WO2023276785A1 - 歯周病の体外診断方法、及び、Ｐｇ菌検出方法 - Google Patents

歯周病の体外診断方法、及び、Ｐｇ菌検出方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an in vitro diagnostic method for periodontal disease and a method for detecting Pg bacteria.
  • Periodontal disease is a general term for diseases in the periodontal tissue, which is the tissue that supports the teeth, and is considered a multifactorial disease caused by various factors. Among these many factors, one of the major ones is the infection of periodontal pathogenic bacteria in periodontal pockets. Due to such bacterial infection, the periodontal tissue is destroyed, and eventually the teeth are lost.
  • Treponema denticola (hereinafter also referred to as “Td bacteria”) are highly likely to be causative bacteria of periodontal disease. They are also considered to be related to diseases, and investigations are underway for in vitro diagnostic methods for detecting the activity of these bacteria in the oral cavity of subjects.
  • Patent Literature 1 describes "a periodontal disease detection method characterized by using a cysteine protease produced by Lactobacillus gingipalis as a periodontal disease marker for detecting periodontal disease.”
  • the periodontal disease detection method described in Patent Document 1 measures enzyme activity, and the activity varies greatly depending on the reaction temperature, and the measurement operation is complicated. There was room.
  • a specimen derived from the oral cavity of a subject is brought into contact with an electrode, electrochemically measured in the presence of a sugar source amino acid and an electron mediator under an anaerobic environment, and as a result of the electrochemical measurement, current generation is detected. If so, providing information for determining that periodontal disease is progressing in the oral cavity of the subject.
  • the glycogenic amino acid contains at least one selected from the group consisting of arginine, histidine, aspartic acid, and glutamic acid.
  • the electronic mediator contains at least one selected from the group consisting of flavin mononucleotide, riboflavin, and 2-hydroxy-1,4-napthoquinone, [ 1] or the method for in vitro diagnosis of periodontal disease according to [2].
  • the information for the determination is at least one selected from the group consisting of the time from the start of the electrochemical measurement to the detection of the current generation, and the maximum value of the current density of the generated current.
  • the information for the determination is at least one selected from the group consisting of the time from the start of the electrochemical measurement to the detection of the current generation, and the maximum value of the current density of the generated current.
  • the Pg bacterium detection method according to any one of [10] to [12], including the measurement result of species.
  • the in-vitro diagnostic method of the present invention includes contacting a specimen derived from the oral cavity of a subject with an electrode, performing electrochemical measurement in the presence of a saccharogenic amino acid and an electron mediator under an anaerobic environment, and obtaining the results of the electrochemical measurement. and providing information for determining that periodontal disease is progressing in the subject's oral cavity if current generation is detected. According to this method, information for judging the progress of periodontal disease can be obtained by a simple operation of electrochemically measuring a specimen in the presence of a glycogenic amino acid and an electronic mediator.
  • the glycogenic amino acid contains at least one selected from the group consisting of arginine, histidine, aspartic acid, and glutamic acid
  • the resulting generated current tends to be larger. Since the measurement can be performed with higher sensitivity than this, more accurate information can be obtained as a result.
  • the electronic mediator contains at least one selected from the group consisting of flavin mononucleotide (FMN), riboflavin (RF), and 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone (hereinafter also referred to as "HNQ")
  • FMN flavin mononucleotide
  • RF riboflavin
  • HNQ 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone
  • the above tendency is particularly pronounced when the electronic mediator includes HNQ.
  • the inventors have experimentally determined that when the electron mediator comprises HNQ, surprisingly, the time until current production is detected is also shorter. That is, it is possible to shorten the time until information is provided.
  • the method of electrochemical measurement is to control the potential of an electrode and measure the current flowing through said electrode as a function of time, the current generation is more detectable, resulting in more accurate information. easy to get
  • the information for determination is at least one measurement result selected from the group consisting of the time from the start of the electrochemical measurement until the current generation is detected, and the maximum value of the current density of the generated current.
  • the progress of periodontal disease can be determined in chronological order by comparing the obtained information.
  • the information for the determination includes comparison information between a predetermined reference value and the measurement result, for example, if the reference value set for each subject is used, the progress of periodontal disease can be evaluated. easier to judge. In addition, if a reference value determined for each attribute of the subject, such as age and gender, is used, even if it is a single measurement, the comparison target becomes clear, so the progress of periodontal disease from the obtained information Easier to judge the degree.
  • the method for detecting Pg bacteria of the present invention comprises contacting a specimen with an electrode, performing electrochemical measurement in the presence of a saccharogenic amino acid and HNQ in an anaerobic environment, and detecting current generation as a result of the electrochemical measurement. If so, providing information for determining that the specimen contains Pg bacteria.
  • HNQ is used as an electron mediator
  • Pg bacteria can be specifically detected with a simple operation even when the sample contains contaminants and/or other bacteria. Since Pg bacteria, which are periodontopathogenic bacteria, can be detected without performing operations such as culturing, it can be easily applied to determination of dental treatment policy.
  • the electrochemical measurement method is a method of controlling the potential of the electrode and measuring the current flowing through the electrode as a function of time, it is easier to detect the current generation by Pg bacteria, and as a result, it is easier to detect. Easy to get accurate information.
  • the information for the determination is at least one selected from the group consisting of the time from the start of the electrochemical measurement to the detection of the current generation, and the maximum value of the current density of the generated current. Including measurement results is preferable in that quantitative evaluation is easier. For example, it is possible to compare the number of Pg bacteria between specimens.
  • the information for judgment includes comparison information between a predetermined reference value and measurement results, for example, creating a reference value based on a blank sample will enable more accurate measurement.
  • FIG. 1 is a flow chart of an in-vitro diagnostic method according to an embodiment of the present invention
  • 4 is a chronoamperogram showing the effect of histidine on the generated current.
  • 4 is a chronoamperogram showing the effect of aspartic acid on the generated current.
  • 4 is a chronoamperogram showing the effect of glutamic acid on generated current.
  • FIG. 10 is a diagram showing current production specific to Pg bacteria when aspartic acid is used as a saccharogenic amino acid. It is an experimental result of examining the influence of HNQ on current generation. It is an experimental result of examining the influence of FMN on current generation. It is the experimental result which investigated the influence on current generation of RF.
  • FIG. 1 is a flow chart of an in-vitro diagnostic method according to an embodiment of the present invention.
  • a sample derived from the oral cavity of a subject is brought into contact with an electrode, and electrochemical measurement is performed in the presence of a glycogenic amino acid and an electron mediator under an anaerobic environment (step S11).
  • the specimen is not particularly limited as long as it is derived from the oral cavity of the subject, but preferably contains saliva, plaque, blood, pus, mixtures thereof, and the like. Especially, when the specimen contains saliva, it is more non-invasive and easier to collect, which is preferable.
  • the specimen may contain water, electrolytes, and the like as components other than those described above.
  • the electrolyte is not particularly limited, but known electrolytes can be used. However, it is preferable that the electrolyte does not contain organic substances other than the saccharogenic amino acids described later.
  • Electrochemical measurements are performed in the presence of glycogenic amino acids. Electrochemical measurement in the presence of a glycogenic amino acid typically includes a form in which the glycogenic amino acid is added to the sample. Examples of glycogenic amino acids include alanine, glycine, serine, threonine, cysteine, tryptophan, isoleucine, methionine, valine, aspartic acid, arginine, glutamic acid, histidine, proline, tyrosine, and phenylalanine, among others.
  • At least one selected from the group consisting of arginine, histidine, aspartic acid, and glutamic acid is preferable, and at least one selected from the group consisting of arginine and histidine from the viewpoint that the generated current (density) tends to be larger 1 type is more preferable.
  • histidine Compared to aspartic acid and glutamic acid, histidine has higher water solubility and is preferable in that even when added to a specimen, it tends to be more uniform. If the water solubility is high, there is no need to add an acid or the like to the sample, which is preferable in that the background current in the measurement tends to be small. In addition, the present inventors have experimentally confirmed that when the glycogenic amino acid is histidine, the generated current derived from the Pg bacterium tends to increase (see Examples).
  • acid e.g., hydrochloric acid
  • the content of the glycogenic amino acid in the sample is not particularly limited, but is generally preferably 0.1 to 1000 mM.
  • Electrochemical measurements are also performed in the presence of an electronic mediator. Periodontopathogenic bacteria generate electric current in an anaerobic environment, and some have the function of transferring the electric current to an extracellular electron acceptor (e.g., anode electrode), but electrochemical measurements are performed in the presence of an electron mediator. This is more preferable because electron transfer can be performed more smoothly. Electrochemical measurement in the presence of an electron mediator typically includes a form in which an electron mediator is added to a specimen, as in the case of the sugargenic amino acid described above.
  • the electronic mediator that can be used is not particularly limited, and known electronic mediators can be used.
  • the electron mediator is preferably water-soluble, and is selected from the group consisting of flavin mononucleotide, riboflavin, and 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone (2-hydroxy-1,4-napthoquinone, HNQ). When at least one is included, a larger generated current (density) can be obtained.
  • the glycogenic amino acid and the electron mediator may not be added to the specimen.
  • the glycogenic amino acid may be immobilized on the electrode surface.
  • a method of controlling the potential of the electrode and measuring the current as a function of time is preferable.
  • Such methods include, for example, the amperometry method, the cyclic voltammetry method, the linear sweep voltammetry method, and the rectangular wave voltammetry method.
  • the material of the electrodes is not particularly limited, and known electrodes for electrochemical measurements can be used.
  • Materials for the electrodes include, for example, ITO (indium tin oxide), noble metals (gold (Au), silver (Ag), platinum (Pt), palladium (Pd), rhodium (Rh), iridium (Ir), ruthenium (Ru ), etc.), copper (Cu), aluminum (Al), tungsten (W), molybdenum (Mo), chromium (Cr), titanium (Ti), nickel (Ni), and the like.
  • Carbon materials such as carbon and graphite (graphene) may also be used.
  • a boron-doped diamond electrode is also preferable in that it has a wide potential window.
  • a general electrochemical measuring device can be used for the electrochemical measurement.
  • a three-electrode electrochemical measurement device in which a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode are housed in a cell can be used.
  • the temperature at which the electrochemical measurement is performed is not particularly limited, it can be performed at the same temperature as the sampling site of the sample, or the temperature can be controlled. In that case, the temperature of the specimen is preferably 10 to 40°C.
  • the measurement may be performed in a general anaerobic glove box (anaerobic chamber), preferably under anoxic conditions.
  • the potential of the electrode (working electrode) exceeds 0 V (vs. Ag/AgCl), and the potential window Control within a range less than the upper limit is preferred. Further, from the viewpoint of easily obtaining a larger generated current or easily generating a current in a shorter time, it is preferable to set the potential of the electrode to 0 to +0.6 V (vs. Ag/AgCl).
  • step S12 If current generation is detected by this electrochemical measurement (step S12: Yes), the presence of periodontopathogenic bacteria in the sample is suggested. In this case, information for determining that periodontal disease is progressing in the oral cavity of the subject is provided (step S13).
  • step S12 if current generation is not detected by this electrochemical measurement (step S12: No), the diagnosis ends and no information is provided for determining that periodontal disease is progressing.
  • the above information is based on the measurement results, and its form is not particularly limited, but it consists of the time from the start of electrochemical measurement to the detection of current generation, and the maximum current density of the generated current.
  • Information containing at least one measurement result selected from the group (hereinafter also referred to as “specific information”) is more preferable because it is likely to be information that contributes to quantitative evaluation of the progress of periodontal disease.
  • the above-mentioned specific information is a numerical value related to the content of periodontopathogenic bacteria in the specimen, and for example, by comparing it with the value of a healthy subject or comparing it with the past value of the same subject, The information is likely to be useful for judging the degree of periodontal disease occurring in the oral cavity of the subject and the chronological progression of the disease.
  • Modification A modification of the in-vitro diagnostic method according to the above-described embodiment compares the obtained measurement result with a reference value when current generation is detected, and provides information including the comparison information as periodontal disease in the oral cavity of the subject. It is an in vitro diagnostic method that provides information for judging progress.
  • Examples of the reference value in the extracorporeal diagnostic method include the result of measurement by the same method using a healthy subject's sample, the past test result of the same subject, and the like.
  • the comparative information includes, for example, the difference between the specific information measured by the same method using a healthy subject's sample and the specific information of the sample.
  • the time from the start of electrochemical measurement to the detection of current generation in the case of measuring by the same method using a healthy subject's specimen, and the same as above for the specimen obtained from the subject The difference from the time measured by the method of . If the time measured for the sample is earlier and the difference is larger, it can be used as information for determining that the sample contains more periodontopathogenic bacteria.
  • the above comparison information is an example, and information other than the above may be used.
  • the specimen is brought into contact with an electrode, and in the presence of a glycogenic amino acid and 2-hydroxy-1,4-napthoquinone, Including performing electrochemical measurement in an anaerobic environment, and providing information for determining that the specimen contains Porphyromonas gingivalis when current generation is detected as a result of the electrochemical measurement. .
  • the specimens in this detection method are not limited to those derived from the oral cavity of the subject, but may be specimens cultured for testing and research, environmental specimens (water and dust), and the like. If the specimen is not liquid, it can be used after extraction and purification using water or the like.
  • Figure 2 is a chronoamperogram showing the effect of histidine on the generated current.
  • PG-w/Histidine means that the sample contains histidine which is a glycogenic amino acid
  • PG-w/Glucose means that the sample does not contain histidine and contains glucose instead. This is the result.
  • current production was detected immediately after adding the Pg bacterial solution.
  • current generation was detected, but at a smaller magnitude and with a longer time to current generation.
  • Fig. 3 is a chronoamperogram showing the effect of aspartic acid on the generated current.
  • FIG. 4 is a chronoamperogram showing the effect of glutamic acid on the generated current. In both cases, current production was detected immediately after adding the Pg bacterial solution.
  • Figure 5 shows the above results. From FIG. 5, it was found that in the sample containing aspartic acid, Pg-specific current production could be detected.
  • FIG. 6 shows experimental results when using HNQ, FIG. 7 using FMN, and FIG. 8 using RF.
  • FIGS. 6 to 8 when any of the electron mediators was used, a larger current was rapidly obtained after addition of the bacterial solution (compare with FIG. 2).
  • HNQ when HNQ was used, a larger current was obtained than when FMN and RF were used, and this tendency was particularly noticeable at concentrations exceeding 10 ⁇ M.
  • saliva can be used as a specimen, and information for determining the progression of periodontal disease can be obtained in a simple manner.
  • the information provided by the in-vitro diagnostic method of the present invention can be used not only for dentists to determine treatment strategies, but also for oral health management by patients themselves at home or in remote locations.
  • the Pg bacterium detection method of the present invention it is possible to detect Pg bacterium-specific current generation by using a combination of saccharogenic amino acids and HNQ. This method is useful not only in formulating a dental treatment policy but also in the field of experimental research.

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Abstract

本発明の歯周病の体外診断方法は、被験者の口腔に由来する検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸と、電子メディエータと、の存在下、嫌気環境下で電気化学測定することと、上記電気化学測定の結果、電流生成が検出された場合、上記被験者の口腔内において歯周病が進行していると判断するための情報を提供することと、を含む。本発明の歯周病の体外診断方法によれば、歯周病の進行状況を判断するための情報を簡単な操作で提供できる。

Description

歯周病の体外診断方法、及び、Ｐｇ菌検出方法
　本発明は、歯周病の体外診断方法、及び、Ｐｇ菌検出方法に関する。
　歯周病は、歯を支持するための組織である歯周組織における疾患の総称であり、様々な要因により引き起こされる多因子性疾患と考えられている。この多数の要因のなかでも、主要なものの一つとされているのが、歯周ポケットへの歯周病原性細菌の感染である。このような細菌感染によって、歯周組織が崩壊していき、ついには歯の脱落が起こる。
　歯周病原性細菌は数多く存在することが知られているが、なかでも、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、以下「Ｐｇ菌」ともいう。）、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ　ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、以下「Ｔｆ菌」ともいう。）、及び、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、以下「Ｔｄ菌」ともいう。）は歯周病の原因菌となる可能性が高く、更に、歯周病だけでなく、他器官の疾患にも関係していると考えられており、被験者の口腔内におけるこれらの細菌の活性を検出するための体外診断方法の検討が進んでいる。
　そのひとつとして、上述の歯周病原性細菌（Ｐｇ菌、Ｔｆ菌、及び、Ｔｄ菌）が、トリプシン様酵素活性を有していることを利用した方法が知られている。すなわち、上記酵素活性を検出することで、歯周病の診断を行う技術である。例えば、特許文献１には、「ジンジパリス菌が産生するシステインプロテアーゼを歯周病検出のための歯周病マーカーとして使用することを特徴とする歯周病検出方法。」が記載されている。
国際公開第２００４／１０６５４１号
　特許文献１に記載の歯周病検出方法は、酵素活性を測定するものであり、反応温度によって活性が大きく異なったり、測定操作が煩雑だったりして、測定に熟練が必要であり、改善の余地があった。
　そこで、本発明は、歯周病の進行状況を判断するための情報を簡単な操作で提供できる、歯周病の体外診断方法を提供することを課題とする。また、本発明はＰｇ菌検出方法を提供することも課題とする。
　本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
　［１］　被験者の口腔に由来する検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸と電子メディエータとの存在下、嫌気環境下で電気化学測定することと、上記電気化学測定の結果、電流生成が検出された場合、上記被験者の口腔内において歯周病が進行していると判断するための情報を提供することと、を含む、歯周病の体外診断方法。
　［２］　上記糖源性アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、及び、グルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む、［１］に記載の歯周病の体外診断方法。
　［３］　上記電子メディエータが、フラビンモノヌクレオチド、リボフラビン、及び、２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，４－ｎａｐｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）からなる群より選択される少なくとも１種を含む、［１］又は［２］に記載の歯周病の体外診断方法。
　［４］　上記電子メディエータが、２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノンである、［１］～［３］のいずれかに記載の歯周病の体外診断方法。
　［５］　上記電気化学測定の方法が、上記電極の電位を制御して、上記電極を流れる電流を時間の関数として測定する方法である、［１］～［４］のいずれかに記載の歯周病の体外診断方法。
　［６］　上記電位が、銀－塩化銀電極に対して０Ｖを超えて、電位窓の上限値未満の範囲内である、［５］に記載の歯周病の体外診断方法。
　［７］　上記判断するための情報が、上記電気化学測定の開始から上記電流生成が検出されるまでの時間、及び、生成される電流の電流密度の最大値からなる群より選択される少なくとも１種の測定結果を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の歯周病の体外診断方法。
　［８］　上記判断するための情報が、予め定められた基準値と、上記測定結果との比較情報を含む、［７］に記載の歯周病の体外診断方法。
　［９］　上記歯周病の原因菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の歯周病の体外診断方法。
　［１０］　検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸と２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，４－ｎａｐｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）との存在下、嫌気環境下で電気化学測定することと、上記電気化学測定の結果、電流生成が検出された場合、上記検体に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が含まれると判断するための情報を提供することと、を含むＰｇ菌検出方法。
　［１１］　上記電気化学測定の方法が、上記電極の電位を制御して、上記電極を流れる電流を時間の関数として測定する方法である、［１０］に記載のＰｇ菌検出方法。
　［１２］　上記電位が、銀－塩化銀電極に対して０Ｖを超えて、電位窓の上限値未満の範囲内である、［１１］に記載のＰｇ菌検出方法。
　［１３］　上記判断するための情報が、上記電気化学測定の開始から上記電流生成が検出されるまでの時間、及び、生成される電流の電流密度の最大値からなる群より選択される少なくとも１種の測定結果を含む、［１０］～［１２］のいずれかに記載のＰｇ菌検出方法。
　［１４］　上記判断するための情報が、予め定められた基準値と、上記測定結果との比較情報を含む、［１３］に記載のＰｇ菌検出方法。
　本発明の体外診断方法は、被験者の口腔に由来する検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸と電子メディエータとの存在下、嫌気環境下で電気化学測定することと、上記電気化学測定の結果、電流生成が検出された場合、上記被験者の口腔内において歯周病が進行していると判断するための情報を提供することと、を含む。本方法によれば、糖源性アミノ酸と電子メディエータの存在下で検体の電気化学測定するという簡単な操作で、歯周病の進行状況を判断するための情報を得ることができる。
　また、糖源性アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、及び、グルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む場合、得られる生成電流がより大きくなりやすい。これよりより高感度に測定できるため、結果として、より正確な情報を得ることができる。
　また、電子メディエータがフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、リボフラビン（ＲＦ）、及び、２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン（以下「ＨＮＱ」ともいう。）からなる群より選択される少なくとも１種を含む場合、歯周病原性細菌の代謝により電極へと渡される電子の流れがよりスムーズになりやすい。言い換えれば、上記特定の電子メディエータにより、歯周病原性細菌から電子がより引き抜かれやすくなる。この結果、より大きな電流生成が得られ、ダイナミックレンジがより大きくなる。
　上記の傾向は、電子メディエータがＨＮＱを含む場合に、特に顕著である。電子メディエータがＨＮＱを含む場合、驚くべきことに、電流生成が検出されるまでの時間もより短くなることを本発明者らは実験的に確かめている。すなわち、情報提供までの時間をより短くすることができる。
　また、電気化学測定の方法が、電極の電位を制御して、上記電極を流れる電流を時間の関数として測定する方法である場合、電流生成をより検知しやすく、結果としてより正確な情報が得られやすい。
　また、制御された電極の電位が、０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ：銀－塩化銀電極）を超えて、電位窓の上限値未満の範囲内であると、歯周病原性細菌から電子メディエータを介して電極へと渡される電子の流れがよりスムーズとなり、より正確な測定が可能となる。
　また、判断するための情報が、電気化学測定の開始から電流生成が検出されるまでの時間、及び、生成される電流の電流密度の最大値からなる群より選択される少なくとも１種の測定結果を含む場合、定量評価がより容易である点で好ましい。例えば、同一の被験者から時間をおいて複数回にわたって検体を採取する場合、得られた情報を比較することで、歯周病の進行具合を時系列的に判断することもできる。
　また、上記判断するための情報が、予め定められた基準値と、上記測定結果との比較情報を含む場合、例えば、被験者ごとに定められた基準値を用いれば、歯周病の進行具合の判断がより容易になる。また、年齢、及び、性別等、被験者の属性ごとに定められた基準値を用いれば、１回の測定であっても、比較対象が明確となるため、得られた情報から歯周病の進行度合いを判断しやすくなる。
　本発明のＰｇ菌検出方法は、検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸とＨＮＱとの存在下、嫌気環境下で電気化学測定することと、上記電気化学測定の結果、電流生成が検出された場合、上記検体に、Ｐｇ菌が含まれると判断するための情報を提供することとを含む。
　上記方法によれば、電子メディエータとしてＨＮＱを用いるため、検体に夾雑物質、及び／又は、他の細菌が含まれる場合にも、簡単な操作でＰｇ菌を特異的に検出できる。培養等の操作を行わなくても、歯周病原性細菌であるＰｇ菌を検出できるため、歯科治療方針の決定等に容易に応用できる。
　また、上記電気化学測定の方法が、上記電極の電位を制御して、上記電極を流れる電流を時間の関数として測定する方法である場合、Ｐｇ菌による電流生成をより検知しやすく、結果としてより正確な情報が得られやすい。
　また、上記制御された上記電極の電位が、０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）を超えて、電位窓の上限値未満の範囲内である場合、Ｐｇ菌からＨＮＱを介して電極へと渡される電子の流れがよりスムーズとなり、より正確な測定が可能となる。
　また、上記判断するための情報が、電気化学測定の開始から上記電流生成が検出されるまでの時間、及び、生成される電流の電流密度の最大値からなる群より選択される少なくとも１種の測定結果を含む場合、定量評価がより容易である点で好ましい。例えば、検体同士でＰｇ菌の菌数比較が可能となる。
　また、判断するための情報が、予め定められた基準値と、測定結果との比較情報を含む場合、例えば、ブランク検体をもとに基準値を作成すればより正確な測定が可能になる。
本発明の実施形態に係る体外診断方法のフローチャートである。 ヒスチジンによる生成電流への影響を示すクロノアンペログラムである。 アスパラギン酸による生成電流への影響を示すクロノアンペログラムである。 グルタミン酸による生成電流への影響を示すクロノアンペログラムである。 糖源性アミノ酸としてアスパラギン酸を用いた場合のＰｇ菌特異的な電流生成を表す図である。 ＨＮＱの電流生成への影響を調べた実験結果である。 ＦＭＮの電流生成への影響を調べた実験結果である。 ＲＦの電流生成への影響を調べた実験結果である。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
　なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
［体外診断方法］
　図１は本発明の実施形態に係る体外診断方法のフローチャートである。
　まず、被験者の口腔に由来する検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸と電子メディエータとの存在下、嫌気環境下で電気化学測定する（ステップＳ１１）。
　検体は、被験者の口腔内に由来するものであれば、特に制限されないが、だ液、プラーク、血液、及び、膿、並びに、これらの混合物等を含むことが好ましい。なかでも、検体がだ液を含む場合、より非侵襲的で、より採取も簡単であり、好ましい。
　検体には上記以外の成分として、水、及び、電解質等が含まれていてもよい。
　電解質としては、特に制限されないが、公知の電解質を用いることができる。但し、電解質には、後述する糖源性アミノ酸以外の有機物が含まれないことが好ましい。
　電気化学測定は、糖源性アミノ酸の存在下で行われる。糖源性アミノ酸の存在下で電気化学測定を行うとは、典型的には検体に糖源性アミノ酸を添加する形態が挙げられる。
　糖源性アミノ酸としては、例えば、アラニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、トリプトファン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、及び、フェニルアラニン等が挙られ、なかでも、生成電流（密度）がより大きくなりやすい観点では、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、及び、グルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、アルギニン、及び、ヒスチジンからなる群より選択される少なくとも１種がより好ましい。
　アスパラギン酸、及び、グルタミン酸と比較して、ヒスチジンは水溶性がより高く、検体に添加する場合でも、より均一になりやすい点で好ましい。水溶性が高いと、検体に酸等を添加する必要がないため、測定におけるバックグラウンド電流が小さくなりやすい点でも好ましい。
　また、糖源性アミノ酸がヒスチジンである場合、Ｐｇ菌に由来する生成電流がより大きくなりやすいことを本発明者らは実験的に確かめている（実施例参照）。
　なお、糖源性アミノ酸として、アスパラギン酸、又は、グルタミン酸を使用する場合、検体に酸（例えば、塩酸）を添加してｐＨを６．０以下（例えば、５．２程度）に調整することによって、より均一な検体を得ることができる。
　検体中における糖源性アミノ酸の含有量としては特に制限されないが、一般に、０．１～１０００ｍＭが好ましい。
　また、電気化学測定は、電子メディエータの存在下で行われる。歯周病原性細菌は嫌気環境下において電流生成し、その電流を細胞外の電子受容体（例えばアノード電極）に移動させる機能を有するものもあるが、電子メディエータの存在下で電気化学測定を行うことによって電子伝達をよりスムーズに行うことができるため、より好ましい。
　電子メディエータの存在下で電気化学測定を行う、とは、上記糖源性アミノ酸の場合と同様に、典型的には、検体に電子メディエータを添加する形態が挙げられる。
　使用できる電子メディエータとしては特に制限されず、公知の電子メディエータが使用できる。電子メディエータは水溶性のものが好ましく、なかでも、フラビンモノヌクレオチド、リボフラビン、及び、２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，４－ｎａｐｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、ＨＮＱ）からなる群より選択される少なくとも１種を含む場合、より大きな生成電流（密度）が得られる。
　特に、電子メディエータがＨＮＱを含む場合、驚くべきことに、口腔内の細菌のなかでも、Ｐｇ菌に由来する生成電流を顕著に大きくすることが本発明者らの検討で明らかになった。これは、検体に、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐｇ菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ（Ｓｍ菌）、及び、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ（Ｃｏ菌）が混在していた場合でも、Ｐｇ菌特異的に生成電流を検知できることを示唆している。
　以上では、検体に、糖源性アミノ酸と電子メディエータとが含まれる場合について説明したが、本体外診断方法においては、糖源性アミノ酸と電子メディエータとの存在下で電気化学測定が行われればよく、糖源性アミノ酸と電子メディエータとを検体に添加する形態でなくてもよい。そのような場合、例えば、糖源性アミノ酸が電極表面に固定されていてもよい。
　電気化学測定の方法としては、上記電極の電位を制御して電流を時間の関数として測定する方法が好ましい。このような方法としては、例えば、アンペロメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法、リニアスイープボルタンメトリー法、及び、矩形波ボルタンメトリー法等が挙げられる。
　電極の材質は特に制限されず、電気化学測定用として公知の電極を用いることができる。電極の材質としては、例えば、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）、貴金属（金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、ルテニウム（Ｒｕ）等）、銅（Ｃｕ）、アルミニウム（Ａｌ）、タングステン（Ｗ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）、チタン（Ｔｉ）、ニッケル（Ｎｉ）等が挙げられる。また、炭素材料、例えば、カーボン、及び、グラファイト（グラフェン）等であってもよい。また、電位窓が広いという点では、ホウ素ドープダイヤモンド電極も好ましい。
　電気化学測定には、一般的な電気化学測定装置を用いることができる。例えば、作用電極、対電極、及び、参照電極がセル内に収容された３電極式の電気化学測定装置を用いることができる。
　電気化学測定を行う温度は特に制限されないが、検体の採取場所と同程度の温度で行うこともできるし、温度を制御して行ってもよい。その場合、検体の温度は、１０～４０℃が好ましい。
　測定は、一般的な嫌気グローブボックス（嫌気チャンバー）内で、好ましくは無酸素状態で測定を行えばよい。
　歯周病原性細菌の嫌気下における代謝によって生じた電子を電極で受け取って電流を検出するために、電極（作用電極）の電位は、０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）を超えて、電位窓の上限値未満の範囲内で制御されることが好ましい。また、より大きな生成電流が得られやすい、又は、より短時間で電流が生成しやすい観点では、電極の電位を、０～＋０．６Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）に設定することが好ましい。
　この電気化学測定によって、電流生成が検出される場合（ステップＳ１２：Ｙｅｓ）、検体中に歯周病原性細菌の存在が示唆される。この場合、被験者の口腔内において歯周病が進行していると判断するための情報が提供される（ステップＳ１３）。
　一方、この電気化学測定によって、電流生成が検出されない場合（ステップＳ１２：Ｎｏ）、診断は終了し、歯周病が進行していると判断するための情報は提供されない。
　上記情報は測定結果に基づくものであって、その形態は特に制限されないが、電気化学測定の開始から電流生成が検出されるまでの時間、及び、生成される電流の電流密度の最大値からなる群より選択される少なくとも１種の測定結果を含む情報（以下「特定情報」ともいう。）である場合、歯周病の進行状況に関する定量評価に資する情報となり易い点でより好ましい。
　上記特定情報は、検体中における歯周病原性細菌の含有量に関連する数値であり、これを例えば、健常者の値と比較したり、同一被験者の過去の値と比較することによれば、被験者の口腔内において発生している歯周病の程度や、時系列的な進行状況を判断するのに資する情報となりやすい。
（変形例）
　上記実施形態に係る体外診断方法の変形例は、電流生成が検出される場合、得られた測定結果を基準値と比較して、その比較情報を含む情報を被験者の口腔内において歯周病が進行していると判断するための情報として提供する、体外診断方法である。
　本体外診断方法における基準値としては、例えば、健常者の検体を用いて同一の方法により測定した結果、及び、同一の被験者の過去の試験結果等が挙げられる。
　比較情報とは、健常者の検体を用いて同一の方法により測定した特定情報と、検体の特定情報との差等が挙げられる。
　より具体的には、健常者の検体を用いて同一の方法で測定した場合における、電気化学測定の開始から電流生成が検出されるまでの時間と、被験者から取得された検体についての上記と同様の方法で測定した時間との差等が挙げられる。検体について測定された時間の方が早く、その差がより大きくなれば、検体中に歯周病原性細菌がより多く含まれていると判断するための情報とすることができる。なお、上記の比較情報は一例であり、上記以外の情報であってもよい。
［Ｐｇ菌検出方法］
　本発明の実施形態に係るＰｇ菌検出方法は、検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸と２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，４－ｎａｐｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）との存在下、嫌気環境下で電気化学測定することと、電気化学測定の結果、電流生成が検出された場合、検体に、ポルフィロモナス・ジンジバリスが含まれると判断するための情報を提供することと、を含む。
　後述する実施例のとおり、本発明者らは、糖源性アミノ酸とＨＮＱとの存在下、嫌気環境下で電気化学測定を行うと、Ｐｇ菌特異的に大きな生成電流が検知できることを実験的に確かめている。
　例えば、歯周病予防の分野において「レッドコンプレックス」と呼ばれる、特に影響の大きな歯周病原性細菌の増殖状態を簡便に検出したいという要望は強い。すでに説明したとおり、酵素法は手順が煩雑でばらつきも大きく、簡便とは言えなかった。しかし、上記方法によれば、非常に簡便な方法で、しかも、Ｐｇ菌をほぼ特異的に検知することが可能である。
　電気化学測定等の条件については、第１実施形態に係る体外診断方法における電気化学測定の方法としてすでに説明したのと同一の方法が適用でき、好適形態も同様であるため、説明を省略する。
　本検出方法における検体としては、被験者の口腔内に由来するものに限らず、試験研究用に培養した検体、環境検体（水、及び、塵芥）等であってもよい。検体が液体でない場合には、水等を用いて抽出、精製して用いることができる。
　以下に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。
［糖源性アミノ酸による生成電流への影響］
（実験１：参考例）
　Ｐｇ菌を用いて、糖源性アミノ酸が電流生成に与える影響を確認した。３電極電気化学セル（作用電極：ＩＴＯ、対電極：白金、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ）を用いて、検体をトータル５ｍＬとして測定した。温度は３７℃とした。
　検体としては、イーストエクストラクトを除いたＤＭ液体培地に、１０ｍＭのヒスチジン、又は、グルコースを添加したものに、更にＰｇ菌液（ＯＤ６００：０．１）を添加したものを用いた。測定は１００％の窒素を充填したＣＯＹ嫌気チャンバー内で、クロノアンペロメトリー法により行った。
　図２は、ヒスチジンによる生成電流への影響を示すクロノアンペログラムである。「ＰＧ－ｗ／Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ」とあるのは、検体に糖源性アミノ酸であるヒスチジンが含まれる場合、「ＰＧ－ｗ／Ｇｌｕｃｏｓｅ」とあるのは、ヒスチジンを含まず、代わりにグルコースを含む場合の結果である。図２に示されるとおり、ヒスチジンを含む検体では、Ｐｇ菌液を添加した後、速やかに電流生成が検出された。一方、グルコースを含む検体では、電流生成は検出されるものの、その大きさはより小さく、電流生成までの時間もより長かった。
（実験２：参考例）
　次に、ヒスチジンに代えて糖源性アミノ酸としてアスパラギン酸、及び、グルタミン酸を用いて試験を行った。なおアスパラギン酸とグルタミン酸は、いずれも水への溶解性が低いため、０．５ＭのＨＣｌに溶解させた。従ってＤＭ液体培地のｐＨが～５．２となった。
　図３は、アスパラギン酸による生成電流への影響を示すクロノアンペログラムである。図４は、グルタミン酸による生成電流への影響を示すクロノアンペログラムである。いずれの場合も、Ｐｇ菌液を添加した後、速やかに電流生成が検出された。
　図２～４の結果から、検体が糖源性アミノ酸を含む場合、Ｐｇ菌液の添加によって電流生成が速やかに検出されることがわかった。また、糖源性アミノ酸がヒスチジンであると、アスパラギン酸、及び、グルタミン酸である場合と比較して、生成電流もより大きく、電流生成までの時間もより短かった。
［Ｐｇ菌によるヒスチジン特異的電流生成］
（実験３：参考例）
　Ｐｇ菌液（ＯＤ６００：０．１）に代えて、Ｐｇ菌液（ＯＤ６００：０．５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ菌液（ＯＤ６００：０．５）、及び、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｏｃｈｒａｃｅａ（ＯＤ６００：０．５）を用いたことを除いては、実験１と同様にして、生成電流を調べた。
　図５は上記の結果である。図５から、アスパラギン酸含む検体では、Ｐｇ菌特異的に電流生成を検出できることがわかった。
［電子メディエータの電流生成への影響］
（実験４：実施例）
　３電極電気化学セル（作用電極：ＩＴＯ、対電極：白金、参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ）に代えて、９６ウェルプレートの底面に３電極が印刷された電気化学測定プレートを用いて、電子メディエータによる電流生成への影響を調べた。
　使用した電子メディエータは、ＨＮＱ、ＦＭＮ、及び、ＲＦで、それぞれ濃度を１０μＭ、５０μＭ、１００μＭとした。また、菌液としては、Ｐｇ菌液（ＯＤ６００：０．５）を用い、それ以外の条件は実験１と同様にした。
　図６は、ＨＮＱ、図７はＦＭＮ、図８はＲＦをそれぞれ用いたときの実験結果である。図６～８の結果、いずれの電子メディエータを用いた場合も、菌液の添加後、迅速により大きな電流が得られた（図２との比較）。
　なかでも、ＨＮＱを用いた場合、ＦＭＮ、及び、ＲＦを用いた場合よりもより大きな電流が得られ、特に、１０μＭを超える濃度ではその傾向が顕著であった。
　本発明の歯周病の体外診断方法によれば、だ液を検体として使うことができ、簡単な方法で歯周病の進行に関する判断のための情報を得ることができる。本発明の体外診断方法により提供される情報は、歯科医師による治療方針の決定だけでなく、在宅、遠隔地における患者自身による口腔内の健康管理にも使用できる。
　また、本発明のＰｇ菌検出方法によれば、糖源性アミノ酸とＨＮＱとを組合わせて用いたことによってＰｇ菌特異的に電流生成を検知することができる。この方法は、歯科治療方針の策定のみならず、試験研究分野においても有用である。

Claims (14)

  1. 　被験者の口腔に由来する検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸と電子メディエータとの存在下、嫌気環境下で電気化学測定することと、
    　前記電気化学測定の結果、電流生成が検出された場合、前記被験者の口腔内において歯周病が進行していると判断するための情報を提供することと、を含む、歯周病の体外診断方法。
  2. 　前記糖源性アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、及び、グルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の歯周病の体外診断方法。
  3. 　前記電子メディエータが、フラビンモノヌクレオチド、リボフラビン、及び、２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，４－ｎａｐｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１又は２に記載の歯周病の体外診断方法。
  4. 　前記電子メディエータが、２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノンである、請求項１～３のいずれか１項に記載の歯周病の体外診断方法。
  5. 　前記電気化学測定の方法が、前記電極の電位を制御して、前記電極を流れる電流を時間の関数として測定する方法である、請求項１～４のいずれか１項に記載の歯周病の体外診断方法。
  6. 　前記電位が、銀－塩化銀電極に対して０Ｖを超えて、電位窓の上限値未満の範囲内である、請求項５に記載の歯周病の体外診断方法。
  7. 　前記判断するための情報が、前記電気化学測定の開始から前記電流生成が検出されるまでの時間、及び、生成される電流の電流密度の最大値からなる群より選択される少なくとも１種の測定結果を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の歯周病の体外診断方法。
  8. 　前記判断するための情報が、予め定められた基準値と、前記測定結果との比較情報を含む、請求項７に記載の歯周病の体外診断方法。
  9. 　前記歯周病の原因菌が、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の歯周病の体外診断方法。
  10. 　検体を電極と接触させ、糖源性アミノ酸と２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，４－ｎａｐｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ）との存在下、嫌気環境下で電気化学測定することと、
    　前記電気化学測定の結果、電流生成が検出された場合、前記検体に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が含まれると判断するための情報を提供することと、を含むＰｇ菌検出方法。
  11. 　前記電気化学測定の方法が、前記電極の電位を制御して、前記電極を流れる電流を時間の関数として測定する方法である、請求項１０に記載のＰｇ菌検出方法。
  12. 　前記電位が、銀－塩化銀電極に対して０Ｖを超えて、電位窓の上限値未満の範囲内である、請求項１１に記載のＰｇ菌検出方法。
  13. 　前記判断するための情報が、前記電気化学測定の開始から前記電流生成が検出されるまでの時間、及び、生成される電流の電流密度の最大値からなる群より選択される少なくとも１種の測定結果を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のＰｇ菌検出方法。
  14. 　前記判断するための情報が、予め定められた基準値と、前記測定結果との比較情報を含む、請求項１３に記載のＰｇ菌検出方法。
    　
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