WO2024004675A1 - 肝臓癌の発症可能性を検査する方法 - Google Patents

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貞嗣 坂根
徹郎 竹原
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to a method of testing the possibility of developing liver cancer.
  • Liver cancer is a malignant tumor that affects approximately 40,000 people and causes 25,000 deaths annually in Japan. Most people who develop liver cancer have some kind of chronic liver disease, and treatment of chronic liver disease is important for improving the prognosis of liver cancer patients. New therapeutic drugs have made it possible to eliminate the virus in many patients with chronic hepatitis C, but liver carcinogenesis still occurs in some cases even after the virus has been eliminated. Although there are multiple therapeutic drugs for chronic hepatitis B, there are cases in which liver cancer develops even when the drugs are taken orally. For cases of non-alcoholic fatty liver disease and alcoholic liver damage, there is still no treatment other than weight loss and alcohol abstinence, and there are still cases in which liver cancer develops even after weight loss and alcohol abstinence.
  • Non-Patent Document 1 ⁇ -fetoprotein, AST, ALT, platelets, and FIB4-index calculated from age have been reported as cancer prediction markers, their diagnostic ability is not sufficient (Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a method for testing the possibility of developing liver cancer.
  • the present inventors have discovered that (1) at least one species selected from the group consisting of Fibulin 3, GPNMB, Fibulin 3 mRNA, and GPNMB mRNA in a biological sample collected from a subject; It has been found that the above problems can be solved by a method for testing the possibility of developing liver cancer, which includes a step of detecting a target molecule.
  • the present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this knowledge. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 The possibility of developing liver cancer, including the step of detecting at least one target molecule selected from the group consisting of Fibulin 3, GPNMB, Fibulin 3 mRNA, and GPNMB mRNA in a biological sample collected from a subject. How to inspect.
  • the step (1) is (1a) a step of bringing a binding molecule for the target molecule into contact with the biological sample; and (1b) a step of measuring the amount or concentration of the target molecule bound to the binding molecule.
  • the method according to item 1, comprising:
  • the step (2) is (2a) determining that the subject has a high possibility of developing liver cancer when the amount or concentration of the target molecule detected in step (1) is equal to or higher than a cutoff value, and/or ( 2b) If the amount or concentration of the target molecule detected in step (1) is below a cutoff value, the method according to item 3 includes the step of determining that the subject has a low possibility of developing liver cancer. Method described.
  • Section 5 The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the subject is a subject with chronic liver disease.
  • Section 6 The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the target molecule is at least one selected from the group consisting of Fibulin 3 and GPNMB.
  • Section 7 The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the biological sample is a body fluid or a sample derived from a body fluid.
  • Section 8. 8 The method according to item 7, wherein the body fluid is at least one selected from the group consisting of whole blood, serum, and plasma.
  • Section 9 The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the subject is a human.
  • Section 10 A test drug for the possibility of developing liver cancer, which contains a binding molecule for at least one target molecule selected from the group consisting of Fibulin 3, GPNMB, Fibulin 3 mRNA, and GPNMB mRNA.
  • Section 11 Use of a molecule binding to at least one target molecule selected from the group consisting of Fibulin 3, GPNMB, Fibulin 3 mRNA, and GPNMB mRNA for the production of a test agent for the possibility of developing liver cancer.
  • Section 12 Use of a molecule binding to at least one target molecule selected from the group consisting of Fibulin 3, GPNMB, Fibulin 3 mRNA, and GPNMB mRNA as a test agent for the possibility of developing liver cancer.
  • Section 13 A molecule that binds to at least one target molecule selected from the group consisting of Fibulin 3, GPNMB, Fibulin 3 mRNA, and GPNMB mRNA for use in testing the possibility of developing liver cancer.
  • a method for testing the possibility of developing liver cancer can be provided.
  • the cumulative liver carcinogenesis rate of all patients with non-alcoholic fatty liver disease in Test Example 1 is shown. Serum Fibulin3 values in each patient group in Test Example 1 are shown. F0 to F4 indicate the stages of fibrosis. Non-HCC indicates a non-carcinogenic group, and HCC indicates a carcinogenic group. **** p ⁇ 0.0001, ** p ⁇ 0.01.
  • the cumulative liver carcinogenesis rate of each of the two groups (145 people below 9.0 ⁇ g/mL, 25 people over 9.0 ⁇ g/mL) classified by serum Fibulin3 value in Test Example 1 is shown.
  • the cumulative liver carcinogenesis rate after chronic hepatitis C SVR in Test Example 2 is shown.
  • the distribution of serum Fibulin3 values before chronic hepatitis C treatment in Test Example 2 is shown. Serum Fibulin3 values in each patient group in Test Example 2 are shown. F0 to F4 indicate the stages of fibrosis. Non-HCC indicates a non-carcinogenic group, and HCC indicates a carcinogenic group. **** p ⁇ 0.0001, *** p ⁇ 0.001. The cumulative liver carcinogenesis rate of each of the two groups (348 people below 15.0 ⁇ g/mL, 122 people over 15.0 ⁇ g/mL) classified by serum Fibulin3 value in Test Example 2 is shown.
  • the cumulative liver carcinogenesis rate of each of the two groups (15.4 ⁇ g/mL or less, more than 15.4 ⁇ g/mL) classified by serum GPNMB value in Test Example 4 is shown.
  • the results of calculating AUROC based on the time-dependent ROC curve for each of the serum Fibulin3 value and FIB-4 index in Test Example 5 are shown.
  • 476 patients overall, 120 patients with advanced fibrosis, and 120 patients with FIB-4 index 2.67 or higher each of the two groups classified by Fibulin3 value (6.7 ⁇ g/mL or higher and lower than 6.7 ⁇ g/mL) Cumulative liver carcinogenesis rate is shown.
  • the present invention provides a method for testing the possibility of developing liver cancer .
  • (1) Fibulin 3, GPNMB, Fibulin 3 mRNA and GPNMB mRNA in a biological sample collected from a subject A method for testing the possibility of developing liver cancer (herein referred to as "the target molecule of the present invention"), which includes the step of detecting at least one kind of target molecule (herein sometimes referred to as “the target molecule of the present invention”). (It may also be referred to as “the inspection method of the present invention.”). This will be explained below.
  • liver cancer to be examined is not particularly limited, and includes hepatocellular carcinoma, cholangiocellular carcinoma, and the like. As liver cancer, hepatocellular carcinoma is preferable. Liver cancer includes all classes, grades, and stages of liver cancer according to various classification standards regarding progression, status, etc.
  • the subject may be any mammal, but is preferably a mammal with chronic liver disease.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs; experimental animals such as rabbits; pets such as dogs and cats; livestock such as cows, pigs, goats, horses, and sheep; monkeys, orangutans, and Examples include primates such as chimpanzees and humans, with humans being particularly preferred.
  • Chronic liver disease includes, but is not limited to, viral hepatitis and fatty liver disease.
  • Viral hepatitis includes, but is not limited to, hepatitis C and hepatitis B.
  • Fatty liver disease includes, but is not limited to, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and secondary fatty liver disease.
  • NAFLD includes non-alcoholic fatty liver (NAFL) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • Subjects in the present invention include chronic liver disease patients whose risk of developing liver cancer needs to be evaluated.
  • Subjects of the present invention include, but are not limited to, subjects after SVR in hepatitis C, subjects under nucleic acid analog (NUC) administration in hepatitis B, and subjects suffering from NAFLD.
  • NUC nucleic acid analog
  • fatty liver disease non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), non-alcoholic fatty liver (NAFL) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH), NAFLD/NASH Clinical Practice Guidelines 2020 (Japanese Gastrointestinal Edited by the Medical Society and the Japan Society of Hepatology, revised 2nd edition, published November 2020, Nankodo (https://www.jsge.or.jp/guideline/guideline/pdf/nafldnash2020.pdf)), English version (Tokushige) , K. et al. HepatologyResearch.2021;51:1013-1025. and Tokushige, K. et al. Journal of Gastroenterology 2021;56: 951-963.).
  • NAFLD/NASH NAFLD/NASH Clinical Practice Guidelines 2020 (Japanese Gastrointestinal Edited by the Medical Society and the Japan Society of Hepatology, revised 2nd edition, published November 2020, Nankodo (https://www.j
  • tests to check for the development of liver cancer from viral chronic hepatitis, fatty liver disease, and other liver diseases include the Liver Cancer Treatment Guidelines (edited by the Japanese Society of Hepatology, 2017 edition, supra). Follow definitions from authoritative liver cancer experts, without limitation.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it can contain the target molecule of the present invention.
  • biological samples include body fluids such as whole blood, serum, plasma, follicular fluid, menstrual blood, saliva, cerebrospinal fluid, joint fluid, urine, tissue fluid, sweat, tears, saliva, and samples derived from these body fluids.
  • the biological sample may be a biological tissue, preferably a liver tissue, or a sample derived from these tissues.
  • Samples derived from body fluids/tissues are not particularly limited as long as they are samples prepared from body fluids/tissues, for example, samples obtained from body fluids/tissues by concentrating or purifying proteins or nucleic acids contained in the body fluids/tissues. Examples include samples.
  • the body fluid includes whole blood, serum, plasma, and the like.
  • One type of biological sample may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • a biological sample can be collected from a subject by methods known to those skilled in the art.
  • whole blood can be collected by blood collection using a syringe or the like.
  • the blood sampling be performed by a medical worker such as a doctor or nurse.
  • Serum is a portion of blood from which blood cells and specific blood coagulation factors have been removed, and can be obtained, for example, as a supernatant after blood has been coagulated.
  • Plasma is a portion of blood from which blood cells have been removed, and can be obtained, for example, as a supernatant when blood is subjected to centrifugation under conditions that do not cause clotting.
  • Fibulin 3 gene is known, and in the case of humans, for example, the gene NCBIGene ID:2202 is the Fibulin 3 gene.
  • Fibulin 3 genes of other biological species can also be easily identified according to known information and/or based on identity analysis with the amino acid and/or nucleotide sequences of known Fibulin 3 genes.
  • the amino acid sequence of Fibulin 3 can be easily identified according to known information and/or based on identity analysis with known Fibulin 3 amino acid sequences.
  • An example of the amino acid sequence of human Fibulin 3 is the amino acid sequence shown in NCBI Reference No. NP_001034437.1.
  • the base sequence of Fibulin 3 mRNA can be easily identified according to known information and/or based on identity analysis with known Fibulin 3 mRNA base sequences.
  • An example of the nucleotide sequence of human Fibulin 3 mRNA is the nucleotide sequence shown in NCBI Reference No. NM_001039348.1.
  • the GPNMB gene is known, and in the case of humans, for example, the gene NCBIGene ID:10457 is the GPNMB gene.
  • GPNMB genes of other biological species can also be easily identified according to known information and/or based on identity analysis with amino acid sequences and/or nucleotide sequences of known GPNMB genes.
  • the amino acid sequence of GPNMB can be easily identified according to known information and/or based on identity analysis with known GPNMB amino acid sequences.
  • An example of the amino acid sequence of human GPNMB is the amino acid sequence shown in NCBI Reference No. NP_001005340.2.
  • the base sequence of GPNMB mRNA can be easily identified according to known information and/or based on identity analysis with known GPNMB mRNA base sequences. Examples of the nucleotide sequence of human GPNMB mRNA include the nucleotide sequence shown in NCBI Reference No. NM_001005340.1.
  • the target molecule of the present invention which is the detection target in step (1), includes isoforms and those containing mutations observed between individuals.
  • the method for detecting the target molecule of the present invention preferably the method of measuring the amount or concentration of the target molecule of the present invention
  • the method is capable of detecting the target molecule.
  • examples of such methods include immunoassay. Immunoassays can be widely employed, regardless of direct method, indirect method, homogeneous method, heterogeneous method, competitive method, non-competitive method, etc.
  • immunoassays include, for example, ELISA (e.g., direct method, indirect method, sandwich method, competitive method, etc.), radioimmunoassay (RIA), immunoradiometric assay (IRMA), enzyme immunoassay (EIA), sandwich EIA, Examples include immunochromatography, Western blot, immunoprecipitation, slot or dot blot assay, immunohistological staining, fluorescent immunoassay, immunoassay using avidin-biotin or streptavidin-biotin system, and immunoassay using surface plasmon resonance (SPR) method.
  • ELISA e.g., direct method, indirect method, sandwich method, competitive method, etc.
  • RIA radioimmunoassay
  • IRMA immunoradiometric assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • sandwich EIA sandwich EIA
  • Examples include immunochromatography, Western blot, immunoprecipitation, slot or dot blot assay, immunohistological staining
  • a labeled antibody is directly or indirectly contacted with a binding molecule for the target molecule of the present invention bound to the target molecule of the present invention, and a signal derived from the label of the bound labeled antibody is detected.
  • a signal derived from the label of the bound labeled antibody is detected.
  • the labeled antibody used in this case or the antibody that mediates the binding molecule to the target molecule of the present invention or the target molecule of the present invention between the labeled antibody and the target molecule of the present invention is not particularly limited, and includes, for example, an antibody against an antibody constant region, an anti-idiotype antibody, etc. etc. can be used.
  • the type of label in the label (eg, labeled antibody, etc.) used when detecting the target molecule of the present invention, which is a protein, is not particularly limited.
  • the label include fluorescent substances, luminescent substances, dyes, enzymes, colloidal gold, and radioactive isotopes.
  • enzyme labels such as peroxidase and alkaline phosphatase are preferred from the viewpoints of safety, economic efficiency, detection sensitivity, and the like.
  • the method of detecting the target molecule of the present invention preferably the method of measuring the amount or concentration of the target molecule of the present invention
  • the method is capable of detecting the target molecule of the invention.
  • examples of such methods include Northern blotting, RNase protection assay, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) (Weis JH et al., Trends in Genetics 1992;8:263-264.); quantitative real-time RT. - PCR method (Held CA et al., Genome Research 1996;6:986-994.) etc. can be used.
  • binding molecules eg, primers, probes, etc.
  • Primer pairs and probes can be synthesized based on the nucleotide sequence of the target molecule mRNA of the present invention.
  • the base lengths of the primers and probes are not particularly limited.
  • the base length of each primer can be 10 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides.
  • the base length of the probe can range from 10 nucleotides to the full length of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the mRNA of the target molecule of the present invention, preferably 20 to 150 nucleotides.
  • the primer pair and probe may be a natural nucleic acid such as RNA or DNA, or may be a combination of a natural nucleic acid and a chemically modified nucleic acid or a pseudo-nucleic acid, if necessary.
  • chemically modified nucleic acids and pseudonucleic acids include PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid; registered trademark), methylphosphonate type DNA, phosphorothioate type DNA, 2'-O-methyl type RNA, and the like.
  • the primers and probes may also contain fluorescent and/or quencher substances, labeling substances such as radioisotopes (e.g.
  • biotin or (strept)avidin or magnetic beads. It may be labeled or modified using a modifier.
  • the labeling substance is not limited, and commercially available ones can be used. For example, in the case of fluorescent substances, FITC, Texas, Cy3, Cy5, Cy7, Cyanine3, Cyanine5, Cyanine7, FAM, HEX, VIC, fluorescamine and its derivatives, rhodamine and its derivatives, etc. can be used. If it is a quencher substance, AMRA, DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, or BHQ-3, etc. can be used.
  • the labeling position of the labeling substance in the primer and probe may be determined as appropriate depending on the characteristics of the modifier and the purpose of use. Generally, the 5' or 3' end is often modified. Further, one primer and probe molecule may be labeled with one or more kinds of labeling substances.
  • the design of the nucleotide sequences of primers and probes and the selection of labeling substances are well known and can be found in molecular biology books such as Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) by Sambrook, J and Russell, DW. This is disclosed in the experimental protocol.
  • One detection method may be used alone, or two or more detection methods may be used in combination.
  • step (1) preferably includes (1a) contacting the biological sample with a binding molecule for the target molecule of the present invention, and (1b) contacting the target molecule bound to the binding molecule of the present invention. measuring the amount or concentration of the molecule.
  • the binding molecule for the target molecule of the present invention is not particularly limited as long as it selectively (specifically) recognizes the target molecule of the present invention.
  • "selectively (specifically) recognize” means that the target molecule of the present invention can be specifically detected, for example, by Western blotting, ELISA, etc., but is not limited thereto. Any detection substance that can be determined by a person skilled in the art to be derived from the target molecule of the present invention may be used.
  • Molecules capable of binding to the target molecule of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, and the above-mentioned molecules having antigen-binding properties, such as Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries. Molecules that include portions of antibodies are included.
  • a binding molecule for the target molecule of the present invention that has antigen-binding ability to a polypeptide consisting of at least consecutive amino acids, usually 8 amino acids, preferably 15 amino acids, and more preferably 20 amino acids, of the target molecule of the present invention is also included. , included in the binding molecules for the target molecule of the present invention.
  • an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the molecule immunizes a non-human animal such as a domestic rabbit, and obtain it from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • a non-human animal such as a mouse is immunized with the target molecule of the present invention expressed in Escherichia coli etc. and purified according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the target molecule of the present invention. It can be obtained from hybridoma cells prepared by fusing the obtained spleen cells with myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Published by John Wiley and Sons. Section 11.4 ⁇ 11.11).
  • the target molecule of the present invention which is used as an immunizing antigen to produce a binding molecule for the target molecule of the present invention, can be prepared by DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into a host, and transformation based on known gene sequence information. It can be obtained by culturing the body and recovering the protein from the culture. These operations are performed according to methods known to those skilled in the art or methods described in literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). It can be done by
  • a recombinant DNA capable of expressing the gene encoding the target molecule of the present invention in a desired host cell is prepared, this is introduced into the host cell, and the transformant is transformed.
  • the target protein By culturing and collecting the target protein from the resulting culture, it is possible to obtain a protein as an immunizing antigen for producing a molecule binding to the target molecule of the present invention.
  • the partial peptide of the target molecule of the present invention can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to known gene sequence information.
  • the binding molecule for the target molecule of the present invention may be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the target molecule of the present invention.
  • the oligo(poly)peptide used for producing a molecule binding to the target molecule of the present invention does not need to have functional biological activity, but may have immunogenic properties similar to the target molecule of the present invention. It is desirable that the Preferably, oligo(poly)peptides having this immunogenic property and consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, and more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the target molecule of the present invention can be exemplified.
  • Molecules that bind to such oligo(poly)peptides to the target molecules of the present invention can also be produced by enhancing the immunological response using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface adjuvants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. It includes the active substance and human adjuvants such as BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.
  • the mode of contact in step (1a) is not particularly limited, and an appropriate mode can be selected depending on the type of the above-mentioned method for detecting the target molecule of the present invention (for example, various immunoassays, etc.).
  • Examples of the contact mode include, for example, a mode in which either the protein (antigen) in the biological sample or the binding molecule for the target molecule of the present invention is contacted with only one of them fixed on a solid phase, and a mode in which both of these are fixed on a solid phase. Examples include a mode in which the contact is made in a state where the contact is not performed.
  • step (1a) there is preferably an embodiment in which at least one of them is brought into contact with the solid phase while being fixed to the solid phase.
  • step (1a) when only one of the two is immobilized on the solid phase, it is preferable to wash the solid phase after immobilization.
  • the solid phase is not particularly limited as long as it can immobilize the target molecule of the present invention or a molecule binding to the target molecule of the present invention.
  • the solid phase include plates, slides, and membranes containing polystyrene, glass, nitrocellulose, etc. as a main component.
  • the solid phase is coated with a component to more easily immobilize the target molecule of the present invention or a molecule binding to the target molecule of the present invention, such as a highly reactive compound (for example, a compound having a highly reactive group, a gold colloid, etc.). It may be something that has been done.
  • Examples of compounds having easily reactive groups include groups that can form covalent bonds with proteins, such as (1H-imidazol-1-yl) carbonyl group, succinimidyloxycarbonyl group, epoxy group, and aldehyde group. , amino group, thiol group, carboxyl group, azide group, cyano group, active ester group (1H-benzotriazol-1-yloxycarbonyl group, pentafluorophenyloxycarbonyl group, paranitrophenyloxycarbonyl group, etc.), or halogen Examples thereof include compounds having a carbonyl group (a carbonyl chloride group, a carbonyl fluoride group, a carbonyl bromide group, a carbonyl iodide group), and the like.
  • proteins such as (1H-imidazol-1-yl) carbonyl group, succinimidyloxycarbonyl group, epoxy group, and aldehyde group. , amino group, thiol group, carboxyl
  • Examples of the compound having an easily reactive group include epoxysilane and polylysine.
  • the solid phase is preferably blocked using a bovine serum albumin (BSA) buffer or the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • the mode of measuring the amount or concentration of the target molecule of the present invention in step (1b) is not particularly limited, and may be an appropriate mode depending on the type of the above-mentioned method for detecting the target molecule of the present invention (for example, various immunoassays, etc.). can be selected.
  • the measurement can be performed, for example, by quantifying the signal derived from the label of the used label.
  • a labeled antibody is brought into contact with a complex of a target molecule of the present invention and a molecule binding to the target molecule of the present invention, and a signal derived from the label of the bound labeled antibody is quantified. This can be done by:
  • Standard antibodies can be prepared from commercially available antibodies, for example, by affinity purification using biotin-labeled antigen and streptavidin-agarose resin. First, wells of a suitable ELISA plate are coated with antigen or antibody, and then blocked with BSA buffer. Next, standard antibodies or specimens at various concentrations are added to the wells, left to stand for a certain period of time, and then the wells are washed, and a secondary antibody labeled with peroxidase is added to the wells and left to stand for a certain period of time.
  • the wells are washed, a peroxidase substrate is added to the wells, and the wells are allowed to stand for a certain period of time to develop color.
  • a reaction stopper such as sulfuric acid
  • absorbance is measured using a plate reader.
  • the concentration of the target molecule of the present invention in the sample is quantified based on the standard curve.
  • the amount of the target molecule of the present invention can be calculated.
  • the amount of signal obtained can be directly used as the amount of the target molecule of the present invention.
  • the amount of signal obtained and the amount of the target molecule of the present invention are in an inversely proportional relationship, so the amount of signal obtained based on this relationship is The amount of the target molecule can be calculated.
  • the concentration of the target molecule of the present invention can be calculated by dividing the amount of the target molecule of the present invention by the amount of the biological sample or the amount of components within the biological sample (for example, the total amount of protein).
  • test method of the present invention including step (1), it is possible to provide the amount and/or concentration of the target biomarker, which is an indicator for testing (for example, stratification) for the possibility of developing liver cancer. This can assist in testing for the possibility of developing liver cancer.
  • step (1) in addition to detecting or measuring the target molecule of the present invention, it is also possible to detect or measure other biomarkers for testing the possibility of developing liver cancer.
  • biomarkers include AFP, FIB-4 index, and the like.
  • the testing method of the present invention further includes (2) determining the possibility of developing liver cancer in the subject based on the amount or concentration of the target molecule detected in step (1). , is preferably included.
  • Step (2) is more specifically, (2a) determining that the subject has a high possibility of developing liver cancer when the amount or concentration of the target molecule detected in step (1) is equal to or higher than a cutoff value, and/or ( 2b)
  • the method may include a step of determining that the subject has a low possibility of developing liver cancer when the amount or concentration of the target molecule detected in step (1) is below a cutoff value.
  • the cut-off value is determined by preparing a database that tracks the amount or concentration of each target molecule of the present invention and the presence or absence of liver cancer development for the evaluation population, and then determining the cut-off value of the present invention between people who have developed liver cancer and those who have not developed liver cancer. It is set in advance based on statistical analysis or ROC analysis of the amount or concentration data of the target molecule. Alternatively, the cutoff value can be set each time. When the cutoff value is determined by statistical analysis, for example, the median value, arithmetic mean, or other average value of the data on the amount or concentration of the target molecule of the present invention in the evaluation population can be used.
  • the cutoff value based on ROC analysis is such that the vertical axis (sensitivity or true positivity) of the ROC curve graph is 1.0 and the horizontal axis (1- It can be the amount or concentration of the target molecule of the present invention at the point on the ROC curve that has the minimum distance from the point where the specificity (specificity) is 0.0, or the Youden index of the ROC curve (Cancer 1950;3: 32-35.).
  • the evaluation population database may be used to set a cutoff value in the method of evaluating the risk of developing liver cancer in a subject, without changing it at all.
  • new patients with chronic liver disease including the subject of the present invention, are incorporated into the evaluation population, and while updating the database of the assessment population of chronic liver disease patients as appropriate, the risk of developing liver cancer in the subject of the present invention is determined. It may also be used to set a cutoff value in a method for evaluating.
  • the cutoff value is, for example, a percentile value of the amount or concentration value of the target molecule of the present invention in a biological sample in a reference subject group, for example, either the 10th to 90th percentile value or the 30th to 70th percentile value. , or between the 40th and 60th percentiles.
  • the cutoff value for serum Fibulin3 concentration is 7 to 13 ⁇ g/mL, preferably 8 to 12 ⁇ g/mL, and more preferably 9 to 11 ⁇ g/mL in the case of a subject with non-alcoholic liver disease.
  • the concentration can be, for example, 11 to 21 ⁇ g/mL, preferably 12 to 20 ⁇ g/mL, and more preferably 13 to 19 ⁇ g/mL.
  • the cutoff value for serum GPNMB concentration is, for example, 12 to 18 ⁇ g/mL, preferably 13 to 17 ⁇ g/mL, and more preferably 14 to 16 ⁇ g/mL in the case of a subject with nonalcoholic liver disease.
  • the concentration can be, for example, 7 to 26 ⁇ g/mL, preferably 8 to 25 ⁇ g/mL, and more preferably 9 to 24 ⁇ g/mL.
  • a high possibility of developing liver cancer means, for example, if the probability of developing liver cancer within 5 years is 5% or more, 7% or more, 10% or more, 12% or more, 15% or more, 17% or more, or 20% or more. % or more.
  • the upper limit in this case is not particularly limited and can be, for example, 50%, 40%, or 30%.
  • a low possibility of developing liver cancer can mean, for example, that the possibility of developing liver cancer within 5 years is less than 5%, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less.
  • the frequency of the test can be, for example, about once every 2 to 4 months.
  • the frequency of testing to determine whether or not they are suffering from liver cancer is low (or the frequency is reduced).
  • the frequency of the test can be, for example, about once every 12 to 60 months.
  • Examples of tests to determine whether a person is suffering from liver cancer include blood tests, image tests, and the like.
  • the present invention provides a test agent for the possibility of developing liver cancer (herein referred to as "the test of the present invention”), which includes a molecule binding to the target molecule of the present invention. (Sometimes referred to as “medicine.”) This will be explained below.
  • the test drug of the present invention is a drug that tests for the possibility of developing liver cancer.
  • the test agent of the present invention may be in the form of a composition containing a molecule that binds to the target molecule of the present invention.
  • the composition may contain other components as necessary.
  • Other ingredients include, for example, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, colorants, and fragrances. , chelating agents, and the like.
  • the test agent of the present invention may be in the form of a kit containing a molecule binding to the target molecule of the present invention.
  • the kit may contain instruments, reagents, etc. that can be used to carry out the testing method of the present invention.
  • the binding molecule for the target molecule of the present invention can also be immobilized on any solid phase. Therefore, the test agent of the present invention is in the form of a substrate (e.g., a microarray chip on which a probe is immobilized; as another example, an ELISA plate, etc. on which an antibody is immobilized) on which a molecule binding to the target molecule of the present invention is immobilized. can be provided as.
  • a substrate e.g., a microarray chip on which a probe is immobilized; as another example, an ELISA plate, etc. on which an antibody is immobilized
  • the solid phase used for immobilization is not particularly limited as long as it can immobilize antibodies, etc., and examples include glass plates, nylon membranes, microbeads, silicon chips, capillaries, and other substrates. can. Immobilization of the detection agent on the solid phase is not particularly limited.
  • instruments include test tubes, microtiter plates, agarose particles, latex particles, purification columns, epoxy-coated glass slides, colloidal gold-coated glass slides, and the like.
  • reagents include labeled antibodies, standard samples (positive controls, negative controls), and the like.
  • labeled antibody various commercially available labeled antibodies can be used depending on the type (eg, isotype) of the binding molecule to the target molecule of the present invention.
  • the target molecule of the present invention is used as the standard sample.
  • the target molecule of the present invention can be obtained, for example, by culturing cells into which an expression vector for the target molecule of the present invention has been introduced and purifying the cells or the culture supernatant.
  • Test example 1 Test for possibility of developing liver cancer 1
  • a study was conducted to clarify the usefulness of Fibulin as a predictive marker for hepatocarcinogenesis in patients with chronic liver disease (non-alcoholic fatty liver disease patients).
  • the subjects were 170 patients who were diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease by liver biopsy and whose clinical course could be ascertained through subsequent follow-up observations. Diagnostic criteria followed guidelines.
  • the MBL Code No. CY-8120 CircuLex Human Fibulin-3/EFEMP1 ELISA Kit was used for measurement.
  • the serum was uniformly diluted 200 times using the diluent included in the kit and measured.
  • a Thermo Fisher Varioskan LUX was used for the measurements.
  • Figure 1 shows the cumulative liver carcinogenesis rate for all patients with non-alcoholic fatty liver disease.
  • Serum Fibulin3 values in each patient group are shown in Figure 2. Fibulin3 increased as fibrosis progressed, and was found to be significantly higher in carcinogenic cases.
  • AUROC was calculated for each of the serum Fibulin3 value and FIB-4 index based on the time-dependent ROC curve.
  • the threshold was set using the Youden Index. The results are shown in Table 2. It was found that it is possible to predict the onset of liver carcinogenesis using Fibulin3.
  • Figure 3 shows the cumulative liver carcinogenesis rate for each of the two groups (145 patients with ⁇ 9.0 ⁇ g/mL, 25 patients with 9.0 ⁇ g/mL or more) classified by serum Fibulin3 value.
  • the verification method used was the Log rank test. It was found that Fibulin3 can be used to stratify the onset of liver cancer.
  • Test example 2 Test for possibility of developing liver cancer 2
  • the subjects were 470 patients who underwent liver biopsy before DAA treatment for hepatitis C, achieved sustained viral negative response (SVR) with DAA treatment, and had pre-treatment serum stored.
  • Diagnosis and treatment of chronic hepatitis C were performed according to the hepatitis C guidelines at the time.
  • Serum Fibulin levels were measured from pre-treatment stored serum in the same manner as Test Example 1, and the relationship with hepatocarcinogenesis after SVR was investigated. For samples that exceeded the standard range, the usual 200-fold dilution was further diluted 3-fold and re-measured to calculate the numerical value.
  • Table 3 shows patient background.
  • Figure 4 shows the cumulative liver carcinogenesis rate after chronic hepatitis C SVR.
  • Figure 5 shows the distribution of serum Fibulin3 values before chronic hepatitis C treatment. Serum Fibulin3 levels before hepatitis C treatment were higher than those in NAFLD.
  • Table 4 shows a comparison of patient characteristics based on serum Fibulin3 levels.
  • Serum Fibulin3 values in each patient group are shown in Figure 6. Fibulin3 increased as fibrosis progressed, and was found to be significantly higher in carcinogenic cases.
  • Table 6 shows the results of multivariate analysis using a model that selected three factors, FIB-4index, AFP, and Fibulin3, which have been reported in previous reports. In this analysis, only Fibulin3 was a significant factor.
  • AUROC was calculated for each of the serum Fibulin3 value and FIB-4 index based on the time-dependent ROC curve.
  • the threshold was set using the Youden Index. The results are shown in Table 7. It was found that it is possible to predict the onset of liver carcinogenesis using Fibulin3.
  • Figure 7 shows the cumulative liver carcinogenesis rate for each of the two groups (348 patients below 15.0 ⁇ g/mL, 122 patients 15.0 ⁇ g/mL or higher) classified by serum Fibulin3 level.
  • the verification method used was the Log rank test. It was found that Fibulin3 can be used to stratify the onset of liver cancer.
  • the cumulative total of two groups classified by serum Fibulin3 value (348 patients with less than 15.0 ⁇ g/mL, 122 patients with 15.0 ⁇ g/mL or more)
  • the liver carcinogenesis rate is shown in Figure 8.
  • Test example 3 Test for possibility of developing liver cancer 3
  • GPNMB a predictive marker for hepatocarcinogenesis in patients with chronic liver disease (non-alcoholic fatty liver disease patients).
  • the subjects were 170 patients who were diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease by liver biopsy and whose clinical course could be ascertained through subsequent follow-up observations. Diagnostic criteria followed guidelines.
  • Serum GPNMB values were measured using the Human Osteoactivin/GPNMB DuoSet ELISA (Catalog #DY2550 R&D SYSTEMS) from the serum stored at the time of liver biopsy, and the relationship with hepatocarcinogenesis was investigated.
  • Serum was measured at a 20-fold dilution using a diluent (1% BSA in PBS).
  • a Thermo Fisher Varioskan LUX was used to measure the absorbance at 450 nm to 540 nm, and a standard was used to create a calibration curve with a 4-parameter logistic curve to measure the concentration of each sample.
  • Table 8 shows patient background. Of the 170 cases, there were 95 cases of nonalcoholic fatty liver disease (NAFL) and 75 cases of nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Based on histopathological diagnosis at the time of liver biopsy, Matteoni classification 1/2 was diagnosed as NAFL, and 3/4 was diagnosed as NASH. Fibrosis was determined according to Kleiner et al.'s NASH CRN scoring system (criteria described in the guidelines).
  • Figure 9 shows the serum GPNMB values in each patient group. Serum GPNMB levels were elevated in the NASH group compared to the NAFL group, and were significantly higher in cancer cases.
  • AUROC was calculated for each of the serum GPNMB value and FIB-4 index based on the time-dependent ROC curve.
  • the threshold was set using the Youden Index.
  • the threshold value of serum GPNMB value was 15.468, the AUROC of serum GPNMB value was 0.772, and the AUROC of FIB-4 index was 0.746.
  • the AUROC of the serum GPNMB value when looking at carcinogenesis within 4 years was 0.7113
  • the AUROC of the serum GPNMB value when looking at carcinogenesis within 5 years was 0.7113.
  • Figure 10 shows the cumulative liver carcinogenesis rate for each of the two groups (15.4 ⁇ g/mL or less, >15.4 ⁇ g/mL) classified by serum GPNMB value.
  • the verification method used was the Log rank test. It was found that GPNMB can be used to stratify the onset of liver cancer.
  • Test example 4 Test for possibility of developing liver cancer 4
  • a study was conducted to clarify the usefulness of GPNMB as a predictive marker for hepatocarcinogenesis in patients with chronic liver disease (chronic hepatitis C patients).
  • the subjects were 469 patients who underwent liver biopsy before DAA treatment for hepatitis C, achieved sustained viral negative response (SVR) with DAA treatment, and had pre-treatment serum stored.
  • Serum GPNMB values were measured from pre-treatment stored serum in the same manner as in Test Example 3, and the relationship with post-SVR liver carcinogenesis was investigated. Table 9 shows the patient background.
  • FIG 11 shows the serum GPNMB values in the non-carcinogenic group and the carcinogenic group. GPNMB was found to be significantly higher in cancer cases.
  • AUROC was calculated for each of the serum GPNMB value and FIB-4 index based on the time-dependent ROC curve.
  • the threshold was set using the Youden Index. The results are shown in Table 11. It was found that it is possible to predict the onset of liver carcinogenesis using GPNMB.
  • Figure 12 shows the cumulative liver carcinogenesis rates for each of the two groups (15.4 ⁇ g/mL or less, >15.4 ⁇ g/mL) classified by serum GPNMB value.
  • the verification method used was the Log rank test. It was found that GPNMB can be used to stratify the onset of liver cancer.
  • Test example 5 Test for possibility of developing liver cancer 5
  • the subjects were a total of 476 cases, including the 170 cases used in Test Example 1, who were diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease by liver biopsy and whose clinical course could be ascertained through subsequent follow-up observations. Diagnostic criteria followed guidelines.
  • the MBL Code No. CY-8120 CircuLex Human Fibulin-3/EFEMP1 ELISA Kit was used for measurement. The serum was uniformly diluted 200 times using the diluent included in the kit and measured. A Thermo Fisher Varioskan LUX was used for the measurements.
  • Table 12 shows patient background. Stages 3 and 4 were defined as cases of advanced fibrosis using Kleiner et al.'s NASH CRN scoring system (criteria listed in the guidelines).

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Abstract

肝臓癌の発症可能性を検査する方法を提供すること。 （1）被検体から採取された生体試料におけるFibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子を検出する工程を含む、肝臓癌の発症可能性を検査する方法。

Description

肝臓癌の発症可能性を検査する方法
　本発明は、肝臓癌の発症可能性を検査する方法等に関する。
　肝臓癌（肝癌）は本邦で年間約4万人が発症し、2万5千人が死亡する悪性腫瘍である。肝癌発症者のほとんどが何らかの慢性肝疾患を有しており、慢性肝疾患の加療が肝癌患者の予後改善には重要である。C型慢性肝炎患者では新規治療薬により多くの症例でウイルスが排除できるようになったが、一部の症例においてはウイルス排除後にも肝発癌を生じる。B型慢性肝炎についても複数の治療薬が存在するものの、薬剤の内服下であっても肝癌を発症する症例がみられる。非アルコール性脂肪性肝疾患およびアルコール性肝障害症例においては、いまだに減量および禁酒以外に治療法が存在せず、さらに減量・禁酒後も肝癌を発症する症例が散見される。このように、現行の慢性肝疾患の治療のみでは肝癌発症率を低下させるものの完全に防ぐことは出来ず、慢性肝疾患患者においては早期に肝癌を発見するために定期的な血液検査と画像検査による経過観察を行っているのが現在の医療の現状である。このような背景において、将来の肝発癌発症を高率に予測できるマーカーは、高リスク群には厳重な経過観察を行うことで早期に肝癌を発見でき、低リスク群には検査頻度を減らすことで患者および医療経済の負担軽減にもつながるため、非常に有用性が高い。
　しかしながら、現在、αフェトプロテインや、AST, ALT, 血小板, 年齢から計算されるFIB4-indexが発癌予測マーカーとして報告されているものの、その診断能は十分ではない（非特許文献１）。
Aliment Pharmacol Ther 2021 Nov;54(10):1340-1349. doi: 10.1111/apt.16632.
　本発明は、肝臓癌の発症可能性を検査する方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、（1）被検体から採取された生体試料におけるFibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子を検出する工程を含む、肝臓癌の発症可能性を検査する方法、であれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　（1）被検体から採取された生体試料におけるFibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子を検出する工程を含む、肝臓癌の発症可能性を検査する方法。
　項２．　前記工程（1）が、
（1a）前記対象分子に対する結合性分子と前記生体試料とを接触させる工程、並びに（1b）前記結合性分子に結合した前記対象分子の量又は濃度を測定する工程、
を含む、項１に記載の方法。
　項３．　さらに、（2）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度に基づいて、前記被検体の肝臓癌の発症可能性を判定する工程、
を含む、項１に記載の方法。
　項４．　前記工程（2）が、
（2a）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体は肝臓癌の発症可能性が高いと判定する工程、及び／又は
（2b）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体は肝臓癌の発症可能性が低いと判定する工程
を含む、項３に記載の方法。
　項５．　前記被検体が慢性肝疾患を有する被検体である、項１～４のいずれかに記載の方法。
　項６．　前記対象分子がFibulin 3及びGPNMBからなる群より選択される少なくとも1種である、項１～４のいずれかに記載の方法。
　項７．　前記生体試料が体液又は体液由来の試料である、項１～４のいずれかに記載の方法。
　項８．　前記体液が全血、血清、及び血漿からなる群より選択される少なくとも1種である、項７に記載の方法。
　項９．　前記被検体がヒトである、項１～４のいずれかに記載の方法。
　項１０．　Fibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子に対する結合性分子を含む、肝臓癌の発症可能性の検査薬。
　項１１．　Fibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子に対する結合性分子の、肝臓癌の発症可能性の検査薬の製造のための使用。
　項１２．　Fibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子に対する結合性分子の、肝臓癌の発症可能性の検査薬としての使用。
　項１３．　肝臓癌の発症可能性の検査における使用のための、Fibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子に対する結合性分子。
　本発明によれば、肝臓癌の発症可能性を検査する方法を提供することができる。
試験例1の非アルコール性脂肪性肝疾患患者全体の累積肝発癌率を示す。 試験例1の各患者群における血清Fibulin3値を示す。F0～F4はFibrosisのステージを示す。non-HCCは非発癌群、HCCは発癌群を示す。**** p＜0.0001、** p＜0.01。 試験例1の血清Fibulin3値で分類した2群（9.0μg/mL未満　145名、9.0μg/mL以上　25名）それぞれの累積肝発癌率を示す。 試験例2のC型慢性肝炎SVR後の累積肝発癌率を示す。 試験例2のC型慢性肝炎治療前血清Fibulin3値の分布を示す。 試験例2の各患者群における血清Fibulin3値を示す。F0～F4はFibrosisのステージを示す。non-HCCは非発癌群、HCCは発癌群を示す。**** p＜0.0001、*** p＜0.001。 試験例2の血清Fibulin3値で分類した2群（15.0μg/mL未満　348名、15.0μg/mL以上　122名）それぞれの累積肝発癌率を示す。 試験例2の患者群をFIB4 index　3.25未満の患者群又はF1及びF2患者群に限定した場合の、血清Fibulin3値で分類した2群（15.0μg/mL未満　348名、15.0μg/mL以上　122名）それぞれの累積肝発癌率を示す。 試験例3の各患者群における血清GPNMB値を示す。 試験例3の血清GPNMB値で分類した2群（15.4μg/mL以下、15.4μg/mL超）それぞれの累積肝発癌率を示す。 試験例4の非発癌群と発癌群における血清GPNMB値を示す。 試験例4の血清GPNMB値で分類した2群（15.4μg/mL以下、15.4μg/mL超）それぞれの累積肝発癌率を示す。 試験例5の、血清Fibulin3値及びFIB－4 indexそれぞれについて、時間依存性ROC曲線に基づいてAUROCを算出した結果を示す。 試験例5の、患者全体476例、線維化進展例120例、FIB-4 index 2.67以上の120例における、Fibulin3値で分類した2群(6.7μg/mL以上および6.7μg/mL未満)それぞれの累積肝発がん率を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．肝臓癌の発症可能性を検査する方法
　本発明は、その一態様において、（1）被検体から採取された生体試料におけるFibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子（本明細書において、「本発明の対象分子」と示すこともある。）を検出する工程を含む、肝臓癌の発症可能性を検査する方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　1-1．工程（1）
　検査対象である肝臓癌は、特に制限されず、肝細胞癌、胆管細胞癌等を包含する。肝臓癌としては、肝細胞癌が好ましい。肝臓癌は、進行度、状態等に関する各種分類基準における全てのクラス、グレード、ステージの肝臓癌を包含する。
　被検体は、任意の哺乳動物であってよいが、好ましくは慢性肝疾患を有する哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類及びウサギなどの実験動物、イヌ及びネコなどのペット、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ及びヒツジなどの家畜、サル、オランウータン及びチンパンジーなどの霊長類並びにヒトなどが挙げられ、特にヒトが好ましい。
　慢性肝疾患は、ウイルス性肝炎及び脂肪性肝疾患を含むが、これらに限られない。ウイルス性肝炎は、C型肝炎及びB型肝炎を含むが、これらに限られない。脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）及び二次性脂肪肝を含むが、これらに限られない。NAFLDは、非アルコール性脂肪肝（NAFL）及び非アルコール性脂肪肝炎（NASH）を含む。本発明における被検体は、肝癌発症のリスクを評価する必要のある、慢性肝疾患患者を含む。本発明の被検体は、C型肝炎におけるSVR後の被検体、B型肝炎における核酸アナログ（NUC）投与下の被検体、NAFLDを罹患している被検体を含むが、これらに限定されない、　本発明において、HCVの持続陰性化（SVR）及びSVRを達成するための治療、SVR達成後の肝癌発症の有無を調べる検査については、それぞれ、C型肝炎治療ガイドライン（日本肝臓学会肝炎診療ガイドライン作成委員会編、第8版、2020年7月発行（https://www.jsh.or.jp/lib/files/medical/guidelines/jsh_guidlines/C_v8_20201005.pdf）、同英語版（Hepatology Research 2020; 50: 791-816.））及び肝癌診療ガイドライン（日本肝臓学会編、2017年版、2017年10月発行（https://www.jsh.or.jp/medical/guidelines/jsh_guidlines/medical/examination_jp_2017.html）、同英語版（https://www.jsh.or.jp/English/examination_en/guidelines_hepatocellular_carcinoma_2017.html））、Ghany MG,及びMorgan TR.（Hepatitis C Guidance 2019 Update: American Association for the Study of Liver Diseases-Infectious Diseases Society of America Recommendations for Testing, Managing, and Treating Hepatitis C Virus Infection. Hepatology 2020;71:686-721.）、Clinical Practice Guidelines Panel （EASL recommendations on treatment of hepatitis C: Final update of the series. J Hepatol 2020;73:1170-1218.）を含むが、これらに限られない、権威ある肝炎及び／又は肝癌の専門家による定義に従う。
　本発明において、B型肝炎におけるNUC投与による治療については、日本肝臓学会編B型肝炎治療ガイドライン（第3．4版）2021年5月（https://www.jsh.or.jp/lib/files/medical/guidelines/jsh_guidlines/B_v3.4.pdf）、同英語版（Hepatology Research, 2020; 50: 892-923.）を含むが、これらに限られない、権威ある肝炎の専門家による定義に従う。
　本発明において、脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪肝（NAFL）及び非アルコール性脂肪肝炎（NASH）については、NAFLD／NASH診療ガイドライン2020（日本消化器病学会・日本肝臓学会編、改訂第2版、2020年11月発行、南江堂（https://www.jsge.or.jp/guideline/guideline/pdf/nafldnash2020.pdf））、同英語版（Tokushige, K. et al. HepatologyResearch.2021;51:1013-1025.及びTokushige, K. et al. Journal of Gastroenterology 2021;56: 951-963.）を含むが、これらに限られない、権威ある肝炎の専門家による定義に従う。
　本発明において、ウイルス性慢性肝炎、脂肪性肝疾患その他の肝疾患からの肝癌発症の有無を調べる検査については、肝癌診療ガイドライン（日本肝臓学会編、2017年版、前出）を含むが、これらに限られない、権威ある肝癌の専門家による定義に従う。
　生体試料は、本発明の対象分子を含有し得るものであれば特に制限されない。生体試料としては、例えば全血、血清、血漿、卵胞液、経血、唾液、髄液、関節液、尿、組織液、汗、涙、唾液などの体液や、これらの体液由来の試料が挙げられる。また、生体試料としては、生体組織、好ましくは肝組織や、これらの組織由来の試料であることもできる。体液／組織由来の試料としては、体液／組織から調製される試料である限り特に制限されず、例えば体液／組織から、該体液／組織に含まれるタンパク質又は核酸を濃縮、精製などして得られる試料などが挙げられる。体液としては、好ましくは全血、血清、血漿などが挙げられる。生体試料は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　生体試料は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。なお、採血は、医師、看護師などの医療従事者が行うことが望ましい。血清は、血液から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、血液から血球を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。
　Fibulin 3遺伝子は公知であり、ヒトの場合であれば、例えばNCBIGene ID:2202の遺伝子がFibulin 3遺伝子である。他の生物種のFibulin 3遺伝子も、公知の情報に従って及び／又は公知のFibulin 3遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列との同一性解析に基づいて、容易に同定することができる。Fibulin 3のアミノ酸配列は、公知の情報に従って及び／又は公知のFibulin 3アミノ酸配列との同一性解析に基づいて、容易に同定することができる。ヒトFibulin 3のアミノ酸配列として、例えばNCBI Reference No. NP_001034437.1に示されるアミノ酸配列が挙げられる。Fibulin 3 mRNAの塩基配列は、公知の情報に従って及び／又は公知のFibulin 3 mRNA塩基配列との同一性解析に基づいて、容易に同定することができる。ヒトFibulin 3 mRNAの塩基配列として、例えばNCBI Reference No. NM_001039348.1に示される塩基配列が挙げられる。
　GPNMB遺伝子は公知であり、ヒトの場合であれば、例えばNCBIGene ID:10457の遺伝子がGPNMB遺伝子である。他の生物種のGPNMB遺伝子も、公知の情報に従って及び／又は公知のGPNMB遺伝子のアミノ酸配列及び／又は塩基配列との同一性解析に基づいて、容易に同定することができる。GPNMBのアミノ酸配列は、公知の情報に従って及び／又は公知のGPNMBアミノ酸配列との同一性解析に基づいて、容易に同定することができる。ヒトGPNMBのアミノ酸配列として、例えばNCBI Reference No. NP_001005340.2に示されるアミノ酸配列が挙げられる。GPNMB mRNAの塩基配列は、公知の情報に従って及び／又は公知のGPNMB mRNA塩基配列との同一性解析に基づいて、容易に同定することができる。ヒトGPNMB mRNAの塩基配列として、例えばNCBI Reference No. NM_001005340.1に示される塩基配列が挙げられる。
　工程（1）の検出対象である本発明の対象分子は、アイソフォームや、個体間で認められる変異を含むものも包含される。
　タンパク質である本発明の対象分子（Fibulin 3、GPNMB）を検出する場合において、本発明の対象分子の検出方法（好ましくは本発明の対象分子の量又は濃度を測定する方法）は、本発明の対象分子を検出可能な方法である限りにおいて、特に制限されない。該方法としては、例えばイムノアッセイが挙げられる。イムノアッセイは、直接法、間接法、均一法、不均一法、競合法、非競合法などを問わず、広く採用することができる。イムノアッセイとして、より具体的には、例えばELISA（例えば直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法など）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、イムノラジオメトリックアッセイ（IRMA）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、サンドイッチEIA、イムノクロマト、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドットブロットアッセイ、免疫組織染色、蛍光イムノアッセイ、アビジン－ビオチン又はストレプトアビジン－ビオチン系を用いるイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いるイムノアッセイなどが挙げられる。イムノアッセイにより、具体的には例えば本発明の対象分子に結合した本発明の対象分子に対する結合性分子に対して直接又は間接的に標識抗体を接触させ、結合した標識抗体の標識に由来するシグナルを定量することによって、本発明の対象分子を検出することができる。この際に使用する標識抗体や標識抗体と本発明の対象分子に対する結合性分子又は本発明の対象分子とを介在する抗体としては、特に制限されず、例えば抗体定常領域に対する抗体、抗イディオタイプ抗体等が使用できる。
　タンパク質である本発明の対象分子を検出する際に用いられる標識物（例えば標識抗体など）における標識の種類は特に制限されない。標識としては、例えば蛍光物質、発光物質、色素、酵素、金コロイド、放射性同位体などが挙げられる。これらの中でも、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素標識は、安全性、経済性、検出感度などの観点から、好ましい。
　mRNAである本発明の対象分子（Fibulin 3 mRNA、GPNMB mRNA）を検出する場合において、本発明の対象分子の検出方法（好ましくは本発明の対象分子の量又は濃度を測定する方法）は、本発明の対象分子を検出可能な方法である限りにおいて、特に制限されない。該方法としては、例えばノーザンブロッティング法、RNaseプロテクション・アッセイ法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（RT－PCR）（Weis JH et al.,Trends in Genetics 1992;8:263-264.）；定量リアルタイムRT－PCR法（Held CA et al.,Genome Research 1996;6:986-994.）等を用いることができる。しかし、感度及び実施しやすさの観点から定量リアルタイムRT－PCR法が好ましい。上記方法においては、本発明の対象分子に対する結合性分子（例えばプライマー、プローブ等）を使用することができる。プライマー対及びプローブは、本発明の対象分子 mRNAのヌクレオチド配列に基づいて合成することができる。プライマー及びプローブの塩基長は特に限定されない。プライマーの塩基長はそれぞれヌクレオチド10～50個、好ましくは15～30個とすることができる。プローブの塩基長はヌクレオチド10個から本発明の対象分子のmRNAのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全長までの範囲、好ましくは、ヌクレオチド20～150個とすることができる。
　プライマー対及びプローブは、RNA、DNA等の天然核酸の他、必要に応じて天然核酸と化学修飾核酸や擬似核酸を組み合わせることもできる。化学修飾核酸や擬似核酸には、例えば、PNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等が挙げられる。また、プライマー及びプローブは、蛍光物質及び／又はクエンチャー物質、又は放射性同位元素（例えば、32P、33P、35S）等の標識物質、あるいはビオチン若しくは（ストレプト）アビジン、又は磁気ビーズ等の修飾物質を用いて標識又は修飾してもよい。標識物質は、限定されず、市販のものを用いることができる。例えば、蛍光物質であればFITC、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、FAM、HEX、VIC、フルオレサミン及びその誘導体、及びローダミン及びその誘導体等を用いることができる。クエンチャー物質であれば、AMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3等を用いることができる。プライマー及びプローブにおける標識物質の標識位置は、その修飾物質の特性や、使用目的に応じて適宜定めればよい。一般的には、5’又は3’末端部に修飾されることが多い。また、1本のプライマー及びプローブ分子が1種類以上の標識物質で標識されていてもかまわない。プライマー及びプローブのヌクレオチド配列の設計、標識物質の選択は公知であり、Sambrook, J及びRussell, DWによるMolecular Cloning: A Laboratory Manual（3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）等の分子生物学の実験プロトコール書に開示されている。
　検出方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　工程（1）は、一態様においては、好ましくは（1a）本発明の対象分子に対する結合性分子と前記生体試料とを接触させる工程、並びに（1b）本発明の結合性分子に結合した前記対象分子の量又は濃度を測定する工程、を含むことができる。
　本発明の対象分子に対する結合性分子は、本発明の対象分子を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばウェスタンブロット法、ELISA法等において、本発明の対象分子が特異的に検出できることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物が本発明の対象分子に由来するものであると判断できるものであればよい。
　本発明の対象分子に対する結合性分子には、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部を含む分子が包含される。本発明の対象分子のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する本発明の対象分子に対する結合性分子も、本発明の対象分子に対する結合性分子に含まれる。
　これらの本発明の対象分子に対する結合性分子の製造方法は、すでに周知であり、本発明の対象分子に対する結合性分子もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12～11.13(2000)）。具体的には、本発明の対象分子に対する結合性分子がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明の対象分子を用いて、あるいは常法に従って当該本発明の対象分子の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本発明の対象分子、あるいは本発明の対象分子の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11）。
　本発明の対象分子に対する結合性分子の作製に免疫抗原として使用される本発明の対象分子は、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
　具体的には、本発明の対象分子をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明本発明の対象分子に対する結合性分子の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また本発明の対象分子の部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
　また本発明の対象分子に対する結合性分子は、本発明の対象分子の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる本発明の対象分子に対する結合性分子の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、本発明の対象分子と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ本発明の対象分子のアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
　かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する本発明の対象分子に対する結合性分子の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット－ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
　工程（1a）における接触の態様は、特に制限されず、上述した本発明の対象分子の検出方法（例えば各種イムノアッセイなど）の種類に応じて、適切な態様を選択することができる。接触態様としては、例えば生体試料中のタンパク質（抗原）、並びに本発明の対象分子に対する結合性分子のいずれか一方のみを固相に固定した状態で接触させる態様、これらの両方とも固相に固定しない状態で接触させる態様などが挙げられる。これらの中でも、効率性などの観点から、好ましくは少なくとも一方のみを固相に固定した状態で接触させる態様が挙げられる。工程（1a）における接触の態様において、少なくとも一方のみのみを固相に固定する場合、固定後に、固相を洗浄することが好ましい。
　固相としては、本発明の対象分子又は本発明の対象分子に対する結合性分子を固定可能なものである限り特に制限されない。該固相としては、例えばポリスチレン、ガラス、ニトロセルロースなどを主成分として含むプレート、スライド、膜などが挙げられる。固相は、本発明の対象分子又は本発明の対象分子に対する結合性分子をより容易に固定させるための成分、例えば易反応性化合物（例えば易反応性基を有する化合物、金コロイドなど）でコーティングされたものであってもよい。易反応性基を有する化合物としては、タンパク質と共有結合を形成しうる基であって、例えば、（1H-イミダゾール-1-イル）カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、又はハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等を有する化合物が挙げられる。
　易反応性基を有する化合物としては、例えば、エポキシシラン、及びポリリジン等が挙げられる。
　固相は、ウシ血清アルブミン（BSA）緩衝液等を用いてブロッキングすることが好ましい。
　工程（1b）における本発明の対象分子の量又は濃度の測定の態様は、特に制限されず、上述した本発明の対象分子の検出方法（例えば各種イムノアッセイなど）の種類に応じて、適切な態様を選択することができる。該測定は、例えば用いられた標識物の標識に由来するシグナルを定量することによって行うことができる。より具体的な態様としては、例えば本発明の対象分子と本発明の対象分子に対する結合性分子との複合体に対して標識抗体を接触させ、結合した標識抗体の標識に由来するシグナルを定量することによって行うことができる。
　その一例としてELISA法がある。ELISA法によれば、標準抗体を用いて標準曲線を作成し、本発明の対象分子の濃度を定量することができる。標準抗体は、例えば、ビオチン標識抗原とストレプトアビジン-アガロース樹脂とを用いたアフィニティー精製によって、市販の抗体から調製できる。まず、適当なELISA用プレートのウエルを抗原又は抗体で被覆した後に、BSA緩衝液でブロッキングする。次に、各濃度の標準抗体または検体をウエルに加えて一定時間静置後にウエルを洗浄し、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体をウエルに加えて一定時間静置する。その後に、ウエルを洗浄し、ペルオキシダーゼの基質をウエルに加えて一定時間静置して発色させ、硫酸等の反応停止液を加えた後に、プレートリーダーを用いて吸光度を測定する。標準抗体の濃度とその吸光度とに基づいて標準曲線を作成した後、標準曲線に基づいて、検体中の本発明の対象分子の濃度を定量する。
　得られたシグナル量に基づいて、本発明の対象分子の量を算出することができる。例えば、非競合法の場合であれば、得られたシグナル量をそのまま本発明の対象分子の量とすることができる。また、別の例として、競合法の場合であれば、得られたシグナル量と本発明の対象分子の量は、反比例の関係にあるので、この関係に基づいて得られたシグナル量から本発明の対象分子の量を算出することができる。
　また、本発明の対象分子の量を、生体試料の量や、生体試料内の成分量（例えばタンパク質全量など）で除することによって、本発明の対象分子の濃度を算出することができる。
　工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、肝臓癌の発症可能性の検査（例えば層別化）の指標である対象バイオマーカーの量及び／又は濃度を提供することができ、これにより肝臓癌の発症可能性の検査などを補助することができる。
　また、工程（1）においては、本発明の対象分子を検出又は測定することに加えて、肝臓癌の発症可能性検査の他のバイオマーカーを検出又は測定することもできる。他のバイオマーカーとしては、例えばAFP、FIB－4インデックス等が挙げられる。
　　　1-2．工程（2）
　本発明の検査方法は、一態様として、さらに、（2）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度に基づいて、前記被検体の肝臓癌の発症可能性を判定する工程、を含むことが好ましい。
　工程（2）は、より具体的には、
（2a）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体は肝臓癌の発症可能性が高いと判定する工程、及び／又は
（2b）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体は肝臓癌の発症可能性が低いと判定する工程
を含むことができる。
　カットオフ値は、評価用集団について、個々の本発明の対象分子の量又は濃度と、肝癌発症の有無とについて追跡したデータベースを用意して、肝癌発症者と肝癌非発症者との本発明の対象分子の量又は濃度のデータの統計解析又はROC解析に基づいて予め設定される。或いは、カットオフ値は、その都度設定することもできる。前記カットオフ値を統計解析により決定する場合には、例えば、前記評価用集団の本発明の対象分子の量又は濃度のデータの、中央値、算術平均その他の平均値を用いることができる。前記カットオフ値をROC解析により決定する場合には、例えば、ROC解析に基づくカットオフ値は、ROC曲線グラフの縦軸（感度又は真の陽性度）が1．0で、横軸（1－特異度）が0．0の点との距離が最小となるROC曲線上の点の本発明の対象分子の量又は濃度とすることができ、あるいは、ROC曲線のYoudenインデックス（Cancer 1950;3:32-35.）から導かれるカットオフ値とすることができる。評価用集団のデータベースは、一度確立した後は全く変更せずに、本発明の被検体の肝癌発症リスクを評価する方法におけるカットオフ値の設定に用いてもよい。あるいは、本発明の被検体を含む、新たな慢性肝疾患患者を前記評価用集団に組み込んで、慢性肝疾患患者の評価用集団のデータベースを適宜更新しながら、本発明の被検体の肝癌発症リスクを評価する方法におけるカットオフ値の設定に用いてもよい。カットオフ値は、例えば、基準となる被検体群における生体試料における本発明の対象分子の量又は濃度の値のパーセンタイル値、例えば10～90パーセンタイル値のいずれか、30～70パーセンタイル値のいずれか、又は40～60パーセンタイル値のいずれかとすることができる。
　例えば血清Fibulin3濃度のカットオフ値は、非アルコール性肝疾患の被検体の場合であれば例えば7～13μg/mL、好ましくは8～12μg/mL、より好ましくは9～11μg/mLであることができ、C型慢性肝炎の被検体の場合であれば例えば11～21μg/mL、好ましくは12～20μg/mL、より好ましくは13～19μg/mLであることができる。
　例えば血清GPNMB濃度のカットオフ値は、非アルコール性肝疾患の被検体の場合であれば例えば12～18μg/mL、好ましくは13～17μg/mL、より好ましくは14～16μg/mLであることができ、C型慢性肝炎の被検体の場合であれば例えば7～26μg/mL、好ましくは8～25μg/mL、より好ましくは9～24μg/mLであることができる。
　肝臓癌の発症可能性が高いとは、例えば5年以内に肝臓癌を発症する可能性が5％以上、7％以上、10％以上、12％以上、15％以上、17％以上、又は20％以上であることができる。この場合の上限は特に制限されず、例えば50％、40％、又は30％であることができる。
　肝臓癌の発症可能性が低いとは、例えば5年以内に肝臓癌を発症する可能性が5％未満、4％以下、3％以下、2％以下、又は1％以下であることができる。
　肝臓癌の発症可能性が高いと判定された被検体については、肝臓癌に罹患しているか否かの検査の頻度が多い（又は頻度を増やす）ことが好ましい。この場合、当該検査の頻度は、例えば2～4カ月に1回程度であることができる。
　肝臓癌の発症可能性が低いと判定された被検体については、肝臓癌に罹患しているか否かの検査の頻度が少ない（又は頻度を減らす）ことが好ましい。この場合、当該検査の頻度は、例えば12～60カ月に1回程度であることができる。
　肝臓癌に罹患しているか否かの検査としては、例えば血液検査、画像検査等が挙げられる。
　2．肝臓癌の発症可能性の検査薬
　本発明は、その一態様において、本発明の対象分子に対する結合性分子を含む、肝臓癌の発症可能性の検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　本発明の検査薬は、肝臓癌の発症可能性を検査する薬である。
　本発明の検査薬は、本発明の対象分子に対する結合性分子を含む組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の検査薬は、本発明の対象分子に対する結合性分子を含むキットの形態であってもよい。該キットには、本発明の検査方法の実施に用いられ得る器具、試薬などが含まれていてもよい。
　本発明の対象分子に対する結合性分子は、任意の固相に固定化された状態であることもできる。このため本発明の検査薬は、本発明の対象分子に対する結合性分子を固定化した基板（例えばプローブを固定化したマイクロアレイチップ等。別の例として、抗体を固定化したELISAプレート等）の形態として提供することができる。
　固定化に使用される固相は、抗体等を固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相への検出剤の固定は、特に制限されない。
　器具としては、例えば試験管、マイクロタイタープレート、アガロース粒子、ラテックス粒子、精製用カラム、エポキシコーティングスライドガラス、金コロイドコーティングスライドガラスなどが挙げられる。
　試薬としては、例えば標識抗体、標準試料（陽性対照、陰性対照）などが挙げられる。
　標識抗体としては、本発明の対象分子に対する結合性分子の種類（例えばアイソタイプ）に応じて、各種市販されているものを用いることができる。
　標準試料としては、本発明の対象分子が用いられる。本発明の対象分子は、例えば本発明の対象分子の発現ベクターを導入した細胞を培養し、その当該細胞又は培養上清から精製して得ることができる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．肝臓癌の発症可能性の検査1
　慢性肝疾患患者（非アルコール性脂肪性肝疾患患者）におけるFibulinの肝発癌発症予測マーカーとしての有用性を明らかにすることを目的として、試験を行った。対象は、肝生検により非アルコール性脂肪性肝疾患と診断し、以後の経過観察がなされ臨床経過を把握できた170症例である。診断基準はガイドラインに準じた。患者の血液を採取後に血清分離し、血清は-80℃で保管したものを使用した。測定に使用したのはMBL Code No.CY-8120 CircuLex Human Fibulin-3/EFEMP1 ELISA Kitである。血清をキットに付属の希釈液により一律200倍に希釈して測定した。測定にはThermo Fisher Varioskan LUXを用いた。
　患者背景を表１に示す。全170症例中、非アルコール性脂肪肝(NAFL)95例、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)75例であった。肝生検時の病理組織診断にてMatteoni分類1/2をNAFL, 3/4をNASHとして診断した。FibrosisはKleinerらのNASH CRN scoring systemに準じた(ガイドラインに記載ある基準)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　非アルコール性脂肪性肝疾患患者全体の累積肝発癌率を図１に示す。
　各患者群における血清Fibulin3値を図２に示す。Fibulin3は線維化進展に従い増加し、発癌例で有意に高値であることが分かった。
　血清Fibulin3値及びFIB－4 indexそれぞれについて、時間依存性ROC曲線に基づいてAUROCを算出した。閾値はYouden Indexを用いて設定した。結果を表２に示す。Fibulin3による肝発癌発症予測が可能であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　血清Fibulin3値で分類した2群（9.0μg/mL未満　145名、9.0μg/mL以上　25名）それぞれの累積肝発癌率を図３に示す。検定方法はLog rank testを使用した。Fibulin3により肝癌発症を層別化できることが分かった。
　試験例2．肝臓癌の発症可能性の検査2
　慢性肝疾患患者（C型慢性肝炎患者）におけるFibulinの肝発癌発症予測マーカーとしての有用性を明らかにすることを目的として、試験を行った。対象は、C型肝炎に対するDAA治療前に肝生検を施行しており、DAA治療により持続的ウイルス陰性化(SVR)が得られ、かつ、治療前保存血清を保管した470例である。C型慢性肝炎の診断およびの治療はその時点でのC型肝炎ガイドラインに準じて行った。治療前の保存血清より、試験例1と同様に血清Fibulin値を測定し、SVR後肝発癌との関連を検討した。スタンダードの範囲を超えたサンプルについては通常200倍希釈のところをさらに3倍希釈して再測定を行い数値を算出した。
　患者背景を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　C型慢性肝炎SVR後の累積肝発癌率を図４に示す。
　C型慢性肝炎治療前血清Fibulin3値の分布を図５に示す。C型肝炎治療前の血清Fibulin3値は、NAFLDの血清Fibulin3値と比較して高値であった。
　血清Fibulin3値による患者背景比較を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　各患者群における血清Fibulin3値を図６に示す。Fibulin3は線維化進展に従い増加し、発癌例で有意に高値であることが分かった。
　単変量解析及び多変量解析の結果を表５に示す。統計にはCox比例ハザードモデルを使用　単変量解析p値でFibulin3は最も低い値であった。今回イベント数が24なので、p値の低いものから3項目（Alb、ヒアルロン酸、Fibulin3）を選択したモデルにて多変量解析を行ったところ、Fibulin3のみ有意な因子となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　既報などで報告されているFIB-4indexおよびAFPと、Fibulin3の3つの因子を選択したモデルにて多変量解析を行った結果を表６に示す。この解析でもFibulin3のみ有意な因子となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　血清Fibulin3値及びFIB－4 indexそれぞれについて、時間依存性ROC曲線に基づいてAUROCを算出した。閾値はYouden Indexを用いて設定した。結果を表７に示す。Fibulin3による肝発癌発症予測が可能であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　血清Fibulin3値で分類した2群（15.0μg/mL未満　348名、15.0μg/mL以上　122名）それぞれの累積肝発癌率を図７に示す。検定方法はLog rank testを使用した。Fibulin3により肝癌発症を層別化できることが分かった。
　患者群をFIB4 index　3.25未満の患者群又はF1及びF2患者群に限定した場合の、血清Fibulin3値で分類した2群（15.0μg/mL未満　348名、15.0μg/mL以上　122名）それぞれの累積肝発癌率を図８に示す。
　試験例3．肝臓癌の発症可能性の検査3
　慢性肝疾患患者（非アルコール性脂肪性肝疾患患者）におけるGPNMBの肝発癌発症予測マーカーとしての有用性を明らかにすることを目的として、試験を行った。対象は、肝生検により非アルコール性脂肪性肝疾患と診断し、以後の経過観察がなされ臨床経過を把握できた170症例である。診断基準はガイドラインに準じた。肝生検時の保存血清より、Human Osteoactivin/GPNMB DuoSet ELISA (Catalog #DY2550 R＆D SYSTEMS)を用いて血清GPNMB値を測定し、肝発癌との関連を検討した。血清は希釈液(1% BSA in PBS)にて20倍希釈にて測定した。測定にはThermo Fisher Varioskan LUXを用い吸光度450nm-540nmの数値を測定、スタンダードを用い検量線を4パラメーターロジスティック曲線で作成し各サンプルの濃度を測定した。
　患者背景を表８に示す。全170症例中、非アルコール性脂肪肝(NAFL)95例、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)75例であった。肝生検時の病理組織診断にてMatteoni分類1/2をNAFL, 3/4をNASHとして診断した。FibrosisはKleinerらのNASH CRN scoring systemに準じた(ガイドラインに記載ある基準)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　各患者群における血清GPNMB値を図９に示す。血清GPNMB値はNAFL群と比較しNASH群で亢進し、発癌例で有意に高値であった。
　血清GPNMB値及びFIB－4 indexそれぞれについて、時間依存性ROC曲線に基づいてAUROCを算出した。閾値はYouden Indexを用いて設定した。5年以内の発癌について見た場合、血清GPNMB値の閾値は15.468であり、血清GPNMB値のAUROCは0.772であり、FIB－4 indexのAUROCは0.746であった。また、4年以内の発癌について見た場合の血清GPNMB値のAUROCは0.7113であり、5年以内の発癌について見た場合の血清GPNMB値のAUROCは0.7113であった。
　血清GPNMB値で分類した2群（15.4μg/mL以下、15.4μg/mL超）それぞれの累積肝発癌率を図１０に示す。検定方法はLog rank testを使用した。GPNMBにより肝癌発症を層別化できることが分かった。
　試験例4．肝臓癌の発症可能性の検査4
　慢性肝疾患患者（C型慢性肝炎患者）におけるGPNMBの肝発癌発症予測マーカーとしての有用性を明らかにすることを目的として、試験を行った。対象は、C型肝炎に対するDAA治療前に肝生検を施行しており、DAA治療により持続的ウイルス陰性化(SVR)が得られ、かつ、治療前保存血清を保管した469例である。治療前の保存血清より、試験例3と同様に血清GPNMB値を測定し、SVR後肝発癌との関連を検討した
　患者背景を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　単変量解析及び多変量解析の結果を表１０に示す。統計にはCox比例ハザードモデルを使用　単変量解析p値でGPNMBは最も低い値であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　非発癌群と発癌群における血清GPNMB値を図１１に示す。GPNMBは発癌例で有意に高値であることが分かった。
　血清GPNMB値及びFIB－4 indexそれぞれについて、時間依存性ROC曲線に基づいてAUROCを算出した。閾値はYouden Indexを用いて設定した。結果を表１１に示す。GPNMBによる肝発癌発症予測が可能であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　血清GPNMB値で分類した2群（15.4μg/mL以下、15.4μg/mL超）それぞれの累積肝発癌率を図１２に示す。検定方法はLog rank testを使用した。GPNMBにより肝癌発症を層別化できることが分かった。
　試験例5．肝臓癌の発症可能性の検査5
　慢性肝疾患患者（非アルコール性脂肪性肝疾患患者）におけるFibulinが肝発癌発症予測マーカー有用であることの再現性を検討すること目的として、試験を行った。対象は、肝生検により非アルコール性脂肪性肝疾患と診断し、以後の経過観察がなされ臨床経過を把握できた、試験例1で用いた170例を含む計476症例である。診断基準はガイドラインに準じた。患者の血液を採取後に血清分離し、血清は-80℃で保管したものを使用した。測定に使用したのはMBL Code No.CY-8120 CircuLex Human Fibulin-3/EFEMP1 ELISA Kitである。血清をキットに付属の希釈液により一律200倍に希釈して測定した。測定にはThermo Fisher Varioskan LUXを用いた。
　患者背景を表１２に示す。KleinerらのNASH CRN scoring systemでStage3,4を線維化進展例と定義した(ガイドラインに記載ある基準)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　単変量解析及び多変量解析の結果を表１３に示す。統計にはCox比例ハザードモデルを使用　単変量解析p値でFibulin3はFIB-4 indexに次いで低い値であった。今回イベント数が18なので、p値の低いものから3項目（FIB-4 index、Fibulin3、M2BPGi）を選択したモデルにて多変量解析を行ったところ、FIB-4 indexとFibulin3の2項目が有意な因子となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　血清Fibulin3値及びFIB－4 indexそれぞれについて、時間依存性ROC曲線に基づいてAUROCを算出した。結果を図１３に示す。Fibulin3による本コホートにおいても肝発癌発症予測が可能であることが分かった。
　図１３のROC曲線においてYouden indexを用いて算出した閾値(6.7μg/mL)を用いて肝癌発症を層別化できるかを検討した。順に患者全体476例、線維化進展例120例、FIB-4 index 2.67以上の120例における、Fibulin3値で分類した2群(6.7μg/mL以上および6.7μg/mL未満)それぞれの累積肝発がん率を図１４に示す。検定方法はLog rank testを使用した。全体、線維化進展例、FIB-4 index 2.67以上のいずれの集団においてもFibulin3により肝癌発症を層別化できることが分かった。

Claims (13)

  1. （1）被検体から採取された生体試料におけるFibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子を検出する工程を含む、肝臓癌の発症可能性を検査する方法。
  2. 前記工程（1）が、
    （1a）前記対象分子に対する結合性分子と前記生体試料とを接触させる工程、並びに（1b）前記結合性分子に結合した前記対象分子の量又は濃度を測定する工程、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. さらに、（2）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度に基づいて、前記被検体の肝臓癌の発症可能性を判定する工程、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記工程（2）が、
    （2a）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度がカットオフ値以上である場合に、前記被検体は肝臓癌の発症可能性が高いと判定する工程、及び／又は
    （2b）前記工程（1）で検出された前記対象分子の量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体は肝臓癌の発症可能性が低いと判定する工程
    を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記被検体が慢性肝疾患を有する被検体である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記対象分子がFibulin 3及びGPNMBからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  7. 前記生体試料が体液又は体液由来の試料である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  8. 前記体液が全血、血清、及び血漿からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記被検体がヒトである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  10. Fibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子に対する結合性分子を含む、肝臓癌の発症可能性の検査薬。
  11. Fibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子に対する結合性分子の、肝臓癌の発症可能性の検査薬の製造のための使用。
  12. Fibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子に対する結合性分子の、肝臓癌の発症可能性の検査薬としての使用。
  13. 肝臓癌の発症可能性の検査における使用のための、Fibulin 3、GPNMB、Fibulin 3 mRNA、及びGPNMB mRNAからなる群より選択される少なくとも1種の対象分子に対する結合性分子。
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