organized protein material, for example, 0.05 to 50% by weight, Examples include 0.1 to 40% by weight, or 0.5 to 30% by weight, preferably 1 to 25% by weight, or 3 to 20% by weight, more preferably 5 to 15% by weight, or 7 to 12% by weight. , when the vegetable protein-containing composition is prepared from a structured protein material, for example, 20 to 60% by weight, preferably 30 to 50% by weight, more preferably 35 to 45% by weight.
  • the vegetable protein contained in the vegetable protein-containing composition is a starchy plant protein such as a grain (preferably barley, sorghum, or rye)
  • a vegetable protein-containing composition is preferably pretreated with amylase.
  • the amylase typically includes ⁇ -amylase.
  • the ⁇ -amylase is not particularly limited, but includes, for example, those of the Aspergillus genus (e.g., Aspergillus oryzae, Aspergillus niga, etc.), the Bacillus genus (e.g., Bacillus amyloliquefaciens), Examples include ⁇ -amylase derived from Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, etc., preferably ⁇ -amylase derived from the genus Bacillus, and more preferably ⁇ -amylase derived from Bacillus. - ⁇ -Amylase derived from Amyloliquefaciens sp.
  • Aspergillus genus e.g., Aspergillus oryzae, Aspergillus niga, etc.
  • Bacillus genus e.g., Bacillus amyloliquefaciens
  • Examples include ⁇ -amylase derived from Bacillus subtilis, Bac
  • the amount of ⁇ -amylase to be used is, for example, 0.5 to 100 U, 1 to 50 U, 2 to 25 U, or 3 to 10 U, preferably 4 to 8 U, per 1 g of the vegetable protein-containing composition.
  • 1 unit (1U) is the amount of enzyme that reduces the iodine-induced coloration of potato starch by 10% in 1 minute.
  • protease any enzyme that can decompose a peptide chain can be used without particular limitation, and typically includes protease and/or peptidase.
  • protease refers to endo-type peptidase.
  • Proteases are not particularly limited in their origin, but include, for example, proteases derived from filamentous fungi and proteases derived from bacteria.
  • protease derived from silk bacteria but for example, Aspergillus, the genus Rhizopus, the genus Mucor (Mucor), the genus Neurospora, the genus (Penicil). LIUM) Authority, Rhizomucor , and proteases derived from the genus Sclerotinia.
  • proteases derived from the genus Aspergillus include Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus melleus, and Aspergillus japonicus. rgillus japonicus), Aspergillus awamori (Aspergillus awamori), Aspergillus kawachii, Aspergillus sojae, Aspergillus tamarii, Aspergillus foet idus), Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus ⁇ Aspergillus aculeatus, Aspergillus candidus, Aspergillus flavus, Aspergillus saitoi , Aspergillus inuii, Aspergillus glaucus, Aspergillus inui Aspergillus caesiellus, Aspergillus clavatus, Aspergillus deflectus,
  • proteases derived from the genus Rhizopus include Rhizopus chinensis, Rhizopus delemar, Rhizopus niveus, and Rhizopus oryzae. oryzae) and the like.
  • bacterial-derived proteases examples include proteases derived from the genus Bacillus and the genus Geobacillus.
  • proteases derived from the genus Bacillus include Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus clausii, and Bacillus clausii. Bacillus intermedius ), Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis S subtilis), and Bacillus thermoproteolyticus , and proteases derived from these Geobacillus species.
  • the above proteases may be used alone or in combination.
  • proteases derived from filamentous fungi from the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, proteases derived from the genus Aspergillus and proteases derived from the genus Rhizopus are preferred.
  • proteases derived from the genus Aspergillus preferred are the proteases derived from Aspergillus oryzae, the proteases derived from Aspergillus niga, and the proteases derived from Aspergillus meleus, from the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid;
  • the proteases Rhizopus niveus-derived protease is preferred from the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid.
  • bacterial-derived proteases from the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, Bacillus stearothermophilus-derived protease, Bacillus licheniformis-derived protease, Bacillus amyloliquefaciens-derived protease and These proteases derived from the genus Geobacillus can be mentioned, and more preferred are proteases derived from Geobacillus stearothermophilus, proteases derived from Bacillus amylochaefaciens, and proteases derived from Bacillus licheniformis, and even more preferred are proteases derived from Bacillus licheniformis. derived proteases.
  • the amount of protease used is not particularly limited, but the amount used per 1 g of vegetable protein material may be, for example, 110 U or more. From the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, preferably 200 U or more, 350 U or more, or 500 U or more, more preferably 700 U or more, or 900 U or more, still more preferably 1000 U or more, and still more preferably 1100 U or more.
  • the upper limit of the usage range of protease per gram of vegetable protein material is not particularly limited, but for example, 300,000U or less, 150,000U or less, 100,000U or less, 75,000U or less, 50,000U or less, 40,000U or less, 30,000U or less, 25,000U or less, 20,000U or less, 15,000U or less, or 10,000 U or less.
  • the amount of protease used per 1 g of vegetable protein is, for example, 110 U or more, and from the viewpoint of further increasing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, it is preferably 200 U or more, 350 U or more, or 500 U or more, more preferably Examples include 750U or more, or 1000U or more, more preferably 1200U or more, even more preferably 1300U or more, or 1400U or more.
  • the upper limit of the usage range of protease per gram of vegetable protein is not particularly limited, but for example, 600,000U or less, 300,000U or less, 150,000U or less, 100,000U or less, 75,000U or less, 60,000U or less, 50,000U or less, 40,000U or less, 30,000U or less, 25,000U or less, or 20,000 U or less.
  • protease activity shall be measured by the Folin method using casein as a substrate. That is, protease activity can be determined by performing an enzymatic reaction using casein as a substrate at a pH set according to the optimum pH of the protease to be measured, and increasing the colored substance in Folin reagent solution equivalent to 1 ⁇ g of tyrosine per minute. The amount of enzyme produced is 1 unit (1U).
  • peptidase refers to exo-type peptidase.
  • Peptidases are not particularly limited in their origin, but examples thereof include peptidases derived from filamentous fungi, peptidases derived from actinomycetes, and peptidases derived from bacteria.
  • Peptidases derived from bacteria are not particularly limited, and include, for example, peptidases derived from the genus Bacillus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, and the like.
  • the above peptidases may be used alone or in combination.
  • peptidases derived from filamentous fungi are preferably used, and more preferably peptidases derived from the genus Rhizopus (among others Rhizopus oryzae) and the genus Aspergillus (among others Aspergillus oryzae) are mentioned.
  • examples include peptidases, and more preferably peptidases derived from the genus Rhizopus (especially Rhizopus oryzae).
  • the amount of peptidase to be used is not particularly limited, but in both cases where the vegetable protein-containing composition is prepared from unstructured protein material and from structured protein material, the amount of peptidase used is The amount used is, for example, 0.001 U or more. From the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, preferably 0.005U or more, 0.01U or more, or 0.015U or more, more preferably 0.025U or more, 0.05U or more, 0.075U or more, or Examples include 0.1U or more, more preferably 0.13U or more, 0.15U or more, 0.18U or more, 0.2U or more, or 0.23U or more, even more preferably 0.25U or more, or 0.27U or more.
  • the amount of peptidase used per 1 g of the vegetable protein material is preferably 0.5 U or more, or 1 U or more, more preferably 2. Examples include 5U or more, 5U or more, or 7.5U or more, more preferably 10U or more, 15U or more, or 20U or more, even more preferably 25U or more, or 30U or more, even more preferably 35U or more, or 40U or more.
  • the upper limit of the usage range of peptidase per 1 g of vegetable protein material is not particularly limited, but it can be In this case, examples include 500U or less, 300U or less, 200U or less, 100U or less, 75U or less, 50U or less, or 45U or less.
  • the upper limit of the range of the amount of peptidase used per 1 g of the vegetable protein material is, for example, 500 U or less, preferably 400 U or less, or 300 U or less, More preferably 200U or less, or 100U or less, still more preferably 80U or less, 70U or less, or 60U or less, even more preferably 55U or less, or 50U or less.
  • the amount of peptidase to be used per 1 g of vegetable protein is, for example, 0.000, regardless of whether the vegetable protein-containing composition is prepared from a non-organized protein material or from a structured protein material.
  • the amount of free glutamic acid preferably 0.005U or more, 0.01U or more, or 0.015U or more, more preferably 0.025U or more, or 0.05U or more.
  • more preferably 0.075U or more or 0.1U or more, even more preferably 0.13U or more, 0.15U or more, 0.18U or more, 0.2U or more, or 0.23U or more, even more preferably 0.
  • Examples include 25U or more, or 0.27U or more, particularly preferably 0.3U or more, or 0.33U or more.
  • the amount of peptidase used per gram of vegetable protein is preferably 1 U or more, or 2.5 U or more, more preferably 5 U or more, or 10 U or more, more preferably 20 U or more, 30 U or more, or 40 U or more, still more preferably 50 U or more, 60 U or more, or 70 U or more, even more preferably 75 U or more, or 80 U or more.
  • the upper limit of the usage range of peptidase per gram of vegetable protein is not particularly limited, but in both cases where the vegetable protein-containing composition is prepared from unstructured protein material and from structured protein material. Also, for example, 1000U or less, 900U or less, 800U or less, 700U or less, 600U or less, 500U or less, 300U or less, 200U or less, 100U or less, or 90U or less.
  • the upper limit of the usage range of peptidase per gram of vegetable protein is, for example, 1000 U or less, 800 U or less, 600 U or less, 500 U or less, 400 U. Examples include 300U or less, 200U or less, 150U or less, 100U or less, or 90U or less.
  • Peptidase activity shall be measured using L-leucyl-p-nitroanilide hydrochloride as a substrate and by a method based on the 9th edition of the Japan Food Additives Official Standards, specifically, L-leucyl-p- An enzymatic reaction is carried out in a conventional manner using nitroanilide hydrochloride as a substrate, and the activity to produce 1 ⁇ mol of p-nitroaniline per minute is defined as 1 unit (1 U).
  • Protein Glutaminase used in the present invention may be any enzyme that exhibits the action of decomposing the amide group-containing side chain of glutamine residues without cleaving peptide bonds or cross-linking proteins, with particular regard to its type and origin. Not limited.
  • Examples of protein glutaminase include Chryseobacterium genus and Flavobacterium genus, which are disclosed in JP-A No. 2000-50887, JP-A No. 2001-218590, and International Publication No. 2006/075772. , the genus Empedobacter, the genus Sphingobacterium, the genus Aureobacterium, or the genus Myroides. These protein glutaminases may be used alone or in combination.
  • protein glutaminases from the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, protein glutaminase derived from the genus Chryseobacterium is preferred, and Chryseobacterium proteolyticum is more preferred.
  • proteins glutaminase derived from seeds are preferred.
  • Protein glutaminase can be prepared from the culture solution of the microorganism from which the protein glutaminase is derived.
  • a specific preparation method includes a method of recovering protein glutaminase from the culture solution or cells of the above-mentioned microorganism.
  • the enzyme can be isolated and/or purified after the bacterial cells are recovered from the culture solution by filtration, centrifugation, etc., if necessary.
  • protein glutaminase non-secreting microorganisms if necessary, after collecting the bacterial cells from the culture solution, crushing the bacterial cells by pressure treatment, ultrasonication, etc.
  • Enzymes can be separated and/or purified.
  • any known protein separation and/or purification method can be used without particular limitation, such as centrifugation method, UF concentration method, salting out method, ion exchange resin, etc. Examples include various chromatography methods using .
  • the isolated and/or purified enzyme can be powdered by a drying method such as freeze drying or vacuum drying, and may be powdered using an appropriate excipient and/or drying aid in the drying method. You can also do that.
  • the isolated and/or purified enzyme can be liquefied by adding appropriate additives and sterilizing it by filtration.
  • the amount of protein glutaminase to be used is not particularly limited, but in both cases where the vegetable protein-containing composition is prepared from unstructured protein material and from structured protein material, the amount of protein glutaminase used is per 1 g of vegetable protein material. As the usage amount, for example, 0.01U or more can be mentioned. From the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, the amount of protein glutaminase used per 1 g of vegetable protein material is preferably 0.5 U or more, more preferably 0.75 U or more, and still more preferably 1.0 U or more. , more preferably 1.2 U or more.
  • the amount of protein glutaminase used per 1 g of the vegetable protein material is preferably 0.01 U or more, more preferably 0.1 U or more, Or 0.25U or more, more preferably 0.5U or more, or 0.8U or more, still more preferably 1U or more, or 1.2U or more.
  • the upper limit of the amount of protein glutaminase to be used per 1 g of vegetable protein material is not particularly limited; Also in the case of Examples include 2U or less.
  • the upper limit of the amount of protein glutaminase used per 1 g of the vegetable protein material is, for example, 200 U or less, 150 U or less, 120 U or less, 100 U or less. , 80U or less, 60U or less, 40U or less, 30U or less, 20U or less, 10U or less, 7.5U or less, 5U or less, 2.5U or less, or 2U or less.
  • the amount of protein glutaminase to be used per gram of vegetable protein is, for example, 0. Examples include 15U or more.
  • the amount of protein glutaminase used per 1 g of vegetable protein is preferably 0.5 U or more, more preferably 0.75 U or more, even more preferably 1.0 U or more, More preferably, it is 1.2 U or more.
  • the amount of protein glutaminase used per gram of vegetable protein is preferably 0.1 U or more, or 0.25 U or more, more preferably Examples include 0.5U or more, or 0.75U or more, more preferably 1U or more, or 1.5U or more, still more preferably 2U or more, or 2.5U or more.
  • the upper limit of the amount of protein glutaminase to be used per gram of vegetable protein is not particularly limited, but the upper limit of the amount range for protein glutaminase used per 1 g of vegetable protein is not particularly limited; In the case of 7. Examples include 5U or less, 5U or less, or 2.5U or less.
  • the upper limit of the amount of protein glutaminase used per gram of vegetable protein is, for example, 400 U or less, 300 U or less, 200 U or less, 100 U or less, Examples include 50U or less, 25U or less, 20U or less, 10U or less, or 5U or less.
  • the usage ratio of proteolytic enzyme and protein glutaminase is determined based on the above usage amount for each enzyme, but from the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, the following usage ratios are preferably used.
  • the amount of protein glutaminase used per 1 U of protease is preferably 0.005 mU or more, more preferably 0.01 mU or more, or 0.02 mU or more, still more preferably 0.03 mU or more, 0.04 mU or more, or 0.045 mU. Above, more preferably 0.05 mU or more, 0.075 mU or more, 0.1 mU or more, or 0.15 mU or more.
  • the upper limit of the usage range of protein glutaminase per 1 U of protease is, for example, 15 mU or less, and from the viewpoint of further increasing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, preferably 12 mU or less, or 10 mU or less, more preferably 8 mU or less, or 6 mU or less, more preferably 5 mU or less, or 4 mU or less, even more preferably 3 mU or less, 2 mU or less, or 1.5 mU or less.
  • the amount of protein glutaminase to be used per 1 U of peptidase is preferably 0.001 U or more, regardless of whether the vegetable protein-containing composition is prepared from a non-organized protein material or a structured protein material. , more preferably 0.005U or more, or 0.01U or more, still more preferably 0.015U or more, 0.02U or more, or 0.025U or more, still more preferably 0.03U or more.
  • the amount of protein glutaminase used per 1 U of peptidase is more preferably 0.005 U or more, still more preferably 0.01 U or more, or 0.02 U.
  • the upper limit of the range of the amount of protein glutaminase used per 1 U of peptidase is, for example, 100 U or less in both cases where the vegetable protein-containing composition is prepared from a non-organized protein material and a structured protein material. From the viewpoint of further enhancing the effect of increasing the amount of free glutamic acid, preferably 75 U or less, 50 U or less, or 40 U or less, more preferably 30 U or less, or 20 U or less, still more preferably 15 U or less, or 10 U or less, and even more preferably Preferably, it is 7U or less, 6U or less, or 5.5U or less.
  • the upper limit of the range of the amount of protein glutaminase used per 1 U of peptidase is preferably 3 U or less, more preferably 2 U or less, or 1 U or less, and even more preferably is 0.5U or less, or 0.1U or less, more preferably 0.075U or less, or 0.05U or less.
  • benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine (Z-Gln-Gly) is used as a substrate, and the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of ammonia per minute is 1 unit (1 U).
  • the treatment advances a reaction that liberates glutamic acid in the vegetable protein-containing composition.
  • proteolytic enzyme and protein glutaminase are made to act is not particularly limited, and each enzyme may be made to act sequentially in any order, or both enzymes may be made to act simultaneously, but preferably both enzymes are made to act at the same time. can be done.
  • Conditions (temperature, pH, time, etc.) for the treatment with proteolytic enzymes and protein glutaminase are appropriately selected depending on the degree of the desired effect of increasing the amount of free glutamic acid.
  • the temperature at which the treatment with proteolytic enzymes and protein glutaminase is carried out is not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the optimal temperature of the enzyme used and/or the thermal characteristics of the vegetable protein-containing composition.
  • the temperature is 30°C to 80°C, preferably 40°C to 70°C, more preferably 40°C to 60°C.
  • the pH of the reaction system in which the treatment with proteolytic enzymes and protein glutaminase is performed is not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the optimum pH of the enzyme used and/or the pH characteristics of the vegetable protein-containing composition.
  • the pH at 25° C. is, for example, 2 to 9, preferably 3 to 8, more preferably 5 to 7, and even more preferably 6 to 7.
  • the time for the treatment with protease and protein glutaminase is, for example, 0.5 to 96 hours, preferably 1 to 72 hours, and more preferably 1 to 30 hours.
  • the production method of the present invention can include any other steps in addition to the enzyme treatment step described above.
  • Specific examples of other steps include the step of preparing the vegetable protein-containing composition described above as a step performed before the enzyme treatment step, and the step of preparing a composition containing a proteolytic enzyme as a step performed after the enzyme treatment step.
  • Examples include a step of deactivating protein glutaminase, a step of filtering the processed vegetable protein-containing composition, and a step of drying the processed vegetable protein-containing composition.
  • methods in the drying step include freeze drying, vacuum drying, spray drying, and the like.
  • the food and drink containing vegetable protein of the present invention is a processed vegetable protein-containing composition obtained by the above-mentioned "1. Method for producing a composition containing processed vegetable protein" or a food and drink material containing the same. It is a cooked product. In these plant protein-containing foods and drinks of the present invention, the amount of free glutamic acid is increased.
  • the cooking method for obtaining the cooked product includes: Any cooking method that is practiced can be used. Specific examples of cooking methods include seasoning, adding food additives, mixing other food and drink materials, heating, fermentation, molding, freezing, and/or baking.
  • the properties of the vegetable protein-containing food or drink of the present invention are not particularly limited.
  • the properties are determined depending on the properties of the vegetable protein-containing composition and the presence or absence of a drying step in the above manufacturing method, but, for example, , liquid, slurry, paste, and other fluid forms and solid forms.
  • Specific examples of solid forms include powder, fine granules, granules, structured forms swollen with water, and dry forms. Examples include organizational form.
  • the vegetable protein-containing food/beverage product of the present invention is a cooked product of a processed vegetable protein-containing composition
  • the properties include any property of a plant-based alternative food/beverage product of a general animal protein cooked product.
  • cooked products are not particularly limited as long as they are plant-based substitute foods and beverages for common animal protein cooked products, and include, for example, substitute milk, substitute meat, substitute cheese, substitute yogurt, and the like.
  • the combination of protease and protein glutaminase can improve (increase) the level of free glutamic acid in a composition containing vegetable protein. Therefore, the present invention also provides an agent for improving the amount of free glutamic acid in a vegetable protein-containing composition containing a protease and a protein glutaminase.
  • Proteolytic enzyme (1-1) Protease, protease derived from Aspergillus niger, protease derived from Rhizopus niveus, protease derived from Aspergillus oryzae, protease derived from Aspergillus melleus, Bacillus licheniformis-derived protease, Bacillus amyloliquefaciens-derived protease, Geobacillus stearothermophilus-derived protease (1- 2) Peptidase/Peptidase derived from Aspergillus oryzae/Peptidase derived from Rhizopus oryzae (2) Protein glutaminase/Protein glutaminase (PG) derived from Chryseobacterium proteolyticum (3) Glutaminase/Glutaminase derived from Bac
  • Proteolytic enzyme (1-1) Protease, protease derived from Aspergillus n
  • Vegetable protein-containing composition used in preliminary test examples and Test Examples 1 and 2 liquid vegetable protein-containing composition
  • the above vegetable protein material (powder) was mixed with water to prepare a liquid vegetable protein-containing composition.
  • the content of the vegetable protein material in the composition was 10% by weight.
  • Vegetable protein-containing compositions used in preliminary test examples and Test Examples 1, 3, and 4 (textured vegetable protein material swollen with water) Six times the weight of water was added to 10 g of the above vegetable protein material (textured). The structured vegetable protein material was left to stand at 60° C. for 60 minutes to swell, and after swelling, it was washed away with water. Thereafter, the water was drained to obtain 25 g of a vegetable protein-containing composition (textured vegetable protein material swollen with water) (the content of the protein material in the vegetable protein-containing composition was approximately 40% by weight). .
  • Protease activity measurement method (1) Protease activity measurement method (1-1) Protease activity measurement method 0.6% (w/v) casein solution (0.05 mol/L sodium hydrogen phosphate, pH 8.0 [derived from Geobacillus stearothermophilus, In the case of protease derived from Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, and Aspergillus melleus] or 0.7% (v/w) lactic acid, pH 3.0 [derived from Aspergillus niger, A For protease derived from Spergillus oryzae and Rhizopus niveus]) 5 mL After heating at 37° C.
  • casein solution 0.05 mol/L sodium hydrogen phosphate, pH 8.0 [derived from Geobacillus stearothermophilus, In the case of protease derived from Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, and Aspergillus melleus] or 0.7% (
  • a trichloroacetic acid test solution (containing 1.8% (w/v) trichloroacetic acid, 1.8% (w/v) sodium acetate and 0.33 mol/L acetic acid [Geobacillus protease derived from stearothermophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Aspergillus melleus], or containing 0.44 mol/L trichloroacetic acid [Asp In the case of protease derived from Ergillus niger, Aspergillus oryzae, and Rhizopus n]) add 5 mL.
  • the mixture was shaken, left at 37° C. for 30 minutes, and filtered.
  • the first 3 mL of the filtrate was removed, the next 2 mL of the filtrate was measured, and 5 mL of 0.55 mol/L sodium carbonate test solution and 1 mL of Folin test solution (1 ⁇ 3) were added, shaken well, and left at 37° C. for 30 minutes.
  • the absorbance AT at a wavelength of 660 nm was measured using water as a control.
  • trichloroacetic acid test solution containing 1.8% (w/v) trichloroacetic acid, 1.8% (w/v) sodium acetate, and 0.33 mol/L acetic acid [Geobacillus stearothermophilus protease derived from Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Aspergillus melleus], or containing 0.44 mol/L trichloroacetic acid [Aspergillus n. In the case of protease derived from Aspergillus oryzae, Rhizopus niveus]) add 5 mL and shake.
  • casein solution 0.05 mol/L sodium hydrogen phosphate, pH 8.0 [derived from Geobacillus stearothermophilus, derived from Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lichen] iformis-derived protease, Aspergillus melleus-derived protease] or , 0.7% (v/w) lactic acid, pH 3.0 [For protease derived from Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Rhizopus niveus]) was added, immediately shaken, and left at 37°C for 30 minutes. The absorbance AB was measured for a solution (blank) that was operated in the same manner as the enzyme reaction solution described above.
  • casein solution 0.05 mol/L sodium hydrogen phosphate, pH 8.0 [derived from Geobacillus stearothermophilus, derived from Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lichen] iformis-derived protease, Asper
  • One unit (1 U) was defined as the amount of enzyme that caused an increase in the colored substance in Folin's reagent solution equivalent to 1 ⁇ g of tyrosine per minute.
  • 1 mL, 2 mL, 3 mL, and 4 mL of 1 mg/mL tyrosine standard stock solution (0.2 mol/L hydrochloric acid) were measured, and 0.2 mol/L hydrochloric acid test solution was added to each to make 100 mL.
  • 2 mL of each solution was measured, 5 mL of 0.55 mol/L sodium carbonate test solution and 1 mL of Folin test solution (1 ⁇ 3) were added, immediately shaken, and left at 37° C. for 30 minutes.
  • absorbance A1, A2, A3, and A4 at a wavelength of 660 nm were measured using a solution obtained by weighing 2 mL of 0.2 mol/L hydrochloric acid test solution and operating in the same manner as above as a control.
  • the absorbances A1, A2, A3, and A4 were plotted on the vertical axis, and the amount of tyrosine ( ⁇ g) in 2 mL of each solution was plotted on the horizontal axis, a calibration curve was created, and the amount of tyrosine ( ⁇ g) for an absorbance difference of 1 was determined.
  • (1-2) Peptidase activity value measurement method Weigh an appropriate amount of enzyme and add pH 7.0 phosphate buffer (0.01 mol/L) to dissolve or uniformly disperse it to make 50 mL, or further buffer it.
  • the sample solution was diluted 10 times, 100 times, or 1000 times using a sample solution.
  • a comparison solution was prepared in the same manner as in the preparation of the test solution using a phosphate buffer solution (0.01 mol/L) having a pH of 7.0 instead of the sample solution.
  • test solution and comparative solution for which the absorbance was to be measured were cloudy, centrifugation was performed and the supernatant solution was measured.
  • the activity of producing 1 ⁇ mol of p-nitroaniline per minute was defined as 1 unit (1 U).
  • the amount of ammonia produced in the reaction solution was measured using Ammonia Test Wako (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the ammonia concentration in the reaction solution was determined from a calibration curve representing the relationship between ammonia concentration and absorbance (630 nm) prepared using an ammonia standard solution (ammonium chloride).
  • the activity of protein glutaminase (PG) was calculated from the following formula, where 1 unit (1 U) is the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute.
  • the reaction liquid volume is 2.1
  • the enzyme solution volume is 0.1
  • Df is the dilution ratio of the enzyme solution.
  • 17.03 is the molecular weight of ammonia.
  • the absorbance of the solution obtained by adding the test solution is greater than the absorbance of the solution obtained by adding the comparison solution.
  • the test solution and comparative solution for which the absorbance was to be measured were cloudy, centrifugation was performed and the supernatant solution was measured.
  • the amount of enzyme that produced 1 ⁇ mol of L-glutamic acid per minute was defined as 1 unit (1 GTU).
  • Test Example 1 (1) Experimental method The enzymes shown in Table 3 were used in the indicated amounts (0.3 parts by weight per 100 parts by weight of vegetable protein material for the peptidase derived from R. oryzae, 3 parts by weight for other proteolytic enzymes per 100 parts by weight of vegetable protein material).
  • the liquid vegetable protein-containing composition was treated with various enzymes in the same manner as in (1) of the preliminary test example above, except that the processed vegetable protein A liquid composition was obtained.
  • Test Example 2 The combinations of enzymes and vegetable protein materials used were changed to those shown in Tables 4 and 5, and for Examples 31 to 33 and 46 to 48, the vegetable protein materials were pretreated with ⁇ -amylase (specifically, To a liquid vegetable protein-containing composition (10% by weight vegetable protein material), ⁇ -amylase was added in an amount of 6.5 U per 1 g of vegetable protein material, and the mixture was heated at 70°C for 0.5 hours. A processed vegetable protein-containing liquid composition was obtained in the same manner as in (1) of Test Example 1, except that the processed vegetable protein-containing liquid composition was changed to (treated and cooled to 50° C.).
  • ⁇ -amylase specifically, To a liquid vegetable protein-containing composition (10% by weight vegetable protein material), ⁇ -amylase was added in an amount of 6.5 U per 1 g of vegetable protein material, and the mixture was heated at 70°C for 0.5 hours.
  • a processed vegetable protein-containing liquid composition was obtained in the same manner as in (1) of Test Example 1, except that the processed vegetable protein-containing liquid composition was changed to
  • Comparative Examples 1 and 3 which are vegetable protein-containing liquid compositions, and processed vegetable protein-containing liquid compositions obtained by the same treatment except that glutaminase was used instead of protein glutaminase. A comparison was made with certain comparative examples (Comparative Examples 2 and 4). The results are shown in Table 6.
  • the textured vegetable protein-containing food (after seasoning, before baking) was baked at 150° C. for 10 minutes to obtain a patty-shaped textured vegetable protein-containing food (after baking).
  • the obtained food was subjected to umami measurement using a taste sensor (manufactured by Intelligent Sensor Technology, Inc.) and sensory evaluation by six trained panelists to obtain an umami score.
  • the degree of umami was evaluated based on the following classification, and the average value was taken as the umami score. The results are shown in Table 7.
  • the umami of the food (Example 40) obtained by treating vegetable protein materials with a combination of proteolytic enzymes and protein glutaminase increased, indicating that the amount of free glutamic acid in the food increased. It can be inferred that there has been a significant increase.
  • the textured vegetable protein-containing food (after seasoning, before baking) was baked at 150° C. for 10 minutes to obtain a patty-shaped textured vegetable protein-containing food (after baking).
  • the resulting food was subjected to sensory evaluation by six trained panelists to obtain a bitterness score.
  • the degree of bitterness was evaluated based on the following classification, and the average value was used as the bitterness score.
  • the bitterness of the food (Example 40) obtained by treating vegetable protein materials with a combination of proteolytic enzymes and protein glutaminase was suppressed, indicating that the amount of free glutamic acid in the food was suppressed. It can be inferred that the increase was so remarkable that the generation of bitterness due to hydrolysis could be effectively suppressed.

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Abstract

本発明の目的は、タンパク質加水分解物の遊離グルタミン酸量を増加させる加工 技術を提供することである。植物性タンパク質含有組成物を、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼで処理する工程を含む加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法により得られる加工植物性タンパク質含有組成物は、遊離グルタミン酸量が増加している。

Description

加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法
　本発明は、加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法に関し、より具体的には、遊離グルタミン酸量が増加する加工がされた植物性タンパク質含有組成物の製造方法に関する。
　タンパク質を含有する食品素材に対して、消化吸収性の向上、低アレルゲン化等の諸特性を付与するために、エンド型プロテアーゼを用いてタンパク質を切断する加工が有効とされているが、その際に苦味が生じることが、食品加工の技術開発において課題となる。
　この苦味は、食品中のタンパク質を加水分解することにより生じた苦味ペプチドに起因する。タンパク質は、アミノ酸が１００～１０００個、１本の鎖状に結合したものであり、その鎖は規則的に折り畳まれ、球状の塊として存在している。球状の塊の外側には親水性のアミノ酸が、内側には疎水性のアミノ酸が多く存在しており、タンパク質を加水分解すると、この塊状の構造は破壊され、内側に存在していた疎水性アミノ酸を多く含む部分が切断されて苦味ペプチドとして露出し、苦味の原因となる（非特許文献１）。
　このような苦味の課題への対処として、苦味を呈するアミノ酸をγ－グルタミル化するために、タンパク質の加水分解物をグルタミナーゼで処理することが提案されている。具体的には、大豆たん白質（フジプロＦ）をＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のプロテアーゼで処理してたん白加水分解物を作成した後、このたん白加水分解物をＢ．　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のグルタミナーゼでγ－グルタミル化でき、これにより苦味が低減されることが確認されている（非特許文献２）。
Habibi-Najafi, M.B., and Lee, B. H., Bitterness in cheese. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 36, 397-411(1996) 鈴木秀之,中藤裕子,田村友規、コク味調味料の新規調製法 ～プロテアーゼ処理で得られたタンパク加水分解物のy－グルタミル化, 大豆たん白質研究　Vol. 17(2014), 42-45
　上記のとおり、所定のタンパク質加水分解物の苦味低減のための処理としてグルタミナーゼ処理が提案されているものの、グルタミナーゼは基質特異性が狭いため、グルタミン酸遊離量の向上効果は限定的であり、未だ改善の余地がある。
　そこで本発明は、タンパク質加水分解物の遊離グルタミン酸量を増加させる加工技術を提供することを目的とする。
　本発明者は、植物性タンパク質含有組成物をタンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼで処理することで、遊離グルタミン酸量が飛躍的に向上することを見出した。本発明は、この知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　植物性タンパク質含有組成物を、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼで処理する工程を含む、加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法。
項２．　前記タンパク質分解酵素がプロテアーゼ及び／又はペプチダーゼである、項１に記載の製造方法。
項３．　前記プロテアーゼを、前記植物性タンパク質１ｇ当たり１１０Ｕ以上用いる、項１又は２に記載の製造方法。
項４．　前記プロテアーゼが糸状菌由来プロテアーゼである、項２又は３に記載の製造方法。
項５．　前記プロテアーゼが、アスペルギルス属及び／又はリゾプス属由来のプロテアーゼである、項２～４のいずれかに記載の製造方法。
項６．　前記プロテアーゼが、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガ、アスペルギルス・メレウス、及びリゾプス・ニベウス由来のプロテアーゼからなる群より選択される、項２～５のいずれかに記載の製造方法。
項７．　前記プロテアーゼが、細菌由来プロテアーゼである、項２又は３に記載の製造方法。
項８．　前記細菌由来プロテアーゼが、バチルス属及び／又はジオバチルス属由来のプロテアーゼである、項７のいずれかに記載の製造方法。
項９．　前記細菌由来プロテアーゼが、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリケファシエンス及びこれらのジオバチルス属由来のプロテアーゼからなる群より選択される、項７又は８に記載の製造方法。
項１０．　前記タンパク質分解酵素が、細菌由来プロテアーゼ及び糸状菌由来ペプチダーゼである、項２、３及び７～９のいずれかに記載の製造方法。
項１１．　前記ペプチダーゼが、リゾプス属及び／又はアスペルギルス属由来のペプチダーゼである、項２～１０のいずれかに記載の製造方法。
項１２．　前記植物性タンパク質が、豆類、穀類、ナッツ類及び種子類からなる群より選択される植物のタンパク質である、項１～１１のいずれかに記載の製造方法。
項１３．　前記植物性タンパク質含有組成物が液状である、項１～１２のいずれかに記載の製造方法。
項１４．　前記植物性タンパク質含有組成物が水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料である、項１～１２のいずれかに記載の製造方法。
項１５．　タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼを含む、植物性タンパク質含有組成物の遊離グルタミン酸量向上剤。
項１６．　項１～１４のいずれかに記載の製造方法によって得られる、植物性タンパク質含有飲食品。
　本発明によれば、タンパク質加水分解物中の遊離グルタミン酸量を増加させる加工技術が提供される。
１．加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法
　本発明の加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法は、植物性タンパク質含有組成物を、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼで処理する工程（酵素処理工程）を含むことを特徴とする。酵素処理工程によって、植物性タンパク質含有組成物中の遊離グルタミン酸量を向上（増加）させることができるため、遊離グルタミン酸量が増加する加工がされた植物性タンパク質含有組成物が得られる。以下、本発明の加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法について詳述する。
１－１．植物性タンパク質含有組成物
　本発明で用いられる植物性タンパク質含有組成物は、植物性タンパク質及び水を含み、典型例は飲食用の組成物である。植物性タンパク質含有組成物の性状に特段の制限はなく、例えば、液状、スラリー状、及びペースト状等の流動性を有する性状（以下において、これら流動性を有する性状の植物性タンパク質含有組成物を総括して「液体等」とも記載する）、及び固形状が挙げられる。
　植物性タンパク質含有組成物の具体例としては、非組織化タンパク質材料から調製されるものとして、（i）植物性タンパク質材料（具体的には、植物性タンパク質の由来植物の植物器官、並びに前記植物器官からタンパク質以外の成分の少なくとも一部の除去等を行って当該タンパク質の含量を高めた材料の少なくともいずれかが挙げられる。以下において同様。）の乾燥粉末を水に分散させて得られる液体等;（ii）植物性タンパク質材料を水中で破砕及び分散させ、必要に応じて植物材料の皮等に由来する不溶物を、遠心、濾過、濾し袋、篩等の任意の手段によって除去して得られる液体等;（iii）上記（i）又は（ii）の液体等から、植物性タンパク質以外の成分の除去等を行って当該タンパク質の含有量を高めた液体等；並びに（iv）上記（i）～（iii）のいずれかの液体等から調製された乾燥末を、水と混合させて得られる液体等が挙げられ、組織化タンパク質材料から調製されるものとして、（v）水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料が挙げられる。
　なお、上記（v）の具体例の調製に用いられる組織化植物性タンパク質材料は、一般的に代替肉（擬似肉）として公知の食品材料である。組織化植物性タンパク質材料の典型的な例として、植物性タンパク質及び水を含む原料混合物をエクストルーダー等で押出し、乾燥又は冷凍させて肉様に組織化させた材料が挙げられる。なお、本発明において、組織化植物性タンパク質材料が模する「肉」とは、食用とされる動物の筋肉を意味し、「肉」と記載する場合、哺乳類及び鳥類の筋肉だけでなく、魚介の身も包含する意味で用いる。
　組織化植物性タンパク質材料の形状としては、粒状及び繊維状が挙げられる。粒状の形状には、小粒型（ミンチ）、大粒型、ブロック型等の様々な大きさ（小粒型、大粒状、ブロック型の順にサイズが大きくなる）の塊状形状；フレーク型、フィレ型、スライス型等の様々な大きさ（フレーク型、フィレ型、スライス型の順にサイズが大きくなる）の扁平状形状が挙げられる。
　組織化植物性タンパク質材料のより具体的な例としては、粒状植物性たん白及び繊維状植物性たん白が挙げられる。粒状植物性たん白及び繊維状植物性たん白とは、いずれも、「植物性たん白の日本農林規格」で定義されたものを指す。しかしながら、本発明で用いられる組織化植物性タンパク質材料は上記のように肉様に組織化した材料であれば上記で定義される粒状植物性たん白及び繊維状植物性たん白に限定されるものではない。
　本発明で用いることができる組織化植物性タンパク質材料について、植物性タンパク質の種類、植物性タンパク質の含有割合以外の特性（例えば、性状、水分量、粒度、品温、食品添加物以外の原材料、食品添加物、かみごたえ、保水性、異物、内容量）及びその測定方法については、「植物性たん白の日本農林規格」で定義された特性及び測定方法に準拠することができる。
　組織化植物性タンパク質材料に含まれる植物性タンパク質の含有量（組織化植物性タンパク質材料が乾燥した状態の重量を基準とする。）としては特に限定されないが、例えば２０重量％以上、２５重量％以上、又は３０重量％以上が挙げられる。遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、当該含有量としては、好ましくは３５重量％以上、より好ましくは４０重量％以上、さらに好ましくは４５重量％以上が挙げられる。当該含有量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば９０重量％以下、好ましくは８０重量％以下、より好ましくは７０重量％以下、さらに好ましくは６０重量％以下、一層好ましくは５５重量％以下が挙げられる。
　液状の植物性タンパク質含有組成物の好ましい例としては、植物性ミルクが挙げられる。
　なお、以下において、植物性タンパク質含有組成物中の「植物性タンパク質材料の含量」とは、非組織化植物性タンパク質材料を用いて調製された植物性タンパク質含有組成物の場合は、植物性タンパク質含有組成物に含まれる上記植物器官を構成していた成分の乾燥重量が占める割合であり、組織化植物性タンパク質材料を用いて調製された植物性タンパク質含有組成物の場合は、当該組織化植物性タンパク質材料の乾燥重量が占める割合をいう。例えば、植物性タンパク質含有組成物が、上記（i）～（iv）の具体例のように、植物器官に由来する成分及び水のみで構成されている液体等である場合、「植物性タンパク質材料の含量」は、当該液体等の乾燥重量が占める割合を指す。植物性タンパク質含有組成物が、上記（i）～（iv）の具体例と添加物とを含む液体等である場合、「植物性タンパク質材料の含量」は、当該液体等から添加物を除いた部分の乾燥重量が占める割合を指す。さらに、植物性タンパク質含有組成物が、上記（ｖ）の具体例のように、組織化植物性タンパク質材料と水のみで構成されている膨潤物である場合、「植物性タンパク質材料の含量」は、当該組成物の乾燥重量が占める割合を指す。植物性タンパク質含有組成物が、上記（ｖ）の具体例と添加物とを含む膨潤物である場合、「植物性タンパク質材料の含量」は、当該膨潤物から添加物を除いた部分の乾燥重量が占める割合を指す。
　植物性タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、大豆、えんどう豆、レンズ豆、ひよこ豆、黒豆、空豆、緑豆、ルピン豆、インゲン豆等の豆類；小麦、大麦、燕麦（オート麦）、ソルガム、米、ライムギ、そば、ひえ、あわ、テフ、トウモロコシ、ポテトなどの穀類；アーモンド、ココナッツ、ピーナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ピリナッツ、栗、ゴマ、松の実等のナッツ類；ヘンプシード（産業用ヘンプ）、チア種子、キア、アマランサス、カナリーシ―ド、アマニなどの種子類に含まれるタンパク質（天然タンパク質）；上記のタンパク質の、酸、アルカリなどによる化学的部分分解タンパク質；各種試薬による化学修飾タンパク質、及び合成ペプチド等が挙げられる。
　本発明において、上記の植物性タンパク質は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。遊離グルタミン酸量をより一層増大させる観点から、好ましくは豆類のタンパク質が挙げられ、より好ましくは、大豆、えんどう豆、レンズ豆、ひよこ豆、空豆、緑豆、ルピン豆のタンパク質が挙げられ、さらに好ましくは、大豆、えんどう豆のタンパク質が挙げられる。
　植物性タンパク質含有組成物中の植物性タンパク質の含量としては特に限定されないが、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製される場合、例えば０．０１～５０重量％、０．０５～４０重量％、又は０．１～３０重量％、好ましくは０．２５～２５重量％、又は０．３５～１５重量％、より好ましくは０．４５～１０重量％、又は０．６～９重量％が挙げられ、植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製される場合、例えば１～７０重量％、好ましくは５～５０重量％、より好ましくは１０～３０重量％、さらに好ましくは１５～２５重量％が挙げられる。
　また、植物性タンパク質含有組成物中の植物性タンパク質材料の含量としても特に限定されないが、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製される場合、例えば０．０５～５０重量％、０．１～４０重量％、又は０．５～３０重量％、好ましくは１～２５重量％、又は３～２０重量％、より好ましくは５～１５重量％、又は７～１２重量％が挙げられ、植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製される場合、例えば２０～６０重量％、好ましくは３０～５０重量％、より好ましくは３５～４５重量％が挙げられる。
　なお、植物性タンパク質含有組成物に含まれる植物性タンパク質が、穀物のような澱粉質の多い植物のタンパク質（好ましくは、大麦、ソルガム、ライムギ）である場合、そのような植物性タンパク質含有組成物は、アミラーゼにより前処理されたものであることが好ましい。アミラーゼとしては、典型的にはα－アミラーゼが挙げられる。当該α－アミラーゼとしては特に限定されないが、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガ等）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等）由来のα－アミラーゼが挙げられ、好ましくはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のα－アミラーゼが挙げられ、より好ましくはバシラス・アミロリケファシエンス種由来のα－アミラーゼが挙げられる。
　α－アミラーゼの使用量については、植物性タンパク質含有組成物１ｇ当たり、例えば０．５～１００Ｕ、１～５０Ｕ、２～２５Ｕ、又は３～１０Ｕ、好ましくは４～８Ｕが挙げられる。
　α－アミラーゼの活性については、１分間にバレイショデンプンのヨウ素による呈色を１０％減少させる酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
１－２．タンパク質分解酵素
　タンパク質分解酵素としては、ペプチド鎖を分解できる酵素を特に制限なく用いることができ、典型的には、プロテアーゼ及び／又はペプチダーゼが挙げられる。
１－２－１．プロテアーゼ
　本発明において、プロテアーゼとは、エンド型ペプチダーゼを指す。プロテアーゼは、その由来において特に限定されるものではないが、例えば、糸状菌由来プロテアーゼ及び細菌由来プロテアーゼが挙げられる。
　糸状菌由来プロテアーゼとしては特に限定されないが、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、及びスクレロティニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属等に由来するプロテアーゼが挙げられる。
　アスペルギルス属由来プロテアーゼの具体例としては、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ソーエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・ファチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・アクレタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・キャンディダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃａｎｄｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ）、アスペルギルス・イヌイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｉｎｕｉｉ）、アスペルギルス・グラカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｌａｕｃｕｓ）、アスペルギルス・セシェルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ）、アスペルギルス・クラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・デフレクタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ）、アスペルギルス・フィシャリアヌス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・パラシティクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ペニシロイデス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス・レストリクタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ）、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｙｄｏｗｉｉ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓｔｕｓ）、及びアスペルギルス・ベルシコロル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）等に由来するプロテアーゼが挙げられる。
　リゾプス属由来プロテアーゼの具体例としては、リゾプス・キネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）及びリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等に由来するプロテアーゼが挙げられる。
　細菌由来プロテアーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属等に由来するプロテアーゼが挙げられる。
　バチルス属（又はジオバチルス属）由来プロテアーゼの具体例としては、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・クラウジー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・インターミディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、及びこれらのジオバチルス属由来のプロテアーゼが挙げられる。
　本発明において、上記のプロテアーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。上記のプロテアーゼの中でも、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは糸状菌由来プロテアーゼ及び／又は細菌由来プロテアーゼが挙げられる。
　また、上記の糸状菌由来プロテアーゼの中でも、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくはアスペルギルス属由来プロテアーゼ、リゾプス属由来プロテアーゼが挙げられる。上記のアスペルギルス属由来プロテアーゼの中でも、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくはアスペルギルス・オリゼ由来プロテアーゼ、アスペルギルス・ニガ由来プロテアーゼ、アスペルギルス・メレウス由来プロテアーゼが挙げられ、上記のリゾプス属由来プロテアーゼの中でも、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくはリゾプス・ニベウス由来プロテアーゼが挙げられる。
　また、上記の細菌由来プロテアーゼの中でも、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくはバチルス・ステアロサーモフィラス由来プロテアーゼ、バチルス・リケニフォルミス由来プロテアーゼ、バチルス・アミロリケファシエンス由来プロテアーゼ及びこれらのジオバチルス属由来のプロテアーゼが挙げられ、より好ましくはジオバチルス・ステアロサーモフィラス由来プロテアーゼ、バチルス・アミロケエファシエンス由来プロテアーゼ、バチルス・リケニフォルミス由来プロテアーゼが挙げられ、さらに好ましくは、バチルス・リケニフォルミス由来プロテアーゼが挙げられる。
　プロテアーゼの使用量としては特に限定されないが、植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量として、例えば１１０Ｕ以上が挙げられる。遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは２００Ｕ以上、３５０Ｕ以上、又は５００Ｕ以上、より好ましくは７００Ｕ以上、又は９００Ｕ以上、さらに好ましくは１０００Ｕ以上、一層好ましくは１１００Ｕ以上が挙げられる。プロテアーゼの植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば３０００００Ｕ以下、１５００００Ｕ以下、１０００００Ｕ以下、７５０００Ｕ以下、５００００Ｕ以下、４００００Ｕ以下、３００００Ｕ以下、２５０００Ｕ以下、２００００Ｕ以下、１５０００Ｕ以下、又は１００００Ｕ以下が挙げられる。
　また、プロテアーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量としては、例えば１１０Ｕ以上が挙げられ、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは２００Ｕ以上、３５０Ｕ以上、又は５００Ｕ以上、より好ましくは７５０Ｕ以上、又は１０００Ｕ以上、さらに好ましくは１２００Ｕ以上、一層好ましくは１３００Ｕ以上、又は１４００Ｕ以上が挙げられる。プロテアーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、例えば、６０００００Ｕ以下、３０００００Ｕ以下、１５００００Ｕ以下、１０００００Ｕ以下、７５０００Ｕ以下、６００００Ｕ以下、５００００Ｕ以下、４００００Ｕ以下、３００００Ｕ以下、２５０００Ｕ以下、又は２００００Ｕ以下が挙げられる。
　プロテアーゼの活性については、カゼインを基質とし、フォリン法により測定されるものとする。すなわち、プロテアーゼの活性は、カゼインを基質として常法により測定対象プロテアーゼの至適ｐＨに応じて設定されるｐＨで酵素反応を行い、１分間にチロシン１μｇに相当するフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
１－２－２．ペプチダーゼ
　本発明において、ペプチダーゼとは、エキソ型ペプチダーゼを指す。ペプチダーゼは、その由来において特に限定されるものではないが、例えば、糸状菌由来ペプチダーゼ、放線菌由来ペプチダーゼ、細菌由来ペプチダーゼが挙げられる。
　糸状菌由来ペプチダーゼとしては特に限定されないが、例えば、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属等に由来するペプチダーゼが挙げられる。放線菌由来ペプチダーゼとしては特に限定されないが、例えば、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等に由来するペプチダーゼが挙げられる。リゾプス属由来ペプチダーゼの具体例としては、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）等に由来するペプチダーゼが挙げられ、アスペルギルス属由来ペプチダーゼの具体例としては、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）等に由来するペプチダーゼが挙げられる。
　細菌由来ペプチダーゼとしては特に限定されないが、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属等に由来するペプチダーゼが挙げられる。
　本発明において、上記のペプチダーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。上記のペプチダーゼの中でも、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは糸状菌由来ペプチダーゼが挙げられ、より好ましくはリゾプス属（中でもリゾプス・オリゼ）及びアスペルギルス属（中でもアスペルギルス・オリゼ）由来ペプチダーゼが挙げられ、さらに好ましくはリゾプス属（中でもリゾプス・オリゼ）由来ペプチダーゼが挙げられる。
　ペプチダーゼの使用量としては特に限定されないが、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量として、例えば０．００１Ｕ以上が挙げられる。遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは０．００５Ｕ以上、０．０１Ｕ以上、又は０．０１５Ｕ以上、より好ましくは０．０２５Ｕ以上、０．０５Ｕ以上、０．０７５Ｕ以上、又は０．１Ｕ以上、さらに好ましくは０．１３Ｕ以上、０．１５Ｕ以上、０．１８Ｕ以上、０．２Ｕ以上、又は０．２３Ｕ以上、一層好ましくは０．２５Ｕ以上、又は０．２７Ｕ以上が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものである場合、ペプチダーゼの植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量としては、好ましくは０．５Ｕ以上、又は１Ｕ以上、より好ましくは２．５Ｕ以上、５Ｕ以上、又は７.５Ｕ以上、さらに好ましくは１０Ｕ以上、１５Ｕ以上、又は２０Ｕ以上、一層好ましくは２５Ｕ以上、又は３０Ｕ以上、より一層好ましくは３５Ｕ以上、又は４０Ｕ以上が挙げられる。
　ペプチダーゼの植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、例えば５００Ｕ以下、３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、７５Ｕ以下、５０Ｕ以下、又は４５Ｕ以下が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものである場合、ペプチダーゼの植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては、例えば５００Ｕ以下、好ましくは４００Ｕ以下、又は３００Ｕ以下、より好ましくは２００Ｕ以下、又は１００Ｕ以下、さらに好ましくは８０Ｕ以下、７０Ｕ以下、又は６０Ｕ以下、一層好ましくは５５Ｕ以下、又は５０Ｕ以下が挙げられる。
　また、ペプチダーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量としては、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、例えば０．００１Ｕ以上が挙げられ、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは０．００５Ｕ以上、０．０１Ｕ以上、又は０．０１５Ｕ以上、より好ましくは０．０２５Ｕ以上、又は０．０５Ｕ以上、さらに好ましくは０．０７５Ｕ以上、又は０．１Ｕ以上、一層好ましくは０．１３Ｕ以上、０．１５Ｕ以上、０．１８Ｕ以上、０．２Ｕ以上、又は０．２３Ｕ以上、より一層好ましくは０．２５Ｕ以上、又は０．２７Ｕ以上、特に好ましくは０．３Ｕ以上、又は０．３３Ｕ以上が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものである場合、ペプチダーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量としては、好ましくは１Ｕ以上、又は２.５Ｕ以上、より好ましくは５Ｕ以上、又は１０Ｕ以上、さらに好ましくは２０Ｕ以上、３０Ｕ以上、又は４０Ｕ以上、一層好ましくは５０Ｕ以上、６０Ｕ以上、又は７０Ｕ以上、より一層好ましくは７５Ｕ以上、又は８０Ｕ以上が挙げられる。
　ペプチダーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、例えば、１０００Ｕ以下、９００Ｕ以下、８００Ｕ以下、７００Ｕ以下、６００Ｕ以下、５００Ｕ以下、３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、又は９０Ｕ以下が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものである場合、ペプチダーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては、例えば１０００Ｕ以下、８００Ｕ以下、６００Ｕ以下、５００Ｕ以下、４００Ｕ以下、３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１５０Ｕ以下、１００Ｕ以下、又は９０Ｕ以下が挙げられる。
　ペプチダーゼの活性については、Ｌ-ロイシル－ｐ－ニトロアニリド・塩酸塩を基質とし、第９版　食品添加物公定書に基づく方法により測定されるものとし、具体的には、Ｌ-ロイシル－ｐ－ニトロアニリド・塩酸塩を基質として常法により酵素反応を行い、１分間に１μｍｏｌのｐ－ニトロアニリンを生成する活性を１単位（１Ｕ）とする。
１－３．プロテイングルタミナーゼ
　本発明で用いられるプロテイングルタミナーゼとしては、ペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わずグルタミン残基のアミド基含有側鎖を分解する作用を示す酵素であれば、その種類及び由来等は特に限定されない。プロテイングルタミナーゼの例として、特開２０００－５０８８７号公報、特開２００１－２１８５９０号公報、国際公開第２００６／０７５７７２号に開示された、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はミロイデス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）属由来のプロテイングルタミナーゼが挙げられる。これらのプロテイングルタミナーゼは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　これらのプロテイングルタミナーゼの中でも、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくはクリセオバクテリウム属由来のプロテイングルタミナーゼが挙げられ、より好ましくはクリセオバクテリウム・プロテオリティカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ）種由来のプロテイングルタミナーゼが挙げられる。
　プロテイングルタミナーゼは、上記のプロテイングルタミナーゼの由来元となる微生物の培養液より調製することができる。具体的な調製方法としては、上記の微生物の培養液又は菌体よりプロテイングルタミナーゼを回収する方法が挙げられる。例えば、プロテイングルタミナーゼ分泌型微生物を用いる場合は、培養液から、必要に応じて予めろ過、遠心処理等によって菌体を回収した後、酵素を分離及び／又は精製することができる。また、プロテイングルタミナーゼ非分泌型微生物を用いる場合は、必要に応じて予め培養液から菌体を回収した後、菌体を加圧処理、超音波処理等によって破砕して酵素を露出させた後、酵素を分離及び／又は精製することができる。酵素の分離及び／又は精製法としては、公知のタンパク質分離及び／又は精製法を特に限定されることなく用いることができ、例えば、遠心分離法、ＵＦ濃縮法、塩析法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等が挙げられる。分離及び／又は精製された酵素は、凍結乾燥、減圧乾燥等の乾燥法により粉末化することができ、また、当該乾燥法において適当な賦形剤及び／又は乾燥助剤を用いて粉末化することもできる。また、分離及び／又は精製された酵素は、適当な添加剤を加え、ろ過滅菌することで液状化することもできる。
　プロテイングルタミナーゼの使用量としては特に限定されないが、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量として、例えば０．０１Ｕ以上が挙げられる。遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量としては、好ましくは０．５Ｕ以上、より好ましくは０．７５Ｕ以上、さらに好ましくは１．０Ｕ以上、一層好ましくは１．２Ｕ以上が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものである場合、プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量としては、好ましくは０．０１Ｕ以上、より好ましくは０.１Ｕ以上、又は０．２５Ｕ以上、さらに好ましくは０．５Ｕ以上、又は０．８Ｕ以上、一層好ましくは１Ｕ以上、又は１．２Ｕ以上が挙げられる。
　プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、例えば２００Ｕ以下、１５０Ｕ以下、１００Ｕ以下、又は５０Ｕ以下、好ましくは３０Ｕ以下、より好ましくは１５Ｕ以下、又は１０Ｕ以下、さらに好ましくは７．５Ｕ以下、５Ｕ以下、２．５Ｕ以下、又は２Ｕ以下が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものである場合、プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質材料１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては、例えば２００Ｕ以下、１５０Ｕ以下、１２０Ｕ以下、１００Ｕ以下、８０Ｕ以下、６０Ｕ以下、４０Ｕ以下、３０Ｕ以下、２０Ｕ以下、１０Ｕ以下、７．５Ｕ以下、５Ｕ以下、２．５Ｕ以下、又は２Ｕ以下が挙げられる。
　また、プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量として、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、例えば０．１５Ｕ以上が挙げられる。遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量としては、好ましくは０．５Ｕ以上、より好ましくは０．７５Ｕ以上、さらに好ましくは１．０Ｕ以上、一層好ましくは１．２Ｕ以上が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものである場合、プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量としては、好ましくは０．１Ｕ以上、又は０．２５Ｕ以上、より好ましくは０．５Ｕ以上、又は０．７５Ｕ以上、さらに好ましくは１Ｕ以上、又は１．５Ｕ以上、一層好ましくは２Ｕ以上、又は２.５Ｕ以上が挙げられる。
　プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては特に限定されないが、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、例えば４００Ｕ以下、３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１５０Ｕ以下、１００Ｕ以下、又は５０Ｕ以下、好ましくは３０Ｕ以下、２５Ｕ以下、又は２０Ｕ以下、より好ましくは１５Ｕ以下、又は１０Ｕ以下、さらに好ましくは７．５Ｕ以下、５Ｕ以下、又は２．５Ｕ以下が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものである場合、プロテイングルタミナーゼの植物性タンパク質１ｇ当たりの使用量範囲の上限としては、例えば４００Ｕ以下、３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、５０Ｕ以下、２５Ｕ以下、２０Ｕ以下、１０Ｕ以下、又は５Ｕ以下が挙げられる。
　タンパク質分解酵素とプロテイングルタミナーゼとの使用比率については、各酵素についての上記使用量に基づいて定まるが、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは以下の使用比率が挙げられる。
　プロテイングルタミナーゼのプロテアーゼ１Ｕ当たりの使用量としては、好ましくは０．００５ｍＵ以上、より好ましくは０．０１ｍＵ以上、又は０．０２ｍＵ以上、さらに好ましくは０．０３ｍＵ以上、０．０４ｍＵ以上、又は０．０４５ｍＵ以上、一層好ましくは０．０５ｍＵ以上、０．０７５ｍＵ以上、０．１ｍＵ以上、又は０．１５ｍＵ以上が挙げられる。プロテイングルタミナーゼのプロテアーゼ１Ｕ当たりの使用量範囲の上限としては、例えば１５ｍＵ以下が挙げられ、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは１２ｍＵ以下、又は１０ｍＵ以下、より好ましくは８ｍＵ以下、又は６ｍＵ以下、さらに好ましくは５ｍＵ以下、又は４ｍＵ以下、一層好ましくは３ｍＵ以下、２ｍＵ以下、又は１．５ｍＵ以下が挙げられる。
　プロテイングルタミナーゼのペプチダーゼ１Ｕ当たりの使用量としては、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、好ましくは０．００１Ｕ以上、より好ましくは０．００５Ｕ以上、又は０．０１Ｕ以上、さらに好ましくは０．０１５Ｕ以上、０．０２Ｕ以上、又は０．０２５Ｕ以上、一層好ましくは０．０３Ｕ以上が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものの場合、プロテイングルタミナーゼのペプチダーゼ１Ｕ当たりの使用量としては、より好ましくは０．００５Ｕ以上、さらに好ましくは０．０１Ｕ以上、又は０．０２Ｕ以上、一層好ましくは０．０２５Ｕ以上、又は０．０３Ｕ以上が挙げられる。プロテイングルタミナーゼのペプチダーゼ１Ｕ当たりの使用量範囲の上限としては、植物性タンパク質含有組成物が非組織化タンパク質材料から調製されるもの及び組織化タンパク質材料から調製されるもののいずれの場合も、例えば１００Ｕ以下が挙げられ、遊離グルタミン酸量の増加効果をより一層高める観点から、好ましくは７５Ｕ以下、５０Ｕ以下、又は４０Ｕ以下、より好ましくは３０Ｕ以下、又は２０Ｕ以下、さらに好ましくは１５Ｕ以下、又は１０Ｕ以下、一層好ましくは７Ｕ以下、６Ｕ以下、又は５．５Ｕ以下が挙げられる。植物性タンパク質含有組成物が組織化タンパク質材料から調製されるものの場合、プロテイングルタミナーゼのペプチダーゼ１Ｕ当たりの使用量範囲の上限としては、好ましくは３Ｕ以下、より好ましくは２Ｕ以下、又は１Ｕ以下、さらに好ましくは０．５Ｕ以下、又は０.１Ｕ以下、一層好ましくは０．０７５Ｕ以下、又は０．０５Ｕ以下が挙げられる。
　プロテイングルタミナーゼの活性については、ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシン（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ）を基質とし、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを遊離する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
１－４．反応条件等
　酵素処理工程では、当該処理により、植物性タンパク質含有組成物においてグルタミン酸を遊離させる反応を進行させる。
　タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼを作用させる順番としては特に限定されず、各酵素を任意の順番で順次作用させてもよいし、両酵素を同時に作用させてもよいが、好ましくは両酵素を同時に作用させることができる。
　タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼによる処理の条件（温度、ｐＨ、時間等）については、目的とする遊離グルタミン酸量の増加効果の程度に応じて適宜選択される。
　タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼによる処理が行われる温度としては特に限定されず、使用酵素の至適温度及び／又は植物性タンパク質含有組成物の熱特性等に応じて当業者が適宜決定することができるが、例えば３０℃～８０℃、好ましくは４０℃～７０℃、より好ましくは４０℃～６０℃が挙げられる。
　タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼによる処理が行われる反応系のｐＨとしても特に限定されず、使用酵素の至適ｐＨ及び／又は植物性タンパク質含有組成物のｐＨ特性等に応じて当業者が適宜決定することができるが、２５℃でのｐＨとして、例えば２～９、好ましくは３～８、より好ましくは５～７、さらに好ましくは６～７が挙げられる。
　タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼによる処理が行われる時間としては例えば０．５～９６時間、好ましくは１～７２時間、より好ましくは１～３０時間が挙げられる。
１－５．他の工程
　本発明の製造方法は、上記の酵素処理工程の他に、任意の他の工程を含むことができる。他の工程の具体例については、酵素処理工程の前に行われる工程として、上記の植物性タンパク質含有組成物を調製する工程が挙げられ、酵素処理工程の後に行われる工程として、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼの失活工程、加工植物性タンパク質含有組成物のろ過工程、加工植物性タンパク質含有組成物の乾燥工程等が挙げられる。乾燥工程における方法としては、凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥等が挙げられる。
２．植物性タンパク質含有飲食品
　本発明の植物性タンパク質含有飲食品は、上記の「１．加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法」によって得られる、加工植物性タンパク質含有組成物又はそれを飲食品材料とする調理品である。これら本発明の植物性タンパク質含有飲食品においては、遊離グルタミン酸量が増加している。
　本発明の植物性タンパク質含有飲食品が加工植物性タンパク質含有組成物の調理品の場合、当該調理品を得るための調理方法としては、一般的な動物性タンパク質調理品の代替飲食品を得るために行われる任意の調理方法を用いることができる。調理方法の具体例としては、調味、食品添加物配合、他の飲食品材料の混合、加熱、発酵、成形、冷凍、及び／又は焼成等が挙げられる。
　本発明の植物性タンパク質含有飲食品の性状は特に限定されない。本発明の植物性タンパク質含有飲食品が加工植物性タンパク質含有組成物の場合における性状としては、上記の製造方法における植物性タンパク質含有組成物の性状及び乾燥工程の有無等に応じて定まるが、例えば、液状、スラリー状、及びペースト状等の流動性を有する性状及び固形状が挙げられ、固形状の具体例としては、粉末状、細粒状、顆粒状、水分で膨潤した組織化状、乾燥した組織化状等が挙げられる。本発明の植物性タンパク質含有飲食品が加工植物性タンパク質含有組成物の調理品の場合における性状としては、一般的な動物性タンパク質調理品の植物性代替飲食品の任意の性状が挙げられる。
　上記の調理品の具体例としては、一般的な動物性タンパク質調理品の植物性代替飲食品であれば特に限定されないが、例えば、代替ミルク、代替肉、代替チーズ、代替ヨーグルト等が挙げられる。
３．遊離グルタミン酸量向上剤
　タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼの組み合わせは、植物性タンパク質含有組成物中の遊離グルタミン酸量を向上（増加）させることができる。従って、本発明は、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼを含む、植物性タンパク質含有組成物の遊離グルタミン酸量向上剤も提供する。
　上記の遊離グルタミン酸量向上剤において、使用する成分の種類、使用量等については、前記「１．加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法」の欄に示す通りである。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
［使用した酵素］
　以下の酵素（全て天野エンザイム(株)製）を使用した。
（１）タンパク質分解酵素
（１－１）プロテアーゼ
・Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来プロテアーゼ
・Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ由来プロテアーゼ
・Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ
・Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ由来プロテアーゼ
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来プロテアーゼ
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来プロテアーゼ
・Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来プロテアーゼ
（１－２）ペプチダーゼ
・Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来ペプチダーゼ
・Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来ペプチダーゼ
（２）プロテイングルタミナーゼ
・Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼ（ＰＧ）
（３）グルタミナーゼ
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来グルタミナーゼ
（４）α－アミラーゼ
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来α－アミラーゼ
［使用した植物性タンパク質材料］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１）予備試験例及び試験例１，２で用いた植物性タンパク質含有組成物（液状の植物性タンパク質含有組成物）
　上記の植物性タンパク質材料（粉末）を水と混合させ、液状の植物性タンパク質含有組成物を調製した。当該組成物中の植物性タンパク質材料の含有量は、１０重量％とした。
（２）予備試験例、及び試験例１，３，４で用いた植物性タンパク質含有組成物（水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料）
　上記の植物性タンパク質材料（組織化）１０ｇに対して６倍重量の水を加えた。６０℃で６０分間静置して組織化植物性タンパク質材料を膨潤させ、膨潤後、水で洗い流した。その後、水分を切り、植物性タンパク質含有組成物（水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料）２５ｇ（植物性タンパク質含有組成物中のタンパク質材料の含有量は、約４０重量％）を得た。
［酵素活性測定方法］
（１）タンパク質分解酵素活性値測定法
（１－１）プロテアーゼ活性値測定法
　０．６％（ｗ／ｖ）カゼイン溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０［Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ由来プロテアーゼの場合］又は、０．７％（ｖ／ｗ）乳酸、ｐＨ３．０［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ由来プロテアーゼの場合］）５ｍＬを、３７℃で１０分間加温した後、プロテアーゼを含む試料溶液１ｍＬを加え、直ちに振り混ぜた。この液を３７℃で１０分間放置した後、トリクロロ酢酸試液（１．８％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、１．８％（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウム及び０．３３ｍｏｌ／Ｌ酢酸を含む［Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ由来プロテアーゼの場合］、又は０．４４ｍｏｌ／Ｌトリクロロ酢酸を含む［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ由来プロテアーゼの場合］）５ｍＬを加えて振り混ぜ、再び３７℃で３０分間放置し、ろ過した。初めのろ液３ｍＬを除き、次のろ液２ｍＬを量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及びフォリン試液（１→３）１ｍＬを加え、よく振り混ぜ、３７℃で３０分間放置した。この液（酵素反応液）につき、水を対照とし、波長６６０ｎｍにおける吸光度ＡＴを測定した。
　別に、プロテアーゼを含む試料溶液１ｍＬを量り、トリクロロ酢酸試液（１．８％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸、１．８％（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウム及び０．３３ｍｏｌ／Ｌ酢酸を含む［Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ由来プロテアーゼの場合］、又は０．４４ｍｏｌ／Ｌトリクロロ酢酸を含む［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ由来プロテアーゼの場合］）５ｍＬを加えて振り混ぜた後、０．６％（ｗ／ｖ）カゼイン溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０［Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ由来プロテアーゼの場合］又は、０．７％（ｖ／ｗ）乳酸、ｐＨ３．０［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ由来プロテアーゼの場合］）５ｍＬを加え、直ちに振り混ぜ、３７℃で３０分間放置したことを除いて上述の酵素反応液と同様に操作した液（ブランク）について、吸光度ＡＢを測定した。
　１分間にチロシン１μｇに相当するフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
　１ｍｇ／ｍＬチロシン標準原液（０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸）１ｍＬ，２ｍＬ，３ｍＬ及び４ｍＬを量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を加え、１００ｍＬとした。それぞれの液２ｍＬを量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及びフォリン試液（１→３）１ｍＬを加え、直ちに振り混ぜ、３７℃で３０分間放置した。これらの液につき、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液２ｍＬを量り上記と同様に操作して得た液を対照とし、波長６６０ｎｍにおける吸光度Ａ１，Ａ２，Ａ３及びＡ４を測定した。縦軸に吸光度Ａ１，Ａ２，Ａ３及びＡ４を、横軸にそれぞれの液２ｍＬ中のチロシン量（μｇ）をとり、検量線を作成し、吸光度差１に対するチロシン量（μｇ）を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
（１－２）ペプチダーゼ活性値測定法
　酵素を適当量量り、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）を加えて溶解若しくは均一に分散して５０ｍＬとしたもの又はこれを更に緩衝液を用いて１０倍、１００倍若しくは１０００倍に希釈したものを試料液とした。Ｌ－ロイシル－ｐ－ニトロアニリド塩酸塩を４０ｍｇ量り、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、１２．５μｍｏｌ/Ｌ硫酸亜鉛含有）を加えて溶かし、１００ｍＬとしたものを基質溶液とした。
　基質溶液２ｍＬを量り、３７℃で５分間加温した後、試料液０．５ｍＬを加えて振り混ぜ、同温度で１５分間加温した。０．２ｍｏｌ/Ｌ塩酸を２．５ｍＬ加え混合し、反応を停止させ、検液とした。別に試料液の代わりにｐＨ７．０のリン酸緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）を用いて検液の調製と同様に操作し、比較液とした。検液及び比較液につき、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定するとき、検液の吸光度は、比較液の吸光度よりも大きい。なお、吸光度を測定する検液及び比較液に濁りがある場合には、遠心分離を行い、上澄液について測定した。1 分間に1μｍｏｌのｐ－ニトロアニリンを生成する活性を１単位（１Ｕ）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
（２）プロテイングルタミナーゼ活性値測定法
　３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍＬにプロテイングルタミナーゼを含む試料溶液０．１ｍＬを添加して、３７℃、１０分間放置した後、０．４Ｍ　ＴＣＡ溶液を１ｍＬ加えて反応を停止した。ブランクとして、３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍＬに０．４Ｍ　ＴＣＡ試液を１ｍＬ加え、さらにプロテイングルタミナーゼを含む試料溶液０．１ｍＬを添加して、３７℃で１０分間放置した。
　前記で得られた溶液についてアンモニアテストワコー（富士フイルム和光純薬）を用い、反応液中に生じたアンモニア量の測定を行った。アンモニア標準液（塩化アンモニウム）を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（６３０ｎｍ）との関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求めた。
　プロテイングルタミナーゼ（ＰＧ）の活性を、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とし、以下の式から算出した。式中、反応液量は２．１、酵素溶液量は０．１、Ｄｆは酵素溶液の希釈倍率である。また、１７．０３はアンモニアの分子量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
（３）グルタミナーゼ活性値測定法
　酵素を適当量量り、酢酸緩衝液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．０、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル含有）を加えて溶解若しくは均一に分散して５０ｍＬとしたもの又はこれを更に同緩衝液を用いて１０倍若しくは１００倍に希釈したものを試料液とした。
　Ｌ－グルタミン２．０ｇを量り、水７０ｍＬを加えて溶かし、ｐＨ６．０の酢酸緩衝液（１ｍｏｌ／Ｌ）１０ｍＬを加え、水を加えて１００ｍＬとしたものを基質溶液とした。試料液1ｍＬを量り、３７℃の水浴中で５分間加温し、あらかじめ３７℃に加温した基質溶液１ｍＬを加えて、直ちに振り混ぜ、更に３７℃で１０分間加温した後、過塩素酸（８３→１０００）１ｍＬを加えて振り混ぜ、直ちに氷水中で１分間以上冷却した。ただし、過塩素酸は質量分率６０％のものを用いた。この液に水酸化ナトリウム溶液（３→１００）１ｍＬを加えて振り混ぜ、検液とした。別に試料液１ｍＬを量り、過塩素酸（８３→１０００）１ｍＬを加えて振り混ぜ、３７℃の水浴中で５分間加温した後、基質溶液１ｍＬを加えて振り混ぜ、氷水中で１分間以上冷却した。この液に水酸化ナトリウム溶液（３→１００）１ｍＬを加えて振り混ぜ、比較液とした。Ｌ－グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油製）を用いて、波長５５５ｎｍにおける吸光度を測定するとき、検液を加えて得られた液の吸光度は、比較液を加えて得られた液の吸光度より大きい。なお、吸光度を測定する検液及び比較液に濁りがある場合には、遠心分離を行い、上澄液について測定した。１分間に１μｍｏｌのＬ-グルタミン酸を生成する酵素量を１単位（１ＧＴＵ）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
（４）α－アミラーゼ活性値測定法
　１重量％バレイショデンプン基質溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸（ｐＨ５．０））１０ｍＬを３７℃で１０分間加温した後、α－アミラーゼを含む試料溶液１ｍＬを加え、直ちに振り混ぜた。この液を３７℃で１０分間放置した後、この液１ｍＬを０．１ｍｏｌ/Ｌ塩酸試液１０ｍＬに加え、直ちに振り混ぜた。次に、この液０．５ｍＬを量り、０．０００２ｍｏｌ/Ｌヨウ素試液(日局)１０ｍＬを加え、振り混ぜた後、水を対照とし、波長６６０ｎｍにおける吸光度（ＡＴ）を測定した。別に、試料溶液の代わりに水１ｍＬを加えて同様に操作し、吸光度（ＡＢ）を測定した。１分間にバレイショデンプンのヨウ素による呈色を１０％減少させる酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
［予備試験例］
（１）実験方法
　１０ｍＬの液状の植物性タンパク質含有組成物（１０重量％植物性タンパク質材料）（ｐＨ６～７（２５℃））に対して、植物性タンパク質材料１００重量部当たり３重量部のタンパク質分解酵素と０．３重量部のＰＧとを添加した。対照実験として、植物性タンパク質材料１００重量部当たり３重量部のタンパク質分解酵素のみの試験画分を準備した。５０℃で１７０ｒｐｍの振とうにより２時間反応させた。反応後、煮沸にて酵素を失活させ、室温まで冷却することで、加工植物性タンパク質含有液状組成物を得た。
（２）遊離アミノ態窒素量（ＦＡＮ）測定
　得られた加工植物性タンパク質含有液状組成物を１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を得た。上清を所定の倍率で希釈し、１．０ｍL希釈液に対してニンヒドリン試薬ｐＨ６．７（１０％Ｎａ2ＨＰＯ4／１２Ｈ2Ｏ、６％ＫＨ2ＰＯ4、０．５０％ニンヒドリン、０．３０％フルクトース）を０．５ｍL添加した。混合後、１６分間煮沸し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。タンパク質分解酵素とＰＧを用いた場合に得られた遊離アミノ態窒素量を、対照実験（ＰＧを用いなかったことを除いて同様に行った実験）で得られた遊離アミノ態窒素量を１とした場合の相対値として導出した。結果を表２に示す。
（３）実験結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表２に示す通り、タンパク質分解酵素を単独で用いた場合に比べ、タンパク質分解酵素とプロテイングルタミナーゼとを併用することで、相対遊離アミノ態窒素量が高くなることが判明した。つまり、プロテイングルタミナーゼにより、タンパク質分解酵素の反応性が向上することが判明した。特に、タンパク質分解酵素として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｍｅｌｌｅｕｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来ペプチダーゼを用いた場合に、相対遊離アミノ態窒素量の増加が顕著であった。また、相対遊離アミノ態窒素量の増加は、大豆タンパク及びエンドウタンパクのいずれにおいても認められた。
　さらに、液状の植物性タンパク質含有組成物を、水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料に変更して同様の操作を行った場合も、相対遊離アミノ態窒素量の増加が認められた。
［試験例１］
（１）実験方法
　表３に示す酵素を表示の量（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ由来ペプチダーゼのみ植物性タンパク質材料１００重量部当たり０．３重量部、その他のタンパク質分解酵素は植物性タンパク質材料１００重量部当たり３重量部に相当）で用いたことを除いて、上記予備試験例の（１）と同様にして、液状の植物性タンパク質含有組成物に対して各種酵素を用いて処理を行い、加工植物性タンパク質含有液状組成物を得た。
（２）遊離アミノ酸分析
　得られた加工植物性タンパク質含有液状組成物を１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を、フィルター（０．４５μｍ）ろ過した後、アミノ酸分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ II ＬＣシステムを用いたアミノ酸分析）にて、当該プロトコルに従って遊離アミノ酸量を分析した。タンパク質分解酵素とＰＧを用いた場合に得られた遊離グルタミン酸量を、対照実験（ＰＧを用いなかったことを除いて同様に行った実験）で得られた遊離グルタミン酸量を１とした場合の相対値として導出した。結果を表３に示す。
（３）食感評価
　得られた加工植物性タンパク質含有液状組成物を、訓練されたパネリストにより、食感（具体的には舌触り）を、酵素処理を行わなかったことを除いて同様に処理した植物性タンパク質含有液状組成物のざらついた舌ざわりを１点、ほぼざらつきが認められなくなるほどになめらかな舌ざわりを１０点とするＶＡＳに基づいて評点した。結果を表３に示す。なお、表３においては、得られた評点（評点Aとする）を、対照実験（ＰＧを用いなかったことを除いて同様に行った実験）で得られた評点（評点Bとする）と並べて、評点A／評点Bの形式で示す。
（４）実験結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表３に示す通り、タンパク質分解酵素を単独で用いた場合に比べ、タンパク質分解酵素とプロテイングルタミナーゼとを併用することで、相対遊離グルタミン酸量が高くなることが認められた。特に、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来ペプチダーゼを用いた場合に、相対遊離グルタミン酸量の増加が各段顕著であった。また、相対遊離グルタミン酸量の増加は、大豆タンパク及びエンドウタンパクのいずれにおいても認められた。なお、実施例で得られた加工植物性タンパク質含有液状組成物を、訓練されたパネリストにより呈味の官能評価を行ったところ、いずれも、ＰＧを用いなかった場合に比べて苦味が低減していることが認められた。
　また、表３に示すとおり、タンパク質分解酵素を単独で用いた場合に比べ、タンパク質分解酵素とプロテイングルタミナーゼとを併用することで、加工植物性タンパク質含有液状組成物の食感の向上効果も認められた。
　さらに、液状の植物性タンパク質含有組成物を、水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料に変更して同様の操作を行った場合も、相対遊離グルタミン酸量の増加が認められた。
［試験例２］
　使用酵素及び植物性タンパク質材料の組み合わせとして表４及び表５に示すものに変更し、実施例３１～３３及び４６～４８に関しては植物性タンパク質材料をα‐アミラーゼによる前処理を経た（具体的には、液状の植物性タンパク質含有組成物（１０重量％の植物性タンパク質材料）に対して、植物性タンパク質材料１ｇ当たり６．５Ｕとなる量のα‐アミラーゼを加えて７０℃で０．５時間処理をし、５０℃まで冷却した）ものに変更したことを除いて、試験例１の（１）と同様にして加工植物性タンパク質含有液状組成物を得た。
　得られた加工植物性タンパク質含有液状組成物について、試験例１の（２）と同様にして遊離グルタミン酸量（絶対値）を測定し、遊離グルタミン酸量の相対値を導出した。結果を表４及び表５に示す。
　なお、表４及び表５に示す実施例のうち、実施例２４，３９について、遊離グルタミン酸量の相対値及び絶対値を、プロテイングルタミナーゼを用いないことを除いて同様に処理して得られた加工植物性タンパク質含有液状組成物である比較例（比較例１，３）、及びプロテイングルタミナーゼの代わりにグルタミナーゼを用いたことを除いて同様に処理して得られた加工植物性タンパク質含有液状組成物である比較例（比較例２，４）と対比した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表４及び表５に示すとおり、全ての植物性タンパク質材料において、遊離グルタミン酸量の増加が認められた。また、表６に示す通り、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼを併用して植物性タンパク質材料を処理すると、加工植物性タンパク質材料中の遊離グルタミン酸量が顕著に増大し、その程度は、加工植物性タンパク質含有液状組成物の苦味を低減するだけでなく、うま味を付与するのにも十分な程度であった。
［試験例３］
　水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料２５ｇに対して、１０ｍＬの水、５ｍＬのオリーブオイル、メチルセルロース（最終濃度２質量％）、及び表７に記載の酵素を表示の量で混合し、パティの形状に成型し、５０℃にて１時間インキュベートすることで、組織化植物性タンパク質含有食品（調味後、焼成前）を得た。
　組織化植物性タンパク質含有食品（調味後、焼成前）を、１５０℃で１０分間焼成することで、パティ形状の組織化植物性タンパク質含有食品（焼成後）を得た。得られた食品を、味覚センサー（Intelligent Sensor Technology, Inc.社製）によるうま味測定と、訓練されたパネリスト６名による官能評価とを行い、うま味スコアを得た。官能評価では、以下の分類に基づいてうま味の程度を評点し、平均値をうま味スコアとした。結果を表７に示す。
　　２点：比較例５の食品よりかなり強い
　　１点：比較例５の食品よりやや強い
　　０点：比較例５の食品と同等
　－１点：比較例５の食品よりやや弱い
　－２点：比較例５の食品よりかなり弱い
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表７に示される通り、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼを併用して植物性タンパク質材料を処理することで得られた食品（実施例４０）のうま味が増大したことから、当該食品において遊離グルタミン酸量が顕著に増大したことが類推できる。
［試験例４］
　水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料２５ｇに対して、１０ｍＬの水、５ｍＬのオリーブオイル、メチルセルロース（最終濃度２質量％）、及び表８に記載の酵素を表示の量で混合し、パティの形状に成型し、５０℃にて１時間インキュベートすることで、組織化植物性タンパク質含有食品（調味後、焼成前）を得た。
　組織化植物性タンパク質含有食品（調味後、焼成前）を、１５０℃で１０分間焼成することで、パティ形状の組織化植物性タンパク質含有食品（焼成後）を得た。得られた食品を、訓練されたパネリスト６名による官能評価を行い、苦味スコアを得た。官能評価では、以下の分類に基づいて苦味の程度を評点し、平均値を苦味スコアとした。結果を表８に示す。
　　２点：比較例５の食品よりかなり強い
　　１点：比較例５の食品よりやや強い
　　０点：比較例５の食品と同等
　－１点：比較例５の食品よりやや弱い
　－２点：比較例５の食品よりかなり弱い
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表８に示される通り、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼを併用して植物性タンパク質材料を処理することで得られた食品（実施例４０）の苦味が抑制されたことから、当該食品における遊離グルタミン酸量の増大が、加水分解による苦味の発生を効果的に抑制できるほどに顕著であったことが類推できる。

Claims (16)

  1. 　植物性タンパク質含有組成物を、タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼで処理する工程を含む、加工植物性タンパク質含有組成物の製造方法。
  2. 　前記タンパク質分解酵素がプロテアーゼ及び／又はペプチダーゼである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記プロテアーゼを、前記植物性タンパク質１ｇ当たり１１０Ｕ以上用いる、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記プロテアーゼが糸状菌由来プロテアーゼである、請求項２に記載の製造方法。
  5. 　前記プロテアーゼが、アスペルギルス属及び／又はリゾプス属由来のプロテアーゼである、請求項２に記載の製造方法。
  6. 　前記プロテアーゼが、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガ、アスペルギルス・メレウス、及びリゾプス・ニベウス由来のプロテアーゼからなる群より選択される、請求項２に記載の製造方法。
  7. 　前記プロテアーゼが、細菌由来プロテアーゼである、請求項２に記載の製造方法。
  8. 　前記細菌由来プロテアーゼが、バチルス属及び／又はジオバチルス属由来のプロテアーゼである、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記細菌由来プロテアーゼが、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリケファシエンス及びこれらのジオバチルス属由来のプロテアーゼからなる群より選択される、請求項７に記載の製造方法。
  10. 　前記タンパク質分解酵素が、細菌由来プロテアーゼ及び糸状菌由来ペプチダーゼである、請求項２に記載の製造方法。
  11. 　前記ペプチダーゼが、リゾプス属及び／又はアスペルギルス属由来のペプチダーゼである、請求項２に記載の製造方法。
  12. 　前記植物性タンパク質が、豆類、穀類、ナッツ類及び種子類からなる群より選択される植物のタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
  13. 　前記植物性タンパク質含有組成物が液状である、請求項１に記載の製造方法。
  14. 　前記植物性タンパク質含有組成物が水で膨潤させた組織化植物性タンパク質材料である、請求項１に記載の製造方法。
  15. 　タンパク質分解酵素及びプロテイングルタミナーゼを含む、植物性タンパク質含有組成物の遊離グルタミン酸量向上剤。
  16. 　請求項１に記載の製造方法によって得られる、植物性タンパク質含有飲食品。
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