WO2023237800A1 - Método de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis Download PDF

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genetic
fibrosis
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Izarbe YARZA
David CELORRIO
Jose M. AZNAR
Cristina JORQUERA
Pello SÁNCHEZ
Maider BEITIA
Diego DELGADO
Mikel SÁNCHEZ
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Santxa Research SLU
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Baigene SL
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention is related to an in vitro method for obtaining data useful for predicting a subject's risk of suffering from fibrosis, falling within the field of Personalized Medicine. Specifically, this method is based on the analysis of a series of genetic polymorphisms, as well as other environmental data of the subject, which together are useful and allow the prediction of the risk of a subject developing fibrosis.
  • Fibrosis in general terms refers to an abnormal growth and accumulation of components of the extracellular matrix, which causes hardening or fibrosing of tissue, resulting in a partial or total loss of function of the affected tissue or organ. Fibrotic disease comprises a wide range of clinical pathologies that are estimated to be responsible for 45% of all deaths in the developed world.
  • Fibrotic pathologies can affect a large number of different organs and tissues, however, it is believed that their generation pathways are common in any organ.
  • fibrotic pathology can occur after a surgical intervention. This condition, called postsurgical fibrosis, is characterized by an excessive proliferation of fibrotic and scar tissue generated after a surgical intervention in a patient, forming more fibrous tissue than necessary, which which usually has a negative impact on their quality of life.
  • Fibrosis appears very frequently at the joint level, which leads to the development of arthrofibrosis, with the consequent hardening or pathological stiffening of a joint due to an exaggerated fibrotic response.
  • the appearance of fibrosis is a complication to take into account in joint surgical interventions due to its incidence: ranging between 1 and 15% of patients affected in knee arthroplasties, and between 4 and 38%. in anterior cruciate ligament reconstruction.
  • Patent application EP2428583A1 describes a method for determining the progress of the healing process of a subject, which comprises determining the level of expression of at least one gene selected from the genes TFAP2A, EGFR, ILIA, IL1 B, IL6, IL10 , IL18, CD44, TNFRSF1A, HSPD1, MYC, CTGF, MMP7, MMP2, MMP9, MMP25, TGFA, TGFB2, EREG, FN1, HBEGF, NF1, SRC, EGF4, CDKN2A, PLAU, SPP1, ITGB2, BAX, MET and PPAR , or a functionally equivalent variant of said genes, in a sample from said subject.
  • ES2422874B1 an in vitro method is described for the prognosis and/or diagnosis of severe liver fibrosis that is characterized by the detection of a series of genetic polymorphisms and the determination of clinical variables.
  • CA2805267A1 a method is described that comprises measuring the level of cadherin-11 in a sample obtained from a subject, and its comparison with control values, where a level of cadherin-11 in the sample obtained from the subject greater than the control value indicates fibrosis or risk of developing fibrosis.
  • the present invention discloses a method for obtaining data useful in vitro to predict the risk of a subject of suffering from a fibrosis process.
  • the inventors are based on the use of environmental variables (degree of obesity, use or not of platelet-rich plasma, and additionally data related to the variables, area susceptible to fibrosis and/or sex of the subject) together with genetic variables that include the analysis of one or several genetic polymorphisms of the MMP3, NEDD4, SMAD4 genes, as well as their combinations with polymorphisms of the IL6R, CTGF, IL-6, BMP4 genes, the application of an algorithm that takes into account
  • the above variables allow us to obtain a value of a subject's risk of generating fibrosis.
  • the algorithm of the invention takes into account genetic and environmental variables jointly, which allow calculating a specific risk value for each subject.
  • the present invention thus provides an innovative approach in the area of Personalized Medicine with multiple associated advantages: it allows obtaining useful data to know a patient's risk of suffering from fibrosis with high sensitivity and specificity; It allows decisions or preventive measures to be taken that can avoid said condition, which in the event that the patient is going to undergo surgery, can in turn facilitate a correct recovery and/or future interventions to eliminate the fibrosis generated. In addition, it may also be useful when guiding the application of certain preventive treatments based on the risk identified in the patient, such as, for example, adjusting the diet or applying preoperative physiotherapy, oral pharmacology or alternative surgical techniques, which avoid the generation of fibrosis. Likewise, it allows us to know a patient's risk of suffering from post-surgical fibrosis before undergoing surgery. Method of invention
  • the present invention refers to an in vitro method for obtaining data useful for predicting the risk of suffering from fibrosis of a subject, hereinafter "the method of the invention", which comprises the following steps:
  • (b) collect data from the subject on at least one environmental variable, selected from the list that consists of: use or non-use of platelet-rich plasma in the treatment of the subject and degree of obesity;
  • step (c) assign a p value to the genetic polymorphisms analyzed in step (a) according to Table 3, and assign a value to the data collected from the subject in step (b) according to Table 3;
  • Po 3.256 pix is the sum of all p values assigned in step (c).
  • in vitro refers to the method of the invention being carried out outside the subject's body.
  • fibrosis refers to a process typical of vascularized connective tissue, in which plasma and circulating and resident cells of the connective tissue participate, highlighting mediators of inflammation, granulocytes, macrophages, platelets and endothelial cells, in addition to fibroblasts and myofibroblasts among others.
  • fibrosis is characterized by the proliferation of fibroblasts, cells abundant in the connective tissue that secretes compounds such as collagen and proteoglycans.
  • myofibroblasts also play a very important role during inflammation, repair and healing. As used here, it refers to a pathological increase in connective tissue in some organ or tissue.
  • healing refers to a natural process that the body of a subject who has suffered a wound has to regenerate the tissues involved in it. In this process, a series of complex biochemical phenomena are carried out that take place to repair the damage caused by the wound.
  • the healing process of the present invention refers to, but is not limited to, any type of healing of a wound caused in the human body, including wounds from post-surgical processes.
  • keloids refers to pathological scars produced by an aberrant and overly exuberant wound healing response. Keloids are raised scars that extend beyond the margins of an original wound and invade the normal skin surrounding the wound site. Keloids may continue to grow over time and may not subside spontaneously. It can be considered that a keloid lesion is made up of several different parts that can present very different biological activity from each other.
  • the central part of a mature keloid lesion (the intra-lesional portion) is largely acellular, while the peripheral part of the lesion (the peh-lesional portion) is relatively more cellular and is the site of greatest angiogenic activity.
  • the phrase "predict the risk of suffering from fibrosis in a subject” refers to determining or predicting the probability of a subject to suffer from said condition.
  • obtaining data useful for this prediction comprises the application of an algorithm that takes into account environmental and genetic variables, in particular, genetic polymorphisms.
  • the algorithm of the method of the invention is considered predictive when the AUCROC (AUC-Area UnderCurve or area under the curve; ROC-Receiver Operating Characteristic) is greater than 0.5.
  • AUCROC AUC-Area UnderCurve or area under the curve; ROC-Receiver Operating Characteristic
  • the AUCROC is defined as the probability of correctly classifying a pair of case and control individuals, selected at random from the population, through the results or values obtained when applying the algorithm.
  • the AUCROC by convention is between 0.5 and 1: the closer the ALICROC value of a variable is to 1, the more precise and predictive it is considered.
  • the sensitivity of the diagnostic test is the probability of obtaining a positive result when the individual has the disease or condition, in the present invention, fibrosis.
  • the specificity of a test indicates the probability of obtaining a negative result when the individual does not have the disease or condition, in the present invention, does not develop or suffer from fibrosis.
  • subject in the present invention refers to any individual susceptible to suffering from fibrosis, or to any individual who is interested in knowing the risk of suffering from said condition.
  • patient or “subject” are used interchangeably herein.
  • fibrosis can affect any organ or tissue of the subject.
  • the fibrosis affects a joint. More preferably, the fibrosis affects a joint, where the joint is selected from the list consisting of knee, ankle, hip, shoulder and elbow.
  • the method of the invention also allows predicting a subject's risk of suffering from post-surgical fibrosis prior to undergoing surgery.
  • the subject is to undergo surgery.
  • the surgery to which the subject is to undergo is performed on a joint.
  • joints include, but are not limited to, knee, ankle, hip, shoulder and elbow.
  • the joint is selected from the list consisting of knee, ankle, hip, shoulder and elbow.
  • the fibrosis is postsurgical fibrosis.
  • post-surgical fibrosis refers to the process of fibrosis in response to surgery (or surgical intervention, terms used interchangeably in the present document) that includes a secondary healing process. As used here, it is used to refer to a condition that includes excessive secondary scarring produced after a surgical intervention, forming more fibrous tissue than necessary causing unwanted effects that can complicate the patient's recovery. Examples of unwanted effects related to said post-surgical fibrosis include, but are not limited to, the compression of a nerve due to the excessive scar, which causes pain to the patient, affecting the patient's recovery and quality of life, or the restriction in the range of movement of a joint after surgical intervention.
  • post-surgical fibrosis mostly appears at the joint level, which leads to the development of arthrofibrosis, with the consequent hardening or pathological stiffening of a joint due to an exaggerated fibrotic response. This can arise in large joints such as shoulders, elbows, hips and knees, and generally causes loss of function and immobility of these joints.
  • postsurgical fibrosis occurs in a joint.
  • the joint is selected from the list consisting of shoulder, elbow, hip and knee.
  • a first step of the method of the invention comprises analyzing in a biological sample isolated from the subject, at least one genetic polymorphism selected from the list consisting of rs679620 of the MMP3 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene, rs12456284 of the gene SMAD4, and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms;
  • genetic polymorphism refers to a variation in the nucleotide sequence of the deoxyribonucleic acid (DNA) chain that has at least a frequency of 1% in individuals in a population. Genetic polymorphisms can be variations of one or more nucleotides. Single nucleotide polymorphisms, or SNPs, generally give rise to two alleles.
  • polynucleotide refers to a polymeric form of nucleotides of any length, which may or may not be chemically or biochemically modified.
  • the genetic polymorphism rs679620 of the MMP3 gene refers to a SNP located at position 102842889 of chromosome 11 of homo sapiens (GenBank accession number of the sequence of chromosome 11 of homo sap/ens:NC_000011.10). Genotypes can be homozygous for adenine (A:A), heterozygous adenine:guanine (A:G) or homozygous for guanine (G:G).
  • the genetic polymorphism rs8032158 of the NEDD4 gene refers to a SNP located at position 55902679 of chromosome 15 of homo sapiens (GenBank accession number of the sequence of chromosome 15 of homo sapiens. NC_000015.10). Genotypes can be homozygous for cytosine (C:C), heterozygous cytosine:thymine (C:T) or homozygous for thymine (T:T).
  • the genetic polymorphism rs12456284 of the SMAD4 gene refers to a SNP located at position 51083598 of chromosome 18 of homo sapiens (GenBank accession number of the sequence of chromosome 18 of homo sapiens. NC_000018.10). Genotypes can be homozygous for adenine (A:A), heterozygous adenine:guanine (A:G) or homozygous for guanine (G:G).
  • step (a) comprises analyzing at least two genetic polymorphisms selected from the list consisting of rs679620 of the gene MMP3 rs8032158 of the NEDD4 gene, rs12456284 of the SMAD4 gene, and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms.
  • step (a) comprises analyzing the genetic polymorphism rs12456284 of the SMAD4 gene and the genetic polymorphism rs679620 of the MMP3 gene.
  • step (a) comprises analyzing the genetic polymorphism rs8032158 of the NEDD4 gene and the genetic polymorphism rs12456284 of the SMAD4 gene.
  • step (a) comprises analyzing the genetic polymorphism rs8032158 of the NEDD4 gene and the genetic polymorphism rs679620 of the MMP3 gene.
  • step (a) comprises analyzing at least three genetic polymorphisms selected from the list consisting of rs679620 of the MMP3 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene, rs12456284 of the SMAD4 gene. , and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms.
  • step (a) comprises analyzing three genetic polymorphisms selected from the list consisting of rs8032158 of the NEDD4 gene, rs12456284 of the SMAD4 gene, rs679620 of the MMP3 gene, and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms.
  • the genetic polymorphisms are rs8032158 of the NEDD4 gene, rs12456284 of the SMAD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene.
  • step (a) of the method of the invention may comprise analyzing at least one genetic polymorphism selected from the list consisting of, rs2228145 of the IL6R gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the gene BMP4, and/or any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms.
  • the genetic polymorphism rs2228145 of the IL6R gene refers to a SNP located at position 154454494 of chromosome 1 of homo sapiens (GenBank accession number of the sequence of chromosome 1 of homo sapiens. NC_000001.11). Genotypes can be homozygous for adenine (A:A), heterozygous adenine:cytosine (A:C) or homozygous for cytosine (C:C).
  • the genetic polymorphism rs9493150 of the CTGF gene refers to a SNP located at position 131952851 of chromosome 6 of homo sapiens (GenBank accession number of the sequence of chromosome 6 of homo sapiens. NC_000006.12). Genotypes can be homozygous for cytosine (C:C), heterozygous cytosine:guanine (C:G) or homozygous for guanine (G:G).
  • the genetic polymorphism rs1800796 of the IL-6 gene refers to a SNP located at position 22726627 of chromosome 7 of homo sapiens (GenBank accession number of the sequence of chromosome 7 of homo sapiens. NC_000007.14). Genotypes can be homozygous for cytosine (C:C), heterozygous cytosine:guanine (C:G) or homozygous for guanine (G:G).
  • the genetic polymorphism rs17563 of the BMP4 gene refers to a SNP located at position 53950804 of chromosome 14 of homo sapiens (GenBank accession number of the sequence of chromosome 14 of homo sapiens. NC_000014.9). Genotypes can be homozygous for cytosine (C:C), heterozygous cytosine:thymine (C:T) or homozygous for thymine (T:T).
  • step (a) further comprises analyzing at least one genetic polymorphism selected from the list consisting of rs2228145 of the IL6R gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms.
  • step (a) further comprises analyzing at least two, at least three, at least four, genetic polymorphisms selected from the list that consists of rs2228145 of the IL6R gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms, including any combination thereof.
  • step (a) comprises analyzing at least 7 genetic polymorphisms selected from a list consisting of rs2228145 of the IL6R gene, rs679620 of the MMP3 gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene, and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms, including any combination of the same..
  • step (a) comprises analyzing the genetic polymorphisms rs2228145 of the IL6R gene, rs679620 of the MMP3 gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the gene IL-6, rs17563 of the BMP4 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene.
  • polymorphisms of the invention is used to refer to at least one genetic polymorphism selected from among the polymorphisms rs679620 of the MMP3 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene, rs12456284 of the SMAD4 gene, any other polymorphism that is in disequilibrium of linkage with said genetic polymorphisms, and/or to any combination of one or more of the previous genetic polymorphisms with at least one genetic polymorphism selected from among rs2228145 of the IL6R gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, and rs17563 of the BMP4 gene, including any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with them
  • the genetic polymorphisms are SNPs, so the terms polymorphisms of the invention and SNPs of the invention can be used interchangeably throughout the document.
  • the genetic polymorphisms that can be analyzed as part of the method of the present invention, and that are useful in predicting a subject's risk of suffering from fibrosis, are shown in Table 1.
  • Table 1 Genetic polymorphisms that can be included as genotypic variables within the prediction model.
  • linkage disequilibrium refers to the property of some genes or DNA markers of not segregating independently, that is, they have a recombination frequency of less than 50%. This is usually due to the fact that the two loci involved are located on the same chromosome, which makes it impossible to transfer them to the progeny in a random manner with the separation of the chromosomes in anaphase. In the present invention, it refers to those genetic polymorphisms that, due to their physical proximity on a chromosome, occur together more frequently than would be expected by chance.
  • a genetic polymorphism that is in linkage disequilibrium with another presents the same capacity or gives equivalent information, in the present invention, relative to the prediction of a subject's risk of suffering from fibrosis, since by the definition itself, both are inherited. on the whole.
  • a measure of linkage disequilibrium between two genetic markers is defined like “r 2 ”.
  • Two genetic polymorphisms that have not been separated by recombination (total linkage disequilibrium), show an r 2 1.
  • the polymorphisms that are in linkage disequilibrium with the genetic polymorphisms rs2228145 of the IL6R gene, rs679620 of the MMP3 gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and /or rs12456284 of the SMAD4 gene preferably have a linkage disequilibrium measurement r 2 > 0.8, more preferably a linkage disequilibrium measurement r 2 > 0.9.
  • the analysis of the polymorphisms of the invention can be carried out by any method known to the person skilled in the art for this purpose. For example, it can be carried out using genotyping kits, sequencing or by PCR amplification (polymerase chain reaction) and subsequent analysis with restriction enzymes or by real-time PCR.
  • Genotyping kits may contain oligonucleotides labeled with fluorophores and may require hybridization of these with a biological sample isolated from a subject.
  • the analysis of the polymorphisms of the invention in step (a) is carried out by any method known to the person skilled in the art for this purpose.
  • it is carried out by amplification, more preferably PCR amplification, and/or sequencing.
  • the analysis of the polymorphisms of the invention in step (a) is carried out using a genotyping kit.
  • the analysis of the polymorphisms of the invention in step (a) comprises the use of probes and/or primers that detect and/or amplify said polymorphisms.
  • the primers and/or probes comprise, or consist of, the nucleotide sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 , SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, and/or any combination thereof.
  • sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 correspond to the sequences of the primers necessary to amplify the rs2228145 polymorphism of the IL6R gene.
  • sequences SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 correspond to the sequences of the probes necessary to specifically detect the rs2228145 polymorphism of the IL6R gene.
  • sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 correspond to the sequences of the primers necessary to amplify the rs679620 polymorphism of the MMP3 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 correspond to the sequences of the probes necessary to specifically detect the rs679620 polymorphism of the MMP3 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 9 and 10 correspond to the sequences of the primers necessary to amplify the rs9493150 polymorphism of the CTGF gene.
  • sequences SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 correspond to the sequences of the probes necessary to specifically detect the rs9493150 polymorphism of the CTGF gene.
  • sequences SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 correspond to the sequences of the primers necessary to amplify the rs1800796 polymorphism of the IL-6 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 correspond to the sequences of the probes necessary to specifically detect the rs1800796 polymorphism of the IL-6 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 correspond to the sequences of the primers necessary to amplify the rs17563 polymorphism of the BMP4 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 correspond to the sequences of the probes necessary to specifically detect the rs17563 polymorphism of the BMP4 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 correspond to the sequences of the primers necessary to amplify the rs8032158 polymorphism of the NEDD4 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 correspond to the sequences of the probes necessary to specifically detect the rs8032158 polymorphism of the NEDD4 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 correspond to the sequences of the primers necessary to amplify the rs12456284 polymorphism of the SMAD4 gene.
  • sequences SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 correspond to the sequences of the probes necessary to specifically detect the rs12456284 polymorphism of the SMAD4 gene.
  • the analysis of the polymorphisms carried out in step (a) comprises the use of probes that detect the polymorphisms of the invention.
  • the probes that detect said polymorphisms are selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 , and any combination of them.
  • the analysis of the polymorphisms of the invention in step (a) comprises the use of hybridization probes labeled with fluorophores.
  • sequencing refers to the determination of the nucleotides of a template nucleic acid and their order.
  • amplification refers to the increase in the number of copies of a template nucleic acid, where this can be carried out using fluorescent probes. In a preferred embodiment, amplification takes place by real-time PCR.
  • template nucleic acid refers to a single-stranded or double-stranded nucleic acid molecule that is to be amplified or sequenced.
  • the increase in the number of copies of a template nucleic acid is carried out by synthesis of complementary DNA using conditions that allow it.
  • the conditions that allow the synthesis of complementary DNA refer to the conditions in which the incorporation of nucleotides into a nascent DNA can take place through base complementarity with the template nucleic acid.
  • the conditions under which sequencing or amplification is performed generally include (a) contacting a template nucleic acid with a polymerase in a mixture further comprising a primer, a divalent cation, (e.g., Mg 2+ ), and nucleotides, generally, dNTPs and, at least, one ddNTP, and (b) subjecting said mixture to a temperature sufficient for the polymerase to initiate the incorporation of the nucleotides into the primer through base complementarity with the template nucleic acid, and give rise to a population of complementary DNA molecules of different sizes.
  • the separation of said population of complementary DNA molecules generally by electrophoresis, allows the nucleotide sequence to be determined.
  • primer refers to an oligonucleotide capable of acting as a starting point for DNA synthesis when hybridized with the template nucleic acid.
  • the primer is a deoxyrhbose oligonucleotide.
  • the Primers may be prepared by any suitable method, including, for example, but not limited to, cloning and restriction of appropriate sequences and direct chemical synthesis. Primers can be designed to hybridize to specific nucleotide sequences in the template nucleic acid (specific primers) or can be synthesized at random (arbitrary primers).
  • telomere sequence refers to a primer whose sequence is complementary to a specific nucleotide sequence in the template nucleic acid to be amplified or sequenced.
  • arbitrary primer refers to a primer whose sequence is synthesized at random and that is used to initiate DNA synthesis at random positions of the template nucleic acid that is to be amplified or sequenced. A population of different arbitrary primers is often used.
  • arbitrary primers refers to a set of primers whose sequence is synthesized at random and that is used to initiate DNA synthesis at random positions of the template nucleic acid that is to be amplified or sequenced.
  • hybridization refers to the pairing of two complementary single-stranded DNA molecules to give a double-stranded molecule.
  • complementarity is 100%. That is, in the region of complementarity each nucleotide of one of the two nucleic acid molecules can form hydrogen bonds with a nucleotide present in the other nucleic acid molecule.
  • those with ordinary experience in the field will recognize that two nucleic acid molecules possessing a region with less than 100% complementarity can also hybridize.
  • nucleotide refers to an organic molecule formed by the covalent bonding of a pentose, a nitrogenous base and a phosphate group.
  • nucleotide includes deoxyribonucleoside triphosphates such as, for example, but not limited to, dATP, dCTP, dITP, dllTP, dGTP, dTTP, or derivatives thereof.
  • nucleotide also includes dideoxyribonucleoside triphosphates (ddNTPs), such as, for example, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, ddTTP or derivatives thereof.
  • a "nucleotide” or a “primer” can be labeled or labeling using techniques well known in the state of the art.
  • Tags detected include, for example, radioactive isotopes, fluorescent tags, chemiluminescent tags, bioluminescent tags or enzymatic tags.
  • biological sample in the present invention refers to any sample that allows DNA to be obtained from the individual from whom said sample has been obtained, and includes, but is not limited to, tissues and/or biological fluids of an individual, obtained by any method. known by an expert in the field that serves this purpose.
  • the biological sample comes from any tissue susceptible to DNA extraction.
  • the biological sample could be, for example, but not limited to, a tissue or fluid sample, such as blood, plasma, serum, oral mucosa, bronchoalveolar lavage, lymph or ascites fluid.
  • the biological sample is selected from the list consisting of tissue, oral mucosa, blood, plasma, serum and lymph.
  • the biological sample may be, for example, but not limited to, fresh, frozen, fixed or fixed and paraffin embedded.
  • the algorithm used in the method of the invention which is useful and allows predicting a subject's risk of suffering from fibrosis, is based on the use of genomic variables together with environmental variables of each subject. To do this, therefore, it is necessary to collect data related to said environmental variables of the subject.
  • a second stage of the method of the invention comprises collecting data from the subject on at least one environmental variable selected from the list that consists of: use or non-use of platelet-rich plasma in the treatment of the subject and degree of obesity.
  • step (b) comprises collecting data from the subject on two environmental variables, where the environmental variables are use or non-use of plasma rich in platelets in the treatment of the subject and degree of obesity.
  • stage (b) of the method of The invention may further comprise collecting data from the subject on at least one environmental variable selected from the list consisting of area of the body susceptible to fibrosis and sex of the subject, which are environmental variables that may also be useful in predicting the risk of fibrosis. a subject to suffer from fibrosis.
  • step (b) further comprises collecting data from the subject on at least one environmental variable selected from the list consisting of area of the body susceptible to suffering from fibrosis and sex of the subject.
  • step (b) comprises collecting data from the subject on the environmental variables, use or non-use of platelet-rich plasma in the treatment of the subject. , degree of obesity, area of the body susceptible to fibrosis and sex of the subject.
  • collected data from the subject refers to the collection and/or recording of data related to environmental variables. As understood by an expert in the field, said data collection can be carried out using any methodology or protocol followed by health professionals.
  • Table 2 shows the subject data that can be collected in step (b) of the method of the invention.
  • Table 2 Subject data that can be collected in stage (b) of the method, and their respective environmental variables.
  • the left column shows the environmental variables, while the right column shows each of the possible data to be collected from the subject for each variable.
  • the data collected from the environmental variable degree of obesity is BMI ⁇ 30, BMI >30, percentage of fat mass > 25% (men), or percentage of fat mass > 33% (women).
  • the data collected from the environmental variable use or non-use of platelet-rich plasma in the treatment of the subject is use or non-use.
  • the data collected from the environmental variable sex of the subject is male or female.
  • step (b) comprises collecting data from the subject, where the data comprises:
  • the body susceptible to fibrosis, where the area of the body is selected from the list consisting of hip, shoulder, knee, ankle or other, including the term “other”, any other part, tissue or organ of the subject's body ;
  • the degree of obesity comprises a body mass index of the subject greater than 30 or less than or equal to 30; and/or a percentage of fat mass greater than 25% or less than or equal to 25% in men, or a percentage of fat mass greater than 33% or less than or equal to 33% in women.
  • area of the body susceptible to fibrosis is understood as the location, tissue, organ or part of the body of the subject that may be susceptible to fibrosis.
  • one of the possible data collected from the subject in step (b) of the method of the invention is whether the area of the body, location or tissue susceptible to suffering fibrosis is hip, shoulder, knee, ankle or another , including the term “other” any other part, tissue or organ of the subject's body.
  • the phrase “other part of the body” refers to any organ, tissue, or area of the subject's body other than hip, shoulder, knee, ankle.
  • the area of the body susceptible to fibrosis is the tissue or organ of the subject where the surgery is performed.
  • Another possible data collected from the subject in this step (b) of the method of the invention is whether the sex of the subject is male or female.
  • platelet-rich plasma is type 13-00-11/24-00-11 as described in Kon E., et al., Expert Opin Biol Ther. , 20 (12):1447-1460 (2020).
  • stage (b) of the method of the invention another of the possible data collected from the subject has to do with the degree of obesity of the subject, understanding this as a body mass index greater than 30 (BMI ⁇ 30), or less or equal to 30 (BMI ⁇ 30) or a percentage of fat mass greater than 25% in men or less than or equal to 25%, and greater than 33% in women or less than or equal to 33%.
  • body mass index or BMI
  • Body fat percentage can be calculated through bioelectrical impedance or by skinfolds using plycometry.
  • Step (c) of the method of the invention assign a value B to the polymorphisms and data of the subject
  • the method of the invention takes into account genetic variables and environmental variables of each subject.
  • a value, in the present invention p-value is assigned to the polymorphisms analyzed in stage (a), and to the data collected from the subject in stage (b) of the method of the invention. .
  • stage (c) comprises assigning a value to the genetic polymorphisms analyzed in stage (a) according to Table 3, and assigning a value p to the data collected from the subject in stage (b) according to Table 3.
  • a p value is assigned for each polymorphism, according to the genotype of the subject. If From the data collected from the subject in step (b) of the method, a p value is assigned for each data collected.
  • step (d) comprises calculating a P value of risk of suffering from fibrosis, by applying the algorithm:
  • Pix is the sum of all p values assigned in step (c),
  • This algorithm hereinafter the algorithm of the invention, relates the risk of a subject to suffering from fibrosis, according to the genetic polymorphisms previously analyzed and data on the environmental variables previously collected from the subject, through Pix.
  • Pix is the sum of all the p values assigned in stage (c) to each of the variables: a p value is assigned to each polymorphism analyzed in stage (a) of the method of the invention, depending on the genotype. according to Table 3; To each data collected from the subject in step (b) of the method of the invention, a p value is also assigned according to Table 3. The sum of all the p values constitutes the Pix value included in the algorithm of the invention.
  • the application of the algorithm of the invention makes it possible to calculate the P value of a subject's risk of suffering from fibrosis.
  • the "P value of risk of suffering fibrosis” also called, “specific risk value of generating fibrosis", or “P value” simply, terms used interchangeably in the present invention
  • the calculated value is as much as one, and can also be interpreted in terms of percentage, multiplying the calculated value by 100.
  • the method of the invention allows predicting a subject's risk of suffering from fibrosis.
  • the implementation of the method of the invention is based, in addition to the collection of environmental data related to the subject, on the analysis of genetic polymorphisms, the polymorphisms of the invention.
  • the means used for the analysis of said genetic polymorphisms may be part of a kit.
  • kits hereinafter the "kit of the invention” which comprises the means for analyzing in vitro in a biological sample isolated from a subject, at least three genetic polymorphisms selected from the list consisting of rs679620 of the MMP3 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene, rs12456284 of the SMAD4 gene, and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms.
  • the kit of the invention may further comprise the means for analyzing in vitro at least one genetic polymorphism selected from the list consisting of rs2228145 of the IL6R gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene. , and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms.
  • the kit of the invention further comprises the means for analyzing in vitro in the biological sample isolated from the subject, at least one genetic polymorphism selected from the list consisting of rs2228145 of the IL6R gene, rs9493150 of the CTGF gene. , rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, and any other polymorphism that is in linkage disequilibrium with said genetic polymorphisms.
  • the kit of the invention comprises the means for analyzing in vitro in a biological sample isolated from the subject, the genetic polymorphisms rs2228145 of the IL6R gene, rs679620 of the MMP3 gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene.
  • the biological sample comes from any tissue susceptible to DNA extraction.
  • the biological sample could be, for example, but not limited to, a tissue or fluid sample, such as blood, plasma, serum, oral mucosa, bronchoalveolar lavage, lymph, or ascites fluid.
  • the biological sample is selected from the list consisting of tissue, oral mucosa, blood, plasma, serum and lymph.
  • kits for analyzing genetic polymorphisms in vitro are understood to mean all those reagents necessary to analyze the polymorphisms of the invention in vitro (primers, probes, buffers, enzymes, coenzymes, substrates).
  • the kits can include all the supports and containers necessary for their start-up and optimization (plastic tubes, plates, reagents, etc.).
  • the kits may also contain other molecules, genes, proteins or probes of interest, which serve as positive and negative controls.
  • genetic polymorphisms can be analyzed by techniques and methods known in the state of the art, including techniques and methods different from those presented here. These methods and techniques have been explained in the previous inventive aspect, and both they and their preferred embodiments are applicable to the kit of the invention.
  • the means for analyzing in vitro the polymorphisms of the invention comprise the reagents necessary to carry out the amplification technique, preferably POR, and/or sequencing.
  • the means for analyzing in vitro the polymorphisms of the invention comprise primers and/or probes that specifically detect said genetic polymorphisms.
  • the primers and/or probes comprise, or consist of, the nucleotide sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, and/or any combination of them.
  • the means comprise probes that specifically detect the polymorphisms of the invention.
  • the probes that detect said polymorphisms are selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO : 28, and any combination of them.
  • kits further comprise instructions for carrying out the analysis of the polymorphisms of the invention and/or the method of the invention.
  • These instructions may be present in the aforementioned kits in a variety of forms, one or more of which may be present in the kit.
  • One way in which these instructions may be present is as printed information on a suitable medium or substrate, e.g. e.g., a sheet or sheets of paper on which the information is printed, on the kit packaging, on a package insert, etc.
  • Another medium would be a computer-readable medium, for example, a CD, USB, etc., on which the information has been recorded.
  • Another medium that may be present is a website address that can be used over the Internet to access information at a remote site. Any convenient media may be present in the kits.
  • the kit of the invention which comprises the means for analyzing the polymorphisms of the invention in vitro, has utility in the method of the invention.
  • the invention relates to the use of the kit of the invention in the method of the invention.
  • kit and use of the kit of the invention have been explained for the method of the invention, and both they and their preferred embodiments are also applicable for the kit of the invention and its use in the method of the invention.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account as variables the genetic polymorphisms rs2228145 of the IL6R gene, rs679620 of the MMP3 gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, rs8032158 of the gene NEDD4 and rs12456284 of the SMAD4 gene, and the environmental variables use or non-use of platelet-rich plasma in the treatment of the subject, degree of obesity, area of the body susceptible to fibrosis, and sex of the subject, in which each point on the graph shows a possible cut-off point for the model in which it reports on its specific sensitivity at that point (Y-axis) with respect to its 1-specificity (X-axis). Diagonally on the graph (from 0.0 to 1.1) the diagonal reference line or non-discrimination line is represented. The diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the rs8032158 polymorphism of the NEDD4 gene as a genetic variable and the use or not of platelet-rich plasma as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the rs12456284 polymorphism of the SMAD4 gene as a genetic variable and the use or not of platelet-rich plasma as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the rs679620 polymorphism of the MMP3 gene as a genetic variable and the use or not of platelet-rich plasma as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the rs8032158 polymorphism of the NEDD4 gene as a genetic variable and the degree of obesity as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the rs12456284 polymorphism of the SMAD4 gene as a genetic variable and the degree of obesity as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the rs679620 polymorphism of the MMP3 gene as a genetic variable and the degree of obesity as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs12456284 of the SMAD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene, and as an environmental variable the use or not of platelet-rich plasma.
  • the Diagonal segments are generated by ties.
  • Fig. 9 ROC curve graph of the prediction model taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene, and as an environmental variable the use or not of platelet-rich plasma.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account as genetic variable the genetic polymorphisms rs8032158 of the NEDD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene. and as an environmental variable the use or not of platelet-rich plasma.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the genetic polymorphisms rs12456284 of the SMAD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene as a genetic variable, and the degree of obesity as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the genetic polymorphisms rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene as a genetic variable, and the degree of obesity as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account the genetic polymorphisms rs8032158 of the NEDD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene as a genetic variable, and the degree of obesity as an environmental variable.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • Fig. 14 ROC curve graph of the algorithm prediction model taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs679620 of the MMP3 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene and as an environmental variable the use or not of platelet-rich plasma.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • ROC curve graph of the prediction model taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs679620 of the MMP3 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene and as an environmental variable the degree of obesity.
  • the diagonal segments are generated by ties.
  • the resulting DNA samples were analyzed by SNP genotyping analysis (polymorphisms rs2228145 of the IL6R gene, rs679620 of the MMP3 gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and rs1245628 4 of the SMAD4 gene) using the Biomark HD system methodology (Fluidigm). Patients were categorized taking into account the following environmental factors:
  • platelet-rich plasma is type 13-00-11/24-00-11 as described in Kon E., et al., Expert Opin Biol Ther. , 20 (12):1447- 1460 (2020).
  • BMI (Kg/m 2 ) Weight (Kg)/(Height (m)) 2 .
  • Po 3.256 ix is the sum of all the values assigned according to Table 3, previously shown in this document.
  • ROC analysis taking into account the rs2228145 IL6R, rs679620 of the MMP3 gene, rs9493150 of the CTGF gene, rs1800796 of the IL-6 gene, rs17563 of the BMP4 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene v rs12456284 of the SMAD4 gene, v environmental variables use or non-use of pest-rich plasma in the treatment of the subject, degree of obesity, area of the body susceptible to fibrosis and sex of the subject.
  • ROC analysis was performed (Fig. 1), establishing the risk of 50.90% of suffering from fibrosis as a cut-off point to classify the subject or patient in question as having high or low risk of developing fibrosis.
  • the P value calculated for the subject is greater than 0.509, the subject is classified as having a high risk of suffering from fibrosis, while if the P value is less than 0.509, the subject is classified as having a low risk of suffering from fibrosis.
  • said value is clearly lower than the selected cut-off point of 0.509, therefore, said patient has a low risk of developing fibrosis.
  • the model showed sensitivity values of: 74.8% and specificity of 73.6%.
  • sensitivity values of: 74.8% and specificity of 73.6%.
  • Table 5 a classification table of “Observed” patients versus “Predicted” by the model (with .00 being no fibrosis and 1.00 being fibrosis) (Table 5).
  • Table 6 provides the value of the area under the curve for the model, with an AUC (area under the curve) of 0.818 and its 95% confidence interval (95% CI) was 0.766-0.871.
  • ROC analyzes were carried out taking into account a smaller number of variables, demonstrating that they are also useful in predicting a subject's risk of suffering from fibrosis, such as and as shown by the results obtained and summarized in Table 7, Table 8 and Table 9.
  • Table 7 Summary of the results obtained by the ROC analysis (2 variables) depending on the genetic and environmental variables taken into account when applying the algorithm.
  • Fig. 2 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account the rs8032158 polymorphism of the NEDD4 gene as a genetic variable and the use or not of platelet-rich plasma as an environmental variable.
  • Fig. 3 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account the rs12456284 polymorphism of the SMAD4 gene as a genetic variable and the use or not of platelet-rich plasma as an environmental variable.
  • Fig. 4 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account the rs679620 polymorphism of the MMP3 gene as a genetic variable and the use or not of platelet-rich plasma as an environmental variable.
  • Fig. 5 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account the rs8032158 polymorphism of the NEDD4 gene as a genetic variable and the degree of obesity as an environmental variable.
  • Fig. 6 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account the rs12456284 polymorphism of the SMAD4 gene as a genetic variable and the degree of obesity as an environmental variable.
  • Fig. 7 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account the rs679620 polymorphism of the MMP3 gene as a genetic variable and the degree of obesity as an environmental variable.
  • Table 8 Summary of the results obtained by the ROC analysis (3 variables) depending on the genetic and environmental variables taken into account when applying the algorithm.
  • Fig. 8 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs12456284 of the SMAD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene, and as an environmental variable the use or not of platelet-rich plasma.
  • Fig. 9 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene, and as an environmental variable the use or not of platelet-rich plasma.
  • Fig. 10 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account as genetic variables the genetic polymorphisms rs8032158 of the NEDD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene. and as an environmental variable the use or not of platelet-rich plasma.
  • Fig. 11 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs12456284 of the SMAD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene, and as an environmental variable the degree of obesity.
  • Fig. 12 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene, and as an environmental variable the degree of obesity.
  • Fig. 13 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs8032158 of the NEDD4 gene and rs679620 of the MMP3 gene, and as an environmental variable the degree of obesity.
  • Table 9 Summary of the results obtained by the ROC analysis (4 variables) depending on the genetic and environmental variables taken into account when applying the algorithm.
  • Fig. 14 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account as a genetic variable the genetic polymorphisms rs679620 of the MMP3 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene and as an environmental variable the use or not of platelet-rich plasma.
  • Fig. 15 shows the ROC curve when applying the algorithm taking into account as a variable genetics the genetic polymorphisms rs679620 of the MMP3 gene, rs8032158 of the NEDD4 gene and rs12456284 of the SMAD4 gene and as an environmental variable the degree of obesity.

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Abstract

La presente invención se relaciona con un método in vitro de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, encuadrándose dentro del campo de la Medicina Personalizada. En concreto, dicho método se basa en el análisis de una serie de polimorfismos genéticos del sujeto, así como otros datos de carácter ambiental del mismo, que conjuntamente son útiles y permiten predecir el riesgo de que un sujeto desarrolle fibrosis.

Description

DESCRIPCION Método de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis
La presente invención se relaciona con un método in vitro de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, encuadrándose dentro del campo de la Medicina Personalizada. En concreto, dicho método, se basa en el análisis de una serie de polimorfismos genéticos, así como otros datos de carácter ambiental del sujeto, que conjuntamente son útiles y permiten la predicción del riesgo de que un sujeto desarrolle fibrosis.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La fibrosis en términos generales hace referencia a un crecimiento y acumulación anómala de componentes de la matriz extracelular, que provoca un endurecimiento o fibrosación de tejido repercutiendo en una pérdida de función parcial o total del tejido u órgano afectado. La enfermedad fibrótica comprende una amplia gama de patologías clínicas que se estima sean responsables del 45% de todas las muertes del mundo desarrollado.
Las patologías fibróticas pueden afectar a un gran número de órganos y tejidos diferentes, sin embargo, se cree que las vías de generación de las mismas son comunes en cualquier órgano. Por otro lado, la patología fibrótica puede darse tras una intervención quirúrgica Esta condición, denominada como la fibrosis postquirúrgica, se caracteriza por una proliferación excesiva de tejido fibrótico y cicatricial generada tras una intervención quirúrgica en un paciente, formándose más tejido fibroso del necesario, lo que habitualmente tiene un impacto negativo en su calidad de vida.
La fibrosis aparece muy frecuentemente a nivel articular, lo que conlleva al desarrollo de la artrofibrosis, con el consecuente endurecimiento o agarrotamiento patológico de una articulación debido a una exagerada respuesta fibrótica. Por ejemplo, la aparición de fibrosis es una complicación a tener en cuenta en las intervenciones quirúrgicas de las articulaciones por su incidencia: oscilando entre el 1 y el 15% de pacientes afectados en las artroplastias de rodilla, y entre el 4 y el 38% en la reconstrucción de ligamento cruzado anterior. Teniendo en cuenta que solo en EEUU al año se estiman puedan surgir unos 85.000 nuevos casos de artrofibrosis solo de rodilla, y que de ellas un 25% necesitan cirugía adicional para intentar reestablecer un movimiento adecuado de rodilla, se puede estimar las implicaciones no solo a nivel de empeoramiento en la calidad de vida derivadas por la menor movilidad, sino también la repercusión social y económica que supone este tipo de patología.
Se han descrito diversos métodos que tienen relación con el diagnóstico o pronóstico de la fibrosis o condiciones similares:
En la solicitud de patente EP2428583A1 se describe un método para determinar el progreso del proceso de cicatrización de un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado entre los genes TFAP2A, EGFR, ILIA, IL1 B, IL6, IL10, IL18, CD44, TNFRSF1A, HSPD1 , MYC, CTGF, MMP7, MMP2, MMP9, MMP25, TGFA, TGFB2, EREG, FN1 , HBEGF, NF1 , SRC, EGF4, CDKN2A, PLAU, SPP1 , ITGB2, BAX, MET y PPAR, o de una vahante funcionalmente equivalente de dichos genes, en una muestra de dicho sujeto.
En ES2422874B1 , se describe un método in vitro para el pronóstico y/o diagnóstico de fibrosis hepática grave que se caracteriza por la detección de una serie de polimorfismos genéticos y la determinación de variables clínicas.
En CA2805267A1 , se describe un método que comprende la medición del nivel de cadherina-11 en una muestra obtenida de un sujeto, y su comparación con valores control, donde un nivel de cadhehna-11 en la muestra obtenida del sujeto mayor que el valor control indica fibrosis o riesgo de desarrollar fibrosis.
Sin embargo, los métodos descritos no permiten predecir de forma fiable el riesgo de un sujeto de padecer fibrosis, lo cual dificulta y limita la toma de decisiones o medidas preventivas que puedan evitar esta condición. Así, a la luz del estado de la técnica, es necesario disponer de métodos que tengan utilidad en la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir un proceso de fibrosis y que permitan determinar con fiabilidad el riesgo de sufrir complicaciones de este tipo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención divulga un método de obtención de datos útiles in vitro para predecir el riesgo de un sujeto de sufrir un proceso de fibrosis
Para el desarrollo del mismo, los inventores se basan en la utilización de variables ambientales (grado de obesidad, utilización o no de plasma rico en plaquetas, y adicionalmente datos relativos a las variables área susceptible de sufrir fibrosis y/o sexo del sujeto) junto con variables genéticas que comprenden el análisis de uno o vahos polimorfismos genéticos de los genes MMP3, NEDD4, SMAD4, así como sus combinaciones con polimorfismos de los genes IL6R, CTGF, IL-6, BMP4, La aplicación de un algoritmo que tiene en cuenta las variables anteriores permite obtener un valor del riesgo de un sujeto de generar fibrosis.
En la bibliografía científica, existen estudios de asociación que determinan por separado la implicación de factores genéticos y ambientales con eventos fibróticos a nivel pulmonar, hepática, articular, u otros. Sin embargo, el algoritmo de la invención tiene en cuenta variables genéticas y ambientales de forma conjunta, que permiten calcular un valor de riesgo específico de cada sujeto.
Los inventores han observado que la aplicación de esta aproximación en pacientes, tiene una sensibilidad y especificidad elevadas, teniendo el método de la invención buena capacidad predictiva, tal y como muestran los análisis de curvas ROC, por sus siglas en inglés Receiver Operating Characteristic, (Figura 1 ; Tablas 7, 8 y 9).
La presente invención provee así una aproximación innovadora en el área de la Medicina Personalizada con múltiples ventajas asociadas: permite obtener datos de utilidad para conocer el riesgo de un paciente a padecer fibrosis con una sensibilidad y especificidad elevada; permite tomar decisiones o medidas preventivas que puedan evitar dicha condición, lo cual en el caso de que el paciente vaya a ser sometido a cirugía, a su vez puede facilitar una correcta recuperación y/o futuras intervenciones para eliminar la fibrosis generada. Además, también puede tener utilidad a la hora de orientar la aplicación de determinados tratamientos preventivos en función del riesgo identificado en el paciente, como, por ejemplo, ajustar la dieta o aplicar fisioterapia preoperatoria, farmacología oral o técnicas quirúrgicas alternativas, que eviten la generación de fibrosis. Asimismo, permite conocer el riesgo de un paciente a padecer fibrosis postquirúrgica previo a pasar por quirófano. Método de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de sufrir fibrosis de un sujeto, de aquí en adelante “el método de la invención”, que comprende las siguientes etapas:
(a) analizar en una muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos;
(b) recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental, seleccionada de la lista que consiste en: uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad;
(c) asignar un valor p a los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) según la Tabla 3, y asignar un valor a los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) según la Tabla 3; y
(d) calcular un valor P de riesgo a sufrir fibrosis, mediante la aplicación del algoritmo:
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en donde,
Po = 3,256 pix es la suma de todos los valores p asignados en la etapa (c).
El término “in vitro" se refiere a que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto.
El término “fibrosis” se refiere a un proceso propio del tejido conectivo vascularizado, en el que participan el plasma y las células circulantes y residentes del tejido conectivo, destacando mediadores de la inflamación, granulocitos, macrófagos, plaquetas y células endoteliales, además de los fibroblastos y miofibroblastos entre otros. A nivel celular la fibrosis está caracterizada por la proliferación de los fibroblastos, células abundantes en el tejido conectivo que segregan compuestos como colágeno y proteoglicanos. Del mismo modo, los miofibroblastos, también desempeñan un papel muy importante durante la inflamación, reparación y cicatrización. Tal y como se usa aquí, se refiere a un aumento patológico del tejido conectivo en algún órgano o tejido.
El término “cicatrización”, tal y como se usa aquí, se refiere a un proceso natural que tiene el cuerpo de un sujeto que ha sufrido una herida para regenerar los tejidos comprometidos en la misma. En dicho proceso se llevan a cabo una serie de complejos fenómenos bioquímicos que tienen lugar para reparar el daño causado por la herida. El proceso de cicatrización de la presente invención se refiere, pero no se limita a, cualquier tipo de cicatrización de una herida causada en el cuerpo humano, incluyendo heridas de procesos postquirúrgicos.
En determinadas ocasiones dicho proceso de cicatrización se descontrola dando lugar a procesos fibróticos como la formación de queloides. El término “queloides”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a cicatrices patológicas producidas por una respuesta de cicatrización de la herida aberrante y demasiado exuberante. Los queloides son cicatrices elevadas que se extienden más allá de los márgenes de una herida original e invaden la piel normal que rodea el lugar de la herida. Los queloides pueden seguir creciendo con el tiempo y no remitir espontáneamente. Se puede considerar que una lesión queloide está formada por vahas partes diferentes que pueden presentar una actividad biológica muy distinta entre sí. Por lo general, la parte central de una lesión queloide madura (la porción intra-lesional) es en gran parte acelular, mientras que la parte periférica de la lesión (la porción peh-lesional) es relativamente más celular y es el sitio de mayor actividad angiogénica.
En la presente invención, la frase “predecir el riesgo de sufrir fibrosis en un sujeto”, se refiere a determinar o predecir la probabilidad de un sujeto a padecer dicha condición. En la presente invención, la obtención de datos útiles para esta predicción comprende la aplicación de un algoritmo que tiene en cuenta variables ambientales y genéticas, en particular, polimorfismos genéticos.
En la presente invención el algoritmo del método de la invención se considera predictivo cuando la AUCROC (AUC-Area UnderCurve o área bajo la curva; ROC-Receiver Operating Characteristic o característica operativa del receptor) es mayor de 0,5. El AUCROC se define como la probabilidad de clasificar correctamente un par de individuos caso y control, seleccionados al azar de la población, mediante los resultados o valores obtenidos al aplicarles el algoritmo.
El AUCROC por convenio está comprendido entre 0,5 y 1 : cuanto más cercano a 1 es el valor ALICROC de una variable, más preciso y predictivo se considera. La sensibilidad de la prueba diagnóstica es la probabilidad de obtener un resultado positivo cuando el individuo tiene la enfermedad o condición, en la presente invención, fibrosis. La especificidad de una prueba indica la probabilidad de obtener un resultado negativo cuando el individuo no tiene la enfermedad o condición, en la presente invención, no desarrolla o sufre fibrosis.
El término “sujeto” en la presente invención, se refiere a cualquier individuo susceptible de sufrir fibrosis, o a cualquier individuo del que se tenga interés en conocer el riesgo a sufrir dicha condición. Los términos “paciente” o “sujeto” se usan en la presente invención de forma indistinta.
En la presente invención, la fibrosis puede afectar a cualquier órgano o tejido del sujeto. Preferiblemente, la fibrosis afecta a una articulación. Más preferiblemente, la fibrosis afecta a una articulación, en donde la articulación es seleccionada de la lista que consiste en rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo.
El método de la invención, además, permite predecir el riesgo de un sujeto a padecer fibrosis postquirúrgica previo a ser sometido a cirugía.
Así, en una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el sujeto va a ser sometido a cirugía. En otra realización más preferida, la cirugía a la que va a ser sometido el sujeto se realiza en una articulación. Ejemplos de articulaciones, incluyen, sin limitar a, rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo. Así, en otra realización aún más preferida, la articulación es seleccionada de la lista que consiste en rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la fibrosis es fibrosis postquirúrgica.
El término “fibrosis postquirúrgica” se refiere al proceso de fibrosis como respuesta a una cirugía (o intervención quirúrgica, términos empleados indistintamente en el presente documento) que comprende un proceso de cicatrización secundaria. Tal y como se usa aquí, se usa para referirse a una condición que comprende una cicatrización excesiva secundaria producida tras una intervención quirúrgica, formándose más tejido fibroso del necesario provocando efectos indeseados que pueden complicar la recuperación del paciente. Ejemplos de efectos indeseados relacionados con dicha fibrosis postquirúrgica incluyen, sin limitar a, la compresión de un nervio por la cicatriz excesiva, que causa dolores al paciente, afectando a su recuperación y a su calidad de vida de quien la padece o la restricción en el rango de movimiento de una articulación tras su intervención quirúrgica.
La fibrosis postquirúrgica, mayormente aparece a nivel articular, lo que conlleva al desarrollo de la artrofibrosis, con el consecuente endurecimiento o agarrotamiento patológico de una articulación debido a una exagerada respuesta fibrótica. Esta puede surgir en grandes articulaciones como hombros, codos, cadera y rodillas, y generalmente causan la perdida de función e inmovilidad de dichas articulaciones. Así, en una realización preferida del método de la invención, la fibrosis postquirúrgica se produce en una articulación. Preferiblemente, la articulación es seleccionada de la lista que consiste en hombro, codo, cadera y rodilla.
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Una primera etapa del método de la invención [etapa (a)] comprende analizar en una muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3, rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos;
El término “polimorfismo genético” se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de la cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN) que tiene al menos una frecuencia del 1 % en los individuos de una población. Los polimorfismos genéticos pueden ser variaciones de uno o vahos nucleótidos. Los polimorfismos de un solo nucleótido, “single nucleotide polymorphism” o SNP, generalmente dan lugar a dos alelos.
Los términos “polinucleótido”, “secuencia nucleotídica”, “secuencia de nucleótidos”, “ácido nucleico” y “oligonucleótido” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.
En la presente invención, el término “analizar” referido a “polimorfismo/s” genético/s”, se refiere a detectar dicho polimorfismo/s, determinando su genotipo o genotipos.
El polimorfismo genético rs679620 del gen MMP3, se refiere a un SNP situado en la posición 102842889 del cromosoma 11 de homo sapiens (número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 11 de homo sap/ens:NC_000011.10). Los genotipos pueden ser homocigoto para adenina (A:A), heterocigoto adenina:guanina (A:G) u homocigoto para guanina (G:G).
El polimorfismo genético rs8032158 del gen NEDD4, se refiere a un SNP situado en la posición 55902679 del cromosoma 15 de homo sapiens (número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 15 de homo sapiens. NC_000015.10). Los genotipos pueden ser homocigoto para citosina (C:C), heterocigoto citosina:t¡m¡na (C:T) u homocigoto para timina (T:T).
El polimorfismo genético rs12456284 del gen SMAD4, se refiere a un SNP situado en la posición 51083598 del cromosoma 18 de homo sapiens (número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 18 de homo sapiens. NC_000018.10). Los genotipos pueden ser homocigoto para adenina (A:A), heterocigoto adenina:guanina (A:G) u homocigoto para guanina (G:G).
En una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas del método de la invención, la etapa (a) comprende analizar, al menos, dos polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
En una realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar el polimorfismo genético rs12456284 del gen SMAD4 y el polimorfismo genético rs679620 del gen MMP3.
En otra realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar el polimorfismo genético rs8032158 del gen NEDD4 y el polimorfismo genético rs12456284 del gen SMAD4.
En otra realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar el polimorfismo genético rs8032158 del gen NEDD4 y el polimorfismo genético rs679620 del gen MMP3.
En otra realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar, al menos, tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
En otra realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, rs679620 del gen MMP3, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos. Aún más preferiblemente, los polimorfismos genéticos son rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3
Además del análisis de al menos uno, al menos dos, al menos tres, o tres de los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, o cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos, la etapa (a) del método de la invención puede comprender analizar, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en, rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y/o cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
El polimorfismo genético rs2228145 del gen IL6R, se refiere a un SNP situado en la posición 154454494 del cromosoma 1 de homo sapiens (número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 1 de homo sapiens. NC_000001.11). Los genotipos pueden ser homocigoto para adenina (A:A), heterocigoto adenina:citosina (A:C) u homocigoto para citosina (C:C). El polimorfismo genético rs9493150 del gen CTGF, se refiere a un SNP situado en la posición 131952851 del cromosoma 6 de homo sapiens (número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 6 de homo sapiens. NC_000006.12). Los genotipos pueden ser homocigoto para citosina (C:C), heterocigoto citosina:guanina (C:G) u homocigoto para guanina (G:G).
El polimorfismo genético rs1800796 del gen IL-6, se refiere a un SNP situado en la posición 22726627 del cromosoma 7 de homo sapiens (número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 7 de homo sapiens. NC_000007.14). Los genotipos pueden ser homocigoto para citosina (C:C), heterocigoto citosina:guanina (C:G) u homocigoto para guanina (G:G).
El polimorfismo genético rs17563 del gen BMP4, se refiere a un SNP situado en la posición 53950804 del cromosoma 14 de homo sapiens (número de acceso al GenBank de la secuencia del cromosoma 14 de homo sapiens. NC_000014.9). Los genotipos pueden ser homocigoto para citosina (C:C), heterocigoto citosina:t¡m¡na (C:T) u homocigoto para timina (T:T).
Así, en una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) además comprende analizar, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) además comprende analizar, al menos, dos, al menos tres, al menos cuatro, polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos, incluyendo cualquier combinación de los mismos.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar, al menos, 7 polimorfismos genéticos seleccionados de lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos, incluyendo cualquier combinación de los mismos..
En otra realización más preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende analizar los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4.
En el presente documento se emplea la frase “polimorfismos de la invención” para referirnos a al menos un polimorfismo genético seleccionado de entre los polimorfismos rs679620 del gen MMP3, rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos, y/o a cualquier combinación de uno o más de los polimorfismos genéticos anteriores con al menos un polimorfismo genético seleccionado de entre rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, y rs17563 del gen BMP4, incluyendo cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con ellos
En la presente invención, los polimorfismos genéticos son SNPs, por lo que los términos polimorfismos de la invención y SNPs de la invención pueden usarse indistintamente a lo largo del documento.
Los polimorfismos genéticos que pueden ser analizados como parte del método de la presente invención, y que tienen utilidad en la predicción del riesgo de un sujeto a sufrir fibrosis, se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1 . Polimorfismos genéticos que pueden ser incluidos como variables genotípicas dentro del modelo de predicción.
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Por otro lado, cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con ellos, puede ser analizado en la presente invención. El término “desequilibrio de ligamiento”, se refiere a la propiedad de algunos genes o marcadores de ADN de no segregar de forma independiente, es decir, poseen una frecuencia de recombinación menor del 50%. Esto suele deberse a que los dos loci implicados se encuentran en el mismo cromosoma, lo que imposibilita su transferencia a la progenie de manera aleatoria con la separación de los cromosomas en anafase. En la presente invención, se refiere a aquellos polimorfismos genéticos que debido a su cercanía física en un cromosoma, se presentan juntos de manera más frecuente de lo que se esperaría por azar. Un polimorfismo genético que se encuentren en desequilibrio de ligamiento con otro presenta la misma capacidad o da una información equivalente, en la presente invención, relativa a la predicción de riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, ya que por la propia definición, ambos se heredan en conjunto.
Una medida del desequilibrio de ligamiento entre dos marcadores genéticos se define como “r2”. Dos polimorfismos genéticos que no han sido separados por recombinación (desequilibrio de ligamiento total), muestran un r2=1. En la presente invención, los polimorfismos que se encuentran en desequilibrio de ligamiento con los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y/o rs12456284 del gen SMAD4, preferiblemente presentan una medida de desequilibrio de ligamiento r2 > 0,8, más preferiblemente una medida de desequilibrio de ligamiento r2 > 0,9.
El análisis de los polimorfismos de la invención, se puede realizar por cualquier método conocido por el experto en la materia para tal fin. Por ejemplo, se puede realizar mediante kits de genotipado, secuenciación o mediante amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y posterior análisis con enzimas de restricción o mediante PCR a tiempo real. Los kits de genotipado pueden contener oligonucleótidos marcados con fluoróforos y puede requerir la hibridación de estos con una muestra biológica aislada de un sujeto.
Así, en el método de la invención, el análisis de los polimorfismos de la invención de la etapa (a), se lleva a cabo por cualquier método conocido por el experto en la materia para tal fin En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, se lleva a cabo mediante amplificación, más preferiblemente amplificación PCR, y/o secuenciación
En otra realización preferida del método de la invención, el análisis de los polimorfismos de la invención de la etapa (a), se lleva a cabo usando un kit de genotipado.
En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el análisis de los polimorfismos de la invención de la etapa (a) comprende el empleo de sondas y/o cebadores que detectan y/o amplifican dichos polimorfismos.
En una realización más preferida, los cebadores y/o sondas comprenden, o consisten en, las secuencias de nucleótidos: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y/o cualquier combinación de ellos.
SEQ ID NO: 1
CCATATTCTCCTCTTCCTCCTCTATCTTCA
SEQ ID NO: 2
CTCCAGCAACCAGGAATGTG
Las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 2, corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs2228145 del gen IL6R.
SEQ ID NO: 3
GGGCAGTGGTACTGAAGAAGAAT
SEQ ID NO: 4
GGGCAGTGGTACTGAAGAAGAAG
Las secuencias SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO: 4 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs2228145 del gen IL6R.
SEQ ID NO: 5
ACTTATTCTGTTAGAAATATCTAGAAAACTACTACGACCT
SEQ ID NO: 6
ACAACAGGACCACTGTCCTT
Las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs679620 del gen MMP3.
SEQ ID NO: 7
TCTCCTAACAAACTGTTTCACATCTTTTTT
SEQ ID NO: 8
TCTCCTAACAAACTGTTTCACATCTTTTTC Las secuencias SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs679620 del gen MMP3.
SEQ ID NO: 9
AAATGATAAATCTATAATGCATTGTTTCTAAAGCCGAT
SEQ ID NO: 10
TGTTGATGCTTCAGAGCATGG
Las secuencias SEQ ID NO: 9 y 10 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs9493150 del gen CTGF.
SEQ ID NO: 11
CATGGGTTCAAGATAAGCATATCTGTTTC
SEQ ID NO: 12
CATGGGTTCAAGATAAGCATATCTGTTTG
Las secuencias SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs9493150 del gen CTGF.
SEQ ID NO: 13
CTGTGTTCTGGCTCTCCCTGT
SEQ ID NO: 14
GCCTTGAAGTAACTGCACGAAATT
Las secuencias SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs1800796 del gen IL-6.
SEQ ID NO: 15
AGGCAGTTCTACAACAGCCC SEQ ID NO: 16
AGGCAGTTCTACAACAGCCG
Las secuencias SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs1800796 del gen IL-6.
SEQ ID NO: 17
CCACCTGCTCCCGGAAGA
SEQ ID NO: 18
CGTTTCCTCTTTAACCTCAGCA
Las secuencias SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs17563 del gen BMP4.
SEQ ID NO: 19
GCATCCCTGAGAACGAGGC
SEQ ID NO: 20
GCATCCCTGAGAACGAGGT
Las secuencias SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs17563 del gen BMP4.
SEQ ID NO: 21
TGAATTTCATCCTTAAGTTCTTTTTATTTAATAAATGTTA
SEQ ID NO: 22
GTGTATGTTTGAAATTTTCCCTAACGAA
Las secuencias SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4.
SEQ ID NO: 23 TTTAAAATATTTGGGAAAAAACTAGCTTATAATAAC
SEQ ID NO: 24
TTTAAAATATTTGGGAAAAAACTAGCTTATAATAAT
Las secuencias SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4.
SEQ ID NO: 25
GGCCCAACCCAGAGCCATTA
SEQ ID NO: 26
CACACCGTTTATTTAAATGCTTTCTCA
Las secuencias SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 corresponden a las secuencias de los cebadores necesarios para amplificar el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4.
SEQ ID NO: 27
CCAGAGCCAGTGTTCTTGTTCA
SEQ ID NO: 28
CAGAGCCAGTGTTCTTGTTCG
Las secuencias SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 corresponden a las secuencias de las sondas necesarias para detectar de forma específica el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4.
En una realización más preferida, el análisis de los polimorfismos llevado a cabo en la etapa (a) comprende empleo de sondas que detectan los polimorfismos de la invención. Preferiblemente, las sondas que detectan dichos polimorfismos se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y cualquier combinación de ellos. En otra realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el análisis de los polimorfismos de la invención de la etapa (a) comprende el empleo de sondas de hibridación marcadas con fluoróforos.
El término “secuenciación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la determinación de los nucleótidos de un ácido nucleico molde y de su orden.
El término “amplificación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al aumento del número de copias de un ácido nucleico molde, donde ésta puede ser realizada utilizando sondas fluorescentes. En una realización preferida, la amplificación tiene lugar mediante PCR a tiempo real.
El término “ácido nucleico molde” o “molde”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ácido nucleico de cadena simple o de doble cadena que va a ser amplificada o secuenciada.
El aumento del número de copias de un ácido nucleico molde se realiza por síntesis de ADN complementario mediante unas condiciones que lo permitan. Las condiciones que permitan la síntesis de ADN complementario se refiere a las condiciones en las que puede tener lugar la incorporación de los nucleótidos a un ADN naciente mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde.
Las condiciones en las cuáles se realiza la secuenciación o la amplificación generalmente incluyen (a) poner en contacto un ácido nucleico molde con una polimerasa en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente, (por ejemplo, Mg2+), y nucleótidos, generalmente, dNTPs y, al menos, un ddNTP, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que la polimerasa inicie la incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar a una población de moléculas de ADN complementario de diferente tamaño. La separación de dicha población de moléculas de ADN complementario, generalmente, mediante electroforesis, permite determinar la secuencia de nucleótidos.
El término “cebador”, como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando híbrida con el ácido nucleico molde. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleótido de desoxirhbosa. Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de nucleótidos en el ácido nucleico molde (cebadores específicos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios).
El término “cebador específico”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un cebador cuya secuencia es complementaria a una secuencia específica de nucleótidos en el ácido nucleico molde que se quiere amplificar o secuenciar.
El término “cebador arbitrario” se refiere a un cebador cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere amplificar o secuenciar. Con frecuencia se emplea una población de distintos cebadores arbitrarios. El término “cebadores arbitrarios” se refiere a un conjunto de cebadores cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar la síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ácido nucleico molde que se quiere amplificar o secuenciar.
El término “hibridación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al apareamiento de dos moléculas de ADN de cadena simple complementarias para dar una molécula de doble cadena. Preferiblemente, la complementariedad es del 100%. Esto es, en la región de complementariedad cada nucleótido de una de las dos moléculas de ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido presente en la otra molécula de ácido nucleico. Sin embargo, aquéllos con una experiencia normal en el campo reconocerán que dos moléculas de ácido nucleico que posean una región con complementariedad menor al 100% también pueden hibridar.
El término “nucleótido”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una molécula orgánica formada por la unión covalente de una pentosa, una base nitrogenada y un grupo fosfato. El término nucleótido incluye desoxirribonucleósidos trifosfato como, por ejemplo, pero sin limitarse, dATP, dCTP, dITP, dllTP, dGTP, dTTP, o derivados de los mismos. El término nucleótido incluye también dideoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTPs), como por ejemplo, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP, ddTTP o derivados de los mismos.
De acuerdo con la presente invención un “nucleótido” o un “cebador” puede ser marcado o etiquetado mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Etiquetas detecta les incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas.
El término “muestra biológica” en la presente invención se refiere a cualquier muestra que permita obtener ADN del individuo del que se ha obtenido dicha muestra, e incluye, pero sin limitarnos, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin.
Así, en una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la muestra biológica procede de cualquier tejido susceptible de una extracción de ADN. La muestra biológica podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, un tejido o una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, mucosa oral, lavado broncoalveolar, linfa o fluido ascítico. En una realización más preferida, la muestra biológica es seleccionada de la lista que consiste en tejido, mucosa oral, sangre, plasma, suero y linfa. Asimismo, la muestra biológica puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.
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Como se ha explicado previamente, el algoritmo empleado en el método de la invención que tiene utilidad y permite predecir el riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, se basa en la utilización de variables genómicas junto con variables ambientales de cada sujeto. Para ello, por tanto, es necesario recoger datos relativos a dichas variables ambientales del sujeto.
Así, una segunda etapa del método de la invención [etapa (b)] comprende recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental seleccionada de la lista que consiste en: uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad.
En una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto de dos variables ambientales, en donde las variables ambientales son uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad. Además de recoger datos del sujeto de, al menos una, variable ambiental seleccionada entre uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, y grado de obesidad, o datos de ambas, la etapa (b) del método de la invención puede comprender adicionalmente recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental seleccionada de la lista que consiste en área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto, que son variables ambientales que también pueden tener utilidad en la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis.
Así, en una realización preferida del método de la invención, la etapa (b) además comprende recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental seleccionada de la lista que consiste en área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
En una realización más preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto de las variables ambientales uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, grado de obesidad, área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
La frase “recoger datos del sujeto”, se refiere a la recolección y/o registro de los datos relativos a variables ambientales. Como entiende un experto en la materia, dicha recogida de datos puede realizarse mediante cualquier metodología o protocolo seguido por los profesionales sanitarios.
En la Tabla 2 se muestran los datos del sujeto que pueden ser recogidos en la etapa (b) del método de la invención.
Tabla 2. Datos del sujeto que pueden ser recogidos en la etapa (b) del método, y sus respectivas variables ambientales. En la columna izquierda se muestran las variables ambientales, mientras que en la columna derecha se muestra cada uno de los posibles datos a recoger del sujeto para cada variable.
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Así, en la presente invención, el dato recogido de la variable ambiental grado de obesidad es IMC <30, IMC >30, porcentaje de masa grasa > 25% (hombres), o porcentaje de masa grasa > 33% (mujeres).
El dato recogido de la variable ambiental uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto es uso o no uso.
El dato recogido de la variable ambiental sexo del sujeto es hombre o mujer.
El dato recogido de la variable ambiental área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis es rodilla, tobillo, cadera, hombro, codo, u otra/s. Así, en una realización más preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto, en donde los datos comprenden:
- área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis, en donde área del cuerpo es seleccionado de la lista que consiste en cadera, hombro, rodilla, tobillo u otra, incluyendo el término “otra”, cualquier otra parte, tejido u órgano del cuerpo del sujeto;
- sexo masculino o femenino del sujeto;
- uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto; y/o
-grado de obesidad, en donde preferiblemente, el grado de obesidad comprende un índice de masa corporal del sujeto mayor a 30 o menor o igual a 30; y/o un porcentaje de masa grasa mayor al 25% o menor o igual a 25% en hombres, o un porcentaje de masa grasa mayor al 33% o menor o igual a 33% en mujeres.
En el presente documento, se entiende por “área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis”, a la localización, tejido, órgano o parte del cuerpo del sujeto que puede ser susceptible de sufrir fibrosis. Así, en la presente invención, uno de los posibles datos recogidos del sujeto en la etapa (b) del método de la invención es si el área del cuerpo, localización o tejido susceptible a sufrir fibrosis es cadera, hombro, rodilla, tobillo u otra, incluyendo el término “otra” cualquier otra parte, tejido u órgano del cuerpo del sujeto. Tal y como se usa aquí, la frase “otra parte del cuerpo”, se refiere a cualquier órgano, tejido, o área del cuerpo del sujeto distinto de cadera, hombro, rodilla, tobillo.
En una realización preferida del método de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, el área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis es el tejido u órgano del sujeto donde se realiza la cirugía.
Otro de los datos posibles recogidos del sujeto en esta etapa (b) del método de la invención es si el sexo del sujeto es masculino o femenino.
En la presente invención, otro de los posibles datos recogidos del sujeto en la etapa (b) es el uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto. Tal y como se usa aquí, el “plasma rico en plaquetas” (o PRP), es de tipo 13-00-11/24-00-11 como se describe en Kon E., et al., Expert Opin Biol Ther., 20 (12):1447-1460 (2020). En la etapa (b) del método de la invención, otro de los posibles datos recogidos del sujeto tiene que ver con el grado de obesidad del sujeto, entendiendo éste como un índice de masa corporal mayor a 30 (IMC <30), o menor o igual a 30 (IMC <30) o un porcentaje de masa grasa superior al 25% en hombres o menor o igual a 25%, y mayor al 33% en mujeres o menor o igual a 33%. El “índice de masa corporal” (o IMC) de un sujeto, en la presente invención un sujeto, se define como el cociente del peso en kilogramos del sujeto y el cuadrado de su altura en metros. El “porcentaje de grasa corporal” se puede calcular a través de impedancia bioeléctrica o por pliegues cutáneos mediante plicómetría.
Etapa (c) del método de la invención: asignar un valor B a /os polimorfismos y datos del sujeto
Como ya se ha mencionado, el método de la invención tiene en cuenta variables genéticas y variables ambientales de cada sujeto. Previamente a la aplicación del algoritmo de la invención, se asigna un valor, en la presente invención valor p, a los polimorfismos analizados en la etapa (a), y a los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) del método de la invención.
Así, una tercera etapa del método de la invención, la etapa (c), comprende asignar un valor a los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) según la Tabla 3, y asignar un valor p a los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) según la Tabla 3.
Tabla 3. Valores de p específicos para cada posibilidad de las variables analizadas. En el caso de los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) del método, un valor P es asignado para cada polimorfismo (según el genotipo del sujeto para ese polimorfismo). En el caso de los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) del método, un valor p es asignado para cada dato recogido.
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Así, en el caso de los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) del método, para cada polimorfismo, según el genotipo del sujeto, se asigna un valor p. En el caso de los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) del método, un valor p es asignado para cada dato recogido.
El sumatorio de los valores asignados en esta etapa (c) del método de la invención, constituye el valor Pix que forma parte del algoritmo aplicado en la siguiente etapa del método de la invención.
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La siguiente etapa del método de la invención, la etapa (d), comprende calcular un valor P de riesgo a sufrir fibrosis, mediante la aplicación del algoritmo:
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en donde,
Po = 3,256
Pix es la suma de todos los valores p asignados en la etapa (c),
Este algoritmo, de aquí en adelante el algoritmo de la invención, relaciona el riesgo de un sujeto a sufrir fibrosis, según los polimorfismos genéticos previamente analizados y datos de las variables ambientales previamente recogidos del sujeto, a través de Pix.
Pix, es la suma de todos los valores p asignados en la etapa (c) a cada una de las variables: a cada polimorfismo analizado en la etapa (a) del método de la invención, en función del genotipo, se asigna un valor p según la Tabla 3; a cada dato recogido del sujeto en la etapa (b) del método de la invención, se asigna también un valor p según la Tabla 3. La suma de todos los valores p, constituye el valor Pix comprendido en el algoritmo de la invención.
La aplicación del algoritmo de la invención permite calcular el valor P de riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis. En la presente invención, el “valor P de riesgo de sufrir fibrosis” (también denominado, “valor de riesgo específico a generar fibrosis”, o “valor P” a secas, términos usados indistintamente en la presente invención), se refiere al riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis. El valor calculado está en tanto por uno, y puede ser también interpretado en términos de porcentaje, multiplicando el valor calculado por 100. Así, el método de la invención permite predecir el riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis.
Kit de la invención y sus usos
La puesta en práctica del método de la invención se fundamenta además de en la recolección de datos ambientales relativos al sujeto, en el análisis de polimorfismos genéticos, los polimorfismos de la invención. Los medios empleados para el análisis de dichos polimorfismos genéticos pueden estar formando parte de un kit.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante el “kit de la invención”, que comprende los medios para analizar in vitro en una muestra biológica aislada de un sujeto, al menos, tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
Adicionalmente, el kit de la invención puede además comprender los medios para analizar in vitro al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos. Así, en una realización preferida, el kit de la invención además comprende los medios para analizar in vitro en la muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
Más preferiblemente, el kit de la invención comprende los medios para analizar in vitro en una muestra biológica aislada del sujeto, los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4.
En una realización preferida, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la muestra biológica procede de cualquier tejido susceptible de una extracción de ADN. La muestra biológica podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse a, un tejido o una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, mucosa oral, lavado broncoalveolar, linfa o fluido ascítico. En una realización más preferida, la muestra biológica es seleccionada de la lista que consiste en tejido, mucosa oral, sangre, plasma, suero y linfa
En la presente invención se entiende por “medios para analizar in vitro los polimorfismos genéticos”, todos aquellos reactivos necesarios para analizar in vitro los polimorfismos de la invención (cebadores, sondas, tampones, enzimas, coenzimas, sustratos). Por otro lado, los kits pueden incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización (tubos de plásticos, placas, reactivos, etc.). Los kits pueden contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos.
Como sabe un experto en la materia, los polimorfismos genéticos pueden analizarse mediante técnicas y métodos conocidos en el estado de la técnica, incluyendo técnicas y métodos diferentes a los aquí presentados. Estos métodos y técnicas se han explicado en el aspecto inventivo anterior, y tanto ellas como sus realizaciones preferidas, son aplicables al kit de la invención.
En una realización preferida del kit de la invención, los medios para analizar in vitro los polimorfismos de la invención comprenden los reactivos necesarios para llevar a cabo la técnica de amplificación, preferiblemente POR, y/o secuenciación.
En otra realización preferida del kit de la invención, los medios para analizar in vitro los polimorfismos de la invención comprenden cebadores y/o sondas que detectan de forma específica dichos polimorfismos genéticos.
En una realización más preferida del kit de la invención, los cebadores y/o sondas comprenden, o consisten en, las secuencias de nucleótidos: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y/o cualquier combinación de ellos. Más preferiblemente, los medios comprenden sondas que detectan de forma específica los polimorfismos de la invención. Aún más preferiblemente, las sondas que detectan dichos polimorfismos se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y cualquier combinación de ellos.
Preferiblemente, los kits comprenden además las instrucciones para llevar a cabo el análisis de los polimorfismos de la invención y/o el método de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, uno o más de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
El kit de la invención, que comprende los medios para analizar in vitro los polimorfismos de la invención, tiene utilidad en el método de la invención. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención en el método de la invención.
Los términos empleados para definir el kit y uso del kit de la invención han sido explicados para el método de la invención, y tanto ellos como sus realizaciones preferidas son aplicables también para el kit de la invención y su uso en el método de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variables los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y las variables ambientales uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, grado de obesidad área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto, en la cual cada punto de la gráfica muestra un posible punto de corte para el modelo en el cual informa sobre su sensibilidad concreta en ese punto (eje Y) con respecto a su 1- especificidad (eje X). Diagonalmente en el gráfico (desde 0,0 hasta 1 ,1) se representa la línea diagonal de referencia o línea de no discriminación. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 2. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 3. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 4. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs679620 del gen MMP3 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 5. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4 y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 6. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 7. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs679620 del gen MMP3 y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 8. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 9. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 10. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs679620 del gen MMP3. y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 11. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 12. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 13. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 14. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates.
Fig. 15. Gráfico de curva ROC del modelo de predicción teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el grado de obesidad. Los segmentos de la diagonal se generan mediante empates. EJEMPLOS
A continuación, se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la invención, incluyendo un ejemplo de la aplicación del método de la invención en la predicción del riesgo de un sujeto a sufrir fibrosis.
1. Metodología
Se seleccionaron un total de 240 pacientes que habían sido operados por el equipo de traumatología de la Unidad de Cirugía Artroscópica del doctor Mikel Sanchez. A todos ellos se les tomo una muestra de frotis bucal mediante los hisopos 4N6FLOQSwab-Life Technologies. El ADN de las muestras fue extraído mediante QIAmp DNA Mini kit (Qiagen), y cuantificado fluorimétricamente utilizando Qubit (Life Technologies). Las muestras de ADN resultantes fueron analizadas mediante un análisis de genotipado de SNPs (polimorfismos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4) utilizando la metodología Biomark HD system (Fluidigm). Los pacientes fueron categorizados teniendo en cuenta los siguientes factores ambientales:
- Tejido operado: cadera, hombro, rodilla, tobillo u otros
- sexo masculino o femenino del paciente;
- uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del paciente. Tal y como se usa aquí, el “plasma rico en plaquetas” (o PRP), es de tipo 13-00-11/24- 00-11 como se describe en Kon E., et al., Expert Opin Biol Ther., 20 (12):1447- 1460 (2020).
-grado de obesidad: considerándolo como un índice de masa corporal del paciente mayor a 30, o menor o igual a 30. Peso y talla se midieron estando el sujeto en ropa interior con una báscula- con una precisión de 100 gramos (peso) y 1 mm (talla). El cálculo del índice de masa corporal se realizó a través de la fórmula IMG (Kg/m2)= Peso (Kg)/(Talla (m))2.
A partir de los datos relativos a los factores ambientales, y los polimorfismos genéticos ambientales, los inventores aplicaron el siguiente algoritmo para la obtención del riesgo específico a generar fibrosis (denominado como P o valor P):
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en donde,
Po = 3,256 ix es la suma de todos los valores asignados según la Tabla 3, previamente mostrada en el presente documento.
Así, tomando como ejemplo el caso de un paciente varón que presentaba lesión en su ligamento cruzado de la rodilla derecha, siendo un área susceptible a sufrir fibrosis posquirúrgica, para el cual se recogieron los siguientes datos:
Peso = 83kg
Altura: 1.70 m
IMC= 83 / (1.70)2= 28.71
Sexo: hombre
Área susceptible a sufrir fibrosis: Rodilla.
Utilización de (PRGF®-Endoret®): Si
Además, se realizó un perfil genético para los rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, obteniendo el siguiente perfil genético: rs2228145 = A:C rs679620 = A:A rs9493150 = C:G rs1800796 = G:G rs17563 = C:T rs8032158 = C:C rs12456284 = A:A
Una vez obtenidos los datos, se obtuvo el valor de p para cada uno, y se sumaron todas las p para obtener el valor Pix. Dicho valor, así como la asignación de cada valor p (según la Tabla 3 previamente mostrada en el presente documento) viene representado en la Tabla 4.
Tabla 4. Valores p para las variables recogidas para el paciente problema.
Variable Posibilidad Beta (P) rs2228145 A:C -0,860 rs679620 A:A 0,000 rs9493150 C:G 0,000 rs1800796 G:G -0,618 rs17563 C:T -0,690 rs8032158 C:C 0,000 rs12456284 A:A 0,607
ÁREA Rodilla -1 ,552
SEXO Hombre -1 ,219
PRP Si 0,000
IMG <30 -1 ,229
Figure imgf000035_0001
5,561
Una vez obtenido el valor ix = -5,561 y teniendo en cuenta que o= 3,256, se reemplazan las variables con dichos valores en la fórmula:
Figure imgf000035_0002
obteniendo como resultado una P=0,090, es decir un riesgo del 9,00% de sufrir fibrosis.
2. Resultados
Siguiendo una metodología como la explicada anteriormente en pacientes, se aplicó en el algoritmo de la invención, es decir:
Figure imgf000035_0003
teniendo en cuenta diferentes variables genéticas y ambientales, realizándose para cada caso un análisis ROC.
2.1. Análisis ROC teniendo en cuenta los
Figure imgf000035_0004
rs2228145 del IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 v rs12456284 del gen SMAD4, v las variables ambientales uso o no uso de plasma rico en plagúelas en el tratamiento del sujeto, grado de obesidad área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
Se realizó un análisis ROC (Fig. 1), estableciendo el riego de 50,90% de sufrir fibrosis como punto de corte para clasificar al sujeto o paciente en cuestión como de alto o bajo riesgo de desarrollar fibrosis. Así, si el valor P calculado para el sujeto es mayor a 0,509, el sujeto es clasificado como de alto riesgo de sufrir fibrosis, mientras que si el valor P es menor a 0,509, el sujeto es clasificado como de bajo riesgo de sufrir fibrosis. Tomando el caso ejemplo del paciente varón para el que se obtuvo una P=0,090, dicho valor es netamente inferior al punto de corte seleccionado 0,509, por tanto, dicho paciente tiene bajo riesgo de desarrollar fibrosis.
El modelo mostró unos valores de Sensibilidad del: 74.8% y de especificidad del 73.6%. A continuación, se muestra una tabla de clasificación de los pacientes “Observado” frente a lo “Pronosticado” por el modelo (siendo ,00 no fibrosis y 1 ,00 si fibrosis) (Tabla 5).
Tabla 5. Tabla de clasificación de los pacientes3
Pronosticado
Figure imgf000036_0001
a. El valor de corte es ,509
En la Tabla 6, se ofrece el valor del área bajo la curva para el modelo, con una AUC (area under the curve) de 0,818 y su intervalo de confianza 95% (IC 95%) fue 0,766- 0,871.
Tabla 6. Área bajo la curva
Variables de resultado de prueba: Probabilidad pronosticada
Significación 95% de intervalo de confianza
Área Desv. Error3 asintóticab asintótico
Figure imgf000037_0001
Las variables de resultado de prueba: Probabilidad pronosticada tienen, como mínimo, un empate entre el grupo de estado real positivo y el grupo de estado real negativo. Las estadísticas podrían estar sesgadas. a. Bajo el supuesto no paramétrico b. Hipótesis nula: área verdadera = 0,5
2.2. Análisis ROC teniendo en cuenta 2, 3 y 4 variables.
Además del análisis ROC teniendo en cuenta todas las variables genéticas y ambientales del apartado anterior, se llevaron a cabo análisis ROC teniendo en cuenta un menor número de variables, demostrando que también tienen utilidad en la predicción del riesgo de un sujeto de sufrir fibrosis, tal y como muestran los resultados obtenidos y resumidos en la Tabla 7, Tabla 8 y Tabla 9.
Tabla 7. Resumen de los resultados arrojados por el análisis ROC (2 variables) en función de las variables genéticas y ambientales tenidas en cuenta a la hora de aplicar el algoritmo.
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000038_0001
La Fig. 2 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 3 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 4 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs679620 del gen MMP3 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 5 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs8032158 del gen NEDD4 y como variable ambiental el grado de obesidad.
La Fig. 6 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el grado de obesidad.
La Fig. 7 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética el polimorfismo rs679620 del gen MMP3 y como variable ambiental el grado de obesidad.
Tabla 8. Resumen de los resultados arrojados por el análisis ROC (3 variables) en función de las variables genéticas y ambientales tenidas en cuenta a la hora de aplicar el algoritmo.
Figure imgf000039_0001
La Fig. 8 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 9 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 10 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs679620 del gen MMP3. y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 11 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el grado de obesidad.
La Fig. 12 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4, y como variable ambiental el grado de obesidad. La Fig. 13 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs8032158 del gen NEDD4 y rs679620 del gen MMP3, y como variable ambiental el grado de obesidad. Tabla 9. Resumen de los resultados arrojados por el análisis ROC (4 variables) en función de las variables genéticas y ambientales tenidas en cuenta a la hora de aplicar el algoritmo.
Figure imgf000040_0001
La Fig. 14 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el uso o no de plasma rico en plaquetas.
La Fig. 15 muestra la curva ROC al aplicar el algoritmo teniendo en cuenta como variable genética los polimorfismos genéticos rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4 y como variable ambiental el grado de obesidad.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro de obtención de datos útiles para la predicción del riesgo de sufrir fibrosis de un sujeto, que comprende las siguientes etapas:
(a) analizar en una muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos;
(b) recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental, seleccionada de la lista que consiste en: uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad;
(c) asignar un valor p a los polimorfismos genéticos analizados en la etapa (a) según la Tabla 3, y asignar un valor a los datos recogidos del sujeto en la etapa (b) según la Tabla 3; y
(d) calcular un valor P de riesgo a sufrir fibrosis, mediante la aplicación del algoritmo:
Figure imgf000042_0001
en donde,
Po = 3,256
Pix es la suma de todos los valores p asignados en la etapa (c).
2. El método según la reivindicación 1 , en donde la etapa (a) comprende analizar, al menos, dos polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
3. El método según la reivindicación 2, en donde la etapa (a) comprende analizar, al menos, tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3, rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
4. El método según la reivindicación 3, en donde la etapa (a) comprende analizar tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, rs679620 del gen MMP3, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
5. El método según la reivindicación 4, en donde los polimorfismos genéticos son rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4 y rs679620 del gen MMP3.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa (a) además comprende analizar, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa (a) comprende analizar los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto de dos variables ambientales, en donde las variables ambientales son uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto y grado de obesidad.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la etapa (b) además comprende recoger datos del sujeto de, al menos, una variable ambiental seleccionada de la lista que consiste en área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la etapa (b) comprende recoger datos del sujeto de las variables ambientales uso o no uso de plasma rico en plaquetas en el tratamiento del sujeto, grado de obesidad, área del cuerpo susceptible a sufrir fibrosis y sexo del sujeto.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la fibrosis afecta a una articulación.
12. El método según la reivindicación 11 , en donde la articulación es seleccionada de la lista que consiste en rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la fibrosis es fibrosis postquirúrgica.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el sujeto va a ser sometido a una cirugía.
15. El método según la reivindicación 14, en donde la cirugía se realiza en una articulación.
16. El método según la reivindicación 15, en donde la articulación es seleccionada de la lista que consiste en rodilla, tobillo, cadera, hombro y codo.
17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la muestra biológica procede de cualquier tejido susceptible de una extracción de ADN.
18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el análisis de los polimorfismos que se lleva a cabo en la etapa (a) comprende el empleo de sondas que detectan dichos polimorfismos.
19. El método según la reivindicación 18, en donde las sondas se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:
20. SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, y cualquier combinación de ellos.
20. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el análisis de los polimorfismos se lleva a cabo en la etapa (a) mediante POR y/o secuenciación.
21. Kit que comprende los medios para analizar in vitro en una muestra biológica aislada de un sujeto, al menos, tres polimorfismos genéticos seleccionados de la lista que consiste en rs679620 del gen MMP3 rs8032158 del gen NEDD4, rs12456284 del gen SMAD4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
22. Kit según la reivindicación 21 , que además comprende los medios para analizar in vitro en la muestra biológica aislada del sujeto, al menos, un polimorfismo genético seleccionado de la lista que consiste en rs2228145 del gen IL6R, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, y cualquier otro polimorfismo que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con dichos polimorfismos genéticos.
23. Kit según la reivindicación 22, que comprende los medios para analizar in vitro en una muestra biológica aislada del sujeto, los polimorfismos genéticos rs2228145 del gen IL6R, rs679620 del gen MMP3, rs9493150 del gen CTGF, rs1800796 del gen IL-6, rs17563 del gen BMP4, rs8032158 del gen NEDD4 y rs12456284 del gen SMAD4.
24. Uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
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