WO2024019127A1 - ヒアルロン酸誘導体医薬組成物及び医薬組成物の製造方法 - Google Patents

ヒアルロン酸誘導体医薬組成物及び医薬組成物の製造方法 Download PDF

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    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition and a method for producing the pharmaceutical composition.
  • This application is filed in Japanese Patent Application No. 2022-115839 filed in Japan on July 20, 2022, Japanese Patent Application No. 2022-151823 filed in Japan on September 22, 2022, and Patent Application No. 2022-151823 filed in Japan on July 20, 2022. , claims priority based on Japanese Patent Application No. 2022-115841, the contents of which are incorporated herein.
  • biopharmaceuticals that contain proteins, peptides, and nucleic acids as active ingredients have been put into practical use, and their number continues to increase year by year. Biopharmaceuticals can fill unmet medical needs that could not be met with conventional small molecule drugs.
  • biopharmaceuticals have the problem of being difficult to absorb from the gastrointestinal tract and mucous membranes, being unstable in the body, and having a short half-life in the blood. Therefore, biopharmaceuticals require frequent administration by injection, which places a heavy burden on both patients and medical personnel. Therefore, there is a need for drug base materials (sustained release drug delivery system base materials) that can encapsulate biopharmaceuticals and gradually release the active ingredients in vivo without impairing pharmacological activity.
  • Patent Document 1 proposes a sustained release drug delivery system base material made of a highly safe hyaluronic acid derivative.
  • the hyaluronic acid derivative disclosed in Patent Document 1 spontaneously associates in an aqueous solution and can efficiently encapsulate drugs, particularly biopharmaceuticals, while maintaining their biological activity. As a result, it aggregates under physiological saline concentration (or disperses even under physiological saline concentration) and has good retention in blood.
  • This hyaluronic acid derivative can be used as a carrier that can efficiently encapsulate many drugs while maintaining pharmacological activity, especially when biopharmaceuticals are used as active ingredients, and as a sustained release carrier and targeting carrier with excellent blood retention. It is said that it can be used as a local (for example, subcutaneous) sustained release carrier that can continuously release drugs.
  • Method of adding a solubilizing agent A method of adding a surfactant to form micelles, emulsify, and solubilize. Method using serum albumin or plasma proteins.
  • the method (a) above involves changing a part of the structure of the active ingredient, which is the active ingredient, and cannot increase the solubility of the active ingredient itself.
  • the use of derivatives may cause various problems such as a decrease in the activity as a drug and precipitation of the drug due to changes in pH, which is not a desirable method.
  • a poorly water-soluble cyclosporine composition is prepared using an organic solvent, a solubilizing agent, water and an organic solvent, water and a solubilizing agent, or a mixed solvent of water, an organic solvent, and a solubilizing agent.
  • a manufacturing method is described that involves a step of dissolving in.
  • the obtained solution was a turbid solution, and partial precipitation was confirmed, indicating that solubilization was not sufficient.
  • Patent Document 3 when encapsulating a poorly water-soluble active ingredient in a hyaluronic acid derivative, it is necessary to dissolve the poorly water-soluble active ingredient in an organic solvent such as methanol. Therefore, the use of organic solvents is unavoidable. In addition, in Patent Document 3, the amount of solubilized poorly water-soluble active ingredients is insufficient. Furthermore, no specific studies have been made on formulation methods for efficiently solubilizing poorly water-soluble active ingredients from a powdered state, and there is still room for improvement.
  • Patent Document 2 even if a solubilizing agent such as polyethylene glycol 300 is used for a poorly water-soluble active ingredient, only a relatively stable suspension containing the poorly water-soluble active ingredient is provided. It is difficult to completely solubilize poorly water-soluble active ingredients at high concentrations.
  • a solubilizing agent such as polyethylene glycol 300
  • Sustained-release drug bases are required to be able to maintain the concentration of the active ingredient in vivo over a longer period of time and gradually release the active ingredient. In addition, it is required to be able to solubilize active ingredients at high concentrations.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a hyaluronic acid derivative that can maintain the concentration of an active ingredient in the body for a longer period of time, gradually release the active ingredient, and solubilize the active ingredient at a high concentration.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and a method for producing the same.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is capable of solubilizing poorly water-soluble active ingredients at high concentrations without using organic solvents and reducing the amount of highly toxic surfactants used.
  • An object of the present invention is to provide a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition and a method for producing the same.
  • a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition comprising (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B) an association promoter, and (C) an active ingredient.
  • a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition comprising (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B) an association promoter, and (C) an active ingredient.
  • B contains at least 4 or more ether structures (ROR) and has 4 or more carbon atoms.
  • the association promoter (B) is polysorbate 80, polysorbate 20, poloxamer, oxyethylene castor oil, polyethylene glycol 300, polyethylene glycol 400, polyethylene glycol 4000, fatty acid sorbitan ester, tocopheryl polyethylene glycol succinate, and polyvinyl
  • the content of the active ingredient (C) relative to 100 parts by mass of the (A) hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced is 10 parts by mass or more and 100 parts by mass or less, [1] to [11]
  • the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition according to any one of the above.
  • the hyaluronic acid derivative (A) into which a hydrophobic group has been introduced has one or more repeating units represented by the following general formula (I), according to any one of [1] to [12].
  • Hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition is one or more repeating units represented by the following general formula (I), according to any one of [1] to [12].
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl.
  • Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of 2 to 30 arbitrary amino acid residues.
  • X 1 is -NR b -R, -NR b -COO-R, -NR b -CO-R, -NR b -CO-NR c -R, -COO-R, -O-COO-R, - Represented by SR, -CO-Y a -SR, -O-CO-Y b -SR, -NR b -CO-Y b -SR, and -SSR, It is a group selected from the group consisting of groups.
  • R a , R b and R c are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl and hydroxy C 2-20 alkyl.
  • the alkyl moieties of R a , R b and R c may have a group selected from the group consisting of -O- and -NR f - inserted therein.
  • R f is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-12 alkyl, amino C 2-12 alkyl, and hydroxy C 2-12 alkyl.
  • the alkyl portion of R f may have a group selected from the group consisting of -O- and -NH- inserted therein.
  • R is a steryl group.
  • Y is C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -.
  • the alkylene of Y may have a group selected from the group consisting of -O-, -NR g - and -SS- inserted therein.
  • R g is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl, and hydroxy C 2-20 alkyl.
  • the alkyl portion of R g may have a group selected from the group consisting of -O- and -NH- inserted therein.
  • Y a is C 1-5 alkylene.
  • Y b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene.
  • m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition according to any one of [1] to [16], which can be sterilized by filtration.
  • a method for producing a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition comprising (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B) an association promoter, and (C) an active ingredient, the method comprising: A) A step of mixing the hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced and the association promoter (B) to obtain an aqueous hyaluronic acid derivative solution containing the association promoter, and (C) containing the active ingredient and the association promoter.
  • a method for producing a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition comprising a mixing step of mixing with a hyaluronic acid derivative aqueous solution.
  • a method for producing a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition comprising (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B) an association promoter, and (C) an active ingredient, the method comprising: C) A step of dispersing the active ingredient in the association promoter (B) to obtain a dispersion (I), and a step of preparing an aqueous hyaluronic acid derivative solution or an aqueous hyaluronic acid solution containing an association promoter to obtain an aqueous solution (II).
  • the present invention includes the following aspects.
  • [21] Contains (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B1) a solubilization aid, and (C1) an active ingredient, the solubilization aid (B1) having an ether structure (R The content of the solubilizing aid (B1) with respect to the hyaluronic acid derivative containing at least 4 or more -OR) and having 4 or more carbon atoms and into which 100 parts by mass of the hydrophobic group (A1) has been introduced. 0.0001 parts by mass or more and 15,000 parts by mass or less, a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition.
  • the solubilization aid (B1) is one or more selected from the group consisting of a nonionic surfactant, a polyethylene glycol with a molecular weight of 190 g/mol or more and 4000 g/mol or less, and a cyclodextrin derivative.
  • a nonionic surfactant e.g., a polyethylene glycol with a molecular weight of 190 g/mol or more and 4000 g/mol or less
  • a cyclodextrin derivative e.g., a nonionic surfactant, a polyethylene glycol with a molecular weight of 190 g/mol or more and 4000 g/mol or less.
  • the solubilization aid (B1) is polysorbate 80, polysorbate 65, polysorbate 60, polysorbate 40, polysorbate 20, poloxamer, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, cyclodextrin derivative, polyethylene glycol 300, polyethylene glycol 400, polyethylene
  • the solubilization aid (B1) is a nonionic surfactant, and the content of the nonionic surfactant is 0 with respect to 100 parts by mass of the (A) hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced.
  • the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition according to any one of [21] to [23], which contains .0001 parts by mass or more and 150 parts by mass or less.
  • the solubilization aid (B1) is polyethylene glycol with a molecular weight of 190 g/mol or more and 4000 g/moL or less, and the polyethylene glycol is The hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition according to any one of [21] to [24], wherein the content is 25 parts by mass or more and 15,000 parts by mass or less.
  • the amount of the poorly water-soluble drug added to 100 parts by mass of the (A1) hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced is 21 parts by mass or more and less than 100 parts by mass, [26] to [31]
  • hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition according to any one of [31] to [32], wherein the hyaluronic acid derivative has one or more repeating units represented by the following general formula (I).
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl.
  • Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of 2 to 30 arbitrary amino acid residues.
  • X 1 is -NR b -R, -NR b -COO-R, -NR b -CO-R, -NR b -CO-NR c -R, -COO-R, -O-COO-R, - Represented by SR, -CO-Y a -SR, -O-CO-Y b -SR, -NR b -CO-Y b -SR, and -SSR, A group selected from the group consisting of groups.
  • R a , R b and R c are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl and hydroxy C 2-20 alkyl.
  • the alkyl moieties of R a , R b and R c may have a group selected from the group consisting of -O- and -NR f - inserted therein.
  • R f is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-12 alkyl, amino C 2-12 alkyl, and hydroxy C 2-12 alkyl.
  • the alkyl portion of R f may have a group selected from the group consisting of -O- and -NH- inserted therein.
  • R is a steryl group.
  • Y is C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -.
  • the alkylene of Y may have a group selected from the group consisting of -O-, -NR g - and -SS- inserted therein.
  • R g is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl, and hydroxy C 2-20 alkyl.
  • the alkyl portion of R g may have a group selected from the group consisting of -O- and -NH- inserted therein.
  • Y a is C 1-5 alkylene.
  • Y b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene.
  • m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • a method for producing a pharmaceutical composition comprising (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B1) a solubilization aid, and (C1) an active ingredient, the method comprising (A1) A step of mixing a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced and (B1) a solubilization aid to obtain a hyaluronic acid derivative aqueous solution containing the solubilization aid; A method for producing a pharmaceutical composition, comprising a mixing step of mixing with an aqueous hyaluronic acid derivative solution.
  • a method for producing a pharmaceutical composition comprising (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B1) a solubilization aid, and (C1) an active ingredient, the method comprising: ) A step of dispersing the active ingredient in the solubilization aid (B1) to obtain a dispersion (I), and a step of preparing an aqueous hyaluronic acid derivative solution or an aqueous hyaluronic acid solution containing a solubilizer to obtain an aqueous solution (II). and mixing the dispersion liquid (I) and the aqueous solution (II).
  • the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition can maintain the concentration of the active ingredient in vivo for a longer period of time, gradually release the active ingredient, and solubilize the active ingredient at a high concentration. It is possible to provide a product and a method for manufacturing the same.
  • the hyaluronic acid derivative pharmaceutical can solubilize a poorly water-soluble active ingredient at a high concentration without using an organic solvent and while reducing the amount of highly toxic surfactant used.
  • Compositions and methods for producing the same can be provided.
  • the present embodiment an embodiment of the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment") will be described in detail, but the present invention is not limited thereto, and various modifications can be made without departing from the gist thereof. It is.
  • C 1-20 alkyl used herein means a straight or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, iso - Contains "C 1-4 alkyl” such as propyl, n-butyl, sec-butyl, iso-butyl, tert-butyl, and further includes n-pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-methylbutyl, -Ethylpropyl, n-hexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, and the like.
  • C 1-20 alkyl also includes C 1-12 alkyl groups having 1 to 12 carbon atoms and C 1-6 alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • C 1-6 alkylcarbonyl as used herein means an alkylcarbonyl group in which the alkyl moiety is C 1-6 alkyl as already mentioned, for example acetyl, propionyl, n-propylcarbonyl, Includes “C 1-4 alkylcarbonyl” such as iso-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, iso-butylcarbonyl, and tert-butylcarbonyl.
  • amino C 2-20 alkyl used herein means a straight or branched alkyl having 2 to 20 carbon atoms and having an amino group as a substituent, for example, an amino group may be located on the terminal carbon atom of the alkyl group.
  • Amino C 2-20 alkyl also includes amino C 2-12 alkyl having 2 or more and 12 or less carbon atoms.
  • hydroxyC 2-20 alkyl used herein means a linear or branched alkyl group having 2 to 20 carbon atoms and having a hydroxy group as a substituent, for example, hydroxy The group may be located on the terminal carbon atom of the alkyl group. Hydroxy C 2-20 alkyl also includes hydroxy C 2-12 alkyl having 2 or more and 12 or less carbon atoms.
  • C2-30 alkylene used herein means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms, such as ethylene, propylene, etc. C 2-20 alkylene with 2 to 20 carbon atoms, C 2-8 alkylene with 2 to 8 carbon atoms, group "-(CH 2 ) n -" (where n is 2 to 30 and preferably 2 or more and 20 or less, more preferably 2 or more and 15 or less).
  • C 1-5 alkylene used herein means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, such as methylene, ethylene, Contains propylene etc.
  • C 2-8 alkenylene refers to a divalent saturated hydrocarbon group containing one or more double bonds, linear or branched, having 2 to 8 carbon atoms.
  • -CH CH-
  • -C(CH 3 ) CH-
  • 2-butene-1,4-diyl hepta-2,4-diene-1,6-diyl
  • octa-2,4 , 6-triene-1,8-diyl etc.
  • each isomer and mixtures thereof are also included.
  • This embodiment is a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition containing (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B) an association promoter, and (C) an active ingredient.
  • a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition comprising (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B) an association promoter, and (C) an active ingredient
  • “Pharmaceutical Composition 1” It may be abbreviated as.
  • Hyaluronic acid derivatives can be formulated with active ingredients and used as pharmaceutical compositions.
  • the hyaluronic acid derivative forms a complex with the active ingredient (hereinafter sometimes referred to as "active ingredient-hyaluronic acid derivative complex").
  • active ingredient-hyaluronic acid derivative complex the active ingredient-hyaluronic acid derivative complex
  • the steryl group in the hyaluronic acid derivative and the hydrophobic site of the active ingredient form a complex through hydrophobic interaction, and the active ingredient and the hydrophobic site such as the steryl group are present in the center.
  • the average particle diameter of the structure containing the active ingredient-hyaluronic acid derivative complex can be 20 nm or more and 220 nm or less, 20 nm or more and 150 nm or less, and 30 nm or more.
  • the thickness can be set to 100 nm or less.
  • the average particle diameter can be measured by, for example, DLS (Dynamic Light Scattering), a nanotracking particle measuring device, size exclusion chromatography, high performance liquid chromatography, electron microscopy, or the like.
  • the measurement is performed by diluting the hyaluronic acid derivative with a 10 mM phosphate buffer containing 10 w/v% sucrose at a rate such that the hyaluronic acid derivative concentration is 1 mg/mL using a DLS device, for example.
  • association promoter (B) included in the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment contains at least 4 or more ether structures (ROR) and has 4 or more carbon atoms.
  • composition 1 of this embodiment has (B) an association promoter.
  • the association promoter (B) interacts with a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, and promotes association between hyaluronic acid derivative molecules.
  • the association promoter of this embodiment forms a complex with a hyaluronic acid derivative, increases drug conjugation ability, and improves precipitation performance under physiological salt concentration.
  • the drug in the gel is sustainedly released by an exchange reaction in which it replaces hydrophobic components such as albumin and other hydrophobic proteins in the body, or by decomposition of the gel. It is thought that the sustained release period can be controlled by controlling the influx of degrading enzymes into the gel, shielding it, and imparting stealth properties.
  • composition 1 of the present embodiment includes (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced.
  • (A) hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced may be referred to as “(A) hyaluronic acid derivative.”
  • the hyaluronic acid derivative includes a steryl group as a hydrophobic group.
  • the steryl group may be directly bonded to hyaluronic acid or may be bonded via a linker.
  • the "linker” here can be any peptide linker that can be introduced by genetic engineering or a synthetic compound linker, but in the hyaluronic acid derivative (A) used in this embodiment, a peptide linker is preferable.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the purpose, but the preferred length is 2 amino acids or more, particularly preferably 15 amino acids.
  • the upper limit of the length of the peptide linker is not particularly limited, but is usually 30 amino acids or less, preferably 20 amino acids or less.
  • the peptide linkers contained in the hyaluronic acid derivative may all have the same length, or may have different lengths.
  • steryl group used herein is not particularly limited as long as it is a group having a steroid skeleton.
  • the steroids specifically include cholesterol, cholestanol, campestanol, ergostanol, stigmastanol, coprostanol, stigmasterol, sitosterol, lanosterol, ergosterol, simiarenol, bile acids, testosterone, estradiol, and pro-steroids. Examples include gestrone, cortisol, cortisone, aldosterone, corticosterone, deoxycortisterone, and the like.
  • steryl group examples include a cholesteryl group, a stigmasteryl group, a lanosteryl group, an ergosteryl group, and among them, a cholesteryl group (particularly a cholest-5-en-3 ⁇ -yl group) is preferred.
  • Stepryl group introduction rate The introduction rate of steryl groups into the hyaluronic acid derivative (hereinafter sometimes simply referred to as "steryl group introduction rate") is preferably 0.1% or more and less than 50%, more preferably 5% or more and less than 45%, It is more preferably 10% or more and 40% or less, particularly preferably 15% or more and 35% or less.
  • the hyaluronic acid derivative (A) can strongly interact with the hydrophobic part of the poorly water-soluble drug or protein and the hydrophobic part of the association promoter. Furthermore, since the steryl group introduction rate is within the above range, the hyaluronic acid derivative-drug complex in which the (A) hyaluronic acid derivative in Pharmaceutical Composition 1 is complexed with a drug has improved formulation stability. It also aggregates and precipitates under physiological salt concentration, allowing sustained release of the drug.
  • the steryl group introduction rate can be measured by 1 H-NMR measurement. That is, the integral value of the peak derived from the steryl group of (A) the hyaluronic acid derivative in the 1 H-NMR spectrum of Pharmaceutical Composition 1, and the acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine contained in (A) the hyaluronic acid derivative. It can be calculated based on the following formula using the integral value of the peak derived from (COCH 3 , 1.6 ppm or more and 2.0 ppm or less, 3H). In addition, during the ceremony. nH represents the number of hydrogen atoms corresponding to the peak. Specifically, it can be measured, for example, according to the method described in Examples below.
  • Stepryl group introduction rate] (%) [(Peak integral value derived from steryl group ⁇ 3/n H )/(Peak integral value derived from acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine)] ⁇ 100
  • the molecular weight of the (A) hyaluronic acid derivative is not particularly limited, but from the viewpoint of improving the sustained release function derived from diffusion delay in local administration, the (A) hyaluronic acid derivative with a relatively large molecular weight is preferred. On the other hand, when the final dosage form is a solution preparation, (A) hyaluronic acid derivatives having a relatively small molecular weight are preferred from the viewpoint of syringability. (A) The molecular weight of the hyaluronic acid derivative may be adjusted as appropriate depending on the use and dosage form.
  • An example of the molecular weight of the hyaluronic acid derivative is preferably 1,000 (1k) or more and 1,000,000 (1,000k) or less, more preferably 5k or more and 300k or less, and even more preferably 5k or more and 120k or less, Particularly preferred is 7k or more and 100k or less.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid derivative can generally be adjusted by using raw materials having a corresponding molecular weight.
  • the weight average molecular weight of the hyaluronic acid derivative is at least the above lower limit, an increase in viscosity can be suppressed, and a higher concentration of the hyaluronic acid derivative can be dissolved in the pharmaceutical composition 1.
  • the weight average molecular weight of hyaluronic acid derivatives can generally be adjusted by using raw materials with corresponding molecular weights. More specifically, from the viewpoint of viscosity, the weight average molecular weight of the hyaluronic acid derivative is preferably 100k or less, more preferably 50k or less, and particularly preferably 40k or less. From the viewpoint of producing a hyaluronic acid derivative, 4k to 100k is preferable, and 6k to 50k is particularly preferable.
  • the hyaluronic acid derivative strongly exhibits the properties as hyaluronic acid, for example, in order to be strongly recognized by the CD44 receptor, it is preferably 100 kDa or more, particularly preferably 200 kDa or more, and most preferably 300 kDa or more.
  • the "molecular weight of the hyaluronic acid derivative” as used herein is the weight average molecular weight determined by size exclusion chromatography multi-angle light scattering detector (SEC-MALS).
  • hyaluronic acid derivatives include, for example, hyaluronic acid derivatives having one or more repeating units represented by the following general formula (I) (hereinafter sometimes referred to as “repeat units (I)"). It will be done.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl.
  • Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of 2 to 30 arbitrary amino acid residues.
  • X 1 is -NR b -R, -NR b -COO-R, -NR b -CO-R, -NR b -CO-NR c -R, -COO-R, -O-COO-R, - Represented by SR, -CO-Y a -SR, -O-CO-Y b -SR, -NR b -CO-Y b -SR, and -SSR, A group selected from the group consisting of groups.
  • R a , R b and R c are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl and hydroxy C 2-20 alkyl.
  • R f is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-12 alkyl, amino C 2-12 alkyl, and hydroxy C 2-12 alkyl.
  • the alkyl portion of R f may have a group selected from the group consisting of -O- and -NH- inserted therein.
  • R is a steryl group.
  • Y is C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -.
  • the alkylene of Y may have a group selected from the group consisting of -O-, -NR g - and -SS- inserted therein.
  • R g is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl, and hydroxy C 2-20 alkyl.
  • the alkyl portion of R g may have a group selected from the group consisting of -O- and -NH- inserted therein.
  • Y a is C 1-5 alkylene.
  • Y b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene.
  • m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • the hyaluronic acid derivative preferably includes a hyaluronic acid derivative having one or more repeating units represented by the following general formula (Ia) (hereinafter sometimes referred to as "repeat units (Ia)").
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl.
  • X is a hydrophobic group represented by -NR a -Y-NR b -COO-R.
  • R a and R b are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom and C 1-6 alkyl.
  • R is a steryl group.
  • Y is C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -, and m is an integer from 1 to 100.
  • the repeating units may be the same or different.
  • the hyaluronic acid derivative may be modified at a position other than repeating unit (I) or repeating unit (Ia), for example, the hydroxy group is -O (C 1-6 alkyl), -O (formyl), -
  • the carboxy group may be converted to O(C 1-6 alkylcarbonyl), etc., and the carboxy group may be converted to an amide or ester, or may form a salt.
  • Such groups include -NH-(CH 2 ) mz -NH-COO-R; -NH-(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -NH-COO-R; and -NH-(CH 2 ) mz -SSR, where mz, R and m are as previously defined herein.
  • Z is preferably a direct bond.
  • X 1 is -NR b -COO-R.
  • Z may be a peptide linker represented by -NH-[CH(-Z a )-CONH] n-1 -CH(-Z a )-CO-, where , n is an integer of 2 or more and 30 or less, and Z a each independently represents a substituent in the ⁇ -amino acid represented as H 2 N-CH(-Z a )-COOH.
  • the peptide linker is bonded to the carboxy group of the glucuronic acid moiety at the N-terminus and to the group -N(-R a )-YX 1 at the C-terminus.
  • amino acids that can be used as amino acid residues in the peptide linker include ⁇ -amino acids, such as alanine, arginine, asparagine (Asn), aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine (Gly), histidine, isoleucine, and leucine (Leu).
  • - Amino acids can be used. That is, examples of Z a include -CH 3 , H 2 NC(NH)NH(CH 2 ) 3 -, H 2 NCOCH 2 -, and the like. Furthermore, n Z's may be the same or different. n is an integer of 2 or more and 30 or less, preferably 2 or more and 10 or less, and more preferably 2 or more and 4 or less.
  • Preferred examples of peptide linkers include -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Asn-Phe-Phe-, -Phe-Phe-, Phe-Gly-, and the like.
  • Y is -(CH 2 ) n1 - and -(CH 2 CH 2 O) m1 -CH 2 CH 2 - (where n1 is an integer of 2 or more and 20 or less, and 2 or more An integer of 15 or less is preferable, an integer of 2 or more and 12 or less is more preferable, and an integer of 2 or more and 6 or less is even more preferable.
  • m1 is an integer of 1 or more and 4 or less.
  • Y is -(CH 2 ) 2 -, -(CH 2 ) 6 --, --(CH 2 ) 8 -- and --(CH 2 ) 12 -- is preferred, and --(CH 2 ) 6 -- is more preferred.
  • Y is, for example, -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -S-S-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -, -(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -S- S-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -, -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -S-S-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -, -(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -S-S-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 - and the like.
  • Y a is preferably -CH 2 - or -CH 2 -CH 2 -.
  • Yb is -CH 2 -CH 2 -, -CH(CH 3 )CH 2 -, 2-butene-1,4-diyl, hepta-2,4-diene-1,6-diyl or octa-2 ,4,6-triene-1,8-diyl is preferred, and --CH 2 --CH 2 -- or --CH(CH 3 )CH 2 -- is more preferred.
  • Specific examples of the group "-Z-N(R a )Y-X 1 " include -NH-(CH 2 ) 2 -NH-CO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH -(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -N(-(CH 2 ) 3 -NH 2 )-COO-cholesteryl, -NH- (CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 4 -N(-(CH 2 ) 3 -NH 2 )-COO-cholesteryl, -NH- (CH 2 ) 3 -NH-(CH 2
  • R a , R b and R c are hydrogen atoms
  • Y is linear C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -
  • Y a is linear C 1-5 alkylene
  • Y b is linear C 2-8 alkylene or linear is a C 2-8 alkenylene.
  • Repeat unit (Ia) In the general formula ( Ia ) , -COO-cholesteryl or -NH-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -NH-COO-cholesteryl is preferred, -NH-(CH 2 ) 2 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 6 -NH-COO-cholesteryl or -NH-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -NH-COO-cholesteryl is more preferred.
  • the hyaluronic acid derivative can further include a repeating unit represented by general formula (II) (hereinafter sometimes referred to as "repeating unit (II)"). .
  • R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are each independently a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl.
  • X a is a group selected from the group consisting of hydroxy and -O-Q + .
  • Q + is a counter cation.
  • the hyaluronic acid derivative (A) contains two or more repeating units (II), the repeating units may be the same or different.
  • the hyaluronic acid derivative (A) may be a hyaluronic acid derivative consisting essentially of repeating unit (I), repeating unit (Ia), and repeating unit (II).
  • Q + is not particularly limited as long as it is a counter cation that forms a salt with a carboxy group in water, and if it has a valence of two or more, it forms a salt with a plurality of carboxy groups depending on the valence.
  • countercations include metal ions such as lithium ions, sodium ions, rubidium ions, cesium ions, magnesium ions, calcium ions; formula: N + R j R k R l R m (where R j , R k , R l and R m are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom and C 1-6 alkyl).
  • Q + is preferably a sodium ion, potassium ion, or tetraalkylammonium ion (eg, tetra n-butylammonium ion, etc.).
  • R j , R k , R l and R m are preferably the same group selected from the group consisting of C 1-6 alkyl, preferably n-butyl group.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 , and R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are all hydrogen atoms. Moreover, it is preferable that both R a and R b are hydrogen atoms.
  • the hyaluronic acid derivative (A) is preferably a hyaluronic acid derivative consisting essentially of repeating units (I) and repeating units (II).
  • A) In the hyaluronic acid derivative for example, 80% or more, preferably 90% or more of the disaccharide repeating units consisting of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine contained in the derivative are More preferably, 95% or more are repeating units (I) and repeating units (II).
  • the hyaluronic acid derivative may be composed only of repeating units (I) and repeating units (II).
  • the content of the hyaluronic acid derivative (A) relative to the total amount of the pharmaceutical composition is preferably 1 mg/mL or more and less than 50 mg/mL, more preferably 3 mg/mL or more and 45 mg/mL or less, and further preferably 5 mg/mL or more and 40 mg/mL or less. preferable.
  • association promoter can be more specifically measured by gel permeation chromatography, and the association promoter defined in this embodiment is defined as the ratio A2 of the areas A1 and A2 shown below. /A1 to confirm.
  • Figure 1 is a chromatogram of a hyaluronic acid derivative.
  • An example of the area A1 shown in FIG. 1 is 1814.
  • FIG. 2 is a chromatogram of hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition 1.
  • An example of the area A2 shown in FIG. 2 is 2813.
  • FIG. 2 shows a gel permeation chromatogram of the hyaluronic acid derivative of this embodiment.
  • the refractive index intensity at the start of the measurement is set to zero, and a line drawn horizontally from this is set as the baseline.
  • the refractive index intensity is adjusted so that the increase or decrease is within the range of ⁇ 0.5 mV, and the refractive index intensity is adjusted so that the increase or decrease is within 0.5 mV or less in 5 minutes.
  • the first point where the refractive index intensity increase exceeds an amount equivalent to five times the noise value three times is set as the "starting point" of the chromatogram, and the elution time is set as 0 minutes.
  • Tlim' is set as the 'end point'.
  • Tlim is the elution time at which maximum refractive index intensity is obtained when 2 kDa polyacrylic acid is measured.
  • the refractive index intensity is calculated every 0.00167 minutes.
  • each area value is calculated using an analysis application of the GPC workstation EcoSEC Elite-WS.
  • a ratio A2/A1 of area A2 to area A1 of 1.2 or more means that association between hyaluronic acid derivative molecules or between the hyaluronic acid derivative and the association promoter is promoted. Note that when the association between hyaluronic acid derivative molecules or between the hyaluronic acid derivative and the association promoter is not promoted, the ratio A2/A1 is in the range of 0.95 to 1.19.
  • the ratio A2/A1 is preferably 1.20 or more, more preferably 1.30 or more, even more preferably 1.40 or more, and particularly preferably 1.50 or more.
  • a relatively large amount of the hyaluronic acid derivative whose association has been promoted can be contained, and when formulated with (C) the active ingredient, (C) ) A large amount of the active ingredient can be retained, and (C) the active ingredient can be solubilized at a high concentration.
  • the association promoter controls the release of the active ingredient (C), making it possible to maintain the sustained release period of the drug in vivo over a long period of time.
  • the upper limit of A2/A1 is preferably as high as the ratio of area A2 is than area A1. Therefore, the upper limit of A2/A1 is not particularly limited, but may be 4.0 or less, 3.5 or less, 3.0 or less, 2.5 or less, 2.1 or less, 2.0 or less, 1.9 or less, 1 It may be .5 or less.
  • the association promoter is not particularly limited as long as it is a surfactant that can be commonly used in pharmaceutical applications.
  • the association promoter is preferably a component containing at least 4 or more ether structures (ROR) and having 4 or more carbon atoms.
  • association promoter (B) examples include polysorbate (having 5 or more ether structures and 10 or more carbon atoms), polyoxyethylene fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyexyethylene castor oil, and the like.
  • Association promoters include, for example, polysorbate 80 (having 20 or more ether structures and having 64 or more carbon atoms), polysorbate 65 (having 20 or more ether structures and having 100 or more carbon atoms), polysorbate 60 (having an ether structure of 20 or more and having a carbon number of 64 or more), Polysorbate 40 (having a 20 or more ether structure and having a carbon number of 62 or more), Polysorbate 20 (having an ether structure of 20 or more and having a carbon number of 62 or more) 57 or more), polyethylene glycol monolaurate (having 7 or more ether structures and having 28 or more carbon atoms), polyoxyl stearate 40 (having 39 or more ether structures and having 98 or more
  • the association promoter is not limited to the above-mentioned surfactants, but includes, for example, poloxamer 188 (having an ether structure of 98 or more and a carbon number of 225 or more), poloxamer 124 (having an ether structure of 26 or more), Poloxamer 237 (having an ether structure of 93 or more and having 225 or more carbon atoms), Poloxamer 338 (having an ether structure of 177 or more and having 400 or more carbon atoms), Poloxamer 338 (having an ether structure of 177 or more and having 400 or more carbon atoms) 407 (having 147 or more ether structures and 352 or more carbon atoms), polyethylene glycol 300 (having 5 or more ether structures and having 12 or more carbon atoms), polyethylene glycol 400 (having 7 or more ether structures and having 7 or more carbon atoms) Polyethylene glycol 4000 (having an ether structure of 59 or more and having a carbon number of
  • the amount of the association promoter (B) added in Pharmaceutical Composition 1 is preferably 0.001 parts by mass or more and 15,000 parts by mass or less, and 0.05 parts by mass or more and 5,000 parts by mass, based on 100 parts by mass of the hyaluronic acid derivative. The following is more preferred, and 1 part by mass or more and 4000 parts by mass or less is even more preferred.
  • the amount of the association promoter (B) added in pharmaceutical composition 1 is 100 parts by mass of the hyaluronic acid derivative. , preferably 0.01 parts by mass or more and 150 parts by mass or less, more preferably 0.05 parts by mass or more and 100 parts by mass or less.
  • the amount of the association promoter (B) added in the pharmaceutical composition 1 is 100 parts by mass of the hyaluronic acid derivative. 10 parts by mass or more and 15000 parts by mass or less, more preferably 100 parts by mass or more and 10000 parts by mass or less, even more preferably 1000 parts by mass or more and 5000 parts by mass or less, and particularly preferably 1500 parts by mass or more and 4000 parts by mass or less. Most preferably 2000 parts by mass or more and 3500 parts by mass or less.
  • composition 1 of the present embodiment can retain a large amount of the active ingredient by containing (B) the association promoter, and furthermore, the pharmaceutical composition 1 can retain a large amount of the active ingredient.
  • the release rate of the active ingredient can be controlled and the active ingredient can be sustainedly released over a long period of time. Note that the desired effect may be obtained by a mechanism different from the above mechanism.
  • active ingredients include, but are not limited to, pharmaceutically active peptides or proteins, nucleic acids, low-molecular compounds, middle-molecular compounds, antigens (cancer antigens, infectious disease-derived antigens, autoantigens in immune diseases, etc.), and the like. Among these, low-molecular compounds, middle-molecular compounds, and peptides are more preferred.
  • the diseases to which the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment can be applied are not particularly limited, and it can be widely used for the prevention and treatment of currently known diseases or diseases that will be discovered in the future. It may be a chronic disease or an acute disease.
  • currently known diseases include cancer, infectious diseases, immune diseases, inflammatory relaxation, allergic diseases, skin diseases, hypertension, diabetes, neurological diseases, genetic diseases, cardiovascular diseases, cerebrovascular diseases, and respiratory diseases.
  • pharmaceutically active peptide or protein By pharmaceutically active peptide or protein is meant one that has a positive or beneficial effect on the condition or disease state of a subject when administered to the subject in a therapeutically effective amount.
  • Preferred pharmaceutically active peptides or proteins have curative or palliative properties and ameliorate, ameliorate, alleviate, reverse, or delay the onset of symptoms of a disease or disorder, or It can be administered to reduce the severity of symptoms.
  • Pharmaceutically active peptides or proteins may also have prophylactic properties and can be used to delay the onset of disease or reduce the severity of such disease or condition.
  • pharmaceutically active peptide or protein includes a full-length protein or polypeptide and may also refer to pharmaceutically active fragments thereof. The term also encompasses pharmaceutically active analogs of peptides or proteins.
  • cytokines examples include, but are not limited to, cytokines and immune system proteins such as immunoactive compounds (e.g., interleukins, colony stimulating factor (CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte Macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin, tumor necrosis factor (TNF), interferon, integrin, addressin, seletin, homing receptor, T cell receptor, immunoglobulin, antibody, hormone (insulin, thyroid hormone) , catecholamines, gonadotropins, stimulating hormones, prolactin, oxytocin, dopamine, bovine somatotropin, leptin, etc.), growth hormones (e.g., human growth hormone), growth factors (e.g., epidermal growth factor, nerve growth factor, insulin-like growth factor, etc.) , growth factor receptors, enzymes (tissue plasminogen activator, streptokinase, cholesterol biosy
  • proteins that inhibit angiogenesis include structural proteins (collagen, fibroin, fibrinogen, elastin, tubulin, actin, myosin, etc.), blood proteins (thrombin, Serum albumin, factor VII, factor VIII, insulin, factor IX, factor X, tissue plasminogen activator, protein C, von Willebrand factor, antithrombin III, glucocerebrosidase, erythropoietin, modified factor VIII , anticoagulant factors), etc.
  • structural proteins collagen, fibroin, fibrinogen, elastin, tubulin, actin, myosin, etc.
  • blood proteins thrombin, Serum albumin, factor VII, factor VIII, insulin, factor IX, factor X, tissue plasminogen activator, protein C, von Willebrand factor, antithrombin III, glucocerebrosidase, erythropoietin, modified factor VIII , anticoagulant factors), etc.
  • Nucleic acids include DNA and RNA, such as short interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), microRNA (miRNA), short hairpin RNA (shRNA), and nucleic acid aptamers.
  • siRNA short interfering RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • miRNA microRNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • low-molecular compounds include compounds with a molecular weight of less than about 500, such as anticancer agents (e.g., alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.), immunosuppressants, anti-inflammatory agents (steroidal agents, non-steroidal agents, etc.). Anti-inflammatory agents, etc.), anti-rheumatic agents, antibacterial agents ( ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa drugs, etc.).
  • anticancer agents e.g., alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.
  • immunosuppressants e.g., anti-inflammatory agents, steroidal agents, non-steroidal agents, etc.
  • Anti-inflammatory agents, etc. anti-rheumatic agents
  • antibacterial agents ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics
  • Active ingredients include Rho kinase inhibitors, endothelin A receptor inhibitors, transmembrane conductance regulator (CFTR) regulators, TRPV1 inhibitors, NK1 receptor inhibitors, purinergic receptor inhibitors, and angiotensin. It may be a receptor inhibitor, a peroxisome proliferator-responsive receptor, a P2Y receptor inhibitor, a VEGF inhibitor, etc., or it may be an active ingredient that has two of these inhibitory effects at the same time.
  • CFTR transmembrane conductance regulator
  • highly hydrophobic that is, sparingly water-soluble substances can also be preferably used, since they can sufficiently interact with the steryl group of the above-mentioned hyaluronic acid derivative.
  • “poorly water-soluble” refers to the amount of water required to dissolve 1 g of solute in the 17th edition of the Japanese Pharmacopoeia to be 30 mL or more.
  • poorly water-soluble solid active ingredients include acetaminophen, ibuprofen, benzoic acid, ethenzamide, caffeine, camphor, quinine, calcium gluconate, dimethylcaprol, sulfamine, theophylline, theopramine, riboflavin, mephenesin, Antipyretic analgesics such as phenobarbital, aminophylline, thioacetazone, quercetin, rutin, salicylic acid, theophylline sodium salt, pirapital, quinine hydrochloride, irgapirin, dioquitoxin, griseofulvin, phenacetin, nervous system drugs, sedative-hypnotics, muscle relaxants, blood pressure stiffening antibiotics such as acetylspiramycin, ampicillin, erythromycin, xatamycin, chloramphenicol, triacetyloleandomycin, nystatin, colistin sulf
  • the active ingredient may be in the form of a poorly water-soluble oil or liquid.
  • poorly water-soluble oily or liquid active ingredients include teprenone, indomethacin farnesil, menatetrenone, phytonadione, vitamin A oil, phenipentol, vitamins such as vitamin D and vitamin E, DHA (docosahexaenoic acid), and EPA. (eicosapentaenoic acid), higher unsaturated fatty acids such as cod liver oil, coenzyme Q, oil-soluble flavorings such as orange oil, lemon oil, peppermint oil, etc., according to the Japanese Pharmacopoeia, ⁇ external groups'', and ⁇ USP''. ”, “NF”, and “EP”.
  • vitamin E there are various homologs and derivatives of vitamin E, but there are no particular limitations as long as they are liquid at room temperature, such as dl- ⁇ -tocopherol, dl- ⁇ -tocopherol acetate, d- ⁇ -tocopherol, and d- ⁇ -acetate. Examples include tocopherol.
  • One type selected from these active ingredients may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the active ingredient may be a semi-solid active ingredient that is poorly water soluble.
  • Semi-solid active ingredients that are poorly water-soluble include, for example, Jiryu, Liquorice, Keihi, Peony, Botanpi, Valerian, Sansho, Gingerbread, Chinpi, Ephedra, Nantenjitsu, Ahi, Onji, Bellflower, Shazenshi, Chazenso, and Stone.
  • One type selected from these active ingredients may be used, or two or more types may be used in combination.
  • middle molecules refer to peptides and macrolide compounds with a molecular weight of about 500 to 5,000, which are neither low molecules (organic compounds with a molecular weight of up to about 500) nor high molecules (such as proteins with a molecular weight of 10,000 or more).
  • the peptide has a molecular weight of about 500 to 2000, ie, a linear or cyclic peptide having about 5 to 20 amino acid residues.
  • the peptide is preferably a cyclic peptide, the details of which will be described later.
  • a macrolide compound is a macrocyclic lactone, and is a general term for compounds having 12 or more ring members. Examples of middle-molecular compounds include FK506 and rapamycin.
  • Cancer antigens are antigens that are often expressed by cancer cells, and in some cases only by cancer cells. Cancer antigens can be expressed within cancer cells or on the surface of cancer cells.
  • Antigenic proteins that can be used in the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment include, but are not limited to, ERK1, ERK2, WT1, MART-1/Melan-A, gp100, adenosine deaminase binding protein (ADAbp), FAP, cyclophilin b, colon Rectal-related antigen (CRC)-C017-1A/GA733, carcinoembryonic antigen (CEA), CAP-1, CAP-2, etv6, AML1, prostate-specific antigen (PSA), PSA-1, PSA-2, PSA-3, prostate-specific membrane antigen (PSMA), T cell receptor/CD3-zeta chain, CD20, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE -A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), M
  • the entire sequence thereof may be used, or a partially deleted sequence may be used.
  • the antigenic peptide that can be used in the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment is one or more types selected from the group consisting of a CD8-positive cytotoxic T cell recognition epitope and a CD4-positive helper T cell recognition epitope among the antigen protein sequences. It is an antigenic peptide containing an epitope.
  • the antigenic peptide is preferably an antigenic peptide containing two or more epitopes from the viewpoint of being loaded onto MHC class I molecules or MHC class II molecules after being degraded in antigen-presenting cells.
  • the antigenic peptide mentioned above includes an antigenic peptide containing an epitope of an antigenic protein of a tumor cell.
  • the antigenic peptide has, for example, 8 to 120 amino acids, preferably 8 to 80 amino acids, more preferably 15 to 80 amino acids, even more preferably 16 to 80 amino acids, even more preferably 23 to 80 amino acids, and even more It preferably has 23 to 60 amino acids, particularly preferably 23 to 50 amino acids.
  • the antigen peptide has one epitope recognized by CD8-positive cytotoxic T cells and one epitope recognized by CD4-positive helper T cells. It is an antigenic peptide containing three or more antigenic peptides.
  • an amino acid linker may be placed between the epitopes.
  • the linker has, for example, 2 to 10 amino acids, preferably 4 to 10 amino acids, more preferably 4 to 8 amino acids.
  • Amino acids used in the linker include glycine (G), tyrosine (Y), leucine (L), tryptophan (W), and the like. Preferably they are tyrosine (Y), leucine (L), and tryptophan (W).
  • amino acid linkers include a linker (4Y) consisting of four consecutive tyrosines (Y), a linker (4L) consisting of four consecutive leucines (L), and a linker (4L) consisting of four consecutive tryptophans (W).
  • a linker of 6 consecutive glycines (G) (6G), a linker of 6 consecutive tyrosines (Y) (6Y), a linker of 6 consecutive leucines (L) (6L), a linker of 6 consecutive tryptophans (W) linker (6W), 8 consecutive tyrosine (Y) linker (8Y), 6 consecutive leucine (L) linker (8L), 8 consecutive tryptophan (W) linker (8W) are mentioned, preferably 6Y, 6L or 6W.
  • infectious disease-derived antigen is not particularly limited as long as it is an infectious pathogen or an antigen derived from an infectious pathogen. Infectious pathogens include viruses, bacteria, fungi, nematodes, and the like.
  • infectious disease pathogen-derived antigen may be an antigenic protein or an antigenic peptide.
  • Diseases contracted from the above infectious pathogens are not particularly limited, and include, for example, adenoviruses, herpesviruses (such as HSV-I, HSV-II, CMV, and VZV), poxviruses (such as variola or vaccinia, and molluscum contagiosum).
  • adenoviruses such as HSV-I, HSV-II, CMV, and VZV
  • poxviruses such as variola or vaccinia, and molluscum contagiosum
  • orthopoxviruses picornaviruses (e.g., rhinoviruses, enteroviruses), orthomyxoviruses (e.g., influenza viruses), paramyxoviruses (e.g., parainfluenza viruses, mumps viruses, measles viruses, respiratory viruses) syncytial virus (RSV)), coronavirus (e.g., SARS coronavirus (SARS-CoV), MERS coronavirus (MERS-CoV), SARS-CoV-2), papovavirus (e.g., genital warts, cystocele vulgaris, papillomaviruses (such as those that cause plantar warts), hepadnaviruses (e.g., hepatitis B virus), flaviviruses (e.g., hepatitis C virus, dengue virus), retroviruses (e.g., lentiviruses such as HIV), etc.
  • RSV syncy
  • Viral diseases such as those caused by viral infections; Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium , Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Haemophilus, Bordetella, etc.; chlamydia, candidiasis, aspergillosis, Fungal diseases including, but not limited to, histoplasmosis, cryptococcal meningitis; malaria, Pneumocystis carinii pneumonia, leishmaniasis, cryptosporidiosis, toxoplasmosis, trypano
  • the structure of the antigen that can be used in the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment is not particularly limited as long as it is at least a part of various components constituting a pathogen, and includes, for example, a live vaccine, an inactivated whole particle, Some of them include protein subunits, proteins, peptides, and the like. Among these, protein subunits, proteins, or peptides are preferred from the viewpoint of conjugation with hyaluronic acid derivatives.
  • influenza virus is an RNA enveloped virus belonging to the Orthomyxoviridae family and having a particle size of about 100 nm in diameter, and is divided into types A, B, and C based on the antigenicity of internal proteins.
  • the influenza virus consists of a core of ribonucleic acid (RNA) associated with an internal nucleocapsid or nucleoprotein surrounded by a viral envelope with a lipid bilayer structure, and an external glycoprotein.
  • the inner layer of the viral envelope is mainly composed of matrix proteins, and the outer layer is mostly composed of host-derived lipid substances.
  • the RNA of the influenza virus has a segmented structure.
  • Influenza that is prevalent all over the world is caused by influenza A virus, and this influenza A virus has two types of envelope glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), and has antigenic properties. Depending on the differences, HA is divided into 16 subtypes and NA into 9 subtypes.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • antigens derived from influenza A and B viruses are preferably used. Note that the subtypes of the above-mentioned influenza A and B viruses are not particularly limited, and may be subtypes that have been isolated so far or subtypes that will be isolated in the future.
  • influenza virus-derived antigen is not particularly limited as long as it is at least a part of the various components constituting the above-mentioned influenza virus.
  • examples include inactivated whole virus particles, or virus subunits produced by removing impurities from the whole virus particles and purifying HA and/or NA. From the viewpoint of immunogenicity, HA subunits or whole virus particles are preferred.
  • the whole virus particles are more preferably inactivated with formalin or the like. Furthermore, it is particularly effective for HA subunits (split), which have few impurities and require an adjuvant such as an immunostimulant.
  • the method for preparing the influenza virus antigen described above is not particularly limited, and any known method can be used without limitation.
  • a method may be used in which chicken eggs or the like are infected with a virus strain isolated from an influenza-infected animal or an influenza patient, cultured by a conventional method, and an antigen is prepared from the purified virus stock solution.
  • virus-derived antigens prepared in cultured cells by genetic engineering may be used.
  • Antigens for immune diseases are not particularly limited as long as they contain epitopes of target proteins of immune diseases.
  • Immune diseases are not particularly limited, and include, for example, plaque psoriasis, ankylosing spondylitis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, axial spondyloarthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, bronchial asthma, chronic urticaria, and hay fever. , atopic dermatitis, etc.
  • Target proteins are not particularly limited, and include IL-17A, DPP4, S100A9, PCSK9, IL-23, IgE, TNF ⁇ , IL-12/23p40, IL-6, ⁇ 4 ⁇ 7 integrin, IL-4/13, IL-5, Examples include BLyS and IL-13.
  • Reference document 1 International Publication No. 2017/164409) describes a peptide derived from IL-17A.
  • the present invention can be utilized more effectively when the active ingredient (C) in the present invention is a poorly water-soluble drug.
  • Poorly water-soluble drugs are terms that indicate solubility in the 17th edition of the Japanese Pharmacopoeia, and are defined as extremely soluble, easily soluble, slightly soluble, slightly soluble, difficult to dissolve, extremely difficult to dissolve, and almost insoluble. Refers to drugs that are classified as slightly soluble, slightly soluble, slightly soluble, extremely soluble, or almost insoluble.
  • the active ingredient (C) includes a poorly water-soluble drug having a solubility in water of 1 mg/mL or less.
  • Pharmaceutical composition 1 of the present invention can solubilize even such poorly water-soluble drugs at high concentrations without using organic solvents and reducing the amount of highly toxic surfactants used.
  • the active ingredient preferably has a molecular weight of 200 or more, more preferably 300 or more, more preferably 400 or more, more preferably 500 or more, even more preferably 600 or more, even more preferably 700 or more, and even more preferably 800 or more. It is more preferably 900 or more, even more preferably 1000 or more, particularly preferably 1100 or more, and most preferably 1200 or more.
  • the molecular weight of the active ingredient is a value calculated from the molecular formula of the compound.
  • the poorly water-soluble drug that is the active ingredient is preferably a poorly water-soluble peptide.
  • the poorly water-soluble peptide may have an acidic amino acid, a basic amino acid, or a neutral amino acid, with basic amino acids or neutral amino acids being preferred.
  • the pH of the solution may be appropriately selected in consideration of the isoelectric point.
  • the amino acids may also include natural amino acids or unnatural amino acids.
  • At least one of the nitrogen atoms constituting the amide bond of the poorly water-soluble peptide has a methyl group. Imparting hydrophobicity through methylation increases the interaction with the hydrophobic part of the hyaluronic acid derivative, and is expected to result in more solubilization. It is also presumed that the interaction is enhanced and the stability of the formulation is also improved.
  • the poorly water-soluble peptide preferably contains at least one selected from cyclic peptides, long-chain peptides, hydrophobic group-modified peptides, membrane-damaging peptides, and peptide-drug complexes.
  • the poorly water-soluble peptide is preferably a cyclic peptide.
  • the cyclic and rigid skeleton maximizes interaction with the hydrophobic part of hyaluronic acid and forms a stable structure with hyaluronic acid derivatives.
  • the cyclic size is preferably a cyclic peptide consisting of 4 to 49 amino acids, more preferably 6 to 30 amino acids, and most preferably 8 to 25 amino acids.
  • the number of rings in the molecule is not particularly limited, but is preferably 1 or more and 8 or less.
  • hydrophobized peptide is an alkylated polypeptide.
  • “Insulin Detemir” sold by Novo Nordisk Pharma is an insulin analog designed to have a C14 fatty acid side chain attached to the lysine at position 29 of the human insulin B chain and to exhibit affinity for albumin. This fatty acid side chain promotes self-association between insulin detemir hexamers and binds to albumin at the subcutaneous injection site, resulting in a stabilizing effect and reducing the rate of absorption from the administration site.
  • the hydrophobic part of the complex of the hyaluronic acid derivative and the association promoter or the solubilization aid and the hydrophobic part of the peptide can be used in vivo.
  • the strong interaction between the two components may make it possible to extend the sustained release period.
  • hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition 1 or pharmaceutical composition 2, which will be described later, which includes the above-mentioned peptide can be expected to be released for a longer period of time because the hyaluronic acid derivative effectively suppresses decomposition by peptide degrading enzymes in the body.
  • the blending amount of the active ingredient (C) relative to 100 parts by mass of the (A) hyaluronic acid derivative is preferably 10 parts by mass or more and 100 parts by mass or less, more preferably 15 parts by mass or more and 50 parts by mass or less. More preferably 20 parts by mass or more and 40 parts by mass or less.
  • the active ingredient which is not particularly limited, but is not limited to a poorly water-soluble drug, may be used alone or in combination of two or more.
  • composition 1 of the present embodiment can be solubilized without using an organic solvent when formulating the active ingredient (C), which is a poorly water-soluble drug, using conventional highly toxic solubilizers. can be reduced. Furthermore, the solubilization aid (B) can promote hydrophobic interaction between the steryl groups of the hyaluronic acid derivative (A). It is presumed that this makes it possible to solubilize the powdered active ingredient (C) at a high concentration. Note that the desired effect may be obtained by a mechanism different from the above mechanism.
  • the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment can also be called an organic solvent-free composition or a powdered drug solubilizing composition.
  • composition 1 of the present embodiment can be administered alone or together with a pharmacologically acceptable carrier according to conventional methods.
  • a pharmacologically acceptable carrier for example, the above-mentioned hyaluronic acid derivative and the above-mentioned active ingredient, and optionally an adjuvant, water or another physiologically acceptable liquid (for example, physiological saline) may be used in combination with a pharmacologically acceptable carrier.
  • physiologically acceptable liquid for example, physiological saline
  • Physiologically acceptable buffers, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, lyophilization aids which may be mixed with water, phosphate buffered saline (PBS), etc. It can also contain agents.
  • PBS phosphate buffered saline
  • buffer examples include Tris, sodium phosphate, potassium phosphate, histidine, or citric acid.
  • the hyaluronic acid derivative is used after being dissolved in a pharmaceutically acceptable medium at any concentration.
  • buffer solutions such as water for injection and phosphate buffer are preferred.
  • the buffering agent is not particularly limited as long as it is a compound having a buffering capacity within the range of pH 4 to 10 of the composition.
  • buffering agents include acetates such as sodium acetate, phosphates such as sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and ⁇ -aminocaproic acid. , amino acid salts such as sodium glutamate, boric acid and its salts, and mixtures thereof.
  • particularly preferred are water for injection, phosphate buffer, sucrose-containing water for injection, sucrose-containing phosphate buffer, and glycerol.
  • composition 1 of the present embodiment or pharmaceutical composition 2 described later may contain a pH adjuster, and examples of the pH adjuster include hydrochloric acid, citric acid, phosphoric acid, acetic acid, tartaric acid, sodium hydroxide, and sodium hydroxide. Examples include potassium, sodium carbonate, and sodium hydrogen carbonate.
  • An acid such as an organic acid or an inorganic acid may be added as necessary. Further, these pH adjusters may be used alone or in any combination of two or more.
  • the pH of the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment or the pharmaceutical composition 2 described below is not particularly limited as long as it is within a pharmaceutically acceptable range, but is, for example, 4.0 to 9.0, preferably 4.0 to 9.0. It is in the range of 0 to 8.8, more preferably 6.5 to 8.8.
  • preservatives for the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment or the pharmaceutical composition 2 described later include benzalkonium chloride, methyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, sorbic acid, alkyl polyaminoethylglycine, etc. can be mentioned. If necessary, one or more preservatives may be further added, and there are no particular restrictions as long as they are pharmaceutically acceptable.
  • Examples of the preservative in the present invention include benzalkonium chloride, benzethonium chloride, chlorhexidine gluconate, paraoxybenzoic acid esters such as ethyl paraoxybenzoate, benzyl alcohol, m-cresol, phenol, phenethyl alcohol, sorbic acid, and their like. Salt, thimerosal, etc. are used.
  • the pharmaceutical composition 1 of this embodiment or the pharmaceutical composition 2 described later may further contain one or more types of thickening agents as needed, and there are no particular restrictions as long as they are pharmaceutically acceptable. It is not something that can be done.
  • Examples of the thickening agent for the pharmaceutical composition 1 of the present invention or the pharmaceutical composition 2 described below include cellulose polymers (methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, etc.), vinyl polymers (polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, etc.), saccharides (mucopolysaccharides such as hyaluronic acid and its salts, polysaccharides such as gellan gum, sodium alginate, dextran, and cyclodextrin), oxyalkylene polymers (polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymer), etc. Can be mentioned.
  • the molecular weight of the thickening agent in the present invention can be selected from, for example, a number average molecular
  • stabilizer examples include sodium edetate hydrate, polyvinylpyrrolidone (povidone), and the like.
  • composition 1 of the present embodiment or pharmaceutical composition 2 described below may contain a chelating agent, and examples of the chelating agent include disodium edetate, trisodium edetate, tetrasodium edetate, and diethyleneamine. Examples include pentaacetic acid and mixtures thereof, which are used to stabilize drugs or preparations.
  • Tonicity agents also include sucrose, glucose, dextrose, lactose, mannitol, calcium or magnesium compounds such as CaCl2 .
  • glycerol at a concentration (2 to 2.5% (v/v)) that makes the pressure substantially isotonic. There is. Therefore, it is expected to have not only a function as an isotonic agent but also an antibacterial and preservative effect.
  • the content of glycerol is, for example, 0.01 to 10% (w/v), preferably 0.05 to 5% (w/v), more preferably 0.1 to 3.0% (w/v). , more preferably 0.3 to 3.0% (w/v), particularly preferably 0.3 to 2.5% (w/v).
  • a base can be added to the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment or the pharmaceutical composition 2 described below as necessary.
  • the base is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable base, and examples thereof include sodium hydroxide, potassium hydroxide, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, trometamol, and meglumine.
  • the base is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable base, and examples include zinc chloride, zinc acetate, and the like.
  • a formulated product may be used.
  • the formulation can be in solid, semi-solid or liquid form.
  • examples include powder, granules, pills, pellets, tablets, capsules, and the like.
  • the solid is preferably a freeze-dried powder.
  • examples include forms such as gel.
  • examples include a suspension in which the powder is diluted or suspended in water or a buffer such as phosphate buffer (PB) or phosphate buffered saline (PBS).
  • PB phosphate buffer
  • PBS phosphate buffered saline
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is preferably one that produces a precipitate under physiological salt concentration.
  • the precipitation rate in vitro is 20%, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, and most preferably 92% or more. % or more is preferable.
  • Precipitation rate (%) ⁇ 1-(Area value of hyaluronic acid derivative of precipitation sample) ⁇ ((Area value of hyaluronic acid derivative of blank sample) x (0.75X)) ⁇ x 100
  • the centrifugation conditions and incubation time may be arbitrarily set when preparing the precipitate sample. For example, if the sample satisfies the precipitation rate of 20% or more when left at 37° C. for two weeks and subjected to the above conditions, it is also determined that precipitation occurs under physiological salt concentration.
  • the pharmaceutical composition 1 of the present embodiment or the pharmaceutical composition 2 described below has no precipitates visually observed in an environment at 20°C. If precipitates are confirmed, use a light-shielding automatic particle counting device (liquid particle counter "KL -05'') can be detected. Drug crystals on the order of micrometers may precipitate from a supersaturated solution in which an amorphous drug is completely dissolved. If there is no precipitate, no particles are observed by the light-shielding automatic particle measuring device. In addition, the determination can also be made by using a DLS device to verify whether particles of 1 ⁇ m or more are present.
  • a light-shielding automatic particle counting device liquid particle counter "KL -05''
  • the pharmaceutical composition 1 of this embodiment or the pharmaceutical composition 2 described below can be sterilized by filtration.
  • the ability to sterilize by filtration can be determined by evaluating the flow of fluid using the following syringe filter. Specifically, it is evaluated whether liquid can pass through a sterile filtration filter with a pore size of 0.45 ⁇ m or 0.22 ⁇ m. More specifically, when the filtration membrane was made of polyether sulfone (PES) with a 13 mm ⁇ pore size of 0.45 ⁇ m, and a 3 mL sterile syringe filter was used, 2 mL of the hyaluronic acid derivative composition passed through the filtration membrane.
  • Hyaluronic acid derivatives can pass 50% or more, preferably 60%, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more.
  • This embodiment is a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition containing (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B1) a solubilization aid, and (C1) an active ingredient.
  • a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition comprising (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B1) a solubilizing agent, and (C1) an active ingredient
  • “Pharmaceutical composition 2”. ” may be abbreviated as “.
  • the average particle diameter of the spherical structure containing the active ingredient-hyaluronic acid derivative complex can be 20 nm or more and 220 nm or less, 20 nm or more and 150 nm or less, and 30 nm or more.
  • the thickness can be set to 100 nm or more.
  • the average particle diameter is within the above numerical range, the particles can exist in a stable structure in vivo and can more easily pass through lymph nodes.
  • the average particle diameter can be measured by, for example, DLS (Dynamic Light Scattering), a nanotracking particle measuring device, size exclusion chromatography, high performance liquid chromatography, electron microscopy, or the like.
  • the hyaluronic acid derivative is diluted with a 10 mM phosphate buffer or a 10 mM phosphate buffer containing 10 w/v% sucrose so that the concentration of the hyaluronic acid derivative becomes 1 mg/mL using a DLS device.
  • the solubilization aid (B1) included in the pharmaceutical composition 2 of the present embodiment contains at least 4 or more ether structures (ROR) and has 4 or more carbon atoms.
  • Pharmaceutical composition 2 of the present embodiment has a content of (B1) solubilizing agent of 0.0001 parts by mass or more and 15,000 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced. be.
  • composition 2 of this embodiment contains a specific amount of a specific solubilization aid.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment containing the above-mentioned (B1) solubilization aid can be combined with the above-mentioned (A1) hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, due to the appropriate polarity due to the ether structure and the appropriate hydrophobicity due to the alkyl skeleton.
  • the hydrophobic groups in the hyaluronic acid derivative (A1) into which the hydrophobic groups have been introduced can be promoted. This makes it possible to provide a pharmaceutical composition that can solubilize poorly water-soluble active ingredients at high concentrations.
  • the active ingredient can be sufficiently solubilized in the pharmaceutical composition.
  • the content of the solubilization aid (B1) is below the upper limit, the viscosity of the pharmaceutical composition does not become too high and the active ingredient can be sufficiently incorporated into the pharmaceutical composition without affecting the living body. Can be dissolved.
  • Stepryl group introduction rate (A1)
  • the introduction rate of steryl groups into the hyaluronic acid derivative is preferably 0.1% or more and less than 50%, more preferably 5% or more and less than 48%, even more preferably 35% or more and less than 47%, and 37% or more and less than 45%. is particularly preferred.
  • the hyaluronic acid derivative (A1) can strongly interact with the poorly water-soluble drug and the hydrophobic part of the surfactant. Furthermore, since the steryl group introduction rate is within the above range, the hyaluronic acid derivative-drug complex in which the (A1) hyaluronic acid derivative in Pharmaceutical Composition 2 is complexed with a drug has improved formulation stability. I can do it.
  • An example of the molecular weight of the hyaluronic acid derivative is preferably 1,000 (1k) or more and 1,000,000 (1,000k) or less, more preferably 5k or more and 300k or less, and even more preferably 5k or more and 120k or less, Particularly preferred is 7k or more and 100k or less.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid derivative can generally be adjusted by using raw materials having a corresponding molecular weight.
  • the weight average molecular weight of the hyaluronic acid derivative When the weight average molecular weight of the hyaluronic acid derivative is equal to or higher than the above lower limit, molecular entanglement can be further enhanced, and retention in blood can be further enhanced. On the other hand, when the weight average molecular weight of the hyaluronic acid derivative is at most the above upper limit, an increase in viscosity can be suppressed and a higher concentration of the hyaluronic acid derivative can be dissolved in the pharmaceutical composition.
  • the weight average molecular weight of hyaluronic acid derivatives can generally be adjusted by using raw materials with corresponding molecular weights.
  • the weight average molecular weight of the hyaluronic acid derivative is preferably 100k or less, more preferably 50k or less, particularly preferably 20k or less, and most preferably 15k or less.
  • the unit of molecular weight is Da. From the viewpoint of producing hyaluronic acid derivatives, 4k to 20k is preferred, 6k to 16k is particularly preferred, and 8k to 12k is most preferred.
  • the hyaluronic acid derivative strongly exhibits the properties as hyaluronic acid, for example, in order to be strongly recognized by the CD44 receptor, it is preferably 100k or more, particularly preferably 200k or more, and most preferably 300k or more.
  • the content of the hyaluronic acid derivative (A1) relative to the total amount of pharmaceutical composition 2 is preferably 6 mg/mL or more and less than 65 mg/mL, more preferably 8 mg/mL or more and 50 mg/mL or less, and 10 mg/mL or more and 30 mg/mL or less. More preferred.
  • ⁇ (B1) Solubilization aid ⁇ refers to making the active ingredient (C1) described below solubilized in water until it becomes visually transparent.
  • the term “solubilization aid” refers to an agent that has the effect of increasing the solubility of (C) the active ingredient when added to water together with (C1) the active ingredient and (A1) the hyaluronic acid derivative.
  • the solubilization aid is not particularly limited as long as it has the effect of dissolving (solubilizing) the active ingredient in the aqueous phase (C1), and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • examples include nonionic surfactants.
  • the solubilization aid (B1) used in the present invention is an agent that can be commonly used in pharmaceutical applications, contains at least 4 or more ether structures (R-OR), and has a carbon number of 4 or more. be.
  • the solubilization aid is preferably one or more selected from the group consisting of a nonionic surfactant, a polyethylene glycol with a molecular weight of 190 g/mol or more and 4000 g/mol or less, and a cyclodextrin derivative.
  • solubilization aid examples include polysorbate, polyoxyethylene fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyexyethylene castor oil, and the like.
  • polysorbate 80 having an ether structure of 20 or more and having a carbon number of 64 or more
  • polysorbate 65 having a ether structure of 20 or more and having a carbon number of 100 or more
  • polysorbate 60 having 20 or more ether structures and having 64 or more carbon atoms
  • Polysorbate 40 having 20 or more ether structures and having 62 or more carbon atoms
  • Polysorbate 20 having 20 or more ether structures and having 57 carbon atoms) above), poloxamers (having 28 or more ether structures and 74 or more carbon atoms), polyoxyethylene hydrogenated castor oil (having 35 or more ether structures and 57 or more carbon atoms), cyclodextrin derivatives
  • Polyethylene glycol 300 having 5 or more ether structures and having 12 or more carbon atoms
  • polyethylene glycol 400 having 7 or more ether structures and having 7 or more carbon atoms) 16 or more
  • polyethylene glycol 4000 having
  • examples include polyethylene glycol monolaurate (having 7 or more ether structures and 28 or more carbon atoms), polyoxyl stearate 40 (having 39 or more ether structures and 98 or more carbon atoms), stearin Acid polyoxyl 45 (having an ether structure of 44 or more and having a carbon number of 108 or more), Stearic acid polyoxyl 55 (having an ether structure of 54 or more and having a carbon number of 128 or more), Cremophor EL (having an ether structure of 35 or more) and carbon number is 127 or more).
  • Solubilization aids include, for example, poloxamer 188 (having an ether structure of 98 or more and having a carbon number of 225 or more), poloxamer 124 (having an ether structure of 26 or more and having a carbon number of 74 or more), poloxamer 237 (having an ether structure of 93 or more and a carbon number of 225 or more), poloxamer 338 (having an ether structure of 177 or more and having a carbon number of 400 or more), Poloxamer 407 (having an ether structure of 147 or more and a carbon number of 352 or more), polyethylene glycol 300 (having 5 or more ether structures and having 12 or more carbon atoms), polyethylene glycol 400 (having 7 or more ether structures and having 16 or more carbon atoms), polyethylene glycol 4000 (having 7 or more ether structures and having 16 or more carbon atoms) Polyvinyl alcohol (having an average degree of polymerization of 500, having an ether,
  • the content of the solubilizing aid (B1) relative to 100 parts by mass of the (A1) hyaluronic acid derivative is 0.0001 parts by mass or more and 15000 parts by mass or less, preferably 0.01 parts by mass or more and 150 parts by mass or less. , more preferably 0.05 parts by mass or more and 100 parts by mass or less, further preferably 1 part by mass or more and 50 parts by mass or less, particularly preferably 5 parts by mass or more and 30 parts by mass or less, and most preferably 10 parts by mass or more and 20 parts by mass or less. .
  • the content of the nonionic surfactant is 0.0001 parts by mass or more and 150 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of (A1) hyaluronic acid derivative. is preferred, more preferably 0.001 parts by mass or more and 100 parts by mass or less, and even more preferably 0.005 parts by mass or more and 50 parts by mass or less.
  • the solubilization aid is polyethylene glycol with a molecular weight of 190 g/mol or more and 4000 g/mol or less
  • the content of polyethylene glycol is 25 parts by mass or more and 15,000 parts by mass relative to 100 parts by mass of the (A1) hyaluronic acid derivative. parts by weight or less, more preferably 250 parts by weight or more and 10,000 parts by weight or less, and still more preferably 500 parts by weight or more and 5,000 parts by weight or less.
  • solubilization aid The smaller the solubilization aid, the better; however, if it is below the above lower limit, the active ingredient cannot be sufficiently solubilized. Moreover, if it exceeds the upper limit, toxicity tends to increase due to too much solubilization aid (B1) and the viscosity of the preparation also improves, so it is preferably within the above range.
  • the amount of the poorly water-soluble drug as the active ingredient (C1) relative to 100 parts by mass of the (A1) hyaluronic acid derivative is preferably 21 parts by mass or more and less than 100 parts by mass, and 22 parts by mass or more and 70 parts by mass. It is more preferably 23 parts by mass or more and 50 parts by mass or less.
  • the active ingredient although not particularly limited, may be a poorly water-soluble drug, which may be used alone or in combination of two or more.
  • composition 2 of the present embodiment can be solubilized without using an organic solvent when formulating the active ingredient (C1), which is a poorly water-soluble drug, and can be solubilized without using a conventional highly toxic solubilizing agent.
  • the usage amount can be reduced.
  • solubilization aid (B1) hydrophobic interaction between the steryl groups of the hyaluronic acid derivative (A1) can be promoted. This is thought to expand the hydrophobic region of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition and increase the amount of hydrophobic drug supported.
  • the solubilizing agent can act as a hydrophobic part region with high mobility inside the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition.
  • C1 It is presumed that the active ingredient can be solubilized at a high concentration. Note that the desired effect may be obtained by a mechanism different from the above mechanism.
  • the pharmaceutical composition 2 of this embodiment can also be called an organic solvent-free composition or a powdered drug solubilizing composition.
  • the content of organic solvent in the pharmaceutical composition 2 is preferably less than 0.8%.
  • the organic solvent contained in the pharmaceutical composition 2 is a solvent that falls under classes 1 to 3 defined by the Pharmaceutical Residual Solvent Guidelines.
  • class 1 organic solvents include benzene, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane, 1,1-dichloroethene, and 1,1,1-trichloroethane.
  • Class 2 organic solvents include acetonitrile, chlorobenzene, chloroform, cyclohexane, 1,2-dichloroethene, dichloromethane, 1,2-dimethoxyethane, N,N-dimethylacetamide, N,N-dimethylformamide, 1,4-dioxane. , 2-ethoxyethanol, formamide, hexane, methanol, 2-methoxyethanol, methylbutylketone, methylcyclohexane, N-methylpyrrolidone, nitromethane, pyridine, sulfolane, tetralin, toluene, 1,1,2-trichloroethene, xylene. Can be mentioned.
  • Class 3 organic solvents include acetic acid, acetone, anisole, 1-butanol, 2-butanol, n-butyl acetate, t-butyl methyl ether, cumene, dimethyl sulfoxide, ethanol, ethyl acetate, diethyl ether, ethyl formate, formic acid, Heptane, isobutyl acetate, isopropyl acetate, methyl acetate, 3-methyl-1-butanol, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, 2-methyl-1-propanol, pentane, 1-pentanol, 1-propanol, 2-propanol, propyl acetate , tetrahydrofuran.
  • organic solvents of classes 1 to 3 are preferably not included in the pharmaceutical composition 2, but are components that inevitably remain in the manufacturing process of hyaluronic acid derivatives. Even if the organic solvent is of Class 1 to Class 3, if the content of the organic solvent in Pharmaceutical Composition 2 is less than 0.8%, it can be used safely.
  • composition 2 of the present embodiment can be administered alone or together with a pharmacologically acceptable carrier according to conventional methods.
  • a pharmacologically acceptable carrier for example, the above-mentioned hyaluronic acid derivative and the above-mentioned active ingredient, and optionally an adjuvant, water or another physiologically acceptable liquid (for example, physiological saline) may be used in combination with a pharmacologically acceptable carrier.
  • physiologically acceptable liquid for example, physiological saline
  • Physiologically acceptable buffers, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, lyophilization aids which may be mixed with water, phosphate buffered saline (PBS), etc. It can also contain agents.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Hyaluronic acid derivatives can be obtained, for example, by converting the carboxyl group of glucuronic acid into an amide and introducing a steryl group. Furthermore, the rate of steryl group introduction can be controlled by adjusting the amount of the compound having a steryl group to be reacted with the raw material hyaluronic acid or its derivative.
  • a steryl group for example, hyaluronic acid or a derivative thereof as a raw material, preferably hyaluronic acid composed only of repeating unit (II) or
  • the derivative is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (e.g., tetrabutylammonium (TBA) salt) and combined with the hyaluronate in a solvent in the presence of a suitable condensing agent to form a compound with the formula: "HNR a -Y-NR b -R, NHR a -Y-NR b -COO-R, HNR a -Y-NR b -COO-R, HNR a -Y-NR b -CO-R, HNR a -Y-NR b -CO-NR c -R, HNR a -Y-NR b -CO-NR c -R, HNR a -Y-NR
  • the condensing agent that can be used in the above reaction is not particularly limited, and examples include 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine)-4-methylmorpholium (DMT-MM), N , N'-carbonyldiimidazole (CDI), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ), 2-benzotriazole-1,1, 3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (HODhbt), benzotriazole-1-oxy -Tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphat
  • DMT-MM is preferable in that the reaction proceeds with high efficiency even in a mixed solvent of water and an organic solvent. Furthermore, by using DMT-MM as a condensing agent, it is possible to highly selectively form an amide bond between an amino group and a carboxy group while suppressing the formation of an ester bond in a system where a large number of hydroxy groups coexist.
  • the alcohol as a solvent may react with the carboxy group of the hyaluronic acid moiety, or the carboxyl group and hydroxyl group that are simultaneously present in the hyaluronic acid moiety may bond within or intermolecularly. , it is possible to prevent the formation of undesired crosslinks.
  • Solvents used in the steryl group introduction reaction include water, DMSO, methanol, ethanol, propanol, butanol, isopropanol, polyhydric alcohol, acetonitrile, DMF, THF, dichloromethane, chloroform, hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and mixtures thereof. Examples include solvents.
  • the polyhydric alcohol may be a dihydric alcohol or a trihydric alcohol. Examples of the dihydric alcohol include ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, neopentyl glycol, 1,4-butanediol, and 1,6-hexanediol. Examples of the trihydric alcohol include glycerin and trimethylolpropane.
  • hyaluronic acid or a derivative thereof as a raw material is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (e.g., tetrabutylammonium (TBA) salt), and the hyaluronate and spacer moiety are reacted in a solvent in the presence of an appropriate condensing agent. (At this time, protection and deprotection reactions may be performed as necessary) to convert the carboxy group (-COOH) of the raw material hyaluronic acid or its derivative, and then react with an appropriate reagent. . Examples of combinations of groups derived from carboxy groups and reaction reagents are shown below.
  • reaction mode examples include dehydrohalogenation reaction, condensation reaction, dehydration reaction, nucleophilic addition reaction such as Michael addition, oxidative disulfide formation reaction, etc. These are well-known reactions and can be selected as appropriate by those skilled in the art. However, the reaction can be carried out by finding preferable reaction conditions.
  • the converter or reactant When the converter or reactant has a carboxyl group, it may be converted into an N-hydroxysuccinimide (hereinafter also referred to as "NHS”) ester and reacted.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • a hyaluronic acid derivative having a spacer having a mercapto group modified with a leaving group at the end is prepared by reacting 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide with the carboxy group of the raw material hyaluronic acid or its derivative. Then, there is a method in which thiocholesterol is subjected to a nucleophilic substitution reaction to form a disulfide bond.
  • hyaluronic acid or its derivatives with a part of the spacer introduced into the carboxy group and one with a part of the spacer introduced into the steryl group, and reacting them.
  • a hyaluronic acid derivative in which a spacer having a mercapto group at the end is introduced into the carboxy group of hyaluronic acid;
  • Another method is to prepare steryl groups into which a spacer having a mercapto group at the end is introduced, and to react them oxidatively to form a disulfide bond. At this time, one mercapto group can be reacted with 2-mercaptopyridine to form a disulfide, and then the other mercapto group can be substituted.
  • the obtained hyaluronic acid derivative may be dried.
  • the drying method include ventilation drying, drying in a thermostatic oven, reduced pressure drying, hot air circulation drying, and freeze drying. Among these, freeze-drying is preferred.
  • the hyaluronic acid derivative preferably further contains a cryoprotectant from the viewpoint of more effectively suppressing an increase in the particle size of the fine particles formed by the hyaluronic acid derivative.
  • cryoprotectant is not particularly limited as long as it is known as a "cryoprotectant” or “lyoprotectant” and includes, for example, disaccharides, sorbitol, dextran, propylene glycol, glycerin, glycerol, polyvinylpyrrolidone, Examples include dimethyl sulfoxide.
  • Disaccharides are not particularly limited and include, for example, sucrose, lactulose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose, cordibiose, nigerose, isomaltose, isotrehalose, neotrehalose, sophorose, laminaribiose, gentiobiose, turanose, maltulose, palatinose,
  • Examples include gentiobiulose, mannobiose, melibiose, melibiulose, neolactose, galactosucrose, silabiose, neohesperidose, rutinose, rutinulose, vicyanose, xylobiose, primeverose, and the like.
  • sucrose, trehalose, maltose, or lactose are preferred because they are widely used as cryoprotectants. Further, sucrose is more preferred from the viewpoint of its use as a pharmaceutical additive and from the viewpoint of more effectively suppressing the increase in particle size of fine particles formed by hyaluronic acid derivatives during freeze-drying.
  • the cryoprotectant may be added in a solid state or in a state dissolved in a solvent such as water.
  • the amount of the cryoprotectant added is not particularly limited, but is preferably 20 parts by mass or more based on 100 parts by mass of the hyaluronic acid derivative.
  • the amount of the cryoprotectant added is at least the above lower limit, a more sufficient effect of suppressing particle size increase can be obtained.
  • the upper limit of the amount of cryoprotectant added is not particularly limited, but may be, for example, 100,000 parts by mass.
  • the apparatus used in freeze-drying is not particularly limited, and for example, a commercially available freeze-dryer can be used.
  • a freeze dryer that can monitor the degree of vacuum inside the apparatus during freeze-drying is preferable, and from the viewpoint of controlling the product temperature, a shelf-type freeze dryer is preferable.
  • composition 1 of this embodiment can be manufactured by Manufacturing Method 1 or Manufacturing Method 2 of Pharmaceutical Composition 1 below. Each manufacturing method will be explained below.
  • Manufacturing method 1 is a method for manufacturing pharmaceutical composition 1 containing (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B) an association promoter, and (C) an active ingredient.
  • Production method 1 includes the steps of: (A) mixing a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced and (B) an association promoter to obtain an aqueous hyaluronic acid derivative solution containing the association promoter; and (C) associating the active ingredient. and a mixing step of mixing with a promoter-containing hyaluronic acid derivative aqueous solution.
  • Manufacturing method 2 is a method for manufacturing pharmaceutical composition 1 containing (A) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B) an association promoter, and (C) an active ingredient.
  • Production method 2 includes the steps of dispersing (C) an active ingredient in (B) an association promoter to obtain a dispersion (I), preparing an aqueous hyaluronic acid derivative solution or an aqueous hyaluronic acid solution containing an association promoter, and dispersing the aqueous solution (II). ), and a step of mixing the dispersion (I) and the aqueous solution (II).
  • the drug may be produced using an appropriate pH and buffering material.
  • manufacturing method 1 and manufacturing method 2 do not include the step of removing the organic solvent.
  • the pharmaceutical composition 2 of this embodiment can be manufactured by the following manufacturing method 1 or manufacturing method 2 of the pharmaceutical composition 2. Each manufacturing method will be explained below.
  • Manufacturing method 1 for pharmaceutical composition 2 includes manufacturing pharmaceutical composition 2 containing (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B1) a solubilization aid, and (C1) an active ingredient. It's a method.
  • Manufacturing method 1 of pharmaceutical composition 2 includes a step of mixing (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced and (B1) a solubilizing agent to obtain a hyaluronic acid derivative aqueous solution containing the solubilizing agent; (C1) A mixing step of mixing the active ingredient with a hyaluronic acid derivative aqueous solution containing a solubilization aid.
  • Manufacturing method 2 of pharmaceutical composition 2 is manufacturing method 2 of pharmaceutical composition 2, which contains (A1) a hyaluronic acid derivative into which a hydrophobic group has been introduced, (B1) a solubilization aid, and (C1) an active ingredient. It's a method.
  • Manufacturing method 2 of pharmaceutical composition 2 includes a step of dispersing (C1) an active ingredient in (B1) a solubilizing agent to obtain a dispersion (I), and a step of dispersing an aqueous hyaluronic acid derivative solution or an aqueous hyaluronic acid solution containing a solubilizing agent. and a step of mixing the dispersion (I) and the aqueous solution (II).
  • the manufacturing method 1 and the manufacturing method 2 of the pharmaceutical composition 2 do not include the step of removing the organic solvent.
  • the subjects to which the pharmaceutical composition 1 or the pharmaceutical composition 2 of the present embodiment is administered are animals classified as mammals including humans (monkeys, marmosets, mice, rats, cows, horses, cats, dogs, pigs, sheep, goats). , rabbits, etc.).
  • administration route of the pharmaceutical composition 1 or pharmaceutical composition 2 of the present embodiment is not particularly limited, and any currently known administration route can be used as appropriate depending on the intended use, the location of the tissue to be treated, etc.
  • administration routes include subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, intraarterial administration, intrathecal administration, intracerebral administration, intraarticular administration, intraperitoneal administration, intravaginal administration, intracapsular administration, intrarectal administration, and intravenous administration.
  • intracorporeal administration periocular administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intranasal administration, transbronchial administration, transpulmonary administration, transdermal administration, sublingual administration, oral administration, buccal administration, and eye drop administration.
  • subcutaneous administration intramuscular administration, intravitreal administration, intrathecal administration, and intraarticular administration are preferred. It may also be administered locally as a powder, cream, ointment, or eye drops.
  • Administration by injection includes subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, intraarterial injection, intrathecal injection, intraarticular injection, intraperitoneal injection, intravitreal injection, periocular injection, intradermal injection, intratumoral injection, etc. can be mentioned.
  • the use of hyaluronic acid derivatives reduces the initial burst of drugs, suppresses aggregation that may occur between drugs during preparation storage and after administration, reduces variations in drug efficacy, and prevents precipitates under physiological conditions and adheres to and remains in the corneal epithelium.
  • the drug By applying the drug, the drug can be released for a longer period of time and the number of eye drops can be reduced.
  • promotion of uptake of drugs into corneal epithelial cells promotion of uptake into conjunctival epithelial cells, etc. can also be considered.
  • it has high moisturizing properties, viscosity, and biocompatibility derived from hyaluronic acid, and can alleviate inflammation, pain, stress, damage, etc.
  • the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition 1 or pharmaceutical composition is excellent in tear film stabilizing effect, corneal epithelial disorder treatment effect, meibomian gland dysfunction treatment effect, and pain suppressing effect by efficiently bringing out drug effects.
  • the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition 1 or pharmaceutical composition is excellent in tear film stabilizing effect, corneal epithelial disorder treatment effect, meibomian gland dysfunction treatment effect, and pain suppressing effect by efficiently bringing out drug effects.
  • the dosage can be appropriately selected in consideration of the type of recipient (including age, gender, etc.).
  • the amount of the active ingredient (preferably protein, peptide, low molecular weight compound) per dose can be 0.01 ⁇ g or more and 20 mg or less, The amount can be 0.1 ⁇ g or more and 15 mg or less, and can be 1 ⁇ g or more and 10 mg or less.
  • the frequency of administration may be a single administration of the above-mentioned dose, and the above-mentioned dose may be administered for 1 day, 2 days, 4 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 1 month, or 2 months. Multiple administrations of two or more times, such as once every 3 months, or every 6 months, may be used. Alternatively, the drug may be administered to two or more locations in one administration.
  • the present invention comprises administering an effective amount of the above-mentioned pharmaceutical composition 1 or pharmaceutical composition 2 to a patient or an affected animal, from the group consisting of cancer, infectious and immunological diseases, and chronic diseases.
  • a method for preventing or treating one or more selected diseases is provided.
  • infectious diseases include those exemplified under "antigens derived from infectious diseases” under "antigens” above.
  • the term "effective amount" as used herein includes an amount effective for prevention or treatment, that is, an amount suitable for prevention or treatment of the above-mentioned diseases.
  • the invention relates to cancer, infectious diseases, immune diseases, inflammatory disorders, allergic diseases, skin diseases, hypertension, diabetes, neurological diseases, genetic diseases, cardiovascular diseases, cerebrovascular diseases, respiratory diseases, etc.
  • a composition for the prevention or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of diseases, eye diseases, ear diseases, and bone and joint diseases, which comprises the above-mentioned active ingredient-hyaluronic acid derivative complex. provide.
  • the present invention provides the use of the above active ingredient-hyaluronic acid derivative complex for producing pharmaceutical composition 1 or pharmaceutical composition 2.
  • Hyaluronic acid derivatives were prepared according to the following steps 1-A, 2-A, and 3-A.
  • Step 1-A (Synthesis of cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride) Cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride (Chol hydrochloride) was synthesized according to the following step 1-1-A, followed by step 1-2-A.
  • Step 1-1-A To a solution of cholesteryl chloroformate (3.37 g, 7.5 mmol) in anhydrous dichloromethane (20 mL) was added triethylamine (TEA, 1.05 mL) and stirred under an argon atmosphere. 6-(t-Butoxycarbonyl)amino-1-aminohexane (1.12 mL, 5 mmol) was added dropwise under ice cooling, and after stirring for 30 minutes under ice cooling, the mixture was warmed to room temperature (approximately 25°C). The mixture was stirred overnight.
  • TSA triethylamine
  • the reaction mixture was washed with ultrapure water and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Step 1-2-A The obtained residue was dissolved in ethyl acetate (40 mL), 4N hydrochloric acid/ethyl acetate solution (40 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature (about 25° C.) overnight. The resulting precipitate was collected by centrifugation. The obtained solid was washed four times with ethyl acetate and then dried under reduced pressure to obtain 1.2 g of cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride (Chol hydrochloride).
  • Step 2-A (Preparation of tetrabutylammonium (TBA) salt of hyaluronic acid)
  • TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) was prepared according to the following Step 2-1-A followed by Step 2-2-A.
  • Step 2-1-A DOWEX (registered trademark) 50WX-8-400 (manufactured by Aldrich) was suspended in ultrapure water, and the resin was washed with ultrapure water about three times by decantation. A 40% by mass aqueous tetrabutylammonium hydroxide solution (TBA-OH) (manufactured by Aldrich) was added in an amount of about 1.5 times the molar equivalent of the cation exchange capacity of the resin, and the mixture was stirred for 30 minutes. After removing excess TBA-OH solution by decantation, the resin was further washed with excess ultrapure water to obtain a TBA-chlorinated cation exchange resin.
  • TBA-OH tetrabutylammonium hydroxide solution
  • Step 2-2-A Raw material hyaluronate sodium salt (HA-Na) with a molecular weight of 35,000 (35 kDa) was dissolved in ultrapure water at a concentration of 15 mg/mL.
  • the suspension of the cation exchange resin which had been converted into TBA salt was added in an amount equivalent to 5 times the ion exchange capacity of the resin based on the number of moles of the HA unit (unit molecular weight: 401.3). After stirring for 15 minutes, filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was freeze-dried to obtain TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) as a white solid.
  • Step 3-A An anhydrous DMSO solution (10 mg/mL) of HA-TBA prepared in the above [Step 2-2-A] was prepared. Thereafter, Chol hydrochloride was added at a molar ratio of 19/100 to the disaccharide repeating unit (HA unit) present in the HA-TBA synthesized in [Step 1-A] above. Next, the amount of 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) added to the HA unit was 24/100 in molar ratio. The mixture was added in the following proportions and stirred overnight at room temperature (about 25°C).
  • DMT-MM 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride
  • the reaction solution was dialyzed (Spectrapore 7, molecular weight cutoff (MWCO): 3,500) in the order of 0.3M ammonia acetate/DMSO solution, 0.15M NaCl aqueous solution, and ultrapure water.
  • the obtained dialysate was freeze-dried to obtain the target product (HA-C 6 -Chol) as a white solid.
  • Step 1-B (Synthesis of cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride) Cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride (Chol hydrochloride) was synthesized according to the following step 1-1-B, followed by step 1-2-B.
  • Step 1-1-B To a solution of cholesteryl chloroformate (3.37 g, 7.5 mmol) in anhydrous dichloromethane (20 mL) was added triethylamine (TEA, 1.05 mL) and stirred under an argon atmosphere. 6-(t-Butoxycarbonyl)amino-1-aminohexane (1.12 mL, 5 mmol) was added dropwise under ice cooling, and after stirring for 30 minutes under ice cooling, the mixture was warmed to room temperature (approximately 25°C). The mixture was stirred overnight.
  • TSA triethylamine
  • the reaction mixture was washed with ultrapure water and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Step 1-2-B The obtained residue was dissolved in ethyl acetate (40 mL), 4N hydrochloric acid/ethyl acetate solution (40 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature (about 25° C.) overnight. The resulting precipitate was collected by centrifugation. The obtained solid was washed four times with ethyl acetate and then dried under reduced pressure to obtain 1.2 g of cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride (Chol hydrochloride).
  • TBA salt of hyaluronic acid was prepared according to the following step 2-1-B followed by step 2-2-B.
  • Step 2-1-B DOWEX (registered trademark) 50WX-8-400 (manufactured by Aldrich) was suspended in ultrapure water, and the resin was washed with ultrapure water about three times by decantation. A 40% by mass aqueous tetrabutylammonium hydroxide solution (TBA-OH) (manufactured by Aldrich) was added in an amount of about 1.5 times the molar equivalent of the cation exchange capacity of the resin, and the mixture was stirred for 30 minutes. After removing excess TBA-OH solution by decantation, the resin was further washed with excess ultrapure water to obtain a TBA-chlorinated cation exchange resin.
  • TBA-OH tetrabutylammonium hydroxide solution
  • Step 2-2-B Raw material hyaluronate sodium salt (HA-Na) with a molecular weight of 35,000 (35 kDa) was dissolved in ultrapure water at a concentration of 15 mg/mL. Add the suspension of the cation exchange resin that was converted to TBA in "(1) Step 2-1-B" in an amount equivalent to 5 times the ion exchange capacity of the resin based on the number of moles of the HA unit (unit molecular weight 401.3). did. After stirring for 15 minutes, filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was freeze-dried to obtain TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) as a white solid.
  • HA-TBA TBA salt of hyaluronic acid
  • Step 3-B An anhydrous DMSO solution (10 mg/mL) of HA-TBA prepared in [Step 2-2-B] was prepared. Thereafter, Chol hydrochloride was added at a molar ratio of 31/100 to the disaccharide repeating unit (HA unit) present in HA-TBA synthesized in [Step 1-B].
  • the amount of 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) added to the HA unit was 37/100 in molar ratio.
  • the mixture was added in the following proportions and stirred overnight at room temperature (about 25°C).
  • the reaction solution was dialyzed (Spectrapore 7, molecular weight cutoff (MWCO): 3,500) in the following order: 0.3M ammonia acetate/DMSO solution, 0.15M NaCl aqueous solution, and ultrapure water.
  • the obtained dialysate was freeze-dried to obtain the target product (HA-C 6 -Chol) as a white solid.
  • the target product H-C 6 -Chol
  • a peak derived from the methyl group in the cholesteryl group (CH 3 , 0.7 ppm, 3H) was confirmed, and the cholesterol introduction rate was 30%.
  • Example 1-1 A formulation of CyA using a hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) containing an association promoter (polysorbate 80) was prepared. The following operations were carried out at 20° C. and room temperature. The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved at 12.0 mg/mL in water for injection by stirring at 20° C. for 24 hours. In a separate vial, polysorbate 80 (Fuji Film Wako, product number: 164-21591) was diluted with water for injection at a ratio of 2 mg/mL.
  • Example 1-2 A CyA formulation was prepared using a hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) containing an association promoter (polyethylene glycol 400). The following operations were carried out at 20° C. and room temperature. The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved at 12.0 mg/mL in water for injection by stirring at 20° C. for 24 hours.
  • an association promoter polyethylene glycol 400
  • Example 1-3 A CyA formulation was prepared using a hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) containing association promoters (polyethylene glycol 400 and polysorbate 80). The following operations were carried out at 20° C. and room temperature.
  • the lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved in water for injection at 12.0 mg/mL by stirring at 20° C. for 24 hours.
  • CyA formulation using ⁇ -cyclodextrin was prepared. The following operations were carried out at 20° C. and room temperature. CyA powder was prepared by dissolving it in a 10% by mass sucrose solution containing ⁇ -cyclodextrin (manufactured by Aldrich) at a concentration of 10% by mass at a ratio of 0.5 mg/mL. At the end the solution was visually clear. Further, no precipitate was observed during 2 weeks of refrigerated storage. The final formulation composition is shown in Table 1.
  • ⁇ Test Example 2> A pharmacokinetic study of CyA in rats was conducted.
  • the solution formulations consisting of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical compositions prepared in Examples 1-1, 1-2, 1-3 and Comparative Example 1-2 and the solution formulation of Comparative Example 1-1 were each prepared using a 25G needle.
  • the dose (mg/kg) shown in 2 was subcutaneously administered to normal rats (SD, 6 weeks old, male).
  • FIG. 3 shows the change in plasma concentration of CyA upon administration of various CyA preparations and the change in plasma concentration of CyA in Comparative Example 1.
  • Example 2-1 is a case where a solution preparation consisting of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition of Example 1-1 was administered.
  • Examples 2-2 to 2-3 and Comparative Examples 2-1 to 2-2 are solution formulations and comparisons consisting of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical compositions of Examples 1-2 to 1-3 and Comparative Example 1-2, respectively. This is a case where each of the solution formulations of Example 1-1 was administered.
  • pharmacokinetic parameters drug half-life (T 1/2 ), mean retention time (MRT), area under the serum drug concentration-(0 to infinity) time curve (AUC inf ) were measured using WinNonlin Ver. 8.3 (manufactured by Pharsight), and the values are shown in Table 2.
  • sustained release properties are evaluated by Mean Residual Time (MRT), and the MRT of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition containing an association promoter is greater than the MRT of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition. If so, the drug is evaluated as having sustained release properties.
  • MRT Mean Residual Time
  • Example 2-1, 2-2, and 2-3 which are formulations containing an association promoter of hyaluronic acid derivatives
  • the half-life of the blood concentration is shorter than that of Comparative Example 2-2, which does not contain an association promoter. It was long and the MRT was large.
  • Example 2-1 was 1.35
  • Example 2-2 was 1.42
  • Example 2-3 was 1. It was .49. In other words, it was found that the drug remained in the blood for a long period of time. From the above, it was confirmed that the hyaluronic acid derivative composition of the present invention has excellent sustained release properties over a longer period of time.
  • Example 3-1 Regarding Example 1-1 prepared in Test Example 1, the degree of association promotion of hyaluronic acid derivatives was evaluated by GPC.
  • FIG. 1 is a chromatogram of the hyaluronic acid derivative used in Synthesis Example 1.
  • the hyaluronic derivative was dissolved in water for injection at a concentration of 1 mg/mL by stirring for 24 hours, and subjected to GPC measurement. At this time, the area value surrounded by the chromatogram and the baseline was defined as A1.
  • FIG. 2 is a chromatogram of the hyaluronic acid derivative composition of Example 1-1.
  • the hyaluronic derivative was diluted with water for injection at a rate of 1 mg/mL and measured. At this time, the area value surrounded by the chromatogram and the baseline was defined as A2.
  • Example 3-2, 3-3, and Comparative Examples 3-1, 3-2 Examples 1-2, 1-3, and Comparative Example 1-2 were also diluted with water for injection and measured in the same manner as Example 1-1, such that the concentration of the hyaluronic derivative was 1 mg/mL.
  • Comparative Example 2-1 was directly subjected to GPC measurement without being diluted. At this time, A2, which is the area value surrounded by each chromatogram and the baseline, was calculated, and the value of the area ratio A2/A1 with A1 is shown in Table 3.
  • Example 4 The association promoter was evaluated by GPC.
  • Examples 4-1, 4-2, 4-3 and Comparative Examples 4-1, 4-2 In the same manner as in Test Example 1, an aqueous hyaluronic acid derivative solution was prepared according to Table 4 below at the same composition ratios, except that it did not contain CyA as an active ingredient and sucrose as an isotonic agent. Each of the prepared samples was diluted with water for injection at a rate such that the concentration of the hyaluronic acid derivative was 1 mg/mL, and subjected to GPC measurement.
  • Examples 5-1 to 5-3, Comparative Examples 5-1 and 5-2 Sample 150 ⁇ L of each formulation obtained in Example 1 into a 1.5 mL microtube. Thereafter, a concentrated buffer solution (40 mM PB (pH 7.4), 600 mM NaCl) was added at a ratio such that the final buffer composition was 10 mM PB (pH 7.4), 150 mM NaCl, and the hyaluronic acid derivative was precipitated. After incubating at 37°C for 20 minutes, centrifuging at 2000G for 5 minutes, sampling 50 ⁇ L of the supernatant, diluting it 2 times with HP- ⁇ -CD aqueous solution (300 mM), and incubating for 1 hour.
  • a concentrated buffer solution 40 mM PB (pH 7.4), 600 mM NaCl
  • Example 6 was prepared by dissolving the freeze-dried hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 at 12.0 mg/mL in water for injection by stirring at 20°C for 24 hours. -1 to 6-11 and Comparative Examples 6-1 to 6-6.
  • Example 6-1 The hyaluronic acid derivative aqueous solution dissolved above was diluted with water for injection at a ratio of 2 mg/mL. In another vial, polyethylene glycol 300 was diluted with water for injection at a concentration of 10 mg/mL. The above hyaluronic acid derivative aqueous solution and polyethylene glycol 300 aqueous solution were mixed at a volume ratio of 1:1 to prepare the compositions shown in Table 6 below. Thereafter, it was incubated at 20°C for 24 hours and then subjected to GPC measurement.
  • Examples 6-2 to 6-11, Comparative Examples 6-1 to 6-6 A solution having the composition shown in Table 6 below was prepared using the same method as in Example 6-1 and subjected to GPC measurement.
  • Example 7 A hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition was produced.
  • Example 7 The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved in water for injection at 12.0 mg/mL by stirring at 20°C for 24 hours. -1 to 7-10 and Comparative Examples 7-1 to 7-6.
  • Example 7-1 A CyA formulation was prepared using a hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) containing an association promoter (polysorbate 80). The following operations were carried out at 20° C. and room temperature. 1.8 mg of powdered CyA (Tokyo Kasei Kogyo, product number: C2408) was weighed into a vial, and then polysorbate 80 was diluted with water for injection to 0.5 mg/mL in another vial. The weighed CyA was suspended in 18 ⁇ L of an aqueous polysorbate 80 solution with a concentration of 0.5 mg/mL.
  • Example 7-2 to 7-10 A hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition containing an association promoter was prepared in the same manner as in Example 7-1 so that the concentration of the association promoter in the final composition was as shown in Table 7 below. Furthermore, the CyA concentration in the formulation after passing through a 0.45 ⁇ m sterile filtration filter was also determined by HPLC in the same manner as in Example 7-1, and the results are summarized in Table 7.
  • a concentrated buffer solution 40 mM PB, 150 mM NaCl aqueous solution
  • a preparation consisting of a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition is added. Thereafter, the mixture is mixed with a vortex for 30 seconds, incubated at 37°C for 20 minutes, and then the precipitate is sedimented with a centrifuge (2000G, 5
  • Precipitation rate (%) ⁇ 1-(Area value of hyaluronic acid derivative of precipitation sample) ⁇ ((Area value of hyaluronic acid derivative of blank sample) x (0.75X)) ⁇ x 100
  • association promoters such as polysorbate 80, polysorbate 20, poloxamer 188, and cremophor EL
  • the poorly water-soluble active ingredients can be highly extracted from powder without using organic solvents. It was shown that it could be solubilized at a certain concentration. Furthermore, it was suggested that the association promoter also improves precipitation performance. From the above, it is expected that the association promoter will promote the association of hyaluronic acid derivatives and provide a pharmaceutical composition that is high in active ingredient content and capable of long-term sustained release.
  • Example 8 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-30%) obtained in Synthesis Example 2 was dissolved in water for injection at 2.0 mg/mL by stirring at 20°C for 24 hours. -1 to 8-11 and Comparative Examples 8-1 to 8-6.
  • Polysorbate 80 was prepared by diluting it with water for injection at a concentration of 10 mg/mL in a glass vial. A 6 mL clean vial was prepared, 400 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution and 10 ⁇ L of polysorbate 80 aqueous solution were added, mixed for 30 seconds with a vortex, and then 390 ⁇ L of water for injection was added to adjust the total to 800 ⁇ L. The ratio was adjusted to give the composition shown in Table 8 below. Thereafter, it was incubated at 20° C. for 24 hours and then subjected to GPC measurement.
  • Example 8-2 to 8-4, Comparative Examples 8-1 to 8-6 A solution having the composition shown in Table 8 below was prepared using the same method as in Example 8-1 and subjected to GPC measurement.
  • Example 9 The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved at 4.0 mg/mL in water for injection by stirring at 20°C for 24 hours. -1 to 9-2 and used in Comparative Example 9-1.
  • Example 9-1 to Example 9-2 An association promoter and water for injection were added to the above hyaluronic acid derivative aqueous solution.
  • human growth hormone (hGH: Genotropin (registered trademark) for injection) powder was dissolved in water for injection in a separate vial to a concentration of 2 mg/mL, and then the hyaluronic acid derivative containing the association promoter was prepared. 250 ⁇ L was added to the aqueous solution, and the total volume was adjusted to 1 mL. Thereafter, complexation with hGH was promoted by incubating at 37°C for 24 hours. The composition of the final formulation was adjusted to the concentrations listed in Table 9.
  • Example 9-1 to 9-2 and Comparative Example 9-1 the concentration of the hyaluronic acid derivative was adjusted to 1.0 mg/mL, and the concentration of hGH was adjusted to 0.5 mg/mL. After 24 hours, clear solutions were obtained in Examples 9-1 and 9-2. Here, only in Comparative Example 9-1, the solution became cloudy after incubation at 37° C. for 24 hours, making it difficult to obtain a complexed solution of hyaluronic acid derivative and hGH.
  • hyaluronic acid derivative composition containing polyethylene glycol 400 which is an association promoter, efficiently complexed hGH, which is a protein drug.
  • Long-term sustained release functionality was expected not only for poorly soluble drugs but also for water-soluble drugs.
  • peptide drugs such as CyA
  • application to protein drugs would enable long-term sustained release in many modalities.
  • Examples 10-1 to 10 were prepared by dissolving the hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-40%) obtained in Synthesis Example 3 at 36.0 mg/mL in water for injection by stirring at 20°C for 24 hours. -9 was used.
  • polysorbate 80 was diluted with water for injection at a concentration of 10 mg/mL. 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution was added to a 6 ml sterile vial, then 10 ⁇ L of 10 mg/mL polysorbate 80 aqueous solution was added and mixed while stirring, and finally 390 ⁇ L of water for injection was added. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-2 First, a 100 mM PB (pH 7.4) phosphate buffer solution was prepared using phosphate buffer powder (manufactured by Fuji Film Wako Co., Ltd.: 167-14491 for Biochemistry).
  • Example 10-1 Add 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 50 ⁇ L of 10 mg/mL polysorbate 80 aqueous solution and mix while stirring, add 100 ⁇ L of 100 mM PB phosphate buffer, and finally add water for injection.
  • a hyaluronic acid derivative aqueous solution was prepared by adding 250 ⁇ L to give a final concentration of 10 mM PB. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • Example 10-3 The following solution preparation was performed using the solution prepared in Example 10-1. Add 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 50 ⁇ L of 10 mg/mL polysorbate 80 aqueous solution and mix with stirring, and finally add 350 ⁇ L of water for injection to prepare the hyaluronic acid derivative aqueous solution. Preparation was carried out. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-4 Subsequently, the following solutions were prepared using the solutions prepared in Examples 10-1 and 10-2. Add 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 100 ⁇ L of polyethylene glycol 400 (manufactured by Nacalai Tesque) and mix while stirring, add 100 ⁇ L of 100 mM PB phosphate buffer, and finally inject. A hyaluronic acid derivative aqueous solution was prepared by adding 200 ⁇ L of water to give a final concentration of 10 mM PB. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • polyethylene glycol 400 manufactured by Nacalai Tesque
  • Example 10-5 Subsequently, the following solution preparation was performed using the solution prepared in Example 10-1. Add 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add and mix 100 ⁇ L of polyethylene glycol 400 (manufactured by Nacalai Tesque) while stirring, and finally add 300 ⁇ L of water for injection to prepare the hyaluronic acid derivative. An aqueous solution was prepared. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-6 Subsequently, the following solution preparation was performed using the solution prepared in Example 10-1. Add 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 300 ⁇ L of polyethylene glycol 400 (manufactured by Nacalai Tesque) and mix while stirring, and finally add 100 ⁇ L of water for injection to prepare the hyaluronic acid derivative. An aqueous solution was prepared. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-7 Poloxamer 338 (manufactured by Aldrich) was dissolved in water for injection at a concentration of 150 mg/mL. Subsequently, the following solution preparation was performed using the solution prepared in Example 10-1. Add 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 100 ⁇ L of 150 mg/mL Poloxamer 338 aqueous solution and mix while stirring, and finally add 300 ⁇ L of water for injection to prepare a hyaluronic acid derivative aqueous solution. I did it. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-8 The following solutions were prepared using the solutions prepared in Example 10-1, Example 10-2, and Example 10-7. Add 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 300 ⁇ L of Poloxamer 338 aqueous solution and mix while stirring, add 100 ⁇ L of 100 mM PB phosphate buffer, and add hyaluronic acid at a ratio to give a final concentration of 10 mM PB. An aqueous derivative solution was prepared. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-9 The following solutions were prepared using the solutions prepared in Example 10-1 and Example 10-7. Add 600 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 300 ⁇ L of 150 mg/mL Poloxamer 338 aqueous solution and mix while stirring, and finally add 100 ⁇ L of water for injection to prepare a hyaluronic acid derivative aqueous solution. I did it. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-10 Chol-PEG600 (manufactured by Avanti) was dissolved by adding water for injection at a concentration of 50 mg/mL.
  • Example 10- 10 to 10-12 Add 750 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 2.8 ⁇ L of 50 mg/mL Chol-PEG600 aqueous solution and mix while stirring, and finally add 747.2 ⁇ L of water for injection.
  • a hyaluronic acid derivative aqueous solution was prepared. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • 10 mM PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-11 The following solution preparation was performed using the solution prepared in Example 10-10. Add 750 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 11.2 ⁇ L of 50 mg/mL Chol-PEG600 aqueous solution and mix while stirring, and finally add 738.8 ⁇ L of water for injection. A hyaluronic acid derivative aqueous solution was prepared. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 10-12 The following solution preparation was performed using the solution prepared in Example 10-10. Add 750 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 6 ml sterile vial, then add 28 ⁇ L of 50 mg/mL Chol-PEG600 aqueous solution and mix with stirring, and finally add 722 ⁇ L of water for injection to prepare the hyaluronic acid derivative aqueous solution. was prepared. Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 24 hours, diluted with 10 mM PB (phosphate buffer, pH 7.4) to give a hyaluronic acid derivative concentration of 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • PB phosphate buffer, pH 7.4
  • Example 11-1 A CyA formulation was prepared using a hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) containing an association promoter (polysorbate 80). The following operations were carried out at 20° C. and room temperature. The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved by adding a 10% sucrose aqueous solution at a concentration of 12.0 mg/mL.
  • sucrose solution For the 10% sucrose solution, use a solution in which sucrose powder (manufactured by Fujifilm Wako Co., Ltd., for manufacturing purposes only) is sufficiently dissolved in water for injection, and then sterilized and filtered using a 0.22 ⁇ m filter (membrane material: PTFE). did. Weighed 10.0 mg of powdered CyA (Tokyo Kasei Kogyo, product number: C2408) into another vial, then added 0.50 mL of polysorbate 80 aqueous solution dissolved in water for injection at a concentration of 100 mg/mL, and added it using a stirrer tip. The mixture was stirred to disperse CyA.
  • Cyclosporin A (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was weighed into a conical tube, 10 mL of 10% sucrose/10% ⁇ -Cyclodextrin aqueous solution was added, and the mixture was stirred and dissolved. Finally, it was filtered through a 0.2 ⁇ m filter to obtain an administration solution.
  • the final formulation composition is shown in Table 11.
  • ⁇ Test Example 12> A pharmacokinetic study of CyA in rats was conducted.
  • the solution formulations consisting of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical compositions prepared in Example 11-1 and Comparative Example 11-2 and the solution formulation of Comparative Example 11-1 were administered at the doses shown in Table 12 (mg/kg) using a 25G needle, respectively. ) was administered subcutaneously to normal rats (SD, 6 weeks old, male).
  • FIG. 4 shows the changes in the blood concentration of CyA during administration of various CyA preparations and the changes in the blood concentration of CyA in Comparative Example 1.
  • Example 12-1 is a case where a solution preparation consisting of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition of Example 11-1 was administered.
  • Comparative Example 12-2 is a case in which a solution formulation consisting of the hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition of Comparative Example 11-2 is administered, and Comparative Example 12-1 is a case in which the solution formulation of Comparative Example 11-1 is administered.
  • the actual measured value was used for the maximum plasma concentration (C max ).
  • the area under the blood concentration-time curve (AUC 0 ⁇ ) and the area under the blood concentration-first moment curve (AUMC 0 ⁇ ) are calculated using the linear trapezoidal method for the area up to the detectable measurement time, and the area under the blood concentration-first moment curve (AUMC 0 ⁇ ) for The area up to infinity was calculated using the disappearance rate constant ( ke ) approximately calculated from three points before the detection limit.
  • MRT mean residence time
  • Example 12-1 which is a formulation containing an association promoter of a hyaluronic acid derivative
  • the value of Cmax/Dose which is an index of initial release abnormality
  • Comparative Example 12-2 which does not contain an association promoter. MRT was a large value.
  • the sustained release property was evaluated using formula (A)
  • the value of Example 12-1 was 2.49 compared to Comparative Example 12-2. In other words, it was found that the drug remained in the blood for a long period of time. From the above, it was confirmed that the hyaluronic acid derivative composition of the present invention has excellent sustained release properties over a longer period of time.
  • ⁇ Test Example 13> A hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition was produced.
  • Example 13 The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved in water for injection at 12.0 mg/mL by stirring at 20°C for 24 hours. -1 to 13-2 and used in Comparative Example 13-1. The following operations were carried out at 20° C. and room temperature.
  • Example 13-1 First, polysorbate 80 (manufactured by Thermo Scientific) was dissolved by adding water for injection at a concentration of 10 mg/mL. Subsequently, glycerin (manufactured by Nacalai Tesque, product code: 17045-94) was dissolved in water for injection to prepare a concentration of 170 mg/mL. Furthermore, 1 mL of 0.5 mol/L-EDTA solution (pH 8.0) (manufactured by Nacalai Tesque, product code: 06894-14) was added to 28.240 mL of water for injection, and 5.0 mg/mL EDTA buffer was added. It was adjusted.
  • hyaluronic acid derivative aqueous solution 416.7 ⁇ L of the above hyaluronic acid derivative aqueous solution was added to a 6 ml sterile vial, and then 100 ⁇ L of 10 mg/mL polysorbate 80 aqueous solution was added and mixed while stirring, and then 318.3 ⁇ L of water for injection was added. Finally, 15 ⁇ L of 5.0 mg/mL EDTA buffer was added to prepare a hyaluronic acid derivative aqueous solution. At this time, the EDTA concentration was 0.075 mg/mL, the glycerin concentration was 25.5 mg/mL, the polysorbate 80 concentration was 1 mg/mL, and the hyaluronic acid derivative concentration was 5 mg/mL.
  • a hyaluronic acid derivative solution was prepared with the same composition except that it did not contain an association promoter, and the obtained area value was set as A1, and the degree of association promotion by the association promoter A2/A1 was calculated and shown in Table 13.
  • CyA formulation using a hyaluronic acid derivative 35k HA-C6-Chol-19%) containing an association promoter (polysorbate 80) was prepared.
  • a CyA formulation using a hyaluronic acid derivative 35k HA-C6-Chol-19%) containing an association promoter (polysorbate 80) was prepared.
  • 2.5 mg of CyA was weighed into a 6 mL sterile vial. Thereafter, 450 ⁇ L of the hyaluronic acid derivative solution prepared in Example 13-1 was added and stirred at 20° C. for 24 hours. Undissolved CyA powder was observed, and the next operation was carried out in a saturated state.
  • the CyA-containing hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition prepared above was sterilized and filtered through a 13 mm ⁇ 0.22 ⁇ m PES filter to remove precipitated drugs that could not be encapsulated in the hyaluronic acid derivative.
  • Example 13-2 An aqueous solution of a hyaluronic acid derivative containing an association promoter was prepared in the same manner as in Example 13-1, except that the polysorbate concentration was 3 mg/mL. At this time, the EDTA concentration was 0.075 mg/mL, the glycerin concentration was 25.5 mg/mL, the polysorbate 80 concentration was 3 mg/mL, and the hyaluronic acid derivative concentration was 5 mg/mL. Thereafter, the mixture was stirred at 20° C. for 24 hours, diluted with water for injection at a rate such that the concentration of the hyaluronic acid derivative was 1 mg/mL, and subjected to GPC measurement.
  • a hyaluronic acid derivative solution was prepared with the same composition except that it did not contain an association promoter, and the degree of association promotion by the association promoter was calculated in the same manner as in Example 13-1, using the obtained area value as A1, and the results are shown in Table 13. Described.
  • CyA formulation using a hyaluronic acid derivative 35k HA-C6-Chol-19%) containing an association promoter (polysorbate 80) was prepared.
  • a CyA formulation using a hyaluronic acid derivative 35k HA-C6-Chol-19%) containing an association promoter (polysorbate 80) was prepared.
  • 2.5 mg of CyA was weighed into a 6 mL sterile vial. Thereafter, 450 ⁇ L of the hyaluronic acid derivative solution prepared in Example 13-2 was added and stirred at 20° C. for 24 hours. Undissolved CyA powder was observed, and the next operation was carried out in a saturated state.
  • the CyA-containing hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition prepared above was sterilized and filtered through a 13 mm ⁇ 0.22 ⁇ m PES filter to remove precipitated drugs that could not be encapsulated in the hyaluronic acid derivative.
  • Example 13-1 A hyaluronic acid derivative aqueous solution was prepared in the same manner as in Example 13-1, except that the polysorbate concentration was 0 mg/mL. At this time, the EDTA concentration was 0.075 mg/mL, the glycerin concentration was 25.5 mg/mL, the polysorbate 80 concentration was 0 mg/mL, and the hyaluronic acid derivative concentration was 5 mg/mL. Thereafter, the mixture was stirred at 20° C. for 24 hours, diluted with water for injection at a rate such that the concentration of the hyaluronic acid derivative was 1 mg/mL, and subjected to GPC measurement.
  • CyA formulation using a hyaluronic acid derivative 35k HA-C6-Chol-19%) was prepared.
  • 2.5 mg of CyA was weighed into a 6 mL sterile vial. Thereafter, 450 ⁇ L of the hyaluronic acid derivative solution prepared in Comparative Example 13-1 was added and stirred at 20° C. for 24 hours. Undissolved CyA powder was observed, and the next operation was carried out in a saturated state. An attempt was made to sterilize the CyA-containing hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition prepared above using a 13 mm ⁇ 0.22 ⁇ m PES filter, but filtration was difficult.
  • the GPC peak of the association promoter alone was also verified under conditions not containing the hyaluronic acid derivative, but no peak derived from the association promoter was detected at the peak position of the hyaluronic acid derivative.
  • the final composition is shown in Table 13.
  • the active ingredient CyA was 29.1 or 37.6 parts by mass per 100 parts by mass of the hyaluronic acid derivative, and it was confirmed that it could be solubilized at a high concentration. Longer-term sustained release is expected.
  • Example 14-1 The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved at 12.0 mg/mL in water for injection by stirring at 20° C. for 24 hours. Add 416.7 ⁇ L of the above 12.0 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 1.5 mL Eppendorf tube, and then add polyvinyl alcohol (degree of polymerization 500, manufactured by Nacalai Tesque) dissolved in water for injection at a concentration of 100 mg/mL. , product number: 11738-62). Thereafter, water for injection was added at a rate of 1000 ⁇ L in total (Table 14). Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 2 hours, diluted 5 times with water for injection at a rate such that the concentration of the hyaluronic acid derivative was 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • polyvinyl alcohol degree of polymerization 500, manufactured by Nacal
  • Example 14-2 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-40%) obtained in Synthesis Example 3 was dissolved in water for injection at 62.6 mg/mL by stirring at 20° C. for 24 hours. Add 79.9 ⁇ L of the above 62.6 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 1.5 mL Eppendorf tube, and then add polyvinyl alcohol (degree of polymerization 500, manufactured by Nacalai Tesque) dissolved in water for injection at a concentration of 100 mg/mL. , product number: 11738-62). Thereafter, water for injection was added at a rate of 1000 ⁇ L in total (Table 14). Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 2 hours, diluted 5 times with water for injection at a rate such that the concentration of the hyaluronic acid derivative was 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • polyvinyl alcohol degree of polymerization 500, manufactured by Na
  • Example 14-3 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-30%) obtained in Synthesis Example 2 was dissolved in water for injection at 40.0 mg/mL by stirring at 20° C. for 24 hours. Add 125.0 ⁇ L of the above 40.0 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution to a 1.5 mL Eppendorf tube, and then add polyvinyl alcohol (polymerization degree 500, manufactured by Nacalai Tesque) dissolved in water for injection at a concentration of 100 mg/mL. , product number: 11738-62). Thereafter, water for injection was added at a rate of 1000 ⁇ L in total (Table 14). Thereafter, the mixture was incubated at 20° C. for 2 hours, diluted 5 times with water for injection at a rate such that the concentration of the hyaluronic acid derivative was 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • polyvinyl alcohol polymerization degree 500, manufactured by Nacalai
  • the GPC peak of the association promoter alone was also verified under conditions not containing the hyaluronic acid derivative, but no peak derived from PVA, which is the association promoter, was detected at the peak position of the hyaluronic acid derivative.
  • Example 14-4 to Example 14-6 The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved at 12.0 mg/mL in water for injection by stirring at 20° C. for 24 hours. Further, using the 10 mg/mL polysorbate 80 aqueous solution prepared in Example 13-1, the 170 mg/mL glycerol aqueous solution, the water for injection, and the 5.0 mg/mL EDTA solution, an association promoter-containing hyaluronic acid derivative aqueous solution was prepared to the concentration shown in Table 14. Adjusted by percentage. Thereafter, it was incubated at 20°C for 24 hours and then subjected to GPC measurement.
  • Example 14-7 to Example 14-8 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-40%) obtained in Synthesis Example 3 was dissolved in water for injection at 62.6 mg/mL by stirring at 20° C. for 24 hours. Further, using the 10 mg/mL polysorbate 80 aqueous solution prepared in Example 13-1, the 170 mg/mL glycerol aqueous solution, the water for injection, and the 5.0 mg/mL EDTA solution, an association promoter-containing hyaluronic acid derivative aqueous solution was prepared to the concentration shown in Table 14. Adjusted by percentage. Thereafter, it was incubated at 20°C for 24 hours and then subjected to GPC measurement.
  • Example 14-9 to Example 14-11 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-30%) obtained in Synthesis Example 2 was dissolved in water for injection at 40.0 mg/mL by stirring at 20° C. for 24 hours. Further, using the 10 mg/mL polysorbate 80 aqueous solution prepared in Example 13-1, the 170 mg/mL glycerol aqueous solution, the water for injection, and the 5.0 mg/mL EDTA solution, an association promoter-containing hyaluronic acid derivative aqueous solution was prepared to the concentration shown in Table 14. Adjusted by percentage. Thereafter, it was incubated at 20°C for 24 hours and then subjected to GPC measurement.
  • Example 14-4 to Example 14-11 Each sample was diluted 5 times with water for injection at a rate such that the concentration of the hyaluronic acid derivative was 1 mg/mL, and then subjected to GPC measurement.
  • the GPC peak of the association promoter alone was also verified under conditions not containing the hyaluronic acid derivative, but no peak derived from the association promoter polysorbate 80 was detected at the peak position of the hyaluronic acid derivative.
  • the final composition and degree of association promotion are shown in Table 14.
  • association promoter has the function of properly interacting and promoting the association of hyaluronic acid derivatives. It is expected that various other buffers, antibacterial preservatives, and stabilizers will have an association-promoting effect, and by expanding the hydrophobic part within nanoparticles, the amount of solubilized poorly soluble drugs can be increased and sustained release after in vivo administration. We can expect the ability to extend the period.
  • Example 15-1 The lyophilized hyaluronic acid derivative (35k HA-C6-Chol-19%) obtained in Synthesis Example 1 was dissolved at 12.0 mg/mL in water for injection by stirring at 20° C. for 24 hours. Thereafter, it was dissolved in another vial with water for injection at a glycerol concentration of 170 mg/mL. Furthermore, in another vial, a 0.5 mol/l-EDTA solution (pH 8.0) (manufactured by Nacalai Tesque) was diluted with water for injection at a rate to give an EDTA concentration of 5 mg/mL. Furthermore, in another vial, polysorbate 80 was diluted with water for injection at a concentration of 10 mg/mL. Using the solution prepared above, an aqueous hyaluronic acid derivative solution containing an association promoter was prepared.
  • the powder of semaglutide (manufactured by Funakoshi, product code: AG-CP3-0032) was dissolved in a 10 mM phosphate buffer solution in an Eppendorf tube to a concentration of 1 mg/mL, and then the above-mentioned association promoter-containing powder was prepared.
  • 150 ⁇ L of a hyaluronic acid derivative aqueous solution and 150 ⁇ L of a 1 mg/mL semaglutide solution were mixed, and then incubated at 20° C. for 1 hour to promote complexation with semaglutide.
  • the composition of the final formulation was adjusted to the concentrations listed in Table 15.
  • Example 15-2 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-30%) obtained in Synthesis Example 2 was dissolved in water for injection at 40.0 mg/mL by stirring at 20° C. for 24 hours. Thereafter, it was dissolved in another vial with water for injection at a glycerol concentration of 170 mg/mL. Furthermore, in another vial, a 0.5 mol/l-EDTA solution (pH 8.0) (manufactured by Nacalai Tesque) was diluted with water for injection at a rate to give an EDTA concentration of 5 mg/mL. Furthermore, in another vial, polysorbate 80 was diluted with water for injection at a concentration of 10 mg/mL. Using the solution prepared above, an aqueous hyaluronic acid derivative solution containing an association promoter was prepared.
  • aqueous solution 125 ⁇ L of a 40.0 mg/mL hyaluronic acid derivative 10k HA-C6-Chol-30%) aqueous solution was added, and then 100 ⁇ L of a 10 mg/mL polysorbate 80 aqueous solution was added while stirring with a stirrer. 150 ⁇ L of mL glycerol solution was added. Thereafter, 610 ⁇ L of water for injection and 15 ⁇ L of 5 mg/mL EDTA solution were added and stirred overnight.
  • the powder of semaglutide (manufactured by Funakoshi, product code: AG-CP3-0032) was dissolved in a 10 mM phosphate buffer solution in an Eppendorf tube to a concentration of 1 mg/mL, and then the above-mentioned association promoter-containing powder was prepared.
  • 150 ⁇ L of a hyaluronic acid derivative aqueous solution and 150 ⁇ L of a 1 mg/mL semaglutide solution were mixed, and then incubated at 20° C. for 1 hour to promote complexation with semaglutide.
  • the composition of the final formulation was adjusted to the concentrations listed in Table 15.
  • Example 15-1 to 15-2 the concentration of the hyaluronic acid derivative was adjusted to 2.5 mg/mL, and the concentration of semaglutide was adjusted to 0.5 mg/mL.
  • the semaglutide conjugation rate was evaluated by GPC as shown below.
  • the hyaluronic acid derivative composition containing polysorbate 80, an association promoter efficiently complexed the peptide drug semaglutide.
  • JP6271672B2 mentions that EDTA plays the role of a protease inhibitor and can be included as a stabilizer for API, but even under such a stabilizer, the association promoter may not interact properly. It also suggests that hyaluronic acid derivatives can be encapsulated. From this result, it was inferred that in addition to cyclic peptide drugs such as CyA, application to long-chain peptide drugs would enable long-term sustained release in many modalities.
  • Step 1B (Synthesis of cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride) Cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride (Chol hydrochloride) was synthesized according to Step 1B-1 shown below, followed by Step 1B-2.
  • the reaction mixture was washed with ultrapure water and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Step 1B-2 The obtained residue was dissolved in ethyl acetate (40 mL), 4N hydrochloric acid/ethyl acetate solution (40 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature (about 25° C.) overnight. The resulting precipitate was collected by centrifugation. The obtained solid was washed four times with ethyl acetate and then dried under reduced pressure to obtain 1.2 g of cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride (Chol hydrochloride).
  • Step 2B Preparation of tetrabutylammonium (TBA) salt of hyaluronic acid
  • TBA salt of hyaluronic acid HA-TBA
  • Step 2B-1 DOWEX (registered trademark) 50WX-8-400 (manufactured by Aldrich) was suspended in ultrapure water, and the resin was washed with ultrapure water about three times by decantation.
  • a 40% by mass aqueous tetrabutylammonium hydroxide solution (TBA-OH) (manufactured by Aldrich) was added in an amount of about 1.5 times the molar equivalent of the cation exchange capacity of the resin, and the mixture was stirred for 30 minutes. After removing the excess TBA-OH solution by decantation, the resin was further washed with excess ultrapure water to obtain a TBA-chlorinated cation exchange resin.
  • Step 2B-2 Raw material hyaluronate sodium salt (HA-Na) with a molecular weight of 10,000 (10 kDa) was dissolved in ultrapure water at a concentration of 15 mg/mL. A suspension of the cation exchange resin salted with TBA in "Step 2B-1" was added in an amount equivalent to 5 times the ion exchange capacity of the resin based on the number of moles of the HA unit (unit molecular weight 401.3). After stirring for 15 minutes, filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was freeze-dried to obtain TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) as a white solid.
  • HA-TBA TBA salt of hyaluronic acid
  • Step 3B An anhydrous DMSO solution (10 mg/mL) of HA-TBA prepared in "Step 2B-2" was prepared. Thereafter, Chol hydrochloride was added in a molar ratio of 44/100 to the disaccharide repeating unit (HA unit) present in HA-TBA synthesized in "Step 1B". Next, the amount of 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) added to the HA unit was 48/100 in molar ratio. The mixture was stirred at room temperature (approximately 25°C) overnight.
  • DMT-MM 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride
  • the reaction solution was dialyzed (Spectrapore 7, molecular weight cutoff (MWCO): 3,500) in the order of 0.3M ammonia acetate/DMSO solution, 0.15M NaCl aqueous solution, and ultrapure water.
  • the obtained dialysate was freeze-dried to obtain the target product (HA-C 6 -Chol) as a white solid.
  • Example 1B-1 Cyclosporine (CyA), a poorly water-soluble peptide, was formulated from powder using a hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%).
  • aqueous solution (II) The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection at 36.0 mg/mL. As a result, an aqueous hyaluronic acid derivative solution (II) was obtained.
  • Step of obtaining dispersion liquid (I) In a separate vial, polysorbate 80 was diluted with water for injection at a rate of 10 mg/mL. Furthermore, 4.0 mg of powdered CyA (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., product number: C2408) was weighed into another vial, and then 80 ⁇ L of 10 mg/mL polysorbate 80 was added. Thereby, a CyA dispersion in which CyA was dispersed in polysorbate 80 was obtained as a dispersion (I).
  • Example 1B-2 to Example 1B-11 CyA was formulated into a formulation using a hyaluronic acid derivative and a solubilizing agent in the same manner as in Example 1B-1 except for changing the type and amount of the solubilizing agent.
  • the theoretical concentration in the formulation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the formulation determined by HPLC measurement are shown in Tables 17 and 18, respectively.
  • Example 1B-1 the product was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to remove precipitated CyA, and the drug concentration in the preparation was determined by HPLC measurement in the same manner as in Example 1B-1. It was confirmed that all the filtrates were clear.
  • Table 4 shows the theoretical drug concentration in the preparation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the preparation determined by HPLC measurement.
  • Example 1B-1 the product was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to remove precipitated CyA, and the drug concentration in the preparation was determined by HPLC measurement in the same manner as in Example 1B-1. It was confirmed that all the filtrates were clear.
  • Table 19 shows the theoretical drug concentration in the preparation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the preparation determined by HPLC measurement.
  • the product was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to remove precipitated CyA, and the drug concentration in the preparation was determined by HPLC measurement.
  • Table 19 shows the theoretical drug concentration in the preparation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the preparation determined by HPLC measurement.
  • Span83 used in Comparative Example 1B-9 was manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., and sucrose stearate used in Comparative Examples 1B-10 to 1B-12 was a reagent manufactured by Mitsubishi Chemical Company.
  • the solubilization aid promotes hydrophobic interaction between the steryl groups of the hyaluronic acid derivative, and as a result, the hydrophobic region of the hyaluronic acid derivative is expanded, resulting in a hydrophobic
  • the solubilization aid inside the hyaluronic acid derivative composition acts as a highly mobile hydrophobic region, in addition to the hydrophobic region bound by chemical bonds to the hyaluronic acid polymer.
  • powdered drugs can be solubilized at high concentrations.
  • the amount of poorly water-soluble drugs solubilized generally increases in proportion to the amount of solubilizer added, but in the present invention, even though the total mass of the solubilizer is reduced, it is effective.
  • Highly concentrated formulations of ingredients can be prepared.
  • Comparative Examples 1B-9 to 1B-12 all satisfy the carbon number of 4 or more, but are solubilization aids that have only one or three ether structures. . In all of these, the drug and solubilization aid could not be stably dissolved in the hyaluronic acid derivative, making filtration almost difficult.
  • a composition consisting of a hyaluronic acid derivative and a solubilizing agent that contains at least 4 or more ether structures (R-OR-R) and has a carbon number of 4 or more can be prepared from powder without using any organic solvent. Even if the concentration of the solubilizing agent is reduced, the ability to solubilize poorly water-soluble drugs can be greatly improved, and it is possible to provide a simple formulation method and a pharmaceutical composition with low toxicity.
  • Example 2B-1 to 2B-12 The amount of solubilization aid added was verified in detail.
  • the lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection to a concentration of 5 mg/mL.
  • 1.0 mg of powdered CyA was weighed, 0.2 mL was added so that the final composition of the solubilizing agent concentration in the formulation was the concentration listed in Table 21, and a stirrer tip was added to stir it. .
  • solubilizing agents containing at least 4 or more ether structures (R-O-R) and having a carbon number of 4 or more can be used in formulations as shown in Examples 2B-1 to 2B-13. improved drug concentration.
  • Example 3B-1 to 3B-14 Next, usable solubilization aids were examined in detail. Specifically, we verified whether polyethylene glycol 300 and polyethylene glycol 400, which contain at least 5 or more ether structures (R-O-R) and have 12 or more carbon atoms, can be used as solubilization aids. .
  • the lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection to a concentration of 8 mg/mL.
  • the concentration of the solubilizing agent in the finally obtained hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition was adjusted as shown in Table 7 below.
  • Example 3B-1 is a solubilizing agent that contains at least 4 or more ether structures (ROR) and has a carbon number of 4 or more.
  • ROR ether structures
  • the drug concentration in the formulation was increased.
  • the active ingredient could be solubilized at a higher concentration than the sum of the solubilized amounts of the hyaluronic acid derivative alone and the solubilization aid alone, demonstrating a synergistic effect.
  • Example 4B-1 Next, detailed verification of the method for producing a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition was conducted.
  • the lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection at 36.0 mg/mL.
  • polysorbate 80 was diluted with water for injection to 10 mg/mL.
  • Table 23 shows the theoretical drug concentration in the preparation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the preparation determined by HPLC measurement.
  • Example 4B-2 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection at 36.0 mg/mL.
  • polysorbate 80 was diluted with water for injection to 10 mg/mL.
  • 320 ⁇ L of 10 mg/mL polysorbate 80 was added to another vial, and while stirring with a stirrer tip in the vial, 0.60 mL of the above 36.0 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution was added, and the liquid volume was Water for injection was added to make 1.30 mL.
  • the method includes a step (I) of dispersing the active ingredient in a solubilization aid, and a step (II) of preparing the aqueous hyaluronic acid derivative solution or the aqueous hyaluronic acid solution containing the solubilizer, and mixing (I) and (II).
  • the solubility of the poorly water-soluble active ingredient in water from the powder can be improved by both methods: the formulation method in which the active ingredient is prepared in the step of mixing the active ingredient with a hyaluronic acid derivative aqueous solution containing a solubilizing agent. It was found that a hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition excellent in increasing the In addition, in this production method, even when the solubilization aid is other than polysorbate 80, high solubilization ability is expected without greatly depending on the mixing method.
  • Example 5B-1 Next, we verified the types of poorly water-soluble drugs.
  • the lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection at a concentration of 36.0 mg/mL.
  • Table 24 shows the theoretical drug concentration in the preparation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the preparation determined by HPLC measurement.
  • Example 5B-2 A formulation was prepared in the same manner as in Example 5B-1, except that the poorly water-soluble drug was changed to fluticasone propionate (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) instead of paclitaxel.
  • Example 5B-1 A formulation was prepared in the same manner as in Example 5B-1, except that no solubilization aid was added.
  • Example 5B-2 A formulation was prepared in the same manner as in Example 5B-2, except that no solubilization aid was added.
  • Example 5B-3 A formulation was prepared in the same manner as in Example 5B-1, except that no hyaluronic acid derivative was added.
  • Example 5B-4 A formulation was prepared in the same manner as in Example 5B-2, except that no hyaluronic acid derivative was added.
  • Table 24 shows the theoretical drug concentration in the preparation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the preparation determined by HPLC measurement. Shown below.
  • solubilizing agents that contain at least 4 or more ether structures (R-O-R) and have 4 or more carbon atoms can be used in formulations as shown in Examples 5B-1 and 5B-2. improved drug concentration.
  • the solubilizing aid alone had almost no ability to solubilize poorly water-soluble drugs.
  • Example 6B-1 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection at 36.0 mg/mL.
  • cholesterol-PEG600 manufactured by Aldrich: C1145-250MG
  • 400 ⁇ L of 10 mg/mL cholesterol-PEG600 was added to another vial, and while stirring with a stirrer tip in the vial, 0.60 mL of the above 36.0 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution was added.
  • Example 1B-1 the precipitated temsirolimus was removed by filtration with a 0.45 ⁇ m sterile filter, and the drug concentration in the preparation was determined by HPLC measurement in the same manner as in Example 1B-1. It was confirmed that all the filtrates were clear.
  • Table 26 shows the theoretical drug concentration in the preparation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the preparation determined by HPLC measurement.
  • solubilization aids containing at least 4 or more ether structures (ROR) and having 4 or more carbon atoms are as shown in Example 6B-1. Improved drug concentration in formulations.
  • the active ingredient could be solubilized at a higher concentration than the sum of the solubilized amounts of the hyaluronic acid derivative alone and the solubilization aid alone, demonstrating a synergistic effect.
  • Example 7B-1 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection at 36.0 mg/mL.
  • cholesterol-PEG600 manufactured by Aldrich: C1145-250MG
  • 400 ⁇ L of 10 mg/mL cholesterol-PEG600 was added to another vial, and while stirring with a stirrer tip in the vial, 0.60 mL of the above 36.0 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution was added.
  • Example 7B-2 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection at 36.0 mg/mL.
  • cholesterol-PEG600 manufactured by Aldrich: C1145-250MG
  • 10.0 mg of powdered CyA was weighed out, and then 0.60 mL of the above 36.0 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution was added, and while stirring with a stirrer tip in the vial, 10 mg/mL of cholesterol was added.
  • Example 7B-3 The lyophilized hyaluronic acid derivative (10k HA-C6-Chol-44%) obtained in Synthesis Example 1B was dissolved in water for injection at 36.0 mg/mL.
  • HP- ⁇ -CD manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.: H0979
  • 10.0 mg of powdered CyA was weighed out, and then 0.60 mL of the above 36.0 mg/mL hyaluronic acid derivative aqueous solution was added, and while stirring with a stirrer tip in the vial, 10 mg/mL of HP was added.
  • Example 1B-1 the product was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to remove precipitated CyA, and the drug concentration in the preparation was determined by HPLC measurement in the same manner as in Example 1B-1. It was confirmed that all the filtrates were clear.
  • Table 26 shows the theoretical drug concentration in the preparation calculated from the added amount and the actual drug concentration in the preparation determined by HPLC measurement.
  • the solubilization aid containing at least 4 or more ether structures (ROR) and having 4 or more carbon atoms was found to be Example 7B.
  • the drug concentration in the formulation was increased.
  • the active ingredient could be solubilized at a higher concentration than the sum of the solubilized amounts of the hyaluronic acid derivative alone and the solubilization aid alone, demonstrating a synergistic effect.
  • hyaluronic acid derivative pharmaceutical composition of the present embodiment a large amount of drug can be solubilized from powder, the amount of solubilized can be maximized, and the active ingredient can be absorbed subcutaneously from within the gelled hyaluronic acid derivative composition.
  • a pharmaceutical composition using a hyaluronic acid derivative that is excellent in controlling the release rate and sustaining the release of active ingredients over a long period of time can be obtained.

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Abstract

（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物。前記（Ｂ）会合促進剤はエーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たすことが好ましい。

Description

ヒアルロン酸誘導体医薬組成物及び医薬組成物の製造方法
　本発明は、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物及び医薬組成物の製造方法に関する。
　本願は、２０２２年７月２０日に、日本に出願された特願２０２２－１１５８３９号、２０２２年９月２２日に、日本に出願された特願２０２２－１５１８２３号及び２０２２年７月２０日に、日本に出願された特願２０２２－１１５８４１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、タンパク質やペプチド、核酸を活性成分とする医薬品であるバイオ医薬品が実用化されており、その数は年々増え続けている。バイオ医薬品は、従来の低分子医薬では満たすことができなかった未充足医療ニーズを満たすことができる。
　しかしながら、バイオ医薬品は消化管や粘膜等からは吸収されにくい上、体内では不安定で血中半減期が短いという課題がある。そのため、バイオ医薬品は注射による頻回投与が必要であり、患者と医療関係者いずれにとっても負担が大きい。そこで、薬理活性を損なうことなくバイオ医薬品をカプセル化して生体内で徐々に有効成分を放出することができる薬物基材（徐放性ドラッグデリバリーシステム基材）が求められている。
　このような背景から、特許文献１では、安全性に優れたヒアルロン酸誘導体からなる徐放性ドラッグデリバリーシステム基材が提案されている。
　特許文献１に開示されたヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に会合し、薬物、特にバイオ医薬品を、その生物活性を維持したまま効率よく封入することができる。これにより、生理食塩濃度下で凝集し（或いは、生理食塩濃度下でも分散し）、なおかつ血中滞留性が良好である。このヒアルロン酸誘導体は、特にバイオ医薬品を有効成分として使用する場合に、薬理活性を維持したまま多くの薬物を効率よく封入できる担体、及び血中滞留性に優れた血中徐放キャリア並びにターゲティングキャリアとして用いることができ、薬物を持続的に徐放できる局所（例えば、皮下等）徐放キャリアにもなり得るとされている。
　一方、医薬品業界においては、強力な生物活性を有する医薬有効成分であっても、その水溶性が低いためにその効果を発揮することができず、その開発を断念する、あるいは本来持つ活性よりも低い活性しか示すことのできない製剤として上市されているものが多数存在している。
　水に不溶性あるいは難水溶性の医薬品有効成分を可溶化する方法としては、以下の（ａ）から（ｃ）に記載の方法が存在する。
　（ａ）薬物の構造の一部を変えて可溶性誘導体にする方法：塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、スルホン酸ナトリウム塩といった可溶性誘導体とする。
　（ｂ）有機溶媒単体、あるいは水系溶媒と有機溶媒との混合溶媒を用いる方法：メタノール、エタノールなどを用いて可溶化する方法。
　（ｃ）溶解補助剤を添加する方法：界面活性剤の添加により、ミセル化、乳化して可溶化する方法。血清アルブミンあるいは血漿蛋白質を用いる方法。
　しかし、上記（ａ）の方法では、有効成分である医薬原薬そのものの構造の一部を変換することであり、原薬そのものの溶解性を上げることはできない。また、誘導体とすることにより、医薬品としての活性が低下する場合や、ｐＨの変化による薬物の析出といった様々な問題が生じることがあり、望まれる方法ではない。
　上記（ｂ）に記載したメタノールのような有機溶媒を用いる方法は、生物活性的に不活性で、かつ溶血性を伴わない安全な有機溶媒は極めて少なく、医薬分野ではあまり実用化されていない。例えば、特許文献２においては、難水溶性のシクロスポリン組成物を、有機溶媒、可溶化助剤あるいは水と有機溶媒あるいは水と可溶化助剤、もしくは水と有機溶媒と可溶化助剤の混合溶媒に溶解する工程を経た製造方法が記載されている。
　しかし、得られた溶液は濁度のある溶液であり、部分的な析出が確認され可溶化が十分になされていないことが分かる。これは、難水溶性の薬剤有効成分が析出していることであり、十分な活性を得られないこと、又析出による生体への毒性が改善されていないことを示している。
　上記（ｃ）の界面活性剤を使用した方法は、生体に安全で、有効な可溶性を示す界面活性剤は極めて少ないのが実情である。従来薬物Ｔａｘｏｌをポリオキシエチル化ひまし油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ）を使用して溶解させたものが存在したが、ポリオキシエチル化ひまし油がＩｇＥを介さず、補体系の活性化の結果として生じる過敏性反応（ＨＳＲ）で示される急性免疫毒性を引き起こすことが非特許文献１に報告されている。安全でかつ有用な界面活性剤が極めて少ないことから、有毒なＣｒｅｍｏｐｈｏｒを用いてパクリタキセルを溶解した製剤が存在する。
　特許文献３では難水溶性の有効成分をヒアルロン酸誘導体に封入させる際には、難水溶性の有効成分をメタノールなどの有機溶剤に溶解させる必要がある。そのために有機溶剤の使用は避けられない。加えて、特許文献３では難水溶性の有効成分の可溶化量が十分でない。また難水溶性の有効成分を粉末の状態から効率的に可溶化する製剤化方法については具体的に検討がなされておらず、改良の余地がある。
　特許文献２等では難水溶性の有効成分をポリエチレングリコール３００などの可溶化助剤を用いても、比較的安定な難水溶性有効成分が含有された懸濁液が提供されるにすぎず、難水溶性の有効成分を高い濃度で完全に可溶化することが難しい。
国際公開第２０１０／０５３１４０号 米国特許出願公開第２０２０／０２３７８５９号明細書 特表２０１４－５３４４１０号公報
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　２１６　（２００５）　１０６－１２１
　徐放性の薬物基材には、生体内で有効成分の濃度をさらに長期間にわたり維持し徐々に有効成分を放出できることが求められる。加えて、有効成分を高濃度で可溶化できることが求められる。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、生体内で有効成分の濃度をさらに長期間にわたり維持し徐々に有効成分を放出でき、有効成分を高濃度で可溶化できるヒアルロン酸誘導体医薬組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。
　さらに、本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、有機溶媒を使用せず、毒性の高い界面活性剤の使用量を低減しつつ、難水溶性有効成分を高濃度で可溶化できるヒアルロン酸誘導体医薬組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２］前記（Ｂ）会合促進剤はエーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす、［１］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［３］前記（Ｂ）会合促進剤が、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー、オキシエチレンヒマシ油、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール４０００、脂肪酸ソルビタンエステル、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート並びにポリビニルアルコールから成る群から選択される１種以上である、［１］又は［２］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［４］生理塩濃度下で沈殿物が生じる、［１］～［３］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［５］前記（Ｃ）有効成分は、タンパク質または難水溶性薬物から選択される少なくとも１種である、［１］～［４］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。［６］前記難水溶性薬物は水への溶解度が１ｍｇ／ｍＬ以下である［５］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［７］前記難水溶性薬物は分子量２００以上である［５］又は［６］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［８］前記難水溶性薬物は難水溶性ペプチドである、［５］～［７］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［９］前記難水溶性ペプチドは、アミド結合を構成する窒素原子の少なくとも１つがメチル基を有する、［８］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［１０］前記難水溶性ペプチドは環状ペプチド、長鎖ペプチドから選択される少なくとも一つ以上を含む、［８］又は［９］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［１１］前記難水溶性ペプチドは環状ペプチドである、［８］～［１０］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［１２］１００質量部の前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する前記（Ｃ）有効成分の含有量は、１０質量部以上１００質量部以下である、［１］～［１１］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［１３］前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有する、［１］～［１２］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基である。Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表す。
　Ｘ１は、－ＮＲｂ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｓ－Ｒ、－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び－Ｓ－Ｓ－Ｒ、で表される基からなる群より選択される基である。
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｆのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒは、ステリル基である。
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－である。ここで、Ｙのアルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｇのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンである。
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンである。
　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
［１４］前記ステリル基はコレステリル基である、［１３］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［１５］前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が７％以上３５％未満である、［１３］～［１４］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。［１６］前記ヒアルロン酸誘導体医薬組成物は目視で析出物が観察されない、［１］～［１５］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［１７］ろ過滅菌可能である、［１］～［１６］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［１８］（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法であって、前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、前記（Ｂ）会合促進剤とを混合し、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を得る工程と、前記（Ｃ）有効成分と前記会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液と混合する混合工程と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法。
［１９］（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法であって、前記（Ｃ）有効成分を前記（Ｂ）会合促進剤に分散させ、分散液（Ｉ）を得る工程と、ヒアルロン酸誘導体水溶液又は会合促進剤含有ヒアルロン酸水溶液を調製し、水溶液（ＩＩ）を得る工程を含み、前記分散液（Ｉ）と水溶液（ＩＩ）とを混合する工程と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法。
［２０］有機溶剤を除去する工程を含まない、［１８］又は［１９］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法。
　さらに、本発明は、以下の態様を含む。
［２１］（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤と、（Ｃ１）有効成分と、を含み、前記（Ｂ１）可溶化助剤は、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たし、１００質量部の前記（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、前記（Ｂ１）可溶化助剤の含有量が０．０００１質量部以上１５０００質量部以下である、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２２］前記（Ｂ１）可溶化助剤が、非イオン界面活性剤、分子量１９０ｇ／ｍｏＬ以上４０００ｇ／ｍｏＬ以下のポリエチレングリコール、シクロデキストリン誘導体、から成る群から選択される１種以上である、［２１］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２３］前記（Ｂ１）可溶化助剤が、ポリソルベート８０、ポリソルベート６５、ポリソルベート６０、ポリソルベート４０、ポリソルベート２０、ポロキサマー、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、シクロデキストリン誘導体、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール４０００、並びにトコフェリルポリエチレングリコールスクシネートから成る群から選択される１種以上である、［２１］又は［２２］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２４］前記（Ｂ１）可溶化助剤が非イオン界面活性剤であり、１００質量部の前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、前記非イオン界面活性剤の含有量が０．０００１質量部以上１５０質量部以下である、［２１］～［２３］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２５］前記（Ｂ１）可溶化助剤が分子量１９０ｇ／ｍｏＬ以上４０００ｇ／ｍｏＬ以下のポリエチレングリコールであり、１００質量部の前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、前記ポリエチレングリコールの含有量が２５質量部以上１５０００質量部以下である、［２１］～［２４］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２６］前記（Ｃ１）有効成分は、水への溶解度が１ｍｇ／ｍＬ以下の難水溶性薬物である、［２１］～［２５］のいずれか１つ記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２７］前記難水溶性薬物は分子量が５００以上である、［２６］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２８］前記難水溶性薬物は難水溶性ペプチドである、［２６］又は［２７］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［２９］前記難水溶性ペプチドは、アミド結合を構成する窒素原子の少なくとも１つがメチル基を有する、［２８］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［３０］前記難水溶性ペプチドは、環状ペプチド及び長鎖ペプチドから選択される少なくとも一つ以上を含む、［２８］又は［２９］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［３１］前記難水溶性ペプチドは環状ペプチドである、［２８］～［３０］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［３２］１００質量部の前記（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、前記難水溶性薬物の配合量は、２１質量部以上１００質量部未満である、［２６］～［３１］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［３３］前記ヒアルロン酸誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有する、［３１］～［３２］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基である。Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表す。
　Ｘ１は、－ＮＲｂ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｓ－Ｒ、－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び－Ｓ－Ｓ－Ｒ、で表される基からなる群より選択される基である。
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｆのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒは、ステリル基である。
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－である。ここで、Ｙのアルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｇのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンである。
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンである。
　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
［３４］前記ステリル基がコレステリル基である、［３３］に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［３５］前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が３５％以上５０％未満である、［３３］～［３４］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。［３６］前記ヒアルロン酸誘導体医薬組成物に対する前記ヒアルロン酸誘導体の含有量が６ｍｇ／ｍＬ以上４５ｍｇ／ｍＬ未満である、［２１］～［３５］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［３７］前記ヒアルロン酸誘導体医薬組成物に対する有機溶剤の含有量が０．８％未満である、［２１］～［３６］のいずれか１つに記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
［３８］（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤と、（Ｃ１）有効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤とを混合し、可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を得る工程と、前記（Ｃ１）有効成分を前記可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液と混合する混合工程と、を含む、医薬組成物の製造方法。
［３９］（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤と、（Ｃ１）有効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、前記（Ｃ１）有効成分を前記（Ｂ１）可溶化助剤に分散させ、分散液（Ｉ）を得る工程と、ヒアルロン酸誘導体水溶液又は可溶化剤含有ヒアルロン酸水溶液を調製し、水溶液（ＩＩ）を得る工程を含み、前記分散液（Ｉ）と前記水溶液（ＩＩ）とを混合する工程と、を含む、医薬組成物の製造方法。
［４０］（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤と、（Ｃ１）有効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、有機溶剤を除去する工程を含まないことを特徴とする、［３８］又は［３９］に記載の医薬組成物の製造方法。
　上記態様のヒアルロン酸誘導体医薬組成物によれば、生体内で有効成分の濃度をさらに長期間にわたり維持し、徐々に有効成分を放出でき、有効成分を高濃度で可溶化できるヒアルロン酸誘導体医薬組成物及びその製造方法を提供することができる。
　上記態様のヒアルロン酸誘導体医薬組成物によれば、有機溶媒を使用せず、毒性の高い界面活性剤の使用量を低減しつつ、難水溶性有効成分を高濃度で可溶化できるヒアルロン酸誘導体医薬組成物及びその製造方法を提供することができる。
ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムである。 ヒアルロン酸誘導体医薬組成物のクロマトグラムである。 シクロスポリンの血漿中濃度推移を示すグラフである。 シクロスポリンの血漿中濃度推移を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
　以下、本明細書において使用される用語を説明する。
　本明細書において使用される「Ｃ１－２０アルキル」という用語は、炭素数１以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等の「Ｃ１－４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、２－エチルブチル等が含まれる。Ｃ１－２０アルキルには、炭素数が１以上１２以下のＣ１－１２アルキル、炭素数が１以上６以下のＣ１－６アルキル基も含まれる。
　本明細書において使用される「Ｃ１－６アルキルカルボニル」という用語は、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ－プロピルカルボニル、ｉｓｏ－プロピルカルボニル、ｎ－ブチルカルボニル、ｓｅｃ－ブチルカルボニル、ｉｓｏ－ブチルカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル等の「Ｃ１－４アルキルカルボニル」が含まれる。
　本明細書において使用される「アミノＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてアミノ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のアミノＣ２－１２アルキルも含まれる。
　本明細書において使用される「ヒドロキシＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてヒドロキシ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のヒドロキシＣ２－１２アルキルも含まれる。
　本明細書において使用される「Ｃ２－３０アルキレン」という用語は、炭素数２以上３０以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン等を含み、炭素数が２以上２０以下のＣ２－２０アルキレン、炭素数が２以上８以下のＣ２－８アルキレン、基「－（ＣＨ２）ｎ－」（ここで、ｎは２以上３０以下であり、２以上２０以下が好ましく、２以上１５以下がより好ましい。）を含む。
　本明細書において使用される「Ｃ１－５アルキレン」という用語は、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン等を含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－８アルケニレン」とは、炭素数２以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル、オクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイル等を含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体及びそれらの混合物も含まれる。
＜ヒアルロン酸誘導体医薬組成物１＞
　本実施形態は、（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物である。以降において、「（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物」を「医薬組成物１」と略記する場合がある。
　ヒアルロン酸誘導体は、有効成分と製剤化して、医薬組成物として使用することができる。
　本実施形態の医薬組成物１において、ヒアルロン酸誘導体は、有効成分と複合体（以下、「有効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体」と称する場合がある）を形成している。具体的には、ヒアルロン酸誘導体中のステリル基と、有効成分の疎水性部位とが疎水性相互作用により複合体を形成しており、有効成分とステリル基等の疎水性部位が中心部に存在し、一方、ヒアルロン酸誘導体中のヒアルロン酸に由来する部位等の親水性部位が外縁部に存在する、シリンダー構造、又はコア－シェル型様のシリンダー構造を呈しているものと推定される。すなわち、有効成分がヒアルロン酸誘導体に封入又は内包された構造を呈しているものと推定される。
　本実施形態の医薬組成物１において、有効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む構造体の平均粒子径は、２０ｎｍ以上２２０ｎｍ以下とすることができ、２０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下とすることができ、３０ｎｍ以上１００ｎｍ以下とすることができる。平均粒子径が上記数値範囲であることで、滅菌ろ過が可能、且つ、安定して生体内で凝集、沈殿させ、徐放基材としての効果が発揮できる。平均粒子径は、例えば、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）や、ナノトラッキング粒子測定装置、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、及び電子顕微鏡法等によって、測定することができる。より具体的には、例えば、ＤＬＳ装置にてヒアルロン酸誘導体濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｗ／ｖ％スクロースを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈して測定する。
　本実施形態の医薬組成物１が有する（Ｂ）会合促進剤は、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たすことが好ましい。
　本実施形態の医薬組成物１は、（Ｂ）会合促進剤を有する。
　本明細書における（Ｂ）会合促進剤とは、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と相互作用して、ヒアルロン酸誘導体分子同士の会合を促進するものである。本実施形態の会合促進剤はヒアルロン酸誘導体とコンプレックスを形成し、薬物複合化能を高め、生理塩濃度下での沈殿性能を向上させる。これについて、皮下に沈殿した後に、ゲル内の薬物は生体内のアルブミンや他の疎水タンパク等の疎水的な成分と置き換わる交換反応あるいはゲルの分解により徐放されるが、交換反応による薬物徐放を制御し、ゲルの分解酵素の流入を抑制、遮蔽、ステルス性を付与することで徐放期間をコントロールできるものと考えられる。
　次いで、本実施形態の構成成分について以下に詳細を説明する。
≪疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体≫
　本実施形態の医薬組成物１は、（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体を含む。以降において、「（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体」を、「（Ａ）ヒアルロン酸誘導体」と記載する場合がある。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、疎水性基としてステリル基を備える。ステリル基は、ヒアルロン酸に対して直接的に結合していてもよく、リンカーを介して結合されていてもよい。
　ここでいう「リンカー」とは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカーを用いることができるが、本実施形態に用いる（Ａ）ヒアルロン酸誘導体においては、ペプチドリンカーが好ましい。
　ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは２アミノ酸以上であり、特に好ましくは１５アミノ酸である。ペプチドリンカーの長さの上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下である。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に含まれるペプチドリンカーは、全て同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよく、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が、疎水性基としてステリル基を備える場合、ヒアルロン酸誘導体中のステリル基が水中で自己会合し、単分子又は複数分子が会合することでナノサイズのハイドロゲルを形成する。
［ステリル基］
　本明細書において使用される「ステリル基」という用語は、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロン等が挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等が挙げられ、中でも、コレステリル基（特に、コレスタ－５－エン－３β－イル基）が好ましい。
［ステリル基導入率］
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対するステリル基の導入率（以下、単に「ステリル基導入率」と称する場合がある）は０．１％以上５０％未満が好ましく、５％以上４５％未満がより好ましく、１０％以上４０％以下がさらに好ましく、１５％以上３５％以下が特に好ましい。
　ステリル基導入率が上記範囲内であることで、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が難水溶性薬物やタンパク質の疎水部および会合促進剤の疎水部と強固に相互作用が可能になる。また、ステリル基導入率が上記範囲内であることで、医薬組成物１中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体を薬物と複合化させた、ヒアルロン酸誘導体－薬物複合体は、製剤の安定性が向上し、かつ生理塩濃度下で凝集、沈殿して薬物の徐放を可能にする。
　ステリル基導入率は、１Ｈ－ＮＭＲ測定により測定することができる。すなわち、医薬組成物１の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおける（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のステリル基に由来するピークの積分値と、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に含まれるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、を用いて、以下の式に基づいて計算することができる。なお、式中。ｎＨはピークに対応する水素原子の数を表す。具体的には、例えば後述する実施例に記載した方法に従って測定することができる。
　［ステリル基導入率］（％）
＝［（ステリル基に由来するピーク積分値×３／ｎＨ）／（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク積分値）］×１００
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定はされないが、局所投与における拡散遅延由来の徐放機能を向上させる観点からは、分子量の比較的大きい（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が好ましい。一方、最終剤形が溶液製剤の場合はシリンジアビリティの観点から分子量の比較的小さい（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が好ましい。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量は、用途や剤形によって適宜調整すればよい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量の一例としては、１，０００（１ｋ）以上１，０００，０００（１，０００ｋ）以下が好ましく、５ｋ以上３００ｋ以下がより好ましく、５ｋ以上１２０ｋ以下がさらに好ましく、７ｋ以上１００ｋ以下が特に好ましい。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
　ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量が上記下限値以上であることで、粘度の上昇を抑制でき、より高濃度のヒアルロン酸誘導体を医薬組成物１中に溶解させることができる。ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
　より詳細には、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量が粘度の観点で、１００ｋ以下が好ましく、５０ｋ以下がさらに好ましく、４０ｋ以下が特に好ましい。
ヒアルロン酸誘導体の製造という観点では、４ｋから１００ｋが好ましく、６ｋから５０ｋが特に好ましい。
　ヒアルロン酸誘導体がヒアルロン酸としての性質を強く発揮するという観点、例えばＣＤ４４受容体に強く認識されるためには１００ｋＤａ以上が好ましく、２００ｋＤａ以上が特に好ましく、３００ｋＤａ以上が最も好ましい。
　ここでいう、「ヒアルロン酸誘導体の分子量」は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量である。
　好ましいヒアルロン酸誘導体として具体的には、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉ）」と称する場合がある）を１以上有するヒアルロン酸誘導体等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基である。
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表す。
　Ｘ１は、－ＮＲｂ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｓ－Ｒ、－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び－Ｓ－Ｓ－Ｒ、で表される基からなる群より選択される基である。
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。ここでＲａ、Ｒｂ及びＲｃのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｆのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒは、ステリル基である。
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－である。ここで、Ｙのアルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｇのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンである。
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンである。
　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
　ヒアルロン酸誘導体は、下記一般式（Ｉａ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉａ）」と称する場合がある）を、１以上有するヒアルロン酸誘導体を含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基である。Ｘは、－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒで表される疎水性基である。Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択される基である。Ｒは、ステリル基である。Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ｍは、１以上１００以下の整数である。）
　ここで、ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）がそれぞれ２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）以外の位置において、修飾されていてもよく、例えば、ヒドロキシ基は－Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｏ（ホルミル）、－Ｏ（Ｃ１－６アルキルカルボニル）等に変換されていてもよく、カルボキシ基は、アミド又はエステルに変換されていてもよく、塩を形成していてもよい。
［繰り返し単位（Ｉ）］
　一般式（Ｉ）中の基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」は、以下の式：－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＣＯＯ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ；及び
　－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ（ここで、ｍｚは、２以上３０以下の整数であり、Ｒ８は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
で表される基からなる群より選択される基を含む。
　当該基としては、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；及び－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ（ここで、ｍｚ、Ｒ、及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）からなる群より選択される基が好ましい。
（Ｚ）
　一般式（Ｉ）において、Ｚは直接結合であることが好ましい。また、別の態様において、Ｚがペプチドリンカーである場合に、Ｘ１は－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒであることが好ましい。さらに、別の態様において、Ｚは、－ＮＨ－［ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＮＨ］ｎ－１－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯ－で表されるペプチドリンカーであってもよく、ここで、ｎは２以上３０以下の整数であり、Ｚａは、それぞれ独立に、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＯＨとして表されるα－アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシ基に結合し、Ｃ末端にて基－Ｎ（－Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としてはα－アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体等が挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα－アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚａとしては、例えば、－ＣＨ３、Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２ＮＣＯＣＨ２－等が挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２以上３０以下の整数であるが、２以上１０以下が好ましく、２以上４以下がより好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－、－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－等が挙げられる。
（Ｙ）
　一般式（Ｉ）において、Ｙは－（ＣＨ２）ｎ１－及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１－ＣＨ２ＣＨ２－（ここで、ｎ１は、２以上２０以下の整数であり、２以上１５以下の整数が好ましく、２以上１２以下の整数がより好ましく、２以上６以下の整数がさらに好ましい。ｍ１は、１以上４以下の整数である）からなる群より選択される基が好ましい。具体的には、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－、－（ＣＨ２）１２－、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－が好ましい。また、純水中乃至低塩濃度下では高い溶解性を実現させつつ、生理食塩濃度下では高い沈殿形成能を示させるという観点からは、Ｙは－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－及び－（ＣＨ２）１２－からなる群より選択される基が好ましく、－（ＣＨ２）６－がより好ましい。
　Ｙは、例えば、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－等であってもよい。
（Ｙａ）
　Ｙａとしては、－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－ＣＨ２－が好ましい。
（Ｙｂ）
　Ｙｂとしては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル又はオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルが好ましく、－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－がより好ましい。
　基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」の具体例としては、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－ＮＨ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－コレステリル等が挙げられる。好ましい基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」としては、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃが、水素原子であり、Ｙが、直鎖状のＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｙａが、直鎖状のＣ１－５アルキレンであるか、又はＹｂが、直鎖状のＣ２－８アルキレン若しくは直鎖状のＣ２－８アルケニレンである。
［繰り返し単位（Ｉａ）］
　一般式（Ｉａ）において、Ｘは、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）１２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルが好ましく、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルがより好ましい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）に加えて、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（ＩＩ）」と称する場合がある）を更に含むことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、及びＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基である。Ｘａは、ヒドロキシ及び－Ｏ－Ｑ＋からなる群より選択される基である。Ｑ＋は、カウンターカチオンである。）
　ここで、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（ＩＩ）が２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
　別の態様において、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）、繰り返し単位（Ｉａ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であってもよい。
［繰り返し単位（ＩＩ）］
　一般式（ＩＩ）において、Ｑ＋はカルボキシ基と水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシ基と塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等の金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択される）で表されるアンモニウムイオン等が挙げられる。中でも、Ｑ＋は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はテトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ－ブチルアンモニウムイオン等）が好ましい。Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、Ｃ１－６アルキルからなる群より選択される同一の基であることが好ましく、ｎ－ブチル基が好ましい。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４、並びにＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、及びＲ４ａは、全て水素原子であることが好ましい。また、Ｒａ及びＲｂは、いずれも水素原子であることが好ましい。
　中でも、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であることが好ましい。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）である。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されていてもよい。
　医薬品組成物の全量に対する（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の含有量は、１ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ未満が好ましく、３ｍｇ／ｍＬ以上４５ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、５ｍｇ／ｍＬ以上４０ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の製造方法は後述する。
≪（Ｂ）会合促進剤≫
　本発明において、会合促進剤とは、より具体的に、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定することができ、本実施形態において定義する会合促進剤であることは、以下に示す面積Ａ１とＡ２の比Ａ２／Ａ１で確認することができる。
　図１は、ヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムである。図１に示す面積Ａ１の一例は、１８１４である。図２は、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物１のクロマトグラムである。図２に示す面積Ａ２の一例は、２８１３である。
　図２には、本実施形態のヒアルロン酸誘導体のゲル浸透クロマトグラムが記載されている。ここで、測定開始時の屈折率強度をゼロとし、ここから水平に引いた線をベースラインとする。例えば、測定開始前に屈折率強度の増減が±０．５ｍＶの範囲内に収まるよう調整し、屈折率強度が５分間で０．５ｍＶ以下の増減に収まるように調整する。例えば、屈折率強度増加量がノイズ値の５倍相当量を３回上回った最初の点をクロマトグラムの「始点」とし、溶出時間０分とする。
　例えば、屈折率強度が最大極大屈折率強度の１０００分の１になった点をクロマトグラムの「終点」とし、屈折率強度が最大極大屈折率強度の１０００分の１に至らない場合は、「Ｔｌｉｍ」を「終点」とする。「Ｔｌｉｍ」は、２ｋＤａのポリアクリル酸を測定した際の極大屈折率強度を呈する溶出時間とする。
　本装置においては、０．００１６７分おきに屈折率強度を算出している。ここで、各面積値はＧＰＣワークステーションＥｃｏＳＥＣ　Ｅｌｉｔｅ－ＷＳの解析アプリケーションを用いて算出する。
　各面積値を算出する際に、ゲル浸透クロマトグラフィーに使用した展開溶媒などに起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークは除く。
　面積Ａ２と面積Ａ１との比Ａ２／Ａ１が１．２以上であると、ヒアルロン酸誘導体分子同士またはヒアルロン酸誘導体と会合促進剤との会合が促進していることを意味する。なお、ヒアルロン酸誘導体分子同士またはヒアルロン酸誘導体と会合促進剤との会合が促進していない場合には、比Ａ２／Ａ１は０．９５から１．１９の範囲となる。
　比Ａ２／Ａ１は１．２０以上であることが好ましく、１．３０以上であることがより好ましく、１．４０以上であることがさらに好ましく、１．５０以上であることが特に好ましい。面積Ａ２とＡ１の比Ａ２／Ａ１が上記下限値以上であることで、会合が促進されたヒアルロン酸誘導体を比較的多く含むことができ、（Ｃ）有効成分と製剤化した際に、（Ｃ）有効成分を多量に保持することができ、（Ｃ）有効成分を高濃度で可溶化できる。加えて、（Ｂ）会合促進剤が（Ｃ）有効成分の放出を制御し、生体内での薬物の徐放期間を長期に渡って維持することができる。
　一方、Ａ２／Ａ１の上限は、面積Ａ２の比率が面積Ａ１よりも高ければ高いほど好ましい。よって、Ａ２／Ａ１の上限は、特に限定されないが、４．０以下、３．５以下、３．０以下、２．５以下、２．１以下、２．０以下、１．９以下、１．５以下であってもよい。
　（Ｂ）会合促進剤としては、医薬用途で通常使用されうる界面活性剤であれば特に制限されない。
　（Ｂ）会合促進剤は、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす成分が好ましい。
　（Ｂ）会合促進剤は、例えば、ポリソルベート（エーテル構造を５以上備え、炭素数は１０以上である）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエキシエチレンヒマシ油などが挙げられる。
　（Ｂ）会合促進剤としては、例えば、ポリソルベート８０（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は６４以上である）、ポリソルベート６５（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は１００以上である）、ポリソルベート６０（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は６４以上である）、ポリソルベート４０（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は６２以上である）、ポリソルベート２０（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は５７以上である）、ポリエチレングリコールモノラウレート（エーテル構造を７以上備え、炭素数は２８以上である）、ステアリン酸ポリオキシル４０（エーテル構造を３９以上備え、炭素数は９８以上である）、ステアリン酸ポリオキシル４５（エーテル構造を４４以上備え、炭素数は１０８以上である）、ステアリン酸ポリオキシル５５（エーテル構造を５４以上備え、炭素数は１２８以上である）、クレモフォールＥＬ（エーテル構造を３５以上備え、炭素数は１２７以上である）、などが挙げられる。この中でも特に、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０とポリエキシエチレンヒマシ油が好ましい。
　（Ｂ）会合促進剤としては、前記界面活性剤だけに限定されるものではなく、例えばポロキサマー１８８（エーテル構造を９８以上備え、炭素数は２２５以上である）、ポロキサマー１２４（エーテル構造を２６以上備え、炭素数は７４以上である）、ポロキサマー２３７（エーテル構造を９３以上備え、炭素数は２２５以上である）、ポロキサマー３３８（エーテル構造を１７７以上備え、炭素数は４００以上である）、ポロキサマー４０７（エーテル構造を１４７以上備え、炭素数は３５２以上である）、ポリエチレングリコール３００（エーテル構造を５以上備え、炭素数は１２以上である）、ポリエチレングリコール４００（エーテル構造を７以上備え、炭素数は１６以上である）、ポリエチレングリコール４０００（エーテル構造を５９以上備え、炭素数は１２０以上である）、ポリビニルアルコール（平均重合度：５００、エーテル構造を４以上備え、炭素数は４以上である）等があげられる。
　医薬組成物１中における（Ｂ）会合促進剤の添加量としては、１００質量部のヒアルロン酸誘導体に対し、０．００１質量部以上１５０００質量部以下が好ましく、０．０５質量部以上５０００質量部以下がより好ましく、１質量部以上４０００質量部以下がさらに好ましい。
　（Ｂ）会合促進剤が前記界面活性剤の群から選択される少なくとも一つである場合、医薬組成物１中における（Ｂ）会合促進剤の添加量としては、１００質量部ヒアルロン酸誘導体に対し、０．０１質量部以上１５０質量部以下が好ましく、０．０５質量部以上１００質量部以下がより好ましい。
　（Ｂ）会合促進剤が前記界面活性剤以外の群から選択される少なくとも一つである場合、医薬組成物１中における（Ｂ）会合促進剤の添加量としては、１００質量部のヒアルロン酸誘導体に対し、１０質量部以上１５０００質量部以下が好ましく、１００質量部以上１００００質量部以下がより好ましく、１０００質量部以上５０００質量部以下がさらに好ましく、１５００質量部以上４０００質量部以下が特に好ましく、２０００質量部以上３５００質量部以下が最も好ましい。
　（Ｂ）会合促進剤は少ないほどよいが、上記下限値以下であると有効成分が十分に可溶化できない。また上限値を超えると、（Ｂ）可溶化助剤が多すぎることに起因して毒性が高くなりやすく、製剤の粘度も向上するため上記範囲内が好ましい。
　（Ｂ）会合促進剤を溶解する手段としては特に制限はなく、撹拌手段、振とう手段、超音波 処理手段などが挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物１は、（Ｂ）会合促進剤を含むことにより、有効成分を多量に保持することができ、さらに、皮下でゲル化したヒアルロン酸誘導体組成物内への疎水的な生体成分の流入を防ぐことで、有効成分の放出速度を制御し、長期間に渡って有効成分を徐放することができる。なお、上記メカニズムと異なるメカニズムで所望の効果が得られる場合であってもよい。
≪（Ｃ）有効成分≫
　有効成分としては、特に限定されないが、医薬活性ペプチド又はタンパク質、核酸、低分子化合物、中分子化合物、抗原（がん抗原、感染症由来抗原、免疫疾患における自己抗原等）等が挙げられる。中でも、低分子化合物、中分子化合物、ペプチドがより好ましい。
　本実施形態の医薬組成物１の適用疾患は特に限定されず、現時点で公知の疾患、又は将来的に見出される疾患の予防や治療に広く用いることができる。慢性疾患でも急性疾患であっても良い。現時点で公知の疾患の例としては、がん、感染症、免疫疾患、炎症性弛緩、アレルギー疾患、皮膚疾患、高血圧症、糖尿病、神経疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、脳血管疾患、呼吸器疾患、眼疾患、耳疾患、骨関節疾患、疼痛疾患等が挙げられる。
［医薬活性ペプチド又はタンパク質］
　医薬活性ペプチド又はタンパク質としては、対象に治療有効量を投与した場合に、対象の状態又は病状に対して正の、又は有利な効果を有するものを意味する。好ましい医薬活性ペプチド又はタンパク質としては、根治的又は対症的性質を有し、疾患又は障害の１つ又は複数の症状を改善する、軽快させる、軽減する、元に戻す、症状の発症を遅らせる、又は症状の重症度を減ずるために投与することができるものである。医薬活性ペプチド又はタンパク質は予防的性質を有することもあり、疾患の発症を遅らせるか、又はこのような疾患又は病態の重症度を減ずるために使用することができる。「医薬活性ペプチド又はタンパク質」という用語は、全長タンパク質又はポリペプチドを含意し、又その医薬的に活性な断片を指すこともある。この用語は、ペプチド又はタンパク質の医薬的に活性なアナログも包含する。
　医薬活性タンパク質の例としては、以下に限定されないが、免疫活性化合物等のサイトカイン及び免疫系タンパク質（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレチン（ｓｅｌｅｔｉｎ）、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、抗体、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、刺激ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチン等）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様成長因子等）、増殖因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｔｉｃ）酵素又は分解酵素、ステロイド産生（ｓｔｅｒｉｏｄｏｇｅｎｉｃ）酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、チトクロム、アデニル酸シクラーゼ又はグアニル酸（ｇｕａｎｙｌａｓｔｅ）シクラーゼ、ノイラミダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）等）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモン結合タンパク質又は増殖因子結合タンパク質等）、転写因子及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質（例えば、血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン及びミオシン等）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインＣ、フォンヴィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、改変第ＶＩＩＩ因子、抗凝固因子）等が挙げられる。
［核酸］
　核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡが含まれ、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び核酸アプタマー等を含む。
［低分子化合物］
　低分子化合物としては、分子量が約５００未満の化合物であって、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β－ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤等）等が挙げられる。
　有効成分としては、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、エンドセリンＡ受容体阻害剤、膜貫通コンダクタンス制御因子（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（ＣＦＴＲ）調節剤、ＴＲＰＶ１阻害剤、ＮＫ１受容体阻害剤、プリン受容体阻害剤、アンジオテンシン受容体阻害剤、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体、Ｐ２Ｙ受容体阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤等でもよく、これらの阻害作用を２つ同時に有する活性成分でもよい。
　また、有効成分としては、上述したヒアルロン酸誘導体のステリル基との相互作用を十分に発揮できることから、疎水性の高い、すなわち、難水溶性のものも好ましく用いることができる。なお、「難水溶性」とは、第１７改正日本薬局方において、溶質１ｇを溶かすのに必要な水量が３０ｍＬ以上必要であることを指す。
　難水溶性で固体状の有効成分としては、例えば、アセトアミノフェン、イブプロフェン、安息香酸、エテンザミド、カフェイン、カンフル、キニーネ、グルコン酸カルシウム、ジメチルカプロール、スルフアミン、テオフィリン、テオプロミン、リボフラビン、メフェネシン、フェノバービタル、アミノフィリン、チオアセタゾン、クエルセチン、ルチン、サリチル酸、テオフィリンナトリウム塩、ピラピタール、塩酸キニーネ、イルガピリン、ジキトキシン、グリセオフルビン、フェナセチン等の解熱鎮痛薬、神経系医薬、鎮静催眠薬、筋弛緩剤、血圧硬化剤、抗ヒスタミン剤等；アセチルスピラマイシン、アンピシリン、エリスロマイシン、キサタマイシン、クロラムフェニコール、トリアセチルオレアンドマイシン、ナイスタチン、硫酸コリスチン等の抗生物質；メチルテストステロン、メチルアンドロステトロンジオール、プロゲステロン、エストラジオールベンゾエイト、エチニレストラジオール、デオキシコルチコステロン・アセテート、コーチゾンアセテート、ハイドロコーチゾン、ハイドロコーチゾンアセテート、ブレドニゾロン等のステロイドホルモン剤；ジエンストロール、ヘキサストロール、ジエチルスチルベステロール、ジエチルスチルベステロールジブロヒオネイト、クロロトリアニセン等の非ステロイド系卵黄ホルモン剤；その他脂溶性ビタミン類等の、「日本薬局方」、「局外基」、「ＵＳＰ」、「ＮＦ」、「ＥＰ」に記載の医薬品有効成分等が挙げられる。これら有効成分から選ばれる１種を使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　有効成分は、難水溶性の油状又は液状のものであってもよい。難水溶性の油状又は液状の有効成分としては、例えば、テプレノン、インドメタシン・ファルネシル、メナテトレノン、フィトナジオン、ビタミンＡ油、フェニペントール、ビタミンＤ、ビタミンＥ等のビタミン類、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、肝油等の高級不飽和脂肪酸類、補酵素Ｑ類、オレンジ油、レモン油、ペパーミント油等の油溶性香味料等の「日本薬局方」、「局外基」、「ＵＳＰ」、「ＮＦ」、「ＥＰ」に記載の医薬品有効成分等が挙げられる。ビタミンＥには種々の同族体、誘導体があるが、常温で液状であれば特に限定されないが、例えばｄｌ－α－トコフェロール、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、ｄ－α－トコフェロール、酢酸ｄ－α－トコフェロール等が挙げられる。これら有効成分から選ばれる１種を使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　有効成分は、難水溶性の半固形状の有効成分のものでもよい。難水溶性の半固形状の有効成分としては、例えば地竜、カンゾウ、ケイヒ、シャクヤク、ボタンピ、カノコソウ、サンショウ、ショウキョウ、チンピ、マオウ、ナンテンジツ、オウヒ、オンジ、キキョウ、シャゼンシ、シャゼンソウ、石蒜、セネカ、バイモ、ウイキョウ、オウバク、オウレン、ガジュツ、カミツレ、ゲンチアナ、ゴオウ、獣胆、シャジン、ショウキョウ、ソウジュツ、チョウジ、チンピ、ビャクジュツ、チクセツニンジン、ニンジン、葛根湯、桂枝湯、香蘇散、紫胡桂枝湯、小紫胡湯、小青竜湯、麦門冬湯、半夏厚朴湯、麻黄湯等の漢方又は生薬エキス類；カキ肉エキス、プロポリス及びプロポリス抽出物、補酵素Ｑ類等が挙げられる。これら有効成分から選ばれる１種を使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
[中分子化合物]
　本明細書において、「中分子」とは、低分子（分子量約５００までの有機化合物）でも高分子（分子量１万以上のタンパク質など）でもない、分子量約５００～５０００程度のペプチド、マクロライド化合物、核酸及び天然物又はそれらの誘導体をいう。好ましくは、分子量５００～２０００程度のペプチド、すなわち、アミノ酸残基５～２０程度の直鎖状又は環状ペプチドである。ペプチドとしては、環状ペプチドが好ましく、その詳細については後述する。マクロライド化合物とは、大環状ラクトンであり、環の員数が１２又はそれ以上の化合物の総称をいう。
　中分子化合物としては、例えば、ＦＫ５０６やラパマイシンなどが挙げられる。
［抗原］
（がん抗原）
　がん抗原とは、がん細胞に多く発現する抗原であり、いくつかの場合には、がん細胞によってのみ発現する。がん抗原は、がん細胞内、又はがん細胞の表面上に発現し得る。
　本実施形態の医薬組成物１において使用され得る抗原タンパク質は、限定されないが、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＷＴ１、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）－Ｃ０１７－１Ａ／ＧＡ７３３、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ－１、ＣＡＰ－２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ－１、ＰＳＡ－２、ＰＳＡ－３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３－ゼータ鎖、ＣＤ２０、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｘｐ２（ＭＡＧＥ－Ｂ２）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ３（ＭＡＧＥ－Ｂ３）、ＭＡＧＥ－Ｘｐ４（ＭＡＧＥ－Ｂ４）、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｃ４、ＭＡＧＥ－Ｃ５、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７、ＧＡＧＥ－８、ＧＡＧＥ－９、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、ＮＡＧ、ＧｎＴ－Ｖ、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α－フェトプロテイン、Ｅ－カドヘリン、α－カテニン、β－カテニン、γ－カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇイディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ－１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶがコードする核抗原（ＥＢＮＡ）－１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－２（ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０）、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＳＳＸ－５、ＳＣＰ－１、ＣＴ－７、ＣＤ２０、ｃ－ｅｒｂＢ－２等が挙げられる。
　上記抗原タンパク質としては、その配列の全てが使用されてもよく、一部が欠失した配列が使用されてもよい。
　本実施形態の医薬組成物１において使用され得る抗原ペプチドは、抗原タンパクの配列のうち、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ及びＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープからなる群より選ばれる１種以上のエピトープを含む抗原ペプチドである。一実施形態において、抗原提示細胞での分解を経てＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩＩ分子に搭載されるという観点から、上記抗原ペプチドは、好ましくは２つ以上のエピトープを含む抗原ペプチドである。具体的には、上記抗原ペプチドとしては、腫瘍細胞の抗原タンパクのエピトープを含む抗原ペプチドが挙げられる。
　一実施形態において、上記抗原ペプチドは、例えば８～１２０アミノ酸、好ましくは８～８０アミノ酸、より好ましくは１５～８０アミノ酸、さらにより好ましくは１６～８０アミノ酸、さらに好ましくは２３～８０アミノ酸、よりさらに好ましくは２３～６０アミノ酸、特に好ましくは２３～５０アミノ酸を有する。
　一実施形態において、ヘルパーＴ細胞による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化誘導の観点から、上記抗原ペプチドは、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープ及びＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープをそれぞれ１つ以上含む抗原ペプチドである。
　一実施形態において、エピトープを２つ以上含む場合、エピトープ間にアミノ酸リンカーを配置してもよい。該リンカーは、例えば２～１０アミノ酸、好ましくは４～１０アミノ酸、より好ましくは４～８アミノ酸を有する。該リンカーに用いるアミノ酸としては、グリシン（Ｇ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）等が挙げられる。好ましくは、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）である。アミノ酸リンカーの具体例としては、連続した４つのチロシン（Ｙ）からなるリンカー（４Ｙ）、連続した４つのロイシン（Ｌ）からなるリンカー（４Ｌ）、連続した４つのトリプトファン（Ｗ）からなるリンカー（４Ｗ）、連続した６つのグリシン（Ｇ）なるリンカー（６Ｇ）、連続した６つのチロシン（Ｙ）なるリンカー（６Ｙ）、連続した６つのロイシン（Ｌ）なるリンカー（６Ｌ）、連続した６つのトリプトファン（Ｗ）なるリンカー（６Ｗ）、連続した８つのチロシン（Ｙ）なるリンカー（８Ｙ）、連続した６つのロイシン（Ｌ）なるリンカー（８Ｌ）、連続した８つのトリプトファン（Ｗ）なるリンカー（８Ｗ）が挙げられ、好ましくは、６Ｙ、６Ｌ又は６Ｗである。
（感染症由来抗原）
　感染症由来抗原としては、感染性病原体及び感染性病原体由来の抗原であれば特に限定されない。感染性病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、線虫等が挙げられる。感染症病原体由来抗原は抗原タンパク質であっても、抗原ペプチドであってもよい。
　上記感染性病原体から罹る疾患としては特に限定されず、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－ＩＩ、ＣＭＶ、ＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡若しくはワクシニア、伝染性軟属腫等のオルトポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス、エンテロウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス)、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、パポバウイルス（例えば、生殖器疣、尋常性胱贅、足底疣費を引き起こすもの等の乳頭腫ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、肝炎Ｂウイルス）、フラビウイルス（例えば、肝炎Ｃウイルス、デングウイルス）、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ等のレンチウイルス）等のウイルス感染から罹る疾患等のウイルス疾患；エシェリキア属、エンテロバクター、サルモネラ、ブドウ球菌、赤痢菌、リステリア、アエロバクター、ヘリコバクター、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、連鎖球菌、クラミジア、マイコプラズマ、肺炎球菌、ナイセリア、クロストリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、カンピロバクター、ビブリオ、セラチア、プロビデンシア、クロモバクテリウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス、ボルデテラ等の細菌感染から罹る疾患等の細菌疾患；クラミジア、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス髄膜炎をはじめとするがこれに限定されるものではない真菌疾患；マラリア、ニューモシスティスカリニ肺炎、レーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ感染等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物１において使用され得る抗原の構造としては、病原体を構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、例えば、生ワクチン、不活化全粒子、それらの一部、タンパクサブユニット、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。中でも、ヒアルロン酸誘導体との複合化の観点から、タンパクサブユニット、タンパク質、又はペプチドが好ましい。
　なお、ここで、上記インフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、Ｂ及びＣ型に分けられる。上記インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質とからなる。上記ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。また、上記インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。なお、世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものであり、このＡ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種の亜型に区別されている。
　上記感染症由来抗原としては、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス由来抗原が好適に用いられる。なお、上述したＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの亜型としては特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。
　また、インフルエンザウイルス由来抗原としては、上記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、例えば、精製ウイルス粒子が有機溶媒／界面活性剤若しくは他の試薬で不活化されたウイルス全粒子、又は、該ウイルス全粒子の中から不純物を取り除き、ＨＡ及び／若しくはＮＡを精製して作られたウイルスサブユニット等が挙げられる。免疫原性の観点から、ＨＡサブユニット又はウイルス全粒子が好ましい。上記ウイルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。また、不純物が少なく、免疫賦活剤等のアジュバントが必須となるＨＡサブユニット（スプリット）について特に有効である。
　上記インフルエンザウイルス抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物又はインフルエンザの患者から単離されたウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製する方法が挙げられる。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。
（免疫疾患における抗原）
　免疫疾患における抗原としては、免疫疾患の標的タンパク質のエピトープを含むものであれば特に限定されない。免疫疾患としては特に限定されず、例えば、尋常性乾癬、強直性脊椎炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、体軸性脊椎関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、気管支喘息、慢性蕁麻疹、花粉症、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。標的タンパク質としては特に限定されず、ＩＬ－１７Ａ、ＤＰＰ４、Ｓ１００Ａ９、ＰＣＳＫ９、ＩＬ－２３、ＩｇＥ、ＴＮＦα、ＩＬ－１２／２３ｐ４０、ＩＬ－６、α４β７インテグリン、ＩＬ－４／１３、ＩＬ－５、ＢＬｙＳ、ＩＬ－１３等が挙げられる。参考文献１（国際公開第２０１７／１６４４０９号）にはＩＬ－１７Ａ由来のペプチドが記載されている。
　本発明における（Ｃ）有効成分が難水溶性薬物であると、本発明をより効果的に利用できる。
　難水溶性薬物とは、第１７改正日本薬局方における溶解性を示す用語において、極めて溶けやすい、溶けやすい、やや溶けやすい、やや溶けにくい、溶けにくい、極めて溶けにくい、ほとんど溶けないとされているもののうち、やや溶けやすい、やや溶けにくい、溶けにくい、極めて溶けにくい、またはほとんど溶けないに分類される薬物を意味する。
　具体的には、（Ｃ）有効成分は、水への溶解度が１ｍｇ／ｍＬ以下の難水溶性薬物が挙げられる。
　本発明の医薬組成物１は、このような難水溶性薬物であっても、有機溶媒を使用せず、毒性の高い界面活性剤の使用量を低減しつつ、高濃度で可溶化できる。
　（Ｃ）有効成分は、分子量が２００以上が好ましく、３００以上がより好ましく、４００以上がより好ましく、５００以上がより好ましく、６００以上がよりいっそう好ましく、７００以上がよりいっそう好ましく、８００以上がよりいっそう好ましく、９００以上がよりいっそう好ましく、１０００以上が特に好ましく、１１００以上が特に好ましく、１２００以上が最も好ましい。
　（Ｃ）有効成分の分子量は、化合物の分子式から算出される値である。
　（Ｃ）有効成分である難水溶性薬物は、難水溶性ペプチドであることが好ましい。難水溶性ペプチドは酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸を有するものであってよく、塩基性アミノ酸又は中性アミノ酸が好ましい。複合化の際は等電点を考慮して、溶液のｐＨを適宜選択してよい。またアミノ酸は天然アミノ酸又は非天然アミノ酸を含んでいてもよい。
　難水溶性ペプチドは、アミド結合を構成する窒素原子の少なくとも１つがメチル基を有することが好ましい。メチル化による疎水性付与がヒアルロン酸誘導体疎水部との相互作用を高め、より多くの可溶化が期待される。また相互作用が高まり、製剤としての安定性も向上するものと推察される。
　難水溶性ペプチドは、環状ペプチド及び長鎖ペプチド、疎水基修飾ペプチド、膜障害性ペプチド、ペプチド薬物複合体からから選択される少なくとも一つ以上を含むことが好ましい。
　難水溶性ペプチドは環状ペプチドであることが好ましい。環状で剛直な骨格であることはヒアルロン酸疎水部との相互作用を最も高め、ヒアルロン酸誘導体と安定な構造を形成する。
　環状サイズとしては、４から４９個のアミノ酸からなる環状ペプチドが好ましく、６から３０個がより好ましく、８から２５個が最も好ましい。
　分子内に有する環の数は特に限定されるものではないが、１つ以上８つ以下であることが好ましい。
　疎水化ペプチドの例としては、アルキル化したポリペプチドがある。ノボノルディスクファーマ社から販売されている「インスリンデテミル」は、ヒトインスリンＢ鎖２９位のリジンにＣ１４脂肪酸側鎖を結合させ、アルブミンと親和性を示すように設計されたインスリンアナログである。この脂肪酸側鎖が、インスリンデテミル六量体間の自己会合を促すことと、皮下注射部位においてアルブミンと結合することから安定化効果を受け、投与部位からの吸収速度が低下する。本実施形態のヒアルロン酸誘導体医薬組成物１又は後述する医薬組成物２とすることで、生体内でヒアルロン酸誘導体と会合促進剤又は可溶化助剤との複合体の疎水部とペプチドの有する疎水部とが強固に相互作用することで、徐放期間の延長を可能にし得る。
　さらに上記ペプチドを包含したヒアルロン酸誘導体医薬組成物１又は後述する医薬組成物２はヒアルロン酸誘導体が生体内のペプチド分解酵素から効果的に分解を抑制することでより長期の徐放が期待できる。
　本実施形態において、１００質量部の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対する、（Ｃ）有効成分の配合量は、１０質量部以上１００質量部以下が好ましく、１５質量部以上５０質量部以下がより好ましく、２０質量部以上４０質量部以下がさらに好ましい。
　（Ｃ）有効成分、特に限定されるものではないが、難水溶性薬物は、１種単独で配合されてもよく、２種以上が配合されていてもよい。
　本実施形態の医薬組成物１は、難水溶性薬物である（Ｃ）有効成分を製剤化する際に、有機溶剤を使用せずに可溶化することができ、従来の毒性が高い可溶化剤を低減できる。さらに、（Ｂ）可溶化助剤により、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のステリル基同士の疎水性相互作用を促進させることができる。これにより、粉末状の（Ｃ）有効成分を高濃度で可溶化することができるものと推察される。なお、上記メカニズムと異なるメカニズムで所望の効果が得られる場合であってもよい。
　すなわち、本実施形態の医薬組成物１は、有機溶剤不使用組成物、又は粉末状薬物可溶化用組成物ということもできる。
≪その他の添加剤≫
　本実施形態の医薬組成物１は、単独で投与することもでき、或いは、薬理学上許容されうる担体とともに常套手段に従って投与することができる。薬理学上許容されうる担体と併用する場合は、例えば、上記ヒアルロン酸誘導体及び上記有効成分、並びに、必要に応じてアジュバントと、水若しくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））等とを、混合してもよく、生理学的に許容し得る緩衝液、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、凍結乾燥補助剤等を含むこともできる。
　緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ヒスチジン、またはクエン酸等が挙げられる。
　ヒアルロン酸誘導体は薬学的に許容される媒体に任意の濃度で溶解させて使用する。例えば、注射用水、リン酸緩衝液などの緩衝液が好ましい。緩衝剤としては、組成物のｐＨ４～１０の範囲の緩衝能を有する化合物であれば特に制限はない。緩衝剤の例としては、酢酸ナトリウム等の酢酸塩、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムリン酸塩等のリン酸塩、ε－アミノカプロン酸、グルタミン酸ナトリウム等のアミノ酸塩、ホウ酸及びその塩、並びにこれらの混合物が挙げられる。中でも注射用水、リン酸緩衝液、スクロース含有注射用水、スクロース含有リン酸緩衝液、グリセロールが特に好ましい。
　本実施形態の医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２にはｐＨ調整剤を含んでいてもよく、ｐＨ調整剤としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、酒石酸、水酸化ナトリウム水酸化カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。
必要に応じて有機酸または無機酸などの酸を配合することもできる。
また、これらのｐＨ調整剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
本実施形態の医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２のｐＨは医薬として許容される範囲内であれば特に制限されるものでないが、例えば、４．０～９．０、好ましくは４．０～８．８、より好ましくは６．５～８．８の範囲である。
　本実施形態の医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２の防腐剤としては、例えば、ベンザルコニウム塩化物、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ソルビン酸、アルキルポリアミノエチルグリシン等が挙げられる。
必要に応じて１または２種以上の防腐剤をさらに配合することができ、医薬として許容されるものであれば特に制限されるものでない。
本発明における防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、パラオキシ安息香酸エチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、ｍ‐クレゾール、フェノール、フェネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、チメロサールなどが用いられる。
　本実施形態の医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２には必要に応じて１または２種以上の粘稠化剤をさらに配合することができ、医薬として許容されるものであれば特に制限されるものでない。
　本発明における医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２の粘稠化剤としては、例えば、セルロース系高分子（メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、ビニル系高分子（ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなど）、糖類（ヒアルロン酸、その塩類などのムコ多糖類、ジェランガム、アルギン酸ナトリウム、デキストラン、シクロデキストリンなどの多糖類）、オキシアルキレン系高分子（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）などが挙げられる。本発明における粘稠化剤の分子量は、例えば、数平均分子量０．５×１０4～１００×１０4程度の範囲から選択できる。
　安定化剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム水和物、ポリビニルピロリドン（ポビドン）等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２にはキレート化剤を含んでいてもよく、キレート化剤としては、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、ジエチレンアミン五酢酸、及びこれらの混合物等が挙げられ、薬物、又は製剤の安定化に用いられる。
　等張化剤としては、スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、マンニトール、カルシウム又はマグネシウム化合物、例えばＣａＣｌ２なども挙げられる。
　特許４７５８８９３号公報によれば、実質的に等浸透圧にする濃度（２～２．５％（ｖ／ｖ））のグリセロールを配合することにより、抗菌防腐の効力を向上させることが記載されている。そのため等張化剤としての機能だけでなく、抗菌防腐の効果も期待される。グリセロールの含有量は、例えば、０．０１～１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５～５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１～３．０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．３～３．０％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．３～２．５％（ｗ／ｖ）である。
　本実施形態の医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２には必要に応じて塩基を配合することができる。医薬として許容される塩基であれば特に制限されるものでないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタモール、メグルミンなどを挙げることができる。
　本実施形態の医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２には必要に応じて無機塩を配合することができる。医薬として許容される塩基であれば特に制限されるものでないが、例えば、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、などを挙げることができる。
　本実施形態の医薬組成物１又は後述する医薬品組成物２としては、製剤化したものを用いてもよい。製剤の形態としては、固体、半固体又は液体の形態とすることができる。
　固体の場合、粉末、顆粒、丸剤、ペレット、タブレット、カプセル等の形態が挙げられる。中でも、固体としては、凍結乾燥粉末であることが好ましい。
　半固体の場合、ゲル等の形態が挙げられる。
　液体の場合、粉末を水又はリン酸緩衝液（ＰＢ）あるいはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液により希釈又は懸濁した懸濁液等の形態が挙げられる。
［医薬品組成物の物性］
　本実施形態の医薬品組成物は、生理塩濃度下で沈殿物が生じるものが好ましい。
　具体的には、下記の試験条件において、ｖｉｔｒｏにおける沈殿率が２０％、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９２％以上である医薬品組成物であることが好ましい。
（試験条件）
・沈殿サンプルの調製
　マイクロチューブ（１．５ｍＬ）に濃縮緩衝液（４０ｍＭ　ＰＢ、６００ｍＭ　ＮａＣｌ水溶液）を２００μＬ入れ、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる製剤を６００μＬ投入する。その後、ｖｏｌｔｅｘで３０秒混合し、３７℃、２０ｍｉｎインキュベートした後に、遠心分離機（２０００Ｇ、５ｍｉｎ）で沈殿物を沈降させる。続いて、上澄み中のヒアルロン酸誘導体をＧＰＣ測定に供する。
・ブランクサンプルの調製
　マイクロチューブ（１．５ｍＬ）に注射用水を２００μＬ入れ、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる製剤（ヒアルロン酸誘導体の理論濃度Ｘｍｇ／ｍＬとする。Ｘ＞１．３３）を６００μＬ投入する。その後、ｖｏｌｔｅｘで３０秒混合し、３７℃、２０ｍｉｎインキュベートした後に、遠心分離機（２０００Ｇ、５ｍｉｎ）に供する。続いて、上澄み中のヒアルロン酸誘導体が１ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水で希釈してＧＰＣ測定に供する。
・ＧＰＣ測定条件
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ
　温度：３０℃
・沈殿の確認
　本明細書においては、下式で表される沈殿率が２０％以上を満たすヒアルロン酸誘導体医薬組成物を生理塩濃度下で沈殿が生じると評価する。
沈殿率（％）＝{１－（沈殿サンプルのヒアルロン酸誘導体の面積値）÷（（ブランクサンプルのヒアルロン酸誘導体の面積値）×（０．７５Ｘ））}×１００
　上記試験において、沈殿サンプルの調製時に、遠心分離条件や、インキュベート時間を任意に設定してもよい。例えば、３７℃、２週間静置して上記条件に供した際に沈殿率が２０％以上満たすものも生理塩濃度下で沈殿物が生じると判断する。
　本実施形態の医薬品組成物１又は後述する医薬品組成物２は、２０℃下の環境にて、目視で析出物が観察されないものであることが好ましい。
　析出物が確認される場合、日本薬局方で定められる注射剤の不溶性微粒子試験法、第１法「光遮断粒子計数法」で用いられる、光遮蔽型自動微粒子測定装置（液中パーティクルカウンタ「ＫＬ－０５」）で検出できる。非晶質薬物が完全に溶解した過飽和溶液からはマイクロメートルオーダーサイズの薬物結晶が析出することがある。析出物がない場合、前記光遮蔽型自動微粒子測定装置では粒子は観測されない。
　その他、ＤＬＳ装置を用いて、１μｍ以上の粒子が存在するか検証することで判断することもできる。
　本実施形態の医薬品組成物１又は後述する医薬品組成物２は、ろ過滅菌可能であることが好ましい。
　ろ過滅菌可能であることは、以下のシリンジフィルターを用いた通液評価で測定することができ、
　具体的には、孔径が０．４５μｍあるいは０．２２μｍの滅菌ろ過フィルターを通液可能か評価する。より具体的には、ろ過膜に１３ｍｍΦの孔径が０．４５μｍ、ポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）製、および３ｍＬの滅菌シリンジフィルターを用いたときに、２ｍＬのヒアルロン酸誘導体組成物のろ過膜を通過したヒアルロン酸誘導体が５０％以上、好ましくは６０％、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上通液可能なものである。
＜ヒアルロン酸誘導体医薬組成物２＞
　本実施形態は、（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤と、（Ｃ１）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物である。以降において、「（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤と、（Ｃ１）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物」を「医薬組成物２」と略記する場合がある。
　本実施形態の医薬組成物２において、有効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む球状構造体の平均粒子径は、２０ｎｍ以上２２０ｎｍ以下とすることができ、２０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下とすることができ、３０ｎｍ以上１００ｎｍ以下とすることができる。平均粒子径が上記数値範囲であることで、生体内で安定した構造で存在することができ、且つ、リンパ節をより容易に通過することができる。平均粒子径は、例えば、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｌｉｇｈｔ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）や、ナノトラッキング粒子測定装置、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、及び電子顕微鏡法等によって、測定することができる。より具体的には、例えば、ＤＬＳ装置にてヒアルロン酸誘導体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるよう１０ｍＭリン酸緩衝液あるいは１０ｗ／ｖ％スクロースを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈して測定する。
　本実施形態の医薬組成物２が有する（Ｂ１）可溶化助剤は、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす。
　本実施形態の医薬組成物２は、１００質量部の（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、（Ｂ１）可溶化助剤の含有量が０．０００１質量部以上１５０００質量部以下である。
　本実施形態の医薬組成物２は、特定の可溶化助剤を特定量配合する。
　上記の（Ｂ１）可溶化助剤を含む本実施形態の医薬組成物は、エーテル構造による適度な極性とアルキル骨格による適度な疎水性によって、上記（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と相互作用することができ、上記（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体中の疎水性基同士の相互作用を促進できる。これにより、難水溶性有効成分を高濃度で可溶化できる医薬組成物を提供できる。
　上記（Ｂ１）可溶化助剤の含有量が上記下限値以上であると、医薬組成物中に有効成分を十分に可溶化できる。
　上記（Ｂ１）可溶化助剤の含有量が上記上限値以下であると、医薬組成物の粘度が高くなりすぎず、かつ生体に影響がない範囲で医薬組成物中に有効成分を十分に可溶化できる。
≪（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体≫
　医薬組成物２が含む（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に関する説明は、上記医薬組成物１が含む（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に関する説明と概ね同様である。
［ステリル基導入率］
　（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体に対するステリル基の導入率は０．１％以上５０％未満が好ましく、５％以上４８％未満がより好ましく、３５％以上４７％以下がさらに好ましく、３７％以上４５％以下が特に好ましい。
　ステリル基導入率が上記範囲内であることで、（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体が難水溶性薬物および界面活性剤の疎水部と強固に相互作用が可能になる。また、ステリル基導入率が上記範囲内であることで、医薬組成物２中の（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体を薬物と複合化させた、ヒアルロン酸誘導体－薬物複合体は、製剤の安定性が向上しうる。
　（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体の分子量の一例としては、１，０００（１ｋ）以上１，０００，０００（１，０００ｋ）以下が好ましく、５ｋ以上３００ｋ以下がより好ましく、５ｋ以上１２０ｋ以下がさらに好ましく、７ｋ以上１００ｋ以下が特に好ましい。（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体の分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
　ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量が上記下限値以上であることで、分子の絡み合いをより高め、血中での滞留性をより高めることができる。一方、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量が上記上限値以下であることで、粘度の上昇を抑制でき、より高濃度のヒアルロン酸誘導体を医薬組成物中に溶解させることができる。ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
　より詳細には、ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量が粘度や分散性の観点で、１００ｋ以下が好ましく、５０ｋ以下がさらに好ましく、２０ｋ以下が特に好ましく、１５ｋ以下が最も好ましい。分子量の単位はＤａである。
　ヒアルロン酸誘導体の製造という観点では、４ｋから２０ｋが好ましく、６ｋから１６ｋが特に好ましく、８ｋから１２ｋが最も好ましい。
　ヒアルロン酸誘導体がヒアルロン酸としての性質を強く発揮するという観点、例えばＣＤ４４受容体に強く認識されるためには１００ｋ以上が好ましく、２００ｋ以上が特に好ましく、３００ｋ以上が最も好ましい。
　医薬品組成物２の全量に対する（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体の含有量は、６ｍｇ／ｍＬ以上６５ｍｇ／ｍＬ未満が好ましく、８ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましい。
≪（Ｂ１）可溶化助剤≫
　本発明において、「可溶化」とは、後述する（Ｃ１）有効成分を、目視で透明になるまで水に溶解可能にすることをいう。
　「可溶化助剤」とは、（Ｃ１）有効成分と（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体と共に水に加えた場合に（Ｃ）有効成分の溶解度を上昇させる効果を有する剤を言う。
　（Ｂ１）可溶化助剤としては、（Ｃ１）有効成分を水相に溶解させる作用（可溶化）を有するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。本発明に用いる（Ｂ１）可溶化助剤は、医薬用途で通常使用されうる剤であって、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす剤である。
　（Ｂ１）可溶化助剤は、非イオン界面活性剤、分子量１９０ｇ／ｍｏＬ以上４０００ｇ／ｍｏＬ以下のポリエチレングリコール、シクロデキストリン誘導体、から成る群から選択される１種以上であることが好ましい。
　（Ｂ１）可溶化助剤としては、例えば、ポリソルベート、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエキシエチレンヒマシ油などが挙げられる。
　（Ｂ１）可溶化助剤としては、ポリソルベート８０（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は６４以上である）、ポリソルベート６５（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は１００以上である）、ポリソルベート６０（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は６４以上である）、ポリソルベート４０（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は６２以上である）、ポリソルベート２０（エーテル構造を２０以上備え、炭素数は５７以上である）、ポロキサマー（エーテル構造を２８以上備え、炭素数は７４以上である）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エーテル構造を３５以上備え、炭素数は５７以上である）、シクロデキストリン誘導体（エーテル構造を１２以上備え、炭素数は３６以上である）、ポリエチレングリコール３００（エーテル構造を５以上備え、炭素数は１２以上である）、ポリエチレングリコール４００（エーテル構造を７以上備え、炭素数は１６以上である）、ポリエチレングリコール４０００（エーテル構造を５９以上備え、炭素数は１２０以上である）、並びにトコフェリルポリエチレングリコールスクシネート（エーテル構造を２１以上備え、炭素数は３５以上である）から成る群から選択される１種以上が好ましい。
　上記以外には例えば、ポリエチレングリコールモノラウレート（エーテル構造を７以上備え、炭素数は２８以上である）、ステアリン酸ポリオキシル４０（エーテル構造を３９以上備え、炭素数は９８以上である）、ステアリン酸ポリオキシル４５（エーテル構造を４４以上備え、炭素数は１０８以上である）、ステアリン酸ポリオキシル５５（エーテル構造を５４以上備え、炭素数は１２８以上である）、クレモフォールＥＬ（エーテル構造を３５以上備え、炭素数は１２７以上である）、などが挙げられる。
　（Ｂ１）可溶化助剤としては、例えばポロキサマー１８８（エーテル構造を９８以上備え、炭素数は２２５以上である）、ポロキサマー１２４（エーテル構造を２６以上備え、炭素数は７４以上である）、ポロキサマー２３７（エーテル構造を９３以上備え、炭素数は２２５以上である）、ポロキサマー３３８（エーテル構造を１７７以上備え、炭素数は４００以上である）、ポロキサマー４０７（エーテル構造を１４７以上備え、炭素数は３５２以上である）、ポリエチレングリコール３００（エーテル構造を５以上備え、炭素数は１２以上である）、ポリエチレングリコール４００（エーテル構造を７以上備え、炭素数は１６以上である）、ポリエチレングリコール４０００（エーテル構造を５９以上備え、炭素数は１２０以上である）、ポリビニルアルコール（平均重合度：５００、エーテル構造を４以上備え、炭素数は４以上である）等があげられる。
　１００質量部の前記（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体に対する、前記（Ｂ１）可溶化助剤の含有量が０．０００１質量部以上１５０００質量部以下であり、０．０１質量部以上１５０質量部以下が好ましく、０．０５質量部以上１００質量部以下がより好ましく、１質量部以上５０質量部以下がさらに好ましく、５質量部以上３０質量部以下が特に好ましく、１０質量部以上２０質量部以下が最も好ましい。
　（Ｂ１）可溶化助剤が非イオン界面活性剤である場合には、１００質量部の（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体に対する、非イオン界面活性剤の含有量は０．０００１質量部以上１５０質量部以下が好ましく、０．００１質量部以上１００質量部以下がより好ましく、０．００５質量部以上５０質量部以下がさらに好ましい。
　（Ｂ１）可溶化助剤が分子量１９０ｇ／ｍｏＬ以上４０００ｇ／ｍｏＬ以下のポリエチレングリコールである場合には、１００質量部の（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体に対する、ポリエチレングリコールの含有量が２５質量部以上１５０００質量部以下が好ましく、２５０質量部以上１００００質量部以下がより好ましく、５００質量部以上５０００質量部以下がさらに好ましい。
　（Ｂ１）可溶化助剤は少ないほどよいが、上記下限値以下であると有効成分が十分に可溶化できない。また上限値を超えると、（Ｂ１）可溶化助剤が多すぎることに起因して毒性が高くなりやすく、製剤の粘度も向上するため上記範囲内が好ましい。
　（Ｂ１）可溶化助剤を溶解する手段としては特に制限はなく、撹拌手段、振とう手段、超音波処理手段などが挙げられる。
≪（Ｃ１）有効成分≫
　医薬組成物２が含む（Ｃ１）有効成分に関する説明は、上記医薬組成物１が含む（Ｃ）有効成分に関する説明と概ね同様である。
　医薬組成物２は、１００質量部の（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体に対する、（Ｃ１）有効成分である難水溶性薬物の配合量は、２１質量部以上１００質量部未満が好ましく、２２質量部以上７０質量部以下がより好ましく、２３質量部以上５０質量部以下がさらに好ましい。
　（Ｃ１）有効成分、特に限定されるものではないが、難水溶性薬物は、１種単独で配合されてもよく、２種以上が配合されていてもよい。
　本実施形態の医薬組成物２は、難水溶性薬物である（Ｃ１）有効成分を製剤化する際に、有機溶剤を使用せずに可溶化することができ、従来の毒性が高い可溶化剤の使用量を低減できる。
　さらに、（Ｂ１）可溶化助剤を含有することにより、（Ａ１）ヒアルロン酸誘導体のステリル基同士の疎水性相互作用を促進させることができる。これにより、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物が有する疎水部領域が拡大し、疎水的な薬物の担持量が増加すると考えられる。また、ヒアルロン酸ポリマーに化学結合で束縛されている疎水部に加え、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の内部で可溶化助剤が移動度の高い疎水部領域として働くことができるため、粉末状の（Ｃ１）有効成分を高濃度で可溶化することができると推察される。なお、上記メカニズムと異なるメカニズムで所望の効果が得られる場合であってもよい。
　すなわち、本実施形態の医薬組成物２は、有機溶剤不使用組成物、又は粉末状薬物可溶化用組成物ということもできる。
　医薬組成物２に対する有機溶剤の含有量は、０．８％未満であることが好ましい。
　ここで、医薬組成物２が含む有機溶剤は、医薬品残溶剤ガイドラインで規定されるクラス１～３に該当する溶剤である。
　具体的には、クラス１の有機溶媒として、ベンゼン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、１，１－ジクロロエテン、１，１，１－トリクロロエタンが挙げられる。
　クラス２の有機溶媒として、アセトニトリル、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、１，２－ジクロロエテン、ジクロロメタン、１，２－ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、１，４－ジオキサン、２－エトキシエタノール、ホルムアミド、ヘキサン、メタノール、２－メトキシエタノール、メチルブチルケトン、メチルシクロヘキサン、Ｎ－メチルピロリドン、ニトロメタン、ピリジン、スルホラン、テトラリン、トルエン、１，１，２－トリクロロエテン、キシレンが挙げられる。
　クラス３の有機溶媒として、酢酸、アセトン、アニソール、１－ブタノール、２－ブタノール、酢酸ｎ－ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３－メチル－１－ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２－メチル－１－プロパノール、ペンタン、１－ペンタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、酢酸プロピル、テトラヒドロフランが挙げられる。
　上記クラス１～３の有機溶媒は、医薬組成物２に含まれないことが好ましいが、ヒアルロン酸誘導体の製造工程において不可避的に残存する成分である。クラス１～３の有機溶媒であっても、医薬組成物２に対する有機溶剤の含有量が０．８％未満であれば、安全に使用できる範囲である。
≪その他の添加剤≫
　本実施形態の医薬組成物２は、単独で投与することもでき、或いは、薬理学上許容されうる担体とともに常套手段に従って投与することができる。薬理学上許容されうる担体と併用する場合は、例えば、上記ヒアルロン酸誘導体及び上記有効成分、並びに、必要に応じてアジュバントと、水若しくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））等とを、混合してもよく、生理学的に許容し得る緩衝液、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、凍結乾燥補助剤等を含むこともできる。添加剤に関する説明は、上記医薬品組成物１における≪その他の添加剤≫に関する説明と同様である。
≪ヒアルロン酸誘導体の製造方法≫
　ヒアルロン酸誘導体は、例えば、グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換し、ステリル基を導入することで得られる。また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体に対して、反応させるステリル基を有する化合物の配合量を調整することで、ステリル基導入率を制御することができる。
　グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換して、ステリル基を導入する方法として具体的には、例えば、原料のヒアルロン酸又はその誘導体、好ましくは、繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されるヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と、式：「ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－Ｒ、ＮＨＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｓ－Ｒ、又は－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、Ｚ及びＲは本明細書で既に定義したとおりである）」で表されるステリル基（特に、コレステリル基）を導入したアミンと、を反応させる方法が挙げられる。
　上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が挙げられる。
　特に、限定はされないが、ＤＭＴ－ＭＭは水及び有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ－ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシ基が共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノ基とカルボキシ基によるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシ基と反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシ基とヒドロキシ基とが、分子内又は分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
　ステリル基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、多価アルコール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。多価アルコールとしては、２価のアルコールであってもよく、３価のアルコールであってもよい。２価のアルコールとしては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、１，４－ブタンジオール、１，６－ヘキサンジオール等が挙げられる。３価のアルコールとしては、例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等が挙げられる。
　或いは、原料のヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシ基から誘導される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯＲ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯ－Ｈａｌ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＣＨ（ＣＨ３）＝ＣＨ２　＋　 ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＯＨ　＋　ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、及びＺは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素からなる群より選択されるハロゲン原子を表す）。
　反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体又は反応物がカルボキシ基を有する場合は、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
　また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基に、２－アミノエチル２－ピリジルジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法が挙げられる。
　さらに、ヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基にスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法も挙げられる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに－Ｓ－Ｓ－が挿入されている場合は、ヒアルロン酸のカルボキシ基に、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法も挙げられる。このとき、一方のメルカプト基を２－メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプト基と置換させることもできる。
　また、ヒアルロン酸誘導体を調製後、さらに他の置換基を導入してもよい。例えば、繰り返し単位（Ｉ）、及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシ基の０．１％以上９９．５％以下、好ましくは４０％以上６５％以下を、－ＣＯ－Ｘｚ、［ここで、Ｘｚは、以下の基：－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；－ＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）４－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）－ＳＨ；－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；及び－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２－ＳＨ（ここで、Ｒ１７は、水素原子又はＣ１－６アルキル基であり、ｐ１は２以上１０以下の整数、ｑは１以上２００以下の整数、ｒは１以上３以下の整数を、それぞれ表す）からなる群より選択される］に変換することで、分子内或いは他分子を含めた分子間で化学的に架橋させてゲル化することもできる。
　得られたヒアルロン酸誘導体は、乾燥させてもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。中でも、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥を行う場合に、ヒアルロン酸誘導体は、該ヒアルロン酸誘導体が形成する微粒子の粒径の増大をより効果的に抑制する観点から、凍結保護剤を更に含むことが好ましい。
　凍結保護剤は、「凍結保護剤」又は「凍結乾燥保護剤」として知られているものであれば特に限定されず、例えば、二糖類、ソルビトール、デキストラン、プロピレングリコール、グリセリン、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
　二糖類としては特に限定されず、例えば、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、イソトレハロース、ネオトレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、ゲンチオビウロース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ネオラクトース、ガラクトスクロース、シラビオース、ネオヘスペリドース、ルチノース、ルチヌロース、ビシアノース、キシロビオース、プリメベロース等が挙げられる。中でも、凍結保護剤として広く使用されていることから、スクロース、トレハロース、マルトース、又はラクトースが好ましい。また、医薬品添加物としての使用実績や、凍結乾燥時におけるヒアルロン酸誘導体が形成する微粒子の粒径の増大をより効果的に抑制する観点から、スクロースがより好ましい。
　凍結保護剤は、固体の状態で添加してもよく、水等の溶媒に溶解した状態で添加してもよい。
　凍結保護剤の添加量は特に限定されないが、ヒアルロン酸誘導体１００質量部に対して、２０質量部以上が好ましい。凍結保護剤の添加量が上記下限値以上であることで、より十分な粒径増大抑制効果が得られる。一方、凍結保護剤の添加量の上限は特に限定されないが、例えば、１００，０００質量部とすることができる。
　凍結乾燥において使用する装置も特に限定されず、例えば、市販の凍結乾燥機を用いることができる。中でも、真空度を制御する観点からは、凍結乾燥中に装置内の真空度をモニタリングできる凍結乾燥機が好ましく、また、品温を制御する観点からは、棚式凍結乾燥機が好ましい。
＜医薬組成物１の製造方法＞
　本実施形態の医薬組成物１は、以下の医薬組成物１の製造方法１又は製造方法２により製造できる。
　以下、各製造方法について説明する。
≪医薬組成物１の製造方法１≫
　製造方法１は、（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含有する、医薬組成物１の製造方法である。
　製造方法１は、（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤とを混合し、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を得る工程と、（Ｃ）有効成分を会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液と混合する混合工程と、を含む。
≪医薬組成物１の製造方法２≫
　製造方法２は、（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含有する、医薬組成物１の製造方法である。
　製造方法２は、（Ｃ）有効成分を（Ｂ）会合促進剤に分散させ、分散液（Ｉ）を得る工程と、ヒアルロン酸誘導体水溶液又は会合促進剤含有ヒアルロン酸水溶液を調製し、水溶液（ＩＩ）を得る工程を含み、前記分散液（Ｉ）と前記水溶液（ＩＩ）とを混合する工程と、を含む。
製造方法１及び２において、薬物の構造によっては、適切なｐＨや緩衝材を適宜用いて製造しても構わない。
　製造方法１及び製造方法２において、有機溶剤を除去する工程を含まないことが好ましい。
＜医薬組成物２の製造方法＞
　本実施形態の医薬組成物２は、以下の医薬組成物２の製造方法１又は製造方法２により製造できる。
　以下、各製造方法について説明する。
≪医薬品組成物２の製造方法１≫
　医薬品組成物２の製造方法１は、（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤と、（Ｃ１）有効成分と、を含有する、医薬組成物２の製造方法である。
　医薬品組成物２の製造方法１は、（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤とを混合し、可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を得る工程と、（Ｃ１）有効成分を可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液と混合する混合工程と、を含む。
≪医薬品組成物２の製造方法２≫
　医薬品組成物２の製造方法２は、（Ａ１）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ１）可溶化助剤と、（Ｃ１）有効成分と、を含有する、医薬組成物２の製造方法である。
　医薬品組成物２の製造方法２は、（Ｃ１）有効成分を（Ｂ１）可溶化助剤に分散させ、分散液（Ｉ）を得る工程と、ヒアルロン酸誘導体水溶液又は可溶化剤含有ヒアルロン酸水溶液を調製し、水溶液（ＩＩ）を得る工程を含み、前記分散液（Ｉ）と前記水溶液（ＩＩ）とを混合する工程と、を含む。
　医薬品組成物２の製造方法１及び製造方法２において、有機溶剤を除去する工程を含まないことが好ましい。
＜投与方法＞
　本実施形態の医薬組成物１又は医薬品組成物２を投与する対象は、ヒトを含む哺乳類に分類される動物（サル、マーモセット、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等）が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物１又は医薬品組成物２の投与経路は特に限定されず、目的とする用途や治療する組織の位置等により、現時点で公知の投与経路に適宜使用できる。
　例えば投与経路は、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、髄腔内投与、脳内投与、関節腔内投与、腹腔内投与、膣内投与、嚢内投与、直腸内投与、硝子体内投与、眼周囲投与、皮内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経気管支投与、経肺投与、経皮投与、舌下投与、経口投与、口腔投与、点眼投与が挙げられる。なかでも皮下投与、筋肉内投与、硝子体内投与、髄腔内投与、関節腔内投与が好ましい。
　また、局所投与として散剤、クリーム、軟膏、または点眼薬としてもよい。
　注射による投与としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、動脈内注射、髄腔内注射、関節腔内注射、腹腔内注射、硝子体内注射、眼周囲注射、皮内注射腫瘍内注射等が挙げられる。
　点眼においては、ヒアルロン酸誘導体を用いることで、薬物の初期バースト低減、製剤保管中及び投与後の薬物同士で生じうる凝集抑制、薬効ばらつき低減、生理条件下で沈殿し角膜上皮に接着、滞留しうることで薬物をより長期間徐放し、点眼回数を低減することができる。さらに薬物の角膜上皮細胞取り込み促進、結膜上皮細胞取り込み促進等も考えられる。また、ヒアルロン酸由来の高い保湿性、粘性、生体適合性を有し、製剤接触時の炎症、痛み、ストレス、ダメージ等を緩和でき、安全性の高い製剤を提供できる。以上により、効率的に薬物の効果を引き出すことで、涙液層安定化効果、角膜上皮障害治療効果、マイボーム腺機能不全治療効果、疼痛抑制効果に優れるヒアルロン酸誘導体医薬組成物１又は医薬品組成物２を提供する。
　本実施形態の医薬組成物１又は医薬品組成物２において、非経口的に投与する場合、その投与量は、投与対象の種類（年齢や性別等も含む）等を考慮して適宜選択することができるが、一般的に例えばヒト（体重６０ｋｇとして）においては、１回あたり、有効成分（好ましくは、タンパク質、ペプチド、低分子化合物）の量として、０．０１μｇ以上２０ｍｇ以下とすることができ、０．１μｇ以上１５ｍｇ以下とすることができ、１μｇ以上１０ｍｇ以下とすることができる。
　投与回数は、上述した投与量の単回投与であってもよく、上述した投与量を、1日、２日、４日、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、又は半年毎に１回等、２回以上の複数回投与であってもよい。或いは、１回の投与において２カ所以上投与してもよい。
≪その他実施形態≫
　一実施形態において、本発明は、上記医薬組成物１又は医薬品組成物２の有効量を、患者又は患畜に投与することを含む、がん、感染症及び免疫疾患、慢性疾患、からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防又は治療方法を提供する。
　なお、感染症としては、上記「抗原」の「感染症由来抗原」において例示されたものが挙げられる。
　また、ここでいう「有効量」とは、予防又は治療に有効な量、すなわち、上記疾患の発症予防又は治療に適する量が包含される。
　一実施形態において、本発明は、がん、感染症、免疫疾患、炎症性弛緩、アレルギー疾患、皮膚疾患、高血圧症、糖尿病、神経疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、脳血管疾患、呼吸器疾患、眼疾患、耳疾患、骨関節疾患からなる群より選ばれる１種以上の疾患の予防又は治療のための組成物であって、上記有効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体を含む、組成物を提供する。
　一実施形態において、本発明は、医薬組成物１又は医薬品組成物２を製造するための、上記有効成分－ヒアルロン酸誘導体複合体の使用を提供する。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を実施例に制限することを意図したものではない。
＜ヒアルロン酸誘導体の合成＞
［合成例１］
　ヒアルロン酸誘導体を次の工程１－Ａ、工程２－Ａ、工程３－Ａに従って調製した。
［工程１－Ａ］
（コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成）
　コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）を次に示す工程１－１－Ａ、続いて工程１－２－Ａに従って合成した。
［工程１－１－Ａ］
　コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温（２５℃程度）まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４）で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
［工程１－２－Ａ］
　得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温（２５℃程度）で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）１．２ｇを得た。
［工程２－Ａ］
（ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の調製）
　ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を次に示す工程２－１－Ａ、続いて工程２－２－Ａに従って調製した。
［工程２－１－Ａ］
　ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０質量％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間撹拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
［工程２－２－Ａ］
　分子量３５，０００（３５ｋＤａ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。［工程２－１－Ａ］でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。
［工程３－Ａ］
　上記［工程２－２－Ａ］で調製したＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、上記［工程１－Ａ］で合成したＨＡ－ＴＢＡ中に存在する二糖繰り返し単位（ＨＡユニット）に対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量がモル比で１９／１００となる割合で添加した。次に、ＨＡユニットに対する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）の添加量がモル比で２４／１００となる割合で加え、室温（２５℃程度）で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：３，５００）した。得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。
　生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認され、コレステロール導入率は１９％であった。
［合成例２］
　ヒアルロン酸誘導体を次の工程１－Ｂ、工程２－Ｂ、工程３－Ｂに従って調製した。
［工程１－Ｂ］
（コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成）
　コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）を次に示す工程１－１－Ｂ、続いて工程１－２－Ｂに従って合成した。
［工程１－１－Ｂ］
　コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温（２５℃程度）まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４）で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
［工程１－２－Ｂ］
　得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温（２５℃程度）で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）１．２ｇを得た。
［工程２－Ｂ］
（ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の調製）
　ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を次に示す工程２－１－Ｂ、続いて工程２－２－Ｂに従って調製した。
［工程２－１－Ｂ］
　ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０質量％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間撹拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
［工程２－２－Ｂ］
　分子量３５，０００（３５ｋＤａ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。「（１）工程２－１－Ｂ」でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。
［工程３－Ｂ］
　［工程２－２－Ｂ］で調製したＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、［工程１－Ｂ］で合成したＨＡ－ＴＢＡ中に存在する二糖繰り返し単位（ＨＡユニット）に対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量がモル比で３１／１００となる割合で添加した。
　次に、ＨＡユニットに対する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）の添加量がモル比で３７／１００となる割合で加え、室温（２５℃程度）で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：３，５００）した。
　得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認され、コレステロール導入率は３０％であった。
＜試験例１＞
　試験例１として、難水溶性ペプチドであるシクロスポリン（ＣｙＡ）の製剤化を行った。
［実施例１－１］
　会合促進剤（ポリソルベート８０）含有ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡの製剤を調製した。　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。別のバイアルに、ポリソルベート８０（富士フイルム和光、製品番号：１６４－２１５９１）を２ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で希釈した。
　またさらに別のバイアルに、粉末のＣｙＡ（東京化成工業、品番：Ｃ２４０８）を２００．０ｍｇ秤量し、その後、エタノールを１．０ｍL添加して、ＣｙＡを均一に溶解させた。この後、１２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を７．２ｍＬと２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を１．２ｍＬ加えて混合させ、１時間攪拌後にポリソルベート８０含有ヒアルロン酸誘導体水溶液へ２００ｍｇ／ｍＬのＣｙＡ含有エタノール溶液を０．０４６ｍＬ滴下して、薬物の複合化を行った。
　さらにＣｙＡが全て複合化されたのちに、注射用水で濃度調整した後に、１０質量％スクロース溶液となる割合でスクロース（富士フイルム和光、製造専用）を粉末で添加し、３時間攪拌して均一化させ、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の調製を行った。最終的な溶液は目視で清澄であった。また、２週間の冷蔵保管中に析出物は認められなかった。
　以上の操作は２０℃で行った。
　最終的な製剤組成を表１に示した。
［実施例１－２］
　会合促進剤（ポリエチレングリコール４００）含有ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡ製剤を調製した。
　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。別のバイアルに、粉末のＣｙＡ（東京化成工業、品番：Ｃ２４０８）を８８．０ｍｇ秤量し、その後、ポリエチレングリコール４００（富士フイルム和光、製品番号：１６１－０９０６５）を１０．０ｍL添加して、ＣｙＡを均一に溶解させた。
　続けて、１２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液が６ｍＬ入ったバイアルへ攪拌しながら８．８ｍｇ／ｍＬのＣｙＡ含有ポリエチレングリコール４００溶液を２．０ｍＬ添加して、薬物の複合化を行った。さらにＣｙＡが全て複合化されたのちに、１０質量％スクロース溶液となる割合でスクロース（富士フイルム和光、製造専用）を粉末で添加し、３時間攪拌して均一化させ、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の調製を行った。最後に溶液は目視で清澄であった。また、２週間の冷蔵保管中に析出物は認められなかった。最終的な製剤組成を表１に示した。
［実施例１－３］
　会合促進剤（ポリエチレングリコール４００およびポリソルベート８０）含有ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡ製剤を調製した。以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。別のバイアルに、粉末のＣｙＡ（東京化成工業、品番：Ｃ２４０８）を９２．６ｍｇ秤量し、その後、ポリエチレングリコール４００（富士フイルム和光、製品番号：１６１－０９０６５）を１０．０ｍＬ添加して、ＣｙＡを均一に溶解させた。続けて、１２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液が６ｍＬ入ったバイアルへ攪拌しながら９．２６ｍｇ／ｍＬのＣｙＡ含有ポリエチレングリコール４００溶液を１．９ｍＬ添加して、薬物の複合化を行った。
　加えて、さらにＣｙＡが全て複合化されたのちに、１００ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を０．１０ｍＬ添加した。１０質量％スクロース溶液となる割合でスクロース（富士フイルム和光、製造専用）を粉末で添加し、３時間攪拌して均一化させ、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の調製を行った。最後に溶液は目視で清澄であった。また、２週間の冷蔵保管中に析出物は認められなかった。最終的な製剤組成を表１に示した。
［比較例１－１］
　αシクロデキストリンを用いたＣｙＡ製剤を調製した。
　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
　ＣｙＡの粉末を０．５ｍｇ／ｍＬとなる割合で濃度が１０質量％のαシクロデキストリン（アルドリッチ社製）が含有された１０質量％スクロース溶液に溶解して調整した。最後に溶液は目視で清澄であった。また、２週間の冷蔵保管中に析出物は認められなかった。最終的な製剤組成を表１に示した。
［比較例１－２］
　ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡの製剤を調製した。
　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。
　またさらに別のバイアルに、粉末のＣｙＡ（東京化成工業、品番：Ｃ２４０８）を２００．０ｍｇ秤量し、その後、エタノールを１．０ｍＬ添加して、ＣｙＡを均一に溶解させた。この後、１２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液へ２００ｍｇ／ｍＬのＣｙＡ含有エタノール溶液を０．０４６ｍＬ滴下して、薬物の複合化を行った。さらにＣｙＡが全て複合化されたのちに、注射用水で濃度調整した後に、１０質量％スクロース溶液となる割合でスクロース（富士フイルム和光、製造専用）を粉末で添加し、３時間攪拌して均一化させた。最後に溶液は目視で清澄であった。
　以上の操作は２０℃で行った。
　最終的な製剤組成を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜試験例２＞
　ＣｙＡのラットにおける薬物動態試験を実施した。
　実施例１－１、１－２、１－３および比較例１－２で調製したヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる溶液製剤および比較例１－１の溶液製剤を、それぞれ２５Ｇ針を用いて表２に示す用量（ｍｇ／ｋｇ）で正常ラット（ＳＤ、６週齢、オス）の皮下に投与した。
　投与後、経時的にへパリン処理をしたシリンジで頸静脈採血を行い、プロテアーゼ阻害剤としてアプロチニンを加えた。得られた血液は血漿分離し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて測定した。各種ＣｙＡ製剤投与時のＣｙＡの血漿中濃度推移および比較例１のＣｙＡの血漿中濃度推移を併せて図３に示した。図３中、実施例２－１は、実施例１－１のヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる溶液製剤を投与した場合である。実施例２－２～２－３、比較例２－１～２－２は、それぞれ実施例１－２～１－３、比較例１－２のヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる溶液製剤、比較例１－１の溶液製剤それぞれを投与した場合である。
　また、薬物動態パラメーター（薬物半減期（Ｔ１／２）および平均滞留時間（ＭＲＴ）、血清中薬物濃度－（０～無限大）時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ　Ｖｅｒ．８．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本明細書において、徐放性は、平均滞留時間（ＭＲＴ（Ｍｅａｎ　Ｒｅｓｉｄｕａｌ　Ｔｉｍｅ））により評価し、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体医薬品組成物のＭＲＴがヒアルロン酸誘導体医薬品組成物のＭＲＴよりも大きくなった場合、徐放性を有すると評価する。
　より具体的には、下記式（Ａ）を満たす場合には、「生体内で有効成分の濃度を長期間にわたり維持できる」と評価する。
（会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体医薬品組成物のＭＲＴ）÷（ヒアルロン酸誘導体医薬品組成物のＭＲＴ）≧１．１　　　・・・式（Ａ）
　ヒアルロン酸誘導体の会合促進剤を含む製剤である実施例２－１、２－２、２－３においては、会合促進剤を含まない比較例２－２に対して、血中濃度の半減期が長く、ＭＲＴが大きい値であった。徐放性を式（Ａ）にて評価したところ、比較例２－２に対して、実施例２－１は１．３５、実施例２－２は１．４２、実施例２－３は１．４９であった。すなわち長期間に渡って薬物が血中に滞留していることがわかった。以上より、本発明のヒアルロン酸誘導体組成物は、より長期間の徐放性に優れることが確認された。
＜試験例３＞
　ＧＰＣによる会合促進度の評価を実施した。
[実施例３－１]
　試験例１で調製した実施例１－１について、ＧＰＣによるヒアルロン酸誘導体の会合促進度を評価した。
［ヒアルロン酸誘導体の会合促進度の評価：面積比Ａ２／Ａ１］
　図１は、合成例１で用いたヒアルロン酸誘導体のクロマトグラムである。
　ヒアルロン誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で注射用水にて２４時間攪拌して溶解させ、ＧＰＣ測定に供した。この時、クロマトグラムとベースラインで囲まれた面積値をＡ１とした。
　図２は、実施例１－１のヒアルロン酸誘導体組成物のクロマトグラムである。
　ヒアルロン誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で注射用水にて希釈して測定した。この時、クロマトグラムとベースラインで囲まれた面積値をＡ２とした。
（ＧＰＣ測定条件）
　装置：ＨＬＣ８３２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ（示差屈折率）
　温度：３０℃
[実施例３－２、３－３、及び比較例３－１、３－２]
　実施例１－２、１－３、及び比較例１－２も実施例１－１と同様にヒアルロン誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で注射用水にて希釈して測定した。比較例２－１は希釈せずにそのままＧＰＣ測定に供した。この時、各クロマトグラムとベースラインで囲まれた面積値であるＡ２をそれぞれ算出し、Ａ１との面積比Ａ２／Ａ１の値を表３に示した。
[比較例３－３～３－６]
　添加剤単体の濃度が実施例３－１～３－３、比較例３－２と同様な濃度となる割合で水溶液を調製し、同様にＧＰＣ測定に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　この結果より、実施例３－１～３－３のヒアルロン酸誘導体はポリソルベート８０やポリエチレングリコール４００によって会合が促進されていることが示唆された。一方でエタノールではＧＰＣにおけるヒアルロン酸誘導体ピークの面積値にエタノールの添加有無に関わらず殆ど変動がなく、ヒアルロン酸誘導体の会合は促進されていないことが確認された。
＜試験例４＞
　ＧＰＣによる会合促進剤の評価を実施した。
[実施例４－１、４－２、４－３及び比較例４－１、４－２]
　試験例１と同様の方法で、有効成分のＣｙＡ及び等張剤であるスクロースを含有しないことを除いては同じ組成となる割合で下表４に従ってヒアルロン酸誘導体水溶液を調製した。調整した各サンプルについて、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水にて希釈してＧＰＣ測定に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
＜試験例５＞
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生理塩濃度下での沈殿挙動を確認した。
[実施例５－１～５－３、比較例５－１、５－２]
　１．５ｍＬのマイクロチューブに実施例１で得られた各製剤を１５０μＬサンプリングする。その後、最終緩衝液組成が１０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌとなる割合で濃縮緩衝液（４０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７．４）、６００ｍＭ　ＮａＣｌ）を加え、ヒアルロン酸誘導体を沈殿させた。３７℃にて２０分間インキュベート後、２０００Ｇにて５分間遠心分離し、上澄みを５０μＬサンプリングし、ＨＰ－β－ＣＤ水溶液（３００ｍＭ）にて２倍希釈し、１時間インキュベート後、ＨＰ－β－ＣＤ水溶液（１０ｍＭ）を３５０μＬ添加して希釈したのちにＧＰＣ測定に供した。検出されたヒアルロン酸誘導体のピーク面積から当初使用量に対するヒアルロン酸誘導体の溶液中の残存率を算出し、沈殿したヒアルロン酸誘導体の割合（沈殿率）を算出した。当該沈殿評価法と、上記［医薬品組成物の物性］（試験条件）、沈殿サンプルの調製に記載の沈殿評価法の結果は一致する。
（ＧＰＣ測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ／リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ（示差屈折率）
　温度：３０℃
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　この結果より、実施例５－１～５－３のヒアルロン酸誘導体はポリソルベート８０やポリエチレングリコール４００によって会合が促進されるだけでなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生理塩濃度下での沈殿性能を向上させることを示唆した。
＜試験例６＞
　会合促進剤の種類について検討した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させたものを実施例６－１～６－１１、比較例６－１～６－６に用いた。
[実施例６－１]
　上記で溶解させたヒアルロン酸誘導体水溶液を２ｍｇ／ｍＬになる割合で注射用水を入れて希釈した。また別のバイアルに１０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合でポリエチレングリコール３００を注射用水で希釈して調整した。上記ヒアルロン酸誘導体水溶液とポリエチレングリコール３００水溶液を体積比１対１で混合して下表６の組成となる割合で調整した。その後、２０℃、２４時間インキュベートしてからＧＰＣ測定に供した。
（ＧＰＣ測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ（示差屈折率）
　温度：３０℃
[実施例６－２～６－１１、比較例６－１～６－６]
　実施例６－１と同様な手法で下表６の組成となる割合で溶液を調製してＧＰＣ測定に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　この結果より、実施例６－１～６－１１のヒアルロン酸誘導体はポリソルベート８０やポリエチレングリコール４００以外のポリエチレングリコール３００、ポロキサマー１８８、クレモフォールＥＬによって会合が促進されていることが示唆された。一方比較例６－１～６－４でテトラヒドロフラン（エーテル構造を１つ備え、炭素数は４である）、エタノール（エーテル構造を有さず、炭素数は２である）、エチレングリコール（エーテル構造を有さず、炭素数は２である）ではＧＰＣにおけるヒアルロン酸誘導体ピークの面積値にエタノール等の添加有無に関わらず殆ど変動がなく、ヒアルロン酸誘導体の会合は促進されていないことが確認された。ここで、ポロキサマー１８８やクレモフォールＥＬについてもポリソルベート８０やポリエチレングリコール４００と同様に、会合促進剤単独のＧＰＣピークはヒアルロン酸誘導体のピーク位置に一切検出されなかった。
＜試験例７＞
　ヒアルロン酸誘導体医薬組成物を製造した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させたものを実施例７－１～７－１０、比較例７－１～７－６に用いた。
［実施例７－１］
　会合促進剤（ポリソルベート８０）含有ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡ製剤を調製した。
　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
　バイアルに、粉末のＣｙＡ（東京化成工業、品番：Ｃ２４０８）を１．８ｍｇ秤量し、その後、別のバイアルにポリソルベート８０を０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水を添加して希釈した。秤量したＣｙＡを濃度０．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液１８μＬで懸濁させた。続けて、１２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を攪拌しながら前記ＣｙＡ含有ポリソルベート８０水溶液ポリソルベート８０水溶液へ４５０μＬ添加して、製剤化時の組成はＣｙＡ濃度が２ｍｇ／ｍＬ、ヒアルロン酸誘導体が６ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０が０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水を４３２μＬ添加して薬物の複合化を行った。２０℃、２４時間攪拌後に析出物を０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を後述するＨＰＬＣ測定にて定量した。最終組成は表７に記載した。
［実施例７－２～７－１０］
　実施例７－１と同様な方法で最終組成の会合促進剤濃度が下記表７に記載の濃度となるよう会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体医薬組成物を製造した。また、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルター後の製剤中のＣｙＡ濃度についても実施例７－１と同様にＨＰＬＣにより定量し、結果を表７にまとめた。
［ＨＰＬＣ定量条件：逆相クロマトグラフィー分析条件］
カラム　：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８　粒子径５μｍ×内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相　：溶離液Ａ ０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
　　　　　溶離液Ｂ ０．１％ＴＦＡ／水
移動相比：溶離液Ａ／溶離液Ｂ＝９／１
流速　　：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入量　：３０μＬ
検出器　：ＵＶ（２１０ｎｍ）
[沈殿評価条件]
　試験例７で調製した各種医薬組成物のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生理塩濃度下での沈殿挙動について次に示す方法で評価した。
[沈殿サンプルの調製]
　マイクロチューブ（１．５ｍＬ）に濃縮緩衝液（４０ｍＭ　ＰＢ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ水溶液）を２００μＬ入れ、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる製剤を６００μＬ投入する。その後、ｖｏｌｔｅｘで３０秒混合し、３７℃、２０ｍｉｎインキュベートした後に、遠心分離機（２０００Ｇ、５ｍｉｎ）で沈殿物を沈降させる。続いて、上澄み中のヒアルロン酸誘導体をＧＰＣ測定に供する。
[ブランクサンプルの調製]
　マイクロチューブ（１．５ｍＬ）に注射用水を２００μＬ入れ、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる製剤（ヒアルロン酸誘導体の理論濃度Ｘｍｇ／ｍＬとする。Ｘ＞１．３３）を６００μＬ投入する。その後、ｖｏｌｔｅｘで３０秒混合し、３７℃、２０ｍｉｎインキュベートした後に、遠心分離機（２０００Ｇ、５ｍｉｎ）に供する。続いて、上澄み中のヒアルロン酸誘導体が１ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水で希釈してＧＰＣ測定に供する。
[ＧＰＣ測定条件]
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ
　温度：３０℃
[沈殿の確認]
　本明細書においては、下式で表される沈殿率が２０％以上を満たすヒアルロン酸誘導体医薬組成物を生理塩濃度下で沈殿するものとする。
沈殿率（％）＝{１－（沈殿サンプルのヒアルロン酸誘導体の面積値）÷（（ブランクサンプルのヒアルロン酸誘導体の面積値）×（０．７５Ｘ））}×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　この結果より、ポリソルベート８０やポリソルベート２０、ポロキサマー１８８、クレモフォールＥＬ等、種々の会合促進剤が少量添加されているだけで、粉末から有機溶剤を使用せずとも、難水溶性の有効成分が高濃度で可溶化できることが示された。さらに、会合促進剤により、沈殿性能も向上することが示唆された。以上より、会合促進剤によって、ヒアルロン酸誘導体の会合が促進され、有効成分が高含有であり、かつ長期徐放が可能な医薬組成物が得られることが期待される。
＜試験例８＞
　ヒアルロン酸誘導体の種類について検討した。
　合成例２で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３０％）を２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させたものを実施例８－１～８－１１、比較例８－１～８－６に用いた。
[実施例８－１]
　ガラスバイアルに１０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合でポリソルベート８０を注射用水で希釈して調整した。６ｍＬのクリーンバイアルを用意し、上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を４００μＬとポリソルベート８０水溶液を１０μＬ添加して、ｖｏｌｔｅｘで３０秒混合後、注射用水を３９０μＬ添加して合計８００μＬとなるよう調整した。下表８の組成となる割合で調整した。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてからＧＰＣ測定に供した。
（ＧＰＣ測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ（示差屈折率）
　温度：３０℃
[実施例８－２～８－４、比較例８－１～８－６]
　実施例８－１と同様な手法で下表８の組成となる割合で溶液を調製してＧＰＣ測定に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　この結果より、実施例８－１～８－４のヒアルロン酸誘導体はポリソルベート８０やポリソルベート２０、クレモフォールＥＬによって会合が促進されていることが示唆された。一方比較例８－１～８－６でテトラヒドロフラン（エーテル構造を１つ備え、炭素数は４である）、エタノール（エーテル構造を有さず、炭素数は２である）、アセトニトリル（エーテル構造を有さず、炭素数は２である）ではＧＰＣにおけるヒアルロン酸誘導体ピークの面積値にテトラヒドロフラン等の添加有無に関わらず殆ど変動がなく、ヒアルロン酸誘導体の会合は促進されていないことが確認された。従って、分子量が小さく、疎水性基の導入率が高いヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３０％）においても同様に、会合促進剤によって、ヒアルロン酸誘導体の会合が促進され、有効成分が高含有であり、かつ長期徐放が可能な医薬組成物が得られることが期待される。
＜試験例９＞
　ヒト成長ホルモン（タンパク質）を用いたヒアルロン酸誘導体医薬組成物の調製を実施した。
[実施例９－１]
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を４．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させたものを実施例９－１～９－２、比較例９－１に用いた。
[実施例９－１～実施例９－２]
　会合促進剤及び注射用水を上記ヒアルロン酸誘導体水溶液に添加した。
　また、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ：ジェノトロピン（登録商標）注射用）の粉末を２ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう別のバイアルで注射用水に溶解し、調製したあとに、前記会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液に２５０μＬ添加し、全量１ｍＬとなるよう調整した。その後、３７℃、２４時間インキュベートすることでｈＧＨとの複合化を促進させた。最終製剤の組成が表９に記載の濃度となるよう調整した。
[比較例９－１]
　テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および注射用水を上記４．０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製されたヒアルロン酸誘導体水溶液に添加した。加えて、２．０ｍｇ／ｍＬのｈＧＨ水溶液を前記ＴＨＦ含有ヒアルロン酸誘導体水溶液に２５０μＬ添加し、全量１ｍＬとなるよう調整した。その後、３７℃、２４時間インキュベートすることでｈＧＨとの複合化を促進させた。実施例９－１と同様、最終製剤の組成が表９に記載の濃度となるよう調整した。
　実施例９－１～９－２、比較例９－１は全て、ヒアルロン酸誘導体が１．０ｍｇ／ｍＬ、ｈＧＨは０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう調整した。２４時間後、実施例９－１～９－２は清澄な溶液が得られた。ここで比較例９－１のみ、３７℃、２４時間インキュベート後に溶液が白濁しており、ヒアルロン酸誘導体とｈＧＨの複合化溶液の取得が困難であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　続いて、実施例９－１～９－２についてｈＧＨの複合化率を次に示すＧＰＣにて評価を行った。
[ＧＰＣ測定条件]
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＵＶ（２８０ｎｍ）
　温度：３０℃
　濃度が０．５０ｍｇ／ｍＬおよび０．２５ｍｇ／ｍＬであるｈＧＨ単独のサンプルを調製し、ＧＰＣ測定に供した。この時、１１．５分にｈＧＨ単体のピークが確認された。ヒアルロン酸誘導体組成物に複合化され、取り込まれると、１１．５分にあるｈＧＨ単体のピーク面積値は減少した。ピーク面積の減少率により、ヒアルロン酸誘導体組成物が内包したｈＧＨの濃度をｈＧＨ複合化率として算出した。ｈＧＨを内包したヒアルロン酸誘導体組成物はヒアルロン酸誘導体に由来するピーク面積値が増大していることも確認された。上で算出したｈＧＨ複合化率から、ヒアルロン酸誘導体が１００質量部に対する、（Ｃ）有効成分（ｈＧＨ）の実質量部を表９に示した。
　この結果より、会合促進剤であるポリエチレングリコール４００を含むヒアルロン酸誘導体組成物は効率的にタンパク質医薬品であるｈＧＨを複合化した。難溶性の薬物のみならず、水溶性の薬物についても長期徐放の機能が期待された。また、ＣｙＡのようなペプチド医薬品以外にもタンパク質医薬品への適用により多くのモダリティについて長期徐放が可能になると推察された。
　一方、比較例９－１で調製したｈＧＨ－ヒアルロン酸誘導体医薬組成物はＴＨＦが複合化を阻害したためか、白濁したサンプルが得られた。ｈＧＨがヒアルロン酸誘導体にうまく複合化されなかったものと推察される。
　以上より、ｈＧＨとの複合化も会合促進剤存在下で効率的に行われ、かつ生体内で長期徐放可能なタンパク質－ヒアルロン酸誘導体医薬組成物が取得できるものと期待される。
＜試験例１０＞
［合成例３］
　試験例６を参考に合成例２と同様の方法で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％）について、ＧＰＣによるヒアルロン酸誘導体の会合促進度を評価した。
（ＧＰＣ測定条件）
　装置：ＨＬＣ８４２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＲＩ（示差屈折率）
　温度：３０℃
　試験例３と同様な方法で、ヒアルロン酸誘導体の会合促進度の評価に用いる面積比Ａ２／Ａ１を算出した。
　合成例３で得たヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）を加えて終夜攪拌することで完全に溶解させた。このサンプルのＧＰＣ評価で算出された面積値をＡ１とした。
[実施例１０－１]
　合成例３で得たヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させたものを実施例１０－１～１０－９に用いた。また別のバイアルに１０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合でポリソルベート８０を注射用水で希釈して調整した。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながら１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液を１０μＬ添加して混合し、最後に注射用水を３９０μＬ添加した。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－２]
　まず、りん酸緩衝剤粉末（富士フイルム和光社製：１６７－１４４９１　　生化学用　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて、１００ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７．４）リン酸緩衝液の調製を行った。
　続いて、実施例１０－１で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながら１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液を５０μＬ添加して混合し、１００ｍＭ　ＰＢリン酸緩衝液を１００μＬ加え、最後に注射用水を２５０μＬ添加して、終濃度１０ｍＭ　ＰＢとなる割合でヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－３]
　実施例１０－１で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながら１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液を５０μＬ添加して混合し、最後に注射用水を３５０μＬ添加して、ヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－４]
　続いて、実施例１０－１、実施例１０－２で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながらポリエチレングリコール４００（ナカライテスク社製）を１００μＬ添加して混合し、１００ｍＭ　ＰＢリン酸緩衝液を１００μＬ加え、最後に注射用水を２００μＬ添加して、終濃度１０ｍＭ　ＰＢとなる割合でヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－５]
　続いて、実施例１０－１で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながらポリエチレングリコール４００（ナカライテスク社製）を１００μＬ添加して混合し、最後に注射用水を３００μＬ添加して、ヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４時間インキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－６]
　続いて、実施例１０－１で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながらポリエチレングリコール４００（ナカライテスク社製）を３００μＬ添加して混合し、最後に注射用水を１００μＬ添加して、ヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４時間インキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－７]
　まず、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ　３３８（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を１５０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で注射用水を加えて溶解させた。続いて、実施例１０－１で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながら１５０ｍｇ／ｍＬのＰｏｌｏｘａｍｅｒ３３８水溶液を１００μＬ添加して混合し、最後に注射用水を３００μＬ添加して、ヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－８]
　実施例１０－１、実施例１０－２、実施例１０－７で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながらＰｏｌｏｘａｍｅｒ３３８水溶液を３００μＬ添加して混合し、１００ｍＭ　ＰＢリン酸緩衝液を１００μＬ加え、終濃度１０ｍＭ　ＰＢとなる割合でヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－９]
　実施例１０－１、実施例１０－７で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を６００μＬ加え、続いて、攪拌しながら１５０ｍｇ／ｍＬのＰｏｌｏｘａｍｅｒ３３８水溶液を３００μＬ添加して混合し、最後に注射用水を１００μＬ添加して、ヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－１０]
　まず、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ６００（Ａｖａｎｔｉ社製）を５０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で注射用水を加えて溶解させた。続いて、合成例３で得たヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％）を１０．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させたものを実施例１０－１０～１０－１２に用いた。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を７５０μＬ加え、続いて、攪拌しながら５０ｍｇ／ｍＬのＣｈｏｌ－ＰＥＧ６００水溶液を２．８μＬ添加して混合し、最後に注射用水を７４７．２μＬ添加して、ヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－１１]
　実施例１０－１０で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を７５０μＬ加え、続いて、攪拌しながら５０ｍｇ／ｍＬのＣｈｏｌ－ＰＥＧ６００水溶液を１１．２μＬ添加して混合し、最後に注射用水を７３８．８μＬ添加して、ヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
[実施例１０－１２]
　実施例１０－１０で調製した溶液を用いて次の溶液調整を行った。６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を７５０μＬ加え、続いて、攪拌しながら５０ｍｇ／ｍＬのＣｈｏｌ－ＰＥＧ６００水溶液を２８μＬ添加して混合し、最後に注射用水を７２２μＬ添加して、ヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。その後、２０℃、２４ｈインキュベートしてから、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で１０ｍＭ　ＰＢ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈してからＧＰＣ測定に供した。
　試験例３と同様な方法で、実施例１０－１～１０－１２の各クロマトグラムとベースラインで囲まれた面積値であるＡ２をそれぞれ算出し、Ａ１との面積比Ａ２／Ａ１の値を表１０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　この結果より、実施例１０－１～１０－１２のヒアルロン酸誘導体はポリソルベート８０やポリエチレングリコール４００、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ３３８、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ６００によって会合が促進されていることが示唆された。ここで、ポロキサマー３３８やＣｈｏｌ－ＰＥＧ６００についてもポリソルベート８０やポリエチレングリコール４００と同様に、会合促進剤単独のＧＰＣピークはヒアルロン酸誘導体のピーク位置に一切検出されなかった。
＜試験例１１＞
　試験例１１として、難水溶性ペプチドであるシクロスポリン（ＣｙＡ）の製剤化を行った。
［実施例１１－１］
　会合促進剤（ポリソルベート８０）含有ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡ製剤を調製した。
　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で、１０％スクロース水溶液を添加して溶解させた。
　この後、２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。１０％スクロース溶液は、事前にスクロース粉末（富士フイルム和光社製、製造専用）を注射用水で十分に溶解させたのちに、０．２２μｍフィルター（膜材質：ＰＴＦＥ）にて滅菌濾過した溶液を使用した。別のバイアルに、粉末のＣｙＡ（東京化成工業、品番：Ｃ２４０８）を１０．０ｍｇ秤量し、その後、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で注射用水に溶解させたポリソルベート８０水溶液を０．５０ｍＬ添加してスターラーチップで攪拌し、ＣｙＡを分散させた。
　続けて、１２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を上記ＣｙＡ懸濁液の入ったバイアルへ攪拌しながら３．７５ｍＬ添加し、さらに１０％スクロース水溶液を０．７５ｍＬ添加したのちに、薬物の複合化を行った。ＣｙＡが全て複合化された会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の溶液は目視で清澄であった。また、２週間の冷蔵保管中に析出物は認められなかった。最終的な製剤組成を表１１に示した。
［比較例１１－１］
　αシクロデキストリンを用いたＣｙＡ製剤を調製した。
　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。まず、ビーカーにスクロースを２．０ｇ、α－Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ（東京化成工業社製）を２．０ｇを秤量し、１５ｍＬ程度の注射用水を加え溶解。メスシリンダーに移し、２０ｍＬにメスアップした。続いて、０．４５μｍのフィルターにて濾過し、１０％スクロース／１０％α－Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ水溶液とした。２．０ｍｇのＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ　Ａ（東京化成工業社製）をコニカルチューブに秤量し、１０ｍＬの１０％スクロース／１０％α－Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ水溶液を加え、攪拌溶解させた。最後に、０．２μｍのフィルターにて濾過し、投与溶液とした。最終的な製剤組成を表１１に示した。
［比較例１１－２］
　ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡの製剤を調製した。
　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。
　またさらに別のバイアルに、粉末のＣｙＡ（東京化成工業、品番：Ｃ２４０８）を２００．０ｍｇ秤量し、その後、エタノールを１．０ｍＬ添加して、ＣｙＡを均一に溶解させた。この後、１２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液３．７５ｍLに対し、２００ｍｇ／ｍＬのＣｙＡ含有エタノール溶液を０．０２２５ｍＬ滴下し、続けて１０％スクロース水溶液を１．２２７５ｍL添加して薬物の複合化を行った。この後、室温下で１２時間以上ゆっくりと攪拌し、均一化させた。溶液は目視で清澄であり、粉末が完全に溶解したことを確認して投与溶液とした。最終的な製剤組成を表１１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
＜試験例１２＞
　ＣｙＡのラットにおける薬物動態試験を実施した。
　実施例１１－１および比較例１１－２で調製したヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる溶液製剤および比較例１１－１の溶液製剤を、それぞれ２５Ｇ針を用いて表１２に示す用量（ｍｇ／ｋｇ）で正常ラット（ＳＤ、６週齢、オス）の皮下に投与した。
　投与後、経時的に鎖骨下静脈から採血を行った。全血に等量の０．１％ＺｎＳＯ４水溶液を添加し溶血処理をした後、Ｍｉｃｒｏ ＶｏｌｕｍｅＱｕＥＣｈＥＲＳ　Ｋｉｔを用いて前処理行った。遠心分離後の上清をフィルター濾過し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて測定した。各種ＣｙＡ製剤投与時のＣｙＡの血中濃度推移および比較例１のＣｙＡの血中濃度推移を併せて図４に示した。図４中、実施例１２－１は、実施例１１－１のヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる溶液製剤を投与した場合である。比較例１２－２は、比較例１１－２のヒアルロン酸誘導体医薬組成物からなる溶液製剤、比較例１２－１は、比較例１１－１の溶液製剤それぞれを投与した場合である。
　また、最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）は実測値を使用した。血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０→∞）および血中濃度－１次モーメント曲線下面積（ＡＵＭＣ０→∞）は、検出可能な測定時間までの面積は線形台形法で、それ以降の時間無限大までの面積は検出限界前の３点より近似的に算出された消失速度定数（ｋｅ）を用いて算出した。最後に、平均滞留時間（ＭＲＴ）は以下の式より求め、その値を表１２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　ヒアルロン酸誘導体の会合促進剤を含む製剤である実施例１２－１においては、会合促進剤を含まない比較例１２－２に対して、初期放出異常の指標であるＣｍａｘ／Ｄｏｓｅの値が小さく、ＭＲＴが大きい値であった。徐放性を式（Ａ）にて評価したところ、比較例１２－２に対して、実施例１２－１は２．４９であった。すなわち長期間に渡って薬物が血中に滞留していることがわかった。以上より、本発明のヒアルロン酸誘導体組成物は、より長期間の徐放性に優れることが確認された。
＜試験例１３＞
　ヒアルロン酸誘導体医薬組成物を製造した。
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させたものを実施例１３－１～１３－２、比較例１３－１に用いた。
　以下の操作は２０℃、室温下の環境下で実施した。
[実施例１３－１]
　まず、ポリソルベート８０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で注射用水を加えて溶解させた。続いて、１７０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合でグリセリン（ナカライテスク社製、商品コード：１７０４５－９４）を注射用水に溶解して調整した。さらに、注射用水２８．２４０ｍＬに対し、０．５ｍｏｌ／Ｌ－ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ　８．０）（ナカライテスク社製、商品コード：０６８９４－１４）を１ｍＬ加えて、５．０ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ緩衝液を調整した。
　ここで、６ｍｌの滅菌バイアルに上記ヒアルロン酸誘導体水溶液を４１６．７μＬ加え、続いて、攪拌しながら１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液を１００μＬ添加して混合し、続けて、注射用水を３１８．３μＬ添加して、最後に５．０ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ緩衝液を１５μＬ加えてヒアルロン酸誘導体水溶液の調製を行った。この時、ＥＤＴＡ濃度は０．０７５ｍｇ／ｍＬ、グリセリン濃度は２５．５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０濃度は１ｍｇ／ｍＬ、ヒアルロン酸誘導体の濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。その後、２０℃、２４ｈ攪拌し、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で希釈してＧＰＣ測定に供した。会合促進剤を含有しないこと以外は同じ組成でヒアルロン酸誘導体溶液を調整し、得られた面積値をＡ１として、会合促進剤による会合促進度Ａ２／Ａ１を算出し、表１３に示した。
　次に、会合促進剤（ポリソルベート８０）含有ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡ製剤を調製した。
　まず、６ｍＬの滅菌バイアルに２．５ｍｇのＣｙＡを秤量した。その後、実施例１３－１で調製したヒアルロン酸誘導体溶液を４５０μＬ添加して２０℃、２４時間攪拌した。ＣｙＡ粉末の溶け残りが認められ、飽和状態で次の操作に移行した。上で調製したＣｙＡ含有ヒアルロン酸誘導体医薬組成物に対して、１３ｍｍφの０．２２μｍＰＥＳフィルターで滅菌ろ過し、ヒアルロン酸誘導体へ封入できずに析出した薬物を取り除き、得られたろ液の製剤中のＣｙＡ濃度を逆相ＨＰＬＣにて定量した。本実験をｎ＝２で実施し、１．５０ｍｇ／ｍＬおよび１．４１ｍｇ／ｍＬであった。製剤中のＣｙＡ濃度について、得られた平均値を表１３にまとめた。また、試験例７と同様な方法で沈殿するか否か検証した。その結果も表１３にまとめた。
[実施例１３－２]
　ポリソルベート濃度が３ｍｇ／ｍＬであること以外すべて同じ濃度で、実施例１３－１と同様な方法にて会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を調整した。
　この時、ＥＤＴＡ濃度は０．０７５ｍｇ／ｍＬ、グリセリン濃度は２５．５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０濃度は３ｍｇ／ｍＬ、ヒアルロン酸誘導体の濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。その後、２０℃、２４ｈ攪拌し、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で希釈してＧＰＣ測定に供した。会合促進剤を含有しないこと以外は同じ組成でヒアルロン酸誘導体溶液を調整し、得られた面積値をＡ１として会合促進剤による会合促進度を実施例１３－１と同様に算出し、表１３に記載した。
　次に、会合促進剤（ポリソルベート８０）含有ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡ製剤を調製した。
　まず、６ｍＬの滅菌バイアルに２．５ｍｇのＣｙＡを秤量した。その後、実施例１３－２で調製したヒアルロン酸誘導体溶液を４５０μＬ添加して２０℃、２４時間攪拌した。ＣｙＡ粉末の溶け残りが認められ、飽和状態で次の操作に移行した。上で調製したＣｙＡ含有ヒアルロン酸誘導体医薬組成物に対して、１３ｍｍφの０．２２μｍＰＥＳフィルターで滅菌ろ過し、ヒアルロン酸誘導体へ封入できずに析出した薬物を取り除き、得られたろ液の製剤中のＣｙＡ濃度を逆相ＨＰＬＣにて定量した。本実験をｎ＝２で実施し、１．８９ｍｇ／ｍＬおよび１．８７ｍｇ／ｍＬであった。製剤中のＣｙＡ濃度について、得られた平均値を表１３にまとめた。また、試験例７と同様な方法で沈殿するか否か検証した。その結果も表１３にまとめた。
[比較例１３－１]
　ポリソルベート濃度が０ｍｇ／ｍＬであること以外すべて同じ濃度で、実施例１３－１と同様な方法にてヒアルロン酸誘導体水溶液を調整した。
　この時、ＥＤＴＡ濃度は０．０７５ｍｇ／ｍＬ、グリセリン濃度は２５．５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０濃度は０ｍｇ／ｍＬ、ヒアルロン酸誘導体の濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。その後、２０℃、２４ｈ攪拌し、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で希釈してＧＰＣ測定に供した。
　次に、ヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を用いたＣｙＡ製剤を調製した。
　まず、６ｍＬの滅菌バイアルに２．５ｍｇのＣｙＡを秤量した。その後、比較例１３－１で調製したヒアルロン酸誘導体溶液を４５０μＬ添加して２０℃、２４時間攪拌した。ＣｙＡ粉末の溶け残りが認められ、飽和状態で次の操作に移行した。上で調製したＣｙＡ含有ヒアルロン酸誘導体医薬組成物に対して、１３ｍｍφの０．２２μｍＰＥＳフィルターで滅菌ろ過を試みたが、ろ過が困難であった。
　ここで、ヒアルロン酸誘導体を含有しない条件で会合促進剤単独のＧＰＣピークも検証したが、会合促進剤由来のピークはヒアルロン酸誘導体のピーク位置に一切検出されなかった。最終組成を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　その結果、等張化剤として用いたグリセリン含有ＥＤＴＡ溶液中でもポリソルベート８０がヒアルロン酸誘導体の会合を促進（Ａ２／Ａ１＝１．９０～２．１０）していることが示された。また、会合促進によりヒアルロン酸誘導体医薬組成物の滅菌ろ過性が向上したことを示唆する結果を得た。
　さらに、ヒアルロン酸誘導体１００質量部に対して、有効成分であるＣｙＡは２９．１又は３７．６質量部であり、高濃度に可溶化できていることが確認され、点眼あるいは筋肉内、皮下投与などでより長期の徐放が期待される。
＜試験例１４＞
　試験例３と同様な方法で、別の会合促進剤について、ＧＰＣによる会合促進度の評価を実施した。
［実施例１４－１］
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。１．５ｍＬのエッペンチューブに１２．０ｍｇ／ｍＬの前記ヒアルロン酸誘導体水溶液を４１６．７μＬ加え、続いて、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で注射用水に溶解させたポリビニルアルコール（重合度５００、ナカライテスク社製、製品番号：１１７３８－６２）を５０μＬ加える。その後、合計１０００μＬとなる割合で注射用水を加えて調整した（表１４）。その後、２０℃、２ｈインキュベートしてからヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で５倍希釈してからＧＰＣ測定に供した。
［実施例１４－２］
　合成例３で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％）を６２．６ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。１．５ｍＬのエッペンチューブに６２．６ｍｇ／ｍＬの前記ヒアルロン酸誘導体水溶液を７９．９μＬ加え、続いて、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で注射用水に溶解させたポリビニルアルコール（重合度５００、ナカライテスク社製、製品番号：１１７３８－６２）を５０μＬ加える。その後、合計１０００μＬとなる割合で注射用水を加えて調整した（表１４）。その後、２０℃、２ｈインキュベートしてからヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で５倍希釈してからＧＰＣ測定に供した。
［実施例１４－３］
　合成例２で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３０％）を４０．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。１．５ｍＬのエッペンチューブに４０．０ｍｇ／ｍＬの前記ヒアルロン酸誘導体水溶液を１２５．０μＬ加え、続いて、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で注射用水に溶解させたポリビニルアルコール（重合度５００、ナカライテスク社製、製品番号：１１７３８－６２）を５０μＬ加える。その後、合計１０００μＬとなる割合で注射用水を加えて調整した（表１４）。その後、２０℃、２ｈインキュベートしてからヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で５倍希釈してからＧＰＣ測定に供した。
　ここで、ヒアルロン酸誘導体を含有しない条件で会合促進剤単独のＧＰＣピークも検証したが、会合促進剤であるＰＶＡ由来のピークはヒアルロン酸誘導体のピーク位置に一切検出されなかった。
［実施例１４－４～実施例１４－６］
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。さらに実施例１３－１で調製した１０ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０水溶液、１７０ｍｇ／ｍLのグリセロール水溶液、注射用水及び５．０ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ溶液を用いて会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を表１４の濃度となる割合で調整した。
　その後、２０℃、２４時間インキュベートしてからＧＰＣ測定に供した。
［実施例１４－７～実施例１４－８］
　合成例３で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％）を６２．６ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。さらに実施例１３－１で調製した１０ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０水溶液、１７０ｍｇ／ｍLのグリセロール水溶液、注射用水及び５．０ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ溶液を用いて会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を表１４の濃度となる割合で調整した。
その後、２０℃、２４時間インキュベートしてからＧＰＣ測定に供した。
［実施例１４－９～実施例１４－１１］
　合成例２で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３０％）を４０．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。さらに実施例１３－１で調製した１０ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０水溶液、１７０ｍｇ／ｍLのグリセロール水溶液、注射用水及び５．０ｍｇ／ｍＬＥＤＴＡ溶液を用いて会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を表１４の濃度となる割合で調整した。
その後、２０℃、２４時間インキュベートしてからＧＰＣ測定に供した。
［実施例１４－４～実施例１４－１１］
　何れも、ヒアルロン酸誘導体の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で５倍希釈してからＧＰＣ測定に供した。
　ここで、ヒアルロン酸誘導体を含有しない条件で会合促進剤単独のＧＰＣピークも検証したが、会合促進剤であるポリソルベート８０由来のピークはヒアルロン酸誘導体のピーク位置に一切検出されなかった。最終組成および会合促進度を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　この結果より、実施例１４－１～１４－３からヒアルロン酸誘導体の分子量違い、コレステリル基導入率違いについてもＰＶＡによる会合促進が認められた。従って、ナノ粒子内の疎水部分の拡大により、難溶性薬物の可溶化量増大や、生体内投与後の徐放期間延長の機能付与が期待できる。
　また、実施例１４－４～１４－１１の結果から、ヒアルロン酸誘導体は分子量違い、コレステリル基導入率違いのヒアルロン酸誘導体で、かつ、グリセロールやＥＤＴＡなど別の添加剤が含まれても会合促進を阻害することない結果が得られた。ＪＰ６２７１６７２Ｂ２にて、ＥＤＴＡがプロテアーゼ阻害剤の役割を担い、ＡＰＩの安定化剤として入れることができると言及されており、特許４７５８８９３号公報にはグリセロールを配合することにより、抗菌防腐の効力を向上させることが記載されている。このような防菌防腐剤やＡＰＩ安定化剤の元でも、会合促進剤がきちんと相互作用してヒアルロン酸誘導体の会合を促進する機能を有することが示された。その他の種々の緩衝液、防菌防腐剤や安定化剤中でも会合促進効果が期待され、ナノ粒子内の疎水部分の拡大により、難溶性薬物の可溶化量増大や、生体内投与後の徐放期間延長の機能付与が期待できる。
＜試験例１５＞
　セマグルチド（ペプチド）を用いたヒアルロン酸誘導体医薬組成物の調製を実施した。
[実施例１５－１]
　合成例１で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）を１２．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。その後、別のバイアルに１７０ｍｇ／ｍＬのグリセロール濃度となる割合で注射用水で溶解させた。さらに別のバイアルに、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ　８．０）（ナカライテスク社製）を用いて、５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ濃度となる割合で注射用水で希釈した。またさらに別のバイアルにポリソルベート８０を１０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で注射用水で希釈して調整した。上で調製した溶液を用いて、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液の調整を実施した。
　具体的には、１２．０ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸誘導体（３５ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）水溶液を４１６．７μＬ添加し、続いて、スターラーで攪拌しながら１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液を１００μＬ加え、１７０ｍｇ／ｍＬのグリセロール溶液を１５０μＬ添加した。その後、注射用水を３１８．３μＬと５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ溶液を１５μＬ添加して終夜で攪拌させた。また、セマグルチド（フナコシ社製、商品コード：ＡＧ－ＣＰ３－００３２）の粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度となるようエッペンチューブで１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、調製したあとに、前記会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液１５０μＬと１ｍｇ／ｍＬセマグルチド溶液１５０μＬで混合し、その後、２０℃、１時間インキュベートすることでセマグルチドとの複合化を促進させた。最終製剤の組成が表１５に記載の濃度となるよう調整した。
[実施例１５－２]
　合成例２で得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３０％）を４０．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に２０℃、２４時間攪拌させて溶解させた。その後、別のバイアルに１７０ｍｇ／ｍＬのグリセロール濃度となる割合で注射用水で溶解させた。さらに別のバイアルに、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ　８．０）（ナカライテスク社製）を用いて、５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ濃度となる割合で注射用水で希釈した。またさらに別のバイアルにポリソルベート８０を１０ｍｇ／ｍＬの濃度となる割合で注射用水で希釈して調整した。上で調製した溶液を用いて、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液の調整を実施した。
　具体的には、４０．０ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸誘導体１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３０％）水溶液を１２５μＬ添加し、続いて、スターラーで攪拌しながら１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０水溶液を１００μＬ加え、１７０ｍｇ／ｍＬのグリセロール溶液を１５０μＬ添加した。その後、注射用水を６１０μＬと５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ溶液を１５μＬ添加して終夜で攪拌させた。また、セマグルチド（フナコシ社製、商品コード：ＡＧ－ＣＰ３－００３２）の粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度となるようエッペンチューブで１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、調製したあとに、前記会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液１５０μＬと１ｍｇ／ｍＬセマグルチド溶液１５０μＬで混合し、その後、２０℃、１時間インキュベートすることでセマグルチドとの複合化を促進させた。最終製剤の組成が表１５に記載の濃度となるよう調整した。
　実施例１５－１～１５－２は全て、ヒアルロン酸誘導体が２．５ｍｇ／ｍＬ、セマグルチドは０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう調整された。実施例１５－１～１５－２について、セマグルチド複合化率を次に示すＧＰＣにて評価を行った。
[ＧＰＣ測定条件]
　装置：ＨＬＣ８３２０－ＧＰＣ（東ソー社製）
　カラム：Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製、粒子径８μｍ、内径７．８ｍｍ、長さ３０ｃｍ、品番：８５４２）
　溶離液：１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
　注入量：５０μＬ
　検出器：ＵＶ（２２０ｎｍ）
　温度：３０℃
　濃度が０．５０ｍｇ／ｍＬおよび０．２５ｍｇ／ｍＬであるセマグルチド単独のサンプルを調製し、ＧＰＣ測定に供した。この時、９．０分にセマグルチド単体のピークが確認された。ヒアルロン酸誘導体組成物に複合化され、取り込まれると、９．０分にあるセマグルチド単体のピーク面積値は減少した。ピーク面積の減少率により、ヒアルロン酸誘導体組成物が内包したセマグルチドの濃度をセマグルチド複合化率として算出した。上で算出したセマグルチド複合化率から、ヒアルロン酸誘導体が１００質量部に対する、（Ｃ）有効成分（セマグルチド）の実質量部を表１５に示した。
　この結果より、会合促進剤であるポリソルベート８０を含むヒアルロン酸誘導体組成物は効率的にペプチド医薬品であるセマグルチドを複合化した。ＪＰ６２７１６７２Ｂ２にて、ＥＤＴＡがプロテアーゼ阻害剤の役割を担い、ＡＰＩの安定化剤として入れることができると言及されているが、このような安定化剤の元でも、会合促進剤がきちんと相互作用しながらもヒアルロン酸誘導体に封入可能であることを示唆している。この結果より、ＣｙＡのような環状ペプチド医薬品以外にも長鎖のペプチド医薬品への適用により多くのモダリティについて長期徐放が可能になると推察された。さらには他の安定化剤やm-クレゾール、フェノール等の防腐剤や、別の等張化剤としてＤ－マンニトールやプロプレングリコールなども活用できると考えられる。
　以上より、セマグルチドとの複合化も会合促進剤存在下で効率的に行われ、かつ生体内で長期徐放可能な長鎖ペプチド－ヒアルロン酸誘導体医薬組成物が取得できるものと期待される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
＜ヒアルロン酸誘導体の合成＞
［合成例１Ｂ］
　ヒアルロン酸誘導体を次の工程１Ｂ～工程３Ｂに従って調製した。
［工程１Ｂ］
（コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成）
　コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）を次に示す工程１Ｂ－１、続いて工程１Ｂ－２に従って合成した。
（工程１Ｂ－１）
　コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温（２５℃程度）まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４）で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
（工程１Ｂ－２）
　得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温（２５℃程度）で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）１．２ｇを得た。
［工程２Ｂ］
（ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の調製）
　ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を次に示す工程２Ｂ－１、続いて工程２Ｂ－２に従って調製した。
（工程２Ｂ－１）
　ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０質量％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間撹拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
（工程２Ｂ－２）
　分子量１０，０００（１０ｋＤａ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。「工程２Ｂ－１」でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。
［工程３Ｂ］
　「工程２Ｂ－２」で調製したＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、「工程１Ｂ」で合成したＨＡ－ＴＢＡ中に存在する二糖繰り返し単位（ＨＡユニット）に対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量がモル比で４４／１００となるよう添加した。次に、ＨＡユニットに対する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）の添加量がモル比で４８／１００となるよう加え、室温（２５℃程度）で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：３，５００）した。得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおいて、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認され、コレステロール導入率は４４％であった。
＜試験例１Ｂ＞
［実施例１Ｂ－１］
　ヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を用い、難水溶性ペプチドであるシクロスポリン（ＣｙＡ）を粉末から製剤化した。
［水溶液（ＩＩ）を得る工程］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。これにより水溶液（ＩＩ）であるヒアルロン酸誘導体水溶液を得た。
［分散液（Ｉ）を得る工程］
　別のバイアルに、ポリソルベート８０を１０ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で希釈した。
　さらに別のバイアルに、粉末のＣｙＡ（東京化成工業社製、製品番号：Ｃ２４０８）を４．０ｍｇ秤量し、その後、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を８０μＬ添加した。これにより、分散液（Ｉ）として、ＣｙＡがポリソルベート８０に分散したＣｙＡ分散液を得た。
［混合工程］
　バイアルにスターラーチップを入れて攪拌しながら、水溶液（ＩＩ）であるヒアルロン酸誘導体水溶液を０．３０ｍＬ添加した後に、液量が０．６５０ｍＬとなる割合で、ＣｙＡ分散液を添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。最終的な製剤組成を表１６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　その後、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を後述するＨＰＬＣ測定にて定量した。ろ過後の製剤中のＣｙＡ濃度は表１７に示す。
［ＨＰＬＣ定量条件：逆相クロマトグラフィー分析条件］
カラム　：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ　Ｃ１８　粒子径５μｍ×内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相　：溶離液Ａ　０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
　　　　　溶離液Ｂ　０．１％ＴＦＡ／水
移動相比：溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９：１
流速　　：１ｍＬ／分
注入量　：３０μＬ
検出器　：ＵＶ（２１０ｎｍ）
［実施例１Ｂ－２～実施例１Ｂ－１１］
　可溶化助剤の種類と添加量を変更する以外は実施例１Ｂ－１と同様な手順にて、ヒアルロン酸誘導体と可溶化助剤を用いて、ＣｙＡの製剤化を行った。各製剤に対して、添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表１７～１８にそれぞれ示す。
［比較例１Ｂ－１］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。
　別のバイアルに、粉末のＣｙＡを４．０ｍｇ秤量し、その後、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．３０ｍＬ添加した。バイアルにスターラーチップを入れて、液量が０．６５０ｍＬになるよう注射用水を添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。ろ液は全て透明であることを確認した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表４に示す。
［比較例１Ｂ－２］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。
　別のバイアルに、粉末のＣｙＡを４．０ｍｇ秤量し、その後、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．１７８３ｍＬ添加した。バイアルにスターラーチップを入れて、液量が０．６５０ｍＬになるよう注射用水を添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。ろ液は全て透明であることを確認した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表１９に示す。
［比較例１Ｂ－３］
　合成例１Ｂで使用した分子量１０，０００（１０ｋＤａ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を５５ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。その後、ポリソルベート２０、ヒアルロン酸ナトリウムを表４に記載の濃度となるよう適宜注射用水で希釈して水溶液を調製した。
　別のバイアルに、粉末のＣｙＡを４．０ｍｇ秤量し、その後、上記ポリソルベート２０含有のＨＡ－Ｎａ水溶液を０．６５ｍＬ添加した。バイアルにスターラーチップを入れて、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度をＨＰＬＣ測定にて定量した。添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表１９に示す。
［比較例１Ｂ－４］
　ポリソルベート８０を１００ｍｇ／ｍＬとなる割合で注射用水で希釈した。
　別のバイアルに、粉末のＣｙＡを４．０ｍｇ秤量し、その後、上記１００．０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を０．６５ｍＬ添加した。バイアルにスターラーチップを入れて、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表１９に示す。
［比較例１Ｂ－５～１Ｂ～１２］
　可溶化助剤の濃度は下表に記載した濃度を用い、それ以外は比較例１Ｂ－４又は実施例１Ｂ－１と同様な手順で製剤化、薬物濃度の定量を行った。結果を表１９～２０に示す。
　比較例１Ｂ－９で用いたＳｐａｎ８３は東京化成工業社製、比較例１Ｂ－１０～１Ｂ－１２で用いたショ糖ステアリン酸エステルは三菱ケミカル社製の試薬を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　上記表１７～１８に示すように、難水溶性薬物を製剤化する際に、有機溶剤を使用せずに可溶化することができ、従来の毒性が高いポリソルベート８０やクレモフォールＥＬなどの可溶化剤の使用量を低減でき、さらに、可溶化助剤により、前記ヒアルロン酸誘導体のステリル基同士の疎水性相互作用を促進させ、結果的にヒアルロン酸誘導体が有する疎水部領域の拡大によって疎水的な薬物の担持量を増加させ、さらにヒアルロン酸ポリマーに化学結合で束縛されている疎水部だけでなく、ヒアルロン酸誘導体組成物内部での可溶化助剤が移動度の高い疎水部領域として働くことで、粉末状の薬物を高濃度で可溶化することができるものと推察される。この結果、一般的には可溶化剤の添加量に比例して難水溶性薬物の可溶化量は増大するが、本発明においては可溶化剤の総質量が低減されるにもかかわらず、有効成分の高濃度製剤を調製できる。
　比較例１Ｂ－１および１Ｂ－２では、ヒアルロン酸誘導体の濃度が９．８８ｍｇ／ｍＬにおいては製剤中のＣｙＡ濃度は０．６８ｍｇ／ｍＬであった。さらにヒアルロン酸誘導体を高濃度化して３６ｍｇ／ｍＬで製剤化した場合においても多少の改善効果しか認められず、製剤中のＣｙＡ濃度が３．５７ｍｇ／ｍＬであった。
　比較例１Ｂ－３では疎水性基が修飾されていないヒアルロン酸では可溶化助剤による相乗効果は認められなかった。
　比較例１Ｂ－４～１Ｂ－８は可溶化助剤単独の可溶化能であるが、ヒアルロン酸誘導体単独の可溶化能を足し合わせた薬物濃度と比較した場合に、本発明における実施例は大幅に難水溶性薬物の溶解度を向上させることができる。
　さらに、可溶化助剤の構造について鋭意検討したところ、比較例１Ｂ－９～１Ｂ－１２は何れも炭素数４以上を満たすが、エーテル構造を１つ又は３つのみ有する可溶化助剤である。これらは何れも薬物および可溶化助剤がヒアルロン酸誘導体中で安定に溶解できずにろ過が殆ど困難であった。
　以上の結果より、ヒアルロン酸誘導体とエーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす可溶化助剤からなる組成物は粉末から有機溶剤を全く使用せず、可溶化剤の濃度を低減させても難水溶性薬物の可溶化能を大幅に向上させ、簡便な製剤化方法と毒性の低い医薬組成物を提供可能である。
＜試験例２Ｂ＞
［実施例２Ｂ－１～２Ｂ－１２］
　可溶化助剤の添加量を詳細に検証した。
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を５ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう注射用水で溶解させた。別のバイアルに、粉末のＣｙＡを１．０ｍｇ秤量し、製剤中の最終組成の可溶化助剤濃度が表２１に記載の濃度となるよう０．２ｍＬ添加してスターラーチップを入れて攪拌させた。
　続いて、上記５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を攪拌しながら０．８ｍＬ添加し、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２１に示す。
［比較例２Ｂ－１］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を５ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう注射用水で溶解させた。別のバイアルに、粉末のＣｙＡを１．０ｍｇ秤量し、製剤中の最終組成の可溶化助剤濃度が表２１に記載の濃度となるよう濃度１０ｍｇ／ｍＬのステアロイル乳酸ナトリウム水溶液を０．１ｍＬ添加してスターラーチップを入れて攪拌させた。
　続いて、上記５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を攪拌しながら０．８ｍＬ添加した後に、注射用水を０．１ｍＬ添加し、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２１に示す。
［比較例２Ｂ－２～２Ｂ－６］
　バイアルに、粉末のＣｙＡを１．０ｍｇ秤量し、製剤中の最終組成の可溶化助剤濃度が表２１に記載の濃度となるよう０．２ｍＬ添加してスターラーチップを入れて攪拌させた。　続いて、注射用水を攪拌しながら０．８ｍＬ添加し、２４時間攪拌させ、可溶化助剤のみで薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　上記の結果から、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす可溶化助剤においては、実施例２Ｂ－１～２Ｂ－１３にあるように製剤中の薬物濃度を向上させた。一方で、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含まない可溶化助剤の一つであるステアロイル乳酸ナトリウムでは可溶化効果が殆ど認められなかった。
　また比較例２Ｂ－２～２Ｂ－６では可溶化助剤自体には可溶化能が殆ど無いことを確認した。これらの結果より、ヒアルロン酸誘導体に少量の可溶化助剤を添加することで可溶化能を大幅に向上できる。
　上記表２１に示すように、可溶化助剤はヒアルロン酸誘導体が１００質量部に対し、０．００３質量部以上を添加するだけで粉末から有機溶剤を使用せずに可溶化能を向上させる。
＜試験例３Ｂ＞
［実施例３Ｂ－１～３Ｂ－１４］
　次に、使用可能な可溶化助剤を詳細に検証した。
　具体的には、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも５以上含み、かつ炭素数１２以上である、ポリエチレングリコール３００及びポリエチレングリコール４００が可溶化助剤として使用可能であるか否か検証した。
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を８ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう注射用水で溶解させた。別のバイアルに、粉末のＣｙＡを１．６ｍｇ秤量し、可溶化助剤および注射用水を合わせて０．５ｍＬとなるよう添加してスターラーチップを入れて攪拌させた。この時、最終的に得られるヒアルロン酸誘導体医薬組成物中の可溶化助剤濃度が下表７の通りになるよう調整した。
　続いて、上記８ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を攪拌しながら０．５ｍＬ添加し、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２２に示す。
［比較例３Ｂ－１～３Ｂ－６］
　バイアルに、粉末のＣｙＡを１．０ｍｇ秤量し、可溶化助剤および注射用水を合わせて０．５ｍＬとなるよう添加してスターラーチップを入れて攪拌させた。この時、最終的に得られる可溶化助剤を含む医薬組成物中の可溶化助剤濃度が下表２２の通りになるよう調整した。
　続いて、注射用水を攪拌しながら０．５ｍＬ添加し、２４時間攪拌させ、可溶化助剤のみで薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
上記の結果より、ポリエチレングリコール３００やポリエチレングリコール４００においても、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす可溶化助剤においては、実施例３Ｂ－１～３Ｂ－１４にあるように製剤中の薬物濃度を向上させた。ヒアルロン酸誘導体単体と可溶化助剤単体の可溶化量の総和よりもさらに高濃度で有効成分を可溶化でき、相乗的な効果が示された。
＜試験例４Ｂ＞
［実施例４Ｂ－１］
　次に、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法の詳細な検証を実施した。
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。別のバイアルに、ポリソルベート８０を１０ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水で希釈した。
　またさらに別のバイアルに、粉末のＣｙＡを４．０ｍｇ秤量し、その後、１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を１６０μＬ添加した。バイアルにスターラーチップを入れて攪拌しながら、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．３０ｍＬ添加した後に、液量が０．６５０ｍＬとなるよう注射用水を添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。最終的な製剤組成を表２３に示した。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２３に示す。
［実施例４Ｂ－２］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。別のバイアルに、ポリソルベート８０を１０ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水で希釈した。
　その後、別のバイアルに１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を３２０μＬ添加し、バイアルにスターラーチップを入れて攪拌しながら、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．６０ｍＬ添加した後に、液量が１．３０ｍＬとなるよう注射用水を添加した。またさらに別のバイアルに、粉末のＣｙＡを４．０ｍｇ秤量し、上記可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体を０．６５ｍＬ添加し、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。最終的な製剤組成を表２０に示した。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　前記有効成分を可溶化助剤に分散させる工程（Ｉ）と、前記ヒアルロン酸誘導体水溶液又は前記可溶化剤含有ヒアルロン酸水溶液を調製する工程（ＩＩ）を含み、（Ｉ）と（ＩＩ）を混合する工程で調製する製剤化方法と、前記有効成分を可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液と混合する工程で調製する製剤化方法の何れの方法でも粉末から難水溶性有効成分の水に対する溶解性を高めることに優れるヒアルロン酸誘導体医薬組成物が得られることがわかった。また本製造方法は可溶化助剤がポリソルベート８０以外についても同様に、混合方法に大きくは依存せず、高い可溶化能が期待される。
＜試験例５Ｂ＞
［実施例５Ｂ－１］
　次に、難水溶性薬物の種類について検証を実施した。
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を、濃度が３６．０ｍｇ／ｍＬとなる割合で、注射用水に溶解させた。
　またさらに別のバイアルに、粉末のパクリタキセル（東京化成工業社製）を１．１ｍｇ秤量し、その後、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．４０ｍＬ添加した。バイアルにスターラーチップを入れて攪拌しながら、その後、注射用水を０．４０ｍL添加し、続けて１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を２００μＬ添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。最終的な製剤組成を表２４に示した。続いて、０．２２μｍの滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したパクリタキセルを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定により定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２４に示す。
［実施例５Ｂ－２］
　難水溶性薬物をパクリタキセルではなく、フルチカゾンプロピオン酸エステル（東京化成工業社製）に変更した以外は実施例５Ｂ－１と同様の手順で製剤調製を行った。
［比較例５Ｂ－１］
　可溶化助剤を添加しない以外は、実施例５Ｂ－１と同様の手順で製剤調製を行った。
［比較例５Ｂ－２］
　可溶化助剤を添加しない以外は、実施例５Ｂ－２と同様の手順で製剤調製を行った。
［比較例５Ｂ－３］
　ヒアルロン酸誘導体を添加しない以外は、実施例５Ｂ－１と同様の手順で製剤調製を行った。
［比較例５Ｂ－４］
　ヒアルロン酸誘導体を添加しない以外は、実施例５Ｂ－２と同様の手順で製剤調製を行った。
　実施例５Ｂ－１～５Ｂ－２、比較例５Ｂ－１～５Ｂ－４について、添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　上記の結果から、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす可溶化助剤においては、実施例５Ｂ－１～５Ｂ－２にあるように製剤中の薬物濃度を向上させた。一方で、比較例５Ｂ－３～５Ｂ－４では可溶化助剤単独では難水溶性薬物の可溶化能が殆ど無いことを確認した。これらの結果より、低分子の難水溶性薬物においてもヒアルロン酸誘導体に少量の可溶化助剤を添加することで可溶化能を大幅に向上できる。
［実施例６Ｂ－１］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。別のバイアルに、コレステロール－ＰＥＧ６００（Ａｌｄｒｉｃｈ社製：Ｃ１１４５－２５０ＭＧ）を１０ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水で希釈した。
　その後、別のバイアルに１０ｍｇ／ｍＬのコレステロール－ＰＥＧ６００を４００μＬ添加し、バイアルにスターラーチップを入れて攪拌しながら、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．６０ｍＬ添加した。またさらに別のバイアルに、粉末のテムシロリムス（東京化成工業社製、製品番号：Ｔ３５７４）を５．０ｍｇ秤量し、上記可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体を０．５ｍＬ添加し、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。最終的な製剤組成を表Ｘ１に示した。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したテムシロリムスを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２５に示す。
［比較例６Ｂ－１］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。
　別のバイアルに、テムシロリムス（東京化成工業社製、　製品番号：Ｔ３５７４）を５．０ｍｇ秤量し、その後、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．３０ｍＬ添加した。バイアルにスターラーチップを入れて、液量が０．５０ｍＬになるよう注射用水を添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したテムシロリムスを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。ろ液は全て透明であることを確認した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２６に示す。
［比較例６Ｂ－２］
　バイアルに、テムシロリムス（東京化成工業社製、　製品番号：Ｔ３５７４）を５．０ｍｇ秤量し、その後、バイアルにスターラーチップを入れて、１０ｍｇ／ｍＬのコレステロール－ＰＥＧ６００を２００μＬ添加し、液量が０．５０ｍＬになるよう注射用水を添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したテムシロリムスを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。ろ液は全て透明であることを確認した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
上記の結果より、コレステロール－ＰＥＧ６００においても、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす可溶化助剤においては、実施例６Ｂ－１にあるように製剤中の薬物濃度を向上させた。ヒアルロン酸誘導体単体と可溶化助剤単体の可溶化量の総和よりもさらに高濃度で有効成分を可溶化でき、相乗的な効果が示された。
［実施例７Ｂ－１］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。別のバイアルに、コレステロール－ＰＥＧ６００（Ａｌｄｒｉｃｈ社製：Ｃ１１４５－２５０ＭＧ）を１０ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水で希釈した。
　その後、別のバイアルに１０ｍｇ／ｍＬのコレステロール－ＰＥＧ６００を４００μＬ添加し、バイアルにスターラーチップを入れて攪拌しながら、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．６０ｍＬ添加した。またさらに別のバイアルに、粉末のＣｙＡを４．０ｍｇ秤量し、を５．０ｍｇ秤量し、上記可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体を０．５ｍＬ添加し、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。最終的な製剤組成を表Ｙ１に示した。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２６に示す。
［実施例７Ｂ－２］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。別のバイアルに、コレステロール－ＰＥＧ６００（Ａｌｄｒｉｃｈ社製：Ｃ１１４５－２５０ＭＧ）を１０ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水で希釈した。
　その後、粉末のＣｙＡを１０．０ｍｇ秤量し、続いて上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．６０ｍＬ添加したのちに、バイアルにスターラーチップを入れて攪拌しながら、１０ｍｇ／ｍＬのコレステロール－ＰＥＧ６００水溶液を４０μＬ添加し、注射用水を３６０μL加えた。その後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。最終的な製剤組成を表２６に示した。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２６に示す。
［実施例７Ｂ－３］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。別のバイアルに、ＨＰ－β－ＣＤ（東京化成工業社製：Ｈ０９７９）を１０ｍｇ／ｍＬとなるよう注射用水で希釈した。
　その後、粉末のＣｙＡを１０．０ｍｇ秤量し、続いて上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．６０ｍＬ添加したのちに、バイアルにスターラーチップを入れて攪拌しながら、１０ｍｇ／ｍＬのＨＰ－β－ＣＤ水溶液を２７２．２μＬ添加した。その後、注射用水を１２７．８μL添加し、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。最終的な製剤組成を表Ｙ１に示した。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２６に示す。
［比較例７Ｂ－１］
　合成例１Ｂで得た凍結乾燥品のヒアルロン酸誘導体（１０ｋ　ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４４％）を３６．０ｍｇ／ｍＬで注射用水に溶解させた。
　別のバイアルに、粉末のＣｙＡを１０．０ｍｇ秤量し、その後、上記３６．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を０．６０ｍＬ添加した。バイアルにスターラーチップを入れて、液量が１．００ｍＬになるよう注射用水を添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。ろ液は全て透明であることを確認した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２６に示す。
［比較例７Ｂ－２］
　バイアルに、粉末のＣｙＡを１０．０ｍｇ秤量し、その後、バイアルにスターラーチップを入れて、１０ｍｇ／ｍＬのコレステロール－ＰＥＧ６００を４００μＬ添加し、液量が１．０ｍＬになるよう注射用水を添加した。この後、２４時間攪拌させて薬物の可溶化を行った。続いて、０．４５μｍ滅菌ろ過フィルターでろ過し、析出したＣｙＡを除去し、製剤中の薬物濃度を実施例１Ｂ－１と同様にＨＰＬＣ測定にて定量した。ろ液は全て透明であることを確認した。
　添加した量から算出される製剤中の理論濃度およびＨＰＬＣ測定で定量した実際の製剤中の薬物濃度結果を表２６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
上記の結果より、コレステロール－ＰＥＧ６００やＨＰ－β－ＣＤにおいても、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす可溶化助剤においては、実施例７Ｂ－１～７Ｂ－３にあるように製剤中の薬物濃度を向上させた。ヒアルロン酸誘導体単体と可溶化助剤単体の可溶化量の総和よりもさらに高濃度で有効成分を可溶化でき、相乗的な効果が示された。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体医薬組成物によれば、多量の薬剤を粉末から可溶化でき、可溶化量を最大化すること、かつ皮下でゲル化したヒアルロン酸誘導体組成物内からの有効成分の放出速度を制御し、長期間に渡って有効成分を徐放することに優れるヒアルロン酸誘導体を用いた医薬組成物が得られる。

Claims (40)

  1. 　（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、
    　（Ｂ）会合促進剤と、
    　（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  2. 　前記（Ｂ）会合促進剤はエーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たす、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  3. 　前記（Ｂ）会合促進剤が、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー、オキシエチレンヒマシ油、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール４０００、脂肪酸ソルビタンエステル、トコフェリルポリエチレングリコールスクシネート並びにポリビニルアルコールから成る群から選択される１種以上である、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  4. 　生理塩濃度下で沈殿物が生じる、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  5. 　前記（Ｃ）有効成分は、タンパク質または難水溶性薬物から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  6. 　前記難水溶性薬物は水への溶解度が１ｍｇ／ｍＬ以下である請求項５に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  7. 　前記難水溶性薬物は分子量２００以上である請求項５に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  8. 　前記難水溶性薬物は難水溶性ペプチドである、請求項５に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  9. 　前記難水溶性ペプチドは、アミド結合を構成する窒素原子の少なくとも１つがメチル基を有する、請求項８に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  10. 　前記難水溶性ペプチドは環状ペプチド、長鎖ペプチドから選択される少なくとも一つ以上を含む、請求項８に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  11. 　前記難水溶性ペプチドは環状ペプチドである請求項８に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  12. 　１００質量部の前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する前記（Ｃ）有効成分の含有量は、１０質量部以上１００質量部以下である、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  13. 　前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有する、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基である。Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表す。
    　Ｘ１は、－ＮＲｂ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｓ－Ｒ、－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び－Ｓ－Ｓ－Ｒ、で表される基からなる群より選択される基である。
    　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
    　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｆのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
    　Ｒは、ステリル基である。
    　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－である。ここで、Ｙのアルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
    　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｇのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
    　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンである。
    　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンである。
    　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
  14. 　前記ステリル基はコレステリル基である、請求項１３に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  15. 　前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が７％以上３５％未満である、請求項１３に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  16. 　前記ヒアルロン酸誘導体医薬組成物は目視で析出物が観察されない、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  17. 　ろ過滅菌可能である、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  18. （Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法であって、
    　前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、前記（Ｂ）会合促進剤とを混合し、会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を得る工程と、
    　前記（Ｃ）有効成分と前記会合促進剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液と混合する混合工程と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法。
  19. （Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）会合促進剤と、（Ｃ）有効成分と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法であって、
    　前記（Ｃ）有効成分を前記（Ｂ）会合促進剤に分散させ、分散液（Ｉ）を得る工程と、　ヒアルロン酸誘導体水溶液又は会合促進剤含有ヒアルロン酸水溶液を調製し、水溶液（ＩＩ）を得る工程を含み、
    　前記分散液（Ｉ）と水溶液（ＩＩ）とを混合する工程と、を含む、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法。
  20. 　有機溶剤を除去する工程を含まない、請求項１８又は１９に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物の製造方法。
  21. 　（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、
    　（Ｂ）可溶化助剤と、
    　（Ｃ）有効成分と、を含み、
    　前記（Ｂ）可溶化助剤は、エーテル構造（Ｒ－Ｏ－Ｒ）を少なくとも４つ以上含み、かつ炭素数４以上を満たし、
    　１００質量部の前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、前記（Ｂ）可溶化助剤の含有量が０．０００１質量部以上１５０００質量部以下である、ヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  22. 　前記（Ｂ）可溶化助剤が、非イオン界面活性剤、分子量１９０ｇ／ｍｏＬ以上４０００ｇ／ｍｏＬ以下のポリエチレングリコール、シクロデキストリン誘導体、から成る群から選択される１種以上である、請求項２１に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  23. 　前記（Ｂ）可溶化助剤が、ポリソルベート８０、ポリソルベート６５、ポリソルベート６０、ポリソルベート４０、ポリソルベート２０、ポロキサマー、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、シクロデキストリン誘導体、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール４０００、並びにトコフェリルポリエチレングリコールスクシネートから成る群から選択される１種以上である、請求項２１又は２２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  24. 　前記（Ｂ）可溶化助剤が非イオン界面活性剤であり、
    　１００質量部の前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、前記非イオン界面活性剤の含有量が０．０００１質量部以上１５０質量部以下である、請求項２１又は２２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  25. 　前記（Ｂ）可溶化助剤が分子量１９０ｇ／ｍｏＬ以上４０００ｇ／ｍｏＬ以下のポリエチレングリコールであり、
    　１００質量部の前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、前記ポリエチレングリコールの含有量が２５質量部以上１５０００質量部以下である、請求項２１又は２２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  26. 　前記（Ｃ）有効成分は、水への溶解度が１ｍｇ／ｍＬ以下の難水溶性薬物である、請求項２１又は２２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  27. 　前記難水溶性薬物は分子量が２００以上である、請求項２６に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  28. 　前記難水溶性薬物は難水溶性ペプチドである、請求項２６に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  29. 　前記難水溶性ペプチドは、アミド結合を構成する窒素原子の少なくとも１つがメチル基を有する、請求項２８に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  30. 　前記難水溶性ペプチドは、環状ペプチド及び長鎖ペプチドから選択される少なくとも一つ以上を含む、請求項２８に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  31. 　前記難水溶性ペプチドは環状ペプチドである、請求項２８に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  32. 　１００質量部の前記（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体に対する、前記難水溶性薬物の配合量は、２１質量部以上１００質量部未満である、請求項２６に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  33. 　前記ヒアルロン酸誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上有する、請求項２１又は２２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基である。Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表す。
    　Ｘ１は、－ＮＲｂ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｓ－Ｒ、－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び－Ｓ－Ｓ－Ｒ、で表される基からなる群より選択される基である。
    　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
    　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｆのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
    　Ｒは、ステリル基である。
    　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－である。ここで、Ｙのアルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
    　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基である。Ｒｇのアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよい。
    　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンである。
    　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンである。
    　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
  34. 　前記ステリル基がコレステリル基である、請求項３３に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  35. 　前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が３５％以上５０％未満である、請求項３３に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  36. 　前記ヒアルロン酸誘導体医薬組成物に対する前記ヒアルロン酸誘導体の含有量が６ｍｇ／ｍＬ以上４５ｍｇ／ｍＬ未満である、請求項２１又は２２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  37. 　前記ヒアルロン酸誘導体医薬組成物に対する有機溶剤の含有量が０．８％未満である、請求項２１又は２２に記載のヒアルロン酸誘導体医薬組成物。
  38. 　（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）可溶化助剤と、（Ｃ）有効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、
    　（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）可溶化助剤とを混合し、可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液を得る工程と、
    　前記（Ｃ）有効成分を前記可溶化助剤含有ヒアルロン酸誘導体水溶液と混合する混合工程と、を含む、医薬組成物の製造方法。
  39. 　（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）可溶化助剤と、（Ｃ）有効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、
    　前記（Ｃ）有効成分を前記（Ｂ）可溶化助剤に分散させ、分散液（Ｉ）を得る工程と、　ヒアルロン酸誘導体水溶液又は可溶化剤含有ヒアルロン酸水溶液を調製し、水溶液（ＩＩ）を得る工程を含み、
    　前記分散液（Ｉ）と前記水溶液（ＩＩ）とを混合する工程と、を含む、医薬組成物の製造方法。
  40. 　（Ａ）疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）可溶化助剤と、（Ｃ）有効成分と、を含有する、医薬組成物の製造方法であって、
    　有機溶剤を除去する工程を含まないことを特徴とする、請求項３８又は３９に記載の医薬組成物の製造方法。
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