WO2024005059A1 - 標的分子の還元方法、還元装置、及び、電極 - Google Patents

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    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for reducing a target molecule, an apparatus for reducing a disulfide bond, and an electrode.
  • Patent Document 1 discloses an enzyme electrode in which a carrier, an enzyme, and a mediator are immobilized on a conductive member.
  • the enzyme electrode described in Patent Document 1 can be used as a sensor that measures current value by observing electron transfer from the enzyme to the electrode.
  • the present disclosure aims to provide a more appropriate reduction method etc. from the viewpoint of reducing a target molecule, such as by cleaving a disulfide bond that the target molecule has.
  • a method for reducing a target molecule uses a thioredoxin whose state changes between an oxidized form and a reduced form, and the reduced thioredoxin causes a disulfide bond in a target molecule present in a reaction system to be reduced. and the thioredoxin whose state has changed to the oxidized form by being oxidized by the disulfide bond in the first step is supplied with electrons from an electrode connected to an external power source outside the reaction system.
  • the first step and the second step are carried out under conditions in which the reaction system is basic.
  • a reduction device is a reduction device that reduces disulfide bonds in target molecules present in a reaction system, and includes a cell separating the reaction system from the outside, and an outside outside the reaction system. an electrode connected to a power source, and thioredoxin whose state changes between an oxidized type and a reduced type is immobilized on the surface of the electrode directly or via a linker.
  • an electrode according to one aspect of the present disclosure is an electrode for a reduction device that reduces a disulfide bond in a target molecule present in a reaction system, wherein the electrode is connected to an external power source outside the reaction system.
  • thioredoxin whose state changes between oxidized and reduced forms is immobilized directly or via a linker.
  • a more appropriate reduction method etc. can be provided from the viewpoint of reducing a target molecule.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the configuration of a disulfide bond cleavage device according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II in FIG.
  • FIG. 3A is a diagram schematically showing thioredoxin immobilized on an electrode.
  • FIG. 3B is another diagram schematically showing thioredoxin immobilized on an electrode.
  • FIG. 4 is a flowchart showing an example of a method for cleaving disulfide bonds.
  • FIG. 5 is a first diagram for explaining the embodiment.
  • FIG. 6 is a second diagram for explaining the embodiment.
  • FIG. 7 is a third diagram for explaining the embodiment.
  • FIG. 8 is a fourth diagram for explaining the embodiment.
  • FIG. 9 is a fifth diagram for explaining the embodiment.
  • FIG. 10 is a sixth diagram for explaining the embodiment.
  • a molecular species that can be used to reduce the target molecule is required.
  • an enzyme-protein combination of thioredoxin reductase and thioredoxin can be used.
  • Thioredoxin can change between two states: oxidized and reduced.
  • the reduced thioredoxin has the function of cleaving the disulfide bond of the target molecule.
  • Thioredoxin with its disulfide bond cleaved is oxidized in exchange for the cleavage of the disulfide bond, and changes to oxidized thioredoxin.
  • Thioredoxin reductase has the function of reducing oxidized thioredoxin using electrons and converting it into reduced thioredoxin. Therefore, if electrons from the electrode can be donated to thioredoxin reductase, oxidized thioredoxin can be changed to reduced thioredoxin. In other words, it is possible to repeat a cycle in which the disulfide bond of the target molecule is cleaved, the oxidized thioredoxin is changed to the reduced form, and the disulfide bond of the target molecule is cleaved again.
  • thioredoxin reductase is an enzyme, its optimum pH is determined, and when the pH is outside of a certain range, the function of converting thioredoxin into a reduced form becomes less effective. More specifically, it is known that the function of thioredoxin reductase is reduced under basic conditions.
  • thioredoxin reductase has difficulty directly receiving electrons from an electrode and requires the presence of an electron carrier usually called an electron mediator (or simply mediator).
  • thioredoxin's ability to cleave disulfide bonds can be used to cleave disulfide bonds in allergens (substances that cause allergic reactions) contained in foods. If the disulfide bonds of an allergen can be cleaved, the three-dimensional structure of the allergen changes or becomes more likely to change, which may make allergic reactions less likely to occur. In other words, technology is being developed to produce foods that contain allergens but are less likely to cause allergic reactions by cutting disulfide bonds. Typical allergens include pullulamine, ovalbumin, and ⁇ -lactoglobulin, but are not limited to these. Among all allergens in which disulfide bonds are present near the molecular surface, the above-mentioned can be applied effectively.
  • the food manufacturing process may include a step of pre-treating food ingredients under basic conditions, and if disulfide bonds can be cleaved in conjunction with this step, the process can be simplified, etc. This makes it possible to reduce food production costs.
  • the present disclosure provides a method for reducing a target molecule that can be used even under basic reaction conditions, from the viewpoint of reducing the target molecule, such as cleaving the disulfide bond that the target molecule has as in the above example. I will provide a.
  • a method for reducing a target molecule uses a thioredoxin whose state changes between an oxidized state and a reduced state, and the reduced state of thioredoxin reduces disulfide in a target molecule present in a reaction system.
  • the first step and the second step are carried out under conditions in which the reaction system is basic.
  • electrons can be donated from the electrode by immobilizing thioredoxin to the electrode directly or via a linker.
  • the reduced thioredoxin changes to the oxidized form each time the target molecule is reduced, and further changes to the reduced form by electrons donated from the electrode.
  • thioredoxin can repeatedly reduce target molecules as long as electrons continue to be donated from the electrode.
  • immobilizing thioredoxin on the electrode thioredoxin is less likely to remain in the reaction system, and can be effectively used in food processing applications.
  • the method for reducing a target molecule according to the second aspect is the method according to the first aspect, wherein the first step and the second step are performed under a pH condition in which the reaction system has a pH higher than 8.5.
  • the target molecule reduction method described above may also be used.
  • disulfide bonds can be cleaved under basic conditions where the reaction system has a pH higher than pH 8.5, and the state of oxidized thioredoxin can be changed to a reduced state.
  • the method for reducing a target molecule according to the third aspect is the method according to the first aspect or the second aspect, wherein the linker includes an alkyl chain, and the number of carbon atoms in the alkyl chain is 1 or more and 14 or less. It may also be a method of reducing the target molecule.
  • electrons can be donated from the electrode by immobilizing thioredoxin on the electrode via a linker containing an alkyl chain, in which the number of carbon atoms in the alkyl chain is 1 or more and 14 or less. .
  • the method for reducing a target molecule according to the fourth aspect the method for reducing a target molecule according to any one of the first to third aspects, wherein the electrode contains gold, platinum, glassy carbon, or ITO. It may be a method.
  • the method for reducing a target molecule according to the fifth aspect may be performed according to any one of the first to fourth aspects, wherein the target molecule is at least one of pullulamine, ovalbumin, and ⁇ -lactoglobulin.
  • the method for reducing a target molecule described in the embodiments may also be used.
  • disulfide bonds contained in at least one of pullulamine, ovalbumin, and ⁇ -lactoglobulin can be repeatedly cleaved using the electrode on which thioredoxin is immobilized.
  • an electron carrier that transports electrons to and from the thioredoxin is not immobilized on the electrode, and the second step is performed as described above.
  • the method for reducing a target molecule according to any one of the first to fifth aspects may include donating electrons from the electrode to the oxidized thioredoxin without using an electron carrier.
  • the electron donation efficiency is determined only by the reaction rate of thioredoxin itself, regardless of the reaction rate at which the electron carrier receives electrons and the reaction rate at which electrons are released from the electron carrier. Another advantage is that it is easy to improve. Furthermore, since fewer molecular species are immobilized on the electrode, it becomes easier to design the electrode, and the manufacturing quality of the electrode can be more stabilized.
  • a reduction device is a reduction device that reduces disulfide bonds in target molecules present in a reaction system, and includes a cell separating the reaction system from the outside, and a cell separating the reaction system from the outside. an electrode connected to an external power source, and thioredoxin whose state changes between oxidized and reduced forms is immobilized on the surface of the electrode directly or via a linker.
  • the disulfide bond cleavage device exhibits the same effects as the disulfide bond cleavage method described in any one of the first to sixth aspects.
  • an electrode according to an eighth aspect of the present disclosure is an electrode for a reduction device that reduces a disulfide bond in a target molecule present in a reaction system, the electrode being connected to an external power source outside the reaction system.
  • thioredoxin which changes state between oxidized and reduced forms, is immobilized directly or via a linker.
  • the electrode can be used in a reduction device that executes the method for reducing a target molecule according to any one of the first to sixth aspects. Therefore, the electrode exhibits the same effect as the method for reducing a target molecule described in any one of the first to sixth aspects.
  • the X-axis direction, Y-axis direction, and Z-axis direction which are orthogonal to each other, will be used appropriately for explanation.
  • the positive side in the Z-axis direction is sometimes described as an upper side
  • the negative side is sometimes described as a lower side.
  • dashed lines represent things that are not visible from the surface and boundaries of regions.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the configuration of a disulfide bond cleavage device according to the present embodiment.
  • the cutting device 100 transports electrons between the electrode and thioredoxin by applying a voltage to the electrode.
  • the cutting device 100 donates electrons from the electrode to thioredoxin immobilized on the surface of the electrode.
  • the cutting device 100 applies a voltage to an electrode while holding a sample containing a target molecule (for example, a sample solution) in a non-flowing state, thereby creating a bond between thioredoxin immobilized on the electrode and the target molecule in the sample. Electrons are exchanged and the target molecule is reduced.
  • the reaction system that is, the inside of the liquid containing the sample is under basic conditions.
  • basic conditions are conditions in a pH range higher than neutrality.
  • neutrality is a pH range having a predetermined range centered around pH 7 (eg, pH 6 to pH 8). Therefore, basic conditions in this embodiment mean a pH range higher than pH8.
  • a liquid in a non-flowing state means, for example, that the liquid is not being stirred or shaken (that is, it is not receiving external forces such as shearing force or vibration), and there is no movement such as fluctuation in the liquid level. It means being unable to see.
  • the cutting device 100 includes a stirring unit 40 that stirs a sample 9 containing target molecules to a fluid state, and a thioredoxin that reduces target molecules by transferring electrons to and from the target molecules.
  • the apparatus includes a fixed electrode (cathode electrode 1), a power source 20 that applies a voltage to the electrode, and a control section 30 that controls the power source 20 and the stirring section 40.
  • the voltage application section 10 includes, for example, a cathode electrode 1 (also referred to as a working electrode), a reference electrode 2, a counter electrode 3, a cell 4, a lid section 5, terminals 6a, 6b, 6c, and leads 7a, 7b, 7c. It is an electrode type cell. Note that the voltage application unit 10 may be, for example, a two-electrode cell including a working electrode (cathode electrode 1) and a counter electrode 3.
  • the cathode electrode 1 and the counter electrode 3 are made of a conductive material.
  • the conductive substance may be, for example, a carbon material, a conductive polymer material, a semiconductor, or a metal.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II in FIG. 3A and 3B are diagrams schematically showing thioredoxin immobilized on an electrode.
  • the cathode electrode 1 is an electrode on which thioredoxin is immobilized.
  • the cathode electrode 1 includes, for example, a glass substrate 11, a titanium deposited layer 12 deposited on the glass substrate 11, a cathode substrate 13 formed on the titanium deposited layer 12, and a reaction containing thioredoxin fixed to the cathode substrate 13. layer 14.
  • a conductive substrate such as gold, platinum, glassy carbon, or ITO (Indium Tin Oxide) may be used.
  • the thickness of the cathode substrate 13 is not particularly limited.
  • the electron carrier is a substance that transfers electrons between the electrode and the thioredoxin immobilized on the electrode, and includes, for example, viologen, quinone, or indophenol.
  • Thioredoxin immobilized on the surface of the electrode is a protein that reduces target molecules.
  • thioredoxin is immobilized on the cathode substrate 13 with a chain linker.
  • the linker includes, for example, an alkyl chain having 1 or more and 14 or less carbon atoms.
  • thioredoxin is immobilized directly on the surface of the electrode without a linker, as shown in Figure 3B. Note that "without a linker" means that no other molecular species is present between the surface of the electrode and the thioredoxin. However, cases in which a part of the main chain or side chain constituting thioredoxin that is involved in immobilization behaves like a linker are also included in not using a linker.
  • the reference electrode 2 is an electrode that does not react with components in the sample 9 and maintains a constant potential, and is used by a power source 20 to control the potential difference between the cathode electrode 1 and the reference electrode 2 to be constant. Ru.
  • the reference electrode 2 is, for example, a silver/silver chloride electrode.
  • the counter electrode 3 is, for example, a platinum electrode.
  • the cell 4 separates the reaction system from the outside. In the cell 4, a first space in which the cathode electrode 1 and the reference electrode 2 are arranged, and a second space in which the counter electrode 3 is arranged are connected via a connecting portion 4a.
  • the connecting portion 4a is provided with a separator 4b to prevent some components of the sample 9 in the first space and the sample 9a in the second space from moving with respect to each other.
  • the power supply 20 applies a voltage between the cathode electrode 1 and the counter electrode 3 of the voltage application section 10 in accordance with the control signal output from the control section 30, and maintains the potential between the cathode electrode 1 and the reference electrode 2 at a predetermined level. Control to value.
  • the control unit 30 performs information processing to control the voltage application of the power source 20 and the movement of the motor (not shown) of the stirring unit 40.
  • the control unit 30 is realized by, for example, a processor, a microcomputer, or a dedicated circuit.
  • the stirring section 40 controls the rotation speed and rotation time of the stirring bar 8 set in the voltage application section 10 by controlling the operation of the motor according to the control signal output from the control section 30.
  • a linker for fixing thioredoxin is immobilized on the electrode.
  • the linker may be an alkyl chain having 14 or fewer carbon atoms to allow electrons to be transferred from the electrode to the thioredoxin.
  • the linker is an alkyl chain having 1 to 14 carbon atoms.
  • the linker has a carboxyl or amino group at one end and a thiol group at the other end.
  • the linker immobilized on the electrode and thioredoxin are combined.
  • the amino group of thioredoxin and the carboxyl group of the linker are bonded by an amine coupling reaction.
  • thioredoxin is immobilized on the electrode via the linker.
  • FIG. 4 is a flowchart showing an example of a method for cleaving disulfide bonds.
  • the disulfide bond contained in the target molecule is cleaved using a three-electrode voltage application section 10 that includes a thioredoxin fixed electrode as a cathode electrode 1, an anode electrode as a counter electrode 3, and a reference electrode 2.
  • Disulfide bonds are cleaved by reducing the target molecule (S101).
  • Step S101 is an example of a first step. Step S101 is performed under basic conditions.
  • the surface area of the anode electrode is, for example, sufficiently larger than that of the cathode electrode 1.
  • thioredoxin is oxidized and converted to its oxidized form.
  • Sample 9 is an aqueous solution containing target molecules.
  • Step S102 is an example of the second step. Step S102 is performed under basic conditions. Then, by repeating step S101 and step S102, it is possible to continuously repeat the cleavage of the disulfide bond that the target molecule has. At this time, the voltage applied to the sample 9 may be controlled so that the potential of the cathode electrode 1 with respect to the reference electrode 2 becomes the oxidation potential of thioredoxin.
  • Example 1 Verification of the number of carbon atoms in the alkyl chain contained in the linker] [1-1. Thioredoxin fixed electrode 1]
  • a method for cleaving a disulfide bond of a target molecule using the thioredoxin fixed electrode of the present disclosure will be specifically described, but the present disclosure is not limited to the following Examples.
  • ⁇ -lactoglobulin was used as the target molecule.
  • the target molecule was dissolved in phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4 and adjusted to 3.3 mg/ml.
  • PBS phosphate buffered saline
  • thioredoxin-fixed electrode To prepare a thioredoxin-fixed electrode, a solution of thioredoxin dissolved in phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4 is added to a gold substrate and left to stand, allowing thioredoxin to be adsorbed onto the substrate. A fixed electrode was fabricated.
  • PBS phosphate buffered saline
  • thioredoxin fixed electrode 2 In the above-mentioned thioredoxin fixed electrode 1, an electrode without a linker, that is, in which thioredoxin was directly adsorbed, was prepared.In contrast, in the thioredoxin fixed electrode 2 of this example, thioredoxin is fixed with a linker having 5 carbon atoms (carboxyl alkane). They differ in that they are immobilized onto the substrate via thiol. Therefore, in this example, a linker solution having five carbon atoms was first prepared, and a self-assembled monolayer (SAM) of the linker was formed on a substrate. Then, the amino group of thioredoxin was bonded to the carboxyl group of the linker by an amine coupling reaction.
  • SAM self-assembled monolayer
  • thioredoxin fixed electrode 3 In the above thioredoxin fixed electrode 2, the alkyl chain contained in the linker has 5 carbon atoms, whereas in the thioredoxin fixed electrode 3 of this example, thioredoxin is attached to a linker (carboxyl alkanethiol) having 10 carbon atoms. It differs in that it is immobilized onto the substrate via. Therefore, in this example, first, a linker solution having 10 carbon atoms was prepared, and a self-assembled monolayer (SAM) of the linker was formed on a substrate. Then, the amino group of thioredoxin was bonded to the carboxyl group of the linker by an amine coupling reaction.
  • SAM self-assembled monolayer
  • Target molecule solutions were introduced as samples 9 and 9a into the cell 4 described in FIG. 1, and each electrode was set.
  • a three-electrode system electrode was used in which the prepared thioredoxin fixed electrode was used as a working electrode, a Pt (platinum) electrode was used as a counter electrode, and an Ag/AgCl (silver/silver chloride) electrode was used as a reference electrode.
  • a stirrer 8 was placed in the target molecule solution, and a predetermined voltage, which will be described later, was applied to the target molecule solution while rotating the stirrer 8 at a predetermined rotational speed (rpm).
  • the reaction system used phosphate buffered saline (PBS) with a pH of 7.4 as the initial condition, it was confirmed that the pH rose to around 11 due to the hydroxyl species generated by the end of the reaction. It was confirmed that cleavage of disulfide bonds proceeded under these conditions. That is, the reaction system is under basic conditions, as long as it remains basic (pH range higher than pH 8.0) during at least a part of the period from the start of the reaction to the end of the reaction.
  • a predetermined potential is applied, so in a normal aqueous solution system, it is assumed that the pH will gradually increase, and disulfide bond cleavage will occur under basic conditions. Being able to do so can be an advantage.
  • the sample after voltage application was mixed with digestive enzymes and reacted at 37°C for 30 minutes, followed by analysis by SDS-PAGE. A similar analysis was performed on the sample before voltage was applied, and the relative amount of disulfide bond cleavage, taking this as 100%, was calculated by image analysis.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the applied potential and the relative amount of disulfide bond cleavage in Example 1.
  • the horizontal axis shows the potential applied between the working electrode and the counter electrode
  • the vertical axis shows the relative amount of disulfide bonds broken at each applied potential.
  • disulfide bonds are rapidly broken at an applied potential of -0.8V, reaching a peak of -1.0V, and at lower potentials, the relative amount of disulfide bonds broken decreases. It was shown that In the following examples, disulfide bonds will be cleaved at an applied potential of -1.0V.
  • FIG. 6 is a graph showing the verification results of Example 1.
  • the horizontal axis shows each thioredoxin-immobilized electrode type
  • the vertical axis shows the relative amount of disulfide bond cleaved in each thioredoxin-immobilized electrode type.
  • about 80% of disulfide bonds were cleaved in the thioredoxin fixed electrode 1 (adsorption) in which thioredoxin was directly adsorbed.
  • thioredoxin fixed electrode 2 showed the highest amount of cutting.
  • the disulfide bond cleavage efficiency decreases due to the lack of freedom in orientation direction of thioredoxin, while in electrodes in which thioredoxin is immobilized through a linker with 10 carbon atoms Therefore, it is presumed that the efficiency of disulfide bond cleavage decreased as the efficiency of electron transfer from the electrode surface to thioredoxin decreased.
  • Example 2 Verification of appropriate pH range in reaction system
  • thioredoxin fixed electrode 2 appropriate conditions for the pH of the reaction system were verified.
  • a comparison will be made between a case in which disulfide bonds are cleaved in a system that can maintain a pH of about 10 and a case in which a disulfide bond is cleaved in a system that can maintain a pH of about 8 or less.
  • FIG. 7 is a graph showing changes over time in the relative amount of disulfide bond cleavage when disulfide bonds are cleaved in a system that can maintain pH 10. Further, FIG.
  • FIGS. 7 and 8 are graph showing changes over time in the relative amount of disulfide bond cleavage when disulfide bonds are cleaved in a system that can maintain pH 8 or lower.
  • black circles and solid lines indicate the relative amount of disulfide bond cleavage
  • open circles and broken lines indicate the pH of the reaction system.
  • the disulfide bond cleavage reaction does not proceed except for the first 2 hours, and in a system that can maintain a pH of about 10, the entire disulfide bond cleavage reaction occurs during the reaction. It was shown that the disulfide bond cleavage reaction progressed during this period.
  • FIG. 9 is a graph showing changes over time in the relative amount of disulfide bond cleavage when disulfide bonds are cleaved under conditions where the pH changes over time from about 7.5 to about 10.5. be.
  • black circles and solid lines indicate the relative amount of disulfide bond cleavage
  • open circles and broken lines indicate the pH of the reaction system.
  • FIG. 10 is a graph organized into the relationship between the pH of the reaction system and the relative amount of disulfide bond cleavage, with the reaction time conditions fixed.
  • disulfide bond cleavage rapidly progresses from the point at which pH exceeds 8.5.

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Abstract

標的分子の還元方法は、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンであって、還元型のチオレドキシンによって、反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する第１の工程と、第１の工程においてジスルフィド結合によって酸化されることにより状態が酸化型に変化したチオレドキシンに、反応系外の外部電源に接続された電極から電子を供与して還元することにより、酸化型のチオレドキシンの状態を還元型に変化させる第２の工程と、を含み、チオレドキシンは、電極の表面に直接またはリンカーを介して固定化されており、第１の工程および第２の工程は、反応系が塩基性の条件で実施される。

Description

標的分子の還元方法、還元装置、及び、電極
　本開示は、標的分子の還元方法、ジスルフィド結合の還元装置、及び、電極に関する。
　電極に酵素を固定することで、電極と酵素との間の電子の伝達を種々の用途に利用できることが知られている。例えば、特許文献１には、導電性部材に担体、酵素、メディエータを固定化した酵素電極が開示されている。
特開２００６－０５８２８９号公報
　特許文献１に記載の酵素電極は、酵素から電極への電子移動を観測して電流値を計測するセンサーとして使用できる。
　ところで、電極から供与される電子を用いて、標的分子が有するジスルフィド結合を還元することにより切断する（言い換えると開裂させる）、などの標的分子の還元のためには、適切な還元方法が必要となる。
　そこで、本開示は、標的分子が有するジスルフィド結合の切断など、標的分子を還元するという観点で、より適切な還元方法等を提供することを目的とする。
　本開示の一態様に係る標的分子の還元方法は、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンであって、前記還元型のチオレドキシンによって、反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する第１の工程と、前記第１の工程において前記ジスルフィド結合によって酸化されることにより状態が前記酸化型に変化した前記チオレドキシンに、前記反応系外の外部電源に接続された電極から電子を供与して還元することにより、前記酸化型の前記チオレドキシンの状態を前記還元型に変化させる第２の工程と、を含み、前記チオレドキシンは、前記電極の表面に直接またはリンカーを介して固定化されており、前記第１の工程および前記第２の工程は、前記反応系が塩基性の条件で実施される。
　また、本開示の一態様に係る還元装置は、反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する還元装置であって、前記反応系を外部と隔てるセルと、前記反応系外の外部電源に接続された電極と、を備え、前記電極の表面には、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンが直接またはリンカーを介して固定化されている。
　また、本開示の一態様に係る電極は、反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する還元装置用の電極であって、前記電極は、前記反応系外の外部電源に接続され、表面に、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンが直接またはリンカーを介して固定化されている。
　本開示によれば、標的分子を還元するという観点で、より適切な還元方法等を提供することができる。
図１は、本実施の形態に係るジスルフィド結合の切断装置の構成の一例を示す図である。 図２は、図１のＩＩ－ＩＩ線における断面図である。 図３Ａは、電極上に固定されたチオレドキシンを模式的に示す図である。 図３Ｂは、電極上に固定されたチオレドキシンを模式的に示す別の図である。 図４は、ジスルフィド結合の切断方法の一例を示すフローチャートである。 図５は、実施例を説明するための第１図である。 図６は、実施例を説明するための第２図である。 図７は、実施例を説明するための第３図である。 図８は、実施例を説明するための第４図である。 図９は、実施例を説明するための第５図である。 図１０は、実施例を説明するための第６図である。
　（本開示に至った知見）
　電極から供与される電子を用いて、標的分子が有するジスルフィド結合を還元することにより切断する、などの標的分子の還元のためには、電極から供与された電子を受け取り、この電子を還元力として用いて標的分子の還元に用いることができる分子種が必要となる。このような分子種として、上記の一例では、従来チオレドキシンレダクターゼ及びチオレドキシンという酵素－タンパク質の組合せを利用できることが知られている。チオレドキシンは、酸化型と還元型との２つの状態の間を変化することができる。そして、還元型のチオレドキシンには、標的分子が有するジスルフィド結合を切断する機能がある。ジスルフィド結合を切断したチオレドキシンは、ジスルフィド結合の切断と引き換えに酸化されて、酸化型のチオレドキシンに変化する。
　チオレドキシンレダクターゼは、酸化型のチオレドキシンを、電子を用いて還元して、還元型のチオレドキシンに変化させる機能がある。そのため、電極からの電子をチオレドキシンレダクターゼに供与できれば、酸化型のチオレドキシンを還元型のチオレドキシンに変化させることができる。つまり、標的分子が有するジスルフィド結合を切断し、酸化型となったチオレドキシンを還元型に変化させ、再び標的分子が有するジスルフィド結合を切断するというサイクルを回転させることができる。ただし、チオレドキシンレダクターゼは、酵素である以上、至適ｐＨが決められており、あるｐＨ範囲の条件を外れるとチオレドキシンを還元型に変化させる機能が作用し難くなる。より具体的には、塩基性の条件下において、チオレドキシンレダクターゼの機能が低下することが知られている。
　また、チオレドキシンレダクターゼは、電極からの電子を直接的に受け取ることが困難であり、通常電子メディエータ（又は単にメディエータ）と呼ばれる電子伝達体の存在を必要とすることが知られている。
　一方、ジスルフィド結合を切断するというチオレドキシンの機能を利用して、食品に含まれるアレルゲン（アレルギー反応を生じさせる原因物質）のジスルフィド結合を切断するという用途がある。アレルゲンのジスルフィド結合を切断できれば、当該アレルゲンの立体構造が変化する、または、変化しやすくなることから、アレルギー反応が生じにくくなる可能性がある。つまり、ジスルフィド結合の切断処理によって、アレルゲンを含みながらもアレルギー反応を生じにくい食品を製造するという技術の開発が進められている。アレルゲンとしては、プルラミン、卵白アルブミン、および、β－ラクトグロブリンなどが代表的であるが、これらに限らないあらゆるアレルゲンであって、ジスルフィド結合が、特に、分子表面付近に存在するアレルゲンについて、上記のことを効果的に適用することができる。
　食品の製造過程には、塩基性の条件で食品の原料となる食材の前処理をする工程を含む場合があり、この工程にジスルフィド結合の切断を併せて行うことができれば、工程の簡略化などが可能となり、食品製造コストを低減させることにもつながりうる。
　しかしながら、上記したように、チオレドキシンレダクターゼを用いる系では、チオレドキシンレダクターゼの機能が低下するために、塩基性の条件下で使用することが困難である。そこで、本開示では、上記の一例のように標的分子が有するジスルフィド結合を切断する、などの標的分子の還元という観点で、その反応条件が塩基性条件下でも使用可能な標的分子の還元方法等を提供する。
　（本開示の一態様）
　本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
　本開示の第１態様に係る標的分子の還元方法は、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンであって、前記還元型のチオレドキシンによって、反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する第１の工程と、前記第１の工程において前記ジスルフィド結合によって酸化されることにより状態が前記酸化型に変化した前記チオレドキシンに、前記反応系外の外部電源に接続された電極から電子を供与して還元することにより、前記酸化型の前記チオレドキシンの状態を前記還元型に変化させる第２の工程と、を含み、前記チオレドキシンは、前記電極の表面に直接またはリンカーを介して固定化されており、前記第１の工程および前記第２の工程は、前記反応系が塩基性の条件で実施される。
　このような標的分子の還元方法によれば、チオレドキシンを電極に直接またはリンカーを介して固定化することで電極からの電子の供与を可能にできる。還元型のチオレドキシンは、標的分子を還元する度に酸化型に変化し、さらに、電極から供与される電子によって還元型に変化する。これにより、チオレドキシンは、電極から電子が供与され続ける限り、標的分子の還元を繰り返し行うことができる。また、チオレドキシンの電極への固定化によって、チオレドキシンが反応系に残留しにくくなり、食品加工用途などにおいて有効に作用させることができる。さらに、チオレドキシンが電極に固定化される際に、チオレドキシンの立体構造が変化し、塩基性の条件でジスルフィド結合を切断すること及び酸化型のチオレドキシンの状態を還元型に変化させることが可能となる。よって、標的分子が有するジスルフィド結合を切断するという観点で、その反応条件が塩基性条件下でも使用可能なジスルフィド結合の切断方法を実現できる。
　また、例えば、第２態様に係る標的分子の還元方法は、前記第１の工程および前記第２の工程が、前記反応系がｐＨ８．５よりも大きいｐＨ条件で実施される、第１態様に記載の標的分子の還元方法であってもよい。
　これによれば、反応系がｐＨ８．５よりも大きいｐＨである塩基性の条件でジスルフィド結合を切断すること及び酸化型のチオレドキシンの状態を還元型に変化させることができる。
　また、例えば、第３態様に係る標的分子の還元方法は、前記リンカーが、アルキル鎖を含み、前記アルキル鎖の炭素数が、１以上１４以下である、第１態様又は第２態様に記載の標的分子の還元方法であってもよい。
　これによれば、アルキル鎖を含むリンカーであって、アルキル鎖の炭素数が、１以上１４以下であるリンカーを介してチオレドキシンを電極に固定化することで電極からの電子の供与を可能にできる。
　また、例えば、第４態様に係る標的分子の還元方法は、前記電極が、金、白金、グラッシーカーボンまたはＩＴＯを含む、第１態様～第３態様のいずれか一態様に記載の標的分子の還元方法であってもよい。
　これによれば、金、白金、グラッシーカーボンまたはＩＴＯを含む、チオレドキシンが固定化された電極によってジスルフィド結合の切断を繰り返し行うことができる。
　また、例えば、第５態様に係る標的分子の還元方法は、前記標的分子が、プルラミン、卵白アルブミン、および、β－ラクトグロブリンの少なくともいずれかである、第１態様～第４態様のいずれか一態様に記載の標的分子の還元方法であってもよい。
　これによれば、チオレドキシンが固定化された電極によって、プルラミン、卵白アルブミン、および、β－ラクトグロブリンの少なくともいずれかに含まれるジスルフィド結合の切断を繰り返し行うことができる。
　また、例えば、第６態様に係る標的分子の還元方法は、前記電極には、前記チオレドキシンとの間の電子輸送を行う電子伝達体が固定化されておらず、前記第２の工程が、前記電子伝達体を介さずに前記電極から前記酸化型の前記チオレドキシンに電子を供与する、第１態様～第５態様のいずれか一態様に記載の標的分子の還元方法であってもよい。
　これによれば、チオレドキシンに電子を供与する際に、電子伝達体を介することなく、電極からチオレドキシンに電子を供与することができる。このとき、チオレドキシンが電極に直接または炭素数が１以上１４以下等の比較的短いリンカーを介して電極の近傍に固定化されていれば、電子伝達体を介さなくとも、電子の供与効率を低下させにくくすることができる。さらには、電子伝達体が電子を受け取る反応速度、及び、電子伝達体から電子が放出される反応速度によらず、単にチオレドキシン自身の電子を受け取る反応速度にのみ律速されるため、電子の供与効率を向上させやすいというメリットもある。また、電極に固定化する分子種が少なくなるため、電極をより設計しやすく、かつ、電極の製造品質をより安定化させることが可能となる。
　また、本開示の第７態様に係る還元装置は、反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する還元装置であって、前記反応系を外部と隔てるセルと、前記反応系外の外部電源に接続された電極と、を備え、前記電極の表面には、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンが直接またはリンカーを介して固定化されている。
　このような還元装置によれば、第１態様～第６態様のいずれか一態様に記載の標的分子の還元方法を実行する還元装置を実現できる。そのため、ジスルフィド結合の切断装置は、第１態様～第６態様のいずれか一態様記載のジスルフィド結合の切断方法と同様の効果を奏する。
　また、本開示の第８態様に係る電極は、反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する還元装置用の電極であって、前記電極は、前記反応系外の外部電源に接続され、表面に、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンが直接またはリンカーを介して固定化されている。
　このような電極によれば、第１態様～第６態様のいずれか一態様に記載の標的分子の還元方法を実行する還元装置に電極を利用することができる。そのため、電極は、第１態様～第６態様のいずれか一態様記載の標的分子の還元方法と同様の効果を奏する。
　なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、装置、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ－ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、装置、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
　以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。
　また、各図において、それぞれ互いに直交するＸ軸方向、Ｙ軸方向、及びＺ軸方向を適宜用いて説明する。特に、Ｚ軸方向のプラス側を上側、マイナス側を下側として説明する場合がある。
　また、本開示において、平行及び垂直などの要素間の関係性を示す用語、及び、矩形などの要素の形状を示す用語、並びに、数値は、厳格な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば数％程度の差異をも含むことを意味する。
　また、本開示の図面において、破線は、表面から見えないもの及び領域の境界を表す。
　（実施の形態）
　以下、実施の形態について、図１から図４を参照しながら具体的に説明する。
　［ジスルフィド結合の切断装置］
　［１．概要］
　まず、図１を参照しながら、実施の形態における標的分子の還元装置の一例としてジスルフィド結合の切断装置（以下、単に切断装置という場合がある）の概要について説明する。図１は、本実施の形態に係るジスルフィド結合の切断装置の構成の一例を示す図である。
　切断装置１００は、電極に電圧が印加されることにより、電極とチオレドキシンとの間の電子輸送を行う。例えば、切断装置１００は、電極から電極の表面に固定化されたチオレドキシンに電子を供与する。これにより、電極と試料中の標的分子との間で電子授受が起こるため、標的分子のジスルフィド結合が還元され、切断される。例えば、切断装置１００は、標的分子を含む試料（例えば、サンプル溶液）を非流動状態で、電極に電圧を印加することで、電極に固定化されたチオレドキシンと試料中の標的分子との間で電子授受が行われ、標的分子が還元される。そして、液体を非流動状態から流動状態に切り替えることにより、還元された標的分子を液体中に拡散させる。このように、液体の流動状態の切り替えを繰り返すことで、液体全体で、標的分子を効率良く還元することができる。このとき、反応系、すなわち、試料を含む液体内は、塩基性の条件となっている。なお、塩基性の条件とは、中性よりも高いｐＨ範囲の条件である。通常、中性とは、ｐＨ７を中心とする所定範囲（例えば、ｐＨ６～ｐＨ８）を有するｐＨ範囲である。そのため、本実施の形態における塩基性の条件とは、ｐＨ８よりも高いｐＨ範囲を意味する。
　なお、液体が非流動状態であるとは、例えば、液体が撹拌又は振盪されておらず（つまり、剪断力、又は、振動などの外力を受けておらず）、液面にゆらぎなどの動きが見られない状態をいう。
　［２．構成］
　続いて、実施の形態における切断装置１００の構成について図１から図３Ｂを参照しながら説明する。
　図１に示されるように、切断装置１００は、標的分子を含む試料９を撹拌して流動状態にする撹拌部４０と、標的分子との間で電子授受を行うことにより標的分子を還元するチオレドキシンが固定された電極（カソード電極１）と、電極に電圧を印加する電源２０と、電源２０及び撹拌部４０を制御する制御部３０と、を備える。
　電圧印加部１０は、例えば、カソード電極１（作用極ともいう）、参照極２、対極３、セル４、蓋部５、端子６ａ、６ｂ、６ｃ、及び、リード７ａ、７ｂ、７ｃを備える三電極式セルである。なお、電圧印加部１０は、例えば、作用極（カソード電極１）及び対極３を備える二電極式セルであってもよい。
　カソード電極１及び対極３は、導電性物質から構成される。導電性物質としては、例えば、炭素材料、導電性ポリマー材料、半導体、又は、金属などであってもよい。
　まず、カソード電極１について、図２、図３Ａ及び図３Ｂを参照しながら説明する。図２は、図１のＩＩ－ＩＩ線における断面図である。図３Ａ及び図３Ｂは、電極上に固定されたチオレドキシンを模式的に示す図である。
　カソード電極１は、チオレドキシンが固定された電極である。カソード電極１は、例えば、ガラス基板１１と、ガラス基板１１上に蒸着されたチタン蒸着層１２と、チタン蒸着層１２に形成されたカソード基板１３と、カソード基板１３に固定されたチオレドキシンを含む反応層１４とを有する。
　カソード基板１３としては、例えば、金、白金、グラッシーカーボン、又は、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ　Ｔｉｎ　Ｏｘｉｄｅ）などの導電性基板を用いてもよい。カソード基板１３の厚みは特に限定されない。
　カソード基板１３には、電子伝達体は固定されていない。電子伝達体とは、電極と電極上に固定されたチオレドキシンとの間の電子授受を行う物質であり、例えば、ビオローゲン、キノン、又は、インドフェノールなどが挙げられる。
　電極の表面（いわゆる、カソード基板１３）に固定化されるチオレドキシンは、標的分子を還元するタンパク質である。チオレドキシンは、図３Ａに示すように、鎖状のリンカーでカソード基板１３上に固定化されている。リンカーは、例えば、炭素数が１以上１４以下のアルキル鎖を含む。あるいは、チオレドキシンは、図３Ｂに示すように、リンカーを介することなく、電極の表面に直接固定化されている。なお、リンカーを介することなく、とは、電極の表面と、チオレドキシンとの間に他の分子種を介在しないことを意味する。ただし、チオレドキシンを構成する主鎖または側鎖の一部であって、固定化に関与する一部がリンカー様にふるまう場合もリンカーを介していないことに含まれる。
　参照極２は、試料９中の成分とは反応せず、一定の電位を維持する電極であり、電源２０によりカソード電極１と参照極２との間の電位差を一定に制御するために使用される。参照極２は、例えば、銀／塩化銀電極である。対極３は、例えば、白金電極である。本実施の形態では、セル４は、反応系を外部と隔てている。セル４は、カソード電極１及び参照極２が配置された第１空間と、対極３が配置された第２空間とが接続部４ａを介して接続されている。接続部４ａには、セパレータ４ｂが備えられ、第１空間の試料９と、第２空間の試料９ａとのうち、一部の成分が互いに移動しないようになっている。
　電源２０は、制御部３０から出力された制御信号に従って、電圧印加部１０のカソード電極１と対極３との間に電圧を印加し、カソード電極１と参照極２との間の電位を所定の値に制御する。
　制御部３０は、電源２０の電圧印加及び撹拌部４０のモータ（不図示）の動きを制御するための情報処理を行う。制御部３０は、例えば、プロセッサ、マイクロコンピュータ又は専用回路によって実現される。
　撹拌部４０は、制御部３０から出力された制御信号に従って、モータの動作を制御することにより、電圧印加部１０の中にセットされた撹拌子８の回転速度及び回転時間を制御する。
　チオレドキシン固定電極の製造方法では、チオレドキシンの固定用リンカーを電極上に固定化する。リンカーを、エタノール：アセトニトリル＝１：１の溶液に溶解し、電極を、例えば、１時間以上浸漬して静置することで固定化する。リンカーは、電子が電極からチオレドキシンに移動できるようにするため、炭素数が１４以下のアルキル鎖であるとよい。例えば、リンカーは、炭素数が１以上１４以下のアルキル鎖である。特に、リンカーは、一方の末端にカルボキシル基又はアミノ基を有し、他方の末端にはチオール基を有する。
　続いて、電極上に固定化されたリンカーとチオレドキシンとを結合させる。このとき、例えば、チオレドキシンのアミノ基とリンカーのカルボキシル基とがアミンカップリング反応により結合される。これにより、チオレドキシンがリンカーを介して電極上に固定化される。
　なお、チオレドキシンを直接電極に固定化する場合、リンカーの固定化のステップは省略される。
　［３．標的分子の還元方法（ジスルフィド結合の切断方法）］
　続いて、標的分子の還元方法の一例としてジスルフィド結合の切断方法について図４を参照しながら説明する。図４は、ジスルフィド結合の切断方法の一例を示すフローチャートである。
　標的分子が有するジスルフィド結合の切断方法は、カソード電極１としてチオレドキシン固定電極と、対極３としてアノード電極と、参照極２とを備える三電極方式の電圧印加部１０を用いて、試料９に含まれる標的分子を還元することにより、ジスルフィド結合を切断する（Ｓ１０１）。ステップＳ１０１は、第１の工程の一例である。ステップＳ１０１は、塩基性条件で行われる。アノード電極の表面積は、例えば、カソード電極１よりも十分大きい。ジスルフィド結合を切断した結果、チオレドキシンは、酸化されて酸化型に変化する。試料９は、標的分子を含む水溶液である。
　続いて、酸化型に変化したチオレドキシンを再び還元して還元型に変化させる（Ｓ１０２）。ステップＳ１０２は、第２の工程の一例である。ステップＳ１０２は、塩基性条件で行われる。そして、ステップＳ１０１とステップＳ１０２とを繰り返すことにより、継続的に標的分子が有するジスルフィド結合の切断を繰り返すことができる。このとき、試料９に印加する電圧は、参照極２に対するカソード電極１の電位がチオレドキシンの酸化電位となるように制御されてもよい。
　［実施例１：リンカーに含まれるアルキル鎖の炭素数の検証］
　［１－１．チオレドキシン固定電極１］
　以下、実施例にて本開示のチオレドキシン固定電極を用いた標的分子のジスルフィド結合の切断方法について具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
　以下の実施例では、標的分子としてβ－ラクトグロブリンを用いた。
　標的分子をｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解して３．３ミリグラム／ミリリットルに調整した。
　チオレドキシン固定電極の作製には、金基板上に、チオレドキシンをｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した溶液を添加して静置し、チオレドキシンを基板に吸着させることにより、チオレドキシン固定電極を作製した。
　［１－２．チオレドキシン固定電極２］
　上記のチオレドキシン固定電極１では、リンカーのない、すなわち、チオレドキシンが直接吸着された電極を作製したのに対して、本例のチオレドキシン固定電極２では、チオレドキシンを炭素数が５個のリンカー（カルボキシルアルカンチオール）を介して基板上へ固定化する点で異なる。そのため、本実施例では、まず、炭素数が５個のリンカー溶液を準備し、リンカーの自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を基板上に形成させた。そして、チオレドキシンのアミノ基をリンカーのカルボキシル基とアミンカップリング反応により結合させた。
　［１－３．チオレドキシン固定電極３］
　上記のチオレドキシン固定電極２では、リンカーに含まれるアルキル鎖の炭素数が５個であるのに対して、本例のチオレドキシン固定電極３では、チオレドキシンを炭素数が１０個のリンカー（カルボキシルアルカンチオール）を介して基板上へ固定化する点で異なる。そのため、本実施例では、まず、炭素数が１０個のリンカー溶液を準備し、リンカーの自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を基板上に形成させた。そして、チオレドキシンのアミノ基をリンカーのカルボキシル基とアミンカップリング反応により結合させた。
　［１－４．チオレドキシン固定電極４（比較例）］
　上記のチオレドキシン固定電極２では、リンカーに含まれるアルキル鎖の炭素数が５個であるのに対して、本例のチオレドキシン固定電極４では、チオレドキシンを炭素数が１５個のリンカー（カルボキシルアルカンチオール）を介して基板上へ固定化する点で異なる。そのため、本実施例では、まず、炭素数が１５個のリンカー溶液を準備し、リンカーの自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を基板上に形成させた。そして、チオレドキシンのアミノ基をリンカーのカルボキシル基とアミンカップリング反応により結合させた。
　［１－５．検証結果］
　図１に説明したセル４に標的分子溶液を試料９及び９ａとして導入し、各電極をセットした。電極は作製されたチオレドキシン固定電極を作用極とし、Ｐｔ（白金）電極を対極とし、Ａｇ／ＡｇＣｌ（銀／塩化銀）電極を参照極とした三電極系の電極を用いた。次いで、標的分子溶液に撹拌子８を入れ、撹拌子８を所定の回転速度（ｒｐｍ）で回転させながら標的分子溶液に、後述する所定の電圧を印加した。なお、反応系は、初期条件としてｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いているが、反応終了時までに発生するヒドロキシ基種によってｐＨが１１付近まで上昇することを確認し、その条件において、ジスルフィド結合の切断が進行されることを確認した。つまり、反応系が塩基性の条件である、とは、反応開始時点から反応終了時点までの少なくとも一部の期間において、塩基性（ｐＨ８．０より高いｐＨ範囲）となればよい。特に、本開示におけるジスルフィド結合の切断方法では、所定の電位の印加を行うため、通常の水溶液系であれば、ｐＨは徐々に上昇することが想定され、塩基性の条件でジスルフィド結合の切断が可能であることは、メリットとなりうる。
　標的分子のジスルフィド結合の開裂の確認には、電圧印加後の試料を消化酵素と混合して３７℃で３０分反応させた後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析を行った。電圧をかける前の試料についても同様の分析を行い、これを１００％とした場合の相対的なジスルフィド結合の切断量を画像解析によって算出した。
　ここで、図５は、実施例１における印加電位と、ジスルフィド結合の相対的な切断量との関係を示すグラフである。図５では、横軸に、作用極と対極との間に印加した電位を示し、縦軸に、各印加電位において切断されたジスルフィド結合の相対的な切断量を示している。図５に示すように、印加電位が－０．８Ｖから急激にジスルフィド結合の切断が起こり、－１．０Ｖを頂点に、それよりも低い電位では、ジスルフィド結合の相対的な切断量が低下することが示された。以降の実施例では、－１．０Ｖの印加電位でジスルフィド結合の切断を行うこととする。
　実施例１の検証結果を図６に示す。図６は、実施例１の検証結果を示すグラフである。図６では、横軸に、各チオレドキシン固定電極種を示し、縦軸に、各チオレドキシン固定電極種において切断されたジスルフィド結合の相対的な切断量を示している。図６に示すように、チオレドキシンを直接吸着させた、チオレドキシン固定電極１（吸着）では、約８０％のジスルフィド結合が切断された。また、炭素数が５個のリンカーを介してチオレドキシンを固定化した、チオレドキシン固定電極２（Ｃ＝５）では、約９０％のジスルフィド結合が切断された。また、炭素数が１０個のリンカーを介してチオレドキシンを固定化した、チオレドキシン固定電極３（Ｃ＝１０）では、約８０％のジスルフィド結合が切断された。これに対して、炭素数が１５個のリンカーを介してチオレドキシンを固定化した、チオレドキシン固定電極４（Ｃ＝１５）では、切断されたジスルフィド結合は１０％にも満たないことが示された。
　この結果から、チオレドキシン固定電極２が最も高い切断量を示した。直接吸着によってチオレドキシンを固定化した電極では、チオレドキシンの配向方向などの自由度がない分、ジスルフィド結合の切断効率が低下し、一方で炭素数が１０個のリンカーを介してチオレドキシンを固定化した電極では、電極表面からチオレドキシンへの電子伝達の効率が低くなる分、ジスルフィド結合の切断効率が低下したものと推定される。
　［実施例２：反応系における適切なｐＨ範囲の検証］
　次に、チオレドキシン固定電極２を用いて、反応系のｐＨの適切な条件を検証した。ここでは、約ｐＨ１０を維持可能な系において、ジスルフィド結合の切断を行った場合と、約ｐＨ８以下を維持可能な系においてジスルフィド結合の切断を行った場合とを比較して説明する。図７は、ｐＨ１０を維持可能な系において、ジスルフィド結合の切断を行ったときのジスルフィド結合の相対的な切断量の経時変化を示すグラフである。また、図８は、ｐＨ８以下を維持可能な系において、ジスルフィド結合の切断を行ったときのジスルフィド結合の相対的な切断量の経時変化を示すグラフである。なお、図７及び図８では、黒丸印及び実線がジスルフィド結合の相対的な切断量を示し、白抜き丸印及び破線が反応系のｐＨを示している。
　図７及び図８に示すように、約ｐＨ８以下を維持可能な系では、最初の２時間を除いてジスルフィド結合の切断反応が進行せず、約ｐＨ１０を維持可能な系では、反応中の全期間においてジスルフィド結合の切断反応が進行することが示された。
　さらに、図９は、ｐＨが約７．５から約１０．５まで経時的に変化する条件において、ジスルフィド結合の切断を行った場合のジスルフィド結合の相対的な切断量の経時変化を示すグラフである。図９では、黒丸印及び実線がジスルフィド結合の相対的な切断量を示し、白抜き丸印及び破線が反応系のｐＨを示している。また、図１０は、反応時間の条件を固定し、反応系のｐＨと、ジスルフィド結合の相対的な切断量との関係に整理したグラフである。
　図９及び図１０に示すように、ｐＨが８．５を超える時点から急速にジスルフィド結合の切断が進行することが示された。これらの結果から、本実施例において作製したチオレドキシン固定電極では、ｐＨが８．５よりも大きいｐＨ条件で、ジスルフィド結合の切断が行われることが好ましいことが示された。
　以上、本開示に係るジスルフィド結合の切断方法、ジスルフィド結合の切断装置、及び、電極について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。
　本開示によれば、標的分子の還元において有用である。
　１　カソード電極
　２　参照極
　３　対極
　４　セル
　４ａ　接続部
　４ｂ　セパレータ
　５　蓋部
　６ａ　端子
　６ｂ　端子
　６ｃ　端子
　７ａ　リード
　７ｂ　リード
　７ｃ　リード
　８　撹拌子
　９、９ａ　試料
　１０　電圧印加部
　１１　ガラス基板
　１２　チタン蒸着層
　１３　カソード基板
　１４　反応層
　２０　電源
　３０　制御部
　４０　撹拌部
　１００　切断装置

Claims (8)

  1. 　状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンであって、前記還元型のチオレドキシンによって、反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する第１の工程と、
    　前記第１の工程において前記ジスルフィド結合によって酸化されることにより状態が前記酸化型に変化した前記チオレドキシンに、前記反応系外の外部電源に接続された電極から電子を供与して還元することにより、前記酸化型の前記チオレドキシンの状態を前記還元型に変化させる第２の工程と、を含み、
    　前記チオレドキシンは、前記電極の表面に直接またはリンカーを介して固定化されており、
    　前記第１の工程および前記第２の工程は、前記反応系が塩基性の条件で実施される、
    　標的分子の還元方法。
  2. 　前記第１の工程および前記第２の工程は、前記反応系がｐＨ８．５よりも大きいｐＨ条件で実施される、
    　請求項１に記載の標的分子の還元方法。
  3. 　前記リンカーは、アルキル鎖を含み、
    　前記アルキル鎖の炭素数は、１以上１４以下である、
    　請求項１に記載の標的分子の還元方法。
  4. 　前記電極は、金、白金、グラッシーカーボンまたはＩＴＯを含む、
    　請求項１に記載の標的分子の還元方法。
  5. 　前記標的分子は、プルラミン、卵白アルブミン、および、β－ラクトグロブリンの少なくともいずれかである、
    　請求項１に記載の標的分子の還元方法。
  6. 　前記電極には、前記チオレドキシンとの間の電子輸送を行う電子伝達体が固定化されておらず、
    　前記第２の工程は、前記電子伝達体を介さずに前記電極から前記酸化型の前記チオレドキシンに電子を供与する、
    　請求項１～５のいずれか１項に記載の標的分子の還元方法。
  7. 　反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する還元装置であって、
    　前記反応系を外部と隔てるセルと、
    　前記反応系外の外部電源に接続された電極と、を備え、
    　前記電極の表面には、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンが直接またはリンカーを介して固定化されている、
    　還元装置。
  8. 　反応系中に存在する標的分子中のジスルフィド結合を還元する還元装置用の電極であって、
    　前記電極は、
    　前記反応系外の外部電源に接続され、
    　表面に、状態が酸化型及び還元型の間で変化するチオレドキシンが直接またはリンカーを介して固定化されている、
    　電極。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS372022B1 (ja) * 1958-01-14 1962-05-16
JP2004187625A (ja) * 2002-12-13 2004-07-08 Higeta Shoyu Co Ltd 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法
JP2006058289A (ja) 2004-07-23 2006-03-02 Canon Inc 酵素電極、センサ、燃料電池、電気化学反応装置
JP2011162838A (ja) * 2010-02-09 2011-08-25 Mitsubishi Electric Corp 活性酸素種生成装置
US20170113951A1 (en) * 2015-10-27 2017-04-27 Massachusetts Institute Of Technology Electrochemical devices or systems comprising redox-functionalized electrodes and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003903504A0 (en) * 2003-07-08 2003-07-24 Johnson, Daniel Improvements in sensor chips
CN115768865A (zh) * 2020-06-23 2023-03-07 松下知识产权经营株式会社 过敏原的灭活方法及过敏原灭活装置
CA3188175A1 (en) * 2020-06-23 2021-12-30 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. Method for cleaving disulfide bond in protein and device for cleaving disulfide bond in protein

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS372022B1 (ja) * 1958-01-14 1962-05-16
JP2004187625A (ja) * 2002-12-13 2004-07-08 Higeta Shoyu Co Ltd 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法
JP2006058289A (ja) 2004-07-23 2006-03-02 Canon Inc 酵素電極、センサ、燃料電池、電気化学反応装置
JP2011162838A (ja) * 2010-02-09 2011-08-25 Mitsubishi Electric Corp 活性酸素種生成装置
US20170113951A1 (en) * 2015-10-27 2017-04-27 Massachusetts Institute Of Technology Electrochemical devices or systems comprising redox-functionalized electrodes and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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