WO2023249421A1 - L-히스티딘 배출 단백질 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산 방법 - Google Patents

L-히스티딘 배출 단백질 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산 방법 Download PDF

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    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • This application relates to a novel protein with histidine excretion activity, an L-histidine producing microorganism modified to express the protein, and a method of producing L-histidine using the microorganism.
  • L-Histidine is one of the 20 standard amino acids. From a nutritional point of view, adults do not require large amounts of it, but it is classified as an essential amino acid for growing children. In addition, L-histidine is involved in important physiological processes such as antioxidant and immune regulation, and is used in the medical industry as a raw material for gastric ulcer treatments, circulatory system treatments, and amino acid solution preparations.
  • L-histidine is especially abundant in hemoglobin, so it is mainly produced through protein hydrolysis extraction using blood meal.
  • this method has disadvantages such as low efficiency and environmental pollution.
  • PRPP phosphoribosyl pyrophosphate
  • the purpose of the present application is (1) the amino acid corresponding to the 72nd amino acid residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 is replaced with another amino acid, or
  • Another object of the present application is to provide a microorganism containing the protein or a polynucleotide encoding the protein.
  • Another object of the present application is to provide a composition for producing L-histidine containing the protein, a polynucleotide encoding the protein, or the microorganism.
  • Another object of the present application is to provide a use of the protein, the polynucleotide encoding the protein, or the microorganism for producing L-histidine.
  • Another object of the present application is to provide a use of the protein, the polynucleotide encoding the protein, or the microorganism for producing a composition for producing L-histidine.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing L-histidine, comprising culturing the microorganism in a medium.
  • This application proposes that L-histidine production can be dramatically improved by discovering a variant of a histidine excretion protein with the ability to excrete L-histidine and expressing it in a microorganism with the ability to produce L-histidine.
  • the protein may be a protein having a specific L-histidine excretion ability.
  • the variant protein may be expressed as a variant L-histidine release protein.
  • the variant protein may have AzlC family ABC transporter penetration activity.
  • the variant protein is equivalent to a wild-type L-histidine export protein (e.g., AzlD domain-containing protein, AzlC family ABC transporter permease, etc.) Or, it may have a more enhanced L-histidine excretion activity.
  • the AzlD domain-containing protein or the AzlC family ABC transporter permease protein may be derived from Helcobacillus massiliensis .
  • the AzlD domain-containing protein derived from Helcobacillus massiriensis may be referred to as the HmaE protein (or HmaE), and the AzlC family ABC transporter permease protein derived from Helcobacillus massiriensis may be referred to as the HmaF protein (or HmaF).
  • HmaE protein or HmaE
  • HmaF protein or HmaF
  • the variant protein (e.g., a variant protein of an AzlD domain-containing protein, specifically a variant protein of an AzlD domain-containing protein from Helcobacillus mairiensis) is identical to the AzlC family ABC transporter permease protein. It may be expressed together in operon genes. In one example, the variant protein may have L-histidine excretion activity by binding to the AzlC family ABC transporter permease protein.
  • the variant protein may be a variant protein of the AzlC series ABC transporter permease protein derived from Helcobacillus massiliensis .
  • the variant protein may be a variant protein in which one or more amino acid residues of the wild-type AzlC series ABC transporter permease protein derived from Helcobacillus marsiliensis are substituted, deleted, or inserted.
  • the wild-type AzlC series ABC transporter permease protein derived from Helcobacillus massiriensis may include or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 (WP_055090792.1).
  • the variant protein has the amino acid corresponding to (1) 72nd residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 replaced with a different amino acid, or
  • Both (1) and (2) above may contain substituted amino acid sequences.
  • Counting amino acids from the N-terminus in the amino acid sequence as described above may mean counting methionine (Met, M) translated from the start codon as the first amino acid.
  • the mutant protein is an amino acid different from the original amino acid in the amino acid corresponding to the (1) 72nd residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, such as leucine (Leu, L), Arginine (Arg, R), histidine (His, H), lysine (Lys, K), aspartic acid (Asp, D), glutamic acid (Glu, E), serine (Ser, S), threonine (Thr, T), Asparagine (Asn, N), glutamine (Gln, Q), cysteine (Cys, C), glycine (Gly, G), proline (Pro, P), alanine (Ala, A), valine (Val, V), methionine (Met, M), phenylalanine (Phe, F), tyrosine (Tyr, Y), or tryptophan (Trp, W), or
  • the amino acid corresponding to the 124th residue is a different amino acid, that is, an amino acid different from the original amino acid, such as valine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, serine, threonine, asparagine, glutamine, cysteine, glycine, proline, Contains a sequence substituted with alanine, leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine, or tryptophan, or
  • the variant protein is one in which (1) the amino acid corresponding to the 72nd residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 is substituted with leucine, glycine, proline, alanine, valine, or methionine;
  • residue 124 is substituted with valine, glycine, proline, alanine, leucine, or methionine;
  • the variant protein may be one in which the amino acid corresponding to the 72nd residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 is substituted with leucine, and the amino acid corresponding to the 124th residue is substituted with valine.
  • the variant proteins even if some amino acid sequences except those corresponding to the 72nd and/or 124th amino acid residues from the N-terminus of SEQ ID NO. 43 are deleted, modified, substituted, or added, they exhibit AzlC series ABC transporter permease activity. It is obvious that it can be included in the variant protein of the present application.
  • the variant protein has at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 91% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43.
  • an amino acid sequence having at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 99.5% sequence homology or sequence identity In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, from the N-terminus, (1) the amino acid corresponding to the 72nd residue is substituted with another amino acid, (2) the amino acid corresponding to the 124th residue is substituted with another amino acid, or (3) the above Both (1) and (2) may include substituted polypeptides.
  • polypeptides that have sequence homology or sequence identity of 99% or more, or 99.5% or more and that have AzlC family ABC transporter permease activity may be included in the variant protein of the present application.
  • the variant protein may include or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, but is not limited thereto.
  • the variant protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 even if some amino acid sequences are deleted, modified, substituted, or added except for the amino acids corresponding to the 72nd and/or 124th residues from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56.
  • the AzlC family ABC transporter can be included in the variant protein of the present application as long as it exhibits permease activity.
  • the variant protein has fixed amino acids corresponding to the 72nd and/or 124th residues from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, and is at least 60%, 65% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56. More than 70%, more than 75%, more than 80%, more than 85%, more than 90%, more than 91%, more than 92%, more than 93%, more than 94%, more than 95%, more than 96%, more than 97%, It may include polypeptides having at least 98%, at least 99%, or at least 99.5% sequence homology or sequence identity.
  • amino acid corresponding to the 72nd and/or 124th residue from the N-terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 is replaced with another amino acid, and is at least 60%, 65%, 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56. or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more,
  • a polypeptide having AzlC family ABC transporter permease activity that has more than 99% or more than 99.5% homology or identity may be included in the variant protein of the present application.
  • the mutant protein may have a more enhanced L-histidine excretion activity than the wild-type protein (eg, wild-type AzlD domain-containing protein).
  • the mutant protein when expressed together with a wild-type AzlC family ABC transporter permease protein, the L-histidine excretion activity may be further enhanced.
  • the wild-type L-histidine excretion protein is SEQ ID NO: 43 (wild-type AzlC family ABC transporter permease protein derived from Helcobacillus massiriensis), SEQ ID NO: 44 (wild-type AzlD domain-containing protein derived from Helcobacillus massiriensis), or a combination thereof. It may be a protein that has more than 60% sequence homology.
  • the wild-type L-histidine release protein has SEQ ID NO: 43, 44, or a combination thereof and 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more It may have a homology of % or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more. .
  • the protein represented by SEQ ID NO: 43 is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 45
  • the protein represented by SEQ ID NO: 44 is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 46, or is expressed by SEQ ID NO: 43 and/or SEQ ID NO: 44.
  • the protein may be encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 47 (which is an operon sequence fused at the overlapping region of the 3' end of SEQ ID NO: 45 and the 5' end of SEQ ID NO: 46).
  • Another aspect provides a polynucleotide encoding (encoding) the variant protein.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or more, which is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain by covalent bonds, and more specifically, the variant polypeptide. refers to a polynucleotide fragment encoding .
  • the polynucleotide encoding the variant protein of the present application may include a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56.
  • a polynucleotide may be used interchangeably with “gene” or a polypeptide (may be used interchangeably with “protein”) “comprises, consists of a particular nucleic acid sequence or amino acid sequence,” “or expressed by a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence” may mean that the polynucleotide or polypeptide essentially includes the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence, and the original function and/or function of the polynucleotide or polypeptide or a “substantially equivalent sequence” in which a mutation (deletion, substitution, modification, and/or addition) is added to the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence to the extent of maintaining the desired function (or a sequence that does not exclude the mutation) can be interpreted as).
  • nucleic acid sequence or amino acid sequence provided herein can be modified by conventional mutagenesis methods, such as directed evolution and/or site-specific methods, to the extent of maintaining their original or desired function. It may include modifications made by site-directed mutagenesis, etc.
  • saying that a polynucleotide or polypeptide “comprises or consists of a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence” means that the polynucleotide or polypeptide (i) includes the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence.
  • Consists of or essentially contains an amino acid sequence having at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 99.5% homology, and It may mean maintaining the function and/or the intended function.
  • the desired function may refer to a function that grants or increases the L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability of a microorganism.
  • nucleic acid sequence described herein is within a range that does not change the amino acid sequence and/or function of the protein expressed from the coding region, taking into account the preferred codon in microorganisms seeking to express the protein due to codon degeneracy. Various modifications can be made to the coding area within.
  • identity refers to the degree of identity with a given nucleic acid sequence or amino acid sequence and can be expressed as a percentage (%).
  • the literature algorithm BLAST see Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993
  • FASTA Pearson
  • BLASTN BLASTTN
  • BLASTX BLASTX
  • a polynucleotide comprising a specific nucleic acid sequence includes not only the specific nucleic acid sequence or a nucleic acid sequence substantially equivalent thereto, but also a polynucleotide fragment comprising a nucleic acid sequence complementary to the specific nucleic acid sequence. It can be interpreted as Specifically, the polynucleotide having the complementarity can be hybridized at a Tm value that can be appropriately adjusted by a person skilled in the art depending on the purpose, for example, a Tm value of 55°C, 60°C, 63°C, or 65°C, and analyzed under the conditions described below. : These conditions are specifically described in well-known literature.
  • genes with high complementarity of 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more are hybridized, and genes with lower complementarity are not hybridized, or normal Southern hybridization.
  • washing conditions 60°C, 1x SSC (saline-sodium citrate buffer), and 0.1% (w/v) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate); 60°C, 0.1x SSC, and 0.1% SDS; Alternatively, conditions of washing once, specifically 2 to 3 times, at a salt concentration and temperature equivalent to 68°C, 0.1x SSC, and 0.1% SDS may be listed, but are not limited thereto.
  • Hybridization requires that two nucleotides have complementary sequences, or mismatches between bases may be allowed depending on the stringency of hybridization.
  • the term “complementary” can be used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other.
  • adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the appropriate stringency to hybridize a polynucleotide depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, which are well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • transformation refers to the process of introducing a specific polynucleotide or a vector containing the same into a host cell.
  • the transformed polynucleotide may be inserted into a chromosome within the host cell or may be located outside the chromosome.
  • transformation may be the introduction of a polynucleotide encoding a target protein (foreign protein) or a vector containing it into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed within the host cell.
  • the polynucleotide may include DNA and/or RNA encoding a target protein.
  • the form in which it is introduced is not limited.
  • the polynucleotide can be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic structure containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may typically include expression control elements such as a promoter, transcription termination signal, ribosome binding site, and/or translation termination signal that are operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • operably linked means that the expression control element (e.g., promoter) and the polynucleotide can perform transcriptional regulation (e.g., transcription initiation) of the polynucleotide encoding the target protein (foreign protein). It may mean that nucleotides are functionally linked. Operable linking can be performed using genetic recombination techniques known in the art, such as, but not limited to, conventional site-specific DNA cutting and ligation.
  • the method of transforming the polynucleotide into a host cell can be performed by any method that introduces a nucleic acid into a cell (microorganism), and can be performed by appropriately selecting transformation techniques known in the art depending on the host cell.
  • the known transformation methods include electroporation, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl2) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) precipitation (polyethylene glycol-mediated uptake), Examples may include the DEAE-dextran method, cationic liposome method, lipofection, and lithium acetate-DMSO method, but are not limited thereto.
  • RNA-guided endonuclease system RNA-guided endonuclease system or CRISPR system.
  • RNA-guided endonuclease e.g., Cas9 protein, etc.
  • guide RNA e.g., single guide RNA (sgRNA), etc.
  • a mixture containing the coding DNA thereof, or a vector containing the DNA e.g., a mixture of an RNA-guide endonuclease protein and a guide RNA, etc.
  • a complex e.g., a ribonucleic acid fusion protein (RNP), a recombinant vector (e.g., , a vector containing an RNA-guide endonuclease encoding gene and a guide RNA encoding DNA, etc.), etc.
  • RNP ribonucleic acid fusion protein
  • recombinant vector e.g., a vector containing an RNA-guide endonuclease encoding gene and a guide RNA encoding DNA, etc.
  • Another aspect provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • the recombinant vector can be used as an expression vector for the polypeptide.
  • the recombinant vector may be used to insert the polynucleotide into the host cell genome or replace the corresponding gene in the host cell genome.
  • the term “vector” refers to a DNA preparation containing the base sequence of a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable control sequence to enable expression of the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequences may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence to regulate transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and/or sequences that regulate the termination of transcription and/or translation. there is.
  • the vector can be transformed into a suitable host cell and then expressed independently of the host cell's genome or integrated into the host cell's genome.
  • the vector that can be used herein is not particularly limited as long as it can replicate within the host cell, and can be selected from all commonly used vectors.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector
  • pBR series and pUC can be used as the plasmid vector.
  • type, pBluescriptII type, pGEM type, pTZ type, pCL type and pET type can be used.
  • examples include pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, and pCC1BAC vectors, but are not limited thereto.
  • Vectors that can be used herein may be known expression vectors and/or vectors for inserting polynucleotides into the host cell chromosome. Insertion of the polynucleotide into the host cell chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination or CRISPR system, but is not limited thereto.
  • the vector may additionally include a selection marker to confirm insertion into the chromosome.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to confirm whether or not the polynucleotide is inserted, and displays selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface proteins. Can be selected and used from among genes that provide . In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or show other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • Another aspect includes one or more (one, two, or all three) selected from the group consisting of the variant protein, a polynucleotide encoding the variant protein, and a recombinant vector containing the polynucleotide.
  • the microorganism may have L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability.
  • the microorganism includes at least one species selected from the group consisting of the variant protein having L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability, a polynucleotide encoding the variant protein, and a recombinant vector containing the polynucleotide. It may be enhanced (or increased, improved) compared to microorganisms that do not.
  • the variant protein may be foreign.
  • “foreign” may mean something that is not inherently present in a microorganism, but is derived from a species different from the microorganism.
  • microorganisms with enhanced L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability are engineered (mutated) to express the variant protein described above, thereby having L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability.
  • microorganism encompasses single-celled bacteria and may be used interchangeably with “cell.”
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and microorganisms that have undergone natural or artificial genetic modification, and can be caused by insertion of foreign genes or enhanced or inactivated activity of intrinsic genes. It is a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened, and may be a microorganism that includes genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein, or product (e.g., L-histidine).
  • the microorganism of the present application may be a microorganism (e.g., a recombinant microorganism) that has been genetically modified through a vector to enhance the activity of the L-histidine release protein or the polynucleotide encoding it, but is not limited thereto.
  • the vector is the same as described above.
  • microorganism in order to distinguish a microorganism before being mutated to express the variant protein from the mutated microorganism, it may be expressed as a “parent microorganism or parent strain” or “host cell.”
  • That the microorganism (or strain, recombinant cell) has L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability, or that L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability is enhanced, means that the L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability are enhanced.
  • a recombinant may mean that L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability is improved compared to the previous cell, parent strain, and/or wild-type strain.
  • the microorganism of the present application is a microorganism containing at least one of the variant protein of the present application, a polynucleotide encoding the variant protein of the present application, and a vector containing the polynucleotide of the present application; Microorganisms modified to express the variant protein of the present application or the polynucleotide of the present application; Microorganisms (e.g., recombinant strains) expressing the variant protein of the present application, or the polynucleotide of the present application; Or it may be a microorganism (e.g., a recombinant strain) having the activity of the variant protein of the present application, but is not limited thereto.
  • the microorganism may be one or more species selected from the group consisting of the genus Corynebacterium microorganisms, Escherichia microorganisms, etc.
  • the microorganisms in the Corynebacterium genus include Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium ammoniagenes , Brevibacterium lactofermentum , and Brevibacterium flavum. ( Brevibacterium flavum ), Corynebacterium thermoaminogenes ( Corynebacterium thermoaminogenes ), Corynebacterium efficiens ( Corynebacterium efficiens ), etc., but are not necessarily limited thereto. More specifically, the microorganism of the Corynebacterium genus may be Corynebacterium glutamicum .
  • the Escherichia genus strain may be Escherichia coli .
  • the microorganism may include one or more (one, two, or all three) selected from the group consisting of a variant protein, a polynucleotide encoding the variant protein, and a recombinant vector containing the polynucleotide.
  • the mutation to express the variant protein is performed by introducing a polynucleotide encoding the variant protein described above, or a recombinant vector containing the same, or by artificial mutation (e.g., Error-prone PCR, etc. ) may be performed by, etc.
  • the polynucleotide encoding the mutant protein introduced into the parent strain may replace or be included in addition to the gene encoding the AzlC family ABC transporter permease within the parent strain.
  • the L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability may be further enhanced.
  • the microorganism with enhanced L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability has an L-histidine production ability of about 10% compared to the parent strain before mutation, an unmodified microorganism, and a microorganism containing a wild-type L-histidine excretion protein. It may be an increase of 10% or more, 15% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, or 80% or more, but is not limited thereto.
  • the microorganism with enhanced L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability has an L-histidine production ability of about 10% compared to the parent strain before mutation, an unmodified microorganism, and a microorganism containing a wild-type L-histidine excretion protein. It may be, but is limited to, an increase of 1 g/L or more, 1.5 g/L or more, 2 g/L or more, 2.5 g/L or more, 3 g/L or more, 3.5 g/L or more, or 4 g/L or more. That is not the case.
  • compositions for producing L-histidine comprising the variant protein, the polynucleotide, the recombinant vector, or the microorganism.
  • Another aspect provides use of the variant protein, the polynucleotide, the recombinant vector, or the microorganism for L-histidine production.
  • Another aspect provides use of the variant protein, the polynucleotide, the recombinant vector, or the microorganism for producing a composition for producing L-histidine.
  • Another aspect provides a method for producing (manufacturing) L-histidine, comprising culturing the microorganism in a medium.
  • the production method may further include recovering L-histidine from the cultured microorganism, medium, or both after the culturing step.
  • Another aspect is a method for increasing the L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability of the microorganism, comprising the step of enhancing the L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability of the microorganism, or A method for imparting L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability to microorganisms is provided.
  • the step of introducing the mutation includes introducing (transforming) a polynucleotide encoding a variant protein or a recombinant vector containing the polynucleotide into a microorganism, or artificially generating a mutation (e.g., Error- prone PCR, etc.).
  • Another example provides a method for producing L-histidine, comprising culturing the microorganism with enhanced L-histidine excretion activity and/or L-histidine production ability in a medium.
  • the method may further include recovering L-histidine from the cultured microorganism, medium, or both after the culturing step.
  • the step of cultivating the microorganism is not particularly limited thereto, but may be performed by known batch culture methods, continuous culture methods, fed-batch culture methods, etc.
  • the culture conditions are not particularly limited, but are adjusted to an appropriate pH (e.g., pH 5 to 9, specifically, using a basic compound (e.g., sodium hydroxide, potassium hydroxide, or ammonia) or an acidic compound (e.g., phosphoric acid or sulfuric acid). can adjust pH 6 to 8) and maintain aerobic conditions by introducing oxygen or an oxygen-containing gas mixture into the culture.
  • the culture temperature can be maintained at 20 to 45°C, or 25 to 40°C, and culture can be performed for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • L-histidine produced by the above culture may be secreted into the medium or remain within the cell.
  • the medium usable for the culture includes sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molase, starch and cellulose), oils and fats (e.g. soybean oil, sunflower seed oil, etc.) as carbon sources.
  • sugars and carbohydrates e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molase, starch and cellulose
  • oils and fats e.g. soybean oil, sunflower seed oil, etc.
  • Peanut oil and coconut oil fatty acids (e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (e.g. glycerol and ethanol), organic acids (e.g. acetic acid), etc. are used individually or Alternatively, a mixture of two or more types may be used, but is not limited thereto.
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (e.g.
  • peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean meal, and urea) and inorganic compounds e.g. ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and nitric acid).
  • Ammonium etc.
  • a phosphorus source one or more types selected from the group consisting of potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and corresponding sodium-containing salts may be used individually or two or more types may be used in combination, but is not limited thereto.
  • the medium may contain essential growth-promoting substances such as other metal salts (e.g., magnesium sulfate or iron sulfate), amino acids, and/or vitamins.
  • the step of recovering L-histidine may involve collecting the desired amino acid from a medium, culture medium, or microorganism using a suitable method known in the art depending on the culture method.
  • the recovering step may be performed by one or more methods selected from centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC, etc.
  • the method for recovering L-histidine may additionally include a purification step before, at the same time, or thereafter.
  • the present application discovers a histidine-excreting protein or a variant thereof with the ability to excrete L-histidine and expresses it in a microorganism with the ability to produce L-histidine, thereby dramatically improving L-histidine production.
  • excretion proteins basic amino acids: L-lysine (L-lys), aromatic amino acids: tryptophan (Trp), side amino acids: isoleucine (Ile)
  • LysE Basic amino acids: L-lysine (L-lys)
  • Trp aromatic amino acids
  • Ile side amino acids: isoleucine (Ile)
  • LysE The amino acid sequences of LysE (Arch Microbiol 180: 155-160), Wex (Korea Patent No. 10-1968317), and BrnFE (Arch Microbiol 180: 155-160)) were used as query sequences, and based on NCBI and Kegg database.
  • PSI-BLAST search candidate genes predicted to be membrane proteins likely to excrete L-histidine and microorganisms possessing them were selected.
  • the biosafety level is based on the microbial pathogenicity index (level 1 to 4) defined by the U.S. Centers for Disease Control and Prevention (the lower the level, the safer)
  • Example 2 Construction of a foreign L-histidine excretion gene candidate introduction vector and a recombinant Corynebacterium strain introducing the same
  • Example 2-1 Construction of vector pDZ ⁇ N2131 for target gene insertion
  • NCgl2131 deletion and target gene insertion vectors were constructed.
  • PCR was performed using the chromosome of Corynebacterium glutamicum strain ATCC13032 as a template and primer pairs of SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 21, respectively.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And after repeating the polymerization reaction at 72°C for 2 minutes 28 times, the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes, resulting in 531 bp of del-N2131L (SEQ ID NO: 22) and 555 bp of del-N2131R (SEQ ID NO: 23) DNA, respectively. A fragment was obtained.
  • the obtained DNA product was purified using QIAGEN's PCR Purification kit and cloned using pDZ vector (Korean Patent No. 10-0924065) and TaKaRa's Infusion Cloning Kit, resulting in NCgl2131 gene deletion and target gene insertion.
  • the vector pDZ ⁇ N2131 was created.
  • haq SEQ ID NO: 2 encoding a protein derived from Herbaspirillum aquaticum (hereinafter, Haq , SEQ ID NO: 1) was obtained from the National Institutes of Health GenBank (NIH GenBank).
  • NIH GenBank National Institutes of Health GenBank
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25 using the chromosomal DNA of the Herbaspirillum aquaticum strain (KCTC42001) as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 2 minutes, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 977bp haq fragment including 945bp haq (SEQ ID NO: 2).
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times for 1 minute at 72°C, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 441bp PgapA fragment including 409bp of PgapA (SEQ ID NO: 17).
  • the obtained haq fragment, PgapA fragment, and pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were subjected to Gibson assembly (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) method.
  • Gibson assembly DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
  • Base sequence information of the gene (hereinafter, cpi, SEQ ID NO: 4) encoding a protein derived from Cupriavidus pinatubonensis (hereinafter, Cpi , SEQ ID NO: 3) was obtained from NIH GenBank.
  • Cpi protein derived from Cupriavidus pinatubonensis
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 using the chromosomal DNA of the Cupriavidus pinatubonensis strain (KCTC22125) as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 2 minutes, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes. As a result, a 977bp cpi fragment including 945bp of cpi (SEQ ID NO: 4) was obtained.
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 30 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times for 1 minute at 72°C, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 441bp PgapA fragment including 409bp of PgapA (SEQ ID NO: 17).
  • the obtained cpi fragment, PgapA fragment, and pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, which was named pDZ ⁇ N2131-PgapA-Cpi.
  • Base sequence information of the gene (hereinafter, kcr, SEQ ID NO: 6) encoding a protein derived from Kluyvera cryocrescens (hereinafter, Kcr , SEQ ID NO: 5) was obtained from NIH GenBank.
  • Kcr a protein derived from Kluyvera cryocrescens
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 using the chromosomal DNA of the Kluyvera cryocrescens strain (KCTC2580) as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times for 2 minutes at 72°C, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 914bp kcr fragment including 882bp of kcr (SEQ ID NO: 6). To obtain a PgapA fragment that can be linked to kcr , PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 33 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 1 minute, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes. As a result, a 441bp PgapA fragment including 409bp of PgapA (SEQ ID NO: 17) was obtained.
  • the obtained kcr fragment, PgapA fragment, and pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, which was named pDZ ⁇ N2131-PgapA-Kcr.
  • Base sequence information of the gene (hereinafter, cst, SEQ ID NO: 8) encoding a protein derived from Corynebacterium stationis (hereinafter, Cst , SEQ ID NO: 7) was obtained from the National Institutes of Health GenBank (NIH GenBank).
  • NIH GenBank National Institutes of Health GenBank
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 using the chromosomal DNA of Corynebacterium stationis strain (ATCC6872) as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 2 minutes, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 749bp cst fragment including 717bp of cst (SEQ ID NO: 8). To obtain a PgapA fragment that can be linked to cst , PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 36 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 1 minute, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes. As a result, a 441bp PgapA fragment including 409bp of PgapA (SEQ ID NO: 17) was obtained.
  • the obtained cst fragment, PgapA fragment, and pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, which was named pDZ ⁇ N2131-PgapA-Cst.
  • Base sequence information of the operon (hereinafter, lsa, SEQ ID NO: 11) encoding a protein derived from Leucobacter salsicius (hereinafter, LsaFE , SEQ ID NO: 9, 10) was obtained from NIH GenBank.
  • LsaFE protein derived from Leucobacter salsicius
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 using the chromosomal DNA of Leucobacter salsicius strain (KCTC19904) as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 2 minutes, and then polymerization was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 1080bp lsa fragment including 1048bp lsa (SEQ ID NO: 11).
  • SEQ ID NO: 11 1080bp lsa fragment including 1048bp lsa
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 39 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times for 1 minute at 72°C, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 441bp PgapA fragment including 409bp of PgapA (SEQ ID NO: 17).
  • the obtained lsa fragment, PgapA fragment, and pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, which was named pDZ ⁇ N2131-PgapA-Lsa.
  • Base sequence information of the operon (hereinafter, dva , SEQ ID NO: 16) encoding a protein derived from Dermabacter vaginalis (hereinafter, DvaFE, SEQ ID NO: 12, 13) was obtained from NIH GenBank.
  • DvaFE protein derived from Dermabacter vaginalis
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41 using the chromosomal DNA of Dermabacter vaginalis strain (KCTC39585) as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And after repeating the polymerization reaction at 72°C for 2 minutes 28 times, the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 1113 bp dva fragment including 1081 bp dva (SEQ ID NO: 16). To obtain a PgapA fragment that can be linked to dva , PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 42 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times for 1 minute at 72°C, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a 441bp PgapA fragment including 409bp of PgapA (SEQ ID NO: 17).
  • the obtained dva fragment, PgapA fragment, and pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, which was named pDZ ⁇ N2131-PgapA-Dva.
  • the constructed NCgl2131 deletion vector (pDZ ⁇ N2131) and six foreign L-histidine excretion gene candidate introduction vectors (pDZ ⁇ N2131-PgapA-Haq, pDZ ⁇ N2131-PgapA) were used.
  • ATCC13032 ⁇ N2131 N2131 gene deletion
  • ATCC13032 ⁇ N2131::Haq N2131 gene replaced with haq
  • ATCC13032 ⁇ N2131::Cpi N2131 gene replaced with cpi
  • ATCC13032 ⁇ N2131::Kcr N2131 gene replaced with kcr
  • ATCC13032 ⁇ N2131 They were named ::Cst (N2131 gene replaced with cst ), ATCC13032 ⁇ N2131::Lsa (N2131 gene replaced with lsa ), and ATCC13032 ⁇ N2131::Dva (N2131 gene replaced with dva ).
  • Example 2 Seven recombinant Corynebacterium glutamicum strains produced in Example 2 (ATCC13032 ⁇ N2131, ATCC13032 ⁇ N2131::Haq, ATCC13032 ⁇ N2131::Cpi, ATCC13032 ⁇ N2131::Kcr, ATCC13032 ⁇ N2131::Cst, ATCC13032 ⁇ N2 131::Lsa, and ATCC13032 ⁇ N2131: :Dva), a minimum inhibitory concentration (MIC) experiment using L-histidine was performed to confirm whether the L-histidine excretion activity was maintained. Seven types of strains were cultured in minimal liquid medium at 30 °C for 24 hours, then diluted to 1 The minimum solid medium composition used is as follows:
  • + indicates the relative growth degree of the strains, each indicating the following: +: single colony is not formed, but heavy (a form that cannot grow as a single colony but grows in clusters) is formed;++: heavy formation and less than 5 single colonies are formed;
  • the Dermabacter vaginalis -derived protein Dva was selected as a protein that confers resistance to L-histidine above the minimum inhibitory concentration to Corynebacterium strains and has a specific L-histidine excretion ability.
  • Example 4 Based on Corynebacterium-derived L-histidine producing strain (KCCM 80179) Dermabacter vaginalis Derived gene ( dva) Production of introduced strain and evaluation of L-histidine production ability
  • the Dermabacter vaginalis -derived gene dva was introduced into the L-histidine producing strain KCCM 80179 (Korean Patent Publication No. 10-2019-0065984).
  • the vectors pDZ ⁇ N2131 and pDZ ⁇ N2131-PgapA-Dva constructed in Example 2 were each transformed into the KCCM80179 strain by electroporation, and through a second crossover process, the NCgl2131 gene on the chromosome was deleted or the L-histidine export gene candidate was transformed.
  • Two strains with a substitution of ( dva ) were created, and they were named KCCM 80179 ⁇ N2131 (NCgl2131 gene deleted) and KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Dva (NCgl2131 gene substituted with dva ), respectively.
  • KCCM 80179 ⁇ N2131 and KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Dva strains produced above they were cultured in the following manner: KCCM 80179 ⁇ N2131 and KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Dva strains were cultured in activation medium for 16 hours. Afterwards, each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium, and cultured at 30° C. for 20 hours with shaking at 200 rpm.
  • L-histidine production (histidine content in the medium) was measured by HPLC, and the results are shown in Table 3 below:
  • the NCgl2131 deletion strain has an L-histidine production ability equivalent to that of the parent strain, KCCM 80179 strain, while the KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Dva strain into which the Dermabacter vaginalis- derived gene was introduced has the NCgl2131 deletion strain and It was confirmed that the L-histidine production ability was increased by more than 23% and 21%, respectively, compared to the parent strain, KCCM 80179 strain.
  • the introduction of a gene derived from Dermabacter vaginalis not only increased resistance to L-histidine concentrations above the minimum inhibitory concentration, but also significantly increased the ability to produce L-histidine.
  • Example 5 Dermabacter vaginalis Securing additional derived L-histidine emitter-like protein
  • a vector was constructed to introduce the two additional L-histidine excretion gene candidates selected in Example 5 into a Corynebacterium genus strain.
  • the NCgl2131 gene was used as a deletion site and PgapA was used as a promoter.
  • HmaFE Helcobacillus massiliensis
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 2 minutes, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes. As a result, a 1113bp hma fragment including 1081bp hma (SEQ ID NO: 47) was obtained. To obtain a PgapA fragment that can be linked to hma, PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 50 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 1 minute, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes. As a result, a 441bp PgapA fragment including 409bp of PgapA (SEQ ID NO: 17) was obtained.
  • the obtained hma fragment, PgapA fragment, and pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, which was named pDZ ⁇ N2131-PgapA-Hma.
  • Example 7 Based on L-histidine producing strain (KCCM 80179) Helcobacillus massiliensis Introduction of derived genes ( hma ) Strain production and evaluation of L-histidine production ability
  • the vector pDZ ⁇ N2131-PgapA-Hma prepared in Example 6 was transformed into the KCCM80179 strain by electroporation, and through a second crossover process, a strain in which the NCgl2131 gene on the chromosome was replaced with a candidate L-histidine export gene was created. It was named KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma (NCgl2131 gene replaced with hma).
  • the strain was cultured by the method performed in Example 4 and L-histidine production was measured.
  • culture and L-histidine production were measured in the same manner for the KCCM 80179 ⁇ N2131 strain and the KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Dva strain produced in Example 4. The obtained results are shown in Table 6.
  • Example 8 Production of Hma mutation library using artificial mutagenesis method
  • a mutant protein expression vector library for primary crossover was created.
  • hma operons in which base substitution mutations were randomly introduced were obtained by error-prone PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 49 using the constructed pDZ ⁇ N2131-PgapA-Hma as a template.
  • Error-prone PCR was performed using the GenemorphII Random Mutagenesis Kit (Stratagene) under conditions where 0 to 3.5 mutations per 1 kb were introduced into the amplified gene fragment.
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 50 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 1 minute, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a PgapA fragment.
  • the obtained mutant hma operons, PgapA fragment, and pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were subjected to Gibson assembly (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix).
  • Example 9 Introduction of Hma artificial mutation library and selection of strains with increased L-histidine production ability
  • the constructed pDZ ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt) library was transformed by homologous chromosomal recombination and plated on a composite plate medium containing kanamycin (25 mg/L) to form about 7,000 colonies. was secured, and each colony was named ATCC13032 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-1 to ATCC13032 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-7000.
  • Glucose 10g Peptone 10g, Beef extract 5g, Yeast extract 5g, Brain Heart Infusion 18.5g, NaCl 2.5g, Urea 2g, Sorbitiol 91g, Agar 20g (based on 1 liter of distilled water)
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) test for L-histidine performed in Example 3 was performed on the obtained 7000 colonies. For efficient screening, it was performed based on liquid minimal medium containing 3g of L-histidine. The colony was immediately inoculated into 300ul of liquid minimal medium and cultured in a 96-deep well plate at 32 ⁇ C and 1000rpm for about 18 hours, and then the OD600 value was measured to select colonies with excellent growth.
  • As a control the ATCC13032 ⁇ N2131 strain and ATCC13032 ⁇ N2131::Hma strain prepared above were used. 251 colonies were selected through the first experiment, and 36 colonies were selected through a repeat experiment.
  • the media components used are as follows.
  • + indicates the relative growth degree of the strains, each indicating the following: +: single colony is not formed, but heavy (a form that cannot grow as a single colony but grows in clusters) is formed;++: heavy formation and less than 5 single colonies are formed;
  • NCgl2131 deletion strain (ATCC13032 ⁇ N2131) did not grow smoothly in minimal medium containing 1 g/L of L-histidine, but the ATCC13032 ⁇ N2131::Hma strain into which the gene derived from Helcobacillus massiliensis was introduced grew smoothly.
  • Example 10 Production of selection library introduction strain based on Corynebacterium-derived L-histidine producing strain (KCCM 80179) and evaluation of L-histidine production ability
  • a vector was constructed to introduce the variant hma contained in the six colonies selected in Example 9 into an L-histidine producing strain.
  • PCR conditions were denaturation 96°C, 30 seconds; Annealing 53°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72°C for 2 minutes.
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 50 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 1 minute, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a PgapA fragment.
  • the six mutant hma fragments obtained above, the PgapA fragment, and the pDZ ⁇ N2131 vector cut with ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, which was converted into pDZ ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt) according to the derived library colony.
  • the constructed vector was transformed into the KCCM 80179 strain by electroporation, and through a second crossing process, 6 strains into which 6 mutant hma strains were introduced were produced, respectively: KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-1216, KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-2315, KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-3411, KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-4426, KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-5 714, KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma( It was named mt)-6718.
  • Example 7 In order to confirm the L-histidine production ability of the six strains produced above, the KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma strain produced in Example 7 was used as a control and measured in the same manner as in Example 4, and the results are shown in Table Shown in 8:
  • KCCM 80179 L-histidine production of 6 mutant hma-introduced strains derived from KCCM 80179 Cell OD 600 used Glucose (g/L) histidine Yield (g/L) KCCM 80179 51.0 100 13.9 KCCM 80179 ⁇ N2131 51.1 100 14.0 KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma 43.5 100 16.5 KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-1216 50.1 100 15.1 KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-2315 45.8 100 16.2 KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-3411 40.1 100 16.4 KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-4426 44.0 100 16.2 KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-
  • the NCgl2131 deletion strain (KCCM 80179 ⁇ N2131) has an L-histidine production ability equivalent to that of the parent strain, KCCM 80179 strain, while the ATCC13032 ⁇ N2131::Hma strain into which the gene derived from Helcobacillus massiliensis was introduced has NCgl2131 deletion.
  • the L-histidine production ability increased compared to the strain and the parent strain, KCCM 80179 strain.
  • the six strains into which each of the six mutant hma strains were introduced were equivalent to or equivalent to the KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma strain compared to the NCgl2131 deletion strain and the parent strain, KCCM 80179 strain.
  • the L-histidine production ability increased to a higher level, and in particular, the L-histidine production ability of the KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-5714 and KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-6718 strains was higher than that of KCCM 80179 ⁇ N2131-PgapA into which wild type hma was introduced. It was confirmed that there was an increase of 3.6% and 12.1%, respectively, compared to -Hma.
  • the base sequence of the Hma variant was analyzed.
  • PCR was performed using the gDNA of the KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-6718 strain as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 21.
  • the base sequence of the variant hma operon and the protein sequence of HmaF or HmaE were confirmed and compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO. 43 or SEQ ID NO. 44, and the mutation information of the amino acid sequence of the variant HmaFE confirmed through this was It is shown in Table 9.
  • the mutant HmaFE introduced into the KCCM80179 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-6718 strain has I72L (isoleucine (Ile, I) at position 72 of SEQ ID NO. 43 is mutated to leucine (Leu, L)) and I124V in HmaF. (Isoleucine (Ile, I) at position 124 of SEQ ID NO: 43 is mutated to valine (Val, V)) It was confirmed that this was a mutant excretor with increased L-histidine excretion ability due to the introduction of the mutation.
  • Example 12 Based on L-histidine producing strain (CA14-737) Helcobacillus massiliensis Production of strain introduced with derived mutant gene and evaluation of L-histidine production ability
  • the HisG polypeptide mutation was introduced to eliminate the feedback limitation caused by L-histidine from wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032, and the L-histidine biosynthesis gene. was introduced into the enhanced L-histidine producing strain CA14-737 (KCCM 12411P, Republic of Korea Patent Publication No. 10-2019-0065984).
  • the three vectors (pDZ ⁇ N2131, pDZ ⁇ N2131-PgapA-Hma, pDZ ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-6718) prepared in Examples 2 and 10 were each transformed into the CA14-737 strain by electroporation, and the second Through a crossover process, three strains were created in which the NCgl2131 gene on the chromosome was deleted or replaced with an L-histidine export gene, which were CA14-737 ⁇ N2131, CA14-737 ⁇ N2131-PgapA-Hma, and CA14-737 ⁇ N2131-PgapA-Hma (mt), respectively. )-6718.
  • the CA14-737 ⁇ N2131-PgapA-Hma strain into which the gene derived from Helcobacillus massiliensis was introduced increased L-histidine production by 54% compared to the NCgl2131 deletion strain (CA14-737 ⁇ N2131) and the parent strain CA14-737 strain;
  • the CA14-737 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-6718 strain into which the mutant hma was introduced increased by 78%.
  • primer pairs of SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53 were used using the chromosomal DNA of ATCC13032 ⁇ N2131-PgapA-Hma and ATCC13032 ⁇ N2131-PgapA-Hma(mt)-6718 as templates.
  • Wild-type and mutant hma DNA fragments were obtained by performing PCR, respectively. PCR conditions were denaturation 96°C, 30 seconds; Annealing 53°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 30 times at 72°C for 2 minutes.
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55 using the chromosome of MG1655 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase for the PCR reaction, and the PCR conditions were as follows: denaturation 95°C, 30 seconds; Annealing 55°C, 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 1 minute, and then the polymerization reaction was performed at 72°C for 5 minutes to obtain a PyccA fragment.
  • Example 14 Based on L-histidine producing strain derived from E. coli Helcobacillus massiliensis Production of strains introduced with Hma wild-type genes and variants and evaluation of L-histidine production ability
  • the two vectors constructed in Example 13 and the pBAC vector were used with previously reported genotypes (purR deletion, hisL deletion) , hisGr; CA14-9003e strain (MG1655+ hisGr hisL'_ ⁇ ) with the directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants; Applied Biochemistry and Microbiology, 2013, Vol. 49, No. 2, pp.
  • CA14-9003e/pBAC, CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma, and CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma(mt)-6718 strains produced above use the following method. Cultured. After culturing the strains in LB solid medium (containing 25 ⁇ g/ml of chloramphenicol) for 16 hours, each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of LB liquid medium, and incubated at 37 ° C. for 20 hours, at 200 °C. The culture was shaken at rpm.
  • Glucose 4% (w/v), yeast extract 0.2% (w/v), ammonium sulfate 1.6% (w/v), potassium dibasic phosphate trihydrate 0.06% (w/v), iron sulfate heptahydrate 0.0005% ( w/v), magnesium sulfate pentahydrate 0.0005% (w/v), calcium carbonate, pH 7.2,
  • L-histidine production (histidine content in the medium) was measured by HPLC, and the results are shown in Table 11 below.
  • the CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma(mt)-6718 strain into which the mutant Hma was introduced had an L-histidine production capacity of 30% compared to the CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma strain into which the wild type Hma was introduced. % increase was confirmed. Through the above results, it was confirmed that the ability to excrete L-histidine out of the cell was significantly increased even when the L-histidine exporter variant derived from Helcobacillus massiliensis was introduced into microorganisms other than Corynebacterium strains.

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Abstract

본 출원은 L-히스티딘 배출능을 갖는 히스티딘 배출 단백질 또는 이의 변이체를 발굴하고, 이를 L-히스티딘의 생산능을 가지는 미생물에서 발현시킨 결과, L-히스티딘 생산량을 획기적으로 향상시킬 수 있다.

Description

L-히스티딘 배출 단백질 및 이를 이용한 L-히스티딘 생산 방법
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2022년 6월 23일자 대한민국 특허출원 제10-2022-0076773호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 대한민국 특허출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 출원은 히스티딘 배출 활성을 갖는 신규 단백질, 상기 단백질이 발현되도록 변형된 L-히스티딘 생산 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-히스티딘을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-히스티딘은 20개의 표준 아미노산들 가운데 하나의 아미노산으로, 영양학적인 관점에서 볼 때 성인에게는 많은 양이 요구되지 않지만, 성장기 어린이들에게는 해당하는 필수 아미노산으로 분류된다. 또한, L-히스티딘은 항산화와 면역 조절 등 중요한 생리적 과정에 관여하여 위장 궤양 치료제, 순환기계 치료제의 원료 및 아미노산 수액 제제 등 의학 산업에 사용된다.
L-히스티딘은 특히 헤모글로빈에 많이 들어 있어서, 혈분을 원료로 하는 단백질 가수 분해 추출법을 통해 주로 생산된다. 그러나, 이러한 방법은 낮은 효율과 환경 오염 등의 단점을 지니고 있다. 반면, 미생물 발효법을 통하여 L-히스티딘을 생산하는 것은 가능하나, 대규모 공업화는 아직 이루어지지 않았다. 이는 L-히스티딘의 생합성이 뉴클레오타이드 합성 전구체인 포스포리보실 피로인산 (PRPP)과 경쟁 관계를 가지며, 고 에너지를 요구하는 복잡한 생합성 과정 및 조절 메커니즘을 가지고 있기 때문이다.
다른 종류의 아미노산의 배출능을 갖는 단백질의 발현 및/또는 기능이 강화되면 해당 아미노산의 생산이 증가되는 예는 알려져 있으나, L-히스티딘 특이적 배출능을 갖는 단백질에 대한 선행 연구는 거의 진행된 바 없다.
이러한 배경하에서, 히스티딘 특이적 배출능을 갖는 단백질의 발굴 및 이를 이용한 히스티딘 생산 기술의 개발이 요구된다.
본 출원의 목적은 (1) 서열번호 43의 아미노산 서열의 72번째 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나,
(2) 서열번호 43의 아미노산 서열의 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나,
(3) 상기 (1) 및 (2)가 모두 치환된, 변이형 L-히스티딘 배출 단백질을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 미생물을 포함하는 L-히스티딘 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 미생물을 L-히스티딘 생산에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 미생물을 L-히스티딘 생산용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-히스티딘 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원은 L-히스티딘 배출능을 갖는 히스티딘 배출 단백질의 변이체를 발굴하고, 이를 L-히스티딘의 생산능을 가지는 미생물에서 발현시킨 결과, L-히스티딘 생산량을 획기적으로 향상시킬 수 있음을 제안한다.
본 명세서에서, 헬코바실러스 마시리엔시스 (Helcobacillus massiliensis) 유래의 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 (AzlC family ABC transporter permease)를 발현하는 미생물이 L-히스티딘 생산능이 우수함을 확인하고, 상기 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소의 특정 위치에 아미노산 치환 변이가 도입되는 경우, L-히스티딘 생산능이 보다 증가하는 것을 확인하였다.
단백질, 폴리뉴클레오타이드, 및 재조합 벡터
일 양상은 L-히스티딘 배출 활성을 갖는 변이형 단백질(또는 폴리펩타이드)을 제공한다. 상기 단백질은 L-히스티딘 특이적 배출능을 갖는 단백질일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 변이형 단백질은 변이형 L-히스티딘 배출 단백질로 표현될 수 있다. 상기 변이형 단백질은 AzlC 계열 ABC 수송체 투과 활성을 가지는 것일 수 있다.
일 예에서 상기 변이형 단백질은 야생형 L-히스티딘 배출 단백질 (예컨대, AzlD 도메인-함유 단백질 (AzlD domain-containing protein), 또는 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질 (AzlC family ABC transporter permease) 등)과 동등하거나 보다 강화된 L-히스티딘 배출 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 AzlD 도메인-함유 단백질 또는 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질은 헬코바실러스 마시리엔시스 (Helcobacillus massiliensis) 유래의 것일 수 있다. 본 명세서에서, 헬코바실러스 마시리엔시스 유래의 AzlD 도메인-함유 단백질은 HmaE 단백질 (또는 HmaE), 헬코바실러스 마시리엔시스 유래의 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질은 HmaF 단백질 (또는 HmaF)로 기재될 수 있다.
일 예에서, 상기 변이형 단백질 (예컨대, AzlD 도메인-함유 단백질의 변이형 단백질, 구체적으로 헬코바실러스 마시리엔시스 유래의 AzlD 도메인-함유 단백질의 변이형 단백질)은 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질과 동일한 오페론 유전자에서 함께 발현되는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 변이형 단백질은 상기 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질과 결합하여 L-히스티딘 배출 활성을 갖는 것일 수 있다.
일 예에서 상기 변이형 단백질은 헬코바실러스 마시리엔시스 (Helcobacillus massiliensis) 유래의 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질의 변이형 단백질일 수 있다.
상기 변이형 단백질은, 헬코바실러스 마시리엔시스 유래의 야생형 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 또는 삽입된 변이가 도입된 변이형 단백질일 수 있다.
상기 헬코바실러스 마시리엔시스 유래의 야생형 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질은 서열번호 43의 아미노산 서열(WP_055090792.1)을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 변이형 단백질은 서열번호 43의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 (1) 72번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나,
(2) 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는
(3) 상기 (1) 및 (2)가 모두 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기와 같이 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 아미노산을 계수하는 것은, 개시코돈으로부터 번역된 메티오닌(Met, M)을 1번째 아미노산으로 하여 계수하는 것을 의미할 수 있다.
일 예에서, 상기 변이형 단백질은 서열번호 43의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 (1) 72번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉 원래의 아미노산과 상이한 아미노산으로서, 류신(Leu, L), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 리신(Lys, K), 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 아스파라긴(Asn, N), 글루타민(Gln, Q), 시스테인(Cys, C), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 알라닌(Ala, A), 발린(Val, V), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 타이로신(Tyr, Y), 또는 트립토판(Trp, W)으로 치환된 서열을 포함하거나,
(2) 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산, 즉 원래의 아미노산과 상이한 아미노산으로서, 발린, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판으로 치환된 서열을 포함하거나,
(3) 상기 (1) 및 (2)가 모두 치환된 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 변이형 단백질은 서열번호 43의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 (1) 72번째 잔기에 상응하는 아미노산이 류신, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 또는 메티오닌으로 치환되거나;
(2) 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 발린, 글리신, 프롤린, 알라닌, 류신, 또는 메티오닌으로 치환되거나; 또는
(3) 상기 (1) 및 (2)가 모두 치환된 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 변이형 단백질은 서열번호 43의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 72번째 잔기에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환되고, 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환된 것일 수 있다. 상기 변이형 단백질 중 서열번호 43의 N-말단으로부터 72번째 및/또는 124번째 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산을 제외한 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되더라도 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 활성을 나타내는 한 본 출원의 변이형 단백질에 포함될 수 있음은 자명하다.
또한, 일 예에서 상기 변이형 단백질은 서열번호 43로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열에서, 서열번호 43의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 (1) 72번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, (2) 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 (3) 상기 (1) 및 (2)가 모두 치환된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 즉 서열번호 43의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 72번째 및/또는 124번째 잔기에 상응하는 위치에서 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고 서열번호 43의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가지며 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 활성을 가지는 폴리펩타이드는 본 출원의 변이형 단백질에 포함될 수 있다.
일 구체예에서 상기 변이형 단백질은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어진 변이형 단백질에서 서열번호 56의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 72번째 및/또는 124번째 잔기에 상응하는 아미노산을 제외한 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되더라도 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 활성을 나타내는 한 본 출원의 변이형 단백질에 포함될 수 있음은 자명하다. 또한 일 예에서 상기 변이형 단백질은 서열번호 56의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 72번째 및/또는 124번째 잔기에 상응하는 아미노산은 고정되고, 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 즉, 서열번호 56의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 72번째 및/또는 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는, AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 활성을 가지는 폴리펩타이드는 본 출원의 변이형 단백질에 포함될 수 있다.
일 예에서, 상기 변이형 단백질은 야생형 단백질 (예컨대, 야생형 AzlD 도메인-함유 단백질)보다 L-히스티딘 배출 활성이 보다 강화된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 변이형 단백질은 야생형 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질과 함께 발현되는 경우, L-히스티딘 배출 활성이 보다 강화될 수 있다.
상기 야생형 L-히스티딘 배출 단백질은 서열번호 43 (헬코바실러스 마시리엔시스 유래의 야생형 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질), 서열번호 44 (헬코바실러스 마시리엔시스 유래의 야생형 AzlD 도메인-함유 단백질) 또는 이들의 조합과 60% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질일 수 있다. 예컨대, 일 구체예에서, 상기 야생형 L-히스티딘 배출 단백질은 서열번호 43, 44, 또는 이의 조합과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 것일 수 있다. 상기 서열번호 43으로 표현되는 단백질은 서열번호 45의 핵산서열에 의하여 암호화되고, 서열번호 44로 표현되는 단백질은 서열번호 46의 핵산서열에 의하여 암호화되거나, 서열번호 43 및/또는 서열번호 44으로 표현되는 단백질은 서열번호 47 핵산서열 (서열번호 45의 3' 말단과 서열번호 46의 5' 말단의 중복 부위에서 융합된 오페론 서열임)에 의하여 암호화되는 것일 수 있다.
다른 양상은, 상기 변이형 단백질을 암호화하는 (코딩하는) 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오타이드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 56의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다, 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다, 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 표현된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 이들의 본래의 기능 또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 통상적인 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및/또는 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형된 것을 포함할 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 목적하는 기능은 미생물의 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능을 부여하거나, 증가시키는 기능을 의미할 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열 및/또는 기능을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "상동성(identity)"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율(%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
일 예에서, 본 명세서에 제공되는 특정 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 특정 핵산 서열 또는 이와 실질적으로 동등한 핵산 서열뿐만 아니라, 상기 특정 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 구체적으로, 상기 상보성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절 가능한 Tm 값, 예컨대, 55℃, 60℃, 63℃ 또는 65℃의 Tm 값에서 혼성화하고, 후술하는 조건에서 분석할 수 있다: 이러한 조건은 공지의 문헌에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 높은 상보성을 갖는 유전자끼리 혼성화하고, 그보다 낮은 상보성을 갖는 유전자끼리는 혼성화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1x SSC(saline-sodium citrate buffer), 및 0.1%(w/v) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate); 60℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS; 또는 68℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세척하는 조건을 열거할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 혼성화에는 두 개의 뉴클레오타이드가 상보적 서열을 가질 것이 요구되거나, 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 허용될 수 있다. 상기 용어 "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오타이드 염기 간의 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, DNA의 경우, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고, 이는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 특정 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 과정으로 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내에서 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 일 예로 형질전환은 표적 단백질(외래 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드나 이를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 발현조절 요소가 목적 단백질(외래 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 부위-특이적 DNA 절단 및 연결에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전법, 염화칼슘 (CaCl2) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 도입 (삽입)은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system 또는 CRISPR system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리펩타이드의 발현 벡터로서 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 유전체에 삽입 또는 숙주 세포 유전체의 대응 유전자를 대체하기 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 숙주 세포의 게놈(유전체)과 무관하게 발현되거나, 숙주 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용가능한 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용 가능한 벡터는 공지된 발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입용 벡터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합 또는 CRISPR 시스템에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 벡터는 상기 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
미생물
다른 양상은, 상기 변이형 단백질, 상기 변이형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1종, 2종, 또는 3종 모두)를 포함하는 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능을 가지는 것일 수 있다. 상기 미생물은 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 상기 변이형 단백질, 상기 변이형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하지 않는 미생물과 비교하여 강화된(또는 증가된, 향상된) 것일 수 있다.
상기 변이형 단백질은 외래의 것일 수 있다. 본 명세서에서 "외래의 것"은 미생물 내재적으로 존재하는 것이 아니라, 상기 미생물과 다른 종으로부터 유래한 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, "L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물"은 앞서 설명한 변이형 단백질을 발현하도록 조작(변이)됨으로써, L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 없던 미생물이 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능을 갖게 되거나, 본래의 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능보다 높은 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능을 갖게된 것일 수 있다.
본 명세서에서 "미생물"은 단세포 박테리아를 포괄하는 것으로, "세포"와 혼용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 산물(예컨대, L-히스티딘)의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 L-히스티딘 배출 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 활성이 강화되도록 벡터를 통해 유전적으로 변형된 미생물(예컨대, 재조합 미생물)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
본 명세서에서, 상기 변이형 단백질을 발현하도록 변이되기 전의 미생물을 상기 변이된 미생물과 구별하기 위하여, "모균주 (parent microorganism or parent strain) 또는 숙주 세포 (host cell)"로 표현될 수 있다.
상기 미생물(또는 균주, 재조합 세포)이 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능을 갖거나, L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 강화된다는 것은, L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 없는 비변형 미생물, 재조합 전의 세포, 모균주, 및/또는 야생형 균주와는 달리 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 부여된 것이거나, 비변형 미생물, 재조합 전의 세포, 모균주, 및/또는 야생형 균주와 비교하여 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 향상된 것을 의미할 수 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 변이형 단백질, 본 출원의 변이형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 본 출원의 변이형 단백질 또는 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 변형된 미생물; 본 출원의 변이형 단백질, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 미생물 (예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이형 단백질 활성을 갖는 미생물 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 (the genus Corynebacterium) 미생물, 에세리키아 속 (Escherichia) 미생물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더욱 구체적으로는, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있다. 상기 에세리키아 속 균주는 대장균 (Escherichia coli)일 수 있다.
상기 미생물은 변이형 단백질, 상기 변이형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1종, 2종, 또는 3종 모두)을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 변이형 단백질을 발현하도록 하는 변이는 앞서 설명한 변이형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 도입하는 것에 의하여 수행되거나, 또는 인공 돌연변이 (예컨대, Error-prone PCR 등) 등에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 이와 같이 모균주에 도입되는 변이형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 모균주 내재의 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 암호화 유전자를 대체하거나 이에 더하여 추가로 포함되는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 미생물은, 상기 변이형 단백질을 야생형 AzlC 계열 ABC 수송체 투과효소 단백질과 함께 포함하는 경우, L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 보다 강화될 수 있다.
일 예에서, 상기 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 야생형 L-히스티딘 배출 단백질을 포함하는 미생물과 비교하여 L-히스티딘 생산능이 약 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 또는 80% 이상 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물은 변이 전 모균주, 비변형 미생물, 야생형 L-히스티딘 배출 단백질을 포함하는 미생물과 비교하여 L-히스티딘 생산능이 약 1 g/L 이상, 1.5 g/L 이상, 2 g/L 이상, 2.5 g/L 이상, 3 g/L 이상, 3.5 g/L 이상, 또는 4 g/L 이상 증가된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 “약(about)”은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 양상은, 상기 변이형 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드, 상기 재조합 벡터, 또는 상기 미생물을 포함하는 L-히스티딘 생산용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 변이형 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드, 상기 재조합 벡터, 또는 상기 미생물을 L-히스티딘 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 양상은 상기 변이형 단백질, 상기 폴리뉴클레오타이드, 상기 재조합 벡터, 또는 상기 미생물을 L-히스티딘 생산용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 양상은, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-히스티딘 생산(제조) 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 배양하는 단계 이후에, 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 양상은, 미생물의 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능을 강화시키는 단계를 포함하는, 상기 미생물의 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능을 증가시키는 방법, 또는 상기 미생물에 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능을 부여하는 방법을 제공한다.
상기 변이를 도입하는 단계는 변이형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입(형질전환)시키는 단계를 포함하거나, 인공적으로 돌연변이를 발생시키는 단계 (예컨대, Error-prone PCR 등)를 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 L-히스티딘 배출 활성 및/또는 L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-히스티딘 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-히스티딘은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
상기 배양에 사용 가능한 배지는 탄소 공급원으로 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올), 유기산 (예: 아세트산) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배지는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산, 및/또는 비타민 등과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기 L-히스티딘을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 회수하는 단계는 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화, HPLC 등에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 L-히스티딘을 회수하는 방법은, 그 이전, 동시, 또는 그 이후에, 정제단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 출원은 L-히스티딘 배출능을 갖는 히스티딘 배출 단백질 또는 이의 변이체를 발굴하고, 이를 L-히스티딘의 생산능을 가지는 미생물에서 발현시킨 결과, L-히스티딘 생산량을 획기적으로 향상시킬 수 있다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 외래 히스티딘 배출 유전자 탐색 및 후보 선별
L-히스티딘 특이 배출능을 갖는 단백질 후보를 선별하기 위하여 분류별 아미노산(염기 아미노산: L-라이신(L-lys), 방향족 아미노산: 트립토판(Trp), 곁가지 아미노산: 이소류신(Ile))에 대한 배출 단백질(LysE(Arch Microbiol 180: 155-160), Wex(대한민국 등록특허 제10-1968317호), BrnFE(Arch Microbiol 180: 155-160))의 아미노산 서열을 query 서열로 하고, NCBI와 Kegg database를 기반으로 PSI-BLAST 탐색 결과, L-히스티딘을 배출할 가능성이 있는 막단백질로 예측되는 후보 유전자들과 이를 보유하는 미생물을 선정하였다.
이 중 생산 균주에 적용 가능한 정도의 생물 안전도 (Biosafety level)와 확보 가능성을 고려하여, 아래 표 1 과 같이 LysE 기반 1종, Wex 기반 3종, BrnFE 기반 2종의 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 및 이를 포함하는 미생물을 선정하였다:
L-히스티딘 배출자 후보 list
No. 균 주 Protein Ref Seq. gDNA Ref Seq. 생물 안전도 아미노산 서열 핵산 서열
Wex 기반 1 Herbaspirillum aquaticum
(KCTC42001)		 WP_088757482.1 NZ_NJGV01000035.1 1 서열번호 1 서열번호 2
2 Cupriavidus pinatubonensis
(KCTC22125)		 WP_041680244.1 CP000091.1 1 서열번호 3 서열번호 4
3 Kluyvera cryocrescens(KCTC2580) WP_052283291.1 NZ_LGHZ01000014.1 1 서열번호 5 서열번호 6
LysE 기반 4 Corynebacterium stationis
(ATCC6872)		 WP_066837457.1 CP014279.1 1 서열번호 7 서열번호 8
BrnFE 기반 5 Leucobacter salsicius
(KCTC19904)		 WP_026139602.1 NZ_AOCN01000022.1 1 서열번호 9 서열번호 11
WP_083879221.1 서열번호 10
6 Dermabacter vaginalis
(KCTC39585)		 WP_065248528.1 (DvaF) NZ_CP012117.1 1 서열번호 12 서열번호 14
WP_065248527.1(DvaE) 서열번호 13 서열번호 15
DvaFE 서열번호 12 및 13 서열번호 16 (DvaFE 오페론)
(상기 표 1에서, 생물안전도는 미국의 Centers for Disease Control and Prevention에서 정의한 미생물 병원성 지표 (level 1~4)에 따른 것임 (level이 낮을수록 안전함)
실시예 2. 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보 도입 벡터 및 이를 도입한 재조합 코리네박테리움 속 균주 제작
상기 실시예 1에서 선정한 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보 6종을 코리네박테리움 속 균주에 도입하기 위한 벡터 6종을 제작하였다.
실시예 2-1. 타겟 유전자 삽입용 벡터 pDZΔN2131 제작
외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보들을 도입하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰의 트렌스포존을 코딩하는 유전자 중 NCgl2131 유전자를 삽입 site로 사용하였다(Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al, 2003). 또한 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보들이 코리네박테리움 유래 gapA 유전자의 프로모터(이하, PgapA, 서열번호 17) 하에서 발현되도록 설계하였다.
NCgl2131 유전자를 배출자 유전자들로 치환하기 위하여 NCgl2131 결손 및 타겟 유전자 삽입 벡터를 제작하였다. 벡터를 제작하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 18 과 서열번호 19, 서열번호 20과 서열번호 21의 프라이머 쌍을 각각 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 각각 531bp의 del-N2131L(서열번호 22)와 555bp의 del-N2131R(서열번호 23)의 DNA 단편을 수득하였다. 수득한 DNA 산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후 pDZ 벡터(대한민국 등록특허 제10-0924065호)와 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 클로닝하여, NCgl2131유전자결손 및 타겟 유전자 삽입용 벡터 pDZΔN2131을 제작하였다.
실시예 2-2. 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보 도입 벡터 6종 제작
Herbaspirillum aquaticum 유래 단백질(이하, Haq, 서열번호 1)를 코딩하는 유전자(이하, haq, 서열번호 2)의 염기서열 정보를 미국보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 획득하였다. haq를 증폭시키기 위하여 Herbaspirillum aquaticum 균주(KCTC42001)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 24와 서열번호 25의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 945bp의 haq (서열번호 2)를 포함한 977bp의 haq 단편을 수득하였다. haq와 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 26과 서열번호 27의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 409bp의 PgapA(서열번호 17)를 포함한 441bp의 PgapA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 haq 단편과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝하여, 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZΔN2131-PgapA-Haq로 명명하였다.
Cupriavidus pinatubonensis 유래 단백질(이하, Cpi, 서열번호 3)를 코딩하는 유전자(이하, cpi, 서열번호 4)의 염기서열 정보를 미국보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 획득하였다. Cupriavidus pinatubonensis 유래 cpi를 증폭시키기 위하여, Cupriavidus pinatubonensis 균주(KCTC22125)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 28와 서열번호 29의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행. 그 결과 945bp의 cpi(서열번호 4)를 포함한 977bp의 cpi 단편을 수득하였다. cpi와 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 26과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 409bp의 PgapA(서열번호 17)를 포함한 441bp의 PgapA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 cpi 단편과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하여, 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZΔN2131-PgapA-Cpi로 명명하였다.
Kluyvera cryocrescens 유래 단백질(이하, Kcr, 서열번호 5)를 코딩하는 유전자(이하, kcr, 서열번호 6)의 염기서열 정보를 미국보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 획득하였다. Kluyvera cryocrescens 유래 kcr를 증폭시키기 위하여, Kluyvera cryocrescens 균주(KCTC2580)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 31와 서열번호 32의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 882bp의 kcr(서열번호 6)를 포함한 914bp의 kcr단편을 수득하였다. kcr와 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 서열번호 26과 서열번호 33의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행. 그 결과 409bp의 PgapA(서열번호 17)를 포함한 441bp의 PgapA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 kcr 단편과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하여, 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZΔN2131-PgapA-Kcr로 명명하였다.
Corynebacterium stationis 유래 단백질(이하, Cst, 서열번호 7)를 코딩하는 유전자(이하, cst, 서열번호 8)의 염기서열 정보를 미국보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 획득하였다. Corynebacterium stationis 유래 cst를 증폭시키기 위하여, Corynebacterium stationis 균주(ATCC6872)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 34와 서열번호 35의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 717bp의 cst (서열번호 8)를 포함한 749bp의 cst 단편을 수득하였다. cst 와 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 서열번호 26과 서열번호 36의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 409bp의 PgapA(서열번호 17)를 포함한 441bp의 PgapA 단편을 수득하였다. 수득된 cst 단편과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하여, 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZΔN2131-PgapA-Cst로 명명하였다.
Leucobacter salsicius 유래 단백질(이하, LsaFE, 서열번호 9, 10)를 코딩하는 오페론(이하, lsa, 서열번호 11)의 염기서열 정보를 미국보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 획득하였다. Leucobacter salsicius 유래 lsa 를 증폭시키기 위하여 Leucobacter salsicius 균주(KCTC19904)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 37와 서열번호 38의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 1048bp의 lsa (서열번호 11)를 포함한 1080bp의 lsa 단편을 수득하였다. lsa 와 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 서열번호 26과 서열번호 39의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 409bp의 PgapA(서열번호 17)를 포함한 441bp의 PgapA 단편을 수득하였다. 수득된 lsa 단편과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하여, 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZΔN2131-PgapA-Lsa로 명명하였다.
Dermabacter vaginalis 유래 단백질(이하, DvaFE, 서열번호 12, 13)를 코딩하는 오페론(이하, dva, 서열번호 16)의 염기서열 정보를 미국보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 획득하였다. Dermabacter vaginalis 유래 dva 를 증폭시키기 위하여, Dermabacter vaginalis 균주(KCTC39585)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 40와 서열번호 41의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 1081bp의 dva (서열번호 16)를 포함한 1113bp의 dva 단편을 수득하였다. dva 와 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 서열번호 26과 서열번호 42의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행한 결과 409bp의 PgapA(서열번호 17)를 포함한 441bp의 PgapA 단편을 수득하였다. 수득된 dva 단편과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하여 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZΔN2131-PgapA-Dva로 명명하였다.
실시예 2-3. 재조합 코리네박테리움 속 균주 제작
상기 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보들의 L-히스티딘 배출능을 확인하기 위하여, 상기 제작된 NCgl2131 결손 벡터(pDZΔN2131), 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보 도입 벡터 6종(pDZΔN2131-PgapA-Haq, pDZΔN2131-PgapA-Cpi, pDZΔN2131-PgapA-Kcr, pDZΔN2131-PgapA-Cst, pDZΔN2131-PgapA-Lsa, pDZΔN2131-PgapA-Dva)을 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 도입하였다. 보다 구체적으로, 상기 벡터들을 각각 ATCC13032 균주에 전기천공법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 NCgl2131 유전자가 결손 되거나 L-히스티딘 배출유전자 후보로 치환되어 있는 7종의 재조합 균주를 제작하였으며, 이들을 각각 ATCC13032ΔN2131 (N2131 유전자 결손), ATCC13032ΔN2131::Haq (N2131 유전자가 haq로 치환), ATCC13032ΔN2131::Cpi (N2131 유전자가 cpi로 치환), ATCC13032ΔN2131::Kcr (N2131 유전자가 kcr로 치환), ATCC13032ΔN2131::Cst (N2131 유전자가 cst로 치환), ATCC13032ΔN2131::Lsa (N2131 유전자가 lsa로 치환), 및 ATCC13032ΔN2131::Dva (N2131 유전자가 dva로 치환)로 명명하였다.
실시예 3. 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보 도입 코리네박테리움 속 균주들의 MIC 측정
상기 실시예 2에서 제작된 7종의 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 (ATCC13032ΔN2131, ATCC13032ΔN2131::Haq, ATCC13032ΔN2131::Cpi, ATCC13032ΔN2131::Kcr, ATCC13032ΔN2131::Cst, ATCC13032ΔN2131::Lsa, 및 ATCC13032ΔN2131::Dva)들의 L-히스티딘 배출능 활성의 보유여부 확인을 위하여, L-히스티딘을 이용한 최소저지농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 실험을 수행하였다. 7종의 균주들을 최소 액체 배지에 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 1 X 103과 1 X 104 개의 세포로 희석하여 L-히스티딘이 첨가된 최소 고체 배지에서 스포팅 (spotting) 배양하였다. 상기 사용된 최소 고체 배지 조성은 다음과 같다:
최소 배지 (pH 7.2)
포도당 10 g, KH2PO4 1 g, K2HPO4 2 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, 요소 2 g, (NH4)2SO4 5 g, NaCl 0.5 g, 니코틴아미드 5 ㎍, 칼슘-판토텐산 0.1 ㎍, 비오틴 0.2 ㎍, 티아민 HCl 3 ㎍, Trace elements solution* 1ml (증류수 1 리터 기준), Agar 20 g
*Trace elements solution
Na2B4O7 10H2O 0.09 g, (NH4)6Mo7O27 4H2O 0.04 g, ZnSO4 7H2O 0.01 g, CuSO4 5H2O 0.27 g, MnCl2 4H2O 0.01 g, FeCl3 6H2O 1 g, CaCl2 0.01 g (증류수 1 리터 기준)
최소저지농도 실험을 위해, 1 g/L의 L-히스티딘을 최소 고체 배지에 첨가하였고, 48시간 후 세포의 성장을 관찰하여, 그 결과를 하기의 표 2에 나타내었다:
L-히스티딘이 포함된 최소배지에서 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보 도입 코리네박티리움 속 균주들의 성장 정도
균주 L-히스티딘 미포함 최소배지 L-히스티딘 1 g/L 포함 최소배지
ATCC13032ΔN2131 ++++ +
ATCC13032ΔN2131::Haq ++++ +
ATCC13032ΔN2131::Cpi ++++ +
ATCC13032ΔN2131::Kcr ++++ +
ATCC13032ΔN2131::Cst ++++ +
ATCC13032ΔN2131::Lsa ++++ +
ATCC13032ΔN2131::Dva ++ +++
(표 2에서, + 개수는 균주들의 상대적 성장 정도를 나타내는 것으로, 각각 다음을 나타냄:+ : single colony는 형성되지 못하나 heavy(single colony로 성장되지 못하고 뭉쳐서 자라는 형태)는 형성됨;++ : heavy 형성되고 single colony 5개 미만 형성됨;
+++ : heavy 형성되고 single colony 50개 미만 형성됨;
++++ : heavy가 single colony 구분되지 않게 형성됨)
상기 표 2에 나타난 바와 같이, ATCC13032ΔN2131::Dva 균주를 제외한 모든 균주가 L-히스티딘 미포함 최소배지에서 원활히 성장하였다. 그러나 L-히스티딘이 1g/L 포함된 최소배지에서는 대부분의 L-히스티딘 배출 후보 유전자들이 도입된 균주들의 성장이 미미했으며, Dermabacter vaginalis 유래 유전자가 도입된 ATCC13032ΔN2131::Dva 균주만 ATCC13032ΔN2131 대비 월등한 성장을 보였다. 이는, 도입된 Dermabacter vaginalis 유래 단백질이 최소저지농도 이상의 L-히스티딘 포함 배지에서도 L-히스티딘 배출능을 가질 수 있음을 보여준다.
이로부터 Dermabacter vaginalis 유래 단백질 Dva를 코리네박테리움 균주에 최소저지농도 이상의 L-히스티딘에 대한 내성을 부여하며 L-히스티딘 특이 배출능을 갖는 단백질로 선택하였다.
실시예 4. 코리네박테리움 유래 L-히스티딘 생산 균주(KCCM 80179) 기반 Dermabacter vaginalis 유래 유전자( dva) 도입 균주 제작 및 L-히스티딘 생산능 평가
Dermabacter vaginalis 유래 단백질 Dva의 L-히스티딘 배출능을 확인하기 위하여, Dermabacter vaginalis 유래 유전자 dva를 L-히스티딘 생산균주 KCCM 80179(대한민국 공개특허 제10-2019-0065984호) 균주에 도입하였다.
이를 위하여, 실시예 2에서 제작된 벡터 pDZΔN2131, 및 pDZΔN2131-PgapA-Dva를 각각 KCCM80179 균주에 전기천공법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 NCgl2131 유전자가 결손 되거나 L-히스티딘 배출 유전자 후보 (dva)로 치환되어 있는 균주 2종을 제작하였으며, 이를 각각 KCCM 80179ΔN2131 (NCgl2131 유전자가 결손) 및 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva (NCgl2131 유전자가 dva로 치환)으로 명명하였다.
상기 제작된 KCCM 80179ΔN2131 및 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva 균주의 L-히스티딘 생산능을 확인하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 배양하였다: KCCM 80179ΔN2131 및 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva 균주를 활성화 배지에서 16시간 동안 배양한 후, 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 배양에 사용된 배지 조성은 다음과 같다:
<활성화 배지>
육즙 1%(w/v), 폴리펩톤 1%(w/v), 소듐클로라이드 0.5%(w/v), 효모엑기스 1%(w/v), 한천 2%(w/v), pH 7.2
<종 배지>
포도당 5%(w/v), 박토펩톤 1%(w/v), 소듐클로라이드 0.25%(w/v), 효모엑기스 1%(w/v), 요소 0.4%(w/v), pH 7.2
<생산 배지>
포도당 10%(w/v), 황산암모늄 2%(w/v), 제1인산칼륨 0.1%(w/v), 황산마그네슘7수염 0.05%(w/v), CSL(옥수수 침지액) 2.0%(w/v), 비오틴 200 ㎍/L, 탄산칼슘, pH 7.2,
배양 종료 후, HPLC에 의해 L-히스티딘 생산량 (배지 내 히스티딘 함량)을 측정하여, 그 결과를 다음의 표 3에 나타내었다:
KCCM 80179 유래 Dermabacter vaginalis 유래 유전자 도입 균주의 L-히스티딘 생산량
Cell OD600 사용한
포도당 (g/L) 		히스티딘
생산량 (g/L)
KCCM 80179 51.4 100 14.1
KCCM 80179ΔN2131 51.6 100 13.9
KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva 42.6 100 17.1
상기 표 3에 나타난 바와 같이, NCgl2131 결손 균주는 모균주인 KCCM 80179 균주와 동등 정도의 L-히스티딘 생산능을 가지는 반면, Dermabacter vaginalis 유래 유전자가 도입된 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva 균주는 NCgl2131 결손 균주 및 모균주인 KCCM 80179 균주 대비 L-히스티딘 생산능이 각각 23% 및 21% 이상 증가됨을 확인하였다. 상기 실시예 3 및 4의 결과를 통해, Dermabacter vaginalis 유래 유전자 도입을 통해 최소저해농도 이상의 L-히스티딘 농도에 대한 내성이 증가될 뿐만 아니라, L-히스티딘 생산능도 크게 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 Dermabacter vaginalis 유래 단백질이 L-히스티딘을 특이적으로 배출할 수 있는 L-히스티딘 배출 단백질임을 입증한다.
실시예 5. Dermabacter vaginalis 유래 L-히스티딘 배출자 유사 단백질 추가 확보
상기 실시예 3과 4에서 Dermabacter vaginalis 유래 단백질의 L-히스티딘 배출능을 확인하였으므로, 상기 단백질과 아미노산 서열 상동성이 높은 유사 단백질을 추가로 확보하기 위하여, DvaFE 중 DvaF의 서열(서열번호 12)을 query로 이용하여 BLAST 탐색을 수행하였다 (표 4 참조).
Figure PCTKR2023008656-appb-img-000001
상기 BLAST 탐색 결과를 바탕으로 60% 이상의 서열 상동성을 나타내고 Dermabacter 속에 속하지 않는 L-히스티딘 배출자 후보 1종을 추가로 선정하여, 다음의 표 5에 나타내었다:
L-히스티딘 배출자 추가 후보 리스트
No. 균 주 Protein Ref Seq. gDNA Ref Seq. 생물 안전도 단백질 서열 유전자
서열
7 Helcobacillus massiliensis WP_055090792.1
(HmaF)		 NZ_CYUG01000017.1 2 서열번호 43 서열번호 45
WP_055090293.1
(HmaE)		 서열번호 44 서열번호 46
HmaFE 서열번호 43 및 44 서열번호 47(HmaFE 오페론)
실시예 6. 추가 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보 도입 벡터 제작
상기 실시예 5에서 추가 선정된 L-히스티딘 배출 유전자 후보 2종을 코리네박테리움 속 균주에 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 실시예 2와 동일하게 NCgl2131 유전자를 결손 site로, PgapA를 프로모터로 사용하였다.
Helcobacillus massiliensis 유래 단백질(이하, HmaFE, 서열번호 43, 44)을 코딩하는 오페론(이하, hma, 서열번호 47)의 염기서열 정보를 미국보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 획득하였다. haq DNA를 수득하기 위하여 Bionics 사(社)의 진합성 서비스를 이용하여 DNA를 합성하였다. 합성된 DNA를 증폭하기 위하여 서열번호 48와 서열번호 49의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행. 그 결과 1081bp의 hma (서열번호 47)를 포함한 1113bp의 hma 단편을 수득하였다. hma 와 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 서열번호 26과 서열번호 50의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행. 그 결과 409bp의 PgapA(서열번호 17)를 포함한 441bp의 PgapA 단편을 수득하였다. 수득된 hma 단편과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하여, 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZΔN2131-PgapA-Hma로 명명하였다.
실시예 7. L-히스티딘 생산 균주(KCCM 80179) 기반 Helcobacillus massiliensis 유래 유전자 도입( hma ) 균주 제작 및 L-히스티딘 생산능 평가
Helcobacillus massiliensis 유래 단백질 Hma의 L-히스티딘 배출능을 확인하기 위하여 L-히스티딘 생산균주 KCCM 80179 균주에 도입하였다.
이를 위해 실시예 6에서 제작된 벡터 pDZΔN2131-PgapA-Hma를 KCCM80179 균주에 전기천공법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 NCgl2131 유전자가 L-히스티딘 배출유전자 후보로 치환되어 있는 균주를 제작하였으며, 이를 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma (NCgl2131 유전자가 hma로 치환)으로 명명하였다.
상기 제작된 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma 균주의 L-히스티딘 생산능을 확인하기 위하여, 상기 균주를 실시예 4에서 수행한 방법으로 배양하고 L-히스티딘 생산량을 측정하였다. 대조군으로 실시예 4에서 제작된 KCCM 80179ΔN2131 균주와 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva 균주에 대하여 동일한 방법으로 배양 및 L-히스티딘 생산량(배지 내 히스티딘 함량) 측정을 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 표 6에 나타내었다.
KCCM 80179 유래 Helcobacillus massiliensis 유래 유전자 도입 균주의 L-히스티딘 생산량
OD 사용한
포도당 (g/L) 		히스티딘
생산량 (g/L)
KCCM 80179 50.3 100 14.0
KCCM 80179ΔN2131 51.5 100 13.9
KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Dva 40.8 100 17.3
KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma 43.1 100 16.6
표 6에 나타난 바와 같이, KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma 균주는 NCgl2131 결손 균주(KCCM 80179ΔN2131) 및 모균주인 KCCM 80179 균주 대비 L-히스티딘 생산량이 각각 19%, 19% 증가하였다. 이러한 결과는 Helcobacillus massiliensis 유래 단백질도 L-히스티딘을 특이적으로 배출할 수 있는 L-히스티딘 배출자로 선별될 수 있음을 보여준다.
실시예 8: 인공돌연변이법을 이용한 Hma 변이 라이브러리 제작
L-히스티딘 배출능이 증가된 변이형 Hma를 획득하기 위하여 1차 crossover용 변이 단백질 발현 벡터 라이브러리를 제작하였다. 이를 위하여 상기 제작된 pDZ ΔN2131-PgapA-Hma를 주형으로 하여 서열번호 48와 서열번호 49의 프라이머 쌍을 이용한 Error-prone PCR법으로 염기치환변이가 무작위적으로 도입된 hma 오페론들을 획득하였다. Error-prone PCR은 GenemorphII Random Mutagenesis Kit(Stratagene)을 사용하여 증폭된 유전자 단편 내에 변이가 1kb당 0 내지 3.5개가 도입되는 조건으로 PCR 수행하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. hma와 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 26과 서열번호 50의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하여 PgapA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 돌연변이 hma 오페론들과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝하였고, DH5α에 형질전환하여 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 염기서열을 분석한 결과 평균 2 mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 10,000개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pDZΔN2131-PgapA-Hma(mt) 라이브러리로 명명하였다.
실시예 9: Hma 인공돌연변이 라이브러리 도입 및 L-히스티딘 생산능 증가 균주 선별
상기 제작된 ATCC13032ΔN2131 균주를 모균주로 하여 상기 제작된 pDZΔN2131-PgapA-Hma(mt) 라이브러리를 상동염색체 재조합에 의해 형질전환하고 카나마이신(25mg/L)이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 7000개의 콜로니를 확보하였으며, 각 콜로니를 ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-1 부터 ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-7000까지로 명명하였다.
<복합평판배지 (pH 7.0)>
포도당 10g, Peptone 10g, Beef extract 5g, Yeast extract 5g, Brain Heart Infusion 18.5g, NaCl 2.5g, Urea 2g, Sorbitiol 91g, Agar 20g(증류수 1 리터 기준)
확보된 7000개의 콜로니를 상기 실시예 3에서 수행한 L-히스티딘에 대한 최소저지농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 실험을 수행하였다. 효율적인 스크리닝을 위하여 3g의 L-히스티딘을 포함하는 액체 최소배지를 기반으로 수행하였다. colony를 바로 액체 최소배지 300ul에 접종하여 96-딥 웰 플레이트에서 32˚C, 1000rpm으로 약 18시간 동안 배양한 후 OD600 값을 측정하여 성장이 우수한 colony를 선별하였다. 대조군으로는 상기 제작된 ATCC13032ΔN2131 균주와 ATCC13032ΔN2131::Hma 균주를 사용하였으며 1차 실험을 통하여 251개를 선별하고, 재반복 실험을 통해서 36개의 colony를 선별하였으며, 사용된 배지 성분은 하기와 같다.
액체 최소 배지 (pH 7.2)
포도당 10g, KH2PO4 1 g, K2HPO4 2 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, 요소 2 g, (NH4)2SO4 5 g, NaCl 0.5 g, 니코틴아미드 5 ㎍, 칼슘-판토텐산 0.1 ㎍, 비오틴 0.2 ㎍, 티아민 HCl 3 ㎍, Trace elements solution* 1ml (증류수 1 리터 기준)
*Trace elements solution
Na2B4O7 10H2O 0.09 g, (NH4)6Mo7O27 4H2O 0.04 g, ZnSO4 7H2O 0.01 g, CuSO4 5H2O 0.27 g, MnCl2 4H2O 0.01 g, FeCl3 6H2O 1 g, CaCl2 0.01 g (증류수 1 리터 기준)
최소저지농도 실험을 위해, 3 g/L의 L-히스티딘을 배지에 첨가하여 18hr 배양함
상기 선별된 36개의 colony를 실시예 3에서 수행한 방법으로 고체 배지 기반 스크리닝을 수행하여 L-히스티딘 배출능이 증가된 6종의 colony를 최종 스크리닝 하였으며, 그 결과를 하기의 표 7에 나타내었다:
L-히스티딘이 포함된 최소배지에서 변이 도입 균주들의 성장 정도
균주 L-히스티딘 미포함 최소배지 L-히스티딘 1 g/L 포함 최소배지
ATCC13032ΔN2131 ++++ +
ATCC13032ΔN2131::Hma ++++ +++
ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-1216 ++++ ++++
ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-2305 ++++ ++++
ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-3411 ++++ ++++
ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-4426 ++++ ++++
ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-5714 ++++ ++++
ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 ++++ ++++
(표 7에서, + 개수는 균주들의 상대적 성장 정도를 나타내는 것으로, 각각 다음을 나타냄:+ : single colony는 형성되지 못하나 heavy(single colony로 성장되지 못하고 뭉쳐서 자라는 형태)는 형성됨;++ : heavy 형성되고 single colony 5개 미만 형성됨;
+++ : heavy 형성되고 single colony 50개 미만 형성됨;
++++ : heavy가 single colony 구분되지 않게 형성됨)
상기 표 7에 나타난 바와 같이, NCgl2131 결손 균주(ATCC13032ΔN2131)는 L-히스티딘 1 g/L 포함 최소배지에서 원활하게 성장하지 못하였으나, Helcobacillus massiliensis 유래 유전자가 도입된 ATCC13032ΔN2131::Hma 균주는 원활하게 성장하였고 고체 배지 기반 스크리닝을 수행하여 L-히스티딘 배출능이 증가된 6종의 균주(ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-1216, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-2305, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-3411, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-4426, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-5714, 및 ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 균주)는 히스티딘 1 g/L 포함 최소배지에서 보다 높은 성장 정도를 확인하였다.
실시예 10. 코리네박테리움 유래 L-히스티딘 생산 균주(KCCM 80179) 기반 선별 라이브러리 도입균주 제작 및 L-히스티딘 생산능 평가
실시예 9에서 선별된 colony 6종이 포함하고 있는 변이형 hma를 L-히스티딘 생산균주에 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 이를 위하여 ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-1216, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-2305, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-3411, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-4426, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-5714, ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 48와 서열번호 49의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 변이형 hma종을 획득하였다. PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. 변이형 hma과 연결 가능한 PgapA 단편을 수득하기 위하여, ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 26과 서열번호 50의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하여 PgapA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 돌연변이 hma 6종 단편과 PgapA 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 pDZΔN2131 벡터를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하여 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 유래 라이브러리 colony에 따라 pDZΔN2131-PgapA-Hma(mt)-1216, pDZΔN2131-PgapA-Hma(mt)-2315, pDZΔN2131- PgapA-Hma(mt)-3411, pDZΔN2131-PgapA-Hma(mt)-4426, pDZΔN2131-PgapA-Hma(mt)-5714, pDZΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718으로 명명하였다.
이후 제작된 벡터를 KCCM 80179 균주에 전기천공법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 변이 hma 6종이 각각 도입된 균주 6종을 제작하였으며, 이를 각각 KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-1216, KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-2315, KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-3411, KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-4426, KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-5714, KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718으로 명명하였다.
상기 제작된 균주 6 종의 L-히스티딘 생산능을 확인하기 위하여, 상기 실시예 7에서 제작된 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma 균주를 대조군으로 사용하여 실시예 4와 같은 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다:
KCCM 80179 유래 변이 hma 도입 균주 6종의 L-히스티딘 생산량
Cell OD600 사용한
포도당 (g/L) 		히스티딘
생산량 (g/L)
KCCM 80179 51.0 100 13.9
KCCM 80179ΔN2131 51.1 100 14.0
KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma 43.5 100 16.5
KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-1216 50.1 100 15.1
KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-2315 45.8 100 16.2
KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-3411 40.1 100 16.4
KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-4426 44.0 100 16.2
KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-5714 41.5 100 17.1
KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 40.7 100 18.5
상기 표 8에 나타난 바와 같이, NCgl2131 결손 균주(KCCM 80179ΔN2131)는 모균주인 KCCM 80179 균주와 동등 정도의 L-히스티딘 생산능을 가지는 반면, Helcobacillus massiliensis 유래 유전자가 도입된 ATCC13032ΔN2131::Hma 균주는 NCgl2131 결손 균주 및 모균주인 KCCM 80179 균주 대비 L-히스티딘 생산능이 증가하였다.변이 hma 6종이 각각 도입된 6종의 균주는 NCgl2131 결손 균주 및 모균주인 KCCM 80179 균주 대비 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma 균주와 동등하거나 그 이상의 수준으로 L-히스티딘 생산능이 증가하였으며, 특히 KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-5714 및 KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 균주는 L-히스티딘 생산능이 야생형 hma가 도입된 KCCM 80179ΔN2131-PgapA-Hma 대비 각각 3.6%, 12.1% 증가함을 확인하였다.
실시예 11. L-히스티딘 생산능 증가 변이형 Hma 유전자 변이 확인
상기 실시예 10에서 L-히스티딘 생산능 증가 효과가 확인된 KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 균주의 Hma에 도입된 변이를 확인하기 위하여 Hma 변이체의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 결정하기 위해 KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 균주의 gDNA를 주형으로 서열번호 18 및 서열번호 21의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. 염기서열 분석을 통하여 변이형 hma 오페론의 염기서열 및 HmaF 또는 HmaE의 단백질 서열을 확인하고 서열번호 43 또는 서열번호 44의 아미노산 서열과 비교하였으며, 이를 통해 확인된 변이형 HmaFE의 아미노산 서열의 변이 정보를 표 9에 나타내었다.
KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 균주 HmaF, HmaE 변이
균주 HmaF
(서열번호 43)		 HmaE
(서열번호 44)
KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 I72L, I124V 변이 X
시퀀스 확인 결과, KCCM80179ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 균주에 도입된 변이형 HmaFE는 HmaF에 I72L(서열번호 43의 72번째 이소류신(Ile, I)이 류신(Leu, L)으로 변이), I124V(서열번호 43의 124번째 이소류신(Ile, I)이 발린(Val, V)으로 변이) 변이가 도입되어 L-히스티딘 배출능이 증가된 변이형 배출자임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, Helcobacillus massiliensis 유래 변이형 배출자 도입을 통해 야생형 대비 최소저해농도 이상의 L-히스티딘 농도에 대한 내성이 증가될 뿐만 아니라, L-히스티딘 생산능도 크게 증가됨을 확인하였다. 이러한 결과는 선별된 Helcobacillus massiliensis 유래 변이 단백질이 L-히스티딘을 특이적으로 배출할 수 있는 변이형 L-히스티딘 배출 단백질임을 입증한다.
실시예 12. L-히스티딘 생산 균주(CA14-737) 기반 Helcobacillus massiliensis 유래 변이 유전자 도입 균주 제작 및 L-히스티딘 생산능 평가
상기 Helcobacillus massiliensis 유래 단백질 Hma 변이체의 L-히스티딘 배출능을 다시 한번 확인하기 위하여, 야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래로 L-히스티딘에 의한 피드백 제한 해소 HisG 폴리펩티드 변이 도입, L-히스티딘 생합성 유전자가 강화된 L-히스티딘 생산균주 CA14-737(KCCM 12411P, 대한민국 공개특허 제10-2019-0065984호) 균주에 도입하였다.
이를 위해 실시예 2와 10에서 제작된 벡터 3종(pDZΔN2131, pDZΔN2131-PgapA-Hma, pDZΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718)을 각각 CA14-737 균주에 전기천공법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 NCgl2131 유전자가 결손되거나 L-히스티딘 배출유전자로 치환되어 있는 균주 3종을 제작하였으며, 이를 각각 CA14-737ΔN2131, CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma, CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718으로 명명하였다.
상기 제작된 CA14-737ΔN2131, CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma, CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 균주의 L-히스티딘 생산능을 확인하기 위하여, 실시예 4에서 수행한 방법으로 배양하고 L-히스티딘 생산량(배지 내 히스티딘 함량)을 측정하여, 그 결과를 다음의 표 10에 나타내었다:
CA14-737 유래 Helcobacillus massiliensis 유래 야생형 유전자 및 변이체 도입 균주의 L-히스티딘 생산량
OD 사용한
포도당 (g/L) 		히스티딘
생산량 (g/L)
CA14-737 90.3 100 4.1
CA14-737ΔN2131 90.5 100 4.0
CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma 71.1 100 6.3
CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 61.5 100 7.3
표 10에 나타난 바와 같이, Helcobacillus massiliensis 유래 유전자가 도입된 CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma 균주는 NCgl2131 결손 균주(CA14-737ΔN2131) 및 모균주인 CA14-737 균주 대비 L-히스티딘 생산량이 54% 증가하였고, 변이형 hma가 도입된 CA14-737ΔN2131-PgapA-Hma(mt)-6718 균주는 78% 증가하였다.이를 통해 Helcobacillus massiliensis 유래 야생형 및 변이형 단백질 모두 L-히스티딘을 특이적으로 배출할 수 있으며, 선별된 변이형 단백질의 경우 야생형 단백질보다 더 높은 배출능을 갖는 L-히스티딘 배출자임을 다시 한번 확인하였다.
실시예 13. Helcobacillus massiliensis 유래 야생형 유전자 및 변이체 대장균 발현용 벡터 제작
상기 Helcobacillus massiliensis 유래 단백질 Hma 및 변이체의 L-히스티딘 배출능을 다양한 균주에 확인하기 위하여 대장균에서 야생형 Hma 및 Hma 변이체를 각각 발현시킬 수 있는 벡터를 제작하였다. 각각의 유전자는 대장균 발현 벡터인 pCC1BAC(이하, pBAC, Epicenter corp.)에 클로닝 되었으며, 외래 L-히스티딘 배출 유전자 후보들이 대장균 균주 MG1655 유래 yccA 유전자의 프로모터(이하. PyccA, 서열번호 51) 하에서 발현되도록 설계하였다.
Helcobacillus massiliensis 유래 단백질 Hma 및 변이형 유전자 단편을 확보하기 위하여 ATCC13032ΔN2131-PgapA-Hma 및 ATCC13032Δ N2131-PgapA-Hma(mt)-6718의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 52와 서열번호 53의 프라이머 쌍을 이용한 각각 PCR을 수행하여 야생형 및 변이형 hma DNA 단편을 획득하였다. PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다. PyccA 단편을 수득하기 위하여, MG1655의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 54과 서열번호 55의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같이 하였다: 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하여 PyccA 단편을 수득하였다. 상기 수득된 야생형 및 돌연변이 hma 단편과 PyccA 단편, 그리고 EcoRI 제한효소로 절단된 pBAC 벡터를 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝하여 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pBAC-PyccA-Hma, pBAC-PyccA-Hma(mt)-6718으로 명명하였다.
실시예 14. 대장균 유래 L-히스티딘 생산 균주 기반 Helcobacillus massiliensis 유래 Hma 야생형 유전자 및 변이체 도입 균주 제작 및 L-히스티딘 생산능 평가
대장균 유래 L-히스티딘 생산 균주를 기반으로 Helcobacillus massiliensis 유래 단백질 Hma 변이체의 L-히스티딘 배출능을 확인하기 위하여, 실시예 13에서 제작된 벡터 2종과 pBAC 벡터를 기 보고된 유전자형(purR 결손, hisL 결손, hisGr; The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants; Applied Biochemistry and Microbiology, 2013, Vol. 49, No. 2, pp. 130-135)을 갖는 CA14-9003e 균주 (MG1655+ hisGr hisL'_Δ ΔpurR)에 도입한 균주 3종을 제작하였으며, 이를 각각 CA14-9003e/pBAC, CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma, CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma(mt)-6718으로 명명하였다.
상기 제작된 CA14-9003e/pBAC, CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma, CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma(mt)-6718 균주의 L-히스티딘 생산능을 확인하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 배양하였다. 균주들을 LB 고체 배지(클로람페니콜 25㎍/ml 포함)에서 16시간 동안 배양한 후, LB 액체 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 37 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 대장균 생산 배지(Applied Biochemistry and Microbiology, 2013, Vol. 49, No. 2, pp. 130-135) 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 37 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 배양에 사용된 배지는 다음과 같다:
<대장균 생산배지>
포도당 4%(w/v), 효모추출액 0.2%(w/v), 황산암모늄 1.6%(w/v), 제2인산칼륨3수염 0.06%(w/v), 황산철7수염 0.0005%(w/v), 황산마그네슘 5수염 0.0005%(w/v), 탄산칼슘, pH 7.2,
배양 종료 후 HPLC에 의해 L-히스티딘 생산량(배지 내 히스티딘 함량)을 측정하여 그 결과를 다음의 표 11에 나타내었다
CA14-9003e 유래 Helcobacillus massiliensis 유래 야생형 및 변이체 도입 균주의 L-히스티딘 생산량
OD 사용한
포도당 (g/L) 		히스티딘
생산량 (g/L)
CA14-9003e/pBAC 24.5 40 2.9
CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma 17.1 40 3.7
CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma(mt)-6718 14.5 40 4.8
표 11에 나타난 바와 같이, 변이형 Hma가 도입된 CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma(mt)-6718 균주는 야생형 Hma 도입주 CA14-9003e/pBAC-PyccA-Hma 균주 대비 L-히스티딘 생산능이 30% 증가됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해, Helcobacillus massiliensis 유래 L-히스티딘 배출자 변이체를 코리네박테리움 속 균주 이외의 미생물에 도입시에도 세포 밖으로의 L-히스티딘 배출능이 크게 증가됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. (1) 서열번호 43의 아미노산 서열의 72번째 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나,
    (2) 서열번호 43의 아미노산 서열의 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는
    (3) 상기 (1) 및 (2)가 모두 치환된,
    변이형 L-히스티딘 배출 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    (1) 서열번호 43의 아미노산 서열의 72번째 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산이 류신, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린 또는 메티오닌으로 치환되거나,
    (2) 서열번호 43의 아미노산 서열의 124번째 잔기에 상응하는 아미노산이 발린, 글리신, 프롤린, 알라닌, 류신 또는 메티오닌으로 치환되거나, 또는,
    (3) 상기 (1) 및 (2)가 모두 치환된, 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 56의 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것인, 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 L-히스티딘 생산능을 갖는 것인, 미생물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속인, 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 에스케리키아 콜라이인, 미생물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질,
    상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는
    상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 미생물을 포함하는, L-히스티딘 생산용 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-히스티딘 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배양하는 단계 이후에, 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, L-히스티딘 생산 방법.
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