WO2023234376A1 - ヒアルロン酸誘導体、医薬組成物、及び医薬組成物の製造方法 - Google Patents

ヒアルロン酸誘導体、医薬組成物、及び医薬組成物の製造方法 Download PDF

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貴士 中井
文康 百瀬
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Mie University NUC
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Definitions

  • the present invention relates to hyaluronic acid derivatives, pharmaceutical compositions, and methods for producing pharmaceutical compositions.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2022-088995 filed in Japan on May 31, 2022, the contents of which are incorporated herein.
  • biopharmaceuticals that contain proteins, peptides, and nucleic acids as active ingredients have been put into practical use, and their number continues to increase year by year.
  • Biopharmaceuticals can fill unmet medical needs that could not be met with conventional small molecule drugs. However, they are difficult to absorb from the gastrointestinal tract or mucous membranes, are unstable in the body, and have a short half-life in the blood. Therefore, biopharmaceuticals require frequent administration by injection, which places a heavy burden on both patients and medical personnel. Therefore, there is a need for drug base materials (sustained release drug delivery system base materials) that can encapsulate biopharmaceuticals and gradually release the active ingredients in vivo without impairing pharmacological activity.
  • Patent Document 1 proposes a sustained release drug delivery system base material made of a highly safe hyaluronic acid derivative.
  • This hyaluronic acid derivative spontaneously associates in an aqueous solution, can efficiently encapsulate drugs, especially biopharmaceuticals, while maintaining their biological activity, and aggregates under physiological saline concentrations (or aggregates under physiological saline concentrations). (disperses even at low temperatures) and has good retention in the blood.
  • This hyaluronic acid derivative can be used as a carrier that can efficiently encapsulate many drugs while maintaining pharmacological activity, especially when biopharmaceuticals are used as active ingredients, and as a sustained release carrier and targeting carrier with excellent blood retention. It is said that it can be used as a local (for example, subcutaneous, etc.) sustained release carrier that can continuously release drugs.
  • the hyaluronic acid derivative used in Patent Document 2 etc. has a broad and non-uniform particle size distribution, and the particle size distribution of the hyaluronic acid derivative and its delivery to immune cells in lymph nodes are difficult to understand.
  • the relationship between gender and activation ability of the immune cells has not been specifically investigated, and there is room for improvement.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a hyaluronic acid derivative which, when formulated with a medicinal ingredient, has excellent delivery properties to immune cells in lymph nodes and the ability to activate the immune cells, and A pharmaceutical composition using a hyaluronic acid derivative and a method for producing the same are provided.
  • the present invention includes the following aspects. (1) A hyaluronic acid derivative into which a steryl group has been introduced, A hyaluronic acid derivative having a ratio A1/A2 of areas A1 and A2 of 0.90 or more, calculated by the method shown below from a chromatogram determined by gel permeation chromatography.
  • the ratio Da/Db of the distance Da and Db calculated by the method shown below from the chromatogram determined by gel permeation chromatography measurement is more than 0.00 and 1.20 or less, according to (1).
  • Hyaluronic acid derivative (i) Draw a perpendicular line from the maximum refractive index intensity point Ka on the chromatogram of 150 kDa polyacrylic acid, which is a standard substance, to the baseline B, and draw a perpendicular line from the point of intersection with the baseline to Ba, and between the maximum refractive index intensity point Ka and the above Ba.
  • a hyaluronic acid derivative into which a steryl group has been introduced The weight of the hyaluronic acid derivative calculated from the chromatogram obtained by gel permeation chromatography measurement based on a calibration curve prepared using polyacrylic acid with molecular weights of 2 kDa, 4 kDa, 8 kDa, 18 kDa, 40 kDa, and 150 kDa as standard substances.
  • a hyaluronic acid derivative having an average molecular weight of 110,000 or more and less than 500,000.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl; Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of 2 to 30 arbitrary amino acid residues;
  • X1 is the following formula: -NR b -R, -NR b -COO-R, -NR b -CO-R, -NR b -CO-NR c -R, -COO-R, -O-COO-R, -S-R, -CO-Y a -SR, -O-CO-Y b -SR, -NR b -CO-Y b -SR, and -SSR,
  • R a , R b and R c are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl,
  • a selected group may be inserted;
  • R is a steryl group;
  • Y is C 2-30 alkylene, or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -, where the alkylene is a group consisting of -O-, -NR g - and -SS- A group selected from the group consisting of;
  • R g is selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl and hydroxy C 2-20 alkyl, and the alkyl portion of the group is selected from the group consisting of -O- and -NH-
  • Y a is C 1-5 alkylene;
  • Y b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene;
  • m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • the medicinal ingredient contains at least one selected from the group consisting of cancer antigens, infectious disease-derived antigens, and autoantigens in immune diseases, and further contains an adjuvant (11) or (12) The pharmaceutical composition described in .
  • a method for producing a pharmaceutical composition comprising: (16) The method for producing a pharmaceutical composition according to (15), wherein the pH of the aqueous phase containing the hyaluronic acid derivative is 6.00 or more and 11.00 or less.
  • the hyaluronic acid derivative of the above embodiment it is possible to provide a hyaluronic acid derivative that, when formulated with a medicinal ingredient, has excellent delivery properties to immune cells in lymph nodes and an ability to activate the immune cells.
  • the pharmaceutical composition of the above embodiment contains the hyaluronic acid derivative and has excellent delivery properties to immune cells in lymph nodes and ability to activate the immune cells.
  • the method for producing a pharmaceutical composition according to the above aspect uses the hyaluronic acid derivative, and a pharmaceutical composition having excellent delivery properties to immune cells in lymph nodes and ability to activate the immune cells can be obtained.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Synthesis Example 1-1.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of a hyaluronic acid derivative in Synthesis Example 1-2.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of a hyaluronic acid derivative in Synthesis Example 1-3.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Example 1-1.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Example 1-2.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Example 1-3.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of a hyaluronic acid derivative in Comparative Example 1-1.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of a hyaluronic acid derivative in Comparative Example 1-2.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of a hyaluronic acid derivative in Comparative Example 1-3.
  • 1 is a gel permeation chromatogram of cholesteryl-modified pullulan (CHP) in Comparative Example 1-4.
  • 2 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Example 1-1 and the hyaluronic acid derivative in the pharmaceutical composition in Example 2-1.
  • CHP cholesteryl-modified pullulan
  • Example 2 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Example 1-2 and the hyaluronic acid derivative in the pharmaceutical composition in Example 2-2.
  • 2 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Example 1-3 and the hyaluronic acid derivative in the pharmaceutical composition in Example 2-3.
  • 12 is a graph showing an example of FACS analysis when calculating the ratio (%) of peptide-incorporated DC expressing CD80 to peptide-incorporated dendritic cells (DC) in Test Example 1-1.
  • 12 is a graph showing an example of FACS analysis when calculating the ratio (%) of peptide-incorporated DCs expressing CD86 to peptide-incorporated DCs in Test Example 1-1.
  • FIG. 2 is a graph showing an example of FACS analysis when calculating the ratio (%) of peptide-incorporated cDC1 expressing CD80 to peptide-incorporated standard type 1 dendritic cells (cDC1) in Test Example 1-1.
  • 12 is a graph showing an example of FACS analysis when calculating the ratio (%) of peptide-incorporated cDC1 expressing CD86 to peptide-incorporated cDC1 in Test Example 1-1.
  • 12 is a graph showing an example of FACS analysis when calculating the ratio (%) of peptide-incorporated Mph expressing CD80 to peptide-incorporated macrophage cells (Mph) in Test Example 1-1.
  • FIG. 12 is a graph showing an example of FACS analysis when calculating the ratio (%) of peptide uptake Mph expressing CD86 to peptide uptake Mph in Test Example 1-1.
  • 2 is a gel permeation chromatogram of hyaluronic acid derivatives in Test Examples 2-1 to 2-8.
  • 3 is a gel permeation chromatogram of hyaluronic acid derivatives in Test Examples 3-1 to 3-6. It is a gel permeation chromatogram of hyaluronic acid in Comparative Example 5-1.
  • Photographs of mixtures when attempting to prepare antigen peptide-hyaluronic acid complexes in Comparative Examples 5-1 and 5-2 and when preparing antigen peptide-hyaluronic acid derivative complexes in Example 7-1-1 This is a photograph of the solution. It is a gel permeation chromatogram of hyaluronic acid in Comparative Example 5-2. It is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Comparative Example 6-1. 1 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Example 6-1. It is a graph showing IgG antibody titer (OD value) in Example 6-1-1 and Comparative Example 6-1-1.
  • Example 6-1-1 It is a graph showing the IgG2a antibody titer (OD value) at a dilution factor of 10 (titer 10 ⁇ 1 ) in Example 6-1-1 and Comparative Example 6-1-1. It is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative in Example 7-1. 1 is a gel permeation chromatogram of a pharmaceutical composition containing an antigen peptide-hyaluronic acid derivative complex in Example 7-1-1. 1 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative obtained in Example 1-1. 1 is a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative obtained in Example 1-1. 3 is a graph showing tumor area values (average values) over time in Test Example 6.
  • the present embodiment an embodiment of the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment") will be described in detail, but the present invention is not limited thereto, and various modifications can be made without departing from the gist thereof. It is.
  • C 1-20 alkyl used herein means a straight or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, iso - Contains "C 1-4 alkyl” such as propyl, n-butyl, sec-butyl, iso-butyl, tert-butyl, and further includes n-pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-methylbutyl, -Ethylpropyl, n-hexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, and the like.
  • C 1-20 alkyl also includes C 1-12 alkyl groups having 1 to 12 carbon atoms and C 1-6 alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • C 1-6 alkylcarbonyl as used herein means an alkylcarbonyl group in which the alkyl moiety is C 1-6 alkyl as already mentioned, for example acetyl, propionyl, n-propylcarbonyl, "C 1-4 alkylcarbonyl” such as iso-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, iso-butylcarbonyl, and tert-butylcarbonyl is included.
  • amino C 2-20 alkyl used herein means a straight or branched alkyl having 2 to 20 carbon atoms and having an amino group as a substituent, for example, an amino group may be located on the terminal carbon atom of the alkyl group.
  • Amino C 2-20 alkyl also includes amino C 2-12 alkyl having 2 or more and 12 or less carbon atoms.
  • hydroxyC 2-20 alkyl used herein means a linear or branched alkyl group having 2 to 20 carbon atoms and having a hydroxy group as a substituent, for example, hydroxy The group may be located on the terminal carbon atom of the alkyl group. Hydroxy C 2-20 alkyl also includes hydroxy C 2-12 alkyl having 2 or more and 12 or less carbon atoms.
  • C2-30 alkylene used herein means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms, such as ethylene, propylene, etc. C2-20 alkylene with 2 to 20 carbon atoms, C2-8 alkylene with 2 to 8 carbon atoms, group "-(CH 2 ) n -" (where n is 2 to 30) and is preferably 2 or more and 20 or less, more preferably 2 or more and 15 or less.).
  • C 1-5 alkylene used herein means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, such as methylene, ethylene, Contains propylene etc.
  • C 2-8 alkenylene refers to a divalent saturated hydrocarbon group containing one or more double bonds, linear or branched, having 2 to 8 carbon atoms.
  • -CH CH-
  • -C(CH 3 ) CH-
  • 2-butene-1,4-diyl hepta-2,4-diene-1,6-diyl
  • octa-2,4 , 6-triene-1,8-diyl etc.
  • each isomer and mixtures thereof are also included.
  • the hyaluronic acid derivative of the first embodiment of the present invention is a hyaluronic acid derivative into which a steryl group is introduced, From the chromatogram shown in FIG. 1 obtained by gel permeation chromatography measurement, the ratio A1/A2 of areas A1 and A2 calculated by the method shown below is 0.90 or more.
  • the hyaluronic acid derivative of the present embodiment has a ratio Da/Db of distance Da and Db of more than 0.00, which is calculated by the method shown below from the chromatogram shown in FIG. 2 determined by gel permeation chromatography measurement. It is preferable that it is .20 or less.
  • (i) Draw a perpendicular line from the maximum refractive index intensity point Ka on the chromatogram of 150 kDa polyacrylic acid, which is a standard substance, to the baseline B, and draw a perpendicular line from the point of intersection with the baseline to Ba, and between the maximum refractive index intensity point Ka and the above Ba.
  • the hyaluronic acid derivative of this embodiment differs from conventional hyaluronic acid derivatives in that it contains a relatively large amount of hyaluronic acid derivative with a specific particle size in its particle size distribution, and the particle size distribution is sharply controlled.
  • this hyaluronic acid derivative with a controlled particle size distribution with a medicinal ingredient By formulating this hyaluronic acid derivative with a controlled particle size distribution with a medicinal ingredient, the inventors have discovered that by formulating this hyaluronic acid derivative with a controlled particle size distribution and a medicinal ingredient, it is possible to improve the effectiveness of hyaluronic acid derivatives with an uncontrolled particle size distribution and the conventional We have completed the present invention by discovering that the delivery to immune cells in lymph nodes and the ability to activate immune cells are significantly superior to that of cholesterol-modified pullulan (CHP), which is used as a carrier. It's arrived.
  • CHP cholesterol-modified pullulan
  • the immune cells mentioned here are preferably myeloid cells, more preferably macrophages or dendritic cells (DC), still more preferably DCs, and particularly preferably standard type 1 dendritic cells (cDC1 ).
  • DC dendritic cells
  • cDC1 standard type 1 dendritic cells
  • Dendritic cells are the most potent antigen-presenting cells and are responsible for regulating the proliferation and function of T cells and natural killer cells in lymphoid and non-lymphoid tissues.
  • cDC1 which specifically expresses the chemokine receptor XCR1 and selectively expresses the C-type lectin endocytosis receptor CLEC9A, has a high cross-presentation ability.
  • T cells cytotoxic T cells (CTLs)
  • CTLs cytotoxic T cells
  • cDC1 cytotoxic T cells
  • Macrophages and DCs can also load antigens onto MHC class II molecules. This activates helper T cells and promotes antibody production by B cells. That is, increasing antigen delivery to macrophages or DCs (preferably cDC1) improves the effectiveness of preventing or treating infectious diseases and treating immune diseases.
  • the ability to activate immune cells refers to the property of improving, promoting, or enhancing the activity of cells as described above, and in particular, improving, promoting, or enhancing the expression of costimulatory molecules in DCs (preferably cDC1). It is preferable that the property is maintained.
  • costimulatory molecules include CD80 and CD86.
  • T cells cytotoxic T cells (CTL)
  • CTL cytotoxic T cells
  • the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably one that can improve, promote, or maintain the expression of both CD80 and CD86 in DC (preferably cDC1) when formulated with a medicinal ingredient.
  • the hyaluronic acid derivative of the present embodiment can form a stable association state with the medicinal ingredient when formulated with the medicinal ingredient, and stably transfer the medicinal ingredient to immune cells (preferably DC, more preferably cDC1). Moreover, it can be efficiently delivered, and furthermore, the uptake of the medicinal ingredient into immune cells can be improved, promoted, or enhanced. It is presumed that this improves, promotes, or enhances the activity of immune cells. Note that even if the desired effect is obtained by a mechanism different from the above-mentioned mechanism, it is still within the technical scope.
  • immune cells preferably DC, more preferably cDC1
  • the hyaluronic acid derivative of this embodiment can also be referred to as a delivery enhancer, delivery promoter, or delivery enhancer of a medicinal ingredient to immune cells. Alternatively, it can also be referred to as an agent for improving, promoting, or enhancing the uptake of medicinal ingredients into immune cells.
  • the below-mentioned pharmaceutical composition containing the hyaluronic acid derivative of the present embodiment and a medicinal ingredient includes a composition for activating immune cells, a composition for improving the expression of costimulatory molecules in DCs (preferably cDC1), and a composition for improving the expression of costimulatory molecules in DCs (preferably cDC1). It can also be referred to as a composition for promoting or a composition for maintaining expression.
  • the particle size distribution of the hyaluronic acid derivative of this embodiment can be measured by gel permeation chromatography, and the particle size distribution controlled as described above is calculated from the gel permeation chromatogram by the method shown below. It can be expressed as the ratio A1/A2 of the areas A1 and A2.
  • the polyacrylic acid used as a standard substance in the gel permeation chromatography measurement is preferably sodium polyacrylate, and specifically, POLYMER Standards Service-USA, ORDER No. More preferably, it is PSS-Paa series (sodium polyacrylate).
  • Measurement of the particle size distribution of a hyaluronic acid derivative by gel permeation chromatography can be performed by the following method.
  • a 1 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution and a 2 mg/mL polyacrylic acid standard aqueous solution are prepared and measured by gel permeation chromatography under the conditions shown below.
  • FIG. 1 is an example of a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative of this embodiment. The method for calculating areas A1 and A2 will be described in detail below with reference to FIG.
  • FIG. 1 shows a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative of this embodiment and a gel permeation chromatogram of 50 kDa polyacrylic acid, which is a standard substance.
  • Ub the intersection point of the chromatogram of the hyaluronic acid derivative and the perpendicular line drawn from the maximum refractive index intensity point Kb on the chromatogram of 50 kDa polyacrylic acid, which is a standard substance.
  • Ub the maximum refractive index intensity point.
  • Bb be the intersection of the perpendicular line drawn from point Kb to baseline B and baseline B.
  • the refractive index intensity at the start of the measurement is set to zero, and a line drawn horizontally from this is set as the baseline.
  • the refractive index intensity is adjusted so that the increase/decrease in the refractive index intensity is within a range of ⁇ 0.5 mV before the start of measurement, and the refractive index intensity is adjusted so that the increase/decrease in the refractive index intensity is within a range of 0.5 mV or less in 5 minutes.
  • the first point at which the refractive index intensity increase exceeds an amount equivalent to five times the noise value three times is set as the "starting point" of the chromatogram, and the elution time is set as 0 minutes.
  • Tlim' is set as the 'end point'.
  • Tlim is the elution time at which maximum refractive index intensity is obtained when 2 kDa polyacrylic acid is measured. In this device, the refractive index intensity is calculated every 0.00167 minutes.
  • the ratio A1/A2 of areas A1 and A2 shown in FIG. 1 is 0.90 or more, more preferably 1.00 or more, more preferably 1.10 or more, and 1.20 or more. is more preferable, more preferably 1.30 or more, more preferably 1.40 or more, more preferably 1.50 or more, even more preferably 1.60 or more, and more preferably 1.70 or more. Particularly preferred.
  • the ratio A1/A2 of area A1 and A2 to the above lower limit value, it is possible to contain a relatively large amount of hyaluronic acid derivative with a large particle size, and when it is formulated with a medicinal ingredient, it can be stably associated with the medicinal ingredient. state can be formed.
  • the medicinal ingredient can be stably and efficiently delivered to immune cells (preferably DC, more preferably cDC1), and furthermore, the uptake of the medicinal ingredient into the immune cells can be improved, promoted, or enhanced. I can do it.
  • the upper limit value of A1/A2 it is preferable that the ratio of area A1 is higher than area A2.
  • the particle size is larger on the left side of the baseline (shorter elution time), and smaller on the right side (longer elution time), so the ratio of large particle size is It is preferable that the value is higher than that of the smaller value. Therefore, the upper limit value of A1/A2 is not particularly limited, and may be, for example, 7.0 or less, 6.0 or less, or 5.0 or less.
  • the shape of the gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative of this embodiment is not particularly limited, but there may be two or more maximum points (peak tops) of the refractive index intensity of the hyaluronic acid derivative.
  • the refractive index intensity of the hyaluronic acid derivative is indicated on each side (left and right) of a perpendicular line drawn from the maximum refractive index intensity point Kb to the baseline B on the chromatogram of 50 kDa polyacrylic acid, which is a standard substance. It may have one or more local maximum points (peak tops).
  • the refractive index intensity at the maximum point (peak top) of the refractive index intensity of the hyaluronic acid derivative on the left side of the perpendicular line drawn from the maximum refractive index intensity point Kb to the baseline B It may be greater than the refractive index intensity at the maximum point (peak top) of the refractive index intensity of the hyaluronic acid derivative on the right side of the perpendicular line drawn to .
  • the refractive index intensity at the maximum point (peak top) on the left side with respect to the maximum point (peak top) on the right side is not particularly limited, but is 1.0 times or more, 2.0 times or more, 3.0 times or more.
  • It may be more than 1000 times, 5.0 times or more, or 10.0 times or more, and the upper limit may be large, but for example, 1000 times or less, 100 times or less, 50.0 times or less, 20.0 times or less, It may be 10.0 times or less, 2.0 times or less, or 1.5 times or less.
  • the fact that the hyaluronic acid derivative of this embodiment has a particle size distribution controlled as described above can also be defined by the ratio Da/Db of the distances Da and Db shown below.
  • FIG. 2 is an example of a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative of this embodiment, and the gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative shown in FIG. Same as 1.
  • FIG. 2 differs from FIG. 1 in that a gel permeation chromatogram of 150 kDa polyacrylic acid, which is a standard substance, is added, and various intersection points are defined. The method for calculating the distances Da and Db will be described in detail below with reference to FIG. 2.
  • the ratio Da/Db between the distances Da and Db shown in FIG. 2 is preferably more than 0.00 and less than 1.20, more preferably more than 0.10 and less than 1.00, more than 0.20, and less than 1.00. It is more preferably 8 or less, further preferably 0.30 or more and 0.95 or less, even more preferably 0.40 or more and 0.94 or less, particularly preferably 0.50 or more and 0.93 or less.
  • the medicinal ingredient can be stably and efficiently delivered to immune cells (preferably DC, more preferably cDC1), and furthermore, the uptake of the medicinal ingredient into the immune cells can be improved, promoted, or enhanced. I can do it.
  • immune cells preferably DC, more preferably cDC1
  • the horizontal axis shows the elution time and the vertical axis shows the refractive index intensity obtained using a differential refractometer. good.
  • the gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative of this embodiment preferably has a particle size distribution with 1 to 5 maximum points, more preferably a particle size distribution with 1 to 3 maximum points. Further, the minimum point may or may not be present. Furthermore, in the gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative of this embodiment, whether the chromatogram expressed by the refractive index intensity and elution time obtained using a differential refractometer is asymmetrical or symmetrical, good.
  • the steryl groups in the hyaluronic acid derivative self-associate in water, and a single molecule or multiple molecules associate to form a nano-sized hydrogel.
  • the steryl group may be bonded directly to hyaluronic acid or may be bonded via a linker.
  • the "linker” used herein may be any peptide linker that can be introduced by genetic engineering or a synthetic compound linker, but peptide linkers are preferred for hyaluronic acid derivatives.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the purpose, but the preferred length is 2 amino acids or more (the upper limit is not particularly limited, but usually 30 amino acids or less, preferably is 20 amino acids or less), particularly preferably 15 amino acids.
  • the peptide linkers contained in the hyaluronic acid derivative may all have the same length, or may have different lengths.
  • steryl group used herein is not particularly limited as long as it is a group having a steroid skeleton.
  • the steroids specifically include cholesterol, cholestanol, campestanol, ergostanol, stigmastanol, coprostanol, stigmasterol, sitosterol, lanosterol, ergosterol, simiarenol, bile acids, testosterone, estradiol, and pro-steroids. Examples include gestrone, cortisol, cortisone, aldosterone, corticosterone, deoxycortisterone, and the like.
  • steryl group examples include a cholesteryl group, a stigmasteryl group, a lanosteryl group, an ergosteryl group, and among them, a cholesteryl group (particularly a cholest-5-en-3 ⁇ -yl group) is preferred.
  • the weight average molecular weight (absolute molecular weight) of the hyaluronic acid derivative is not particularly limited, but from the viewpoint of increasing the number of steryl groups introduced per molecule of the hyaluronic acid derivative to form a complex with the medicinal ingredient, and increasing molecular entanglement. From the viewpoint of increasing retention in blood, hyaluronic acid derivatives with relatively large molecular weights are preferred.
  • the weight average molecular weight (absolute molecular weight) of such a hyaluronic acid derivative is preferably 4000 (4k) or more and 1,000,000 (1,000k) or less, more preferably 5k or more and 500k or less, and further preferably 6k or more and 500k or less.
  • the weight average molecular weight (absolute molecular weight) of the hyaluronic acid derivative is more preferably 5k or more and 25k or less.
  • the weight average molecular weight (absolute molecular weight) of the hyaluronic acid derivative is equal to or greater than the above lower limit, molecular entanglement can be further enhanced and retention in blood can be further enhanced.
  • the weight average molecular weight (absolute molecular weight) of the hyaluronic acid derivative is equal to or less than the above upper limit, an increase in viscosity can be suppressed, and a higher concentration of the hyaluronic acid derivative can be dissolved in the pharmaceutical composition.
  • the weight average molecular weight (absolute molecular weight) of a hyaluronic acid derivative can generally be adjusted by using raw materials having a corresponding molecular weight.
  • the "molecular weight (absolute molecular weight) of the hyaluronic acid derivative” as used herein is the weight average molecular weight (absolute molecular weight) determined by size exclusion chromatography multi-angle light scattering detector (SEC-MALS).
  • the refractive index intensity of the hyaluronic acid derivative with respect to the retention time Pr (elution time Bb) of the maximum refractive index intensity point (peak top) of the standard substance 50 kDa polyacrylic acid The ratio Pt/Pr of the retention time Pt at the maximum point (peak top) is not particularly limited, but Pt/Pr is preferably 0.5 or more and less than 1.0, and 0.7 or more and less than 0.95. It is more preferable that it is 0.75 or more and less than 0.92.
  • the ratio Pt/Pr is within the above range, it is possible to contain a relatively large amount of hyaluronic acid derivative with a large particle size, and when formulated with a medicinal ingredient, it is possible to form a stable association state with the medicinal ingredient. can.
  • the medicinal ingredient can be stably and efficiently delivered to immune cells (preferably DC, more preferably cDC1), and furthermore, the uptake of the medicinal ingredient into the immune cells can be improved, promoted, or enhanced. I can do it.
  • the refractive index intensity maximum points (peak tops) where the refractive index intensity is maximum ) is employed as the retention time Pt of the maximum refractive index intensity point (peak top) of the hyaluronic acid derivative.
  • the polyacrylic acid used as a standard substance in the gel permeation chromatography measurement is preferably sodium polyacrylate, and specifically, POLYMER Standards Service-USA, ORDER No. More preferably, it is PSS-Paa series (sodium polyacrylate).
  • the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative is not particularly limited, but it is preferable that the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative is 110,000 or more, and 110,000 or more and less than 500,000. It is more preferably 130,000 or more and less than 300,000, even more preferably 140,000 or more and less than 250,000.
  • the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative is within the above range, it is possible to contain a relatively large amount of the hyaluronic acid derivative with a large particle size, and when formulated with a medicinal ingredient, the medicinal ingredient A stable association state can be formed with Thereby, the medicinal ingredient can be stably and efficiently delivered to immune cells (preferably DC, more preferably cDC1), and furthermore, the uptake of the medicinal ingredient into the immune cells can be improved, promoted, or enhanced. I can do it.
  • immune cells preferably DC, more preferably cDC1
  • the uptake of the medicinal ingredient into the immune cells can be improved, promoted, or enhanced. I can do it.
  • the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative exceeds the above upper limit, the viscosity increases and it may be difficult to use it as a preparation.
  • the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative is determined from the chromatogram determined by the gel permeation chromatography measurement.
  • PSS-Paa2k (2kDa), 4k (4kDa), 8k (8kDa), 18k (18kDa), 40k (40kDa), 150k (150kDa) PSS Polymer Standard service GmbH, sodium polyacrylate
  • At3+Bt2+Ct+D based on the calibration curve obtained.
  • hyaluronic acid derivatives include, for example, hyaluronic acid derivatives having one or more repeating units represented by the following general formula (I) (hereinafter sometimes referred to as “repeat units (I)"). It will be done.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl; Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of 2 to 30 arbitrary amino acid residues;
  • X1 is the following formula: -NR b -R, -NR b -COO-R, -NR b -CO-R, -NR b -CO-NR c -R, -COO-R, -O-COO-R, -S-R, -CO-Y a -SR, -O-CO-Y b -SR, -NR b -CO-Y b -SR, and -SSR,
  • R a , R b and R c are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl,
  • a selected group may be inserted;
  • R is a steryl group;
  • Y is C 2-30 alkylene, or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -, where the alkylene is a group consisting of -O-, -NR g - and -SS- A group selected from the group consisting of;
  • R g is selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl and hydroxy C 2-20 alkyl, and the alkyl portion of the group is selected from the group consisting of -O- and -NH-
  • Y a is C 1-5 alkylene;
  • Y b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene;
  • m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • the hyaluronic acid derivative preferably contains one or more repeating units represented by the following general formula (Ia) (hereinafter sometimes referred to as “repeat units (Ia)”) as repeating units (I).
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X is a hydrophobic group represented by -NR a -Y-NR b -COO-R;
  • R a and R b are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom and C1-6 alkyl;
  • R is a steryl group;
  • Y is C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O)m-CH 2 CH 2 -, m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • the repeating units may be the same or different.
  • the hyaluronic acid derivative may be modified at a position other than repeating unit (I) or repeating unit (Ia), for example, the hydroxy group is -O (C 1-6 alkyl), -O (formyl), -
  • the carboxy group may be converted to O(C 1-6 alkylcarbonyl), etc., and the carboxy group may be converted to an amide or ester, or may form a salt.
  • Z is preferably a direct bond.
  • X 1 is -NR b -COO-R.
  • Z may be a peptide linker represented by -NH-[CH(-Z a )-CONH] n-1 -CH(-Z a )-CO-, where , n is an integer of 2 or more and 30 or less, and Z a each independently represents a substituent in the ⁇ -amino acid represented as H 2 N-CH(-Z a )-COOH.
  • the peptide linker is bonded to the carboxy group of the glucuronic acid moiety at the N-terminus and to the group -N(-R a )-YX 1 at the C-terminus.
  • amino acids that can be used as amino acid residues in the peptide linker include ⁇ -amino acids such as alanine, arginine, asparagine (Asn), aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine (Gly), histidine, isoleucine, leucine ( Natural (L-type) amino acids such as Leu), lysine, methionine, phenylalanine (Phe), proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine, and their D forms, and all synthetic amino acids, including ⁇ -amino acids can be used.
  • examples of Z a include -CH 3 , H 2 NC(NH)NH(CH 2 ) 3 -, H 2 NCOCH 2 -, and the like.
  • n Z's may be the same or different.
  • n is an integer of 2 or more and 30 or less, preferably 2 or more and 10 or less, and more preferably 2 or more and 4 or less.
  • Preferred examples of peptide linkers include -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Asn-Phe-Phe-, -Phe-Phe-, Phe-Gly-, and the like.
  • Y is -(CH 2 ) n1 - and -(CH 2 CH 2 O) m1 -CH 2 CH 2 - (where n1 is an integer of 2 or more and 20 or less, and 2 or more An integer of 15 or less is preferable, an integer of 2 or more and 12 or less is more preferable, and an integer of 2 or more and 6 or less is even more preferable.
  • m1 is an integer of 1 or more and 4 or less. Specifically, -(CH 2 ) 2 -, -(CH 2 ) 6 -, -(CH 2 ) 8 -, -(CH 2 ) 12 -, or -(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 - is preferred.
  • Y is -(CH 2 ) 2 -, -(CH 2 ) 6 --, --(CH 2 ) 8 -- and --(CH 2 ) 12 -- is preferred, and --(CH 2 ) 6 -- is more preferred.
  • Y is, for example, -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -S-S-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -, -(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -S- S-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -, -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -S-S-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -, -(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -S-S-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 - and the like.
  • Y a is preferably -CH 2 - or -CH 2 -CH 2 -.
  • Yb is -CH 2 -CH 2 -, -CH(CH 3 )CH 2 -, 2-butene-1,4-diyl, hepta-2,4-diene-1,6-diyl or octa-2 ,4,6-triene-1,8-diyl is preferred, and --CH 2 --CH 2 -- or --CH(CH 3 )CH 2 -- is more preferred.
  • Specific examples of the group "-Z-N(R a )Y-X 1 " include -NH-(CH 2 ) 2 -NH-CO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH -(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -N(-(CH 2 ) 3 -NH 2 )-COO-cholesteryl, -NH- (CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 4 -N(-(CH 2 ) 3 -NH 2 )-COO-cholesteryl, -NH- (CH 2 ) 3 -NH-(CH 2
  • R a , R b and R c are hydrogen atoms
  • Y is linear C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -
  • Y a is linear C 1-5 alkylene
  • Y b is linear C 2-8 alkylene or linear is a C 2-8 alkenylene.
  • Repeat unit (Ia) In the general formula ( Ia ) , -COO-cholesteryl or -NH-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -NH-COO-cholesteryl is preferred, -NH-(CH 2 ) 2 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 6 -NH-COO-cholesteryl or -NH-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -NH-COO-cholesteryl is more preferred, and -NH-(CH 2 ) 6 -NH-COO-cholesteryl is even more preferred.
  • the hyaluronic acid derivative can further include a repeating unit represented by general formula (II) (hereinafter sometimes referred to as "repeat unit (II)").
  • R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X a is selected from the group consisting of hydroxy and -O-Q + ; where Q + is a countercation.
  • the hyaluronic acid derivative when the hyaluronic acid derivative contains two or more repeating units (II), the repeating units may be the same or different.
  • the hyaluronic acid derivative may be a hyaluronic acid derivative consisting essentially of repeating unit (I), repeating unit (Ia), and repeating unit (II).
  • Q + is not particularly limited as long as it is a counter cation that forms a salt with a carboxy group in water, and if it has a valence of two or more, it forms a salt with a plurality of carboxy groups depending on the valence.
  • countercations include metal ions such as lithium ions, sodium ions, rubidium ions, cesium ions, magnesium ions, calcium ions; formula: N + R j R k R l R m (where R j , R k , R l and R m are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom and C 1-6 alkyl).
  • Q + is preferably a sodium ion, potassium ion, or tetraalkylammonium ion (eg, tetra n-butylammonium ion, etc.).
  • R j , R k , R l and R m are preferably the same group selected from the group consisting of C 1-6 alkyl, preferably n-butyl group.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 as well as R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are all hydrogen atoms. Moreover, it is preferable that both R a and R b are hydrogen atoms.
  • the hyaluronic acid derivative is preferably a hyaluronic acid derivative consisting essentially of repeating unit (I) and repeating unit (II).
  • the hyaluronic acid derivative for example, 80% or more, preferably 90% or more of the disaccharide repeating unit consisting of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine contained in the derivative is more preferably 95% or more are repeating units (I) and repeating units (II).
  • the hyaluronic acid derivative may be composed only of repeating unit (I) and repeating unit (II), or may be composed only of repeating unit (I).
  • the introduction rate of steryl groups (hereinafter sometimes simply referred to as "steryl group introduction rate") with respect to the disaccharide repeating unit constituting the hyaluronic acid derivative is 15% or more and 60%.
  • the following is preferable, preferably 20% or more and 60% or less, 30% or more and 60% or less, more preferably 30% or more and 55% or less, even more preferably 35% or more and 50% or less, particularly 35% or more and 45% or less. preferable.
  • the steryl group introduction rate is equal to or higher than the above lower limit, a stable hydrogel can be maintained without precipitating in vivo.
  • the average particle diameter of the hydrogel can be within the above range.
  • the steryl group introduction rate can be measured by 1 H-NMR measurement. That is, the integral value of the peak derived from the steryl group of the hyaluronic acid derivative in the 1 H-NMR spectrum of the hyaluronic acid derivative component, and the peak derived from the acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine contained in the hyaluronic acid derivative (COCH 3 , 1.6 ppm or more and 2.0 ppm or less, 3H), it can be calculated based on the following formula. Note that in the formula, n H represents the number of hydrogen atoms corresponding to the peak.
  • the 1 H-NMR is performed, for example, at a measurement temperature of 85° C.
  • the peak derived from the cholesteryl group (5H) overlaps the peak around 1.6 to 2.0 ppm, which includes the peak derived from the acetyl group of glucosamine, so the cholesteryl A value calculated by subtracting 5/3 of the integral value of the peak derived from the group methyl (0.7 ppm) (i.e., integral value (1.6 to 2.0 ppm) - integral value (0.7 ppm) x 5/ 3) can be used to calculate the introduction rate as an integral value of acetyl groups derived from hyaluronic acid.
  • Stepryl group introduction rate] (%) [(Peak integral value derived from steryl group ⁇ 3/n H )/(Peak integral value derived from acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine)] ⁇ 100
  • Hyaluronic acid derivatives can be obtained, for example, by converting the carboxyl group of glucuronic acid into an amide and introducing a steryl group. Furthermore, the rate of steryl group introduction can be controlled by adjusting the amount of the compound having a steryl group to be reacted with the raw material hyaluronic acid or its derivative.
  • a method of converting the carboxyl group of glucuronic acid into an amide and introducing a steryl group for example, hyaluronic acid as a raw material or a derivative thereof, preferably hyaluronic acid composed only of repeating unit (II).
  • a tetraalkylammonium salt e.g., tetrabutylammonium (TBA) salt
  • TSA tetrabutylammonium
  • the hyaluronate is combined with the hyaluronate of the formula: "HNR a -Y-NR b -R, NHR a -Y-NR b -COO-R, HNR a -Y-NR b -COO-R, HNR a -Y-NR b -CO-R, HNR a -Y-NR b -CO- NR c -R, HNR a -Y-COO-R, HNR a -Y-O-COO-R, HNR a -Y-S-R, HNR a -Y-CO-Y a -S-R, HNR a -Y-O-CO-Y b -S
  • the condensing agent that can be used in the above reaction is not particularly limited, and examples include 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine)-4-methylmorpholium (DMT-MM), N , N'-carbonyldiimidazole (CDI), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ), 2-benzotriazole-1,1, 3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (HODhbt), benzotriazole-1-oxy -Tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphat
  • DMT-MM is preferable in that the reaction proceeds with high efficiency even in a mixed solvent of water and an organic solvent. Furthermore, by using DMT-MM as a condensing agent, it is possible to highly selectively form an amide bond between an amino group and a carboxy group while suppressing the formation of an ester bond in a system where a large number of hydroxy groups coexist.
  • the alcohol as a solvent may react with the carboxy group of the hyaluronic acid moiety, or the carboxyl group and hydroxyl group that are simultaneously present in the hyaluronic acid moiety may bond within or intermolecularly. , it is possible to prevent the formation of undesired crosslinks.
  • Solvents used in the steryl group introduction reaction include water, DMSO, methanol, ethanol, propanol, butanol, isopropanol, polyhydric alcohol, acetonitrile, DMF, THF, dichloromethane, chloroform, hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and mixtures thereof. Examples include solvents.
  • the polyhydric alcohol may be a dihydric alcohol or a trihydric alcohol. Examples of the dihydric alcohol include ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, neopentyl glycol, 1,4-butanediol, and 1,6-hexanediol. Examples of the trihydric alcohol include glycerin and trimethylolpropane.
  • hyaluronic acid or a derivative thereof as a raw material is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (e.g., tetrabutylammonium (TBA) salt), and the hyaluronate and spacer moiety are reacted in a solvent in the presence of an appropriate condensing agent. (At this time, protection and deprotection reactions may be performed as necessary) to convert the carboxy group (-COOH) of the raw material hyaluronic acid or its derivative, and then react with an appropriate reagent. . Examples of combinations of groups derived from carboxy groups and reaction reagents are shown below.
  • reaction mode examples include dehydrohalogenation reaction, condensation reaction, dehydration reaction, nucleophilic addition reaction such as Michael addition, oxidative disulfide formation reaction, etc. These are well-known reactions and can be selected as appropriate by those skilled in the art. However, the reaction can be carried out by finding preferable reaction conditions.
  • the converter or reactant When the converter or reactant has a carboxyl group, it may be converted into an N-hydroxysuccinimide (hereinafter also referred to as "NHS”) ester and reacted.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • a hyaluronic acid derivative having a spacer having a mercapto group modified with a leaving group at the end is prepared by reacting 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide with the carboxy group of the raw material hyaluronic acid or its derivative. Then, there is a method in which thiocholesterol is subjected to a nucleophilic substitution reaction to form a disulfide bond.
  • hyaluronic acid or its derivatives with a part of the spacer introduced into the carboxy group and one with a part of the spacer introduced into the steryl group, and reacting them.
  • a hyaluronic acid derivative in which a spacer having a mercapto group at the end is introduced into the carboxy group of hyaluronic acid;
  • Another method is to prepare steryl groups into which a spacer having a mercapto group at the end is introduced, and to react them oxidatively to form a disulfide bond. At this time, one mercapto group can be reacted with 2-mercaptopyridine to form a disulfide, and then the other mercapto group can be substituted.
  • hyaluronic acid derivative consisting essentially of repeating units (I) and repeating units (II), -CO-X z ,
  • a dialysis membrane with a MWCO (molecular weight cutoff) of 300 kDa for 1 to 9 times, preferably 3 to 9 times, more preferably 6 to 9 times.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • a hyaluronic acid derivative having a particle size distribution satisfying an area ratio A1/A2 of 0.9 or more can be obtained.
  • Those skilled in the art can appropriately select the number of times of dialysis as long as the area ratio A1/A2 satisfies 0.9 or more. In some cases, fractionation may be performed by dialysis nine or more times.
  • the method for obtaining a hyaluronic acid derivative having a particle size distribution satisfying the area ratio A1/A2 of 0.9 or more is not limited to dialysis alone.
  • centrifugal filtration using ultrafiltration membrane or microfiltration membrane preparative purification HPLC, preparative purification GPC, separation by ultracentrifugation, separation by ion exchange resin, separation by membrane distillation, membrane separation by organic or inorganic membrane, activated carbon. Separation by adsorption/desorption using zeolite, MOF (Metal Organic Frameworks), separation by TFF (Tangential Flow Filtration), liquid feeding using a filter, pressure or vacuum filtration, precipitation separation using salting out, etc.
  • MOF Metal Organic Frameworks
  • TFF Tangential Flow Filtration
  • separation using hyaluronic acid receptors similarly removes hyaluronic acid derivatives with a particle size distribution below that of the standard substance polyacrylic acid (50 kDa, manufactured by Polymer Standards Service-USA, ORDER No. PSS-Paa50k). By doing so, a hyaluronic acid derivative having a particle size distribution satisfying the area ratio A1/A2 of 0.9 or more can be obtained.
  • the obtained hyaluronic acid derivative may be dried.
  • the drying method include ventilation drying, drying in a thermostatic oven, reduced pressure drying, hot air circulation drying, and freeze drying. Among these, freeze-drying is preferred.
  • the hyaluronic acid derivative preferably further contains a cryoprotectant from the viewpoint of more effectively suppressing an increase in the particle size of the fine particles formed by the hyaluronic acid derivative.
  • cryoprotectant is not particularly limited as long as it is known as a "cryoprotectant” or “lyoprotectant” and includes, for example, disaccharides, sorbitol, dextran, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, glycerol, Examples include polyvinylpyrrolidone and dimethyl sulfoxide.
  • Disaccharides are not particularly limited and include, for example, sucrose, lactulose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose, cordibiose, nigerose, isomaltose, isotrehalose, neotrehalose, sophorose, laminaribiose, gentiobiose, turanose, maltulose, palatinose,
  • Examples include gentiobiulose, mannobiose, melibiose, melibiulose, neolactose, galactosucrose, silabiose, neohesperidose, rutinose, rutinulose, vicyanose, xylobiose, primeverose, and the like.
  • sucrose, trehalose, maltose, or lactose are preferred because they are widely used as cryoprotectants. Further, sucrose is more preferred from the viewpoint of its use as a pharmaceutical additive and from the viewpoint of more effectively suppressing the increase in particle size of fine particles formed by hyaluronic acid derivatives during freeze-drying.
  • the cryoprotectant may be added in a solid state or in a state dissolved in a solvent such as water.
  • the amount of the cryoprotectant added is not particularly limited, but is preferably 20 parts by mass or more based on 100 parts by mass of the hyaluronic acid derivative.
  • the amount of the cryoprotectant added is at least the above lower limit, a more sufficient effect of suppressing particle size increase can be obtained.
  • the upper limit of the amount of cryoprotectant added is not particularly limited, but may be, for example, 100,000 parts by mass.
  • the apparatus used in freeze-drying is not particularly limited, and for example, a commercially available freeze-dryer can be used.
  • a freeze dryer that can monitor the degree of vacuum inside the apparatus during freeze-drying is preferable, and from the viewpoint of controlling the product temperature, a shelf-type freeze dryer is preferable.
  • the hyaluronic acid derivative of the second embodiment of the present invention is a hyaluronic acid derivative into which a steryl group has been introduced, and in a chromatogram obtained by gel permeation chromatography measurement, the refraction of 50 kDa polyacrylic acid, which is a standard substance, is
  • the ratio Pt/Pr of the retention time Pt at the maximum refractive index intensity point (peak top) of the hyaluronic acid derivative to the retention time Pr at the maximum index intensity point (peak top) is 0.5 or more and less than 1.0, and 0 More preferably .7 or more and less than 0.95, most preferably 0.75 or more and less than 0.92.
  • the ratio Pt/Pr within the above range, it is possible to contain a relatively large amount of hyaluronic acid derivative with a large particle size, and when formulated with a medicinal ingredient, it is possible to form a stable association state with the medicinal ingredient. .
  • the medicinal ingredient can be stably and efficiently delivered to immune cells (preferably DC, more preferably cDC1), and furthermore, the uptake of the medicinal ingredient into the immune cells can be improved, promoted, or enhanced. I can do it.
  • the polyacrylic acid used as a standard substance in the gel permeation chromatography measurement is preferably sodium polyacrylate, and specifically, POLYMER Standards Service-USA, ORDER No. More preferably, it is PSS-Paa50k (sodium polyacrylate).
  • the measurement by gel permeation chromatography can be performed, for example, by the following method. A 1 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution and a 2 mg/mL polyacrylic acid standard aqueous solution are prepared and measured by gel permeation chromatography under the conditions shown below.
  • the hyaluronic acid derivative of the third embodiment of the present invention is a hyaluronic acid derivative into which a steryl group has been introduced, and the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative is 110,000 or more and less than 500,000. , preferably 130,000 or more and less than 300,000, more preferably 140,000 or more and less than 250,000.
  • the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative satisfies the above range, it is possible to contain a relatively large amount of the hyaluronic acid derivative with a large particle size, and when formulated with a medicinal ingredient, it is stable. A state of association can be formed.
  • the medicinal ingredient can be stably and efficiently delivered to immune cells (preferably DC, more preferably cDC1), and furthermore, the uptake of the medicinal ingredient into the immune cells can be improved, promoted, or enhanced. I can do it.
  • immune cells preferably DC, more preferably cDC1
  • the uptake of the medicinal ingredient into the immune cells can be improved, promoted, or enhanced. I can do it.
  • the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative exceeds the above upper limit, the viscosity may increase and it may be difficult to use it as a preparation.
  • the weight average molecular weight (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative is determined from the chromatogram determined by gel permeation chromatography, using polyacrylic acid having a standard molecular weight of 2 kDa, 4 kDa, 8 kDa, 18 kDa, 40 kDa, and 150 kDa. It is calculated according to the following formula: At3+Bt2+Ct+D based on a calibration curve created as a substance.
  • the polyacrylic acid used as the standard substance is preferably sodium polyacrylate, and specifically, POLYMER STANDARDS SERVICE-USA, ORDER No. More preferably, it is PSS-Paa series (sodium polyacrylate).
  • the measurement by gel permeation chromatography can be performed by the method described in the first or second embodiment.
  • descriptions of the same configurations as the hyaluronic acid derivatives of the first embodiment and/or the second embodiment will be omitted.
  • the hyaluronic acid derivatives of the first to third embodiments can be formulated with medicinal ingredients and used as a pharmaceutical composition. That is, the pharmaceutical composition of this embodiment contains the above-described hyaluronic acid derivative and a medicinal ingredient.
  • the hyaluronic acid derivative forms a complex with a medicinal ingredient (hereinafter sometimes referred to as "medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex").
  • a medicinal ingredient hereinafter sometimes referred to as "medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex”
  • the steryl group in the hyaluronic acid derivative and the hydrophobic site of the medicinal ingredient form a complex through hydrophobic interaction, and the medicinal ingredient and the hydrophobic site, such as the steryl group, are located in the center.
  • the average particle diameter of the spherical structure containing the medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex can be 20 nm or more and 100 nm or less, 20 nm or more and 95 nm or less, and 20 nm or more
  • the thickness can be 90 nm or less.
  • the average particle diameter here is a value expressed as a z average.
  • the average particle diameter can be measured by, for example, DLS (Dynamic Light Scattering), a nanotracking particle measuring device, size exclusion chromatography, high performance liquid chromatography, electron microscopy, or the like.
  • the hyaluronic acid derivative is diluted with a 10 mM phosphate buffer containing 10 w/v% sucrose and measured using a DLS device so that the concentration of the hyaluronic acid derivative becomes 1 mg/mL.
  • the weight average molecular weight Mw (in terms of polyacrylic acid) of the hyaluronic acid derivative or the medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex is preferably 110,000 or more.
  • the weight average molecular weight Mw (in terms of polyacrylic acid) can be calculated by creating a calibration curve using a plurality of polyacrylic acid samples having different molecular weights.
  • the polyacrylic acid preparation used is preferably sodium polyacrylate, specifically, ORDER No. manufactured by Polymer Standards Service-USA. More preferably, it is PSS-Paa series (sodium polyacrylate).
  • the medicinal ingredients such as peptides can be absorbed into immune cells (especially It can be stably and efficiently delivered to cDC1, macrophages), and furthermore, it can improve, promote, or enhance the uptake of the medicinal ingredient into immune cells. It is believed that the expression of the molecules CD80 and CD86) can be improved, promoted, maintained or enhanced.
  • Mw can be measured, for example, by DLS (Dynamic Light Scattering), size exclusion chromatography, electron microscopy, or the like. More specifically, for example, the hyaluronic acid derivative is diluted to a concentration of 1 mg/mL using a size exclusion chromatography device, and then measured.
  • the peak top time in the particle size distribution of the hyaluronic acid derivative or the medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex in size exclusion chromatography is greater than the peak top time of the standard substance polyacrylic acid (50 kDa). It is preferable that it is also small.
  • the peak top time is within the above range, there are more aggregate sizes that are excellent in activating costimulatory molecules, and by using the pharmaceutical composition of this embodiment, the medicinal ingredients such as peptides can be absorbed into immune cells (especially , cDC1, and macrophages), and further improves, promotes, or enhances the uptake of the medicinal ingredient into immune cells.
  • Peak top time can be measured, for example, by size exclusion chromatography. More specifically, for example, the hyaluronic acid derivative is diluted to a concentration of 1 mg/mL using a size exclusion chromatography device, and then measured.
  • the content of the hyaluronic acid derivative is not particularly limited, but may be, for example, 0.01 parts by mass or more and 50.00 parts by mass or less based on 100 parts by mass of the pharmaceutical composition. It is preferably 0.10 parts by mass or more and 25.00 parts by mass or less, and even more preferably 0.20 parts by mass or more and 10.00 parts by mass or less.
  • medicinal ingredients include, but are not limited to, antigens (cancer antigens, infectious disease-derived antigens, autoantigens in immune diseases, etc.), pharmaceutically active peptides or proteins, nucleic acids, low-molecular compounds, middle-molecular compounds, and the like.
  • antigens are preferred, at least one selected from the group consisting of cancer antigens, infectious disease-derived antigens, and self-antigens in immune diseases is more preferred, and cancer antigens or infectious disease-derived antigens are more preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment is preferably a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of cancer, infectious diseases, and immune diseases; Even more preferably, it is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can also be called a vaccine composition when the applicable disease is cancer, infectious disease, or immune disease.
  • Cancer antigens are antigens that are often expressed by cancer cells, and in some cases only by cancer cells. Cancer antigens can be expressed within cancer cells or on the surface of cancer cells.
  • Antigenic proteins that can be used in the pharmaceutical composition of this embodiment include, but are not limited to, ERK1, ERK2, WT1, MART-1/Melan-A, gp100, adenosine deaminase binding protein (ADAbp), FAP, cyclophilin b, colorectal Related antigen (CRC) - C017-1A/GA733, carcinoembryonic antigen (CEA), CAP-1, CAP-2, etv6, AML1, prostate specific antigen (PSA), PSA-1, PSA-2, PSA -3, prostate specific membrane antigen (PSMA), T cell receptor/CD3-zeta chain, CD20, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE- A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-X
  • the entire sequence thereof may be used, or a partially deleted sequence may be used.
  • the antigenic peptide that can be used in the pharmaceutical composition of the present embodiment is one or more epitopes selected from the group consisting of a CD8-positive cytotoxic T cell recognition epitope and a CD4-positive helper T cell recognition epitope among the antigen protein sequences. It is an antigenic peptide containing.
  • the antigenic peptide is preferably an antigenic peptide containing two or more epitopes from the viewpoint of being loaded onto MHC class I molecules or MHC class II molecules after being degraded in antigen-presenting cells.
  • the antigenic peptide mentioned above includes an antigenic peptide containing an epitope of an antigenic protein of a tumor cell.
  • the antigenic peptide has, for example, 8 to 120 amino acids, preferably 8 to 80 amino acids, more preferably 15 to 80 amino acids, even more preferably 16 to 80 amino acids, even more preferably 23 to 80 amino acids, and even more It preferably has 23 to 60 amino acids, particularly preferably 23 to 50 amino acids.
  • the antigen peptide has one epitope recognized by CD8-positive cytotoxic T cells and one epitope recognized by CD4-positive helper T cells. It is an antigenic peptide containing three or more antigenic peptides.
  • an amino acid linker may be placed between the epitopes.
  • the linker has, for example, 2 to 10 amino acids, preferably 4 to 10 amino acids, more preferably 4 to 8 amino acids.
  • Amino acids used in the linker include glycine (G), tyrosine (Y), leucine (L), tryptophan (W), and the like. Preferably they are tyrosine (Y), leucine (L), and tryptophan (W).
  • amino acid linkers include a linker (4Y) consisting of four consecutive tyrosines (Y), a linker (4L) consisting of four consecutive leucines (L), and a linker (4L) consisting of four consecutive tryptophans (W).
  • a linker of 6 consecutive glycines (G) (6G), a linker of 6 consecutive tyrosines (Y) (6Y), a linker of 6 consecutive leucines (L) (6L), a linker of 6 consecutive tryptophans (W) linker (6W), 8 consecutive tyrosine (Y) linker (8Y), 6 consecutive leucine (L) linker (8L), 8 consecutive tryptophan (W) linker (8W) are mentioned, preferably 6Y, 6L or 6W.
  • Cancer antigens may be tumor-associated antigens, cancer testis antigens, viral antigens, or tumor-specific antigens (including neoantigens). Cancer antigens may be used alone or in combination of two or more.
  • infectious disease-derived antigen is not particularly limited as long as it is an infectious pathogen or an antigen derived from an infectious pathogen. Infectious pathogens include viruses, bacteria, fungi, nematodes, and the like.
  • infectious disease pathogen-derived antigen may be an antigenic protein or an antigenic peptide.
  • Diseases contracted from the above infectious pathogens are not particularly limited, and include, for example, adenoviruses, herpesviruses (such as HSV-I, HSV-II, CMV, and VZV), poxviruses (such as variola or vaccinia, and molluscum contagiosum).
  • adenoviruses such as HSV-I, HSV-II, CMV, and VZV
  • poxviruses such as variola or vaccinia, and molluscum contagiosum
  • orthopoxviruses picornaviruses (e.g., rhinoviruses, enteroviruses), orthomyxoviruses (e.g., influenza viruses), paramyxoviruses (e.g., parainfluenza viruses, mumps viruses, measles viruses, respiratory viruses) syncytial virus (RSV)), coronavirus (e.g., SARS coronavirus (SARS-CoV), MERS coronavirus (MERS-CoV), SARS-CoV-2), papovavirus (e.g., genital warts, cystocele vulgaris, papillomaviruses (such as those that cause plantar warts), hepadnaviruses (e.g., hepatitis B virus), flaviviruses (e.g., hepatitis C virus, dengue virus), retroviruses (e.g., lentiviruses such as HIV), etc.
  • RSV syncy
  • Viral diseases such as those caused by viral infections; Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium , Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Haemophilus, Bordetella, etc.; chlamydia, candidiasis, aspergillosis, Fungal diseases such as histoplasmosis and cryptococcal meningitis; malaria, Pneumocystis carinii pneumonia, leishmaniasis, cryptosporidiosis, toxoplasmosis, trypanosome infection, and the
  • the structure of the antigen that can be used in the pharmaceutical composition of the present embodiment is not particularly limited as long as it is at least a part of various components constituting a pathogen, and examples include live vaccines, inactivated whole particles, and the like. Examples include a part of a protein, a protein subunit, a protein, a peptide, and the like. Among these, protein subunits, proteins, or peptides are preferred from the viewpoint of conjugation with hyaluronic acid derivatives.
  • the above-mentioned influenza virus is an RNA enveloped virus that belongs to the Orthomyxoviridae family and has a particle size of about 100 nm in diameter, and is divided into types A, B, and C based on the antigenicity of the internal protein.
  • the influenza virus consists of a core of ribonucleic acid (RNA) associated with an internal nucleocapsid or nucleoprotein surrounded by a viral envelope with a lipid bilayer structure, and an external glycoprotein.
  • the inner layer of the viral envelope is mainly composed of matrix proteins, and the outer layer is mostly composed of host-derived lipid substances.
  • the RNA of the influenza virus has a segmented structure. Influenza that is prevalent all over the world is caused by influenza A virus.
  • Influenza A virus has two types of envelope glycoproteins, hemagglutinin and neuraminidase, and there are 16 types of hemagglutinin due to antigenic differences. , neuraminidase is classified into nine subtypes.
  • antigens derived from influenza A and B viruses are preferably used.
  • the subtypes of the above-mentioned influenza A and B viruses are not particularly limited, and may be subtypes that have been isolated so far or subtypes that will be isolated in the future.
  • the influenza virus-derived antigen is not particularly limited as long as it is at least a part of the various components constituting the above-mentioned influenza virus.
  • purified virus particles are inactivated with an organic solvent/surfactant or other reagent.
  • examples include whole virus particles produced by the virus, or virus subunits produced by removing impurities from the whole virus particles and purifying hemagglutinin and/or neuraminidase. From the viewpoint of immunogenicity, hemagglutinin subunits or whole virus particles are preferred.
  • the whole virus particles are more preferably inactivated with formalin or the like. Furthermore, it is particularly effective for hemagglutinin subunit (split), which has few impurities and requires an adjuvant such as an immunostimulant.
  • the method for preparing the influenza virus antigen described above is not particularly limited, and any known method can be used without limitation.
  • a method may be used in which chicken eggs or the like are infected with a virus strain isolated from an influenza-infected animal or an influenza patient, cultured by a conventional method, and an antigen is prepared from the purified virus stock solution.
  • a virus-derived antigen prepared in cultured cells by genetic engineering may be used.
  • Antigens for immune diseases are not particularly limited as long as they contain epitopes of target proteins of immune diseases.
  • Immune diseases are not particularly limited, and include, for example, plaque psoriasis, ankylosing spondylitis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, axial spondyloarthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, bronchial asthma, chronic urticaria, and hay fever. , atopic dermatitis, etc.
  • Target proteins are not particularly limited, and include IL-17A, DPP4, S100A9, PCSK9, IL-23, IgE, TNF ⁇ , IL-12/23p40, IL-6, ⁇ 4 ⁇ 7 integrin, IL-4/13, IL-5, Examples include BLyS and IL-13.
  • Reference document 2 International Publication No. 2017/164409) describes a peptide derived from IL-17A.
  • the peptide may have not only an epitope of the target protein but also an epitope of a protein other than the target protein. It may be a B cell epitope or a T cell epitope.
  • a peptide is a sequence that has an epitope and may have a cyclic structure. The early peptide may have multiple cyclic structures within the molecule.
  • the peptide may be conjugated to a protein. A therapeutic effect can be expected by the production of antibodies against the administered protein or peptide within the body.
  • pharmaceutically active peptide or protein By pharmaceutically active peptide or protein is meant one that has a positive or beneficial effect on a condition or disease state of a subject when administered to the subject in a therapeutically effective amount.
  • Preferred pharmaceutically active peptides or proteins have curative or palliative properties and ameliorate, ameliorate, alleviate, reverse, or delay the onset of symptoms of a disease or disorder, or It can be administered to reduce the severity of symptoms.
  • Pharmaceutically active peptides or proteins may also have prophylactic properties and can be used to delay the onset of disease or reduce the severity of such disease or condition.
  • pharmaceutically active peptide or protein includes a full-length protein or polypeptide and may also refer to pharmaceutically active fragments thereof. The term also encompasses pharmaceutically active analogs of peptides or proteins.
  • cytokines examples include, but are not limited to, cytokines and immune system proteins such as immunoactive compounds (e.g., interleukins, colony stimulating factor (CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte Macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin, tumor necrosis factor (TNF), interferon, integrin, addressin, seletin, homing receptor, T cell receptor, immunoglobulin, antibody, hormone (insulin, thyroid hormone) , catecholamines, gonadotropins, stimulating hormones, prolactin, oxytocin, dopamine, bovine somatotropin, leptin, etc.), growth hormones (e.g., human growth hormone), growth factors (e.g., epidermal growth factor, nerve growth factor, insulin-like growth factor, etc.) , growth factor receptors, enzymes (tissue plasminogen activator, streptokinase, cholesterol biosy
  • proteins that inhibit angiogenesis include structural proteins (collagen, fibroin, fibrinogen, elastin, tubulin, actin, myosin, etc.), blood proteins (thrombin, Serum albumin, factor VII, factor VIII, insulin, factor IX, factor X, tissue plasminogen activator, protein C, von Willebrand factor, antithrombin III, glucocerebrosidase, erythropoietin, modified factor VIII , anticoagulant factors), etc.
  • structural proteins collagen, fibroin, fibrinogen, elastin, tubulin, actin, myosin, etc.
  • blood proteins thrombin, Serum albumin, factor VII, factor VIII, insulin, factor IX, factor X, tissue plasminogen activator, protein C, von Willebrand factor, antithrombin III, glucocerebrosidase, erythropoietin, modified factor VIII , anticoagulant factors), etc.
  • the pharmaceutically active protein is a cytokine involved in the regulation of lymphocyte homeostasis, preferably involved in one or more selected from the group consisting of T cell development, priming, expansion, differentiation and survival. and cytokines that induce or enhance them.
  • the cytokine is an interleukin.
  • the pharmaceutically active protein is one or more interleukins selected from the group consisting of IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 and IL-21.
  • the pharmaceutically active peptide may have a cyclic structure. The peptide may have multiple cyclic structures within the molecule.
  • nucleic acids examples include DNA, RNA, antisense nucleic acids, decoy nucleic acids, ribozymes, small interfering RNAs, and nucleic acid aptamers. Furthermore, when the antigen is a peptide or protein, nucleic acids (DNA, mRNA, etc.) encoding the antigenic peptide or protein are also preferably used.
  • low-molecular compounds examples include anticancer agents (e.g., alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.), immunosuppressants, anti-inflammatory agents (steroidal agents, nonsteroidal anti-inflammatory agents, etc.), antirheumatic agents, and antibacterial agents. agents ( ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa drugs, etc.).
  • anticancer agents e.g., alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.
  • immunosuppressants e.g., anti-inflammatory agents, etc.
  • anti-inflammatory agents steroidal agents, nonsteroidal anti-inflammatory agents, etc.
  • antirheumatic agents e.g., antibacterial agents.
  • agents ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics,
  • highly hydrophobic, ie, poorly water-soluble ones can also be preferably used because they can sufficiently interact with the steryl group of the above-mentioned hyaluronic acid derivative.
  • “poorly water-soluble” refers to the amount of water required to dissolve 1 g of solute in the 17th edition of the Japanese Pharmacopoeia to be 30 mL or more.
  • poorly water-soluble solid medicinal ingredients include acetaminophen, ibuprofen, benzoic acid, ethenzamide, caffeine, camphor, quinine, calcium gluconate, dimethyl caprol, sulfamine, theophylline, theopramine, riboflavin, mephenesin, Antipyretic analgesics such as phenobarbital, aminophylline, thioacetazone, quercetin, rutin, salicylic acid, theophylline sodium salt, pirapital, quinine hydrochloride, irgapirin, dioquitoxin, griseofulvin, phenacetin, nervous system drugs, sedative-hypnotics, muscle relaxants, blood pressure stiffening antibiotics such as acetylspiramycin, ampicillin, erythromycin, xatamycin, chloramphenicol, triacetyloleandomycin, nystatin, colistin sulf
  • the medicinal ingredient may be in the form of a poorly water-soluble oil or liquid.
  • sparingly water-soluble oily or liquid medicinal ingredients include teprenone, indomethacin farnesil, menatetrenone, phytonadione, vitamin A oil, fenipentol, vitamins such as vitamin D and vitamin E, DHA (docosahexaenoic acid), and EPA. (eicosapentaenoic acid), higher unsaturated fatty acids such as cod liver oil, coenzyme Q, oil-soluble flavorings such as orange oil, lemon oil, peppermint oil, etc., according to the Japanese Pharmacopoeia, ⁇ external groups'', and ⁇ USP''.
  • vitamin E There are various homologs and derivatives of vitamin E, but there are no particular limitations as long as they are liquid at room temperature. Examples include dl- ⁇ -tocopherol, dl- ⁇ -tocopherol acetate, d- ⁇ -tocopherol, and d- ⁇ -acetate. Examples include tocopherol. One type selected from these medicinal ingredients may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the medicinal ingredient may be a semi-solid substance that is poorly water soluble.
  • Semi-solid medicinal ingredients that are poorly water-soluble include, for example, Jiryu, Liquorice, Keihi, Peony, Botanpi, Valerian, Sansho, Gingerbread, Chinpi, Ephedra, Nantenjitsu, Japanese apricot, Onji, Bellflower, Shazenshi, Chazenso, and Stone.
  • One type selected from these medicinal ingredients may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the content of the medicinal ingredient may be 0.001% by mass or more and 10,000% by mass or less based on the mass of the hyaluronic acid derivative, although it depends on the structure of the medicinal component. It is preferably 0.1% by mass or more and 1000% by mass or less, more preferably 1.0% by mass or more and 100.0% by mass or less, and preferably 1.5% by mass or more and 50.0% by mass or less. It is more preferably 3.0% by mass or more and 30.0% by mass or less, most preferably 5.0% by mass or more and 20.0% by mass or less.
  • the content of the medicinal ingredient is more preferably 0.1% by mass or more and 100.0% by mass or less, based on the mass of the hyaluronic acid derivative, and 0.1% by mass. % or more and 50.0 mass% or less, further preferably 0.1 mass% or more and 30.0 mass% or less, and 0.5 mass% or more and 30.0 mass% or less. More preferably, the content is 1.0% by mass or more and 30.0% by mass or less, even more preferably 1.0% by mass or more and 25.0% by mass, and 1.0% by mass or more and 20.0% by mass. It is more preferably not more than 1.0% by mass and not more than 15.0% by mass, even more preferably not less than 1.0% by mass and not more than 10.0% by mass.
  • the content of the medicinal ingredient is preferably 0.0001 parts by mass or more and 1.00 parts by mass or less, and 0.001 parts by mass, based on 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • the amount is more preferably 0.100 parts by mass or more, and even more preferably 0.002 parts by mass or more and 0.500 parts by mass or less.
  • the content of the medicinal ingredient is preferably 0.001 parts by mass or more and 1.00 parts by mass or less, and 0.001 parts by mass or less, based on 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • Parts by weight or more and 0.500 parts by weight or less more preferably 0.001 parts by weight or more and 0.200 parts by weight or less, and 0.005 parts by weight or more and 0.100 parts by weight or less. More preferred.
  • the content of the medicinal ingredient is at least the lower limit above, it is possible to activate immune cells more effectively, and on the other hand, when the content is below the upper limit above, the medicinal ingredient is encapsulated in the hyaluronic acid derivative component.
  • the structure can be made more stable.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment when the pharmaceutical composition of this embodiment is a vaccine composition, it can further contain an adjuvant in addition to the above-mentioned medicinal ingredients and the above-mentioned hyaluronic acid derivative. Thereby, immunity can be induced more effectively.
  • the immunity induced may be either humoral immunity or cell-mediated immunity. That is, the pharmaceutical composition of this embodiment contains the hyaluronic acid derivative, an antigen (preferably a cancer antigen or an infectious disease-derived antigen) as the medicinal ingredient, and further contains an adjuvant. It is preferable that there be.
  • humoral immunity refers to an immune mechanism mainly consisting of B cells and antibodies.
  • Cytokines produced by helper T cells (Th2 cells) stimulate B cells, which differentiate into plasma cells and produce large amounts of antibodies, which circulate in body fluids and spread throughout the body. .
  • some of the stimulated B cells become memory B cells that remember information about the antigen, and upon reinfection, the response is faster and has a higher affinity for the antigen than the initial response.
  • Antibodies can be produced in large quantities.
  • cell-mediated immunity refers to an immune mechanism in which cells are the main effectors in eliminating foreign substances such as pathogens themselves, virus-infected cells, and cancer cells. This is an elimination mechanism by immunocompetent cells themselves such as macrophages, cytotoxic T cells (CTL, killer T cells), and natural killer cells (NK cells).
  • the adjuvant is not particularly limited as long as it is commonly used in vaccines, but examples include aluminum salts, squalene, and ligands for innate immune receptors.
  • ligand here refers to a substance that specifically binds to a receptor, and in particular, substances that specifically bind to a receptor and exhibit various physiological effects can be used. Such substances are also called "agonists.”
  • TLRs toll-like receptors
  • RLRs RIG-I-like receptors
  • NLRs NOD-like receptors
  • CLR C-type lectin receptor
  • TLR ligand for example, at least one TLR selected from the group consisting of TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-6, TLR-7, TLR-8, and TLR-9. What is necessary is to select the one that interacts with the appropriate one.
  • TLR-2 ligands examples include Pam3CSK4 and the like.
  • TLR-3 ligands examples include polyICLC, polyinosine:polycytidylic acid (polyI:C), and the like.
  • TLR-4 ligands examples include R-type lipopolysaccharide, S-type lipopolysaccharide, Paclitaxel, lipid A, monophosphoryl lipid A, and the like.
  • TLR-5 ligands examples include flagellin and the like.
  • TLR-2 and TLR-6 ligands examples include MALP-2.
  • TLR-7 and TLR-8 ligands examples include resiquimod (R848), imiquimod (imiquimod, R837), gardiquimod, loxoribine, and the like.
  • TLR-9 ligands examples include CpG oligodeoxynucleotides and the like.
  • anionic compounds are preferred, and CpG oligodeoxynucleotides are more preferred, since they can further improve the antigen presentation function.
  • CpG oligodeoxynucleotides examples include CpG-ODN 1826, CpG-K3, and the like.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be administered alone or together with a pharmacologically acceptable carrier according to conventional methods.
  • a pharmacologically acceptable carrier for example, the above-mentioned hyaluronic acid derivative and the above-mentioned medicinal ingredient, and if necessary an adjuvant, water or other physiologically acceptable liquid (for example, physiological saline).
  • physiologically acceptable liquid for example, physiological saline.
  • Physiologically acceptable buffers, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. which may be mixed with water, aqueous ethanol, phosphate buffered saline (PBS), etc. Freeze-drying aids and the like may also be included.
  • buffer examples include Tris, sodium phosphate, potassium phosphate, histidine, or citric acid.
  • preservative examples include benzalkonium chloride, methyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, sorbic acid, alkylpolyaminoethylglycine, and the like.
  • stabilizer examples include sodium edetate hydrate, polyvinylpyrrolidone (povidone), and polysorbate 80.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may be formulated.
  • the formulation can be in solid, semi-solid or liquid form.
  • examples include powder, granules, pills, pellets, tablets, capsules, and the like.
  • the solid is preferably a freeze-dried powder.
  • examples include forms such as gels.
  • examples include a suspension in which the powder is diluted or suspended in water or a buffer such as phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be manufactured by appropriately mixing the hyaluronic acid derivative and the medicinal ingredient, but it is preferably manufactured by the method shown below.
  • the method for producing a pharmaceutical composition of the present embodiment is a method for producing a pharmaceutical composition containing a hyaluronic acid derivative and a medicinal ingredient, and includes the following steps. a preparation step of dissolving the medicinal ingredient in an organic solvent or organic solvent-containing water to prepare an oil phase containing the medicinal ingredient; and A mixing step of mixing the oil phase and the aqueous phase containing the hyaluronic acid derivative at a volume ratio of 20:100 to 0.01:100.
  • hyaluronic acid derivatives have been found to have problems such as the interaction between steryl groups being inhibited by the oil phase, causing the particles to disintegrate or some to aggregate. It was difficult to maintain the particle size of the acid derivative. Therefore, pharmaceutical compositions have contained only relatively small-sized hyaluronic acid derivatives in which particles are broken down, or complexes of hyaluronic acid derivatives and medicinal ingredients containing partially aggregated particles. Furthermore, since the pharmaceutical composition was manufactured using a dialysis method, it was difficult to control the weight ratio of the hyaluronic acid derivative to the medicinal ingredient. Furthermore, a concentration step was necessary to achieve the target concentration of medicinal ingredients.
  • the method for producing a pharmaceutical composition of the present embodiment does not use the dialysis method, but involves mixing the above composition so that the mixing ratio of the oil phase and the aqueous phase is within the above numerical range.
  • This makes it possible to form a complex with the medicinal ingredient while maintaining the particle size distribution of the hyaluronic acid derivative before manufacturing the pharmaceutical composition, and it is also possible to control the weight ratio of the hyaluronic acid derivative to the medicinal ingredient to a constant level. .
  • a medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex can be obtained with a stable structure.
  • a pharmaceutical composition can be obtained that has excellent delivery properties to immune cells in lymph nodes and an ability to activate these immune cells.
  • the medicinal ingredient is dissolved in an organic solvent or organic solvent-containing water to prepare an oil phase containing the medicinal ingredient.
  • a poorly water-soluble medicinal ingredient can be preferably used.
  • the medicinal ingredient those exemplified in the above “medicinal ingredient” can be used.
  • organic solvents for dissolving medicinal ingredients include known ones that are generally used in the production of pharmaceutical compositions, such as dimethyl sulfoxide (DMSO), methanol, ethanol, tetrahydrofuran, acetone, and acetonitrile. , ethyl acetate, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 1-pentanol, methyl ethyl ketone, heptane, isobutyl acetate, isopropyl acetate, methyl acetate, methyl isobutyl ketone, dimethylformamide and the like.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • methanol ethanol
  • tetrahydrofuran acetone
  • acetonitrile examples include known ones that are generally used in the production of pharmaceutical compositions, such as dimethyl sulfoxide (DMSO), methanol, ethanol, tetrahydrofuran, ace
  • the hyaluronic acid derivative is used after being dissolved or dispersed in water or the like in advance to a desired concentration.
  • the pH of the aqueous phase containing the hyaluronic acid derivative is preferably 6.00 or more, and preferably 6.00 or more and 11.00 or less.
  • the pH is equal to or higher than the above lower limit, it is possible to more effectively suppress the aggregation of the hyaluronic acid derivative and form a complex with the medicinal ingredient, thereby forming a medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex. A more stable structure is obtained.
  • the pH is below the above upper limit, the drug can be complexed while maintaining the dispersion stability of the hyaluronic acid derivative.
  • a complex can be formed not only through hydrophobic interactions but also through interactions such as electrostatic interactions and hydrogen bonds.
  • the mixing ratio of the oil phase and the aqueous phase is 20:100 to 0.01:100 by volume, preferably 10:100 to 0.05:100, more preferably 5:100 to The ratio is 0.1:100, more preferably 2.5:100 to 0.5:100.
  • a sufficient amount of the medicinal ingredient can be encapsulated in the hyaluronic acid derivative to form a medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex, and hyaluronic acid It is possible to effectively suppress disassociation of acid derivative particles due to inhibition of hydrophobic interaction between steryl groups by the oil phase. However, this is not limited to only hydrophobic interactions, but also the collapse of interactions that can contribute to structural stability, such as electrostatic interactions and hydrogen bonds, can also be effectively suppressed.
  • the concentration of the medicinal ingredient dissolved in the oil phase is not particularly limited, but it is preferably 0.1 parts by mass or more and 50 parts by mass or less, and 0.2 parts by mass or more, based on 100 parts by mass of the oil phase. It is more preferably 25 parts by mass or less, and even more preferably 0.5 parts by mass or more and 10 parts by mass or less.
  • the concentration of the hyaluronic acid derivative dissolved in the aqueous phase is not particularly limited, but the concentration of the hyaluronic acid derivative is preferably 0.01 parts by mass or more and 10 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of the aqueous phase. , more preferably 0.1 parts by mass or more and 10 parts by mass or less, and still more preferably 0.5 parts by mass or more and 5 parts by mass or less.
  • the temperature is preferably 20°C or more and 65°C or less, and preferably 23°C or more and 55°C or less, from the viewpoint of slightly exposing the hydrophobic part of the medicinal ingredient and making it easier to interact with the hyaluronic acid derivative. More preferably, the temperature is 25°C or higher and even more preferably 40°C or lower. Alternatively, the optimum temperature can be appropriately set depending on the structure and properties of the medicinal ingredient.
  • the method is not particularly limited, but for example, an oil phase containing a medicinal ingredient is added to the aqueous phase containing the hyaluronic acid derivative in any ratio, or an oil phase containing a medicinal ingredient is added to the aqueous phase containing the hyaluronic acid derivative.
  • the aqueous phase containing the above-mentioned hyaluronic acid derivative is added into the mixture at an arbitrary ratio, so that the final mixing ratio of the oil phase and the aqueous phase is 20:100 to 0.01:100 by volume.
  • the particle size of the hyaluronic acid derivative can be maintained through the mixing process.
  • the mixing step is not limited to a batch method, and the oil phase and the aqueous phase may be mixed by a flow method (continuous method).
  • the particle size of the hyaluronic acid derivative can be maintained by setting the mixing ratio of the oil phase and the water phase to a volume ratio of 20:100 to 0.01:100.
  • the material and shape of the reactor in the flow method are not particularly limited as long as the material and shape are selected as applicable to the production method of the present invention, but for example, the inner diameter of the piping through which the oil phase and the aqueous phase each pass, They may have different diameters.
  • the material and shape of the tube in the flow method may be selected from materials and shapes that are applicable to the method for producing the pharmaceutical composition of this embodiment, and are not particularly limited.
  • Teflon (registered trademark) tube stainless steel, etc.
  • Examples include tubes, glass tubes, plastic tubes, etc.
  • the time is not particularly limited, but can be, for example, 30 minutes or more and 90 hours or less, or 1 hour or more and 80 hours or less.
  • the organic solvent in which the medicinal ingredient is dissolved is subjected to tangential flow filtration (TFF), centrifugal filtration, ultrafiltration/diafiltration (UFDF).
  • TFF tangential flow filtration
  • UFDF ultrafiltration/diafiltration
  • a sterilization step may be performed in which the solution containing the obtained medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex is sterilized to obtain a sterile preparation.
  • methods for sterilizing the preparation include filtration sterilization using a sterilization filter, gas sterilization, ⁇ -ray sterilization, and electron beam sterilization. Filtration sterilization using a sterilizing filter is most preferred.
  • a drying step may be performed in which the obtained solution containing the medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex is dried to obtain a dried product.
  • Examples of the drying method include the same methods as those exemplified in the above "method for producing hyaluronic acid derivatives.”
  • Subjects to which the pharmaceutical composition of the present embodiment is administered include animals classified as mammals including humans (monkeys, marmosets, mice, rats, cows, horses, cats, dogs, pigs, sheep, goats, rabbits, etc.). It will be done.
  • Administration routes include, for example, intrathecal injection, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, as well as intranasal, transbronchial, transpulmonary, intramuscular, percutaneous, or oral administration. This can be done by methods known to those skilled in the art. Among these, when the pharmaceutical composition of this embodiment is a vaccine composition, subcutaneous injection or intramuscular injection is preferred.
  • the dosage can be appropriately selected taking into consideration the type of recipient (including age, gender, etc.); For example, for humans (assuming a body weight of 60 kg), the amount of the medicinal ingredient (preferably antigen) per dose can be 0.01 ⁇ g or more and 5 mg or less, and 0.1 ⁇ g or more and 500 ⁇ g or less, The amount can be 1 ⁇ g or more and 100 ⁇ g or less.
  • the amount of the medicinal ingredient (preferably antigen) per dose can be 0.01 ⁇ g or more and 5 mg or less, and 0.1 ⁇ g or more and 500 ⁇ g or less, The amount can be 1 ⁇ g or more and 100 ⁇ g or less.
  • the frequency of administration may be a single administration of the above-mentioned dose, or the above-mentioned dose may be administered once every 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, or every six months.
  • the administration may be multiple times, such as twice or more.
  • the drug may be administered to two or more locations in one administration.
  • the present invention provides prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of cancer, infectious diseases, and immune diseases, which comprises administering an effective amount of the above pharmaceutical composition to a patient or affected animal.
  • diseases selected from the group consisting of cancer, infectious diseases, and immune diseases
  • infectious diseases include those exemplified under "antigens derived from infectious diseases” under “antigens” above.
  • effective amount as used herein includes an amount effective for prevention or treatment, that is, an amount suitable for preventing or treating the onset of the above-mentioned diseases.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of cancer, infectious diseases, and immune diseases, comprising the above-mentioned medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex.
  • a composition comprising:
  • the present invention provides the use of the above medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex for manufacturing a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition is preferably an infectious disease vaccine, a cancer vaccine, or a pharmaceutical composition for immune diseases.
  • the present invention further provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a composition comprising a hyaluronic acid derivative and an antigen, and a lymphocyte expressing an immune receptor for the antigen.
  • a pharmaceutical composition containing lymphocytes expressing immunoreceptors for antigens is provided for use in combination administration with a composition containing an early hyaluronic acid derivative and an antigen.
  • a pharmaceutical composition characterized in that it consists of a combination of a composition containing a hyaluronic acid derivative and an antigen, and antigen-specific lymphocytes can also be in the form of a kit.
  • the pharmaceutical composition can be, for example, a cancer treatment kit comprising a composition containing a hyaluronic acid derivative and an antigen, and antigen-specific lymphocytes.
  • the composition containing the hyaluronic acid derivative and the antigen is preferably administered before administering the antigen-specific lymphocytes.
  • the unit of administration is one unit or one infusion of antigen-specific lymphocytes after one administration of a composition containing a hyaluronic acid derivative and an antigen.
  • the composition containing the hyaluronic acid derivative and the antigen is administered at least once after two units have been administered.
  • the interval between the first administration and the second administration of the composition containing a hyaluronic acid derivative and an antigen is, for example, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more. , 6 or more days, 7 or more days, 8 or more days, 9 or more days, 10 or more days, 11 or more days, 12 or more days, 13 or more days, or 14 or more days.
  • the interval may be, for example, 28 days or less, 24 days or less, 21 days or less, 17 days or less, 14 days or less, 13 days or less, 12 days or less, 11 days or less, 10 days or less, 9 days or less, 8 days or less. , 7 days or less, 6 days or less, 5 days or less, 4 days or less, 3 days or less, or 2 days or less.
  • a composition containing a hyaluronic acid derivative and an antigen of the present invention may be administered in combination with one or more antibodies used in cancer treatment.
  • the antibody is, for example, one or more antibodies that inhibit immunosuppressive signals by a tumor or activate co-stimulatory signals of immune cells, preferably antibodies that inhibit immunosuppressive signals by a tumor or co-stimulate immune cells. It is an antibody that activates the signal. Specifically, it is one or more antibodies selected from the group consisting of anti-CTLA4 antibody, anti-PD1 antibody, anti-PDL1 antibody, anti-OX40, and anti-4-1BB antibody.
  • the dosage of the composition containing the hyaluronic acid derivative and antigen when administered in combination is, for example, 0.01 to 100 mg/time, preferably 0.1 to 50 mg/time, more preferably 0.1 to 20 mg/time.
  • the dosage of the antibody is, for example, 0.01 to 200 mg/kg body weight, preferably 0.1 to 100 mg/kg body weight, and more preferably 1 to 40 mg/kg body weight.
  • the antibody may be administered at the same timing as the composition containing the hyaluronic acid derivative and the antigen (including when the antibody is included in the formulation) or at a different timing.
  • a composition containing a hyaluronic acid derivative and an antigen may be administered in combination with both the adjuvant and antibody described above.
  • the dosage of the composition containing the hyaluronic acid derivative and the antigen is, for example, 0.01 to 100 mg/time, preferably 0.1 to 50 mg/time, more preferably 0.1 to 20 mg/time.
  • the dosage of the adjuvant is, for example, 0.01 to 100 mg/kg body weight, preferably 0.1 to 50 mg/kg body weight, more preferably 0.1 to 10 mg/kg body weight
  • the dosage of the antibody is, for example, 0. .01 to 200 mg/kg body weight, preferably 0.1 to 100 mg/kg body weight, more preferably 1 to 40 mg/kg body weight.
  • the adjuvant and antibody may be administered at the same time as the composition containing the hyaluronic acid derivative and antigen (including when the adjuvant is included in the formulation) or at different times. If administered at different times, it is preferred that the vaccine formulation, adjuvant, and antibody are all administered within, eg, 1 minute to 24 hours, preferably 1 minute to 5 hours.
  • the present invention provides a composition for improving, promoting, or enhancing the uptake of a medicinal ingredient into immune cells, the composition comprising the above medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex.
  • the present invention provides a composition for improving, promoting, or enhancing the activity of immune cells, the composition comprising the above-mentioned medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex.
  • the present invention provides a composition for improving, promoting, maintaining or enhancing the expression of costimulatory molecules (particularly CD80 and CD86) of DCs (particularly cDC1), the composition comprising: Compositions are provided that include acid derivative complexes.
  • the present invention improves, promotes, or enhances the uptake of a medicinal ingredient into immune cells in vivo or in vitro, comprising administering a composition comprising the above medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex.
  • a composition comprising the above medicinal ingredient-hyaluronic acid derivative complex.
  • the present invention provides a method for improving, promoting, or enhancing the activity of immune cells in vivo or in vitro, comprising administering a composition comprising the above-described pharmaceutical ingredient-hyaluronic acid derivative complex.
  • the present invention provides costimulatory molecules (particularly CD80 and CD86) of DCs (particularly cDC1) in vivo or in vitro, comprising administering a composition comprising the above-mentioned pharmaceutical ingredient-hyaluronic acid derivative complex. ) provides a method for improving, promoting, maintaining or enhancing the expression of
  • TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) was prepared according to step 2-1 shown below, followed by step 2-2.
  • TBA salt of hyaluronic acid HA-TBA
  • Process 3 An anhydrous DMSO solution (10 mg/mL) of HA-TBA prepared in "2. (2) Step 2-2" was prepared. Thereafter, Chol hydrochloride was added in such a manner that the molar ratio of Chol hydrochloride to the disaccharide repeating unit (HA unit) present in the HA-TBA synthesized in "1. Step 1" was 44/100. Next, the amount of 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) added to the HA unit was 48/100 in molar ratio. It was stirred overnight at room temperature (about 25°C).
  • DMT-MM 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride
  • the reaction solution was prepared using a Spectrapore 7 dialysis membrane (manufactured by Spectrum Laboratories, molecular weight cutoff (MWCO): 3,500) in the order of 0.3M ammonia acetate/DMSO solution, 0.15M NaCl aqueous solution, and ultrapure water. Dialysis was performed using The obtained dialysate was freeze-dried to obtain the target product (HA-C 6 -Chol) as a white solid.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • the cholesterol introduction rate in the obtained white solid was calculated by the following method.
  • the measurement was carried out at 85° C., and a 1 H-NMR spectrum of a white solid was obtained.
  • a lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C 6 -Chol-44%) was dissolved in water for injection at 1 mg/mL and measured by gel permeation chromatography under the conditions shown below.
  • Figure 3A is the resulting chromatogram.
  • Example 1-1 The hyaluronic acid derivative obtained in Synthesis Example 1-1 was fractionated as follows. Lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C 6 -Chol-44%) was dissolved in water for injection at 5 mg/mL and transferred to a dialysis cassette (Flotalizer G2, MWCO: 300,000, Ieda Boeki Co., Ltd.). , dialysis was performed 9 times against 10 mM phosphate buffer pH 7.4. The hyaluronic acid derivative of the obtained dialysis fluid was measured by gel permeation chromatography. Figure 4A is the resulting chromatogram.
  • Example 21 and 22 show the hyaluronic acid derivative obtained in Example 1-1 and the standard substance polyacrylic acid, in order to explain the method of calculating the area ratio A1/A2 and the distance ratio Da/Db, which will be described later. It is a diagram showing overlapping chromatograms of .
  • the filtrate was concentrated to a desired concentration using an ultraconcentrator (Vivaspin 20, MWCO: 10,000, Sartorius).
  • Example 1-2 The hyaluronic acid derivative obtained in Synthesis Example 1-2 was fractionated using the same procedure as in Example 1-1.
  • the hyaluronic acid derivative of the obtained dialysis fluid was measured by gel permeation chromatography.
  • Figure 4B is the resulting chromatogram.
  • Example 1-3 The hyaluronic acid derivative obtained in Synthesis Example 1-3 was fractionated by the same procedure as in Example 1-1.
  • the hyaluronic acid derivative of the obtained dialysis fluid was measured by gel permeation chromatography.
  • Figure 4C is the resulting chromatogram.
  • hyaluronic acid derivative obtained in Synthesis Example 1-1 was fractionated as follows. Lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C 6 -Chol-44%) was dissolved in water for injection at 10 mg/mL and made into 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) with 100 mM phosphate buffer. diluted as follows. Thereafter, it was filtered using an ultrafilter (Vivaspin (registered trademark) 20, MWCO: 300,000, Sartorius), and the hyaluronic acid derivative of the obtained filtrate was measured by gel permeation chromatography. Figure 5A is the resulting chromatogram. The filtrate was concentrated to a desired concentration using an ultraconcentrator (Vivaspin 20, MWCO: 10,000, Sartorius).
  • the area ratio A1/A2 and the distance ratio Da/Db were calculated from the gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative obtained in Example 1-1 and polyacrylic acid as a standard substance.
  • the standard substance polyacrylic acid (50 kDa) was manufactured by Polymer Standards Service-USA, ORDER No. PSS-Paa50k (sodium polyacrylate) was used.
  • the standard substance polyacrylic acid (150 kDa) was manufactured by Polymer Standards Service-USA, ORDER No. PSS-Paa150k (sodium polyacrylate) was used.
  • Standard substance polyacrylic acid powder was dissolved in water for injection to a concentration of 2 mg/mL. All polyacrylic acids that are standard substances described hereinafter were manufactured by Polymer Standards Service-USA (sodium polyacrylate).
  • areas A1 and A2 were calculated from the gel permeation chromatogram shown in FIG. 21, and the area ratio A1/A2 was calculated.
  • the distances Da and Db were calculated from the gel permeation chromatogram shown in FIG. 22, and the distance ratio Da/Db was calculated.
  • the elution time at point R1 was 5.74 minutes
  • the elution time at point S1 was 7.68 minutes.
  • Bb the intersection of the baseline and a perpendicular line drawn from the maximum refractive index intensity point Kb on the chromatogram of 50 kDa polyacrylic acid, which is a standard substance, to the baseline was defined as Bb.
  • the elution time at the maximum refractive index intensity point Kb is as described above.
  • the hyaluronic acid derivatives obtained in Synthesis Examples 1-1 to 1-3, Examples 1-2 to 1-3, and Comparative Examples 1-1 to 1-4 were obtained in the same manner as the hyaluronic acid derivatives obtained in Example 1-1.
  • the area ratio A1/A2 and the distance ratio Da/Db were calculated from the gel permeation chromatograms of each hyaluronic acid derivative and the standard substance polyacrylic acid.
  • the calculated area ratio A1/A2 and distance ratio Da/Db are shown in Table 1 below.
  • Table 1 the distance ratio Da/Db of cholesteryl-modified pullulan (CHP) of Comparative Example 3 could not be calculated because the RI value was small.
  • Example 2-1 The hyaluronic acid derivative obtained in Example 1-1 was prepared by diluting it to a concentration of 5 mg/mL with 10 mM phosphate buffer pH 7.4. Meanwhile, in another container, a fluorescently labeled peptide was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 50 mg/mL.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the above hyaluronic acid derivative aqueous solution and the DMSO solution of the fluorescently labeled peptide are mixed at a volume ratio of 100:1 at room temperature (about 25°C), and the fluorescently labeled peptide is mixed at room temperature (about 25°C) for 24 hours.
  • a composition containing a hyaluronic acid derivative complex was obtained.
  • solid purified sucrose manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385
  • product number 198-18385 was added to the composition containing the fluorescently labeled peptide-hyaluronic acid derivative complex at 10% by mass of sucrose based on the total mass of sucrose. and stirred at room temperature (approximately 25°C) for 1 hour or more.
  • the peptide was diluted with 10mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% sucrose to a concentration of approximately 0.3mg/mL, and 0.2 ⁇ m PES (polyether Sulfone) (manufactured by Pall, Acrodisc syringe filter, 25 mm ⁇ ) was used to sterilize and filtrate to obtain a pharmaceutical composition containing a fluorescently labeled peptide-hyaluronic acid derivative complex.
  • the content of the fluorescently labeled peptide was 0.0317 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • Example 2-2 Using the hyaluronic acid derivative obtained in Example 1-2, a pharmaceutical composition containing a fluorescently labeled peptide-hyaluronic acid derivative complex was obtained by the same procedure as in Example 2-1. The content of the fluorescently labeled peptide was 0.0478 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • the content of the fluorescently labeled peptide was 0.0478 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • Example 2-3 Using the hyaluronic acid derivative obtained in Example 1-3, a pharmaceutical composition containing a fluorescently labeled peptide-hyaluronic acid derivative complex was obtained by the same procedure as in Example 2-1.
  • the content of the fluorescently labeled peptide was 0.0303 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • Comparative example 2-1 The hyaluronic acid derivative obtained in Comparative Example 1-1 was prepared by diluting it to a concentration of 5 mg/mL with 10 mM phosphate buffer pH 7.4. On the other hand, in another container, the fluorescently labeled peptide was dissolved in DMSO to a concentration of 50 mg/mL.
  • the above hyaluronic acid derivative aqueous solution and the dimethyl sulfoxide solution of the fluorescently labeled peptide are mixed at a volume ratio of 100:1 at room temperature (about 25°C), and the mixture is stirred at room temperature (about 25°C) for 24 hours to obtain the fluorescent label.
  • a composition containing a peptide-hyaluronic acid derivative complex was obtained.
  • solid purified sucrose manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385
  • product number 198-18385 solid purified sucrose
  • the mixture was stirred at room temperature (approximately 25° C.) for more than 1 hour.
  • the peptide was diluted with 10mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% sucrose to a concentration of 0.3mg/mL, and 0.2 ⁇ m PES (polyether sulfone) was added.
  • the above hyaluronic acid derivative aqueous solution and the dimethyl sulfoxide solution of the fluorescently labeled peptide are mixed at a volume ratio of 100:1 at room temperature (about 25°C), and the mixture is stirred at room temperature (about 25°C) for 24 hours to obtain the fluorescent label.
  • a composition containing a peptide-hyaluronic acid derivative complex was obtained.
  • solid purified sucrose manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385
  • product number 198-18385 solid purified sucrose
  • the mixture was stirred at room temperature (approximately 25° C.) for more than 1 hour.
  • the peptide was diluted with 25mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% by mass sucrose to a concentration of 0.3mg/mL, and 0.2 ⁇ m PES (polyether sulfone) was added.
  • a pharmaceutical composition containing a fluorescently labeled peptide-hyaluronic acid derivative complex (manufactured by Pall, Acrodisc syringe filter, 25 mm ⁇ ) to obtain a pharmaceutical composition containing a fluorescently labeled peptide-hyaluronic acid derivative complex.
  • the content of the fluorescently labeled peptide was 0.0316 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • solid purified sucrose manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385
  • product number 198-18385 solid purified sucrose
  • the mixture was stirred at room temperature (approximately 25° C.) for more than 1 hour.
  • the peptide was diluted with 30mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% sucrose to a concentration of 0.33mg/mL, and 0.2 ⁇ m PES (polyether sulfone) was added.
  • Fluorescently labeled peptide-hyaluronic acid derivative complexes of Examples 2-1 to 2-3 and Comparative Examples 2-1 to 2-3, 3, 4-1, and 4-2 were determined by high-performance liquid chromatography measurement under the following conditions. It was confirmed that the fluorescently labeled peptide was complexed and solubilized with the hyaluronic acid derivative in the pharmaceutical compositions containing the following, and the concentration of the fluorescently labeled peptide in each pharmaceutical composition was provided.
  • HPLC device JASCO HPLC-EXTREMA
  • Flow rate 2 mL/min
  • Injection volume 30 ⁇ L
  • Gradient program shown in Table 2 below. In Table 2, "%" means "v/v%”.
  • Test Example 1-1 Peptide uptake into myeloid cells in lymph nodes and activation analysis
  • Materials Adjuvant CpG oligo DNA1668 (purchased from Ajinomoto Biopharma Service Gene Design)
  • the fluorescently labeled antibodies used for evaluation are as follows. All were purchased from Biolegend. Brilliant Violet 421 labeled anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8); Brilliant Violet 510 labeled anti-mouse CD11c antibody (clone N418); APC-Cy7 labeled anti-mouse XCR1 antibody (clone ZET); APC-labeled anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1); APC-labeled anti-mouse CD86 antibody (clone GL-1); Purified CD16/32 antibody (clone 93).
  • Example 2-1 Comparative Example 2-1 and Comparative Example 4-1 were mixed with 10% by mass sucrose and 10mM phosphorus so that the fluorescent (fluorescein) labeled peptide concentration was about 0.3mg/mL.
  • the diluted solution of each pharmaceutical composition was administered to the right dorsal region of BALB/c mice.
  • the peptides were subcutaneously administered at 60 ⁇ g each.
  • 50 ⁇ g of CpG oligo DNA 1668 (Ajinomoto BioPharma Service Gene Design) dissolved in PBS was administered as an adjuvant.
  • the regional lymph node (right inguinal lymph node) at the administration site was collected, and after grinding the lymph node using a slide glass, the cells were suspended in RPMI1640 medium. At this time, cells from two animals per group were pooled. After centrifugation (400 ⁇ g, 5 minutes, 4° C.), the supernatant was removed, washed twice with RPMI1640 medium, and then suspended in RPMI1640 medium containing 10 v/v% FBS. The number of cells was measured using a hemocytometer, and the cell concentration was adjusted to 1.2 x 10 7 cells/mL.
  • 50 ⁇ L of the cell suspension was added to a 96-well V-bottom microplate (Nunc, Thermo Fisher Scientific) at 6 ⁇ 10 5 cells per well.
  • the cell suspension was centrifuged (2000 rpm, 2 minutes, 4°C), the supernatant was removed, and the cell suspension was washed twice with 200 ⁇ L of staining buffer (PBS containing 0.5 v/v% FBS) and suspended. . After centrifugation and removal of the supernatant, 50 ⁇ L of a solution containing anti-mouse CD16/CD32 antibody diluted 50 times was added, and the mixture was left standing in the dark at 4° C. for 10 minutes.
  • the cells were further washed twice with 200 ⁇ L of staining buffer.
  • the usage concentration recommended by each antibody manufacturer add 50 ⁇ L of a solution containing the first, second, and third antibodies in the combinations listed in Table 3 above, mix, and store in the dark at 4°C. It was left standing for 15 minutes.
  • the cells were further washed twice with 200 ⁇ L of staining buffer.
  • the suspension was resuspended in 200 ⁇ L of staining buffer and transferred to a round bottom polystyrene tube (BD Bioscience). Cells were analyzed using a flow cytometer FACS Canto II (BD Biosciences) and the attached analysis software (FACSDiva).
  • DC Dendritic cells
  • Mph macrophages
  • cDC1 standard type 1 DC
  • FITC fluorescein
  • CD80 and CD86 The expression of costimulatory molecules CD80 and CD86 was analyzed for FITC-positive cells in each cell type.
  • the FACS analysis method is shown in FIGS. 7A to 7F. The analysis results are shown in Tables 4-1 to 4-3.
  • peptide + CD80 + DC means “peptide-incorporated dendritic cells (DC) that express CD80
  • peptide + CD86 + DC means “peptide-incorporated dendritic cells (DC) that express CD86.
  • Peptide+DC means "peptide-incorporating dendritic cells (DC).
  • Example 1-2 Using the pharmaceutical compositions of Example 2-2, Comparative Example 2-2, and Comparative Example 4-2, 10 mass% sucrose and 10 mM phosphorus were added so that the fluorescent (fluorescein) labeled peptide concentration was about 0.2 mg/mL.
  • the test was carried out in the same manner as in Test Example 1-1, except that the peptides were diluted with an acid buffer pH 7.4 and administered subcutaneously at 40 ⁇ g each.
  • the analysis results are shown in Tables 5-1 to 5-3.
  • Comparative Example 2-2 Similarly to Test Example 1-1, in the mouse group to which the pharmaceutical composition of Example 2-2 was administered, the pharmaceutical compositions of Comparative Example 2-2 and Comparative Example 4-2 (hyaluronic acid derivative before fractionation) were administered. Higher expression of costimulatory molecules (CD80 and CD86) in macrophages and DCs (especially cDC1) was confirmed than in the mouse group. Comparative Example 4-2 had relatively high expression of CD80 and CD86 on cDC1, but low expression of CD80 and CD86 on macrophages, and was inferior to the pharmaceutical composition of Example 2-2.
  • Test Example 1-1 was carried out in the same manner as in Test Example 1-1, except that the pharmaceutical composition of Example 2-3 was used and 40 ⁇ g of each peptide was administered subcutaneously. The analysis results are shown in Tables 6-1 to 6-3.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment it is possible to stably and efficiently deliver medicinal ingredients such as peptides to immune cells (especially cDC1 and macrophages), and furthermore, to deliver the medicinal ingredients such as peptides to immune cells. It is presumed that the uptake of the drug can be improved, promoted, or enhanced, and at the same time, the activity of immune cells (particularly, the expression of costimulatory molecules CD80 and CD86 in cDC1) is improved, promoted, maintained, or enhanced.
  • gp100RP2RP1_6Y peptide manufactured by Biologica and having the following amino acid sequence was used.
  • the lyophilized hyaluronic acid derivative obtained in Synthesis Example 1-1 was weighed, water for injection was added to the concentration shown in Table 7 below, and the mixture was stirred overnight to ensure sufficient dissolution. I let it happen. Meanwhile, in another container, the peptide was dissolved in DMSO to a concentration of 50 mg/mL. After confirming the dissolution, a 1 mol/L sodium hydroxide aqueous solution (manufactured by Fuji Film Wako Co., Ltd.) was added to the hyaluronic acid derivative aqueous solution according to Table 7 below.
  • the hyaluronic acid derivative aqueous solution and the peptide dimethyl sulfoxide solution are mixed in the volume ratio shown in Table 7 below, and the mixture is stirred at room temperature (approximately 25°C) for 24 hours to form the peptide-hyaluron.
  • a composition containing an acid derivative complex was obtained.
  • the pH of the solution was also measured.
  • solid purified sucrose (manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385) was added to the composition containing the peptide-hyaluronic acid derivative complex so that the amount of sucrose was 10% by mass based on the total mass of the sucrose and the composition containing the peptide-hyaluronic acid derivative complex.
  • the mixture was added and stirred at room temperature (approximately 25° C.) for 1 hour or more.
  • the peptide was diluted with 25mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% by mass sucrose so that the theoretical concentration of the peptide was 0.3mg/mL, and 0.2 ⁇ m PES (polyether sulfone) (manufactured by Pall, Acrodisc) was added.
  • the mixture was sterilized and filtered using a syringe filter (25 mm ⁇ ) to obtain a pharmaceutical composition containing a peptide-hyaluronic acid derivative complex.
  • the peptide concentration in the pharmaceutical composition containing the peptide-hyaluronic acid derivative complex was determined in the same manner as in Example 2-1 above, and the results are shown in Table 7 above.
  • a composition containing a peptide-hyaluronic acid derivative complex produced by the method shown below was measured by dynamic light scattering (DLS) under the following conditions to obtain the z-average particle diameter. The results are shown in Table 7 above.
  • DLS device Otsuka Electronics
  • ELSZ2000 Cell Micro particle size cell Temperature: 25°C Concentration of peptide-hyaluronic acid derivative complex: 4.95mg/mL
  • the particle size of the complex of a medicinal ingredient such as a peptide and a hyaluronic acid derivative can be maintained within a certain range. It has become clear that the stability of the complex in solution can be improved by keeping the temperature within a certain range.
  • peptide As the peptide, a peptide manufactured by Biologica and having the following amino acid sequence was used.
  • the above hyaluronic acid derivative aqueous solution and peptide DMSO solution are mixed in a volume ratio according to Table 8 below, and stirred at room temperature (approximately 25°C) for 24 hours to form peptide-hyaluronic acid.
  • a composition containing a derivative complex was obtained.
  • the pH of the solution was also measured.
  • solid purified sucrose manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385 is added to the composition containing the peptide-hyaluronic acid derivative complex and the total mass of sucrose to give a concentration of 10% by mass of sucrose.
  • Test Examples 3-1 to 3-6 The mixing ratio for maintaining an appropriate particle size distribution was verified in the same manner as in Test Examples 2-1 to 2-8, except that ethanol was used instead of DMSO for the oil phase. Measurement was performed by gel permeation chromatography, and the area ratio A1/A2 was calculated in the same manner as in Example 1-1, and the results are shown in Table 10 below. The obtained gel permeation chromatogram is shown in FIG.
  • hyaluronic acid powder with a weight average molecular weight Mw (absolute molecular weight) of 980 kDa was dissolved in water for injection to a concentration of 10 mg/mL, and then diluted with water for injection to a concentration of 5 mg/mL. I got it. Meanwhile, in another container, the antigen peptide was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 50 mg/mL to obtain a DMSO solution of the antigen peptide.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the antigen peptide a peptide manufactured by Biologica and having the following amino acid sequence was used.
  • the above hyaluronic acid aqueous solution and antigen peptide DMSO solution are mixed at a volume ratio of 100:1, and stirred at room temperature (approximately 25°C) for 24 hours to form antigen peptide-hyaluronic acid.
  • the resulting mixed solution was cloudy, as confirmed by the photograph labeled "hyaluronic acid (980 kDa)" in FIG. 11, indicating that the antigenic peptide was not dissolved and a large amount of peptide was not encapsulated. was suggested.
  • solid purified sucrose manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385
  • product number 198-18385 was added to the sucrose in an amount of 10% by mass based on the total mass of the composition containing the peptide-hyaluronic acid complex and sucrose. and stirred at room temperature for over 1 hour.
  • the peptide was diluted with 10mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% sucrose to a concentration of approximately 0.30mg/mL, and 0.2 ⁇ m PES (polyether Sulfone) (manufactured by Pall, Acrodisc syringe filter, 25 mm ⁇ ) to obtain a pharmaceutical composition containing a peptide-hyaluronic acid complex.
  • the peptide content in the pharmaceutical composition was determined by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 2-1. As a result, the peptide content in the pharmaceutical composition was below the detection limit.
  • Hyaluronic acid powder having a weight average molecular weight Mw (absolute molecular weight) of 650 kDa was dissolved in water for injection to a concentration of 10 mg/mL, and diluted with water for injection to a concentration of 5 mg/mL to obtain an aqueous hyaluronic acid solution.
  • the antigen peptide was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 50 mg/mL to obtain a DMSO solution of the antigen peptide.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • As the antigen peptide a peptide manufactured by Biologica and having the following amino acid sequence was used.
  • the above hyaluronic acid aqueous solution and antigen peptide DMSO solution are mixed at a volume ratio of 100:1, and stirred at room temperature (approximately 25°C) for 24 hours to form antigen peptide-hyaluronic acid.
  • the resulting mixed solution was cloudy, as confirmed by the photograph labeled "hyaluronic acid (640 kDa)" in Figure 11, suggesting that the antigen peptide was not dissolved and the peptide was not encapsulated. It was done.
  • solid purified sucrose manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385
  • product number 198-18385 was added to the sucrose in an amount of 10% by mass based on the total mass of the composition containing the peptide-hyaluronic acid complex and sucrose. and stirred at room temperature (approximately 25°C) for 1 hour or more.
  • the peptide was diluted with 10mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% sucrose to a concentration of approximately 0.30mg/mL, and 0.2 ⁇ m PES (polyether Sulfone) (manufactured by Pall, Acrodisc syringe filter, 25 mm ⁇ ) to obtain a pharmaceutical composition containing a peptide-hyaluronic acid complex.
  • the content of the peptide in the pharmaceutical composition was determined by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 2-1. As a result, the peptide content in the pharmaceutical composition was below the detection limit.
  • Example 6-1 A hyaluronic acid derivative was synthesized in the same manner as in Synthesis Example 1-1. It was used as is without fractionation. The obtained freeze-dried product of the hyaluronic acid derivative was weighed, water for injection was added to give a concentration of 5 mg/mL, and the mixture was stirred overnight at room temperature to fully dissolve. The above hyaluronic acid derivative aqueous solution was diluted five times with water for injection to a concentration of 1 mg/mL, and then measured by gel permeation chromatography. FIG. 13 is the gel permeation chromatogram obtained. In addition, the particle size distribution of the hyaluronic acid derivative was evaluated in the same manner as in Example 1-1, and the results are shown in Table 11 below.
  • Example 6-1 A hyaluronic acid derivative synthesized in the same manner as in Synthesis Example 1-1 was fractionated in the same manner as in Example 1-1 to obtain a hyaluronic acid derivative.
  • the hyaluronic acid derivative of the obtained dialysis fluid was measured by gel permeation chromatography.
  • FIG. 14 is the gel permeation chromatogram obtained.
  • the particle size distribution of the hyaluronic acid derivative was evaluated in the same manner as in Example 1-1, and the results are shown in Table 11 below.
  • Example 6-1-1 The concentration of the hyaluronic acid derivative in the hyaluronic acid derivative aqueous solution obtained in Example 6-1 was calculated from the area value of the hyaluronic acid derivative of known concentration to be 4.28 mg/mL.
  • PBS pH 7.4 (product manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) so that the concentration of ovalbumin (OVA, low endotoxin product manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is 5 mg/mL. No. 166-23555) to obtain an OVA/PBS solution.
  • sucrose was added as a solid to make a 10% sucrose isotonic solution, and the mixture was thoroughly stirred at room temperature until a clear solution was obtained.
  • the OVA concentration in the formulation was 0.15 mg/mL
  • the hyaluronic acid derivative concentration was 3.0 mg/mL
  • a 10% sucrose solution containing 10 mM PB (pH 7.4) was used.
  • the mixture was incubated at 75° C. for 1 hour to obtain a composition containing an OVA-hyaluronic acid derivative complex.
  • Example 6-1-1 The composition containing the OVA-hyaluronic acid derivative complex prepared in Example 6-1-1 and Comparative Example 6-1-1 was administered to BALB/c mice on day 0 so that OVA was 20 ⁇ g. , was administered subcutaneously on the 7th day, and serum was collected on the 10th day.
  • OVA-hyaluronic acid derivative complex 50 ⁇ g of CpG1826 (manufacturer: INVIVOGEN, product code: tlrl-1826-1), which is an adjuvant, was administered subcutaneously.
  • the antibody titer against OVA was determined using an ELISA kit (Chondrex, Mouse Anti-OVA IgG Antibody Assay Kit, Mouse Anti-OVA IgG1 Antibody Assay Kit, Mouse Anti-OVA IgG2). Measurement using Antibody Assay Kit) according to the attached protocol. did.
  • the dilution factors of serum were 10, 50, 250, 1250, 6250, and 31250.
  • FIG. 15 shows the IgG antibody titer (OD) calculated using the Mouse Anti-OVA IgG Antibody Assay Kit.
  • Figure 16 shows the IgG1 antibody titer (OD) calculated using the Mouse Anti-OVA IgG1 Antibody Assay Kit.
  • nti-OVA FIG. 17 shows the IgG2a antibody titer (OD) calculated using the IgG2a Antibody Assay Kit.
  • Each antibody titer at a dilution factor of 10 is shown in FIG. 18A (IgG antibody titer), FIG. 18B (IgG1 antibody titer), and FIG. 18C (IgG2a antibody titer).
  • the composition containing the OVA-hyaluronic acid derivative complex of Example 6-1-1 is more effective.
  • a higher antibody titer was obtained than the composition containing the OVA-hyaluronic acid derivative complex of Comparative Example 6-1-1.
  • Example 6-1-1 induces not only humoral immunity but also cell-mediated immunity, and is expected to induce a stronger immune response as an infectious disease vaccine.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment not only peptides but also the medicinal components of protein antigens can be protected from heating conditions, and they can be applied to immune cells (especially cDC1 and macrophages) while maintaining an appropriate three-dimensional structure. It can be delivered stably and efficiently, and furthermore, it can improve, promote, or enhance the uptake of the medicinal ingredient into immune cells, and at the same time, it can improve the activity of immune cells (in particular, the costimulatory molecules CD80 and CD86 in cDC1). It is presumed that the expression of these substances was improved, promoted, maintained, or enhanced. It is inferred that the antigen directed against the epitope was produced by promoting the activation of helper T cells and further promoting the activation and expansion of B cells.
  • hyaluronic acid derivatives of the first to third embodiments it is possible to provide vaccines against foreign antigens (mainly vaccines for infectious diseases) that are superior to those using conventional hyaluronic acid derivatives. At the same time, it is considered possible to provide pharmaceuticals containing excellent therapeutic antibody-inducing antigens.
  • a long-chain peptide antigen-loaded hyaluronic acid derivative cancer vaccine was prepared by conjugating a long-chain peptide antigen containing the CD8 epitope of mutant ERK2 antigen (mERK2) with various hyaluronic acid derivatives, and its therapeutic efficacy was investigated.
  • mice Female BALB/c mice (CD90.2 positive) aged 6 to 8 weeks were purchased from Japan SLC. Both mice were bred at the Mie University Advanced Science Research Support Center Animal Experiment Facility. The animal experiment protocol was approved by the Ethics Committee of Mie University School of Medicine.
  • a long-chain peptide antigen-loaded hyaluronic acid derivative that is a complex of the long-chain peptide antigen and various hyaluronic acid derivatives is sometimes referred to as a "long-chain peptide antigen-loaded HA nanogel cancer vaccine" or "HA nanogel cancer vaccine.” .
  • Example 7-1 The hyaluronic acid derivative obtained in Comparative Example 6-1 was fractionated as follows. A lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C 6 -Chol-41.3%) was dissolved in water for injection at 5 mg/mL, and a dialysis cassette (Flotalizer G2, MWCO: 300,000, Ieda Boeki Co., Ltd.) was added. The cells were transferred to a 10-mM phosphate buffer solution (pH 7.4), and the hyaluronic acid derivatives in the resulting dialyzed solution were measured by gel permeation chromatography. Figure 19 is the gel permeation chromatogram obtained. The particle size distribution of the hyaluronic acid derivative was evaluated in the same manner as in Example 1-1. The results are shown in Table 12.
  • Example 7-1-1 The concentration of the hyaluronic acid derivative in the aqueous hyaluronic acid derivative solution obtained in Example 7-1 was calculated from the area value of the hyaluronic acid derivative at a known concentration to be 3.8 mg/mL. Meanwhile, in another container, the antigen peptide was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 50 mg/mL to obtain a DMSO solution of the antigen peptide. As the antigen peptide, a peptide manufactured by Biologica and having the following amino acid sequence was used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the above hyaluronic acid derivative aqueous solution and DMSO solution of antigen peptide were mixed at a ratio of 10 parts by mass of peptide to 100 parts by mass of hyaluronic acid derivative, and the mixture was incubated at room temperature (approximately 25°C) for 2 hours.
  • a clear solution was obtained, as confirmed by the photograph labeled "hyaluronic acid derivative" in FIG. 11. This confirmed that the peptide was indeed encapsulated.
  • solid purified sucrose (manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only, product number 198-18385) is converted to 10% by mass of sucrose based on the total mass of the composition containing the peptide-hyaluronic acid derivative complex and sucrose. and stirred at room temperature (approximately 25° C.) for more than 1 hour.
  • the peptide was diluted with 10mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% sucrose to a concentration of approximately 0.30mg/mL, and 0.2 ⁇ m PES (polyether).
  • the mixture was sterilized and filtered through a peptide-hyaluronic acid derivative complex (Acrodisc syringe filter, 25 mm ⁇ , manufactured by Pall) to obtain a pharmaceutical composition containing a peptide-hyaluronic acid derivative complex.
  • the peptide content in the pharmaceutical composition was determined by high performance liquid chromatography in the same manner as in Example 2-1. As a result, the content of the peptide was 0.383 parts by mass based on 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide-hyaluronic acid derivative complex was diluted with a 10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% by mass sucrose to give a peptide concentration of 250 ⁇ g/mL to obtain a pharmaceutical composition for administration.
  • Ta The pharmaceutical composition containing the above peptide-hyaluronic acid derivative complex was measured by gel permeation chromatography using the method described in Example 1-1 under the measurement conditions shown below.
  • FIG. 20 is the gel permeation chromatogram obtained.
  • Example 7-1-1 The peptide used in Example 7-1-1 was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 50 mg/mL. The peptide was diluted with 10mM phosphate buffer pH 7.4 containing 10% by mass sucrose to a concentration of 0.25mg/mL.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Tumor Growth Test Mouse fibrosarcoma CMS5a cell line was cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS using T75 culture flasks (Corning). The cultured cells were detached using PBS containing 0.5% trypsin and suspended in RPMI1640 medium containing 10% FBS. The suspension was centrifuged (400 ⁇ g, 5 minutes, 4° C.) and the supernatant was removed. Thereafter, the cells were washed twice with RPMI1640 medium and suspended in RPMI1640 medium at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells/100 ⁇ L. A dose of 100 ⁇ L/individual was subcutaneously implanted in the right anterior dorsal region of BALB/c mice (5 mice per group).
  • the long-chain peptide antigen-loaded HA nanogel cancer vaccine When administering the long-chain peptide antigen-loaded HA nanogel cancer vaccine, 50 ⁇ g of the long-chain peptide antigen-loaded HA nanogel cancer vaccine was dissolved in PBS 7, 10, 13, and 16 days after tumor transplantation. It was subcutaneously administered to the right back of the mouse together with 50 ⁇ g of CpG oligo DNA (Ajinomoto BioPharma Service Gene Design). Thereafter, the tumor area was measured over time. Also when administering the long chain peptide antigen of Comparative Example 7-1-1, 50 ⁇ g of the long chain peptide was added to 50 ⁇ g of CpG oligo DNA dissolved in PBS 7 days, 10 days, 13 days, and 16 days after tumor transplantation. (Ajinomoto BioPharma Service Gene Design) was subcutaneously administered to the right hind region of mice. Thereafter, the tumor area was measured over time.
  • Figure 23 shows the tumor area values (average values) over time.
  • the aggregate size that is superior in the activation of costimulatory molecules is larger.
  • the medicinal components of peptides and proteins can be stably and efficiently delivered to immune cells (in particular, cDC1 and macrophages), and furthermore, the medicinal components can be delivered to immune cells. It is presumed that the uptake can be improved, promoted, or enhanced, and at the same time, the activity of immune cells (in particular, the expression of costimulatory molecules CD80 and CD86 in cDC1) is improved, promoted, maintained, or enhanced.
  • a calibration curve was created using polyacrylic acid as a standard substance, and Synthesis Examples 1-1 to 1-3, Examples 1-1 to 1-3, 6-1, 7-1, and Comparative Examples 1-1 to The molecular weight of each hyaluronic acid derivative obtained in 1-3 and 6-1 was calculated based on polyacrylic acid.
  • the polyacrylic acid standard substances include PSS-Paa2k (2kDa), 4k (4kDa), 8k (8kDa), 18k (18kDa), 40k (40kDa), 150k (150kDa) (manufactured by PSS Polymer Standard service GmbH (polyacrylic Sodium chloride)) was used. The results are shown in Table 14.
  • the fractionation method is not limited to the fractionation method using a dialysis membrane.
  • the hyaluronic acid derivative obtained in Synthesis Example 1-1 is dissolved in water for injection at 20 mg/mL, and fractionated by gel permeation chromatography under the conditions shown below. For example, aliquots are taken every 0.1 minute.
  • the hyaluronic acid derivative of the present embodiment it is possible to provide a hyaluronic acid derivative that is excellent in delivery to immune cells in lymph nodes and activation ability of the immune cells when formulated with a medicinal ingredient.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment contains the hyaluronic acid derivative and has excellent delivery properties to immune cells in lymph nodes and ability to activate the immune cells.
  • the method for producing a pharmaceutical composition of the present embodiment uses the hyaluronic acid derivative, and a pharmaceutical composition having excellent delivery properties to immune cells in lymph nodes and ability to activate the immune cells can be obtained.

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Abstract

本発明のステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、以下に示す方法により算出される面積A1とA2の比A1/A2が0.90以上である。　標準物質である50kDaのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点(Kb)からベースライン(B)へ引いた垂線と前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムとの交点(Ub)から前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムの終点までの曲線と、前記屈折率強度極大点(Kb)から前記ベースライン(B)へ引いた垂線と、ベースライン(B)で囲まれた面積値をA2とし、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムの始点から前記交点(Ub)までの曲線と、前記屈折率強度極大点(Kb)から前記ベースライン(B)へ引いた垂線と、ベースライン(B)で囲まれた面積値をA1とする。

Description

ヒアルロン酸誘導体、医薬組成物、及び医薬組成物の製造方法
　本発明は、ヒアルロン酸誘導体、医薬組成物、及び医薬組成物の製造方法に関する。
　本願は、２０２２年５月３１日に、日本に出願された特願２０２２－０８８９９５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、タンパク質やペプチド、核酸を活性成分とする医薬品であるバイオ医薬品が実用化されており、その数は年々増え続けている。バイオ医薬品は、従来の低分子医薬では満たすことができなかった未充足医療ニーズを満たすことができる。しかしながら、消化管乃至粘膜等からは吸収されにくい上、体内では不安定で血中半減期が短いという課題がある。そのため、バイオ医薬品は注射による頻回投与が必要であり、患者と医療関係者いずれにとっても負担が大きい。そこで、薬理活性を損なうことなくバイオ医薬品をカプセル化して生体内で徐々に有効成分を放出することができる薬物基材（徐放性ドラッグデリバリーシステム基材）が求められている。
　このような背景から、特許文献１では、安全性に優れたヒアルロン酸誘導体からなる徐放性ドラッグデリバリーシステム基材が提案されている。このヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に会合し、薬物、特にバイオ医薬品を、その生物活性を維持したまま効率よく封入することができ、生理食塩濃度下で凝集し（或いは、生理食塩濃度下でも分散し）、なおかつ血中滞留性が良好である。このヒアルロン酸誘導体は、特にバイオ医薬品を有効成分として使用する場合に、薬理活性を維持したまま多くの薬物を効率よく封入できる担体、及び血中滞留性に優れた血中徐放キャリア並びにターゲティングキャリアとして用いることができ、薬物を持続的に徐放できる局所（例えば、皮下等）徐放キャリアにもなり得るとされている。
　また、上記ヒアルロン酸誘導体を担体として用いたがんワクチンも報告されている（例えば、特許文献２等参照）。
国際公開第２０１０／０５３１４０号 国際公開第２０２０／１５８７７１号
　しかしながら、特許文献２等で使用されているヒアルロン酸誘導体は、粒子サイズ分布がブロードであり、且つ、不均一なものであり、ヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布とリンパ節内の免疫細胞への送達性や該免疫細胞の活性化能の関連性については具体的に検討がなされておらず、改良の余地がある。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、薬効成分と製剤化した際のリンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能に優れるヒアルロン酸誘導体、及び前記ヒアルロン酸誘導体を用いた医薬組成物及びその製造方法を提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）　ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、
　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、以下に示す方法により算出される面積Ａ１とＡ２の比Ａ１／Ａ２が０．９０以上である、ヒアルロン酸誘導体。
　（ｉ）標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムとの交点をＵｂとする；
　（ｉｉ）前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムで前記Ｕｂから終点までの曲線と、前記屈折率強度極大点Ｋｂから前記ベースラインＢへ引いた垂線と、ベースラインで囲まれた面積値をＡ２とし、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムで始点から前記Ｕｂまでの曲線と、前記屈折率強度極大点Ｋｂから前記ベースラインＢへ引いた垂線と、ベースラインで囲まれた面積値をＡ１とする。
（２）　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、以下に示す方法により算出される距離ＤａとＤｂの比Ｄａ／Ｄｂが０．００超１．２０以下である、（１）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（ｉ）標準物質である１５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ垂線を引き、ベースラインとの交点をＢａ、前記屈折率強度極大点Ｋａと前記Ｂａの間の長さをＬａとする；
　（ｉｉ）屈折率強度がＬａ／２０となるクロマトグラム上の２点のうち、溶出時間が早いほうを点Ｒ１とし、溶出時間が遅いほうを点Ｓ１とする；
　（ｉｖ）前記点Ｒ１と前記点Ｓ１を結んだ直線Ｄ１と、前記屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ引いた垂線との交点をＴａとし、前記屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と前記直線Ｄ１との交点をＴｂとする；
　（ｖ）前記点Ｒ１と前記Ｔａの距離をＤａ、前記Ｔａと前記Ｔｂの距離をＤｂとする。
（３）　前記面積Ａ１とＡ２の比Ａ１／Ａ２が１．７０以上である、（１）又は（２）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（４）　ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、
　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから算出される、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸の屈折率強度極大点における保持時間Ｐｒに対する、ヒアルロン酸誘導体の屈折率強度極大点における保持時間Ｐｔの比Ｐｔ／Ｐｒが０．５以上１．０未満である、ヒアルロン酸誘導体。
（５）　ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、
　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、各分子量が２ｋＤａ、４ｋＤａ、８ｋＤａ、１８ｋＤａ、４０ｋＤａ、および１５０ｋＤａであるポリアクリル酸を標準物質として作成した検量線に基づき算出されるヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量が１１万以上５０万未満である、ヒアルロン酸誘導体。
（６）　前記ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有する、（１）～（５）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｘ１は、以下の式：
　－ＮＲｂ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｓ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
（７）　前記ステリル基がコレステリル基である、（１）～（６）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体。
（８）　前記ヒアルロン酸誘導体を構成する二糖の繰り返し単位に対する、ステリル基の導入率が、３０％以上６０％以下である、（１）～（７）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体。
（９）　前記ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）が４，０００以上１，０００，０００以下である、（１）～（８）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体。
（１０）　前記ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）が５０００以上２５，０００以下である、（９）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（１１）　（１）～（１０）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体と、薬効成分と、を含有する、医薬組成物。
（１２）　がん、感染症、及び免疫疾患からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防又は治療用である、（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）　前記薬効成分として、がん抗原、感染症由来抗原、及び免疫疾患における自己抗原からなる群から選択される少なくとも一つを含み、且つ、アジュバントを更に含む、（１１）または（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）　前記薬効成分として、がん抗原又は感染症由来抗原を含み、且つ、アジュバントを更に含む、（１１）～（１３）のいずれか一つに記載の医薬組成物。
（１５）　（１）～（１０）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体と、薬効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、
　前記薬効成分を有機溶媒又は有機溶媒含有水に溶解して、前記薬効成分を含有する油相を調製する調製工程と、
　前記油相と前記ヒアルロン酸誘導体を含有する水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００となるように混合する混合工程と、
を含む、医薬組成物の製造方法。
（１６）　前記ヒアルロン酸誘導体を含有する水相のｐＨが６．００以上１１．００以下である、（１５）に記載の医薬組成物の製造方法。
　上記態様のヒアルロン酸誘導体によれば、薬効成分と製剤化した際のリンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能に優れるヒアルロン酸誘導体を提供することができる。上記態様の医薬組成物は、前記ヒアルロン酸誘導体を含み、リンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能に優れる。上記態様の医薬組成物の製造方法は、前記ヒアルロン酸誘導体を用いており、リンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能に優れる医薬組成物が得られる。
本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムの一例である。 本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムの一例である。 合成例１－１におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 合成例１－２におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 合成例１－３におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例１－１におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例１－２におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例１－３におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 比較例１－１におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 比較例１－２におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 比較例１－３におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 比較例１－４におけるコレステリル修飾プルラン（ＣＨＰ）のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例１－１におけるヒアルロン酸誘導体及び実施例２－１における医薬組成物中のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例１－２におけるヒアルロン酸誘導体及び実施例２－２における医薬組成物中のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例１－３におけるヒアルロン酸誘導体及び実施例２－３における医薬組成物中のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 試験例１－１におけるペプチド取り込み樹状細胞（ＤＣ）に対するＣＤ８０を発現するペプチド取り込みＤＣの割合（％）を算出した際のＦＡＣＳ解析の一例を示すグラフである。 試験例１－１におけるペプチド取り込みＤＣに対するＣＤ８６を発現するペプチド取り込みＤＣの割合（％）を算出した際のＦＡＣＳ解析の一例を示すグラフである。 試験例１－１におけるペプチド取り込み標準型１型樹状細胞（ｃＤＣ１）に対するＣＤ８０を発現するペプチド取り込みｃＤＣ１の割合（％）を算出した際のＦＡＣＳ解析の一例を示すグラフである。 試験例１－１におけるペプチド取り込みｃＤＣ１に対するＣＤ８６を発現するペプチド取り込みｃＤＣ１の割合（％）を算出した際のＦＡＣＳ解析の一例を示すグラフである。 試験例１－１におけるペプチド取り込みマクロファージ細胞（Ｍｐｈ）に対するＣＤ８０を発現するペプチド取り込みＭｐｈの割合（％）を算出した際のＦＡＣＳ解析の一例を示すグラフである。 試験例１－１におけるペプチド取り込みＭｐｈに対するＣＤ８６を発現するペプチド取り込みＭｐｈの割合（％）を算出した際のＦＡＣＳ解析の一例を示すグラフである。 試験例２－１～２－８におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 試験例３－１～３－６におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 比較例５－１におけるヒアルロン酸のゲル浸透クロマトグラムである。 比較例５－１及び５－２における抗原ペプチド－ヒアルロン酸複合体の調製を試みた時の混合液の写真と、実施例７－１－１における抗原ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を調製した時の溶液の写真である。 比較例５－２におけるヒアルロン酸のゲル浸透クロマトグラムである。 比較例６－１におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例６－１におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例６－１－１および比較例６－１－１におけるＩｇＧ抗体価（ＯＤ値）を示すグラフである。 実施例６－１－１および比較例６－１－１におけるＩｇＧ１抗体価（ＯＤ値）を示すグラフである。 実施例６－１－１および比較例６－１－１におけるＩｇＧ２ａ抗体価（ＯＤ値）を示すグラフである。 実施例６－１－１および比較例６－１－１における希釈倍率１０（力価１０－１）である時のＩｇＧ抗体価（ＯＤ値）を示すグラフである。 実施例６－１－１および比較例６－１－１における希釈倍率１０（力価１０－１）である時のＩｇＧ１抗体価（ＯＤ値）を示すグラフである。 実施例６－１－１および比較例６－１－１における希釈倍率１０（力価１０－１）である時のＩｇＧ２ａ抗体価（ＯＤ値）を示すグラフである。 実施例７－１におけるヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例７－１－１における抗原ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 実施例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムである。 試験例６における経時的な腫瘍面積値（平均値）を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
　以下、本明細書において使用される用語を説明する。
　本明細書において使用される「Ｃ１－２０アルキル」という用語は、炭素数１以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等の「Ｃ１－４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、２－エチルブチル等が含まれる。Ｃ１－２０アルキルには、炭素数が１以上１２以下のＣ１－１２アルキル、炭素数が１以上６以下のＣ１－６アルキル基も含まれる。
　本明細書において使用される「Ｃ１－６アルキルカルボニル」という用語は、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ－プロピルカルボニル、ｉｓｏ－プロピルカルボニル、ｎ－ブチルカルボニル、ｓｅｃ－ブチルカルボニル、ｉｓｏ－ブチルカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル等の「Ｃ１－４アルキルカルボニル」が含まれる。
　本明細書において使用される「アミノＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてアミノ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のアミノＣ２－１２アルキルも含まれる。
　本明細書において使用される「ヒドロキシＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてヒドロキシ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のヒドロキシＣ２－１２アルキルも含まれる。
　本明細書において使用される「Ｃ２－３０アルキレン」という用語は、炭素数２以上３０以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン等を含み、炭素数が２以上２０以下のＣ２－２０アルキレン、炭素数が２以上８以下のＣ２－８アルキレン、基「－（ＣＨ２）ｎ－」（ここで、ｎは２以上３０以下であり、２以上２０以下が好ましく、２以上１５以下がより好ましい。）を含む。
　本明細書において使用される「Ｃ１－５アルキレン」という用語は、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン等を含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－８アルケニレン」とは、炭素数２以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル、オクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイル等を含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体及びそれらの混合物も含まれる。
≪ヒアルロン酸誘導体≫
　本発明の第１の実施形態のヒアルロン酸誘導体は、ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、
　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められる図１に示すクロマトグラムから、以下に示す方法により算出される面積Ａ１とＡ２の比Ａ１／Ａ２が０．９０以上である。
　（ｉ）標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムとの交点をＵｂ、前記屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線とベースラインとの交点をＢｂとする；
　（ｉｉ）前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムで前記Ｕｂから終点まで曲線と、前記屈折率強度極大点Ｋｂから前記ベースラインＢへ引いた垂線と、ベースラインで囲まれた面積値をＡ２とし、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムで始点から前記Ｕｂまでの曲線と、前記屈折率強度極大点Ｋｂから前記ベースラインＢへ引いた垂線と、ベースラインで囲まれた面積値をＡ１とする。
　さらに、本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められる図２に示すクロマトグラムから、以下に示す方法により算出される距離ＤａとＤｂの比Ｄａ／Ｄｂが０．００超１．２０以下であることが好ましい。
　（ｉ）標準物質である１５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ垂線を引き、ベースラインとの交点をＢａ、前記屈折率強度極大点Ｋａと前記Ｂａの間の長さをＬａとする；
　（ｉｉ）屈折率強度がＬａ／２０となるクロマトグラム上の２点のうち、溶出時間が早いほうを点Ｒ１とし、溶出時間が遅いほうを点Ｓ１とする；
　（ｉｉｉ）標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線とベースラインとの交点をＢｂとする；
　（ｉｖ）前記点Ｒ１と前記点Ｓ１を結んだ直線Ｄ１と、前記屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ引いた垂線との交点をＴａとし、前記屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と前記直線Ｄ１との交点をＴｂとする；
　（ｖ）前記点Ｒ１と前記Ｔａの距離をＤａ、前記Ｔａと前記Ｔｂの距離をＤｂとする。
　（ｉｉ）において、屈折率強度がＬａ／２０となるクロマトグラム上の点が３点以上ある場合、始点に最も近い交点をＲ１、終点に最も近い交点をＳ１とする。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、従来のヒアルロン酸誘導体とは異なり、粒子サイズ分布において、特定の粒子サイズのヒアルロン酸誘導体を比較的多く含み、粒子サイズ分布がシャープに制御されたものである。発明者らは、この粒子サイズ分布が制御されたヒアルロン酸誘導体を薬効成分と製剤化することで、後述する実施例に示すように、粒子サイズ分布が制御されていないヒアルロン酸誘導体や、従来から担体として使用されているコレステロール化プルラン（ＣＨＰ）と比較して、リンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能が顕著に優れることを見出して、本発明を完成するに至った。
　ここでいう免疫細胞としては、好ましくはミエロイド系細胞であり、より好ましくは、マクロファージ又は樹状細胞（ＤＣ）であり、さらに好ましくはＤＣであり、特に好ましくは標準型１型樹状細胞（ｃＤＣ１）である。
　マクロファージ及び樹状細胞は、いずれも抗原提示能を有する。樹状細胞は最も強力な抗原提示細胞であり、リンパ組織及び非リンパ組織におけるＴ細胞及びナチュラルキラー細胞の増殖と機能の調整を担当している。樹状細胞にはいくつかのサブタイプがあるが、ケモカイン受容体ＸＣＲ１を特異的に発現し、Ｃ型レクチンエンドサイトーシス受容体ＣＬＥＣ９Ａを選択的に発現するｃＤＣ１は、高いクロスプレゼンテーション能を有することから、抗原をＭＨＣクラスＩ分子に効率的に搭載する（参考文献１：Noubade R et al., “Beyond cDC1: Emerging Roles of DC Crosstalk in Cancer Immunity”, Front Immunol., Vol. 10, Article 1014, pp. 1-13. 2019.）。同時に共刺激分子を発現することにより、ウイルスや細菌に感染した細胞やがん細胞を攻撃するＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ））を活性化することが可能である。
　すなわち、マクロファージ又はＤＣ（好ましくはｃＤＣ１）への抗原送達性を高めることは、がんの予防又は治療、感染症の予防又は治療の効果を向上させることになる。
　また、マクロファージ及びＤＣは抗原をＭＨＣクラスＩＩ分子に搭載することができる。これはヘルパーＴ細胞を活性化し、Ｂ細胞による抗体産生を促進する。
　すなわち、マクロファージ又はＤＣ（好ましくはｃＤＣ１）への抗原送達性を高めることは、感染症の予防又は治療、免疫疾患の治療の効果を向上させることになる。
　また、免疫細胞の活性化能としては、上述したような細胞の活性を向上、促進、又は増強させる性質を意味し、中でも、ＤＣ（好ましくはｃＤＣ１）における共刺激分子の発現を向上、促進又は維持させる性質であることが好ましい。共刺激分子としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６等が挙げられる。これら共刺激分子の発現が向上、促進又は維持することで、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ））を顕著に誘導することができる。よって、本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、薬効成分と製剤化した際に、ＤＣ（好ましくはｃＤＣ１）におけるＣＤ８０及びＣＤ８６両方の発現を向上、促進又は維持できるものであることが好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、薬効成分と製剤化した際に、薬効成分と安定した会合状態を形成することができ、薬効成分を免疫細胞（好ましくはＤＣ、より好ましくはｃＤＣ１）に安定的且つ効率よく送達させることができ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができる。これにより、免疫細胞の活性を向上、促進、又は増強させているものと推察される。なお、上記メカニズムと異なるメカニズムで所望の効果が得られる場合であっても、技術的範囲に含まれる。
　すなわち、本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、免疫細胞への薬効成分の送達向上剤、送達促進剤、又は送達増強剤ということもできる。或いは、免疫細胞への薬効成分の取り込み向上剤、促進剤、又は増強剤ということもできる。
　また、本実施形態のヒアルロン酸誘導体と薬効成分とを含む、後述する医薬組成物は、免疫細胞の活性化用組成物、ＤＣ（好ましくはｃＤＣ１）における共刺激分子の発現向上用組成物、発現促進用組成物又は発現維持用組成物ということもできる。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定することができ、上記のとおり制御された粒子サイズ分布であることは、ゲル浸透クロマトグラムから以下に示す方法により算出される面積Ａ１とＡ２の比Ａ１／Ａ２で示すことができる。
　前記ゲル浸透クロマトグラフィー測定において標準物質として使用されるポリアクリル酸は、ポリアクリル酸ナトリウムであることが好ましく、具体的には、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製、ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＳＳ－Ｐａａシリーズ（ポリアクリル酸ナトリウム）であることがより好ましい。
　ゲル浸透クロマトグラフィーによるヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布の測定は、以下の方法で行うことができる。
　１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液、２ｍｇ／ｍＬのポリアクリル酸標準物質水溶液を調製し、以下に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行う。
（測定条件）
　装置：高速ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）装置
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ（示差屈折率検出器）
　温度：３０℃
　図１は、本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムの一例である。図１を参照しながら、面積Ａ１及びＡ２の算出方法について以下に詳細を説明する。
　（ｉ）図１には、本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムと、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のゲル浸透クロマトグラムが記載されている。まず、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムとの交点をＵｂ、前記屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線とベースラインＢとの交点をＢｂとする。ここで、測定開始時の屈折率強度をゼロとし、ここから水平に引いた線をベースラインとする。例えば、測定開始前に屈折率強度の増減が±０．５ｍＶの範囲内に収まるよう調整し、屈折率強度が５分間で０．５ｍＶ以下の増減に収まるように調整する。例えば、屈折率強度増加量がノイズ値の５倍相当量を３回上回った最初の点をクロマトグラムの「始点」とし、溶出時間０分とする。例えば、屈折率強度が最大極大屈折率強度の１０００分の１になった点をクロマトグラムの「終点」とし、屈折率強度が最大極大屈折率強度の１０００分の１に至らない場合は、「Ｔｌｉｍ」を「終点」とする。「Ｔｌｉｍ」は、２ｋＤａのポリアクリル酸を測定した際の極大屈折率強度を呈する溶出時間とする。
　本装置においては、０．００１６７分おきに屈折率強度を算出する。
　（ｉｉ）次に、ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムにおいて、交点Ｕｂから終点までの曲線と、屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線（交点Ｕｂから交点Ｂｂまでの直線）と、ベースラインＢで囲まれた面積値をＡ２とし、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムで始点から前記Ｕｂまでの曲線と、前記屈折率強度極大点Ｋｂから前記ベースラインＢへ引いた垂線（交点Ｕｂから交点Ｂｂまでの直線）と、ベースラインＢで囲まれた面積値をＡ１とする。
　ここで、各面積値はＧＰＣワークステーションＥｃｏＳＥＣ　Ｅｌｉｔｅ－ＷＳの解析アプリケーションを用いて算出される。
　各面積値を算出する際に、ゲル浸透クロマトグラフィーに使用した展開溶媒などに起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークは除く。
　図１に示す面積Ａ１とＡ２の比Ａ１／Ａ２が０．９０以上であり、１．００以上であることがより好ましく、１，１０以上であることがより好ましく、１．２０以上であることがより好ましく、１．３０以上であることがより好ましく、１．４０以上、１．５０以上であることがより好ましく、１．６０以上であることがさらに好ましく、１．７０以上であることが特に好ましい。面積Ａ１とＡ２の比Ａ１／Ａ２が上記下限値以上であることで、粒子サイズの大きいヒアルロン酸誘導体を比較的多く含むことができ、薬効成分と製剤化した際に、薬効成分と安定した会合状態を形成することができる。これにより、薬効成分を免疫細胞（好ましくはＤＣ、より好ましくはｃＤＣ１）に安定的且つ効率よく送達させることができ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができる。
　一方、Ａ１／Ａ２の上限値は、面積Ａ１の比率が面積Ａ２よりも高ければ高いほど好ましい。すなわち、図１では、ベースラインの左側（溶出時間が短くなる）ほど粒子サイズが大きく、右側（溶出時間が長くなる）ほど粒子サイズが小さくなることから、粒子サイズが大きいものの比率が、粒子サイズが小さいものよりも高ければ高いほど好ましい。よって、Ａ１／Ａ２の上限値は、特に限定されないが、例えば、７．０以下、６．０以下、または５．０以下であってよい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムの形状は、特に限定されないが、ヒアルロン酸誘導体の屈折率強度の極大点（ピークトップ）が２つ以上あってよい。特に限定されないが、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線の両側（左右）のそれぞれに、ヒアルロン酸誘導体の屈折率強度の極大点（ピークトップ）を１つ以上有していて良い。このとき、屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線の左側のヒアルロン酸誘導体の屈折率強度の極大点（ピークトップ）における屈折率強度が、屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線の右側のヒアルロン酸誘導体の屈折率強度の極大点（ピークトップ）における屈折率強度より大きくてもよい。また、右側の極大点（ピークトップ）における屈折率強度に対する、左側の極大点（ピークトップ）における屈折率強度は、特に限定されないが、１．０倍以上、２．０倍以上、３．０倍以上、５．０倍以上、または１０．０倍以上であってもよく、上限は大きくて良いが、例えば、１０００倍以下、１００倍以下、５０．０倍以下、２０．０倍以下、１０．０倍以下、２．０倍以下、または１．５倍以下であってよい。
　また、本実施形態のヒアルロン酸誘導体が上記のとおり制御された粒子サイズ分布であることは、以下に示す距離ＤａとＤｂの比Ｄａ／Ｄｂでも定義することができる。
　図２は、本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムの一例であり、図２に示すヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムと標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のゲル浸透クロマトグラムは図１と同一である。しかしながら、図２では、標準物質である１５０ｋＤａのポリアクリル酸のゲル浸透クロマトグラムが追記されており、各種交点等について定義されている点で上記図１とは異なる。図２を参照しながら、距離Ｄａ及びＤｂの算出方法について以下に詳細を説明する。
　（ｉ）まず、標準物質である１５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ垂線を引き、ベースラインとの交点をＢａ、前記屈折率強度極大点Ｋａと前記Ｂａの間の長さをＬａとする。
　（ｉｉ）次に、屈折率強度がＬａ／２０となるクロマトグラム上の２点のうち、溶出時間が早いほうを点Ｒ１とし、溶出時間が遅いほうを点Ｓ１とする。
　（ｉｉｉ）次に、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線とベースラインとの交点をＢｂとする。
　（ｉｖ）次に、前記点Ｒ１と前記点Ｓ１を結んだ直線Ｄ１と、前記屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ引いた垂線との交点をＴａとし、前記屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と前記直線Ｄ１との交点をＴｂとする。
　（ｖ）最後に、前記点Ｒ１と前記Ｔａの距離をＤａ、前記Ｔａと前記Ｔｂの距離をＤｂとする。
　図２に示す距離ＤａとＤｂの比Ｄａ／Ｄｂが０．００超１．２０以下であることが好ましく、０．１０以上１．００以下であることがより好ましく、０．２０以上、０．８以下がより好ましく、０．３０以上０．９５以下がさらに好ましく、０．４０以上、０．９４以下がよりさらに好ましく、０．５０以上０．９３以下が特に好ましい。距離ＤａとＤｂの比Ｄａ／Ｄｂが上記範囲内であることで、標準物質である１５０ｋＤａのポリアクリル酸よりも粒子サイズの大きいヒアルロン酸誘導体を比較的多く含むことができ、薬効成分と製剤化した際に、薬効成分と安定した会合状態を形成することができる。これにより、薬効成分を免疫細胞（好ましくはＤＣ、より好ましくはｃＤＣ１）に安定的且つ効率よく送達させることができ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができる。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムにおいて、横軸は溶出時間を、縦軸は示差屈折率計を用いて得られた屈折率強度を示すが、屈折率極大点はいくつあってもよい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムは、１～５つの極大点を有する粒子サイズ分布が好ましく、より好ましくは１～３つの極大点を有する粒子サイズ分布が好ましい。また、極小点はあってもなくてもよい。
　さらに、本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムにおいて、示差屈折率計を用いて得られた屈折率強度と溶出時間で表されるクロマトグラムが左右非対称であっても対称であってもよい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸誘導体中のステリル基が水中で自己会合し、単分子又は複数分子が会合することでナノサイズのハイドロゲルを形成するものである。
　ヒアルロン酸誘導体において、ステリル基は、ヒアルロン酸に対して直接的に結合していてもよく、リンカーを解して結合されていてもよい。
　ここでいう「リンカー」とは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカーを用いることができるが、ヒアルロン酸誘導体においては、ペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは２アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下）であり、特に好ましくは１５アミノ酸である。ヒアルロン酸誘導体に含まれるペプチドリンカーは、全て同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよく、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい。
［ステリル基］
　本明細書において使用される「ステリル基」という用語は、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロン等が挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等が挙げられ、中でも、コレステリル基（特に、コレスタ－５－エン－３β－イル基）が好ましい。
　ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）は特に限定はされないが、ヒアルロン酸誘導体１分子あたりのステリル基導入数を増やし、薬効成分との複合体を形成する観点、また、分子の絡み合いを高め、血中での滞留性を高める観点からは、分子量の比較的大きいヒアルロン酸誘導体が好ましい。このようなヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）としては、４０００（４ｋ）以上１，０００，０００（１，０００ｋ）以下が好ましく、５ｋ以上５００ｋ以下がより好ましく、６ｋ以上５００ｋ以下がさらに好ましく、７ｋ以上３００ｋ以下がよりさらに好ましく、７ｋ以上１００ｋ以下がよりさらに好ましく、７ｋ以上５０ｋ以下がよりさらに好ましく、７ｋ以上２５ｋ以下がさらにより好ましく、８ｋ以上１５ｋ以下が特に好ましい。あるいは、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）としては、５ｋ以上２５ｋ以下がより好ましい。ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）が上記下限値以上であることで、分子の絡み合いをより高め、血中での滞留性をより高めることができる。一方、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）が上記上限値以下であることで、粘度の上昇を抑制でき、より高濃度のヒアルロン酸誘導体を医薬組成物中に溶解させることができる。ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
　ここでいう、「ヒアルロン酸誘導体の分子量（絶対分子量）」は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量（絶対分子量）である。
　前記ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムにおいて、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸の屈折率強度極大点（ピークトップ）の保持時間Ｐｒ（溶出時間Ｂｂ）に対する、ヒアルロン酸誘導体の屈折率強度極大点（ピークトップ）の保持時間Ｐｔの比Ｐｔ／Ｐｒは特に限定はされないが、Ｐｔ／Ｐｒが０．５以上１．０未満であることが好ましく、０．７以上０．９５未満であることがより好ましく、０．７５以上０．９２未満であることがより更に好ましい。比Ｐｔ／Ｐｒが前記範囲内である場合に、粒子サイズの大きいヒアルロン酸誘導体を比較的多く含むことができ、薬効成分と製剤化した際に、薬効成分と安定した会合状態を形成することができる。これにより、薬効成分を免疫細胞（好ましくはＤＣ、より好ましくはｃＤＣ１）に安定的且つ効率よく送達させることができ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができる。
　なお、前記ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムにおいて、ヒアルロン酸誘導体の屈折率強度極大点（ピークトップ）が複数ある場合には、屈折率強度が最大となる屈折率強度極大点（ピークトップ）における溶出時間を、前記ヒアルロン酸誘導体の屈折率強度極大点（ピークトップ）の保持時間Ｐｔとして採用する。
　また、前記ゲル浸透クロマトグラフィー測定において標準物質として使用されるポリアクリル酸は、ポリアクリル酸ナトリウムであることが好ましく、具体的には、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製、ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＳＳ－Ｐａａシリーズ（ポリアクリル酸ナトリウム）であることがより好ましい。
　ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）は特に限定はされないが、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）が１１万以上であることが好ましく、１１万以上５０万未満がより好ましく、１３万以上３０万未満がよりさらに好ましく、１４万以上２５万未満が最も好ましい。ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）が前記範囲内となる場合には、粒子サイズの大きいヒアルロン酸誘導体を比較的多く含むことができ、薬効成分と製剤化した際に、薬効成分と安定した会合状態を形成することができる。これにより、薬効成分を免疫細胞（好ましくはＤＣ、より好ましくはｃＤＣ１）に安定的且つ効率よく送達させることができ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができる。
　一方、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）が前記上限値を超える場合、粘性が増大し、製剤として使用しにくい場合がある。
　前記ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）は、前記ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、各分子量が２ｋＤａ、４ｋＤａ、８ｋＤａ、１８ｋＤａ、４０ｋＤａ、および１５０ｋＤａであるポリアクリル酸（ＰＳＳ－Ｐａａ２ｋ（２ｋＤａ）、４ｋ（４ｋＤａ）、８ｋ（８ｋＤａ）、１８ｋ（１８ｋＤａ）、４０ｋ（４０ｋＤａ）、１５０ｋ（１５０ｋＤａ）（ＰＳＳ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｅｒｖｉｃｅ　ＧｍｂＨ社製、ポリアクリル酸ナトリウム）を標準物質として作成された検量線に基づき、下記式：Ａｔ３＋Ｂｔ２＋Ｃｔ＋Ｄに従い算出される。
　好ましいヒアルロン酸誘導体として具体的には、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉ）」と称する場合がある）を１以上有するヒアルロン酸誘導体等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｘ１は、以下の式：
　－ＮＲｂ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｓ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
　前記ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）として、下記一般式（Ｉａ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉａ）」と称する場合がある）を１以上含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｘは、－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒで表される疎水性基であり；
　Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択され；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、
　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
　ここで、ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）がそれぞれ２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
　ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）以外の位置において、修飾されていてもよく、例えば、ヒドロキシ基は－Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｏ（ホルミル）、－Ｏ（Ｃ１－６アルキルカルボニル）等に変換されていてもよく、カルボキシ基は、アミド又はエステルに変換されていてもよく、塩を形成していてもよい。
［繰り返し単位（Ｉ）］
　一般式（Ｉ）中の基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」は、以下の式：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ；及び
　－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ
（ここで、ｍｚは、２以上３０以下の整数であり、Ｒ８は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
で表される基からなる群より選択されることが好ましく、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；及び
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ
（ここで、ｍｚ、Ｒ、及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
からなる群より選択されることがより好ましい。
（Ｚ）
　一般式（Ｉ）において、Ｚは直接結合であることが好ましい。
　別の態様において、Ｚがペプチドリンカーである場合に、Ｘ１は－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒであることが好ましい。
　さらに、別の態様において、Ｚは、－ＮＨ－［ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＮＨ］ｎ－１－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯ－で表されるペプチドリンカーであってもよく、ここで、ｎは２以上３０以下の整数であり、Ｚａは、それぞれ独立に、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＯＨとして表されるα－アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシ基に結合し、Ｃ末端にて基－Ｎ（－Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としては、α－アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体等が挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα－アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚａとしては、例えば、－ＣＨ３、Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２ＮＣＯＣＨ２－等が挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２以上３０以下の整数であるが、２以上１０以下が好ましく、２以上４以下がより好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－、－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－等が挙げられる。
（Ｙ）
　一般式（Ｉ）において、Ｙは－（ＣＨ２）ｎ１－及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１－ＣＨ２ＣＨ２－（ここで、ｎ１は、２以上２０以下の整数であり、２以上１５以下の整数が好ましく、２以上１２以下の整数がより好ましく、２以上６以下の整数がさらに好ましい。ｍ１は、１以上４以下の整数である）からなる群より選択される基が好ましい。具体的には、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－、－（ＣＨ２）１２－、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－が好ましい。また、純水中乃至低塩濃度下では高い溶解性を実現させつつ、生理食塩濃度下では高い沈殿形成能を示させるという観点からは、Ｙは－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－及び－（ＣＨ２）１２－からなる群より選択される基が好ましく、－（ＣＨ２）６－がより好ましい。
　Ｙは、例えば、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－等であってもよい。
（Ｙａ）
　Ｙａとしては、－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－ＣＨ２－が好ましい。
（Ｙｂ）
　Ｙｂとしては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル又はオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルが好ましく、－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－がより好ましい。
　基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」の具体例としては、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－ＮＨ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－コレステリル等が挙げられる。好ましい基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」としては、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃが、水素原子であり、Ｙが、直鎖状のＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｙａが、直鎖状のＣ１－５アルキレンであるか、又はＹｂが、直鎖状のＣ２－８アルキレン若しくは直鎖状のＣ２－８アルケニレンである。
［繰り返し単位（Ｉａ）］
　一般式（Ｉａ）において、Ｘは、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）１２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルが好ましく、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルがより好ましく、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルがより更に好ましい。
　ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）に加えて、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（ＩＩ）」と称する場合がある）を更に含むことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、及びＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｘａは、ヒドロキシ及び－Ｏ－Ｑ＋からなる群より選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンである。）
　ここで、ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（ＩＩ）が２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
　別の態様において、ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）、繰り返し単位（Ｉａ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であってもよい。
［繰り返し単位（ＩＩ）］
　一般式（ＩＩ）において、Ｑ＋はカルボキシ基と水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシ基と塩を形成する。
　カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等の金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択される）で表されるアンモニウムイオン等が挙げられる。
　中でも、Ｑ＋は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はテトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ－ブチルアンモニウムイオン等）が好ましい。
　前記式中、Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、Ｃ１－６アルキルからなる群より選択される同一の基であることが好ましく、ｎ－ブチル基が好ましい。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４、並びにＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、及びＲ４ａは、全て水素原子であることが好ましい。また、Ｒａ及びＲｂは、いずれも水素原子であることが好ましい。
　中でも、ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であることが好ましい。ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）である。ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されていてもよく、繰り返し単位（Ｉ）のみから構成されていてもよい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体において、ヒアルロン酸誘導体を構成する二糖の繰り返し単位に対する、ステリル基の導入率（以下、単に「ステリル基導入率」と称する場合がある）は、１５％以上６０％以下が好ましく、２０％以上６０％以下が好ましく、３０％以上６０％以下が好ましく、３０％以上５５％以下がより好ましく、３５％以上５０％以下がさらに好ましく、３５％以上４５％以下が特に好ましい。
　ステリル基導入率が上記下限値以上であることで、生体内で沈殿せずに安定したハイドロゲルを保つことができる。一方で、上記上限値以下であることで、ハイドロゲルの平均粒子径を上記範囲内とすることができる。
　ステリル基導入率は、１Ｈ－ＮＭＲ測定により測定することができる。すなわち、ヒアルロン酸誘導体成分の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおけるヒアルロン酸誘導体のステリル基に由来するピークの積分値と、ヒアルロン酸誘導体に含まれるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、を用いて、以下の式に基づいて計算することができる。なお、式中ｎＨはピークに対応する水素原子の数を表す。
　前記１Ｈ－ＮＭＲは、例えば、測定溶媒として０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ　ＤＣｌ　Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ－ｄ６＝１：９９）を用い、測定温度８５℃にて実施することができる。
　なおグルコサミンのアセチル基由来のピークが含まれる１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なるため、１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６～２．０ｐｐｍ）－積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をヒアルロン酸由来のアセチル基の積分値として導入率の計算に使用することができる。
　［ステリル基導入率］（％）
＝［（ステリル基に由来するピーク積分値×３／ｎＨ）／（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク積分値）］×１００
＜ヒアルロン酸誘導体の製造方法＞
　ヒアルロン酸誘導体は、例えば、グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換し、ステリル基を導入することで得られる。また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体に対して、反応させるステリル基を有する化合物の配合量を調整することで、ステリル基導入率を制御することができる。
　グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換して、ステリル基を導入する方法として、具体的には、例えば、原料のヒアルロン酸又はその誘導体、好ましくは、繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されるヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と、式：「ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－Ｒ、ＮＨＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｓ－Ｒ、又は－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、Ｚ及びＲは本明細書で既に定義したとおりである）」で表されるステリル基（特に、コレステリル基）を導入したアミンと、を反応させる方法が挙げられる。
　上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が挙げられる。
　特に、限定はされないが、ＤＭＴ－ＭＭは、水及び有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ－ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシ基が共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノ基とカルボキシ基によるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシ基と反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシ基とヒドロキシ基とが、分子内又は分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
　ステリル基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、多価アルコール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。
　多価アルコールとしては、２価のアルコールであってもよく、３価のアルコールであってもよい。
　２価のアルコールとしては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、１，４－ブタンジオール、１，６－ヘキサンジオール等が挙げられる。
　３価のアルコールとしては、例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等が挙げられる。
　或いは、原料のヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシ基から誘導される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯＲ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯ－Ｈａｌ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＣＨ（ＣＨ３）＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＯＨ　＋　ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、及びＺは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素からなる群より選択されるハロゲン原子を表す）。
　反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体又は反応物がカルボキシ基を有する場合は、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
　また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基に、２－アミノエチル２－ピリジルジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法が挙げられる。
　さらに、ヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基にスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法も挙げられる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに－Ｓ－Ｓ－が挿入されている場合は、ヒアルロン酸のカルボキシ基に、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法も挙げられる。このとき、一方のメルカプト基を２－メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプト基と置換させることもできる。
　また、ヒアルロン酸誘導体を調製後、さらに他の置換基を導入してもよい。例えば、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシ基の０．１モル％以上９９．５モル％以下、好ましくは４０モル％以上６５モル％以下を、－ＣＯ－Ｘｚ、［ここで、Ｘｚは、以下の基：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）４－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；及び
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２－ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子又はＣ１－６アルキル基であり、ｐ１は２以上１０以下の整数、ｑは１以上１００以下の整数、ｒは１以上３以下の整数を、それぞれ表す）からなる群より選択される］
に変換することで、分子内或いは他分子を含めた分子間で化学的に架橋させてゲル化することもできる。
　透析により粒子サイズを特定の範囲に制御する場合は、ＭＷＣＯ（分画分子量）３００ｋＤａの透析膜で１回以上９回以下、好ましくは３回以上９回以下、より好ましくは６回以上９回以下透析することで、面積比Ａ１／Ａ２が０．９以上を満たす粒子サイズ分布を持つヒアルロン酸誘導体を得ることができる。透析の回数は、面積比Ａ１／Ａ２が０．９以上を満たせば任意の回数を当業者が適宜選択することができる。場合によっては９回以上の透析で分画してもよい。
　この時、面積比Ａ１／Ａ２が０．９以上を満たす粒子サイズ分布を持つヒアルロン酸誘導体を得る方法としては透析のみに限定されるものではない。例えば、限外ろ過膜或いは精密ろ過膜による遠心ろ過分離、分取精製ＨＰＬＣ、分取精製ＧＰＣ、超遠心による分離、イオン交換樹脂による分離、膜蒸留による分離、有機又は無機膜による膜分離、活性炭やゼオライト、ＭＯＦ（Ｍｅｔａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｆｒａｍｅｗоｒｋｓ）を利用した吸脱着法による分離、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　Ｆｌｏｗ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による分離、フィルターを用いた送液、加圧或いは減圧ろ過分離、塩析等を用いた沈殿分離法、ヒアルロン酸レセプターを用いた分離等でも、同様に、標準物質であるポリアクリル酸（５０ｋＤａ、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製、ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＳＳ－Ｐａａ５０ｋ）の粒子サイズ分布以下のヒアルロン酸誘導体を除去することで、面積比Ａ１／Ａ２が０．９以上を満たす粒子サイズ分布を持つヒアルロン酸誘導体を取得できる。 
　得られたヒアルロン酸誘導体は、乾燥させてもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。中でも、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥を行う場合に、ヒアルロン酸誘導体は、該ヒアルロン酸誘導体が形成する微粒子の粒径の増大をより効果的に抑制する観点から、凍結保護剤を更に含むことが好ましい。
　凍結保護剤は、「凍結保護剤」又は「凍結乾燥保護剤」として知られているものであれば特に限定されず、例えば、二糖類、ソルビトール、デキストラン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
　二糖類としては特に限定されず、例えば、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソトレハロース、ネオトレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ネオラクトース、ガラクトスクロース、シラビオース、ネオヘスペリドース、ルチノース、ルチヌロース、ビシアノース、キシロビオース、プリメベロース等が挙げられる。中でも、凍結保護剤として広く使用されていることから、スクロース、トレハロース、マルトース、又はラクトースが好ましい。また、医薬品添加物としての使用実績や、凍結乾燥時におけるヒアルロン酸誘導体が形成する微粒子の粒径の増大をより効果的に抑制する観点から、スクロースがより好ましい。
　凍結保護剤は、固体の状態で添加してもよく、水等の溶媒に溶解した状態で添加してもよい。
　凍結保護剤の添加量は特に限定されないが、ヒアルロン酸誘導体１００質量部に対して、２０質量部以上が好ましい。凍結保護剤の添加量が上記下限値以上であることで、より十分な粒径増大抑制効果が得られる。一方、凍結保護剤の添加量の上限は特に限定されないが、例えば、１００，０００質量部とすることができる。
　凍結乾燥において使用する装置も特に限定されず、例えば、市販の凍結乾燥機を用いることができる。中でも、真空度を制御する観点からは、凍結乾燥中に装置内の真空度をモニタリングできる凍結乾燥機が好ましく、また、品温を制御する観点からは、棚式凍結乾燥機が好ましい。
　本発明の第２の実施形態のヒアルロン酸誘導体は、ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムにおいて、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸の屈折率強度極大点（ピークトップ）における保持時間Ｐｒに対する、ヒアルロン酸誘導体の屈折率強度極大点（ピークトップ）における保持時間Ｐｔの比Ｐｔ／Ｐｒが、０．５以上１．０未満であり、０．７以上０．９５未満がより好ましく、０．７５以上０．９２未満が最も好ましい。比Ｐｔ／Ｐｒが前記範囲であることにより、粒子サイズの大きいヒアルロン酸誘導体を比較的多く含むことができ、薬効成分と製剤化した際に、薬効成分と安定した会合状態を形成することができる。これにより、薬効成分を免疫細胞（好ましくはＤＣ、より好ましくはｃＤＣ１）に安定的且つ効率よく送達させることができ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができる。
　前記ゲル浸透クロマトグラフィー測定において標準物質として使用されるポリアクリル酸は、ポリアクリル酸ナトリウムであることが好ましく、具体的には、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製、ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＳＳ－Ｐａａ５０ｋ（ポリアクリル酸ナトリウム）であることがより好ましい。
　前記ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定は、例えば、以下の方法で行うことができる。
　１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液、２ｍｇ／ｍＬのポリアクリル酸標準物質水溶液を調製し、以下に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行う。
（測定条件）
　装置：高速ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）装置
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ（示差屈折率検出器）
　温度：３０℃
　その他、前記第１の実施形態のヒアルロン酸誘導体と同じ構成等について、その説明を省略する。
　本発明の第３の実施形態のヒアルロン酸誘導体は、ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）が、１１万以上５０万未満であり、１３万以上３０万未満が好ましく、１４万以上２５万未満がより好ましい。ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）が前記範囲を満たす場合に、粒子サイズの大きいヒアルロン酸誘導体を比較的多く含むことができ、薬効成分と製剤化した際に、薬効成分と安定した会合状態を形成することができる。これにより、薬効成分を免疫細胞（好ましくはＤＣ、より好ましくはｃＤＣ１）に安定的且つ効率よく送達させることができ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができる。
　一方で、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）が前記上限値を超える場合は、粘性が増し、製剤として使用しにくい場合がある。
　前記ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（ポリアクリル酸換算）は、ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、各分子量が２ｋＤａ、４ｋＤａ、８ｋＤａ、１８ｋＤａ、４０ｋＤａ、および１５０ｋＤａであるポリアクリル酸を標準物質として作成された検量線に基づき、下記式：Ａｔ３＋Ｂｔ２＋Ｃｔ＋Ｄに従い算出される。
　前記標準物質として使用されるポリアクリル酸は、ポリアクリル酸ナトリウムであることが好ましく、具体的には、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製、ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＳＳ－Ｐａａシリーズ（ポリアクリル酸ナトリウム）であることがより好ましい。
　前記ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定は、前記第１または第２の実施態様で記載の方法で行うことができる。そのほか、前記第１の実施形態、及び／又は、前記第２の実施形態のヒアルロン酸誘導体と同じ構成等について、その説明を省略する。
≪医薬組成物≫
　前記第１～第３の実施形態のヒアルロン酸誘導体は、薬効成分と製剤化して、医薬組成物として使用することができる。
　すなわち、本実施形態の医薬組成物は、上述したヒアルロン酸誘導体と、薬効成分と、を含有する。
　本実施形態の医薬組成物において、上記ヒアルロン酸誘導体は、薬効成分と複合体（以下、「薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体」と称する場合がある）を形成している。具体的には、ヒアルロン酸誘導体中のステリル基と、薬効成分の疎水性部位とが疎水性相互作用により複合体を形成しており、薬効成分とステリル基等の疎水性部位が中心部に存在し、一方、ヒアルロン酸誘導体中のヒアルロン酸に由来する部位等の親水性部位が外縁部に存在する、コア－シェル型様の球状構造を呈しているものと推定される。すなわち、薬効成分がヒアルロン酸誘導体に封入又は内包された構造を呈しているものと推定される。
　本実施形態の医薬組成物において、薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む球状構造体の平均粒子径は、２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下とすることができ、２０ｎｍ以上９５ｎｍ以下とすることができ、２０ｎｍ以上９０ｎｍ以下とすることができる。ここでいう平均粒子径とは、ｚ平均で表される値である。平均粒子径が上記数値範囲であることで、生体内で安定した構造で存在することができ、且つ、リンパ節をより容易に通過することができる。平均粒子径は、例えば、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）や、ナノトラッキング粒子測定装置、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、及び電子顕微鏡法等によって、測定することができる。より具体的には、例えば、ＤＬＳ装置にてヒアルロン酸誘導体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように１０ｗ／ｖ％スクロースを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈して測定する。
　本実施形態の医薬組成物において、ヒアルロン酸誘導体、または薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体の重量平均分子量Ｍｗ（ポリアクリル酸換算）は１１万以上が好ましい。重量平均分子量Ｍｗ（ポリアクリル酸換算）は、異なる分子量を有する複数のポリアクリル酸標品を用いて、検量線を作成することで算出することが可能である。使用されるポリアクリル酸標品は、ポリアクリル酸ナトリウムであることが好ましく、具体的には、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製、ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＳＳ－Ｐａａシリーズ（ポリアクリル酸ナトリウム）であることがより好ましい。
　Ｍｗが上記数値範囲であることで、共刺激分子の活性化に優れる会合体サイズがより多く存在し、本実施形態の医薬組成物を用いることで、ペプチド等の薬効成分を免疫細胞（特に、ｃＤＣ１、マクロファージ）に安定的且つ効率よく送達させ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができ、同時に、免疫細胞の活性（特に、ｃＤＣ１での共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現）を向上、促進、維持又は増強させることができると考えられる。
　Ｍｗは、例えば、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電子顕微鏡法等によって、測定することができる。より具体的には、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー装置にてヒアルロン酸誘導体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように希釈して測定する。
　本実施形態の医薬組成物において、ヒアルロン酸誘導体、または薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体のサイズ排除クロマトグラフィーでの粒子径分布におけるピークトップ時間は標準物質ポリアクリル酸（５０ｋＤａ）のピークトップ時間よりも小さいことが好ましい。ピークトップ時間が上記範囲であることで、共刺激分子の活性化に優れる会合体サイズがより多く存在し、本実施形態の医薬組成物を用いることで、ペプチド等の薬効成分を免疫細胞（特に、ｃＤＣ１、マクロファージ）に安定的且つ効率よく送達させ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができ、同時に、免疫細胞の活性（特に、ｃＤＣ１での共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現）を向上、促進、維持又は増強させることができると考えられる。ピークトップ時間は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって、測定することができる。より具体的には、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー装置にてヒアルロン酸誘導体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように希釈して測定する。
　本実施形態の医薬組成物において、ヒアルロン酸誘導体の含有量は、特に限定されないが、例えば、医薬組成物の１００質量部に対して、０．０１質量部以上５０．００質量部以下であることが好ましく、０．１０質量部以上２５．００質量部以下であることがより好ましく、０．２０質量部以上１０．００質量部以下であることがさらに好ましい。
　次いで、本実施形態の構成成分について以下に詳細を説明する。
＜薬効成分＞
　薬効成分としては、特に限定されないが、抗原（がん抗原、感染症由来抗原、免疫疾患における自己抗原等）、医薬活性ペプチド又はタンパク質、核酸、低分子化合物、中分子化合物等が挙げられる。中でも、抗原が好ましく、がん抗原、感染症由来抗原、及び免疫疾患における自己抗原からなる群から選択される少なくとも一つがより好ましく、がん抗原又は感染症由来抗原がより好ましい。
　すなわち、本実施形態の医薬組成物は、がん、感染症、及び免疫疾患からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防又は治療用医薬組成物であることが好ましく、がん又は感染症の予防又は治療用医薬組成物であることがより更に好ましい。本実施形態の医薬組成物は、適用疾患ががん、感染症又は免疫疾患である場合には、ワクチン組成物ということもできる。
［抗原］
（がん抗原）
　がん抗原とは、がん細胞に多く発現する抗原であり、いくつかの場合には、がん細胞によってのみ発現する。がん抗原は、がん細胞内、又はがん細胞の表面上に発現し得る。
　本実施形態の医薬組成物において使用され得る抗原タンパク質は、限定されないが、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＷＴ１、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－Ｃ０１７－１Ａ／ＧＡ７３３、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ－１、ＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、ＰＳＡ－３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３－ゼータ鎖、ＣＤ２０、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４、ＭＡＧＥ－Ｃ５、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－９、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α－フェトプロテイン、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、γ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇイディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ－１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶがコードする核抗原（ＥＢＮＡ）－１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１、ＣＴ－７、ＣＤ２０、ｃ－ｅｒｂＢ－２等が挙げられる。
　上記抗原タンパク質としては、その配列の全てが使用されてもよく、一部が欠失した配列が使用されてもよい。
　本実施形態の医薬組成物において使用され得る抗原ペプチドは、抗原タンパクの配列のうち、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ及びＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープからなる群より選ばれる１種以上のエピトープを含む抗原ペプチドである。一実施形態において、抗原提示細胞での分解を経てＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩＩ分子に搭載されるという観点から、上記抗原ペプチドは、好ましくは２つ以上のエピトープを含む抗原ペプチドである。具体的には、上記抗原ペプチドとしては、腫瘍細胞の抗原タンパクのエピトープを含む抗原ペプチドが挙げられる。
　一実施形態において、上記抗原ペプチドは、例えば８～１２０アミノ酸、好ましくは８～８０アミノ酸、より好ましくは１５～８０アミノ酸、さらにより好ましくは１６～８０アミノ酸、さらに好ましくは２３～８０アミノ酸、よりさらに好ましくは２３～６０アミノ酸、特に好ましくは２３～５０アミノ酸を有する。
　一実施形態において、ヘルパーＴ細胞による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化誘導の観点から、上記抗原ペプチドは、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ及びＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープをそれぞれ１つ以上含む抗原ペプチドである。
　一実施形態において、エピトープを２つ以上含む場合、エピトープ間にアミノ酸リンカーを配置してもよい。該リンカーは、例えば２～１０アミノ酸、好ましくは４～１０アミノ酸、より好ましくは４～８アミノ酸を有する。
　該リンカーに用いるアミノ酸としては、グリシン（Ｇ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）等が挙げられる。好ましくは、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）である。アミノ酸リンカーの具体例としては、連続した４つのチロシン（Ｙ）からなるリンカー（４Ｙ）、連続した４つのロイシン（Ｌ）からなるリンカー（４Ｌ）、連続した４つのトリプトファン（Ｗ）からなるリンカー（４Ｗ）、連続した６つのグリシン（Ｇ）なるリンカー（６Ｇ）、連続した６つのチロシン（Ｙ）なるリンカー（６Ｙ）、連続した６つのロイシン（Ｌ）なるリンカー（６Ｌ）、連続した６つのトリプトファン（Ｗ）なるリンカー（６Ｗ）、連続した８つのチロシン（Ｙ）なるリンカー（８Ｙ）、連続した６つのロイシン（Ｌ）なるリンカー（８Ｌ）、連続した８つのトリプトファン（Ｗ）なるリンカー（８Ｗ）が挙げられ、好ましくは、６Ｙ、６Ｌ又は６Ｗである。
　がん抗原は、腫瘍関連抗原であっても、がん精巣抗原であっても、ウイルス抗原であっても、腫瘍特異的抗原（ネオアンチゲンを含む）であってもよい。がん抗原は一つで用いてもよく、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。
（感染症由来抗原）
　感染症由来抗原としては、感染性病原体及び感染性病原体由来の抗原であれば特に限定されない。感染性病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、線虫等が挙げられる。感染症病原体由来抗原は抗原タンパク質であっても、抗原ペプチドであってもよい。
　上記感染性病原体から罹る疾患としては特に限定されず、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－ＩＩ、ＣＭＶ、ＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡若しくはワクシニア、伝染性軟属腫等のオルトポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス、エンテロウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス)、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、パポバウイルス（例えば、生殖器疣、尋常性胱贅、足底疣費を引き起こすもの等の乳頭腫ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、肝炎Ｂウイルス）、フラビウイルス（例えば、肝炎Ｃウイルス、デングウイルス）、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ等のレンチウイルス）等のウイルス感染から罹る疾患等のウイルス疾患；エシェリキア属、エンテロバクター、サルモネラ、ブドウ球菌、赤痢菌、リステリア、アエロバクター、ヘリコバクター、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、連鎖球菌、クラミジア、マイコプラズマ、肺炎球菌、ナイセリア、クロストリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、カンピロバクター、ビブリオ、セラチア、プロビデンシア、クロモバクテリウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス、ボルデテラ等の細菌感染から罹る疾患等の細菌疾患；クラミジア、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス髄膜炎等の真菌疾患；マラリア、ニューモシスティスカリニ肺炎、レーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ感染等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物において使用され得る抗原の構造としては、病原体を構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、例えば、生ワクチン、不活化全粒子、それらの一部、タンパクサブユニット、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。中でも、ヒアルロン酸誘導体との複合化の観点から、タンパクサブユニット、タンパク質、又はペプチドが好ましい。
　上記インフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、Ｂ及びＣ型に分けられる。上記インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質とからなる。上記ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。また、上記インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。なお、世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものであり、このＡ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼの２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってヘマグルチニンでは１６種、ノイラミニダーゼでは９種の亜型に区別されている。
　上記感染症由来抗原としては、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス由来抗原が好適に用いられる。なお、上述したＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの亜型としては特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。
　インフルエンザウイルス由来抗原としては、上記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、例えば、精製ウイルス粒子が有機溶媒／界面活性剤若しくは他の試薬で不活化されたウイルス全粒子、又は、該ウイルス全粒子の中から不純物を取り除き、ヘマグルチニン及び／若しくはノイラミニダーゼを精製して作られたウイルスサブユニット等が挙げられる。免疫原性の観点から、ヘマグルチニンサブユニット又はウイルス全粒子が好ましい。上記ウイルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。また、不純物が少なく、免疫賦活剤等のアジュバントが必須となるヘマグルチニンサブユニット（スプリット）について特に有効である。
　上記インフルエンザウイルス抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物又はインフルエンザの患者から単離されたウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製する方法が挙げられる。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。
（免疫疾患における抗原）
　免疫疾患における抗原としては、免疫疾患の標的タンパク質のエピトープを含むものであれば特に限定されない。免疫疾患としては特に限定されず、例えば、尋常性乾癬、強直性脊椎炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、体軸性脊椎関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、気管支喘息、慢性蕁麻疹、花粉症、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。
　標的タンパク質としては特に限定されず、ＩＬ－１７Ａ、ＤＰＰ４、Ｓ１００Ａ９、ＰＣＳＫ９、ＩＬ－２３、ＩｇＥ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２／２３ｐ４０、ＩＬ－６、α４β７インテグリン、ＩＬ－４／１３、ＩＬ－５、ＢＬｙＳ、ＩＬ－１３等が挙げられる。参考文献２（国際公開第２０１７／１６４４０９号）にはＩＬ－１７Ａ由来のペプチドが記載されている。
　ペプチドは、標的タンパク質のエピトープだけではなく、標的タンパク質以外ののエピトープを有しても良い。Ｂ細胞エピトープであってもＴ細胞エピトープであってもよい。
　ペプチドはエピトープを有する配列であり、環状構造を有していてもよい。前期ペプチドは分子内に複数の環状構造を有していてもよい。
　さらに前記ペプチドはタンパクへコンジュゲートされていてもよい。
　投与されたタンパク質やペプチドに対する抗体が体内で産生されることにより治療効果が期待できる。
［医薬活性ペプチド又はタンパク質］
　医薬活性ペプチド又はタンパク質としては、対象に治療有効量を投与した場合に、対象の状態又は病状に対して正の、又は有利な効果を有するものを意味する。好ましい医薬活性ペプチド又はタンパク質としては、根治的又は対症的性質を有し、疾患又は障害の１つ又は複数の症状を改善する、軽快させる、軽減する、元に戻す、症状の発症を遅らせる、又は症状の重症度を減ずるために投与することができるものである。医薬活性ペプチド又はタンパク質は予防的性質を有することもあり、疾患の発症を遅らせるか、又はこのような疾患又は病態の重症度を減ずるために使用することができる。「医薬活性ペプチド又はタンパク質」という用語は、全長タンパク質又はポリペプチドを含意し、又その医薬的に活性な断片を指すこともある。この用語は、ペプチド又はタンパク質の医薬的に活性なアナログも包含する。
　医薬活性タンパク質の例としては、以下に限定されないが、免疫活性化合物等のサイトカイン及び免疫系タンパク質（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレチン（ｓｅｌｅｔｉｎ）、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、抗体、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、刺激ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチン等）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様成長因子等）、増殖因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｔｉｃ）酵素又は分解酵素、ステロイド産生（ｓｔｅｒｉｏｄｏｇｅｎｉｃ）酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、チトクロム、アデニル酸シクラーゼ又はグアニル酸（ｇｕａｎｙｌａｓｔｅ）シクラーゼ、ノイラミダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）等）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモン結合タンパク質又は増殖因子結合タンパク質等）、転写因子及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質（例えば、血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン及びミオシン等）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインＣ、フォンヴィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、改変第ＶＩＩＩ因子、抗凝固因子）等が挙げられる。
　一実施形態では、医薬活性タンパク質は、リンパ球のホメオスタシスの制御に関与するサイトカインであり、好ましくは、Ｔ細胞の発生、初回刺激、増幅、分化及び生存からなる群より選ばれる１種以上に関与し、且つ、それらを誘導又は増強するサイトカインである。
　一実施形態では、サイトカインはインターロイキンである。
　一実施形態では、医薬活性タンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１からなる群より選択される１種以上のインターロイキンである。
　一実施形態では、医薬活性ペプチドは、環状構造を有してもよい。前記ペプチドは分子内に複数の環状構造を有していてもよい。
［核酸］
　核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、核酸アプタマー等が挙げられる。また、上記抗原がペプチド又はタンパク質である場合には、それら抗原ペプチド又はタンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ等）も好ましく用いられる。
［低分子化合物］
　低分子化合物としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β－ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤等）等が挙げられる。
　また、薬効成分としては、上述したヒアルロン酸誘導体のステリル基との相互作用を十分に発揮できることから、疎水性の高い、すなわち、難水溶性のものも好ましく用いることができる。なお、「難水溶性」とは、第１７改正日本薬局方において、溶質１ｇを溶かすのに必要な水量が３０ｍＬ以上必要であることを指す。
　難水溶性で固体状の薬効成分としては、例えば、アセトアミノフェン、イブプロフェン、安息香酸、エテンザミド、カフェイン、カンフル、キニーネ、グルコン酸カルシウム、ジメチルカプロール、スルフアミン、テオフィリン、テオプロミン、リボフラビン、メフェネシン、フェノバービタル、アミノフィリン、チオアセタゾン、クエルセチン、ルチン、サリチル酸、テオフィリンナトリウム塩、ピラピタール、塩酸キニーネ、イルガピリン、ジキトキシン、グリセオフルビン、フェナセチン等の解熱鎮痛薬、神経系医薬、鎮静催眠薬、筋弛緩剤、血圧硬化剤、抗ヒスタミン剤等；アセチルスピラマイシン、アンピシリン、エリスロマイシン、キサタマイシン、クロラムフェニコール、トリアセチルオレアンドマイシン、ナイスタチン、硫酸コリスチン等の抗生物質；メチルテストステロン、メチルアンドロステトロンジオール、プロゲステロン、エストラジオールベンゾエイト、エチニレストラジオール、デオキシコルチコステロン・アセテート、コーチゾンアセテート、ハイドロコーチゾン、ハイドロコーチゾンアセテート、ブレドニゾロン等のステロイドホルモン剤；ジエンストロール、ヘキサストロール、ジエチルスチルベステロール、ジエチルスチルベステロールジブロヒオネイト、クロロトリアニセン等の非ステロイド系卵黄ホルモン剤；その他脂溶性ビタミン類等の、「日本薬局方」、「局外基」、「ＵＳＰ（米国薬局方）」、「ＮＦ（国民医薬品集）」、「ＥＰ（欧州薬局方）」に記載の医薬品薬効成分等が挙げられる。これら薬効成分から選ばれる１種を使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　薬効成分は、難水溶性の油状又は液状のものであってもよい。難水溶性の油状又は液状の薬効成分としては、例えば、テプレノン、インドメタシン・ファルネシル、メナテトレノン、フィトナジオン、ビタミンＡ油、フェニペントール、ビタミンＤ、ビタミンＥ等のビタミン類、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、肝油等の高級不飽和脂肪酸類、補酵素Ｑ類、オレンジ油、レモン油、ペパーミント油等の油溶性香味料等の「日本薬局方」、「局外基」、「ＵＳＰ」、「ＮＦ」、「ＥＰ」に記載の医薬品薬効成分等が挙げられる。ビタミンＥには種々の同族体、誘導体があるが、常温で液状であれば特に限定されず、例えばｄｌ－α－トコフェロール、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、ｄ－α－トコフェロール、酢酸ｄ－α－トコフェロール等が挙げられる。これら薬効成分から選ばれる１種を使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　薬効成分は、難水溶性の半固形状の物質でもよい。難水溶性の半固形状の薬効成分としては、例えば地竜、カンゾウ、ケイヒ、シャクヤク、ボタンピ、カノコソウ、サンショウ、ショウキョウ、チンピ、マオウ、ナンテンジツ、オウヒ、オンジ、キキョウ、シャゼンシ、シャゼンソウ、石蒜、セネカ、バイモ、ウイキョウ、オウバク、オウレン、ガジュツ、カミツレ、ゲンチアナ、ゴオウ、獣胆、シャジン、ショウキョウ、ソウジュツ、チョウジ、チンピ、ビャクジュツ、チクセツニンジン、ニンジン、葛根湯、桂枝湯、香蘇散、紫胡桂枝湯、小紫胡湯、小青竜湯、麦門冬湯、半夏厚朴湯、麻黄湯等の漢方又は生薬エキス類；カキ肉エキス、プロポリス及びプロポリス抽出物、補酵素Ｑ類等が挙げられる。これら薬効成分から選ばれる１種を使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　本実施形態の医薬組成物において、薬効成分の含有量は、薬効成分の構造にもよるが、ヒアルロン酸誘導体の質量に対して、０．００１質量％以上１０，０００質量％以下とすることができ、０．１質量％以上１０００質量％以下が好ましく、１．０質量％以上１００．０質量％以下であることがより好ましく、１．５質量％以上５０．０質量％以下であることがさらに好ましく、３．０質量％以上３０．０質量％以下であることが特に好ましく、５．０質量％以上２０．０質量％以下であることが最も好ましい。
　或いは、本実施形態の医薬組成物において、薬効成分の含有量は、ヒアルロン酸誘導体の質量に対して、０.１質量％以上１００．０質量％以下であることがより好ましく、０．１質量％以上５０．０質量％以下であることがさらに好ましく、０．１質量％以上３０．０質量％以下であることがさらに好ましく、０．５質量％以上３０．０質量％以下であることがさらに好ましく、１．０質量％以上３０．０質量％以下であることがさらに好ましく、１.０質量％以上２５．０質量％以下であることがさらに好ましく、１．０質量％以上２０．０質量％以下であることがさらに好ましく、１．０質量％以上１５．０質量％以下であることがよりさらに好ましく、１．０質量％以上１０．０質量％以下であることが特に好ましい。
　或いは、本実施形態の医薬組成物において、薬効成分の含有量は、医薬組成物１００質量部に対して、０．０００１質量部以上１．００質量部以下であることが好ましく、０．００１質量部以上０．１００質量部以下であることがより好ましく、０．００２質量部以上０．５００質量部以下であることがさらに好ましい。
　或いは、本実施形態の医薬組成物において、薬効成分の含有量は、医薬組成物１００質量部に対して、０．００１質量部以上１．００質量部以下であることが好ましく、０．００１質量部以上０．５００質量部以下であることがより好ましく、０．００１質量部以上０．２００質量部以下であることがより好ましく、０．００５質量部以上０．１００質量部以下であることがさらに好ましい。
　薬効成分の含有量が上記下限値以上であることで、より効果的に免疫細胞を活性化させることができ、一方で、上記上限値以下であることで、薬効成分をヒアルロン酸誘導体成分に封入し、より安定的な構造とすることができる。
＜アジュバント＞
　本実施形態の医薬組成物がワクチン組成物である場合に、上記薬効成分及び上記ヒアルロン酸誘導体に加えて、アジュバントを更に含むことができる。これにより、より効果的に免疫を誘導することができる。ここで、誘導される免疫は液性免疫でも細胞性免疫で合っても良い。すなわち、本実施形態の医薬組成物は、上記ヒアルロン酸誘導体と、上記薬効成分として抗原（好ましくはがん抗原又は感染症由来抗原）と、を含み、且つ、アジュバントを更に含む、医薬組成物であることが好ましい。
　なお、一般に、液性免疫とは、Ｂ細胞と抗体が中心となる免疫機構のことをいう。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）の産生するサイトカインにより、Ｂ細胞が刺激されることで、Ｂ細胞が形質細胞へと分化し、大量の抗体を産生し、抗体は体液中を循環して全身に広がる。また、刺激されたＢ細胞の一部は、抗原の情報を記憶しているメモリーＢ細胞となって、再度の感染の際には、最初の反応より迅速に、そしてより抗原に親和性が高い抗体を大量に産生することができる。
　一方、細胞性免疫とは、病原体そのものやウイルス感染細胞、癌細胞等の異物の排除において、細胞が主なエフェクターとなる免疫機構のことをいう。マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、キラーＴ細胞)、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）等の免疫担当細胞自体による排除機構である。
　アジュバントとしては、ワクチンに通常用いられるものであれば特に限定されないが、例えば、アルミニウム塩、スクアレン、自然免疫受容体に対するリガンド等が挙げられる。
　ここでいう「リガンド」とは、受容体に特異的に結合する物質を意味し、特に、受容体に特異的に結合して、種々の生理作用を示す物質を用いることができる。このような物質を「アゴニスト」ともいう。
　自然免疫受容体としては、例えば、トール様受容体（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＩＧ－Ｉ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＯＤ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＮＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（Ｃ－ｔｙｐｅ　ｌｅｃｔｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＬＲ）等が挙げられる。
　ＴＬＲリガンドとしては、例えば、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－４、ＴＬＲ－５、ＴＬＲ－６、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８及びＴＬＲ－９からなる群より選択される少なくとも１種のＴＬＲと相互作用するものを適宜選択すればよい。
　ＴＬＲ－２リガンドとしては、例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４等が挙げられる。
　ＴＬＲ－３リガンドとしては、例えば、ポリＩＣＬＣ、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）等が挙げられる。
　ＴＬＲ－４リガンドとしては、例えば、Ｒ型リポ多糖、Ｓ型リポ多糖、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ等が挙げられる。
　ＴＬＲ－５リガンドとしては、例えば、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）等が挙げられる。
　ＴＬＲ－２及びＴＬＲ－６リガンドとしては、例えば、ＭＡＬＰ－２等が挙げられる。
　ＴＬＲ－７及びＴＬＲ－８リガンドとしては、例えば、レシキモド（Ｒ８４８）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、Ｒ８３７）、ガルジキモド（ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）等が挙げられる。
　ＴＬＲ－９リガンドとしては、例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド等が挙げられる。
　中でも、アジュバントとしては、抗原提示機能をより向上できることから、アニオン性化合物が好ましく、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドがより好ましい。
　ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドとしては、例えば、ＣｐＧ－ＯＤＮ　１８２６、ＣｐＧ－Ｋ３等が挙げられる。
＜その他添加剤＞
　本実施形態の医薬組成物は、単独で投与することもでき、或いは、薬理学上許容されうる担体とともに常套手段に従って投与することができる。薬理学上許容されうる担体と併用する場合は、例えば、上記ヒアルロン酸誘導体及び上記薬効成分、並びに、必要に応じてアジュバントと、水若しくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、生理食塩水、含水エタノール、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））等とを、混合してもよく、生理学的に許容し得る緩衝液、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、凍結乾燥補助剤等を含むこともできる。
　緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ヒスチジン、またはクエン酸等が挙げられる。
　防腐剤としては、例えば、ベンザルコニウム塩化物、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ソルビン酸、アルキルポリアミノエチルグリシン等が挙げられる。
　安定化剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム水和物、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、ポリソルベート８０等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物としては、製剤化したものを用いてもよい。製剤の形態としては、固体、半固体又は液体の形態とすることができる。
　固体の場合、粉末、顆粒、丸剤、ペレット、タブレット、カプセル等の形態が挙げられる。中でも、固体としては、凍結乾燥粉末であることが好ましい。
　半固体の場合、ゲル等の形態が挙げられる。
　液体の場合、粉末を水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液により希釈又は懸濁した懸濁液等の形態が挙げられる。
＜医薬組成物の製造方法＞
　本実施形態の医薬組成物は、上記ヒアルロン酸誘導体と上記薬効成分を適宜混合することで製造できるが、以下に示す方法で製造することが好ましい。
　本実施形態の医薬組成物の製造方法は、ヒアルロン酸誘導体と、薬効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、以下の工程を含む。
　前記薬効成分を有機溶媒又は有機溶媒含有水に溶解して、前記薬効成分を含有する油相を調製する調製工程；及び、
　前記油相と前記ヒアルロン酸誘導体を含有する水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００となるように混合する混合工程。
　従来では、前記油相と水相の比率によって、ヒアルロン酸誘導体は、油相によりステリル基同士の相互作用が阻害されて、粒子が解れてしまう、或いは、一部が凝集してしまうなど、ヒアルロン酸誘導体の粒子サイズの維持が困難であった。そのため、粒子が解れた比較的小さなサイズのヒアルロン酸誘導体、或いは、一部凝集した粒子を含むヒアルロン酸誘導体と薬効成分との複合体しか医薬組成物に含まれていなかった。また、透析法を用いて医薬組成物を製造していたため、ヒアルロン酸誘導体と薬効成分との重量比は制御が難しく成り行きであった。さらに目標の薬効成分濃度とするために濃縮する工程も必要であった。
　これに対して、本実施形態の医薬組成物の製造方法は、透析法を用いておらず、上記構成、特に油相と水相との混合比が上記数値範囲内となるように混合することで、医薬組成物の製造前のヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布を保ちながら、薬効成分との複合体を形成させることができ、ヒアルロン酸誘導体と薬効成分との重量比も一定に制御可能である。これにより、薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を安定した構造で得られる。その結果、リンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能により優れる医薬組成物が得られる。
　次いで、本実施形態の医薬組成物の製造方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
［調製工程］
　調製工程では、薬効成分を有機溶媒又は有機溶媒含有水に溶解して、薬効成分を含有する油相を調製する。
　有機溶媒又は有機溶媒含有水に溶解させることから、薬効成分としては難水溶性のものを好ましく用いることができる。薬効成分として具体的には、上記「薬効成分」において例示されたものを用いることができる。
　薬効成分を溶解する有機溶媒としては、医薬組成物の製造に一般的に用いられる公知のものが挙げられ、具体的には、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、１－ペンタノール、メチルエチルケトン、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルイソブチルケトン、ジメチルホルムアミド等が挙げられる。
［混合工程］
　混合工程では、調製工程で得られた油相と前記ヒアルロン酸誘導体を含有する水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００となるように混合する。
　ヒアルロン酸誘導体は、予め所望の濃度となるように水等に溶解又は分散して用いる。このとき、ヒアルロン酸誘導体を含有する水相のｐＨが６．００以上であることが好ましく、６．００以上１１．００以下であることが好ましい。ｐＨが上記下限値以上であることで、ヒアルロン酸誘導体の凝集をより効果的に抑制しながら、薬効成分との複合体を形成させることができ、これにより、薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体をより安定した構造で得られる。ｐＨが上記上限値以下であることで、ヒアルロン酸誘導体の分散安定性を維持しながら薬物を複合化できる。また薬物の電荷が負に傾くため、ヒアルロン酸誘導体の疎水部と薬物とがより相互作用しやすくなる側面もある。一方で、上記上限値以下であることで、ヒアルロン酸誘導体の主鎖分解をより抑制することができる。
　混合工程において、ヒアルロン酸誘導体のステリル基と、薬効成分との疎水性相互作用により、ステリル基及び薬効成分が内部に存在し、一方で、ヒアルロン酸に由来する親水性部位が外縁部に存在する構造からなる、薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体が形成される。薬効成分の構造により、上記疎水性相互作用だけではなく静電的相互作用、水素結合等の相互作用で複合体を形成しうる。
　混合工程において、油相と水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００であり、好ましくは１０：１００～０．０５：１００であり、より好ましくは５：１００～０．１：１００であり、さらに好ましくは２．５：１００～０．５：１００である。油相と水相との混合比が上記範囲内であることで、十分量の薬効成分をヒアルロン酸誘導体に内包させて、薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を形成することができ、且つ、ヒアルロン酸誘導体の粒子が油相によりステリル基同士の疎水性相互作用が阻害されて会合が解けることを効果的に抑制することができる。但し、疎水性相互作用だけに限るものではなく、静電的相互作用、水素結合等の構造安定に寄与しうる相互作用の崩壊についても効果的に抑制できる。
　混合工程において、油相へ溶解する薬効成分の濃度は特に限定されないが、油相１００質量部に対して、０．１質量部以上５０質量部以下であることが好ましく、０．２質量部以上２５質量部以下であることがより好ましく、０．５質量部以上１０質量部以下であることがさらに好ましい。
　混合工程において、水相へ溶解するヒアルロン酸誘導体の濃度は特に限定されないが、水相１００質量部に対して、ヒアルロン酸誘導体の濃度が０．０１質量部以上１０質量部以下であることが好ましく、０．１質量部以上１０質量部以下であることがより好ましく、０．５質量部以上５質量部以下であることがさらに好ましい。
　混合工程において、薬効成分の疎水部をやや露出し、ヒアルロン酸誘導体と相互作用しやすくする観点から、温度を２０℃以上６５℃以下とすることが好ましく、２３℃以上５５℃以下とすることがより好ましく、２５℃以上４０℃以下とすることがさらに好ましい。或いは、薬効成分の構造及び特性によって、最適な温度を適宜設定することができる。
　混合工程において、方法は特に限定されないが、例えば、上記ヒアルロン酸誘導体の含有する水相の中に、薬効成分の含有した油相を任意の比で添加する、或いは、薬効成分の含有した油相の中に、上記ヒアルロン酸誘導体の含有する水相を任意の比で添加していき、最終的な油相と水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００にする混合合工程を経ることでヒアルロン酸誘導体の粒子サイズを維持することができる。
　混合工程は、バッチ方式（回分式）に限定されず、油相および水相をフロー法（連続式）で混合してもよい。その際の油相と水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００にすることでヒアルロン酸誘導体の粒子サイズを維持することができる。
　フロー法におけるリアクターの材質や形状は、本発明の製造方法に適用可能な材質や形状を選択すればよく、特に限定されないが、例えば、油相と水相のそれぞれが通過する配管の内径は、異なる径であってもよい。
　フロー法におけるチューブの材質や形状は、本実施形態の医薬組成物の製造方法に適用可能な材質や形状を選択すればよく、特に限定されないが、例えば、テフロン（登録商標）製のチューブ、ステンレス管、ガラス管、プラスチック管等が挙げられる。
　混合工程において、時間は特に限定されないが、例えば、３０分間以上９０時間以下とすることができ、１時間以上８０時間以下とすることができる。
　混合工程において、薬効成分がヒアルロン酸誘導体に複合化された後に、薬効成分を溶解した有機溶媒を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、或いは、遠心ろ過、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）膜における複数のＴＦＦ等で除く工程があってもよい。
［滅菌工程］
　混合工程の後に、得られた薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む溶液を滅菌して、滅菌製剤を得る滅菌工程を行ってもよい。製剤の滅菌方法としては、滅菌用フィルターによるろ過滅菌、ガス滅菌、γ線滅菌または電子線滅菌等が挙げられる。滅菌用フィルターによるろ過滅菌が最も好ましい。
［乾燥工程］
　混合工程の後に、得られた薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む溶液を乾燥して、乾燥体を得る乾燥工程を行ってもよい。乾燥方法としては、上記「ヒアルロン酸誘導体の製造方法」において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
＜投与方法＞
　本実施形態の医薬組成物を投与する対象は、ヒトを含む哺乳類に分類される動物（サル、マーモセット、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等）が挙げられる。
　投与経路は、例えば、髄腔内注射、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、経肺的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法により行なうことができる。中でも、本実施形態の医薬組成物がワクチン組成物である場合には、皮下注射又は筋肉内注射が好ましい。
　本実施形態の医薬組成物において、非経口的に投与する場合、その投与量は、投与対象の種類（年齢や性別等も含む）等を考慮して適宜選択することができるが、一般的に例えばヒト（体重６０ｋｇとして）においては、１回あたり、薬効成分（好ましくは、抗原）の量として、０．０１μｇ以上５ｍｇ以下とすることができ、０．１μｇ以上５００μｇ以下とすることができ、１μｇ以上１００μｇ以下とすることができる。
　投与回数は、上述した投与量の単回投与であってもよく、上述した投与量を、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、又は半年毎に１回等、２回以上の複数回投与であってもよい。或いは、１回の投与において２カ所以上投与してもよい。
≪その他実施形態≫
　一実施形態において、本発明は、上記医薬組成物の有効量を、患者又は患畜に投与することを含む、がん、感染症及び免疫疾患からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防又は治療方法を提供する。
　なお、感染症としては、上記「抗原」の「感染症由来抗原」において例示されたものが挙げられる。
　また、ここでいう「有効量」とは、予防又は治療に有効な量、すなわち、上記疾患の発症予防又は治療に適する量が包含される。
　一実施形態において、本発明は、がん、感染症及び免疫疾患からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防又は治療のための組成物であって、上記薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を提供する。
　一実施形態において、本発明は、医薬組成物を製造するための、上記薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体の使用を提供する。
　前記医薬組成物は、感染症ワクチン、がんワクチン、または免疫疾患用医薬組成物であることが好ましい。
　一実施形態において、さらに、本発明はヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物と、前記抗原に対する免疫受容体を発現するリンパ球を含むこと特徴とする、医薬組成物を提供する。ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物と抗原特異的リンパ球を組み合わせて用いることにより、より強く、より効率的に、より持続的に、及び／又はより広範囲において抗腫瘍効果を発揮することができる。
　抗原に対する免疫受容体を発現するリンパ球を含有する、前期ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物との併用投与に用いるための医薬組成物を提供する。
　ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物と、抗原特異的リンパ球との組合せからなることを特徴とする、医薬組成物は、キットの形態であることもできる。当該医薬組成物は、例えば、ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物と抗原特異的リンパ球とを含むがん治療キットであることができる。
　本発明の好ましい一態様において、ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物は抗原特異的リンパ球を投与する前に投与されることが好ましい。本発明の好ましい一態様において、ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物が１回投与された後に抗原特異的リンパ球が１回輸注されることを投与回数の単位とした際に、１単位又は２単位の投与がなされた後に、ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物が少なくとも１回投与されることが好ましい。
　本発明の好ましい一態様において、ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物の投与１回目と投与２回目の間隔は、例えば１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、又は１４日以上であることができる。また、当該間隔は、例えば２８日以下、２４日以下、２１日以下、１７日以下、１４日以下、１３日以下、１２日以下、１１日以下、１０日以下、９日以下、８日以下、７日以下、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、又は２日以下であることができる。
　一実施形態において、本発明はヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物は、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与してもよい。
　抗体は、例えば腫瘍による免疫抑制シグナルを阻害する抗体、または免疫細胞の共刺激シグナルを活性化する1種類以上の抗体であり、好ましくは腫瘍による免疫抑制シグナルを阻害する抗体または免疫細胞の共刺激シグナルを活性化する抗体である。具体的には、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＯＸ４０、および抗４－１ＢＢ抗体からなる群から選択される１種類以上の抗体である。
　組み合わせて投与する場合のヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物の投与量は、例えば０．０１～１００ｍｇ／回、好ましくは０．１～５０ｍｇ／回、より好ましくは０．１～２０ｍｇ／回であり、抗体の投与量は、例えば０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１～４０ｍｇ／ｋｇ体重である。
　抗体はヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物と同じタイミング（製剤中に抗体が含まれる場合を含む）で投与しても、異なるタイミングで投与してもよい。異なるタイミングで投与する場合は、一方を投与後にもう一方を、例えば１分～２４時間、好ましくは１分～５時間以内に投与するのが好ましい。
　ヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物は、上記アジュバントと抗体の両方と組み合わせて投与してもよい。その場合のヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物の投与量は、例えば０．０１～１００ｍｇ／回、好ましくは０．１～５０ｍｇ／回、より好ましくは例えば０．１～２０ｍｇ／回であり、アジュバントの投与量は、例えば０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、抗体の投与量は、例えば０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１～４０ｍｇ／ｋｇ体重である。アジュバントおよび抗体はヒアルロン酸誘導体及び抗原を含有する組成物と同じタイミング（製剤中にアジュバントが含まれる場合を含む）で投与しても、異なるタイミングで投与してもよい。異なるタイミングで投与する場合は、ワクチン製剤、アジュバント、および抗体の全てを、例えば１分～２４時間、好ましくは１分～５時間以内に投与するのが好ましい。
　一実施形態において、本発明は、薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強するための組成物であって、上記薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を提供する。
　一実施形態において、本発明は、免疫細胞の活性を向上、促進、又は増強するための組成物であって、上記薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を提供する。
　一実施形態において、本発明は、ＤＣ（特に、ｃＤＣ１）の共刺激分子（特に、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現を向上、促進、維持又は増強するための組成物であって、上記薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を提供する。
　一実施形態において、本発明は、上記薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を投与することを含む、インビボ又はインビトロにおいて薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させる方法を提供する。
　一実施形態において、本発明は、上記薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を投与することを含む、インビボ又はインビトロにおいて免疫細胞の活性を向上、促進、又は増強させる方法を提供する。
　一実施形態において、本発明は、上記薬効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を投与することを含む、インビボ又はインビトロにおいてＤＣ（特に、ｃＤＣ１）の共刺激分子（特に、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現を向上、促進、維持又は増強させる方法を提供する。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を実施例に制限することを意図したものではない。
＜ヒアルロン酸誘導体の合成＞
［合成例１－１］
　ヒアルロン酸誘導体を次の工程１～工程３に従って調製した。
１．工程１
（コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成）
　コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）を、次に示す工程１－１、続いて工程１－２に従って合成した。
（１）工程１－１
　コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温（２５℃程度）まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４）で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
（２）工程１－２
　得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温（２５℃程度）で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）１．２ｇを得た。
２．工程２
（ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の調製）
　ヒアルロン酸（ＨＡ）のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を次に示す工程２－１、続いて工程２－２に従って調製した。
（１）工程２－１
　ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０ｗｔ％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間、室温（２５℃程度）で撹拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
（２）工程２－２
　重量平均分子量（絶対分子量）１０，０００（１０ｋＤａ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。「（１）工程２－１」でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。室温（２５℃程度）で１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。
３．工程３
　「２．（２）工程２－２」で調製したＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、「１．工程１」で合成したＨＡ－ＴＢＡ中に存在する二糖繰り返し単位（ＨＡユニット）に対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量がモル比で４４／１００となるように添加した。次に、ＨＡユニットに対する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）の添加量がモル比で４８／１００となるように加え、室温（２５℃程度）で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で、スペクトラポア７透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製製、分画分子量（ＭＷＣＯ）：３，５００）を用いて透析した。得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。
　得られた白色固体におけるコレステロール導入率を以下の方法で算出した。
　測定溶媒として０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ　ＤＣｌ　Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ－ｄ６＝１：９９）を用い、ＮＭＲ装置としてＪＮＭ－ＥＣＳ４００（日本電子株式会社製）を用い、８５℃で測定を行い、白色個体の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを得た。得られた１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認され、コレステロール導入率は４４％であった。
　凍結乾燥品であるヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を１ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解し、以下に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図３Ａは、得られたクロマトグラムである。
（測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ
　温度：３０℃
［合成例１－２］
　合成例１－１と同様の手順により、ヒアルロン酸誘導体を合成した。
　生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認され、コレステロール導入率は４４％であった。上記合成例１－１に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行い、得られたクロマトグラムを図３Ｂに示す。
［合成例１－３］
　合成例１－１と同様の手順により、ヒアルロン酸誘導体を合成した。
　生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認され、コレステロール導入率は４４％であった。上記合成例１－１に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行い、得られたクロマトグラムを図３Ｃに示す。
［実施例１－１］
　合成例１－１で得たヒアルロン酸誘導体の分取を次のとおり行った。凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を５ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解し、透析カセット（フロータライザーＧ２、ＭＷＣＯ：３００,０００、家田貿易株式会社）に移し、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４に対して９回透析を行った。得られた透析内液のヒアルロン酸誘導体について、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図４Ａは、得られたクロマトグラムである。図２１及び図２２は、後述する面積比Ａ１／Ａ２及び距離の比Ｄａ／Ｄｂの算出方法を説明するために、実施例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体及び標準物質であるポリアクリル酸のクロマトグラムを重ねて示した図である。
　ろ液を所望の濃度まで限外濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ：１０,０００、ザルトリウス）にて濃縮した。
［実施例１－２］
　実施例１－１と同様の手順により、合成例１－２で得たヒアルロン酸誘導体の分取を行った。得られた透析内液のヒアルロン酸誘導体について、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図４Ｂは、得られたクロマトグラムである。
［実施例１－３］
　実施例１－１と同様の手順により、合成例１－３で得たヒアルロン酸誘導体の分取を行った。得られた透析内液のヒアルロン酸誘導体について、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図４Ｃは、得られたクロマトグラムである。
［比較例１－１］
　合成例１－１で得たヒアルロン酸誘導体の分取を次のとおり行った。凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を１０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解し、１００ｍＭリン酸緩衝液にて、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）となるように希釈した。その後、限外ろ過器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）２０、ＭＷＣＯ：３００,０００、ザルトリウス）にてろ過し、得られたろ液のヒアルロン酸誘導体について、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図５Ａは、得られたクロマトグラムである。ろ液を所望の濃度まで限外濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ：１０,０００、ザルトリウス）にて濃縮した。
［比較例１－２］
　比較例１－１と同様の手順により、合成例１－２で得たヒアルロン酸誘導体の分取を行った。得られたろ液のヒアルロン酸誘導体について、所望の濃度まで限外濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ：１０,０００、ザルトリウス）にて濃縮した。その後、１ｍｇ／ｍＬになるように注射用水で希釈し、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図５Ｂは、得られたクロマトグラムである。
［比較例１－３］
　比較例１－２と同様の手順により、合成例１－３で得たヒアルロン酸誘導体の分取を行った。得られたろ液のヒアルロン酸誘導体について、所望の濃度まで限外濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ：１０,０００、ザルトリウス）にて濃縮した。その後、１ｍｇ／ｍＬになるように注射用水で希釈し、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図５Ｃは、得られたクロマトグラムである。
［比較例１－４］
　コレステリル修飾プルラン（ＣＨＰ：日油社製，製品番号ＣＨＰ－８０Ｔ）の凍結乾燥体を１ｍｇ／ｍＬになるように注射用水に溶解し、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図５Ｄは、得られたクロマトグラムである。
［ヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布の評価：面積比Ａ１／Ａ２及び距離の比Ｄａ／Ｄｂ］
　実施例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体と標準物質であるポリアクリル酸のゲル浸透クロマトグラムから、面積比Ａ１／Ａ２及び距離の比Ｄａ／Ｄｂを算出した。
　標準物質であるポリアクリル酸（５０ｋＤａ）は、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製、ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＳＳ－Ｐａａ５０ｋ（ポリアクリル酸ナトリウム）を使用した。
　標準物質であるポリアクリル酸（１５０ｋＤａ）は、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製、ＯＲＤＥＲ　Ｎｏ．ＰＳＳ－Ｐａａ１５０ｋ（ポリアクリル酸ナトリウム）を使用した。
　標準物質ポリアクリル酸の粉末は２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように注射用水にて溶解させた。これ以降記載する標準物質であるポリアクリル酸は全て、Ｐоｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ－ＵＳＡ社製（ポリアクリル酸ナトリウム）のものを用いた。
　次に示す方法により、図２１に示すゲル浸透クロマトグラムから面積Ａ１及びＡ２を算出して、面積比Ａ１／Ａ２を計算した。
　（ｉ）まず、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムとの交点をＵｂ、前記屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線とベースラインとの交点をＢｂとした。ここで、屈折率強度極大点Ｋｂにおける溶出時間は７．４１分であった。
　（ｉｉ）次に、ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムにおいて、Ｕｂから終点までの曲線と、屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と、ベースラインで囲まれた面積値をＡ２とし、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムで始点から前記Ｕｂまでの曲線と、前記屈折率強度極大点Ｋｂから前記ベースラインＢへ引いた垂線と、ベースラインで囲まれた面積値をＡ１とした。
　次に示す方法により、図２２に示すゲル浸透クロマトグラムから距離Ｄａ及びＤｂを算出して、距離の比Ｄａ／Ｄｂを計算した。
　（ｉ）まず、標準物質である１５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ垂線を引き、ベースラインとの交点をＢａ、前記屈折率強度極大点Ｋａと前記Ｂａの間の長さをＬａとした。ここで、屈折率強度極大点Ｋａにおける溶出時間は６．４６分であった。
　（ｉｉ）次に、屈折率強度がＬａ／２０となるクロマトグラム上の２点のうち、溶出時間が早いほうを点Ｒ１とし、溶出時間が遅いほうを点Ｓ１とした。ここで、点Ｒ１における溶出時間は５．７４分であり、点Ｓ１における溶出時間は７．６８分であった。
　（ｉｉｉ）次に、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線とベースラインとの交点をＢｂとした。ここで、屈折率強度極大点Ｋｂにおける溶出時間は前記の通りである。
　（ｉｖ）次に、前記点Ｒ１と前記点Ｓ１を結んだ直線Ｄ１と、前記屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ引いた垂線との交点をＴａとし、前記屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と前記直線Ｄ１との交点をＴｂとした。
　（ｖ）最後に、前記点Ｒ１と前記Ｔａの距離をＤａ、前記Ｔａと前記Ｔｂの距離をＤｂとした。
　実施例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体と同様の方法で、合成例１－１～１－３、実施例１－２～１－３及び比較例１－１～１－４で得られた各ヒアルロン酸誘導体と標準物質であるポリアクリル酸のゲル浸透クロマトグラムから、面積比Ａ１／Ａ２及び距離の比Ｄａ／Ｄｂを算出した。
　算出された面積比Ａ１／Ａ２及び距離の比Ｄａ／Ｄｂを以下の表１に示す。なお、表１において、比較例３のコレステリル修飾プルラン（ＣＨＰ）の距離の比Ｄａ／ＤｂはＲＩの値が小さく、算出できなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表１に示すように、精製前の合成例１－１～１－３のヒアルロン酸誘導体に比べて、面積比Ａ１／Ａ２が高い実施例１－１～１－３のヒアルロン酸誘導体が得られた。
＜医薬組成物の製造＞
［実施例２－１］
　実施例１－１で得られたヒアルロン酸誘導体を５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にて希釈して調製した。
　一方、別の容器にて、蛍光標識ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）へ溶解させた。蛍光標識ペプチドはバイオロジカ社製のＮ末にフルオロセインが結合している次のアミノ酸配列を有する蛍光標識ペプチドを用いた。
　ＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴ（配列番号１）
　室温（２５℃程度）で、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液と蛍光標識ペプチドのＤＭＳＯ溶液を容量比で１００：１の割合で混合し、室温（２５℃程度）で２４時間攪拌することで、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）を、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物とスクロースとの合計質量に対して１０質量％スクロースとなるように添加して、室温（２５℃程度）で１時間以上攪拌した。スクロースが十分に溶解したことを確認して、１０質量％スクロース含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの濃度が約０．３ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）を用いて滅菌ろ過し、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０３１７質量部であった。
　合成例１－１に記載の方法で、ヒアルロン酸誘導体が１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈してゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行ったところ、ペプチド封入前後でヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムに大きな変化は認められなかった（図６Ａ）。この時、ペプチド濃度は０．１ｍｇ／ｍＬとなり、仕込みのペプチドが１００％封入できていることも確認された。
［実施例２－２］
　実施例１－２で得られたヒアルロン酸誘導体を用いて、実施例２－１と同様の手順により、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０４７８質量部であった。
　合成例１－１に記載の方法で、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行ったところ、ペプチド封入前後でヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムに大きな変化は認められなかった（図６Ｂ）。
［実施例２－３］
　実施例１－３で得られたヒアルロン酸誘導体を用いて、実施例２－１と同様の手順により、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０３０３質量部であった。
　合成例１－１に記載の方法で、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行ったところ、ペプチド封入前後でヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムに大きな変化は認められなかった（図６Ｃ）。
［比較例２－１］
　比較例１－１で取得したヒアルロン酸誘導体を５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にて希釈して調製した。
　一方、別の容器にて、蛍光標識ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯへ溶解させた。
　室温（２５℃程度）で、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液と蛍光標識ペプチドのジメチルスルホキシド溶液を容量比で１００：１の割合で混合し、室温（２５℃程度）で２４時間攪拌することで、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）を蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物とスクロースとの合計質量に対して１０質量％スクロースとなるように添加して、室温（２５℃程度）で１時間以上攪拌した。スクロースが十分に溶解したことを確認して、１０質量％スクロース含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０３０８質量部であった。
［比較例２－２］
　比較例１－２で取得したヒアルロン酸誘導体を用いて、比較例２－１と同様の手順により、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０３３２質量部であった。
［比較例２－３］
　比較例１－３で取得したヒアルロン酸誘導体を用いて、比較例２－１と同様の手順により、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０３４８質量部であった。
［比較例３］
　ＣＨＰ（日油社製，製品番号ＣＨＰ－８０Ｔ）の凍結乾燥体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように６Ｍ尿素含有リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４に溶解させた。
　一方、別の容器にて、蛍光標識ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシドへ溶解させた。
　室温（２５℃程度）で、上記６Ｍ尿素含有ＣＨＰ水溶液と蛍光標識ペプチドのジメチルスルホキシド溶液を容量比で１００：１の割合で混合し、室温（２５℃程度）で２４時間攪拌することで、蛍光標識ペプチド－ＣＨＰ複合体を含む組成物を得た。
　その後、透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｇ２　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ，　３．５Ｋ　ＭＷＣＯ，　１５ｍＬ，　Ｎｏ．８７７２４）に移し、０．６Ｍ尿素含有リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で透析した。続いて、０．０６Ｍ尿素含有リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４の順に透析を行った。さらに所望の濃度まで限外濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０、ＭＷＣＯ：１０,０００、ザルトリウス）にて濃縮した。
　最後に、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、蛍光標識ペプチド－ＣＨＰ複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０４２０質量部であった。
［比較例４－１］
　合成例１－１で取得したヒアルロン酸誘導体の凍結乾燥体を秤量し、５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように注射用水を添加し、一晩攪拌して十分に溶解させた。
　一方、別の容器にて、蛍光標識ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯへ溶解させた。
　室温（２５℃程度）で、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液と蛍光標識ペプチドのジメチルスルホキシド溶液を容量比で１００：１の割合で混合し、室温（２５℃程度）で２４時間攪拌することで、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）を蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物とスクロースとの合計質量に対して１０質量％スクロースとなるように添加して、室温（２５℃程度）で１時間以上攪拌した。スクロースが十分に溶解したことを確認して、１０質量％スクロース含有２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０３１６質量部であった。
［比較例４－２］
　合成例１－２で取得したヒアルロン酸誘導体の凍結乾燥体を用いて、比較例４－１と同様の手順により、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）を蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物とスクロースとの合計質量に対して１０質量％スクロースとなるように添加して、室温（２５℃程度）で１時間以上攪拌した。スクロースが十分に溶解したことを確認して、１０質量％スクロース含有３０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの濃度が０．３３ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物１００質量部に対する、蛍光標識ペプチドの含有量は０．０３５８質量部であった。
［蛍光標識ペプチド濃度の確認］
　以下の条件の高速液体クロマトグラフィー測定によって、実施例２－１～２－３及び比較例２－１～２－３、３、４－１、４－２の蛍光標識ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物において、蛍光標識ペプチドがヒアルロン酸誘導体に複合化されて可溶化していることを確認し、また、各医薬組成物中の蛍光標識ペプチドの濃度を提供した。
（測定条件）
　ＨＰＬＣ装置：日本分光ＨＰＬＣ－ＥＸＴＲＥＭＡ
　カラム：ＰＬＲＰ－Ｓ　１０００Ａ　８μｍ　長さ５０ｍｍ×内径４．６ｍｍ（アジレント・テクノロジー株式会社製、製品番号：ＰＬ１５１２－１８０２）
　カラム温度：４０℃
　移動相：（Ａ）０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
　　　　　（Ｂ）０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸／水
　流速：２ｍＬ／分
　注入量：３０μＬ
　検出器：ＵＶ（２１５ｎｍ）
　グラジエントプログラム：以下の表２に示す。表２中、「％」は「ｖ／ｖ％」を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［試験例１－１］
（リンパ節内ミエロイド細胞へのペプチドの取り込み及び活性化解析）
１．材料
　アジュバント：ＣｐＧオリゴＤＮＡ１６６８（味の素バイオファーマサービスジーンデザインから購入）
　投与した組成物：実施例２－１、比較例２－１，比較例３、及び比較例４－１の医薬組成物。
　評価に用いた蛍光標識抗体は以下のとおりである。全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄより購入した。
　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１標識抗マウスＦ４／８０抗体（クローンＢＭ８）；
　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　５１０標識抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（クローンＮ４１８）；
　ＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗マウスＸＣＲ１抗体（クローンＺＥＴ）；
　ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ８０抗体（クローン１６－１０Ａ１）；
　ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ８６抗体（クローンＧＬ－１）；
　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＣＤ１６／３２抗体（クローン９３）。
　なお、後述するＦＡＣＳ解析で用いた抗体の組み合わせは以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
２．解析方法
　蛍光（フルオロセイン）標識ペプチド濃度が０．３ｍｇ／ｍＬ程度となるように、実施例２－１、比較例２－１及び比較例４－１の医薬組成物を１０質量％スクロース１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で希釈し、また比較例３の医薬組成物をリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で希釈してから、各医薬組成物の希釈液をＢＡＬＢ／ｃマウスの右側後背部にペプチドとして各６０μｇとなるように皮下投与した。同時に、アジュバントとして、ＰＢＳに溶解した５０μｇのＣｐＧオリゴＤＮＡ１６６８（味の素バイオファーマサービスジーンデザイン）を投与した。
　投与から２０時間後に投与部位の所属リンパ節（右鼠径リンパ節）を採取し、スライドガラスを用いてリンパ節を磨砕後、細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。このとき、１群２匹分の細胞をプールした。遠心分離（４００×ｇ、５分間、４℃）後に上清を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２回洗浄後、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。細胞血球計を用いて細胞数を測定し、細胞濃度が１．２×１０７個／ｍＬになるよう調製した。
　９６穴Ｖ底マイクロプレート（ヌンク、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、１ウェルあたり６×１０５個となるように、細胞懸濁液５０μＬを添加した。細胞懸濁液を遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分間、４℃）し、上清を除去後、２００μＬの染色用バッファー（０．５ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）を用いて２回洗浄後懸濁した。遠心分離して上清を除去後、５０倍希釈した抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体を含む溶液５０μＬを添加し、４℃の暗所にて１０分間静置した。１５０μＬの染色用バッファーを加え、遠心分離して上清を除去後、さらに２００μＬの染色用バッファーで細胞を２回洗浄した。各抗体のメーカーが推奨する使用濃度に従い、上記表３に記載の組み合わせてとなるように、第１、第２、及び第３の抗体を含む溶液５０μＬを添加し混合後、４℃の暗所にて１５分間静置した。１５０μＬの染色用バッファーを加え、遠心分離して上清を除去後、さらに２００μＬの染色用バッファーで細胞を２回洗浄した。遠心分離して上清を除去後、２００μＬの染色用バッファーに再懸濁を行い、丸底ポリスチレンチューブ（ＢＤバイオサイエンス）へ移した。細胞はフローサイトメーターＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス）及び付属の解析ソフトウェア（ＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて解析した。
　樹状細胞（ＤＣ）はＣＤ１１ｃ陽性、マクロファージ（Ｍｐｈ）はＦ４／８０陽性、標準型１型ＤＣ（ｃＤＣ１）はＣＤ１１ｃ陽性且つＸＣＲ１陽性の集団として検出した。
　細胞種毎に、ＦＩＴＣ（フルオロセイン）陽性細胞を、ペプチド取り込み細胞として検出した。
　共刺激分子であるＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は、各細胞種におけるＦＩＴＣ陽性細胞に対して解析した。
　ＦＡＣＳ解析方法を図７Ａ～図７Ｆに示す。
　また、解析結果を表４－１～表４－３に示す。例えば、表４－１において、「ペプチド＋ＣＤ８０＋ＤＣ」は「ＣＤ８０を発現するペプチド取り込み樹状細胞（ＤＣ）」を意味し、「ペプチド＋ＣＤ８６＋ＤＣ」は「ＣＤ８６を発現するペプチド取り込み樹状細胞（ＤＣ）」を意味し、「ペプチド＋ＤＣ」は「ペプチド取り込み樹状細胞（ＤＣ）」を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表４－１～表４－３に示すように、実施例２－１の医薬組成物を投与したマウス群では、比較例２－１及び比較例４－１（分画前ヒアルロン酸誘導体）の医薬組成物を投与したマウス群よりも、マクロファージ及びＤＣ（特にｃＤＣ１）での共刺激分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の高発現が確認された。また、ＤＣ（特にｃＤＣ１）においては、実施例２－１の医薬組成物を投与したマウス群では、他の多糖（プルラン）の誘導体である比較例３の医薬組成物を投与したマウス群よりも、マクロファージ及びＤＣ（特にｃＤＣ１）での共刺激分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の高発現が確認された。
［試験例１－２］
　実施例２－２、比較例２－２、比較例４－２の医薬組成物を用いて、蛍光（フルオロセイン）標識ペプチド濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ程度となるように１０質量％スクロース１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で希釈し、ペプチドとして各４０μｇとなるように皮下投与した以外は、試験例１－１と同様の方法で実施した。解析結果を表５－１～表５－３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　試験例１－１と同様に、実施例２－２の医薬組成物を投与したマウス群では、比較例２－２及び比較例４－２（分画前ヒアルロン酸誘導体）の医薬組成物を投与したマウス群よりも、マクロファージ及びＤＣ（特にｃＤＣ１）での共刺激分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の高発現が確認された。比較例４－２はｃＤＣ１に対するＣＤ８０及びＣＤ８６の発現が比較的高いものの、マクロファージでのＣＤ８０及びＣＤ８６の発現が低く、実施例２－２の医薬組成物よりも劣っていた。
［試験例１－３］
　実施例２－３の医薬組成物を用い、ペプチドとして各４０μｇとなるように皮下投与した以外は、試験例１－１と同様の方法で実施した。解析結果を表６－１～表６－３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　試験例１－１及び試験例１－２と同様に、実施例２－３の医薬組成物を投与したマウス群では、マクロファージ及びＤＣ（特にｃＤＣ１）での共刺激分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）の高発現が確認された。
　ここで、マクロファージに対するＣＤ８６の発現が低下していると、免疫抑制に働く、或いは、働いていると報告されている（参考文献３：Taams LS et al., “Modulation of monocyte/macrophage function by human CD4+CD25+ regulatory T cells.”, Hum Immunol., Vol. 66, Issue 3, pp. 222-230, 2005.；参考文献４：Sansom DM et al., “What's the difference between CD80 and CD86?”, Trends in Immunology., Vol. 24, Issue 6, pp. 313-318, 2003.）。前記参考文献３の報告内容と上記試験例１－１～試験例１－３の結果によれば、ＤＣのみならずマクロファージでもＣＤ８６が強く発現している実施例２－１、実施例２－２及び実施例２－３の医薬組成物は、より強い免疫を誘導することが期待される。
　これらの結果から、本実施形態の医薬組成物を用いることで、ペプチド等の薬効成分を免疫細胞（特に、ｃＤＣ１、マクロファージ）に安定的且つ効率よく送達させ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができ、同時に、免疫細胞の活性（特に、ｃＤＣ１での共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現）を向上、促進、維持又は増強させたと推察される。
＜医薬組成物の製造条件の検討＞
［参考例１］
　合成例１－１で得たヒアルロン酸誘導体を用いて、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物の調製を行なった。
　ペプチドとしては、バイオロジカ社製の次のアミノ酸配列を有するｇｐ１００ＲＰ２ＲＰ１＿６Ｙペプチドを用いた。
　ＳＶＹＤＦＦＶＷＬＹＹＹＹＹＹＴＷＨＲＹＨＬＬＹＹＹＹＹＹＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号２）
　具体的には、まず、合成例１－１で得たヒアルロン酸誘導体の凍結乾燥体を秤量し、以下の表７の濃度になるように注射用水を添加し、一晩攪拌して十分に溶解させた。
　一方、別の容器にて、ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯへ溶解させた。
　溶解を確認した後に、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液に対して、１ｍｏＬ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（富士フイルム和光社製）を以下の表７に従い、添加した。
　室温（２５℃程度）で、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液とペプチドのジメチルスルホキシド溶液を以下の表７に記載の容量比で混合し、室温（２５℃程度）で２４時間攪拌することで、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。この時の溶液のｐＨも測定した。
（ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体の安定性：水溶液の外観）
　２４時間後のペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物（水溶液）の様子を目視で判断し、白濁しているか検証した。結果は以下の表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）をペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物とスクロースの合計質量に対して１０質量％スクロースとなるように添加して、室温（２５℃程度）で１時間以上攪拌した。続いて、１０質量％スクロース含有２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの理論濃度が０．３ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。この時のペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物中のペプチド濃度を上述の実施例２－１と同様な方法で定量し、結果を上記表７に示した。
（平均粒子径）
　以下に示す方法で製造したペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物について、以下条件で動的光散乱法（ＤＬＳ）による測定を行い、ｚ平均粒子径を得た。結果を上記表７に示す。
（測定条件）
　ＤＬＳ装置：大塚電子製、ＥＬＳＺ２０００
　セル：微量粒径セル
　温度：２５℃
　ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体の濃度：４．９５ｍｇ／ｍＬ
　上記表７に示すように、医薬組成物の製造において、混合溶液のｐＨを特定の範囲内に調整することで、ペプチド等の薬効成分とヒアルロン酸誘導体との複合体の粒子径を一定の範囲内に保ち、該複合体の溶液中での安定性を良好なものとできることが明らかとなった。
［参考例２－１～２－３］
　合成例１－１で得たヒアルロン酸誘導体、及び、参考例１とは異なるペプチドを用いて、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物の調製を行なった。
　ペプチドとしては、バイオロジカ社製の次のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた。
　ＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰ（配列番号３）
　具体的には、まず、合成例１－１で得たヒアルロン酸誘導体の凍結乾燥体を秤量し、以下の表８の濃度になるように注射用水を添加し、一晩攪拌して十分に溶解させた。
　一方、別の容器にて、ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯへ溶解させた。
　溶解を確認した後に、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液に対して、１ｍｏＬ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（富士フイルム和光社製）を以下の表８に従い、添加した。
　室温（２５℃程度）で、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液とペプチドのＤＭＳＯ溶液を以下の表８に従う容量比の割合で混合し、室温（２５℃程度）で２４時間攪拌することで、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。この時の溶液のｐＨも測定した。
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）を、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物とスクロースの合計質量に対して、１０質量％スクロースとなるように添加して、室温（２５℃程度）で１時間以上攪拌した。続いて、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。この時のペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物中のペプチド濃度を上述の実施例２－１と同様な方法で定量し、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物の平均粒子径を上述の参考例１と同様な方法で測定した。その結果を以下の表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　上記表８に示すように、参考例１とは異なるペプチドを用いた医薬組成物の製造においても、混合溶液のｐＨを特定の範囲内に調整することで、ペプチド等の薬効成分とヒアルロン酸誘導体との複合体の粒子径を一定の範囲内に保ち、該複合体の溶液中での安定性を良好なものとでき、医薬組成物中のペプチド濃度を高められることが明らかとなった。
＜適切な粒子サイズ分布を維持する製造条件＞
［試験例２－１～２－８］
　実施例１－１と同様な手法で分取したヒアルロン酸誘導体について、濃度５ｍｇ／ｍＬの水溶液を準備し、ヒアルロン酸誘導体を含有する水相と油相の混合比について詳細な検討を行った。
　５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体４００μＬに対し、下記表９に従って油相であるＤＭＳＯを混合させた。十分に混合した後、最終的なヒアルロン酸誘導体濃度が一定となるように注射用水を下記表９に従い添加する。さらに、２４時間室温（２５℃）でインキュベートした後に、以下に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行い、実施例１－１と同様の方法で面積比Ａ１／Ａ２を算出した（表９）。得られたゲル浸透クロマトグラムを図８に示す。
（測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ
　温度：３０℃
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
［試験例３－１～３－６］
　油相をＤＭＳＯではなく、エタノールを用いた以外は、前記試験例２－１～２－８と同じ方法で適切な粒子サイズ分布を維持する混合比率の検証を行った。ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行い、実施例１－１と同様の方法で面積比Ａ１／Ａ２を算出し、下記表１０に結果を示した。得られたゲル浸透クロマトグラムを図９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　試験例２－１～２－８および３－１～３－６の結果より、油相とヒアルロン酸誘導体の含有する水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００にする混合工程を経ることで薬効に優れるヒアルロン酸誘導体の粒子サイズを維持することができることがわかった。
［比較例５－１］
　重量平均分子量Ｍｗ（絶対分子量）が９８０ｋＤａのヒアルロン酸（キッコーマン社製）の粉末を、１ｍｇ／ｍＬとなるように注射用水へ溶解し、合成例１－１に示す同様の条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行い、得られたクロマトグラムを図１０に示す。
　さらに重量平均分子量Ｍｗ（絶対分子量）が９８０ｋＤａのヒアルロン酸の粉末を、１０ｍｇ／ｍＬとなるように注射用水へ溶解し、その後、５ｍｇ／ｍＬとになるように注射用水で希釈し、ヒアルロン酸水溶液を得た。
　一方、別の容器にて、抗原ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）へ溶解させ、抗原ペプチドのＤＭＳＯ溶液を得た。抗原ペプチドはバイオロジカ社製の次のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた。
　ＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴ（配列番号１）
　室温（２５℃程度）で、上記ヒアルロン酸水溶液と抗原ペプチドのＤＭＳＯ溶液を容量比で１００：１の割合で混合し、室温（２５℃程度）で２４時間攪拌することで、抗原ペプチド－ヒアルロン酸複合体の調製を試みた。得られた混合液は、図１１において「ヒアルロン酸（９８０ｋＤａ）」と記載された写真により確認されるように、白濁が認められ、抗原ペプチドが溶解せず、多量のペプチドが封入されていないことが示唆された。
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）を、ペプチド－ヒアルロン酸複合体を含む組成物とスクロースとの合計質量に対して１０質量％スクロースとなるように添加して、室温で１時間以上攪拌した。スクロースが十分に溶解したことを確認して、１０質量％スクロース含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの濃度が約０．３０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、ペプチド－ヒアルロン酸複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物中のペプチド含有量は実施例２－１と同様の方法で高速液体クロマトグラフィー測定によって定量した。その結果、医薬組成物中のペプチド含有量は検出限界未満であった。
［比較例５－２］
　重量平均分子量Ｍｗ（絶対分子量）が６５０ｋＤａのヒアルロン酸の粉末（キューピー社製）を１ｍｇ／ｍＬとなるように注射用水へ溶解し、合成例１－１に示す同様の条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行い、得られたゲル浸透クロマトグラムを図１２に示す。
　重量平均分子量Ｍｗ（絶対分子量）が６５０ｋＤａのヒアルロン酸の粉末を１０ｍｇ／ｍＬとなるように注射用水へ溶解し、５ｍｇ／ｍＬになるように注射用水で希釈してヒアルロン酸水溶液を得た。
　一方、別の容器にて、抗原ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）へ溶解させ抗原ペプチドのＤＭＳＯ溶液を得た。抗原ペプチドはバイオロジカ社製の次のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた。
　ＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴ（配列番号１）
　室温（２５℃程度）で、上記ヒアルロン酸水溶液と抗原ペプチドのＤＭＳＯ溶液を容量比で１００：１の割合で混合し、室温（２５℃程度）で２４時間攪拌することで、抗原ペプチド－ヒアルロン酸複合体の調製を試みた。得られた混合液は、図１１において「ヒアルロン酸（６４０ｋＤａ）」と記載された写真により確認されるように、白濁が認められ、抗原ペプチドが溶解せず、ペプチドが封入されていないことが示唆された。
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）を、ペプチド－ヒアルロン酸複合体を含む組成物とスクロースとの合計質量に対して１０質量％スクロースとなるように添加して、室温（２５℃程度）で１時間以上攪拌した。スクロースが十分に溶解したことを確認して、１０質量％スクロース含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの濃度が約０．３０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、ペプチド－ヒアルロン酸複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物中のペプチドの含有量は実施例２－１と同様の方法で高速液体クロマトグラフィー測定によって定量した。その結果、医薬組成物中のペプチド含有量は検出限界未満であった。
　比較例５－１、５－２の結果から、面積比Ａ１／Ａ２が０．９以上となる高分子量ヒアルロン酸においてはペプチドの封入が困難であり、ペプチド等の薬効成分を免疫細胞（特に、ｃＤＣ１、マクロファージ）に安定的且つ効率よく送達させ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることが困難であった。
＜感染症ワクチンとしての機能評価（外来性抗原に対する抗体産生評価）および免疫疾患治療用抗体体内産生機能評価＞
［試験例４］
［比較例６－１］
　合成例１－１と同様な方法で、ヒアルロン酸誘導体を合成した。分画は行わず、そのまま用いた。取得したヒアルロン酸誘導体の凍結乾燥体を秤量し、５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように注射用水を添加し、室温で一晩攪拌して十分に溶解させた。上記ヒアルロン酸誘導体水溶液について、１ｍｇ／ｍＬとなるように注射用水で５倍希釈してゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図１３は、得られたゲル浸透クロマトグラムである。また、実施例１－１等と同様な方法でヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布の評価を実施し、結果を下記表１１に示した。
［実施例６－１］
　合成例１－１と同様な方法で合成したヒアルロン酸誘導体を、実施例１－１と同様な方法で分画し、ヒアルロン酸誘導体を取得した。得られた透析内液のヒアルロン酸誘導体について、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図１４は、得られたゲル浸透クロマトグラムである。また、実施例１－１等と同様な方法でヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布の評価を実施し、結果を下記表１１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
＜医薬組成物の製造＞
［実施例６－１－１］
　実施例６－１で取得したヒアルロン酸誘導体水溶液におけるヒアルロン酸誘導体の濃度を、既知濃度のヒアルロン酸誘導体の面積値から算出すると、４．２８ｍｇ／ｍＬであった。
　別の容器にて、オボアルブミン（ＯＶＡ、富士フイルム和光純薬株式会社製低エンドトキシン品）の濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）（富士フイルム和光純薬株式会社製、製品番号：１６６－２３５５５）へ溶解させ、ＯＶＡ／ＰＢＳ溶液を得た。
　注射用水、ヒアルロン酸誘導体水溶液、ＯＶＡ／ＰＢＳ溶液の順で混合したのちに、１０％スクロース等張液となるようにスクロースを固体添加して清澄な溶液になるまで十分に室温で攪拌した。製剤中のＯＶＡ濃度は０．１５ｍｇ／ｍＬ、ヒアルロン酸誘導体濃度は３．０ｍｇ／ｍＬであり、１０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７．４）を含む１０％スクロース溶液とした。７５℃、１時間の加熱条件下でインキュベートし、ＯＶＡ－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。
［比較例６－１－１］
　比較例６－１で取得したヒアルロン酸誘導体水溶液を用い、実施例６－１－１と同様の方法でＯＶＡをヒアルロン酸誘導体に封入し、ＯＶＡ－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を得た。
［抗体産生試験］
　実施例６－１－１、比較例６－１－１で調製したＯＶＡ－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、ＯＶＡが２０μｇとなるように、０日目、７日目に皮下投与し、１０日目に血清を採取した。なお、ＯＶＡ－ヒアルロン酸誘導体複合体投与時にアジュバントであるＣｐＧ１８２６（製造元：ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ、製品コード：ｔｌｒｌ－１８２６－１）を５０μｇ皮下投与した。ＯＶＡに対する抗体価をＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社製、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ-ＯＶＡ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ-ＯＶＡ ＩｇＧ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ-ＯＶＡ ＩｇＧ２ａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）を用いて、添付のプロトコールに準じて測定した。血清の希釈倍率は１０、５０、２５０、１２５０、６２５０、３１２５０とした。
　Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ-ＯＶＡ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて算出したＩｇＧ抗体価（ＯＤ）を図１５、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ-ＯＶＡ ＩｇＧ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて算出したＩｇＧ１抗体価（ＯＤ）を図１６、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ-ＯＶＡ ＩｇＧ２ａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて算出したＩｇＧ２ａ抗体価（ＯＤ）を図１７に示す。希釈倍率１０における各抗体価を図１８Ａ（ＩｇＧ抗体価）、図１８Ｂ（ＩｇＧ１抗体価）および図１８Ｃ（ＩｇＧ２ａ抗体価）に示す。
　血清希釈が１２５０倍以上である場合には抗体価に差異はないが、希釈倍率がそれより低い場合には、実施例６－１－１のＯＶＡ－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物の方が、比較例６－１－１のＯＶＡ－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物よりも高い抗体価が得られることが確認された。これにより、実施例６－１のヒアルロン酸誘導体（Ａ１／Ａ２＝２．０３）は比較例６－１のヒアルロン酸誘導体（Ａ１／Ａ２＝０．８１）よりも、外来抗原に対する高い抗体産生能を有することが明らかとなり、治療用抗体の体内産生機能が高いことも示された。
　抗原を添加した成熟樹状細胞はＩＦＮ－γ産生Ｉ型ヘルパーＴ細胞の誘導を介して抗原特異的ＩｇＧ２ａ産生を亢進させると報告されている（参考文献５：Shigeharu Fujita et al., “Regulatory dendritic cells protect against allergic airway inflammation in a murine asthmatic model.”, J Allergy Clin Immunol 2008;121:95-104.）。前記参考文献５の報告内容と上記試験例４の結果によれば、実施例６－１－１のＯＶＡ－ヒアルロン酸誘導体を含む医薬組成物がＤＣの共刺激分子を活性化し、ＣＤ８０及びＣＤ８６が強く発現され、続く抗原特異的なＴ細胞の誘導とＩＦＮ－γ産生能を高めたことで、その結果、抗原特異的ＩｇＧ２ａ産生を亢進させたと推察される。よって、実施例６－１－１の医薬組成物は、液性免疫だけでなく、細胞性免疫も誘導し、感染症ワクチンとしてより強い免疫応答を誘導することが期待される。
　本実施形態の医薬組成物を用いることで、ペプチドだけでなく、タンパク抗原の薬効成分でも加熱条件下から保護し、適切な３次元構造を維持したままに免疫細胞（特に、ｃＤＣ１、マクロファージ）に安定的且つ効率よく送達させ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができ、同時に、免疫細胞の活性（特に、ｃＤＣ１での共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現）を向上、促進、維持又は増強させたと推察される。
　ヘルパーＴ細胞の活性化を促し、さらにＢ細胞の活性化・増大の促すことにより、エピトープに対する抗原が産生されたと推察される。
　前記第１～第３の実施形態のヒアルロン酸誘導体を用いることで、従来のヒアルロン酸誘導体を用いるよりも優れた外来抗原に対するワクチン（主に感染症ワクチン）を提供できると考えられる。同時に優れた治療用抗体誘導抗原を含む医薬品を提供できると考えられる。
＜がんワクチンとしての機能評価（ヒアルロン酸誘導体および抗原を含む投与組成物を用いたがんワクチン抗腫瘍試験）＞
［試験例５］
　面積比Ａ１／Ａ２の異なるヒアルロン酸誘導体のがんワクチンによる抗腫瘍効果について明らかにするため、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）抵抗性繊維肉腫細胞株ＣＭＳ５ａ担癌マウスを用いて、ＣＭＳ５ａに発現する変異型ＥＲＫ２抗原（ｍＥＲＫ２）のＣＤ８エピトープを含む長鎖ペプチド抗原と種々のヒアルロン酸誘導体を複合化した長鎖ペプチド抗原搭載ヒアルロン酸誘導体がんワクチンを作製し、治療効果を検討した。
　材料及び方法を以下に示す。
　（１）細胞
　ＲＰＭＩ１６４０培地（２－メルカプトエタノール添加）は細胞科学研究所から購入した。
　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＧｉｂｃｏから購入した。
　マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ細胞株はメモリアルスローンケタリングがん研究所より分譲され、三重大学で継代したものを用いた。マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ細胞株は、変異型ＥＲＫ２蛋白質を発現している。変異型ＥＲＫ２蛋白質の変異部分を含むペプチド（ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ（配列番号４））は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞に認識される。このペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が単離され、ＴＣＲを遺伝子導入したトランスジェニックマウス（ＤＵＣ１８マウス）が作出されている。
　（２）試験動物
　雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＤ９０．２陽性）は６週齢～８週齢のものを日本ＳＬＣから購入した。
　両マウスは三重大学先端科学研究支援センター動物実験施設にて飼育した。動物実験のプロトコールは、三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。
　（３）長鎖ペプチド抗原
　合成長鎖ペプチド抗原はシグマジェノシスから購入した。配列は次の通りであった。
ＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴ（配列番号１）。
　当該配列は、前記変異型ＥＲＫ２のＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として１６番目のＱから２４番目のＬまでの９個のアミノ酸配列（ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ（配列番号４））を、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープ配列として１３番目のＲから２９番目のＫまでの１７個のアミノ酸配列（ＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫ（配列番号５））を含む。
　当該長鎖ペプチド抗原と種々のヒアルロン酸誘導体を複合化した長鎖ペプチド抗原搭載ヒアルロン酸誘導体を、「長鎖ペプチド抗原搭載ＨＡナノゲルがんワクチン」又は「ＨＡナノゲルがんワクチン」と示すこともある。
［実施例７－１］
　比較例６－１で得たヒアルロン酸誘導体を次のとおり分画した。凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４１．３％）を５ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解し、透析カセット（フロータライザーＧ２、ＭＷＣＯ：３００,０００、家田貿易株式会社）に移し、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４に対して透析を行い、得られた透析内液のヒアルロン酸誘導体について、ゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図１９は、得られたゲル浸透クロマトグラムである。実施例１－１等と同様な方法で、ヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布の評価を実施した。結果を表１２に示す。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
＜医薬組成物の製造＞
［実施例７－１－１］
　実施例７－１で得られたヒアルロン酸誘導体水溶液中におけるヒアルロン酸誘導体の濃度を、既知濃度のヒアルロン酸誘導体の面積値から算出すると、３．８ｍｇ／ｍＬであった。
　一方、別の容器にて、抗原ペプチドの濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）へ溶解させ、抗原ペプチドのＤＭＳＯ溶液を得た。抗原ペプチドはバイオロジカ社製の次のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた。
　ＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴ（配列番号１） 
　室温（２５℃程度）で、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液と抗原ペプチドのＤＭＳＯ溶液をヒアルロン酸誘導体１００質量部に対して、ペプチド１０質量部となる比率で混合し、室温（２５℃程度）で２時間攪拌することで、抗原ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体の調製を試みた。この時の溶液の様子を目視で確認したところ、図１１において「ヒアルロン酸誘導体」と記載された写真により確認されるように、清澄な溶液が取得できた。このことから、ペプチドが確かに封入できていることが確認された。
　その後、固体の精製スクロース（富士フイルム和光社製、製造専用、製品番号１９８－１８３８５）を、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む組成物とスクロースとの合計質量に対して１０質量％スクロースとなるように添加して、室温（２５℃程度）で１時間以上攪拌した。スクロースが十分に溶解したことを確認して、１０質量％スクロース含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの濃度が約０．３０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、０．２μｍＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）（Ｐａｌｌ社製、アクロディスクシリンジフィルター、２５ｍｍΦ）で滅菌ろ過し、ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物を得た。医薬組成物中のペプチド含有量は実施例２－１と同様の方法で高速液体クロマトグラフィー測定によって定量した。その結果、医薬組成物１００質量部に対する、ペプチドの含有量は０．３８３質量部であった。さらに上記ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物が２５０μｇ／ｍＬのペプチド濃度となるように１０質量％スクロース含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で希釈して投与液の医薬組成物を得た。上記ペプチド－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む医薬組成物について、実施例１－１に記載の方法で、以下に示す測定条件でゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。図２０は、得られたゲル浸透クロマトグラムである。
（測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ
　温度：３０℃
［比較例７－１－１］
　実施例７－１－１で用いたペプチドを５０ｍｇ／ｍＬとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）へ溶解させた。１０質量％スクロース含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４にてペプチドの濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。
［試験例６］
腫瘍増殖試験
　Ｔ７５培養フラスコ（コーニング）を用い、マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ細胞株を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。培養した細胞は０．５％トリプシン含有ＰＢＳを用いて剥離し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。懸濁液を遠心分離（４００×ｇ、５分、４℃）した後に上清を除いた。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２回洗浄し、１×１０６個／１００μＬの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。１００μＬ／個体の用量でＢＡＬＢ／ｃマウスの右側前背部に皮下移植した（１群あたり５匹）。
　長鎖ペプチド抗原搭載ＨＡナノゲルがんワクチンを投与する際には、腫瘍移植７日後、１０日後、１３日後、及び１６日後に、長鎖ペプチド抗原搭載ＨＡナノゲルがんワクチン５０μｇを、ＰＢＳに溶解した５０μｇのＣｐＧオリゴＤＮＡ（味の素バイオファーマサービスジーンデザイン）と共にマウスの右側後背部に皮下投与した。その後、経時的に腫瘍面積を測定した。
　比較例７－１－１の長鎖ペプチド抗原を投与する際にも、腫瘍移植７日後、１０日後、１３日後、及び１６日後に、長鎖ペプチド５０μｇを、ＰＢＳに溶解した５０μｇのＣｐＧオリゴＤＮＡ（味の素バイオファーマサービスジーンデザイン）と共にマウスの右側後背部に皮下投与した。その後、経時的に腫瘍面積を測定した。
　経時的な腫瘍面積値（平均値）を図２３に示す。
　実施例７－１のヒアルロン酸誘導体（Ａ１／Ａ２＝６．６２）と前記長鎖ペプチド抗原とを複合化して得た長鎖ペプチド抗原搭載ＨＡナノゲルがんワクチンとＣｐＧオリゴＤＮＡを組み合わせた医薬組成物は、比較例７－１の前記長鎖ペプチド抗原とＣｐＧオリゴＤＮＡを組み合わせた医薬組成物よりも、ＣＭＳ５ａ腫瘍の増殖を抑制することが明らかとなった。このことからＡ１／Ａ２＝６．６２であるヒアルロン酸誘導体を用いることで、優れたがんワクチンを提供できると考えられる。
＜サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるピークトップ（屈折率強度極大点）の保持時間の免疫細胞活性化およびワクチン機能への影響）＞
［試験例７］
［ヒアルロン酸誘導体の粒子サイズ分布におけるピークトップの保持時間比］
　合成例１－１～１－３、実施例１－１～１－３、６－１、７－１、及び、比較例１－１～１－３、６－１、７－１、７－２で得たヒアルロン酸誘導体と、標準物質であるポリアクリル酸（５０ｋＤａ）について、実施例１－１に記載の方法にてサンプルを調製し、以下に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行った。
（測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ
　温度：３０℃ 
　合成例１－１～１－３、実施例１－１～１－３、６－１、７－１、及び、比較例１－１～１－３、６－１、７－１、７－２で得たヒアルロン酸誘導体のピークトップ保持時間Ｐｔと、標準物質であるポリアクリル酸（５０ｋＤａ）のピークトップ保持時間Ｐｒを下記表１３に示す。また、ヒアルロン酸誘導体のピークトップ保持時間Ｐｔと標準物質であるポリアクリル酸（５０ｋＤａ）のピークトップ保持時間Ｐｒの比である、Ｐｔ／Ｐｒを算出し、下記表１３に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　ヒアルロン酸誘導体のピークトップ保持時間Ｐｔが標準物質であるポリアクリル酸（５０ｋＤａ）におけるピークトップ保持時間Ｐｒよりも短い会合粒子サイズの場合に、共刺激分子の活性化に優れる会合体サイズがより多く存在し、本実施形態の医薬組成物を用いることで、ペプチドやタンパクの薬効成分を免疫細胞（特に、ｃＤＣ１、マクロファージ）に安定的且つ効率よく送達させ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができ、同時に、免疫細胞の活性（特に、ｃＤＣ１での共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現）を向上、促進、維持又は増強させたと推察される。
＜ＧＰＣ－ＳＥＣによる平均分子量（ポリアクリル酸換算）の免疫細胞活性化およびワクチン機能への影響＞
［試験例８］
　合成例１－１～１－３、実施例１－１～１－３、６－１、７－１、及び、比較例１－１～１－３、６－１で得たヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）（ポリアクリル酸換算）を以下の条件で測定を行った。ポリアクリル酸を標準物質として、検量線を作成し、合成例１－１～１－３、実施例１－１～１－３、６－１、７－１、及び、比較例１―１～１－３、６－１で得たヒアルロン酸誘導体のポリアクリル酸を基準とした各分子量を算出した。前記ポリアクリル酸標準物質としてはＰＳＳ－Ｐａａ２ｋ（２ｋＤａ）、４ｋ（４ｋＤａ）、８ｋ（８ｋＤａ）、１８ｋ（１８ｋＤａ）、４０ｋ（４０ｋＤａ）、１５０ｋ（１５０ｋＤａ）（ＰＳＳ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｅｒｖｉｃｅ　ＧｍｂＨ社製（ポリアクリル酸ナトリウム））を用いた。結果を表１４に示す。
（測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ
　サンプル濃度：合成例、実施例、比較例で得たヒアルロン酸誘導体は１ｍｇ／ｍｌ、ポリアクリル酸標準物質は２ｍｇ／ｍｌ
　検量線条件：近似式として３次：Ａｔ３＋Ｂｔ２＋Ｃｔ＋Ｄを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　ポリアクリル酸を標準物質として算出したヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量Ｍｗ（ポリアクリル酸換算）が１１万以上を満たす場合には、共刺激分子の活性化に優れる会合体サイズがより多く存在し、本実施形態の医薬組成物を用いることで、ペプチド等の薬効成分を免疫細胞（特に、ｃＤＣ１、マクロファージ）に安定的且つ効率よく送達させ、さらに、該薬効成分の免疫細胞への取り込みを向上、促進、又は増強させることができ、同時に、免疫細胞の活性（特に、ｃＤＣ１での共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現）を向上、促進、維持又は増強させたと推察される。
＜ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）による分取方法＞
［実施例８］
　分取方法は透析膜を用いた分画方法だけに限らない。
　合成例１－１で取得したヒアルロン酸誘導体を２０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解し、以下に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる分取を行う。例えば、０．１分おきに分取する。
（測定条件）
　装置：ＨＩＴＡＣＨＩ，　ＣＨＲＯＭＡＳＴＥＲ
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８ｍｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
ガードカラム：ＴＳＫＧＥＬ　ＧＵＡＲＤＣＯＬＵＭＮ　ＳＷＸＬ　（６．０ｍｍ　Ｉ．Ｄ．Ｘ　４ＣＭ）
　溶離液：１０ｍｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：１００ｍＬ
　検出器：ＲＩ
　分取後、合成例１－１に記載の方法でＧＰＣ分析し、面積比Ａ１／Ａ２が０．９０以上の画分であることを確認し、目的のヒアルロン酸誘導体を得る。
＜適切な粒子サイズ分布を維持する医薬組成物の製造条件＞
［実施例９－１～９－４、比較例９－１～９－４］
　実施例１－１と同様な手法で分取したヒアルロン酸誘導体について、濃度５ｍｇ／ｍＬの水溶液を準備し、ヒアルロン酸誘導体を含有する水相と油相の混合比について詳細な検討を行った。
　６ｍLのクリーンバイアルに、ペプチド薬物であるシクロスポリン（東京化成工業社製、製品番号：Ｃ２４０８）を秤量し、ペプチドが５０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＤＭＳＯ（富士フイルム和光社製、製品番号：０４５－２４５１１）へ溶解させた。
　続いて、５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体４００μＬに対し、薬物を含有した油相である５０ｍｇ／ｍＬのシクロスポリンを４μL添加した。その後、下記表１５に従って油相ＤＭＳＯを混合させた。十分に混合した後、最終的なヒアルロン酸誘導体濃度が一定となるように注射用水を下記表１５に従い添加する。さらに、２４時間、室温（２５℃）でインキュベートした後に、以下に示す条件にてゲル浸透クロマトグラフィーによる測定を行い、実施例１－１と同様の方法で面積比Ａ１／Ａ２を算出した（表１５）。
（測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ
　温度：３０℃
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　実施例９－１～９－４および比較例９－１～９－４の結果より、油相とヒアルロン酸誘導体の含有する水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００にする混合工程を経ることで薬効に優れるヒアルロン酸誘導体の粒子サイズを維持することができることがわかった。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体によれば、薬効成分と製剤化した際のリンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能に優れるヒアルロン酸誘導体を提供することができる。本実施形態の医薬組成物は、前記ヒアルロン酸誘導体を含み、リンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能に優れる。本実施形態の医薬組成物の製造方法は、前記ヒアルロン酸誘導体を用いており、リンパ節内の免疫細胞への送達性及び該免疫細胞の活性化能に優れる医薬組成物が得られる。

Claims (16)

  1. 　ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、
    　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、以下に示す方法により算出される面積Ａ１とＡ２の比Ａ１／Ａ２が０．９０以上である、ヒアルロン酸誘導体。
    　（ｉ）標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムとの交点をＵｂとする；
    　（ｉｉ）前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムで前記Ｕｂから終点までの曲線と、前記屈折率強度極大点Ｋｂから前記ベースラインＢへ引いた垂線と、ベースラインで囲まれた面積値をＡ２とし、前記ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムで始点から前記Ｕｂまでの曲線と、前記屈折率強度極大点Ｋｂから前記ベースラインＢへ引いた垂線と、ベースラインで囲まれた面積値をＡ１とする。
  2. 　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、以下に示す方法により算出される距離ＤａとＤｂの比Ｄａ／Ｄｂが０．００超１．２０以下である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
    　（ｉ）標準物質である１５０ｋＤａのポリアクリル酸のクロマトグラム上の屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ垂線を引き、ベースラインとの交点をＢａ、前記屈折率強度極大点Ｋａと前記Ｂａの間の長さをＬａとする；
    　（ｉｉ）屈折率強度がＬａ／２０となるクロマトグラム上の２点のうち、溶出時間が早いほうを点Ｒ１とし、溶出時間が遅いほうを点Ｓ１とする；
    　（ｉｖ）前記点Ｒ１と前記点Ｓ１を結んだ直線Ｄ１と、前記屈折率強度極大点ＫａからベースラインＢへ引いた垂線との交点をＴａとし、前記屈折率強度極大点ＫｂからベースラインＢへ引いた垂線と前記直線Ｄ１との交点をＴｂとする；
    　（ｖ）前記点Ｒ１と前記Ｔａの距離をＤａ、前記Ｔａと前記Ｔｂの距離をＤｂとする。
  3. 　前記面積Ａ１とＡ２の比Ａ１／Ａ２が１．７０以上である、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体。
  4. 　ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、
    　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから算出される、標準物質である５０ｋＤａのポリアクリル酸の屈折率強度極大点における保持時間Ｐｒに対する、ヒアルロン酸誘導体の屈折率強度極大点における保持時間Ｐｔの比Ｐｔ／Ｐｒが０．５以上１．０未満である、ヒアルロン酸誘導体。
  5. 　ステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体であって、
    　ゲル浸透クロマトグラフィー測定により求められるクロマトグラムから、各分子量が２ｋＤａ、４ｋＤａ、８ｋＤａ、１８ｋＤａ、４０ｋＤａ、および１５０ｋＤａであるポリアクリル酸を標準物質として作成した検量線に基づき算出されるヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量が１１万以上５０万未満である、ヒアルロン酸誘導体。
  6. 　前記ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有する、請求項１、４又は５に記載のヒアルロン酸誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
    　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
    　Ｘ１は、以下の式：
    　－ＮＲｂ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
    　－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－Ｓ－Ｒ、
    　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
    　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
    　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
    で表される基からなる群より選択される基であり；
    　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒは、ステリル基であり；
    　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
    　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
    　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
  7. 　前記ステリル基がコレステリル基である、請求項１、４又は５に記載のヒアルロン酸誘導体。
  8. 　前記ヒアルロン酸誘導体を構成する二糖の繰り返し単位に対する、ステリル基の導入率が、３０％以上６０％以下である、請求項１、４又は５に記載のヒアルロン酸誘導体。
  9. 　前記ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）が４，０００以上１，０００，０００以下である、請求項１、４又は５に記載のヒアルロン酸誘導体。
  10. 　前記ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量（絶対分子量）が５，０００以上２５，０００以下である、請求項９に記載のヒアルロン酸誘導体。
  11. 　請求項１、４又は５に記載のヒアルロン酸誘導体と、薬効成分と、を含有する、医薬組成物。
  12. 　がん、感染症、及び免疫疾患からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防又は治療用である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　前記薬効成分として、がん抗原、感染症由来抗原、及び免疫疾患における自己抗原からなる群から選択される少なくとも一つを含み、且つ、アジュバントを更に含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 　前記薬効成分として、がん抗原又は感染症由来抗原を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　請求項１、４又は５に記載のヒアルロン酸誘導体と、薬効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、
    　前記薬効成分を有機溶媒又は有機溶媒含有水に溶解して、前記薬効成分を含有する油相を調製する調製工程と、
    　前記油相と前記ヒアルロン酸誘導体を含有する水相との混合比が容量比で２０：１００～０．０１：１００となるように混合する混合工程と、
    を含む、医薬組成物の製造方法。
  16. 　前記ヒアルロン酸誘導体を含有する水相のｐＨが６．００以上１１．００以下である、請求項１５に記載の医薬組成物の製造方法。
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Free format text: APRESENTE NOVAS FOLHAS DO RELATORIO DESCRITIVO E RESUMO ADAPTADAS AOS ARTS. 26 E 40 DA PORTARIA NO 14/2024, UMA VEZ QUE O CONTEUDO ENVIADO NA PETICAO NO 870240097885 ENCONTRA-SE FORA DA NORMA: OS DOCUMENTOS DEVEM SER INICIADOS PELO TITULO CENTRALIZADO SEM O USO DE PALAVRAS ADICIONAIS (RELATORIO DESCRITIVO DE?, PATENTE DE INVENCAO...). A EXIGENCIA DEVE SER RESPONDIDA EM ATE 60 (SESSENTA) DIAS DE SUA PUBLICACAO E DEVE SER REALIZADA POR MEIO DA PETICAO GRU CODIGO DE SERVICO 207.

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