WO2023287251A1 - Hif-1 알파 저해제 - Google Patents

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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Definitions

  • the present invention relates to a method for preventing or treating an eye disease (eg, retinal or macular disease) comprising administering an inhibitor of expression or activity of HIF-1 ⁇ .
  • an eye disease eg, retinal or macular disease
  • HIF-1 ⁇ (Hypoxia-inducible factor 1-alpha) is one subunit of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) encoded by the HIF1A gene.
  • HIF1A is considered a master transcriptional regulator of cellular and developmental responses to hypoxia (Wang GL ee al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 92 (12): 5510-4 (1995)).
  • Dysregulation and overexpression of HIF1A by hypoxia or genetic causes has been implicated not only in cancer but also in many other pathophysiologies, particularly in the areas of angiogenesis and angiogenesis, energy metabolism, cell survival and tumor invasion (Semenza GL, Nature Reviews. Cancer.3 (10): 721-32 (2003)).
  • the retina is a transparent and thin membrane located at the innermost part of the eyeball wall and in contact with the vitreous body. It converts the optical information of an object into an electrical signal and transmits the image to the central visual area of the brain through the optic nerve. act as an intelligence agency.
  • the retina consists of over 100 million light-sensing cells (light-sensitive photoreceptor cells), over 1 million ganglion cells, which are visual nerve cells, and nerve cells that connect them.
  • the macula is a nerve tissue located in the center of the retina, and most of the photoreceptors are gathered here.
  • the macula lutea is composed of a photoreceptor cell layer composed of cone cells and a ganglion cell layer, so the thickness of the retina is thin.
  • Retinal or macular diseases include choroidal neovascularization, macular degeneration, macular edema, retinopathy, retinal edema, retinal vascular occlusion, retinal detachment, glaucoma, and the like.
  • An object of the present invention is a HIF comprising administering an antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector comprising the nucleic acid molecule to a subject in need thereof in a therapeutically effective amount. It is to provide a method for preventing or treating eye diseases that are refractory or unresponsive to existing eye disease treatments by inhibiting the expression or activity of -1 ⁇ .
  • Another object of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector comprising the nucleic acid molecule to a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount, It is to provide a method for inhibiting the expression or activity of HIF-1 ⁇ .
  • Another object of the present invention is a method for preventing or treating eye diseases that are refractory or unresponsive to existing eye disease treatments, comprising administering a therapeutically effective amount of an HIF-1 ⁇ expression or activity inhibitor to a subject in need thereof. is providing
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases that is refractory or non-responsive to existing treatments for eye diseases, including an inhibitor of expression or activity of HIF-1 ⁇ as an active ingredient.
  • the present invention relates to HIF-1 ⁇ expression or activity inhibitors and uses thereof, for example, antibodies or antigen-binding fragments thereof that inhibit HIF-1 ⁇ expression or activity, nucleic acid molecules encoding the same, or containing the nucleic acid molecules It is shown that ocular diseases, particularly retinal or macular diseases that are refractory or non-responsive to existing retinal or macular disease treatments, can be controlled, cured, alleviated, or reduced or prevented from recurring by administration of a vector.
  • the terms “treat,” “treating,” and “treatment” mean reversing, ameliorating, alleviating, inhibiting, or delaying the progression, occurrence, severity, or recurrence of a symptom, complication, condition, or biochemical marker associated with a disease. refers to any kind of intervention or procedure performed on a subject for the purpose of inducing, or administration of an active agent to a subject. Treatment can be directed to a subject with the disease or to a subject without the disease (eg prophylaxis).
  • the term “administration” refers to the physical introduction of a therapeutic agent or composition comprising a therapeutic agent to a subject using any of a variety of methods and delivery systems known to those skilled in the art.
  • Different routes of administration for the antibodies disclosed herein include intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, spinal or other parenteral routes of administration, such as by injection or infusion.
  • parenteral administration refers to modes of administration other than enteral and topical administration, generally by injection, including but not limited to intravenous, intraperitoneal, intramuscular, Intraarterial, intrathecal, intralymphatic, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, transtracheal, intratracheal, pulmonary, subcutaneous, subcutaneous, intraocular, intraarticular, subcapsular , subarachnoid, intraventricular, intravitreal, epidural, and substernal injection and infusion, as well as in vivo electroporation.
  • a preferred route of administration for the compositions described herein includes intraocular administration.
  • intraocular refers to within or under eye tissue.
  • intraocular administration refers to any administration capable of delivering a composition to the sub-Tenon, subconjunctival, suprachoroidal, subretinal, intravitreal and similar locations of the eye. refers to In some aspects, intraocular administration includes suprachoroidal, subretinal, and intravitreal administration.
  • eye disease means a disease occurring in the eye, and includes eye vascular disease, retinal or macular disease, corneal disease, conjunctival disease, uveal disease, glaucoma, cataract, and the like.
  • ocular vascular disease As used herein, the terms “ocular vascular disease,” “ocular vascular disorder,” and “vascular eye disease” are used interchangeably herein and include intraocular neovascular syndromes such as diabetic retinopathy, diabetic macular edema, retina of prematurity.
  • an ocular vascular disorder refers to any pathological condition characterized by the altered or uncontrolled proliferation and invasion of new blood vessels into structures of the eye, such
  • the ocular vascular disease is selected from the group consisting of: wet age related macular degeneration (wet AMD), dry age related macular degeneration (dry AMD), diabetic macular edema (DME), capsular macular Edema (CME), non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR), proliferative diabetic retinopathy (PDR), capsular macular edema, vasculitis (eg, central retinal vein occlusion), papilledema, retinitis, conjunctivitis , uveitis, choroiditis, multifocal choroiditis, ocular histoplasmosis, blepharitis, dry eye (Sjogren's disease) and other ophthalmic diseases, wherein the ocular disease or disorder is associated with ocular neovascularization, vascular leakage, and/or retinal oedema.
  • wet AMD wet age related macular degeneration
  • dry AMD dry age related
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is suitable for use in wet AMD, dry AMD, CME, DME, NPDR, PDR, blepharitis, dry eye and uveitis, preferably wet AMD, dry AMD, blepharitis and dry eye, preferably is useful for the prevention and treatment of CME, DME, NPDR and PDR, preferably blepharitis and dry eye, particularly wet AMD and dry AMD, particularly wet AMD.
  • the eye disease is selected from the group consisting of wet age-related macular degeneration (wet AMD), macular edema, retinal vein occlusion, retinopathy of prematurity, and diabetic retinopathy.
  • the term "retinal disease” or “macular disease” refers to a disease, disorder or condition affecting or relating to a part or region of the choroid, retina or macula of the eye.
  • the retinal or macular disease treatable by the compositions and methods disclosed herein is one or more diseases selected from the group consisting of choroidal neovascularization, maculopathy, macular edema, retinopathy, retinocyte degeneration, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and glaucoma.
  • diseases selected from the group consisting of choroidal neovascularization, maculopathy, macular edema, retinopathy, retinocyte degeneration, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and glaucoma.
  • retinopathy refers to disease or damage of the retina (ie, the tissue lining the inner surface at the back of the eye that captures images passing through the cornea and lens) or retinal cells.
  • DR diabetic retinopathy
  • NPDR non-proliferative diabetic retinopathy
  • PDR proliferative diabetic retinopathy
  • All types of diabetic retinopathy including but not limited to diabetic maculopathy and diabetic macular edema.
  • DR can be asymptomatic, cause mild vision problems or lead to blindness.
  • DR is the result of microvascular retinal changes. Hyperglycemia-induced death of intramural pericytes and thickening of the basement membrane can lead to insufficiency of the vessel wall. These damages alter the formation of the blood-retinal barrier and make retinal vessels more permeable.
  • DR can be classified into two distinct stages (Wu L., el al., World J Diabetes 4(6): 290-294 (2013)).
  • the first stage called nonproliferative diabetic retinopathy (NPDR)
  • NPDR nonproliferative diabetic retinopathy
  • PDR proliferative diabetic retinopathy
  • PDR is characterized by abnormal new blood vessel formation (i.e., angiogenesis) that can cause rupture and hemorrhage, blurring vision.
  • Other symptoms of PDR include floating spots or dark lines in the field of vision (“floaters”), vision changes, color vision loss, dark or blank areas in the field of vision, pain, patchy vision, and complete loss of vision.
  • the term “maculopathy” refers to any pathological condition of the macula, a central region of the retina that is highly sensitive and is associated with accurate vision.
  • the terms “maculopathy” and “retinopathy” may be used interchangeably (ie, where only the macula is affected).
  • the maculopathy is diabetic maculopathy.
  • Diabetic maculopathy occurs when the macula becomes affected by retinal changes caused by diabetes. The term refers to two distinct eye diseases, diabetic macular edema and diabetic ischemic maculopathy.
  • macular degeneration refers to any number of disorders and conditions in which the macula or macular cells become degenerated or lose functional activity. Age-related macular degeneration is the most common of the macular degenerations, but the term “macular degeneration” does not necessarily exclude macular degeneration in non-elderly patients.
  • macular degeneration examples include: age-related macular degeneration (wet or dry); Best macular dystrophy, Sorsby fundus dystrophy, Mallatia Leventinese, Doyne honeycomb retinal dystrophy, Stargardt disease (also known as Stargardt macular dystrophy, juvenile macular degeneration or fundus flavimaculatus) and macular degeneration associated with pigment epithelial detachment includes
  • AMD age-related macular degeneration
  • AMD refers to a retinopathy that commonly affects older adults and is associated with loss of central vision due to damage to the central part of the retina (ie macula).
  • AMD is usually caused by the gradual accumulation of yellowish insoluble extracellular deposits called drusen (accumulation of extracellular proteins and lipids such as amyloid beta) within the macula (mainly between the retinal pigment epithelium (RPE) and the underlying choroid) or characterized by aggregation. Accumulation or aggregation of these deposits within the macula can progressively deteriorate the macula, resulting in damage to central vision.
  • the term "macula” refers to the central portion of the retina responsible for central high-resolution color vision.
  • age-related macular degeneration includes both dry AMD and wet AMD.
  • age-related macular degeneration also includes all types of age-related macular degeneration and any and all symptoms of age-related macular degeneration, regardless of cause.
  • Non-limiting examples of symptoms associated with macular degeneration include: loss of central vision, distortion, decreased contrast medium sensitivity, blurred vision, difficulty adjusting to low light, sudden onset and rapid worsening of symptoms and decreased color vision includes
  • macular degeneration eg, age-related macular degeneration
  • macular edema ie, macular swelling due to entrapment of fluid and protein deposits above or below the macula.
  • dry AMD also called atrophic age-related macular degeneration or non-exudative AMD
  • dry AMD refers to any form of AMD other than wet (angiogenic) AMD. This includes the early and intermediate forms of AMD as well as the advanced form of dry AMD known as geographic atrophy. Dry AMD patients tend to have minimal symptoms at an earlier inception; Loss of visual function occurs more often when symptoms progress to map shape atrophy.
  • wet AMD also called angiogenic age-related macular degeneration or exudative AMD
  • retinal neovascularization the most advanced form of AMD.
  • blood vessels grow from the choroidal capillaries and, in some cases, from the underlying retinal pigment epithelium (choroidal neovascularization or neovascularization) through defects in Bruch's membrane.
  • angiogenesis refers to the growth of new abnormal blood vessels in different parts of the eye that can cause bleeding and loss of vision.
  • choroidal neovascularization refers to the abnormal growth of new blood vessels in the choroid (ie, the vascular layer of the eye that contains connective tissue and lies between the retina and the sclera).
  • new blood vessels can grow through the retinal pigment epithelium (RPE) and choroid into the retina, resulting in blood and lipid leakage, impairing visual function.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • retina neovascularization refers to the abnormal development, proliferation and/or growth of blood vessels on or within the retina, eg, on the retinal surface.
  • Retinal neovascularization is associated with retinopathy associated with retinal ischemia (e.g., diabetic retinopathy, sickle cell retinopathy, Eales disease, ocular ischemic syndrome, carotid cavernous fistula, familial exudative vitreoretinopathy).
  • retinal ischemia e.g., diabetic retinopathy, sickle cell retinopathy, Eales disease, ocular ischemic syndrome, carotid cavernous fistula, familial exudative vitreoretinopathy.
  • hyperviscosity syndrome radiation retinopathy, retinal vein occlusion, retinal artery occlusion, retinal embolism, birdshot retinochoroidopathy, choroidal melanoma, chronic retinal detachment, anterior ischemic optic neuropathy (AION), non-arterial anterior It can occur in many retinopathy such as ischemic optic neuropathy (NAION) and incontinentia pigmenti.
  • AION anterior ischemic optic neuropathy
  • NAION non-arterial anterior It can occur in many retinopathy such as ischemic optic neuropathy (NAION) and incontinentia pigmenti.
  • glaucoma refers to a disease in which visual field defects appear due to damage to the optic nerve or optic nerve cells. Glaucoma is one of the leading causes of blindness. Non-limiting examples of glaucoma include: primary congenital glaucoma, open-angle glaucoma, angle-closure glaucoma.
  • retinitis pigmentosa refers to a hereditary retinal disease in which optic cells and retinal pigment epithelial cells are damaged (degenerated). As visual cells are damaged, night blindness appears in the early stages, and the field of vision gradually narrows, eventually leading to blindness.
  • refractory or “non-response” refers to a disease that does not respond to existing treatment for an eye disease or does not show a sufficient effect by existing treatment.
  • the term “existing eye disease treatment agent” refers to an eye disease treatment method developed or marketed prior to the filing date of the present invention or a treatment method applied to an eye disease treatment method whose mechanism of action is already known.
  • the term "existing retinal or macular disease treatment” refers to the expression or activity of one or more target proteins selected from the group consisting of VEGFA, VEGFB, PIGF, CCR3, VEGFR, PDGFR, CSF1R, FGF-2, PGF and Ang2 may be a substance that inhibits Such substances include compounds capable of inhibiting the expression or activity of these target proteins, nucleic acids, peptides, viruses, vectors containing the nucleic acids, siRNA specific to these proteins, antisense oligonucleotides, aptamers, antibodies or antigen binding thereof Including but not limited to fragments.
  • VEGF inhibitors Preferred examples of existing retinal or macular disease therapeutics may be VEGF inhibitors.
  • VEGF inhibitor comprehensively refers to a substance that inhibits only VEGF or inhibits other proteins (eg, ANG-2) and VEGF at the same time. (biopolymer) is also included.
  • VEGF inhibitors include aflibercept (marketed under trade names such as Eylea®), ranibizumab (Lucentis®), Susvimo® - Port Delivery System, and the like.
  • bevacizumab marketed under trade names such as Avastin®
  • brolucizumab marketed under trade names such as Beovu®
  • pegaptanib marketed under trade names such as Macugen®
  • faricimab marketed under trade names such as Vabysmo®
  • KSI-301 combinations thereof, and the like, but are not limited thereto.
  • the phrase “inhibit the expression or activity of HIF-1 ⁇ ” refers to any measurable decrease in expression of the HIF1A gene or protein or HIF-1 ⁇ protein activity, e.g., by at least about 10%, at least about 20% , at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, at least about 99%, or up to 100% of HIF-1 ⁇ inhibition of expression or activity.
  • an effective amount is defined as an amount sufficient to achieve or at least partially achieve the desired effect.
  • a “therapeutically effective amount” or “therapeutically effective dosage” of a drug or therapeutic agent, when used alone or in combination with other therapeutic agents, is a disease regression evidenced by a reduction in the severity of disease symptoms, a period of disease symptom-free time The amount of a drug that promotes an increase in the frequency and duration of treatment, or prevention of disability or injury due to a disease.
  • a therapeutically effective amount or dosage of a drug includes a "prophylactically effective amount” or “prophylactically effective dosage", which alone or in combination with other therapeutic agents is intended for subjects at risk of developing or suffering from a recurrence of a disease. The amount of drug that, when administered to a patient, inhibits the occurrence or recurrence of a disease.
  • a therapeutically effective amount or effective dosage of a drug may increase HIF-1 ⁇ by at least about 20%, at least about 40%, at least about 60%, or at least about 80% relative to untreated subjects. Inhibits the expression or activity of
  • antibody is a term of art and may be used interchangeably herein, and refers to a molecule having an antigen binding site that specifically binds to an antigen. As used herein, the term includes whole antibodies and any antigen-binding fragments (ie “antigen-binding portion") or single chains thereof. In one embodiment, “antibody” refers to a glycoprotein comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-linked by disulfide bonds, or an antigen-binding portion thereof. In another embodiment, “antibody” refers to a single chain antibody comprising a single variable domain, eg a VHH domain.
  • Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated as VH) and a heavy chain constant region.
  • the heavy chain constant region consists of three domains CH1, CH2 and CH3.
  • each light chain consists of a light chain variable region (abbreviated as VL) and a light chain constant region.
  • the light chain constant region consists of one domain, CL.
  • VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDRs), interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, which are arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the order FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain binding domains that interact with antigen.
  • the constant regions of antibodies can mediate the binding of immunoglobulins to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system.
  • the antibody may be any type (eg IgG, IgE, IgM, IgD, IgA or IgY), any type (eg IgD, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 or IgA2), or any subtype of an immunoglobulin molecule. (eg IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 in humans; and IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 in mice). Immunoglobulins, such as IgG1, exist in several allotypes, which differ from each other by up to a few amino acids. Antibodies disclosed herein may be derived from any of the commonly known isotypes, types, subtypes, or allotypes.
  • an antibody disclosed herein is an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 subtype or any hybrid thereof. In certain embodiments, the antibody is of the human IgG1 subclass or of the human IgG2 or human IgG4 subclass.
  • Antibody includes, by way of example, naturally-occurring and non-naturally-occurring antibodies; monoclonal and polyclonal antibodies; chimeric and humanized antibodies; human and non-human antibodies, fully synthetic antibodies; single chain antibodies; monospecific antibodies; multispecific antibodies (including bispecific antibodies); tetrameric antibodies comprising two heavy and two light chain molecules; antibody light chain monomers; antibody heavy chain monomers; antibody light chain dimers; antibody heavy chain dimers; antibody light chain-antibody heavy chain pairs; intrabody; heteroconjugate antibodies; monovalent antibodies; camelization antibodies; Affibody; Anti-idiotypic (anti-Id) antibodies (including, for example, anti-anti-Id antibodies), and binding consisting of a single monomeric variable antibody domain (eg, a VH domain or a VL domain) sufficiently capable of antigen binding.
  • single-domain antibodies (sdAbs) comprising molecules (Harmen M. M. and Haard H. J. Appl Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22
  • antigen-binding portion of an antibody ie, "antigen-binding fragment” refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen.
  • fragments are, for example, about 8 to about 1500 amino acids in length, suitably about 8 to about 745 amino acids in length, more suitably about 8 to about 300, for example about 8 to about 200 amino acids in length. amino acids, or from about 10 to about 50 or 100 amino acids in length. It has been discovered that the antigen-binding function of antibodies can be performed by fragments of full-length antibodies.
  • binding fragments encompassed by the term antigen-binding fragment include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL, and CH1 domains; (ii) F(ab')2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) Fv fragments consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, and disulfide-linked Fvs (sdFv); (v) dAb fragments consisting of the VH domain (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) or (vii) a combination of two or more isolated CDRs optionally spliced by a synthetic linker.
  • CDR complementarity determining region
  • the two domains of the Fv fragment, VL and VH are encoded by separate genes, they can be joined by a synthetic linker and using recombinant methods, whereby the VL and VH regions are paired to form a monovalent molecule.
  • It can be a single protein chain (referred to as a single-chain Fv (scFv)) (eg Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883).
  • scFv single-chain Fv
  • Such single chain antibodies are also included within the terms "antigen-binding portion" or "antigen-binding fragment" of an antibody.
  • antibody fragments are obtained using conventional techniques known to those skilled in the art, and fragments are prepared in the same manner as intact antibodies.
  • the antigen-binding portion may be generated by recombinant DNA techniques or by enzymatic or chemical cleavage of intact immunoglobulins.
  • variable region typically refers to a portion of an antibody, usually a portion of a light or heavy chain, typically about the amino terminal 110 to 120 amino acids in a mature heavy chain and about 90 to 115 amino acids in a mature light chain, which are widely sequenced with antibodies. They are different and are used because of the binding and specificity of a particular antibody to its particular antigen. Sequence variability is concentrated in regions called complementarity determining regions (CDRs), and regions that are more highly conserved in variable domains are called framework regions (FRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FRs framework regions
  • variable region is a human variable region.
  • variable regions include rodent or murine CDRs and human framework regions (FRs).
  • FRs human framework regions
  • variable region is a primate (eg, non-human primate) variable region.
  • the variable regions include rodent or murine CDRs and primate (eg, non-human primate) framework regions (FRs).
  • the term “heavy chain,” when used in reference to an antibody, is any of a different type, e.g., alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), epsilon ( ⁇ ), Gamma ( ⁇ ) and mu ( ⁇ ) can be referred to, which give rise to the IgA, IgD, IgE, IgG and IgM types of antibodies, including subtypes of IgG, e.g., IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, respectively.
  • the term "light chain” when used in reference to an antibody may refer to any of the different types, eg, kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ), based on the amino acid sequence of the constant domain. Light chain amino acid sequences are well known in the art. In certain embodiments, the light chain is a human light chain.
  • VL and “VL domain” are used interchangeably and refer to the light chain variable region of an antibody.
  • VH and “VH domain” are used interchangeably and refer to the heavy chain variable region of an antibody.
  • constant region or “constant domain” as used herein are interchangeable and have their ordinary meaning in the art.
  • the constant domain is the portion of an antibody, eg the carboxy-terminal portion of the light and/or heavy chain that is not directly involved in the binding of the antibody to antigen but may exhibit various effector functions, such as interaction with Fc receptors.
  • the constant regions of immunoglobulin molecules generally have a more conserved amino acid sequence than immunoglobulin variable domains.
  • Fc region fragment crystallizable region
  • Fc domain fragment crystallizable region
  • Fc domain fragment crystallizable region
  • Fc is an Fc receptor located on various cells of the immune system (eg effector cells) or the first component (C1q) of the orthodox complement system and refers to the C-terminal region of the heavy chain of an antibody that mediates the binding of immunoglobulins to host tissues or factors, including binding of.
  • an Fc region includes the constant region of an antibody excluding the first constant region immunoglobulin domain (eg CH1 or CL).
  • the Fc region comprises two identical protein fragments derived from the second (CH2) and third (CH3) constant domains of the antibody's two heavy chains; IgM and IgE Fc regions contain three heavy-chain constant domains (CH domains 2-4) on each polypeptide chain.
  • the Fc region includes the immunoglobulin domains C ⁇ 2 and C ⁇ 3 and the hinge between C ⁇ 1 and C ⁇ 2.
  • human IgG heavy chain Fc regions are generally defined by an amino acid residue at position C226 or P230 (or an amino acid between these two amino acids) extending to the carboxy-terminus of the heavy chain, where Numbering follows the same EU index as in Kabat.
  • the CH2 domain of the human IgG Fc region extends from about amino acid 231 to about amino acid 340, and the CH3 domain is located on the C-terminal side of the Cm domain in the Fc region, i.e. it extends from about amino acid 341 to about amino acid 447 of the IgG. .
  • An Fc region may be a native sequence Fc, including any allotypic variant, or a variant Fc (eg a non-naturally occurring Fc).
  • Fc also refers to a region in an isolated state or an Fc-containing protein polypeptide, such as a "binding protein comprising an Fc region", also referred to as an "Fc fusion protein” (eg an antibody or immunoadhesion).
  • Fc fusion protein eg an antibody or immunoadhesion
  • Hinge refers to the domain of the heavy chain constant region that connects the CH1 domain to the CH2 domain and includes the upper, middle, and lower portions of the hinge (Roux et al. al. J. Immunol. 1998 161:4083).
  • the hinge changes the level of flexibility between the binding and effector regions of an antibody, and also provides a site for intermolecular disulfide linkages between the two heavy chain constant regions. Sequences of wild-type IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 hinges are known in the art (e.g.
  • isotype refers to the type of antibody encoded by the heavy chain constant region genes (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD, and IgE antibodies).
  • heavy chain constant region genes eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD, and IgE antibodies.
  • allotype refers to a naturally-occurring variant within a particular isotype group that differs by a few amino acids (see eg Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Antibodies presented herein may be of any allotype. Allotypes of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 are known in the art (eg, Kabat EA et al., (1991) (ibid.); Vidarsson G. et al., Front Immunol . 5:520 ( Published online October 20, 2014; and Lefranc MP, mAbs 1:4, 1-7 (2009)).
  • isolated antibody refers to an antibody that is substantially free of other antibodies with different antigenic specificities.
  • the term “monoclonal antibody” refers to an antibody that exhibits a single binding specificity and affinity for a particular epitope or a composition of antibodies in which all antibodies exhibit a single binding specificity and affinity for a particular epitope.
  • the term “human monoclonal antibody” refers to an antibody or antibody composition that exhibits a single binding specificity and has variable and optional constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences.
  • the human monoclonal antibody comprises a B cell obtained from a transgenic non-human animal, e.g., a transgenic mouse having a genome comprising a human heavy chain transgene and a light chain transgene fused to an immortalized cell. produced by hybridomas that
  • the term "recombinant human antibody” refers to (a) an antibody isolated from an animal (e.g., a mouse) that is transgenic or transchromosomal for a human immunoglobulin gene, or a hybridoma prepared therefrom; (b) antibodies isolated from host cells transformed to express the antibodies, e.g., from transfectomas, (c) antibodies isolated from recombinant, combinatorial human antibody libraries, and (d) other DNA sequences. It includes any human antibody produced, expressed, produced or isolated by recombinant means, such as an antibody prepared, expressed, produced or isolated by any other means involving splicing of human immunoglobulin gene sequences for .
  • variable regions are encoded by germline genes, but utilize specific human germline immunoglobulin sequences, including subsequent rearrangements and mutations that occur, for example, during antibody maturation.
  • variable regions are encoded by various genes that rearrange to form antibodies specific for foreign antigens, Contains an antigen binding domain.
  • the variable regions can be further modified by a number of single amino acid changes (somatic mutations or hypermutations) to increase the affinity of the antibody for the foreign antigen.
  • the constant region will change upon further response to antigen (ie isotype switch).
  • nucleic acid molecules encoding light and heavy chain immunoglobulin polypeptides in response to antigen may not have sequence identity to the original nucleic acid molecule, but will instead be substantially identical or similar (i.e., at least 80% identity). have).
  • human antibody refers to an antibody having variable regions in which both the framework and CDR regions are derived from human germline immunoglobulin sequences. In addition, if the antibody contains a constant region, the constant region is also derived from human germline immunoglobulin sequences. Antibodies provided herein may contain amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-directed mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo). . However, the term “human antibody” does not include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, have been grafted onto human framework sequences. The terms "human” antibody and "fully human” antibody are used synonymously.
  • humanized antibody refers to an antibody in which some, most or all of the amino acids outside the CDR domains of a non-human antibody are substituted with corresponding amino acids derived from human immunoglobulin. In one embodiment of the humanized form of the antibody, some, most or all of the amino acids outside the CDR domains are substituted with amino acids from a human immunoglobulin, and some, most or all of the amino acids within one or more CDR regions are left untouched. Additions, deletions, insertions, substitutions or modifications of amino acids are permitted as long as they do not abrogate the ability of the antibody to bind a particular antigen. A "humanized" antibody retains an antigenic specificity similar to that of the original antibody.
  • chimeric antibody refers to an antibody in which the variable regions are derived from one species and the constant regions are derived from another species, such as an antibody in which the variable regions are derived from a mouse antibody and the constant regions are derived from a human antibody. .
  • the present invention provides the step of administering a therapeutically effective amount of the antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector comprising the nucleic acid molecule to a subject in need thereof Including, it provides a method for inhibiting the expression or activity of HIF-1 ⁇ .
  • the present invention provides the step of administering a therapeutically effective amount of the antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector comprising the nucleic acid molecule to a subject in need thereof
  • Prophylaxis of eye diseases eg, retinal or macular diseases
  • ocular disease eg, retinal or macular disease
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises the following CDR sequences:
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a light chain variable region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a heavy chain variable region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof may include the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11 encode light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 1, light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 2, and light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 3, respectively.
  • Each of the base sequences of SEQ ID NOs: 9 to 11 may be codon-optimized for CHO cells, and nucleic acids comprising the codon-optimized base sequences are included within the range of nucleic acids encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.
  • a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.
  • the nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof may include the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14 encode the heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 4, the heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 5, and the heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 6, respectively.
  • Each of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 12 to 14 may be codon-optimized for CHO cells, and nucleic acids comprising such codon-optimized nucleotide sequences are included within the range of nucleic acids encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.
  • a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22.
  • the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include a light chain variable region-encoding nucleic acid comprising SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 23.
  • the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include a heavy chain variable region-encoding nucleic acid comprising SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 24.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include a light chain comprising SEQ ID NO: 25.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include a heavy chain comprising SEQ ID NO: 26.
  • the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may include a light chain encoding nucleic acid comprising SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29.
  • the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include a heavy chain encoding nucleic acid comprising SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 30.
  • the antibody is the 2G4 antibody described in WO 2020/076105.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof (or a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or an antibody or antigen-binding fragment thereof formed by expressing a vector containing the nucleic acid molecule) is capable of expressing or activating the HIF-1 ⁇ Inhibiting, preferably in vivo (in vivo), more preferably in the eye, even more preferably in the choroid or retina, but is not limited thereto.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof inhibits the expression or activity of HIF-1 ⁇ in cells in the eyeball, preferably Is composed of cells selected from the group consisting of optic nerve cells, retinal Mueller cells, choroid cells, retinal microvascular endothelial cells (RMEC), retinal pigment epithelial (RPE) cells, and photoreceptor cells, but is not limited thereto .
  • Examples of diseases caused by dysfunction or damage of the choroid cells, retinal microvascular endothelial cells (RMEC), retinal pigment epithelial (RPE) cells, and photoreceptor cells include choroidal neovascularization, maculopathy, retinopathy, and retinal cells.
  • RMEC retinal microvascular endothelial cells
  • RPE retinal pigment epithelial
  • PDR retinal vascular occlusion
  • diseases caused by malfunction or damage of the optic nerve cells and retinal Mueller cells include glaucoma.
  • the suppression of the expression of HIF-1 ⁇ means suppression or inhibition of the entire process including the expression of the HIF-1 ⁇ gene and the regulation of protein synthesis and protein degradation, or a partial process thereof, preferably suppressing mRNA or protein expression, more preferably may be activity inhibition according to protein degradation promotion.
  • Inhibiting the activity of HIF-1 ⁇ can be achieved by inhibiting the function of the HIF-1 ⁇ protein itself, promoting degradation of the HIF-1 ⁇ protein, or inhibiting the activity of HIF-1 ⁇ by SCF-induced phosphorylation.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof (or the antibody or antigen-binding fragment thereof formed by expression of the nucleic acid molecule or a vector containing the nucleic acid molecule) by at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or up to 100% HIF- Inhibits the expression of 1 ⁇ .
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof (or including an antibody or antigen-binding fragment thereof formed by expressing the nucleic acid molecule or a vector containing the nucleic acid molecule) additionally modulates an angiogenic factor and/or an inflammatory factor. .
  • the angiogenic factor and/or inflammatory factor is angiogenin, angiopoietin-2, CXCL16, endoglin, coagulation factor III, endothelin-1 -1), MCP-1, EG-VEGF, VEGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IL-1 ⁇ , PDGF-AA, PIGF, Serpin E, Serpin F1, thrombos It may be one or more factors selected from the group consisting of thrombospondin-2, ANGPT2, pentraxin 3, IL-8, FGF2 and FGF5.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof increases the expression of the angiogenic factor and / or inflammatory factor Reduce up-regulation or down-regulation.
  • the decrease in the upregulation of the expression of the angiogenic factor and / or the inflammatory factor is compared to the subject who did not receive the administration, the antibody or antigen-binding fragment thereof (or the antibody formed by expressing the nucleic acid molecule or a vector containing the nucleic acid molecule) at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or reduce upregulation by 100%.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof (or the antibody or antigen-binding fragment thereof formed by expression of the nucleic acid molecule or a vector containing the nucleic acid molecule) is used to inhibit the proliferation, migration and vascularization of microvascular cells. Reduced selection from the group consisting of tube formation.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an eye disease comprising administering a therapeutically effective amount of an HIF-1 ⁇ expression or activity inhibitor to a subject in need thereof.
  • the present invention provides the step of administering a therapeutically effective amount of the antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector comprising the nucleic acid molecule to a subject in need thereof
  • Prophylaxis of eye diseases eg, retinal or macular diseases
  • ocular disease eg, retinal or macular disease
  • the expression or activity inhibitor of HIF-1 ⁇ is an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following CDR sequence, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector comprising the nucleic acid molecule contains:
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a light chain variable region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a heavy chain variable region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof is the above item ⁇ II.
  • Methods for inhibiting expression or activity of HIF-1 ⁇ > are incorporated into this section as they are.
  • the antibody is the 2G4 antibody described in WO 2020/076105.
  • the eye disease is one or more diseases selected from the group consisting of ocular vascular disease, retinal or macular disease, corneal disease, conjunctival disease, uveal disease, glaucoma, and cataract.
  • the retinal or macular disease is one or more diseases selected from the group consisting of choroidal neovascularization, maculopathy, retinopathy, retinal cell degeneration, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and glaucoma.
  • the retinal or macular disease is Diabetic Retinopathy (DR), Diabetic Macular Edema (DME), wet Age-related Macular Degeneration (wet AMD), retinal It is at least one disease selected from the group consisting of Retinal Vein Occlusion (RVO), Retinopathy of Prematurity, and Glaucoma.
  • DR Diabetic Retinopathy
  • DME Diabetic Macular Edema
  • wet AMD wet Age-related Macular Degeneration
  • retinal It is at least one disease selected from the group consisting of Retinal Vein Occlusion (RVO), Retinopathy of Prematurity, and Glaucoma.
  • the methods disclosed herein increase the likelihood of treatment or decrease the duration of treatment in a subject (eg, DR, DME, AMD, etc.).
  • the duration of treatment of a subject is at least about 1 month, at least about 2 months, at least about 3 months, at least about 1 month compared to a reference subject (eg, another subject not treated with an antibody or composition disclosed herein). 4 months, at least about 5 months, at least about 6 months, at least about 7 months, at least about 8 months, at least about 9 months, at least about 10 months, at least about 11 months, or at least about 1 year or longer Decrease.
  • a method disclosed herein causes the duration of a weakened state in a subject to be greater than the duration of a reference subject (eg, another subject not treated with an antibody or composition disclosed herein). (about 1 month longer, about 2 months longer, about 3 months longer, about 4 months longer, about 5 months longer, about 6 months longer, about 7 months longer, about 8 months longer , about 9 months longer, about 10 months longer, about 11 months longer, or about 1 year longer).
  • the methods of the invention increase the duration of progression-free or attenuated disease in a subject.
  • a subject's disease progression-free duration is at least about 1 month, at least about 2 months, at least about 3 months as compared to a reference subject (eg, another subject not treated with an antibody or composition disclosed herein).
  • a reference subject eg, another subject not treated with an antibody or composition disclosed herein.
  • at least about 4 months at least about 5 months, at least about 6 months, at least about 7 months, at least about 8 months, at least about 9 months, at least about 10 months, at least about 11 months, or at least about 1 year.
  • the methods disclosed herein effectively increase response rates in a group of subjects.
  • the response rate in a group of subjects is at least about 2%, at least about 3%, at least about 4% as compared to a reference subject (eg, another subject not treated with an antibody or composition disclosed herein).
  • a reference subject eg, another subject not treated with an antibody or composition disclosed herein.
  • at least about 5%, at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 35%, at least about 40%, at least about 45%, at least about 50% , at least about 55%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 99% or at least about 100% is increased up to
  • the term "reference” as used herein refers to a subject (eg, diabetic) who has not been administered a composition disclosed herein (eg, an inhibitor of the expression or activity of HIF-1 ⁇ , such as an antibody). retinopathy or age-related macular degeneration).
  • the term “baseline” may also refer to the same subject (eg, a subject with diabetic retinopathy or age-related macular degeneration) prior to administration of a composition disclosed herein.
  • the term “baseline” refers to the average of a population of subjects (eg, subjects with diabetic retinopathy or age-related macular degeneration).
  • retinopathy treatable with the present disclosure includes diabetic retinopathy.
  • the diabetic retinopathy is non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR).
  • the diabetic retinopathy is proliferative diabetic retinopathy (PDR).
  • the diabetic retinopathy is diabetic maculopathy.
  • the diabetic retinopathy is diabetic macular edema.
  • diabetic retinopathy is any retinopathy associated with ischemic damage in the retina.
  • macular degeneration treatable with the present disclosure includes age-related macular degeneration (AMD).
  • AMD age-related macular degeneration
  • the age-related macular degeneration is early AMD.
  • the age-related macular degeneration is intermediate AMD.
  • the age-related macular degeneration is late or progressive AMD (ie, geographic atrophy).
  • the age-related macular degeneration is dry (non-exudative) AMD.
  • the age-related macular degeneration is wet (angiogenic or exudative) AMD.
  • the subject to be treated in the method is a non-human animal, such as a rat or mouse. In some embodiments, the subject to be treated in the methods is a human.
  • the "existing retinal or macular disease treatment" in the present method may be a VEGF inhibitor, specifically, aflibercept, ranibizumab, Susvimo®, bevacizumab It may be selected from the group consisting of (bevacizumab), brolucizumab, pegaptanib, faricimab, and KSI-301.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating eye diseases (eg, retinal or macular diseases) comprising an inhibitor of expression or activity of HIF-1 ⁇ as an active ingredient.
  • eye diseases eg, retinal or macular diseases
  • the expression or activity inhibitor of HIF-1 ⁇ is an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following CDR sequence, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector comprising the nucleic acid molecule contains:
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following CDR sequences, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector containing the nucleic acid molecule as an active ingredient
  • Prophylaxis of eye diseases eg, retinal or macular diseases
  • ocular disease eg, retinal or macular disease
  • it provides a pharmaceutical composition for treatment.
  • the present invention provides an eye disease that is refractory or non-responsive to existing eye disease (e.g., retinal or macular disease) treatment by inhibiting the expression or activity of HIF-1 ⁇ (e.g., for example, an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following CDR sequences, a nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, or a vector containing the nucleic acid molecule for use in the prevention or treatment of retinal or macular disease) provides uses for:
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes a light chain variable region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a heavy chain variable region of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the nucleic acid molecule encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof is the above item ⁇ II.
  • Methods for inhibiting expression or activity of HIF-1 ⁇ > are incorporated into this section as they are.
  • the antibody is the 2G4 antibody described in WO 2020/076105.
  • the ocular disease is one or more diseases selected from the group consisting of ocular vascular disease, retinal or macular disease, corneal disease, conjunctival disease, uveal disease, glaucoma, and cataract.
  • the retinal or macular disease is one or more diseases selected from the group consisting of choroidal neovascularization, maculopathy, retinopathy, retinal cell degeneration, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and glaucoma.
  • the retinal or macular disease is Diabetic Retinopathy, Diabetic Macular Edema, wet Age-related Macular Degeneration, Retinal Vein Occlusion , Retinopathy of Prematurity, and at least one disease selected from the group consisting of glaucoma.
  • compositions comprising an antibody disclosed herein having a desired degree of purity in a physiologically acceptable carrier, excipient, or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA).
  • a pharmaceutical composition comprises an antibody or antigen-binding portion thereof, bispecific molecule or immune complex described herein in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition comprises an effective amount of an antibody described herein, or antigen-binding portion thereof, and optionally one or more additional prophylactic or therapeutic agents in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the antibody is the only active ingredient included in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical compositions described herein may be useful for inhibiting the expression or activity of HIF-1 ⁇ and for treating eye diseases, disorders or conditions such as AMD, glaucoma.
  • a pharmaceutical composition of the present disclosure may be formulated for any route of administration to a subject.
  • a pharmaceutical composition disclosed herein may be administered via any route capable of delivering the composition to the subtenon's, subconjunctival, suprachoroidal, subretinal, intravitreal and similar locations of the eye.
  • a pharmaceutical composition disclosed herein is delivered to a subject via ocular administration.
  • ocular administration includes intravitreal administration. Parenteral administration featuring subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal or intravenous injection is also contemplated herein.
  • the antibodies described herein, or antigen-binding portions thereof may be applied in the form of gels, creams and lotions for topical or topical use, such as topical application to the skin and mucous membranes, such as in the eye, and also applied to the eye or intracisternal or spinal cord. It can be formulated for my application. Topical administration is contemplated for transdermal delivery and also for ocular or mucosal administration or for inhalation therapy. A nasal solution of the antibody may be administered alone or in combination with other pharmaceutically acceptable excipients.
  • compositions comprising an antibody or antigen-binding portion thereof described herein are lyophilized powders that can be reconstituted for administration as solutions, emulsions, and other mixtures.
  • the lyophilized powder can also be reconstituted and formulated as a solid or gel.
  • the lyophilized powder is reconstituted with water for injection to provide a formulation for parenteral administration.
  • the lyophilized powder is added to sterile water or another suitable carrier. The exact amount depends on the compound selected. This amount can be determined empirically.
  • the present invention provides an inhibitor of HIF-1 ⁇ expression or activity.
  • the expression or activity inhibitor of HIF-1 ⁇ of the present invention effectively inhibits the expression of HIF-1 ⁇ in the eye and down-regulates the expression of angiogenic factor and/or inflammatory factor, thereby preventing or treating eye diseases, particularly It can be usefully used for the prevention or treatment of retinal or macular diseases that are refractory or non-responsive to existing retinal or macular disease treatments.
  • Figure 2 is a result confirming that NN2101 effectively suppresses the expression of HIF-1 ⁇ in hypoxic conditions.
  • 2A Protein levels in whole cell lysates.
  • 2b and 2c sSCF and sVEGFA secreted into the culture supernatant.
  • Figure 3 is a result confirming that NN2101 regulates HIF-1 ⁇ expression by SCF-induced phosphorylation.
  • 3A Protein levels in whole cell lysates.
  • Figure 3b sSCF (top) and sVEGFA (bottom) secreted into the culture supernatant.
  • Figure 4 is a result confirming that NN2101 treatment significantly reduced the protein expression of HIF-1 ⁇ , VEGFA, mSCF, and phospho-cKIT under hypoxic conditions.
  • 5 shows the results confirming that the mRNA levels of HIF-1 ⁇ target genes were regulated in hypoxic conditions by NN2101 treatment in HRMEC.
  • 5A CoCl 2 treatment induces hypoxia.
  • Figure 5b Verification using a hypoxic chamber.
  • Figure 6 shows the results confirming that the mRNA and protein levels of HIF-1 ⁇ target genes were regulated in hypoxic conditions by NN2101 treatment in RPE cells.
  • Figure 6a Protein levels.
  • Figure 6b mRNA levels.
  • Figure 7 is a result of analyzing the protein level expression of cell lysates by Western blotting when HRMEC, ARPE19, MIO-M1 and Y79 cells were pretreated with NN2101 and further treated under low oxygen conditions (1% O 2 ).
  • FIGS. 8 and 9 are results showing that NN2101 promotes the degradation of HIF-1 ⁇ through the Uniquitin-Proteasome Degradation Pathway.
  • Figure 8a MG132 treatment results.
  • Figure 8b CHx treatment results.
  • Figure 9 HIF-1 ⁇ -PHD assay results.
  • FIGS. 10 to 13 show the results confirming that NN2101 regulates angiogenic/inflammatory factors in HRMEC, ARPE19, MIO-M1 and Y79 cells.
  • Figure 10 HRMEC cells.
  • Figure 11 ARPE19 cells.
  • Figure 12 MIO-M1 cells.
  • Figure 13 Y79 cells.
  • Antibodies exhibiting activity as inhibitors (expression or activity inhibitors) for HIF-1 ⁇ were selected using an antibody pool owned by Novelty Nobility Co., Ltd.
  • Example 2 downregulates the expression of HIF-1 ⁇ in a murine CNV model.
  • Laser-induced CNV mice were constructed as follows. For one eye of 10-week-old C57BL/6 mice (Orient Co., Ltd., Korea), choroidal neovascularization was induced by damaging Bruch's membrane of the mouse using a laser.
  • the lasers used are as follows: Laser photocoagulation: wavelength: 532 nm; fixed diameter: 50 ⁇ m; intensity: 300 mW; duration: 0.70.
  • Intravitreal injection of NN2101 suppressed choroidal expression of HIF-1 ⁇ in CNV mice, and accordingly, VEGF-A expression was also reduced, and pho-cKIT expression was also reduced (FIG. 1).
  • Example 3 Unlike Aflibercept, NN2101 completely inhibits HIF-1 ⁇ in hypoxic HRMEC (human retinal microvascular endothelial cells).
  • HIF-1 ⁇ Under hypoxic conditions, HIF-1 ⁇ is expressed, and HIF-1 ⁇ in turn stimulates the expression of angiogenic factors including SCF and VEGF, thereby activating SCF/cKIT and VEGF signaling mechanisms, respectively.
  • NN2101 suppresses the expression of HIF-1 ⁇ under CoCl 2 -induced hypoxic conditions.
  • HRMEC Cell Systems, Kirkland, WA, USA
  • EBM Long-Walkersville, MD, USA
  • HRMEC were pretreated with NN2101 10 ⁇ g/ml or Eylea (Bayer korea Ltd., Seoul, Korea) 10 ⁇ g/ml for 6 hours and then additionally treated with 100 ⁇ M CoCl 2 for 2 hours to induce hypoxia.
  • Expression of protein levels in whole cell lysates was analyzed by Western blotting (FIG. 2A).
  • sSCF Figs. 2b and 2c, left
  • sVEGF Figs. 2b and 2c, right
  • Example 4 NN2101 regulates the expression of HIF-1 ⁇ and the phosphorylation of GSK-3 ⁇ in the presence of SCF under hypoxic conditions.
  • Example 3 we tried to examine whether NN2101 inhibits the expression of HIF-1 ⁇ in hypoxic conditions.
  • activation of GSK-3 ⁇ contributes to angiogenesis, and since GSK-3 ⁇ phosphorylation is regulated by SCF/c-KIT signaling, we tried to confirm the activation of the SCF/c-KIT signaling pathway by checking the degree of GSK-3 ⁇ phosphorylation. .
  • HRMECs were cultured overnight with EBM containing 0.5% FBS and treated as follows. HRMECs were pretreated with NN2101 (1 or 10 ⁇ g/ml) or Eylea (1 or 10 ⁇ g/ml) for 6 h and then further treated with 100 ⁇ M CoCl 2 or/and 100 ng/ml SCF. Expression of protein levels in whole cell lysates for 2 hours was analyzed by Western blotting (FIG. 3A). sSCF (Fig. 3b, top) and VEGF (Fig. 3b, bottom) secreted into the culture supernatant were quantified by ELISA.
  • NN2101 decreased the expression of HIF-1 ⁇ in a concentration-dependent manner in the presence of hypoxia and SCF, and accordingly, the expression of SCF and VEGFA was also significantly reduced, and the activation of cKIT due to phosphorylation was blocked (phospho-cKIT expression decrease), and phosphorylation of GSK-3 ⁇ , a sub-signal thereof, was also inhibited.
  • Example 5 NN2101 rapidly inhibits the protein expression of HIF-1 ⁇ .
  • HRMECs were cultured overnight with EBM containing 0.5% FBS and treated as follows. Each plate was pretreated with 10 ⁇ g/ml of NN2101 for 6 hours and then exposed to 1% O 2 for 0.5, 6, 12, or 18 h, respectively, to induce hypoxia. Protein level expression of whole cell lysates was analyzed by Western blotting (FIG. 4).
  • Example 6 NN2101 down-regulates mRNA expression of HIF-1 ⁇ target genes in HRMEC.
  • HRMECs were cultured overnight with EBM containing 0.5% FBS and treated as follows. HRMECs were pretreated with NN2101 or Eylea (1, 10 or 20 ⁇ g/ml, respectively) for 6 hours and then further treated with 100 ⁇ M CoCl 2 for 2 hours to induce hypoxia (Fig. 5a).
  • HRMECs were pretreated with 10 ⁇ g/ml NN2101 for 6 h followed by additional exposure with 1% O 2 for 6 h or 12 h (Fig. 5b). mRNA expression levels were analyzed by real-time PCR.
  • Example 7 NN2101 significantly inhibits the expression of HIF-1 ⁇ target genes in retinal pigment epithelial (RPE) cells.
  • ARPE-19 American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA
  • DMEM-F12 fetal bovine serum
  • Fig. 6a NN2101 10 ⁇ g/ml or Eylea 10 ⁇ g/ml for 6 h and then further treated with 50 and 100 ⁇ M CoCl 2 (Fig. 6a) to induce hypoxia, or each plate was treated for 0.5 h, 6 h, Alternatively, hypoxia was induced by exposure to 1% O 2 for 12 h (FIG. 6b).
  • HIF-1 ⁇ target gene protein FIG. 6a
  • HIF-1 ⁇ target gene mRNA FIG. 6b
  • Example 8 In primary retinal cells, NN2101 suppresses the expression of HIF-1 ⁇ and VEGFA, etc., in actual hypoxic conditions (1% O 2 ) compared to Eylea.
  • Example 9 NN2101 promotes the degradation of HIF-1 ⁇ through the Uniquitin-Proteasome Degradation Pathway.
  • HIF-1 ⁇ is hydroxylated by prolyl hydroxylase (PHD) under normal oxygen conditions and then degraded by the proteasome through pVHL-mediated ubiquitination. Under hypoxic conditions, hydroxylation is suppressed and HIF-1 ⁇ entering the nucleus is dimerized with HIF-1 ⁇ to promote the transcriptional expression of target genes that promote angiogenesis.
  • PLD prolyl hydroxylase
  • HIF-1 ⁇ entering the nucleus is dimerized with HIF-1 ⁇ to promote the transcriptional expression of target genes that promote angiogenesis.
  • CHx cyclohexamide
  • HRMEC were incubated overnight with EBM containing 0.5% FBS.
  • Cells were pretreated with NN2101 (10 ⁇ g/ml) for 6 hours and then treated with 50 ⁇ M CoCl 2 .
  • 10 ⁇ mol/L of MG132 or CHx was added, respectively, for the indicated period.
  • the total white matter expression level of HIF-1 ⁇ in cells was analyzed by Western blot. The density of each protein band was determined with an image analysis system and normalized to that of the corresponding ⁇ -tubulin.
  • HUVEC Longza, Walkersville, MD, USA
  • HUVEC cells were overexpressed using expression vectors encoding three isotypes of PHD, ie, GFP-PHD1, GFP-PHD2, and GFP-PHD3, to which Green Fluorescent Protein (GFP) was attached.
  • Transfected cells were incubated under hypoxic or normoxic conditions simultaneously with treatment with 10 ⁇ g NN2101 as indicated for 12 hours, respectively.
  • Cells were treated with or without 10 ⁇ mol/L of MG132 for 3 hours before harvesting.
  • HIF-1 ⁇ was selectively immunoprecipitated (IP) from whole cell lysates, followed by analysis of HIF-1 ⁇ bound to overexpressed PHD (HIF-1 ⁇ -PHD) by Western blotting (FIG. 9).
  • Example 10 NN2101 reduces the upregulation of pro-angiogenesis/inflammation factors, including HIF target genes, under hypoxic conditions in primary retinal cells.
  • HRMEC Human retinal microvascular endothelial cell
  • ARPE19 spontaneous retinal pigment epithelial cell
  • MIO-M1 Moorfields/Institute of Ophthalmology-Mueller 1; spontaneoulsy immortalized human Mueller glia cell line
  • Y79 photoreceptor cell
  • HRMEC were incubated overnight with EBM containing 0.5% FBS, and the cells were pretreated with NN2101 antibody or Eylea (10 ⁇ g/ml) for 6 hours and further treated with 100 ⁇ M CoCl 2 for 18 hours. Culture supernatants were analyzed with a proteome profiler and quantified. As a result of the above analysis, it was confirmed that NN2101 regulates angiogenic/inflammatory factors that are increased in HRMEC under hypoxic conditions (FIG. 10).
  • ARPE19 cells were cultured overnight in DMEM/F12 containing 0.5% FBS and cells were pretreated with NN2101 mAb or Eylea (10 ⁇ g/ml) for 6 hours, followed by further treatment with 100 ⁇ M CoCl 2 . The 18-hour culture supernatant was analyzed with a proteome profiler and quantified. As a result of the above analysis, it was confirmed that NN2101 regulates angiogenic/inflammatory factors that are increased in RPE under hypoxic conditions (FIG. 11).
  • MIO-M1 cells were cultured overnight with DMEM containing 0.5% FBS, cells were pretreated with NN2101 mAb or Eylea (10 ⁇ g/ml) for 6 hours, and then treated with 100 ⁇ M CoCl 2 . further processed. The 18-hour culture supernatant was analyzed with a proteome profiler and quantified. As a result of the above analysis, it was confirmed that NN2101 regulates angiogenic/inflammatory factors that are increased in MIO-M1 cells under hypoxic conditions (FIG. 12).
  • Y79 cells were incubated overnight with RPMI1640 containing 0.5% FBS and cells were pretreated with NN2101 mAb or Eylea (10 ⁇ g/ml) for 6 hours, then further treated with 100 ⁇ M CoCl 2 for 18 hours . Culture supernatants were analyzed with a proteome profiler and quantified. As a result of the above analysis, it was confirmed that NN2101 regulates angiogenic/inflammatory factors that are increased in Y79 cells under hypoxic conditions (FIG. 13).
  • NN2101 regulates angiogenic/inflammatory factors derived from hypoxic conditions in each cell (FIGS. 10 to 13).
  • NN2101 simultaneously reduced Angiopoietin-2 and VEGF and regulated other angiogenic factors, suggesting that faricimab, which simultaneously targets Angiopoietin-2 and VEGF, will have an effect equivalent to or better than that.

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Abstract

본 발명은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제에 관한 것이다. 본 발명의 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제는 안구 내 HIF-1α의 발현을 효과적으로 억제하고, 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자의 발현을 하향조절함으로써, 안 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

HIF-1 알파 저해제
본 발명은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환)의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
HIF-1α (Hypoxia-inducible factor 1-alpha)는 HIF1A 유전자에 의해 암호화되는 저산소증 유발 인자 1(HIF-1)의 하나의 서브유닛이다. HIF1A는 저산소증에 대한 세포 및 발달 반응의 마스터 전사 조절자로 여겨지고 있다(Wang GL ee al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (12): 5510-4 (1995)). 저산소증 또는 유전적 원인에 의한 HIF1A의 조절 장애 및 과발현은 암 뿐만 아니라 특히 혈관 형성 및 혈관 신생, 에너지 대사, 세포 생존 및 종양 침습 영역에서 많은 다른 병태 생리학에 크게 관련되어 있다(Semenza GL, Nature Reviews. Cancer. 3 (10): 721-32 (2003)).
망막은 안구 벽의 가장 안쪽에 위치하여 유리체(vitreous body)와 접하고 있는 투명하고 얇은 막으로서, 사물의 광학적 정보를 전기적 신호로 변환하여 시각신경을 통해 뇌의 중추 시각영역으로 영상을 전달하는 일차 시각정보기관의 역할을 한다. 망막에는 1억 개가 넘는 빛감지세포(광수용체세포, light-sensitive photoreceptor cells)와 1백만 개가 넘는 시각신경세포인 신경절세포(ganglion cells), 그리고 이들을 연결하는 신경세포로 이루어져 있다. 황반은 망막의 중심부에 위치한 신경조직으로 시세포의 대부분이 이곳에 모여 있으며, 물체의 상이 맺히는 곳으로 중심시력을 담당한다. 황반부(macula lutea)는 원뿔세포로 구성된 광수용체세포 층과 신경절세포층으로 이루어져 있어 망막의 두께가 얇으며, 밝은 빛 상태에서 영상의 전기적 신호가 화학적 신호로 전환되어 신경절세포의 축삭인 시각신경(optic nerve)을 타고 뇌로 전달되고, 황반부 이외의 망막은 주변부를 알아보고 어두울 때 주 역할을 담당한다. 따라서 노화 또는 외부적인 요인으로 망막 또는 황반에 이상이 발생되면 시력과 시야에 문제가 생기는 시각장애와 함께 실명에 이를 수 있다. 망막 또는 황반 질환에는 맥락막 혈관 신생, 황반변성, 황반부종, 망막병증, 망막부종, 망막혈관폐쇄, 망막박리, 녹내장 등이 있다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명의 목적은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량 투여하는 단계를 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제에 의한, 기존 안 질환 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량 투여하는 단계를 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 기존 안 질환 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 기존 안 질환 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제 및 이의 용도에 관한 것으로서, 예를 들어 HIF-1α의 발현 또는 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터의 투여에 의해 안 질환, 특히, 기존 망막 또는 황반 질환 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 망막 또는 황반 질환이 제어, 치료, 완화, 또는 감소되거나 재발이 억제될 수 있음을 보여준다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 다수의 용어 및 문구가 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에서 제시된다.
I. 정의
본 명세서에서 용어 "약"은 대략(approximately), 대충(roughly), 근처(around), 또는 ~~의 영역 내를 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때 그것은 제시된 수치 값 위와 아래로 경계를 확장시킴으로써 해당 범위를 변형한다. 일반적으로, 용어 "약"은, 예를 들어 위나 아래로(더 높거나 더 낮게) 10 퍼센트의 변동까지 언급된 값의 위와 아래로 수치 값을 변형할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 질환과 관련된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 지표의 진행, 발생, 심각성 또는 재발을 반전, 개선, 완화, 저해 또는 지연시킬 목적으로 대상에 대해 수행된 임의의 종류의 개입 또는 과정, 또는 대상에 활성제의 투여를 말한다. 치료는 질환을 가진 대상 또는 질환을 갖지 않은 대상(예를 들어 예방)에 대해 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "투여"는 당업자에게 공지된 다양한 방법 및 송달 시스템(delivery systems) 중 어느 것을 사용하여, 대상에게 치료제 또는 치료제를 포함하는 조성물을 물리적으로 도입하는 것을 말한다. 본 명세서에 개시된 항체를 위한 상이한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어, 주사(injection) 또는 주입(infusion)에 의한 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한, 장(enteral) 및 국부적(topical) 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 제한은 없지만, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 림프내, 병소내, 낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 피내, 기관지경(transtracheal), 기관내, 폐, 피하, 표피하, 안내, 관절내, 낭하, 지주막하, 뇌실내, 유리체내(intravitreal), 경막외, 및 흉골하 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 본 명세서에 기재된 조성물에 대한 바람직한 투여 경로는 안내 투여를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "안내"는 눈 조직 내부 또는 하부를 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "안내 투여"는 조성물을 눈의 테논낭하(sub-Tenon), 결막하, 맥락막상(suprachoroidal), 망막하(subretinal), 유리체내 및 유사 위치에 전달할 수 있는 임의의 투여를 지칭한다. 몇몇 측면에 있어서, 안내 투여는 맥락막상(suprachoroidal), 망막하(subretinal), 유리체내 투여를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "안 질환"은 안구에 생기는 질병을 의미하며, 안 혈관 질환이나, 망막 또는 황반 질환, 각막 질환, 결막 질환, 포도막 질환, 녹내장, 백내장 등을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "안 혈관 질환", "안 혈관 장애" 및 "혈관 눈 질환"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 안내 신생혈관 증후군, 예컨대, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 미숙아의 망막병증, 신생혈관 녹내장, 망막 정맥 폐쇄, 중심 망막 정맥 폐쇄, 황반 변성, 연령 관련 황반 변성, 색소성 망막염, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관확장, 허혈성 망막병증, 홍채 신생혈관형성, 안내 신생혈관형성, 각막 신생혈관형성, 망막 신생혈관형성, 맥락막 신생혈관형성 및 망막 변성을 포함하나 이들로 한정되지 않는다(Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710). 본원에서 사용된 바와 같이, 안 혈관 장애는 눈 조직, 예컨대, 망막 또는 각막의 구조물 내로의 신생 혈관의 변경된 또는 비-조절된 증식 및 침습을 특징으로 하는 임의의 병리학적 상태를 지칭한다.
일 실시양태에서, 안 혈관 질환은 하기 질환들로 구성된 군으로부터 선택된다: 습성 연령 관련 황반 변성(습성 AMD), 건성 연령 관련 황반 변성(건성 AMD), 당뇨병성 황반 부종(DME), 낭모양 황반 부종(CME), 비-증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 낭모양 황반 부종, 혈관염(예를 들면, 중심 망막 정맥 폐쇄), 유두부종, 망막염, 결막염, 포도막염, 맥락막염, 다초점 맥락막염, 안 히스토플라스마증, 안검염, 건조한 눈(쇼그렌병) 및 다른 안과 질환(이때, 안 질환 또는 장애는 안 신생혈관형성, 혈관 누출 및/또는 망막 부종과 관련되어 있다). 따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 습성 AMD, 건성 AMD, CME, DME, NPDR, PDR, 안검염, 건조한 눈 및 포도막염, 바람직하게는 습성 AMD, 건성 AMD, 안검염 및 건조한 눈, 바람직하게는 CME, DME, NPDR 및 PDR, 바람직하게는 안검염 및 건조한 눈, 특히 습성 AMD 및 건성 AMD, 특히 습성 AMD의 예방 및 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 안 질환은 습성 연령 관련 황반 변성(습성 AMD), 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, 미숙아의 망막병증 및 당뇨병성 망막병증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "망막 질환" 또는 "황반 질환"은 안구의 맥락막, 망막 또는 황반의 일부 또는 영역에 영향을 주거나 관련되는 질환, 질병 또는 증상을 지칭한다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 망막 또는 황반질환은 맥락막 혈관 신생, 황반병증, 황반부종, 망막병증, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "망막병증"은 망막(즉, 각막과 수정체를 통과하는 상을 포착하는 눈 뒤쪽의 안쪽 표면을 감싸고 있는 조직) 또는 망막 세포의 질환 또는 손상을 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "당뇨병성 망막병증"(DR)은 당뇨병과 관련된 합병증에 의해 유발되는 망막병증을 지칭하며, 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 당뇨병성 황반병증 및 당뇨병성 황반부종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 유형의 당뇨병성 망막병증을 포함한다.
상기 질환의 중증도에 따라 DR은 무증상이거나 경미한 시력 문제를 초래하거나 실명으로 이어질 수 있다. DR은 미세혈관 망막 변화의 결과이다. 고혈당증-유도 벽내(intramural) 혈관 주위 세포의 사멸과 기저막의 비후는 혈관벽의 부전으로 이어질 수 있다. 이들 손상은 혈액-망막 장벽의 형성을 변화시키고 망막 혈관을 더 잘 투과할 수 있게 한다.
DR은 2개의 별도 단계로 분류될 수 있다(Wu L., el al., World J Diabetes 4(6): 290-294 (2013)). 비증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)이라고 하는 제1기는 조기 당뇨병성 망막병증과 관련이 있다. NPDR은 일반적으로 분명한 증상이 없거나 주변 조직으로 체액이 빠져나가는 혈관으로 인해 초래되는 경미한 시력 왜곡(vision distortion)과 관련이 있다. 치료하지 않고 방치하면 DR 환자는 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR)이라고 하는 더욱 진행된 제2기로 진행될 수 있다. PDR은 파열과 출혈을 일으켜 시야를 흐려지게 할 수 있는 비정상적인 새로운 혈관 형성(즉, 혈관신생)을 특징으로 한다. PDR의 다른 증상으로는 시야에 떠다니는 반점이나 짙은 줄("비문증(floaters)"), 시력 변화, 색각 손상, 시야에 짙거나 빈 영역, 통증, 고르지 못한 시력과 완전한 시력 상실 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "황반병증"은 매우 민감하고 정확한 시력과 관련이 있는 망막의 중심 영역인 황반의 임의의 병리학적 증상을 의미한다. 몇몇 측면에 있어서, 용어 "황반병증" 및 "망막병증"은 호환하여 사용될 수 있다(즉, 황반의 영향만 받는 경우). 몇몇 측면에 있어서, 상기 황반병증은 당뇨병성 황반병증이다.
"당뇨병성 황반병증"은 황반이 당뇨병에 의해 초래된 망막 변화에 의한 영향을 받게 될 때 발생한다. 상기 용어는 2개의 구별되는 안 질환인 당뇨병성 황반부종과 당뇨병성 허혈성 황반병증을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "황반변성"은 황반 또는 황반 세포가 변성되거나 기능적 활성을 잃어버리는 임의의 수의 장애와 증상을 지칭한다. 노화-관련 황반변성은 황반변성 중 가장 흔하지만 용어 "황반변성"은 노인이 아닌 환자의 황반변성을 반드시 배제하는 것은 아니다. 황반변성의 비제한적인 예는: 노화-관련 황반변성(습성 또는 건성); Best 황반 이영양증, Sorsby 안저 이영양증, Mallatia Leventinese, Doyne 벌집 모양 망막 이영양증, 스타르가르트(Stargardt 병(Stargardt 황반 이영양증, 청소년 황반변성 또는 노란점 안저(fundus flavimaculatus)라고도 함) 및 색소 상피 박리 관련 황반변성을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "노화-관련 황반변성"(AMD)은 일반적으로 노인에게 영향을 미치고 망막의 중앙부(즉, 황반) 손상으로 인한 중심시 상실과 관련된 망막병증을 의미한다. AMD는 일반적으로 황반(주로 망막 색소 상피(RPE)와 그 밑에 있는 맥락막 사이) 내 드루젠(아밀로이드 베타와 같은 세포외 단백질 및 지질의 축적)이라고 하는 황색을 띠는 불용성 세포외 침착물의 점진적인 축적 또는 응집을 특징으로 한다. 황반 내 이들 침착물의 축적 또는 응집은 황반을 점차 악화시켜 중심시 손상을 초래할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "황반"은 중앙의 고해상도 색각을 담당하는 망막의 중심부를 의미한다.
AMD에는 2가지 주요 형태인 (i) 건성 AMD 및 (ii) 습성 AMD가 있다. 달리 특정하지 않는 한, 용어 "노화-관련 황반변성"은 건성 AMD와 습성 AMD 모두를 포함한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "노화-관련 황반변성"은 또한 원인에 관계없이 모든 유형의 노화-관련 황반변성과 노화-관련 황반변성의 임의 및 모든 증상들을 포함한다. 황반변성(예를 들어 노화-관련 황반변성)과 관련한 증상의 비제한적인 예는: 중심시 상실, 왜곡, 조영제 감도 감소, 시야 흐림, 저조도 적응의 어려움, 갑작스런 발병 및 증상의 급속 악화 및 색각 감소를 포함한다. 몇몇 측면에 있어서, 황반변성(예를 들어 노화-관련 황반변성)은 황반부종(즉, 황반 위 또는 아래에 체액과 단백질 침착물의 포집으로 인한 황반 종창)을 일으킬 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "건성 AMD"(위축성 노화-관련 황반변성 또는 비-삼출성 AMD라고도 함)는 습성(혈관신생성) AMD가 아닌 모든 형태의 AMD를 지칭한다. 이는 초기 및 중기 형태의 AMD 뿐만 아니라 지도 모양 위축으로 알려진 진행기 형태의 건성 AMD를 포함한다. 건성 AMD 환자는 더 이른 초기에서 최소 증상을 갖는 경향이 있고; 시각 기능 상실은 증상이 지도 모양 위축으로 진행되는 경우에 더 자주 발생한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "습성 AMD"(혈관신생성 노화-관련 황반변성 또는 삼출성 AMD라고도 함)은 망막 혈관신생의 존재를 특징으로 하는 망막 증상을 지칭하는 것으로, 가장 진행된 형태의 AMD이다. 습성 AMD에서 혈관은 브루크막(Bruch's membrane)의 결함을 통해 맥락막 모세혈관 및 일부의 경우에는 하부의 망막 색소 상피(맥락막 신생혈관 형성 또는 혈관신생)로부터 성장한다. 이들 혈관으로부터 빠져나가는 장액성 또는 출혈성 삼출물의 조직화는 신경망막의 부수적 변성, 망막 색소 상피의 박리 및 파열, 유리체 출혈 및 중심시의 영구 손상과 함께 황반 부위의 섬유 혈관 흉터 생성을 일으킬 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "혈관신생"은 출혈을 유발하고 시력 상실을 일으킬 수 있는 눈의 서로 다른 부분에서 새로운 비정상적인 혈관의 성장을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "맥락막 혈관신생"은 맥락막(즉, 결합 조직을 포함하고 망막과 공막 사이에 있는 눈의 혈관층)에서 새로운 혈관의 비정상적인 성장을 지칭한다. 습성 AMD에서 새로운 혈관은 망막 색소 상피(RPE)와 맥락막을 통해 망막으로 성장할 수 있으며 혈액 및 지질 누출로 인해 시각 기능에 손상을 줄 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "망막 혈관신생"은 망막 상부 또는 내부, 예를 들어 망막 표면에서 혈관의 비정상적인 발달, 증식 및/또는 성장을 지칭한다. 망막 혈관신생은 망막 허혈과 관련된 망막병증(예를 들어 당뇨병성 망막병증, 겸상 적혈구 망막병증, 일스(Eales)병, 안허혈 증후군, 경동맥 해면 정맥동루(carotid cavernous fistula), 가족성 삼출성 유리체 망막병증, 과점도 증후군, 방사선 망막병증, 망막 정맥 폐쇄, 망막 동맥 폐쇄, 망막 색전증, 버드샷 망막맥락막증(birdshot retinochoroidopathy), 맥락막 흑색종, 만성 망막 박리, 전방 허혈성 시신경병증(AION), 비-동맥성 전방 허혈성 시신경병증(NAION) 및 색소실조증(incontinentia pigmenti)과 같은 많은 망막병증에서 발생할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "녹내장"은 시신경 (optic nerve) 또는 시신경 세포의 손상으로 시야 결손이 나타나는 질환을 지칭한다. 녹내장은 실명의 주요 원인 중 하나이다. 녹내장의 비제한적인 예는: 원발선천녹내장, 개방각녹내장, 폐쇄각녹내장을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "망막색소변성"(RP)는 망막의 시각세포(optic cell)와 망막색소상피 세포가 손상(변성)되는 유전성 망막 질환을 지칭한다. 시각세포가 손상됨에 따라 초기에 야맹증이 나타나며 정차적으로 시야가 좁아지고 결국 실명을 하게 된다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "불응성" 또는 "무반응성"은 기존 안 질환 치료에 반응하지 않거나, 또는 기존 치료에 의해 충분한 효과가 나타나지 않는 질환을 지칭한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 " 기존 안 질환 치료제"는 본 발명의 출원일 이전에 개발 또는 시판된 안 질환 치료제 또는 작용기전이 이미 공지된 안 질환 치료 방식을 적용한 치료제를 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "기존 망막 또는 황반 질환 치료제"는 VEGFA, VEGFB, PIGF, CCR3, VEGFR, PDGFR, CSF1R, FGF-2, PGF 및 Ang2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질일 수 있다. 이러한 물질에는, 이들 표적 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 이들 단백질에 특이적인 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.
기존 망막 또는 황반 질환 치료제의 바람직한 예는 VEGF 억제제일 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "VEGF 억제제"는 VEGF만을 억제하거나, 또는 다른 단백질(예컨대 ANG-2)과 VEGF를 동시에 억제하는 물질을 포괄적으로 지칭하며, 작용시간 등을 증가시키기 위해 VEGF 억제제에 생중합체(biopolymer)를 접합시킨 형태의 물질 역시 포함된다. VEGF 억제제의 예로는 애플리버셉트(aflibercept; 아일리아(Eylea)® 등의 상품명으로 시판됨), 라니비주맙(ranibizumab; 루센티스(Lucentis)®, 서스비모(Susvimo)® - Port Delivery System 등의 상품명으로 시판됨), 베바시주맙(bevacizumab; 아바스틴(Avastin)® 등의 상품명으로 시판됨), 브롤루시주맙(brolucizumab); 비오뷰(Beovu)® 등의 상품명으로 시판됨), 페갑타닙(pegaptanib; 마쿠젠(Macugen)® 등의 상품명으로 시판됨), 파리시맙(faricimab; 바비스모(Vabysmo)® 등의 상품명으로 시판됨), KSI-301, 이들의 조합 등을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 문구 "HIF-1α의 발현 또는 활성을 억제한다"는 HIF1A 유전자 또는 단백질의 발현 또는 HIF-1α 단백질 활성의 임의의 측정 가능한 감소, 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 99%, 또는 100%까지의 HIF-1α의 발현 또는 활성의 저해를 포함한다.
용어 "유효량", "치료적 유효량" 또는 "유효 투약량"은 원하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 약물 또는 치료제의 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 투약량"은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 사용되었을 때, 질환 증상의 심각성의 감소에 의해 증명된 질환 퇴행(regression), 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환으로 인한 장해나 상해의 예방을 촉진하는 약물의 양이다. 약물의 치료적 유효량 또는 유효 투약량은 "예방적 유효량" 또는 "예방적 유효 투약량"을 포함하며, 이것은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 질환이 발생할 위험이 있거나 질환의 재발로 고통받을 위험이 있는 대상에 투여되었을 때 질환의 발생이나 재발을 저해하는 약물의 양이다.
예로서, 망막 또는 황반 질환 치료의 경우, 약물의 치료적 유효량 또는 유효 투약량은 치료되지 않은 대상에 비해 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 80%까지 HIF-1α의 발현 또는 활성을 저해한다.
용어 "항체"는 당업계의 용어이며 본 명세서에서 상호 교환하여 사용될 수 있고, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 가진 분자를 말한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉 "항원-결합 부분") 또는 이들의 단쇄를 포함한다. 하나의 구체예에서, "항체"는 이황화물 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원-결합 부분을 말한다. 다른 구체예에서, "항체"는 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 도메인을 포함하는 단쇄 항체를 말한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH로 약기)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 특정 자연-발생 항체에서, 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 특정 자연-발생 항체에서, 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL로 약기)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다.
VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는, 더 보존되는 영역들이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는, 초가변성의 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어지며, 이들은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단을 향해 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어 이펙터 세포) 및 정통 보체 시스템의 제1 성분(C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자들과 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체는 면역글로불린 분자의 임의의 타입(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 유형(예를 들어 IgD, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 아형(예를 들어 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 마우스에서IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3)를 가질 수 있다. 면역글로불린, 예를 들어 IgG1은 몇몇 알로타입으로 존재하며, 이들은 최대 몇 개의 아미노산이 서로 상이하다. 본 명세서에 개시된 항체는 통상 알려진 이소타입, 유형, 아형, 또는 알로타입 중 어느 것으로부터 유래할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형 또는 이들의 임의의 하이브리드이다. 특정 구체예에서, 항체는 인간 IgG1 아형 또는 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 아형의 것이다.
"항체"는, 예로서, 자연-발생 및 비-자연-발생 항체; 단클론성 및 다클론성 항체; 키메라 및 인간화된 항체; 인간 및 비-인간 항체, 전체 합성 항체; 단쇄 항체; 단일특이적 항체; 다중특이적 항체(이중특이적 항체를 포함); 2개의 중쇄와 2개의 경쇄 분자를 포함하는 테트라머 항체; 항체 경쇄 모노머; 항체 중쇄 모노머; 항체 경쇄 다이머; 항체 중쇄 다이머; 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍; 인트라바디; 헤테로콘쥬게이트 항체; 1가 항체; 낙타화 항체; 아피바디; 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어 항-항-Id 항체를 포함), 및 충분히 항원 결합할 수 있는 단일 모노머 가변 항체 도메인(예를 들어 VH 도메인 또는 VL 도메인)으로 구성된 결합 분자를 포함하는 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함한다(Harmen M. M. and Haard H. J. Appl Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22 (2007)).
본 명세서에서 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분", 즉, "항원 결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 이러한 "단편"은, 예를 들어 약 8 내지 약 1500개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 745개 아미노산 길이, 더 적합하게는 약 8 내지 약 300개, 예를 들어 약 8 내지 약 200개 아미노산, 또는 약 10개 내지 약 50 또는 100개 아미노산 길이이다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 항원 결합 단편이란 용어에 포함되는 결합 단편의 예들은 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, 및 이황화물-연결된 Fvs(sdFv); (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 이어질 수 있는 둘 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL과 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여 이어질 수 있으며, 이로써 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 사슬이 될 수 있다(단쇄 Fv(scFv)라고 한다)(예를 들어 Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단쇄 항체도 또한 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원 결합 단편이라는 용어 내에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 얻어지며, 단편들은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소 또는 화학 절단에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 당업계에서 통상적으로 상호 교환하여 사용된다. 가변 영역은 전형적으로 항체의 일부분, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부분, 전형적으로 성숙한 중쇄에서 약 아미노 말단 110 내지 120개 아미노산 및 성숙한 경쇄에서 약 90 내지 115개 아미노산을 말하며, 이들은 항체와 서열이 광범하게 상이하고 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성 때문에 사용된다. 서열 변동성은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 영역에 집중되며, 가변 도메인에서 더 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 불린다.
경쇄 및 중쇄의 CDR은 항원과 항체의 상호작용 및 특이성을 주로 담당한다고 여겨진다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR과 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어 비-인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR과 영장류(예를 들어 비-인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "중쇄"는 항체와 관련하여 사용되었을 때, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 임의의 상이한 타입, 예를 들어 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)를 말할 수 있으며, 이들은 각각 IgG의 아형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여, 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 유형을 발생시킨다.
본 명세서에서 사용된 용어 "경쇄"는 항체와 관련하여 사용되었을 때, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 임의의 상이한 타입, 예를 들어 카파(κ) 및 람다(λ)를 말할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 잘 공지되어 있다. 특정한 구체예에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 상호 교환하여 사용되며 항체의 경쇄 가변 영역을 말한다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 상호 교환하여 사용되며 항체의 중쇄 가변 영역을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호 교환 가능하며 당업계에서의 통상의 의미를 가진다. 불변 도메인은 항체 부분이며, 예를 들어 항체와 항원의 결합에는 직접 연루되지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카복시 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 가진다.
"Fc 영역"(단편 결정화 가능한 영역) 또는 "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어 이펙터 세포) 상에 위치된 Fc 수용체 또는 정통 보체 시스템의 제1 성분(C1q)과의 결합을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자들과 면역글로불린의 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 말한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인(예를 들어 CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소타입에서, Fc 영역은 항체의 두 중쇄의 제2(CH2) 및 제3(CH3) 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편을 포함한다; IgM 및 IgE Fc 영역은 각 폴리펩타이드 사슬에 3개의 중쇄 불변 도메인(CH 도메인 2~4)을 포함한다. IgG의 경우, Fc 영역은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3과 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양하지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 C226이나 P230에 있는 아미노산 잔기(또는 이들 두 아미노산 사이의 아미노산)에서 중쇄의 카복시-말단까지 늘어난 것으로서 한정되며, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스를 따른다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340까지 연장되고, CH3 도메인은 Fc 영역에서 Cm 도메인의 C-말단 측에 위치되는데, 즉 그것은 IgG의 약 아미노산 341에서 약 아미노산 447까지 연장된다. Fc 영역은 임의의 알로타입 변이체를 포함하는 자생 서열 Fc, 또는 변이체 Fc(예를 들어 비-자연-발생 Fc)일 수 있다. 또한, Fc는 분리된 상태의 영역을 말하거나 또는 "Fc 융합 단백질"(예를 들어 항체 또는 면역유착(immunoadhesion))이라고도 하는, "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"과 같은 Fc-포함 단백질 폴리펩타이드와 관련된 영역을 말한다.
"힌지", "힌지 도메인" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하고 힌지의 상부, 중앙, 및 하부 부분을 포함하는 중쇄 불변 영역의 도메인을 말한다(Roux et al.J. Immunol. 1998 161:4083). 힌지는 항체의 결합 영역과 이펙터 영역 사이에 가요성의 수준을 변화시키며, 또한 두 중쇄 불변 영역 사이에 분자간 이황화물 결합을 위한 부위를 제공한다. 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지의 서열이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개) 참조).
본 명세서에서 사용된 용어 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 유형(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알로타입"은 몇 개의 아미노산이 차이가 있는 특정한 이소타입 그룹 내에서 자연-발생한 변이체를 말한다(예를 들어 Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1 참조). 본 명세서에 제시된 항체는 임의의 알로타입을 가질 수 있다. IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 알로타입은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Kabat EA et al., (1991)(상동); Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(2014년 10월 20일 온라인 공개); 및 Lefranc MP, mAbs 1:4, 1-7(2009) 참조).
본 명세서에서 사용된 용어 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단클론성 항체"는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체 또는 모든 항체가 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체들의 조성물을 말한다. 따라서, 용어 "인간 단클론성 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내고 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 선택적 불변 영역을 가진 항체 또는 항체 조성물을 말한다. 하나의 구체예에서, 인간 단클론성 항체는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스젠과 경쇄 트랜스젠을 포함하는 게놈을 가진, 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 면역 글로불린 유전자에 대해 트랜스젠이거나 트랜스염색체성(transchromosomal)인 동물(예를 들어 마우스)로부터 분리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열을 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 점라인 유전자에 의해 암호화되지만, 예를 들어 항체 성숙화 동안 발생하는 후속 재배열 및 돌연변이를 포함하는 특정한 인간 점라인 면역글로불린 서열을 이용하는 가변 및 불변 영역을 포함한다. 당업계에 공지된 대로(예를 들어 Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125 참조), 가변 영역은 외래 항원에 대해 특이적인 항체를 형성하도록 재배열한 다양한 유전자에 의해 암호화된, 항원 결합 도메인을 함유한다. 재배열에 더하여, 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 다수의 단일 아미노산 변화(체세포 돌연변이 또는 초돌연변이)에 의해 더 변형될 수 있다. 불변 영역은 항원에 대한 추가의 반응(즉 이소타입 스위치)에서 변할 것이다. 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 원래 핵산 분자와 서열 동일성을 가질 수 없지만, 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다(즉 적어도 80% 동일성을 가진다).
본 명세서에서 사용된 용어 "인간" 항체(HuMAb)는 프레임워크와 CDR 영역이 둘 다 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진 항체를 말한다. 또한, 이 항체가 불변 영역을 함유한다면, 불변 영역 역시 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 명세서에 제시된 항체는 인간 점라인 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어 시험관내 무작위 또는 부위-특정 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 점라인으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 접목된 항체는 포함하지 않는다. 용어 "인간" 항체와 "완전한 인간" 항체는 동의어로서 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "인간화된 항체"는 비-인간 항체의 CDR 도메인 밖의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 치환된 항체를 말한다. 항체의 인간화된 형태의 하나의 구체예에서, CDR 도메인 밖의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린으로부터의 아미노산으로 치환되고, 하나 이상의 CDR 영역 내의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 그대로 남는다. 아미노산의 첨가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 이들이 항체가 특정 항원에 결합하는 능력을 없애지 않는 한 허용된다. "인간화된" 항체는 원래 항체의 것과 유사한 항원 특이성을 보유한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "키메라 항체"는 하나의 종으로부터 가변 영역이 유래되고 다른 종으로부터 불변 영역이 유래된 항체, 예컨대 마우스 항체로부터 가변 영역이 유래되고 인간 항체로부터 불변 영역이 유래된 항체를 말한다.
II. HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법
일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량 투여하는 단계를 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법을 제공한다.
일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량 투여하는 단계를 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제에 의한, 기존 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환) 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기의 CDR 서열을 포함한다:
(i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
(ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
(iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
(iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
(v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
(vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자는 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열을 포함할 수 있다. 여기서, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열은 각각 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3을 코딩한다. 서열번호 9 내지 11의 염기서열은 각각 CHO 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있으며, 이와 같이 코돈 최적화된 염기서열을 포함하는 핵산은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산의 범위 내에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19를 포함할 수 있다.
선택적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자는 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열을 포함할 수 있다. 여기서, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열은 각각 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3을 코딩한다. 서열번호 12 내지 14의 염기서열은 각각 CHO 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있으며, 이와 같이 코돈 최적화된 염기서열을 포함하는 핵산은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산의 범위 내에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 서열번호 15 또는 서열번호 23을 포함하는 경쇄 가변영역 코딩 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 서열번호 16 또는 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변영역 코딩 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 26을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 서열번호 27 또는 서열번호 29를 포함하는 경쇄 코딩 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 서열번호 28 또는 서열번호 30을 포함하는 중쇄 코딩 핵산을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 항체는 WO 2020/076105에 기재된 2G4 항체이다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터가 발현되어 형성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 상기 HIF-1α의 발현 또는 활성을 억제하며, 바람직하게는 생체 내(in vivo)에서, 보다 바람직하게는 안구 내에서, 보다 더 바람직하게는 맥락막 또는 망막 내에서 이루어지는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 상기 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터가 발현되어 형성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 안구 내 세포에서 HIF-1α의 발현 또는 활성을 억제하며, 바람직하게는 시신경 세포, 망막 뮐러(Mueller) 세포, 맥락막 세포, 망막 미세혈관 내피 세포(RMEC), 망막 색소 상피(RPE) 세포 및 광수용체 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포에서 이루어지는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 맥락막 세포, 망막 미세혈관 내피 세포(RMEC), 망막 색소 상피(RPE) 세포 및 광수용체 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환의 예로는 맥락막 혈관 신생, 황반병증, 망막병증, 망막세포변성, 망막박리, 망막혈관폐쇄(PDR) 등이 있으며, 상기 시신경 세포, 망막 뮐러(Mueller) 세포의 기능 이상 또는 손상을 원인으로 발생되는 질환의 예로는 녹내장 등이 있다.
상기 HIF-1α의 발현 억제는 HIF-1α 유전자가 발현되어 단백질 합성, 및 단백질 분해조절을 포함한 전체 과정 또는 그의 일부 과정의 억제 또는 저해를 의미하며, 바람직하게는 mRNA 또는 단백질 발현 억제, 보다 바람직하게는 단백질 분해 촉진에 따른 활성 억제일 수 있다.
상기 HIF-1α의 활성 억제는 상기 발현되어 생성된 HIF-1α 단백질 자체의 기능 억제, HIF-1α 단백질의 분해 촉진, SCF 유도 인산화에 의한 HIF-1α의 활성 억제 등을 통하여 달성될 수 있다.
다만 본원에서는 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제는 엄격하게 구별되어 사용되지 않으며, 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
상기 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제는 투여받지 않은 대상과 비교하여, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 상기 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터가 발현되어 형성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)의 투여에 의해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%까지 HIF-1α의 발현을 억제시킨다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 상기 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터가 발현되어 형성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 추가적으로 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자를 조절한다.
상기 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자는 엔지오제닌(Angiogenin), 엔지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), CXCL16, 엔도글린(Endoglin), 응고인자 III (Coagulation Factor III), 엔도테린-1(Endotherin-1), MCP-1, EG-VEGF, VEGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IL-1β, PDGF-AA, PIGF, 세르핀 E(Serpin E), 세르핀 F1(Serpin F1), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), ANGPT2, 펜트라신 3(Pentraxin 3), IL-8, FGF2 및 FGF5으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 인자일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 상기 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터가 발현되어 형성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 상기 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자 발현의 상향 조절(up-regulation)을 감소 또는 하향 조절(down-regulation)시킨다.
상기 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자 발현의 상향 조절의 감소는 투여받지 않은 대상과 비교하여, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (또는 상기 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터가 발현되어 형성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)의 투여에 의해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%까지 상향 조절을 감소시킨다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 상기 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터가 발현되어 형성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 포함)은 미세혈관 세포의 증식, 이동(migration) 및 관 형성(tube formation)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 감소시킬 수 있다.
III. 안 질환의 예방 또는 치료 방법
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량 투여하는 단계를 포함하는 안 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량 투여하는 단계를 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제에 의한, 기존 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환) 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제는 하기의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함한다:
(i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
(ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
(iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
(iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
(v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
(vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자는, 위 항목 < II. HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법>에서 언급된 기재를 그대로 본 항목에도 도입한다.
일부 구체예에서, 상기 항체는 WO 2020/076105에 기재된 2G4 항체이다.
일부 구체예에서, 상기 안 질환은 안 혈관 질환, 망막 또는 황반 질환, 각막질환, 결막질환, 포도막질환, 녹내장, 백내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환이다.
일부 구체예에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 맥락막 혈관 신생, 황반병증, 망막병증, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환이다.
일부 구체예에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 당뇨병성 망막병증 (Diabetic Retinopathy; DR), 당뇨병성 황반부종(Diabetic Macular Edema; DME), 습성 황반변성(wet Age-related Macular Degeneration; wet AMD), 망막정맥폐쇄(Retinal Vein Occlusion; RVO), 미숙아망막증(Retinopathy of Prematurity) 및 녹내장(Glaucoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환이다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 하는 대상(예를 들어, DR, DME, AMD 등)의 치료 가능성을 증가시키거나 치료기간을 감소시킨다. 예를 들어, 대상의 치료기간은 기준 개체(예를 들어 본 명세서에 개시된 항체 또는 조성물로 치료되지 않은 다른 대상)과 비교했을 때 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 7개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 11개월, 또는 적어도 약 1년 또는 그 이상까지 치료기간을 감소시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 대상의 질병이 약화된 상태의 지속기간을, 기준 대상(예를 들어 본 명세서에 개시된 항체 또는 조성물로 치료되지 않은 다른 대상)의 지속기간보다 더 긴 수준으로(약 1개월 더 길게, 약 2개월 더 길게, 약 3개월 더 길게, 약 4개월 더 길게, 약 5개월 더 길게, 약 6개월 더 길게, 약 7개월 더 길게, 약 8개월 더 길게, 약 9개월 더 길게, 약 10개월 더 길게, 약 11개월 더 길게, 또는 약 1년 더 길게) 증가시킨다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 대상의 질환 진행이 없거나 약화된 지속기간을 증가시킨다. 예를 들어, 대상의 질환 진행 없는 지속기간은 기준 대상(예를 들어 본 명세서에 개시된 항체 또는 조성물로 치료되지 않은 다른 대상)과 비교했을 때 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 7개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 11개월, 또는 적어도 약 1년까지 증가된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 일군의 대상에서의 반응 속도를 효과적으로 증가시킨다. 예를 들어, 일군의 대상에서의 반응 속도는 기준 대상(예를 들어 본 명세서에 개시된 항체 또는 조성물로 치료되지 않은 다른 대상)과 비교했을 때 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%까지 증가된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에서 사용하는 용어 "기준"은 본 명세서에 개시된 조성물(예를 들어 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제, 예를 들어 항체)을 투여 받지 않은 해당 대상(예를 들어 당뇨병성 망막병증 또는 노화-관련 황반변성을 가진 대상)을 지칭한다. 용어 "기준"은 또한 본 명세서에 개시된 조성물을 투여하기 전의 동일한 대상(예를 들어 당뇨병성 망막병증 또는 노화-관련 황반변성을 가진 대상)을 지칭할 수도 있다. 특정 양태에서, 용어 "기준"은 대상들(예를 들어 당뇨병성 망막병증 또는 노화-관련 황반변성을 가진 대상들)의 집단의 평균을 지칭한다.
일부 구체예에서, 본 개시 내용으로 치료할 수 있는 망막병증은 당뇨병성 망막병증을 포함한다. 특정 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 비-증식성 당뇨병성 망막병증(NPDR)이다. 다른 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR)이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 당뇨병성 황반병증이다. 다른 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 당뇨병성 황반부종이다. 일부 양태에서, 당뇨병성 망막병증은 망막 내 허혈성 손상과 관련된 임의의 망막병증이다.
일부 구체예에서, 본 개시 내용으로 치료할 수 있는 황반변성은 노화-관련 황반변성(AMD)을 포함한다. 일부 양태에서, 노화-관련 황반변성은 초기 AMD이다. 다른 양태에서, 노화-관련 황반변성은 중기 AMD이다. 다른 양태에서, 노화-관련 황반변성은 후기 또는 진행성 AMD(즉, 지도 모양 위축)이다. 일부 양태에서, 노화-관련 황반변성은 건성(비-삼출성) AMD이다. 다른 양태에서, 노화-관련 황반변성은 습성(혈관신생성 또는 삼출성) AMD이다.
일부 구체예에서, 본 방법에서 치료될 대상은 비-인간 동물, 예컨대 래트 또는 마우스이다. 일부 구체예에서, 본 방법에서 치료될 대상은 인간이다.
일 실시태양에서, 본 방법에서 "기존 망막 또는 황반 질환 치료제"는 VEGF 억제제일 수 있으며, 구체적으로, 애플리버셉트(aflibercept), 라니비주맙(ranibizumab), 서스비모(Susvimo)®, 베바시주맙(bevacizumab), 브롤루시주맙(brolucizumab), 페갑타닙(pegaptanib), 파리시맙(faricimab), 및 KSI-301로 이루어지는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
IV. 약제학적 조성물 또는 용도
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제는 하기의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함한다:
(i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
(ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
(iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
(iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
(v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
(vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제에 의한, 기존 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환) 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
(ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
(iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
(iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
(v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
(vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제에 의해, 기존 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환) 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환(예를 들어, 망막 또는 황반 질환)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 하기의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터의 용도를 제공한다:
(i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
(ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
(iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
(iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
(v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
(vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자는, 위 항목 < II. HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법>에서 언급된 기재를 그대로 본 항목에도 도입한다.
일부 구체예에서, 상기 항체는 WO 2020/076105에 기재된 2G4 항체이다.
일부 구체예에서, 상기 안 질환은 안 혈관 질환, 망막 또는 황반 질환, 각막 질환, 결막 질환, 포도막 질환, 녹내장, 백내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환이다.
일부 구체예에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 맥락막 혈관 신생, 황반병증, 망막병증, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환이다.
일부 구체예에서, 상기 망막 또는 황반 질환은 당뇨병성 망막병증 (Diabetic Retinopathy), 당뇨병성 황반부종(Diabetic Macular Edema), 습성 황반변성(wet Age-related Macular Degeneration), 망막정맥폐쇄(Retinal Vein Occlusion), 미숙아망막증(Retinopathy of Prematurity) 및 녹내장(Glaucoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환이다.
생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA) 중에서 원하는 정도의 순도를 가진, 본 명세서에 개시된 항체를 포함하는 조성물이 본 명세서에 개시된다
일부 구체예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 2중 특이적 분자 또는 면역 복합체를 포함한다. 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분의 유효량 및 경우에 따라 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 항체는 상기 약제학적 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 HIF-1α의 발현 또는 활성을 억제하고 AMD, 녹내장과 같은 안 질환, 장애 또는 증상을 치료하는데 유용할 수 있다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 대상에 대한 임의의 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 눈의 테논낭하, 결막하, 맥락막상, 망막하, 유리체내 및 유사 위치에 상기 조성물을 전달할 수 있는 임의의 경로를 통해 투여할 수 있다. 특정 양태에서, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 대상에 안구 투여를 통해 전달된다. 일부 양태에서, 안구 투여는 유리체내 투여를 포함한다. 본 명세서에서는 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사를 특징으로 하는 비경구 투여 또한 고려된다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 눈 안에 있는 것과 같은 피부와 점막에 국소 도포와 같이 국소용 또는 국부용으로 겔, 크림 및 로션 형태로 또한 눈에 적용 또는 수조내(intracisternal) 또는 척수내 적용을 위해 제제화될 수 있다. 국소 투여는 경피 전달용으로 그리고 눈이나 점막 투여용 또는 흡입 요법용으로도 고려된다. 상기 항체의 점비액(nasal solution)은 단독으로 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는 약제학적 조성물은 용액, 유화액 및 그외 다른 혼합물로서 투여용으로 재구성할 수 있는 동결건조 분말이다. 상기 동결건조 분말은 또한 고체 또는 겔로서 재구성 및 제형화될 수 있다.
이러한 동결건조된 분말을 주사용수에 의해 재구성하여 비경구 투여용으로 사용하기 위한 제형을 제공한다. 재구성을 위해서 상기 동결건조된 분말을 멸균수 또는 다른 적합한 담체에 첨가한다. 그 정확한 양은 선택한 화합물에 따라 다르다. 이러한 양은 경험적으로 결정할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제를 제공한다.
(ii) 본 발명의 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제제는 안구 내 HIF-1α의 발현을 효과적으로 억제하고, 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자의 발현을 하향조절함으로써, 안 질환의 예방 또는 치료, 특히 기존 망막 또는 황반 질환 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 망막 또는 황반 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 NN2101이 레이저 유도 CNV 마우스에서 HIF-1α의 맥락막 발현을 효과적으로 억제함을 확인한 결과이다.
도 2는 NN2101이 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현을 효과적으로 억제함을 확인한 결과이다. 도 2a: 전체 세포 용해물에서 단백질 수준. 도 2b 및 2c: 배양 상층액으로 분비된 sSCF 및 sVEGFA.
도 3은 NN2101이 SCF 유도 인산화에 의한 HIF-1α 발현을 조절함을 확인한 결과이다. 도 3a: 전체 세포 용해물에서 단백질 수준. 도 3b: 배양 상층액으로 분비된 sSCF(위) 및 sVEGFA(아래).
도 4는 NN2101 처리가 저산소 상태에서 HIF-1α, VEGFA, mSCF, phospho-cKIT의 단백질 발현을 유의하게 감소하였음을 확인한 결과이다.
도 5는 HRMEC에서 NN2101 처리에 의해 저산소 상태에서 HIF-1α 표적 유전자의 mRNA 수준이 조절되었음을 확인한 결과이다. 도 5a: CoCl2 처리로 저산소 상태 유도. 도 5b: 저산소 챔버를 이용한 검증.
도 6은 RPE 세포에서 NN2101 처리에 의해 저산소 상태에서 HIF-1α 표적 유전자의 mRNA 수준 및 단백질 수준이 조절되었음을 확인한 결과이다. 도 6a: 단백질 수준. 도 6b: mRNA 수준.
도 7은 HRMEC, ARPE19, MIO-M1 및 Y79 세포에 NN2101 선 처리 후, 저 산소 상태(1% O2)에서 추가 처리하였을 때 세포 용해물의 단백질 수준 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과이다.
도 8 및 9는 NN2101이 Uniquitin-Proteasome Degradation Pathway를 통해 HIF-1α의 분해를 촉진함을 보여주는 결과이다. 도 8a: MG132 처리 결과. 도 8b: CHx 처리 결과. 도 9: HIF-1α-PHD 분석 결과.
도 10 내지 도 13는 NN2101이 HRMEC, ARPE19, MIO-M1 및 Y79 세포에서 혈관신생/염증 인자를 조절하는 것을 확인한 결과를 나타낸다. 도 10: HRMEC 세포. 도 11: ARPE19 세포. 도 12: MIO-M1 세포. 도 13: Y79 세포.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. HIF-1α 저해제로서의 NN2101 항체의 선별
(주)노벨티노빌리티 보유 항체 pool을 이용하여, HIF-1α에 대한 저해제(발현 또는 활성 억제제)로서의 활성을 나타내는 항체를 선별하였다.
상기 선별된 NN2101 항체의 CDR 서열은 하기의 표 1과 같다:
CDR Sequence SEQ ID NO
L-CDR1 QSLLHSNGYN Y SEQ ID NO: 1
L-CDR2 LGS SEQ ID NO: 2
L-CDR3 MQALQTIT SEQ ID NO: 3
H-CDR1 GFTFSRYG SEQ ID NO: 4
H-CDR2 IWYDGTNK SEQ ID NO: 5
H-CDR3 AREDWAEAFD M SEQ ID NO: 6
상기 NN2101 항체의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역의 서열은 하기의 표 2와 같다:
Variable region Sequence SEQ ID NO
light chain DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQALQTI TFGQGTRLEI K SEQ ID NO: 7
heavy chain QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS RYGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGTNKDY TDSVRGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARED WAEAFDMWGQ GTTVTVSS SEQ ID NO: 8
실시예 2. NN2101는 뮤린 CNV 모델에서 HIF-1α의 발현을 하향조절한다.
레이저 유도 CNV 마우스를 다음과 같이 제작하였다. 10주령 C57BL/6 mice (Orient Co., Ltd., Korea)의 한쪽 눈에 대해, Laser를 이용하여 마우스의 Bruch's membrane을 손상시켜 맥락막 혈관신생을 유도하였다. 사용된 Laser는 다음과 같다 : Laser photocoagulation : wavelength: 532 nm; fixed diameter: 50 μm; intensity: 300 mW; duration: 0.70.
CNV 마우스의 한쪽 눈은 레이저 광응고 직후 NN2101(1 μg/1 μL)를 1회 유리체내 주사로 투여받았다. 반대쪽 눈은 대조군으로 사용하였고, PBS(1 μL)를 유리체내 투여하였다. 레이저 광응고술 후 7일째 레이저 유도 CNV 마우스에서 눈을 적출하였다. 이로부터 추출된 맥락막 조직을 이용하여 웨스턴 블랏(Western Blot; 이하 "WB"로도 지칭함) 분석을 수행하여 pho-cKIT, pho-GSK-3β, HIF-1α, VEGF-A 단백질을 정량하였다.
NN2101의 유리체내 주사는 CNV 마우스에서 HIF-1α의 맥락막 발현을 억제하였고, 이에 따라 VEGF-A 발현 역시 감소하였으며, pho-cKIT 발현 역시 감소됨을 확인하였다(도 1).
실시예 3: NN2101은 Aflibercept와 달리 저산소 HRMEC(인간 망막 미세혈관 내피 세포)에서 HIF-1α를 완전히 억제한다.
저산소 상태에서는 HIF-1α가 발현되고, HIF-1α는 다시 SCF, VEGF 등을 포함한 혈관형성 인자의 발현을 자극하며, 이에 따라 SCF/cKIT 및 VEGF 신호전달 기전이 각각 활성화된다. 본 실시예에서는 NN2101이 CoCl2로 유도된 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현을 억제하는지를 확인하고자 하였다.
HRMEC (Cell Systems, Kirkland, WA, USA)를 0.5% FBS를 포함하는 EBM (Lonza, Walkersville, MD, USA) 과 함께 밤새 배양한 후, 다음과 같이 처리하였다. HRMEC를 NN2101 10 μg/ml 또는 Eylea (Bayer korea Ltd., Seoul, Korea) 10 μg/ml로 6시간 동안 전처리한 다음 2 시간 동안 100 μM의 CoCl2로 추가 처리하여 저산소상태를 유발하였다. 전체 세포 용해물에서 단백질 수준의 발현은 웨스턴 블롯팅(도 2a)에 의해 분석되었다. 배양 상층액으로 분비된 sSCF (도 2b 및 2c, 왼쪽) 및 sVEGF (도 2b 및 2c, 오른쪽)를 ELISA로 정량화하였다.
상기 분석 결과, NN2101은 CoCl2로 유도된 저산소 상태에서 HIF-1α 발현을 억제하였고, 이에 따라 SCF 및 VEGFA의 발현 역시 현저히 감소되었으며, pho-cKIT의 signal이 차단됨을 확인하였다. 반면, Eylea는 HIF-1α 수준에 영향을 미치지 않았다.
실시예 4: NN2101은 저산소 조건에서 SCF의 존재 하에 HIF-1α의 발현 및 GSK-3β의 인산화를 조절한다.
실시예 3과 마찬가지로, 본 실시예에서도 NN2101이 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현을 억제하는지를 살펴보고자 하였다. 또한 GSK-3β의 활성화는 angiogenesis에 기여하는데, GSK-3β 인산화는 SCF/c-KIT signaling에 의해 조절되므로, GSK-3β 인산화 정도를 확인하여 SCF/c-KIT 신호전달 기전 활성화 여부를 확인하고자 하였다.
HRMEC를 0.5% FBS를 포함하는 EBM과 함께 밤새 배양한 후, 다음과 같이 처리하였다. HRMEC를 NN2101(1 또는 10 μg/ml) 또는 Eylea(1 또는 10 μg/ml)로 6 시간 동안 전처리한 후 100 μM의 CoCl2 또는/및 100 ng/ml의 SCF로 추가 처리하였다. 2시간 동안 전체 세포 용해물에서 단백질 수준의 발현은 웨스턴 블롯팅(도 3a)에 의해 분석되었다. 배양 상층액으로 분비된 sSCF (도 3b, 위) 및 VEGF(도 3b, 아래)를 ELISA로 정량화하였다.
상기 분석 결과, NN2101은 저산소 및 SCF 존재 하에서 HIF-1α의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰고, 이에 따라 SCF 및 VEGFA의 발현 역시 현저히 감소되었으며, 인산화로 인한 cKIT의 활성화가 차단되며(phospho-cKIT의 발현 감소), 이의 하위 신호물질인 GSK-3β의 인산화 역시 억제됨을 확인하였다.
실시예 5: NN2101은 HIF-1α의 단백질 발현을 빠르게 억제한다.
HRMEC를 0.5% FBS를 포함하는 EBM과 함께 밤새 배양한 후, 다음과 같이 처리하였다. 각 플레이트에 HRMEC를 6시간 동안 10 μg/ml의 NN2101로 전처리한 후 각각 0.5, 6, 12, 또는 18h만큼 1% O2를 노출시켜 저산소 상태를 유발하였다. 전체 세포 용해물의 단백질 수준 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다(도 4).
상기 분석 결과, HIF-1α, VEGFA, mSCF, pho-cKIT의 단백질 발현은 저산소 상태에서 NN2101 처리에 의해 유의하게 감소되었음을 확인하였다.
실시예 6: NN2101은 HRMEC에서 HIF-1α 표적 유전자의 mRNA 발현을 하향 조절한다.
저산소 상태에서 HIF-1α 발현시, VEGF, GLUT1, GLUT3 등의 단백질이 함께 발현됨이 알려져 있다. 이에 본 실시예에서는 위 표적 단백질의 mRNA 발현량을 확인함으로써 NN2101에 의한 HIF-1α 발현 억제 여부를 확인하고자 하였다.
HRMEC를 0.5% FBS를 포함하는 EBM과 함께 밤새 배양한 후, 다음과 같이 처리하였다. HRMEC를 NN2101 또는 Eylea (각각 1, 10 또는 20 μg/ml)로 6시간 동안 전처리한 다음, 2 시간 동안 100 μM의 CoCl2로 추가 처리하여 저산소 상태를 유발하였다(도 5a).
별도로, 실제 저산소 농도에서의 HIF1a의 유도를 확인하기 위해, HRMEC를 6시간 동안 10 μg/ml의 NN2101로 전처리한 후, 6h 또는 12h 동안 1% O2로 추가 노출을 가했다(도 5b). mRNA 발현 수준을 실시간 PCR로 분석하였다.
상기 분석 결과, HRMEC에서 저산소 상태에서 NN2101 처리에 의해 HIF-1α 발현의 표적 단백질인 VEGFA, GLUT1 또는 GLUT3의 mRNA 수준이 하향 조절되었음을 확인하였다. 반면, Eylea는 VEGFA의 mRNA 수준은 약간 감소시켰으나, 다른 표적 단백질인 GLUT1 또는 GLUT3의 발현은 거의 조절하지 못하였다.
실시예 7: NN2101은 망막 색소 상피(RPE) 세포에서 HIF-1α 표적 유전자의 발현을 유의하게 억제한다.
ARPE-19 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 세포를 1% FBS를 함유하는 DMEM-F12와 함께 밤새 배양하였다. 세포를 NN2101 10 μg/ml 또는 Eylea 10 μg/ml로 6시간 동안 전처리한 다음, 저산소증을 유도하기 위해 50 및 100 μM CoCl2 (도 6a)로 추가 처리하거나, 또는 각 플레이트를 0.5h, 6h, 또는 12h 동안 1% O2에 노출(도 6b)시켜 저산소 상태를 유발하였다.
상기 분석 결과, HIF-1α 표적 유전자의 단백질(도 6a) 및 HIF-1α의 표적 유전자 mRNA(도 6b) 수준은 RPE 세포의 저산소 상태에서 NN2101 처리에 의해 조절되었음을 확인하였다.
실시예 8: 주요 망막 세포에서 NN2101은 Eylea와 비교하여 실제 저산소 상태(1% O2)에서 HIF-1 α및 VEGFA 등의 발현을 억제한다.
4개의 망막 세포; HRMEC (Human retinal microvascular endothelial cell), ARPE19 (spontaneoulsy arising retinal pigment epithelial cell), MIO-M1 (Moorfields /Institute of Ophthalmology-Mueller 1; spontaneoulsy immortalized human Mueller glia cell line) 및 Y79(photoreceptor cell)를 선택하여 다음과 같이 배양하였다. HRMEC는 EBM과 함께 밤새 인큐베이션하였다. ARPE19 세포를 DMEM/F12와 함께 밤새 인큐베이션하였다. MIO-M1 세포(Mueller glial)를 DMEM과 함께 밤새 배양하였다. MIO-M1는 G. Astrid Limb 교수(Institute of Ophthalmology, University College London, 런던, 영국)로부터 제공받았다. Y79 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) 세포를 RPMI1640과 함께 밤새 인큐베이션하였다.
위 4개 세포를 지시된 조합으로 처리하였다. 세포를 NN2101 항체 (10 μg/ml) 또는 Eylea (10 μg/ml)로 6시간 동안 전처리한 다음, 1% O2에 18 시간 동안 추가로 저산소에 노출시켰다. 전체 세포 용해물의 단백질 수준 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다(도 7).
상기 분석 결과, 주요 망막 세포주에서 HIF-1α의 발현은 NN2101 처리에 의해 조절되었고, 이에 따라 SCF 및 VEGFA의 발현 역시 현저히 감소되었으며, pho-cKIT의 signal이 차단됨을 확인하였다. 반면, Eylea는 HIF-1α, mSCF, VEGFA, phospho-cKIT 수준에 영향을 미치지 않았다.
실시예 9: NN2101은 Uniquitin-Proteasome Degradation Pathway를 통해 HIF-1α의 분해를 촉진한다.
<실시예 9-1>
HIF-1α는 정상 산소 상태에서는 prolyl hydroxylase (PHD)에 의해 hydroxylate된 후 pVHL-매개 유비퀴틴화(ubiquitination) 과정을 통해 프로테아좀에 의해 분해된다. 저산소 상태에서는, hydroxylation이 억제되어 핵 내로 들어간 HIF-1α는 HIF-1β와 dimerization되어 혈관신생 등을 촉진하는 타겟 유전자의 전사발현을 촉진시키게 된다. 본 실시예에서는 NN2101이 HIF-1α의 Uniquitin-Proteasome Degradation pathway를 통해 단백질 발현에 관여하는지 여부를 확인하고자 하였으며, 이를 위해 대표적인 Proteasomal inhibitor인 MG132 (S2619, Selleckchem, Houston, USA)와, mRNA로부터 단백질로의 신생 합성 과정을 억제하는 cyclohexamide (CHx) (S7418, Selleckchem, Houston, USA)를 각각 사용하였다.
HRMEC를 0.5% FBS를 함유하는 EBM과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 NN2101(10 ㎍ /ml) 로 6시간 동안 전처리한 후, 50 μM의 CoCl2로 12시간 동안 추가 처리하여 저산소 상태를 유도하였다. 처리가 끝나면 표시된 기간 동안 MG132 또는 CHx 10 μmol/L를 각각 첨가하였다. 세포 내 HIF-1α의 단 전체 백질 발현 양을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 각 단백질 밴드의 밀도는 이미지 분석 시스템으로 결정되었고 해당 α- 튜불린의 밀도로 정규화되었다.
분석 결과, CoCl2로 저산소 상태를 유도하여 증가되어진 HIF-1α의 양이(도 8a, 2번째 lane), NN2101처리를 통해 감소된 것을 확인하였다(도 8a, 4번째 lane). 이렇게 감소된 HIF-1α는 Preoteasomal inhibitor인 MG132 처리를 통해, vehicle 처리군과 동일한 수준으로 다시 복구되었다(도 8a, 3번째 lane vs 5번째 lane). MG132의 처리를 통해, NN2101 처리를 통해 동일한 수준으로 HIF-1α이 환원된 것을 통해, 이는 NN2101이 HIF-1α의 Uniquitin-Proteasome pathway에 관여함을 시사한다.
또한 단백질의 합성을 억제하는 CHx 처리를 통해, HIF-1α의 반감기를 측정하여 보았다. 대조군 (Vehicle)에서의 반감기 기울기(도 8b 아래; 동그라미)에 비해 NN2101처리군의 기울기가 급격함을 확인하였다(도 8b 아래; 네모). 이는 NN2101이 HIF-1α의 단백질 분해 속도를 가속화시킴을 시사한다(도 8b).
<실시예 9-2>
본 실시예에서는 HUVEC (Lonza, Walkersville, MD, USA) 세포를 PHD을 과발현하여 NN2101과 HIF-1α의 degradation 관련성을 확인하고자 하였다.
이를 위해 HUVEC 세포를 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP)가 부착된 3가지 isotype의 PHD, 즉, GFP-PHD1, GFP-PHD2 및 GFP-PHD3을 인코딩하는 발현 벡터를 이용해 과발현하였다. 형질감염된 세포를 12시간 동안 표시한 대로 10 μg NN2101처리와 동시에 저산소 상태 또는 정상산소 상태에서 각각 인큐베이션하였다. 세포를 수확하기 전에 3시간 동안 10 μmol/L의 MG132로 처리하거나 처리하지 않았다. 전체 세포 용해물에서 선택적으로 HIF-1α을 면역침전(IP)시키고, 이어서 웨스턴 블롯팅으로 과발현된 PHD에 결합된 HIF-1α (HIF-1α-PHD)를 분석하였다(도 9).
분석 결과, 정상 산소 상태에서 proteasomal inhibitor인 MG132만을 단독으로 처리한 경우에는 HIF-1α-PHD의 양이 증가하였으나(도 9의 각각 1번째 lane), 저산소 상태에서는 HIF-1α-PHD가 거의 검출되지 않았다(도 9의 각각 2번째 lane). 이에 반해 저산소 상태에서 NN2101 존재시에는 HIF-1α-PHD의 양이 증가함을 확인하였다(도 9의 각각 3번째 lane). 이 결과 역시 NN2101이 저산소 상태에서 HIF-1α의 Uniquitin-Proteasomal degradation에 관여함을 시사한다.
실시예 10: NN2101은 주요 망막 세포의 저산소 상태에서 HIF 표적 유전자를 포함한 pro-angiogenesis / inflammation factors의 상향조절을 감소시킨다.
4개의 망막 세포 HRMEC (Human retinal microvascular endothelial cell), ARPE19 (spontaneoulsy arising retinal pigment epithelial cell), MIO-M1 (Moorfields /Institute of Ophthalmology-Mueller 1; spontaneoulsy immortalized human Mueller glia cell line) 및 Y79(photoreceptor cell)를 선택하여 다음과 같이 배양하고 처리하였다.
HRMEC를 0.5% FBS가 포함된 EBM과 함께 밤새 배양하고 세포를 NN2101 항체 또는 Eylea(10μg/ml)로 6시간 동안 전처리한 후 100μM의 CoCl2로 18시간 동안 추가 처리하였다. 배양 상층액을 프로테옴 프로파일러로 분석하고 정량화했다. 상기 분석 결과, NN2101은 저산소상태에서 HRMEC에서 증가되는 혈관신생/염증 인자를 조절하는 것을 확인하였다(도 10).
ARPE19 세포를 0.5% FBS를 함유한 DMEM/F12로 밤새 배양하고 세포를 NN2101 mAb 또는 Eylea(10 μg/ml) 로 6 시간 동안 전처리한 후, 100μM의 CoCl2로 추가 처리하였다. 18시간 배양 상층액을 프로테옴 프로파일러로 분석하고 정량화하였다. 상기 분석 결과, NN2101은 저산소상태에서 RPE에서 증가되는 혈관신생/염증 인자를 조절하는 것을 확인하였다(도 11).
MIO-M1 세포를 0.5% FBS를 포함하는 DMEM과 함께 밤새 배양하고 세포를 NN2101 mAb 또는 Eylea(10 μg/ml)로 6시간 동안 전처리한 후 100 μM의 CoCl2 로 추가 처리하였다. 18시간 배양 상층액을 프로테옴 프로파일러로 분석하고 정량화하였다. 상기 분석 결과, NN2101은 저산소상태에서 MIO-M1 세포에서 증가되는 혈관신생/염증 인자를 조절함을 확인하였다(도 12).
Y79 세포를 0.5% FBS를 함유하는 RPMI1640과 함께 밤새 인큐베이션하고 세포를 NN2101 mAb 또는 Eylea(10 ㎍/ml)로 6시간 동안 전처리한 다음, 18시간 동안 100 μM의 CoCl2로 추가 처리하였다. 배양 상층액을 프로테옴 프로파일러로 분석하고 정량화하였다. 상기 분석 결과, NN2101은 저산소상태에서 Y79 세포에서 증가되는 혈관신생/염증 인자를 조절함을 확인하였다(도 13).
상기 분석 결과, NN2101은 각각의 세포에서 저산소상태에서 유래되는 혈관신생/염증 인자를 조절하는 것을 확인하였다(도 10 내지 13). 특히 NN2101은 Angiopoietin-2와 VEGF를 동시에 감소시켰고, 그 이외의 혈관 신생인자들을 조절하였는데, 이는 Angiopoietin-2와 VEGF을 동시에 target하는 faricimab과 동등하거나 그보다 우수한 효과를 나타낼 것임을 시사한다.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (19)

  1. 하기의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제에 의한, 기존 안 질환 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환의 예방 또는 치료 방법:
    (i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
    (ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
    (iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
    (iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
    (v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
    (vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 안 질환은 망막 또는 황반 질환인 것을 특징으로 하는, 안 질환의 예방 또는 치료 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 망막 또는 황반 질환은 맥락막 혈관 신생, 황반병증, 망막병증, 망막세포변성, 망막혈관폐쇄, 망막박리 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 안 질환의 예방 또는 치료 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 망막 또는 황반 질환은 당뇨병성 망막병증 (Diabetic Retinopathy), 당뇨병성 황반부종(Diabetic Macular Edema), 습성 황반변성(wet Age-related Macular Degeneration), 망막정맥폐쇄(Retinal Vein Occlusion), 미숙아망막증(Retinopathy of Prematurity) 및 녹내장(Glaucoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 질환인 것을 특징으로 하는, 안 질환의 예방 또는 치료 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 기존 안 질환 치료제는 VEGF 억제제인, 안 질환의 예방 또는 치료 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 기존 안 질환 치료제는 애플리버셉트(aflibercept), 라니비주맙(ranibizumab), 서스비모(Susvimo)®, 베바시주맙(bevacizumab), 브롤루시주맙(brolucizumab), 페갑타닙(pegaptanib), 파리시맙(faricimab), 및 KSI-301로 이루어지는 군으로부터 선택된 것인, 안 질환의 예방 또는 치료 방법.
  7. 하기의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법:
    (i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
    (ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
    (iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
    (iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
    (v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
    (vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제는 맥락막 또는 망막 내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제는 시신경 세포, 망막 뮐러(Mueller) 세포, 맥락막 세포, 망막 미세혈관 내피 세포(RMEC), 망막 색소 상피(RPE) 세포 및 광수용체 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 HIF-1α의 발현 억제는 HIF-1α의 단백질 발현 억제인 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 상기 HIF-1α의 발현 또는 활성 억제는 HIF-1α 단백질의 분해를 촉진하여 달성되는 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 HIF-1α의 활성 억제는 SCF/C-Kit 유도 인산화에 의한 HIF-1α의 활성을 억제하여 달성되는 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  14. 제 7 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가적으로 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자를 조절하는 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자는 엔지오제닌(Angiogenin), 엔지오포이에틴-2(Angiopoietin-2), CXCL16, 엔도글린(Endoglin), 응고인자 III (Coagulation Factor III), 엔도테린-1(Endotherin-1), MCP-1, EG-VEGF, VEGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IL-1β, PDGF-AA, PIGF, 세르핀 E(Serpin E), 세르핀 F1(Serpin F1), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), ANGPT2, 펜트라신 3(Pentraxin 3), IL-8, FGF2 및 FGF5으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 인자인 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 혈관신생 인자 및/또는 염증 인자 발현의 상향 조절을 감소시키는 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  17. 제 7 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 미세혈관 세포의 증식, 이동(migration) 및 관 형성(tube formation)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 감소시키는 것을 특징으로 하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제 방법.
  18. 하기의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는, HIF-1α의 발현 또는 활성 억제에 의한, 기존 안 질환 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
    (i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
    (ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
    (iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
    (iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
    (v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
    (vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
  19. HIF-1α의 발현 또는 활성 억제에 의해, 기존 안 질환 치료제에 불응성이거나 또는 무반응성인 안 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 하기의 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터의 용도:
    (i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR1;
    (ii) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR2;
    (iii) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 경쇄 CDR3;
    (iv) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR1;
    (v) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR2; 및
    (vi) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열의 중쇄 CDR3.
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