WO2024035191A1 - 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 - Google Patents

케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 Download PDF

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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present application relates to a microorganism producing L-valine comprising a ketol acid reductoisomerase variant, a polynucleotide encoding the variant of the present application, a ketol acid reductoisomerase variant of the present application or a polynucleotide encoding the same, and
  • the present application relates to a method for producing L-valine using microorganisms.
  • L-amino acid is the basic building block of protein and is used as an important material for pharmaceutical ingredients, food additives, animal feed, nutrients, pesticides, and disinfectants.
  • branched chain amino acids BCAA
  • BCAA branched chain amino acids
  • the branched chain amino acids have antioxidant effects and promote protein synthesis in muscle cells. There is.
  • branched chain amino acids using microorganisms is mainly carried out by microorganisms of the genus Corynebacterium, and is known to be biosynthesized from pyruvic acid through several steps. [APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2010, p. 8053-8061].
  • the production of branched chain amino acids through microorganisms has the problem that industrial mass production is not easy.
  • One purpose of the present application is to provide a ketolic acid reductoisomerase variant in which the amino acid corresponding to position 87 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with valine (V) or aspartate (D).
  • Another object of the present application is to provide polynucleotides encoding the variants of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a variant of the present application or a microorganism containing a polynucleotide encoding the variant of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing L-valine, comprising culturing the microorganism of the present application in a medium.
  • Another object of the present application is to provide a composition for producing L-valine containing the microorganism of the present application, a medium culturing the microorganism of the present application, or a combination of two or more thereof.
  • ketolic acid reductoisomerase variant wherein the amino acid corresponding to the 87th position of SEQ ID NO: 1 is replaced with another amino acid.
  • ketolic acid reductoisomerase variant refers to any polypeptide having ketolic acid reductoisomerase activity or the 87th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 in ketolic acid reductoisomerase. refers to a variant containing the substitution of the corresponding amino acid with another amino acid.
  • variants of the present application may also be described as “ketolic acid reductoisomerase variant,” “(variant) polypeptide with ketolic acid reductoisomerase activity,” and “IlvC variant.”
  • Ketol-acid reductoisomerase refers to an enzyme also referred to as “acetohydroxy acid isomeroreductase”, “KARI”, and “AHAIR”.
  • -It is an enzyme involved in the biosynthesis of branched chain amino acids.
  • the ketolic acid reductoisomerase can be classified as EC 1.1.1.86.
  • acetohydroxy acid synthase catalyzes the decarboxylation of pyruvate and the condensation reaction with other pyruvate molecules to form acetolactate, a precursor of valine. It can produce acetolactate or catalyze the decarboxylation of pyruvic acid and the condensation reaction with 2-ketobutyrate to produce acetohydroxybutyrate, a precursor of isoleucine.
  • Ketolic acid reductoisomerase uses acetolactic acid or acetohydroxybutyrate as a substrate to proceed with a reaction that can produce L-valine, L-leucine, and L-isoleucine.
  • ketolic acid reductoisomerase converts 2-aceto-2-hydroxybutyrate into 2,3-dihydroxy-3-methyl valerate (2,3-dihydroxy- 3-methylvalerate), or 2-acetolactate can be converted to 2,3-dihydroxyisovalerate.
  • the 2,3-dihydroxy-3-methylvalerate is produced by dihydroxy acid dehydratase and transaminase B. Through a catalyzed reaction, L-isoleucine is produced.
  • 2-ketoisovalerate (2- ketoisovalerate) is produced, and 2-ketoisovalerate is converted to L-valine by transaminase B, or converted to 2-ketoisocaproate and then converted to L- through enzymatic conversion. It can be converted to leucine. Therefore, ketolic acid reductoisomerase is an important enzyme in the production of branched chain amino acids, including L-valine, L-leucine and L-isoleucine.
  • the amino acid sequence of ketol acid reductoisomerase of the present application may be the amino acid sequence encoded by the ilvC gene, and may also be referred to as “IlvC protein.”
  • the amino acid sequence of ketol acid reductoisomerase of the present application can be obtained from NCBI's GenBank, a known database.
  • the ketolic acid reductoisomerase may be a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the ketolic acid reductoisomerase may be derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, for example, it may be derived from Corynebacterium glutamicum.
  • Examples include WP_003854117.1, 6JX2_A, HJE10081.1, WP_059289140.1, WP_060564426.1, WP_006286981.1, WP_096455581.1, WP_066565326.1, WP_015651057. 1, WP_053544709.1, WP_006769331.1, BAC18177.1, WP_156227806. 1, WP_191733749.1, WP_042621277.1, WP_126119396.1, NLZ56857.1 or WP_015400720.1, but is not limited thereto, and includes without limitation a sequence having the same ketol acid reductoisomerase activity as the amino acid sequence. can do.
  • the ketolic acid reductoisomerase of the present application has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% thereof. It may be a protein containing an amino acid sequence having more than 99% homology or identity. In addition, if it is an amino acid sequence that has such homology or identity and shows efficacy corresponding to the protein, proteins with amino acid sequences in which part of the sequence is deleted, modified, substituted, or added are also included within the scope of the protein that is the subject of mutation in the present application. is self-explanatory.
  • ketol acid reductoisomerase which is subject to mutation
  • a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 but meaningless sequences are added before or after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or can occur naturally. Mutation or its silent mutation is not excluded, and if it has the same or corresponding activity as the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, it applies to the ketolic acid reductoisomerase of the present application. It is obvious to those skilled in the art.
  • homology refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or base sequences and can be expressed as a percentage.
  • homology and identity can often be used interchangeably.
  • sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and may be used with a default gap penalty established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing to all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes hybridization with a polynucleotide containing a common codon or a codon taking codon degeneracy into account.
  • Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity, or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: It can be determined using a known computer algorithm such as the "FASTA” program using default parameters as in 2444. Or, as performed in the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later), It can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
  • a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) the unitary comparison matrix (containing values 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: Weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) permutation matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10 and a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps. Accordingly, the term “homology” or “identity” used in this application refers to the relationship between sequences.
  • variants or modified polypeptide refers to a sequence in which one or more amino acids are modified by conservative substitution and/or modification of the recited sequence. ), but refers to a protein that maintains the functions or properties of the protein.
  • the variant differs from the identified sequence by several amino acid substitutions, deletions, or additions.
  • Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein and evaluating the properties of the modified protein. In other words, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the native protein.
  • some variants may include variant polypeptides in which one or more parts, such as the N-terminal leader sequence or transmembrane domain, have been removed.
  • Other variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • the term "variant” or “variant polypeptide” may be used interchangeably with terms such as variant, modification, mutated protein, mutation, etc. (English expressions include modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant, etc.). , if the term is used in a modified sense, it is not limited thereto.
  • conservative substitution means replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Typically, conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the resulting polypeptide.
  • the variant may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities.
  • conservative substitutions may generally occur based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and/or amphipathic nature of the residues.
  • Examples of this classification include positively charged (basic) amino acids: arginine, lysine, and histidine; Negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and aspartate; Amino acids with nonpolar side chains (nonpolar amino acids) include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline; Amino acids with polar or hydrophilic side chains (polar amino acids) can be classified into serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • arginine, lysine, histidine, glutamic acid, and aspartate are amino acids that have electrically charged side chains (electrically charged amino acids), and amino acids that have uncharged side chains (also referred to as neutral amino acids). It can be classified into glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine. As another example, phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be classified as aromatic amino acids.
  • valine, leucine, and isoleucine can be classified as branched amino acids.
  • 20 types of amino acids are classified according to size, starting from the amino acid group with relatively small volume; glycine, alanine, serine; Cysteine, proline, threonine, aspartate, asparagine; Valine, histidine, glutamic acid, glutamine; Isoleucine, leucine, methionine, lysine, arginine; and phenylalanine, tryptophan, and tyrosine.
  • variants may include deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • the polypeptide can be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein that is involved in the transfer of the protein co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
  • the variant of the present application is a ketolic acid reductoisomerase in which the amino acid corresponding to the 87th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 1, among the above-described ketolic acid reductoisomerases, is substituted with a different amino acid. It may be a variant or variant polypeptide having ketolic acid reductoisomerase activity.
  • the variant may be capable of increasing L-valine production compared to the unmutated protein, wild-type protein, native polypeptide, or unmodified polypeptide.
  • 'substitution with another amino acid' is not limited as long as it is an amino acid that is different from the amino acid before substitution. Meanwhile, in the present application, when it is expressed that 'a specific amino acid is substituted', it is obvious that it is substituted with an amino acid different from the amino acid before substitution, even if it is not separately indicated that it has been substituted with a different amino acid.
  • the “other amino acid” may be an amino acid other than glutamine (Q).
  • the other amino acids are selected from glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, aspartate, glutamic acid, lysine, arginine, and histidine. It may be possible.
  • the variant is a ketole acid reductoisomerase in which the amino acid corresponding to position 87 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with valine (V) or aspartate (D). It may be a variant.
  • N position in the present application may include the N position and an amino acid position corresponding to the N position.
  • a specific amino acid sequence may include an amino acid position corresponding to any amino acid residue in the disclosed mature polypeptide.
  • the specific amino acid sequence may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • corresponding to refers to an amino acid residue at a recited position in a polypeptide, or to an amino acid residue that is similar, identical, or homologous to a recited residue in a polypeptide. Identifying the amino acid at the corresponding position may be determining the specific amino acid in the sequence that refers to the specific sequence.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related or reference protein.
  • specific numbering may be used for amino acid residue positions within the proteins used in this application. For example, by aligning the polypeptide sequence of the target protein to be compared with the protein of the present application, it is possible to renumber the positions corresponding to the amino acid residue positions of the protein of the present application.
  • an arbitrary amino acid sequence can be aligned with SEQ ID NO: 1, and based on this, each amino acid residue in the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue in SEQ ID NO: 1.
  • sequence alignment algorithms such as those described in this application can identify the positions of amino acids or where modifications such as substitutions, insertions, or deletions occur compared to a query sequence (also referred to as a “reference sequence”).
  • Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277), etc. may be used, but are not limited thereto, and sequence alignment programs and pairwise sequence comparison algorithms known in the art may be appropriately used.
  • the ketolic acid reductoisomerase variant of the present application has the amino acid corresponding to the 87th position of SEQ ID NO: 1 substituted with valine (V) or aspartate (D), and is at least 70% identical to SEQ ID NO: 1. , may be a variant containing a sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology or identity.
  • the ketolic acid reductoisomerase variant may be a variant having less than 100% homology or identity with SEQ ID NO: 1.
  • the ketolic acid reductoisomerase variant of the present application has the amino acid corresponding to the 87th position of SEQ ID NO: 1 substituted with valine (V) or aspartate (D), Has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology or identity with SEQ ID NO: 1, and ketol acid reductoisomerase It may be a polypeptide with activity.
  • the ketolic acid reductoisomerase variant of the present application has the amino acid corresponding to the 87th position of SEQ ID NO: 1 being valine (V) or aspartate (D), and SEQ ID NO: 1 and has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology or identity and has ketolic acid reductoisomerase activity. It may be a polypeptide.
  • the variant of the present application has, comprises, or consists essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 25 ( (essentially consisting of), can be made.
  • the variant of the present application is at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more homologous to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 25. It may contain a sequence having identity or may be composed of the above amino acid sequence.
  • the amino acid corresponding to position 87 of SEQ ID NO: 3 or 25 may be valine (V) or aspartate (D).
  • the ketol acid reductoisomerase variant of the present application may have enhanced ketol acid reductoisomerase activity, but is not limited thereto.
  • the ketol acid reductoisomerase variant of the present application has an increased L-valine production ability compared to a wild-type, native or unmodified polypeptide having ketol acid reductoisomerase activity. It may have an activity that makes it possible, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a polynucleotide encoding a variant of the present application.
  • the variant is the same as described in the other aspects above.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or more, which is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain by covalent bonds, and more specifically, encoding the variant. refers to a polynucleotide fragment.
  • the polynucleotide of the present application has various variations in the coding region within the range of not changing the amino acid sequence of the variant of the present application, taking into account codon degeneracy or preferred codons in organisms intended to express the variant of the present application. Transformations can occur. Therefore, it is clear that a polynucleotide that can be translated into a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the variant of the present application or a polypeptide having homology or identity thereto due to codon degeneracy may also be included.
  • the polynucleotide of the present application has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% homology or identity with the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 66. , or has or includes a base sequence that is more than 99% and less than 100%, or has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 2. , may consist of or consist essentially of 97%, 98%, or 99% or more of the base sequence, but is not limited thereto.
  • the codon encoding the amino acid corresponding to the 87th position of SEQ ID NO: 1 may be one of the codons encoding valine (V) or aspartate (D). , but is not limited to this.
  • the polynucleotide of the present application includes, without limitation, any probe that can be prepared from a known genetic sequence, for example, a sequence that can hybridize under stringent conditions with a complementary sequence to all or part of the polynucleotide sequence of the present application. You can.
  • the “stringent condition” refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • polynucleotides with high homology or identity 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, Or, conditions in which polynucleotides with 99% or more homology or identity hybridize with each other and polynucleotides with lower homology or identity do not hybridize with each other, or 60°C, which is the washing condition of normal southern hybridization, Washing once, specifically 2 to 3 times, at a salt concentration and temperature equivalent to 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS. Conditions can be listed.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases may be possible depending on the stringency of hybridization.
  • the term “complementary” is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Accordingly, the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity with the polynucleotide of the present application can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55°C and using the conditions described above. Additionally, the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art depending on the purpose.
  • the appropriate stringency to hybridize the polynucleotide depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, variables that are well known in the art (e.g., J. Sambrook et al., supra).
  • Another aspect of the present application provides a vector containing a polynucleotide encoding the variant of the present application.
  • the variants and polynucleotides are the same as described in the other aspects above.
  • the vector may be an expression vector for expressing the polynucleotide in a microorganism, but is not limited thereto.
  • the term "vector” refers to a DNA product containing the base sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) to enable expression of the target polypeptide in a suitable host.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable microorganism, the vector can replicate or function independently of the host genome and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in this application is not particularly limited, and any vector known in the art can be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors can be used.
  • pBluescriptII series, pGEM series, pTZ series, pCL series, and pET series can be used.
  • pDZ pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors, etc.
  • pDC pDC
  • pDCM2 pACYC177
  • pACYC184 pCL
  • pECCG117 pUC19
  • pBR322 pMW118
  • pCC1BAC vectors etc.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be inserted into a chromosome using a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker may be additionally included to confirm whether the chromosome has been inserted. The selection marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to confirm the insertion of the target nucleic acid molecule, and to display selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface polypeptides. Markers that provide may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or show other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • the term “transformation” refers to introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide into a microorganism or microorganism so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed within the microorganism.
  • the transformed polynucleotide can include both of these, regardless of whether they are inserted into the chromosome of the microorganism or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding the polypeptide of interest.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a microorganism.
  • the polynucleotide can be introduced into a microorganism in the form of an expression cassette, which is a genetic structure containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may typically include a promoter, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal that are operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a microorganism in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the microorganism, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide encoding the target variant of the present application.
  • introduction refers to a method of delivering a polynucleotide encoding the variant of the present application or a vector containing the same to a host cell. Such introduction can be easily performed according to conventional methods in the art.
  • the CaCl 2 precipitation method the Hanahan method that increases efficiency by using a reducing substance called DMSO (dimethyl sulfoxide) in the CaCl 2 method
  • electroporation calcium phosphate precipitation
  • protoplasm fusion method and stirring using silicon carbide fibers methods
  • transformation methods using PEG, dextran sulfate, lipofectamine, and desiccation/inhibition-mediated transformation methods is not limited to the above examples, and transformation or transfection methods commonly used in the art can be used without limitation.
  • Another aspect of the present application provides a microorganism comprising the ketol acid reductoisomerase variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant.
  • the microorganism may contain a vector containing a polynucleotide encoding the variant.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism having the ability to produce L-valine.
  • L-valine refers to an L-amino acid with the formula (CH 3 ) 2 CHCH(NH 2 )COOH, which is one of the essential amino acids and structurally corresponds to a branched chain amino acid along with L-leucine and L-isoleucine. do.
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and microorganisms that have undergone natural or artificial genetic modification, and can be caused by insertion of foreign genes or enhanced or inactivated activity of intrinsic genes. It is a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened, and may be a microorganism that includes genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein, or product.
  • strain and “microorganism” have the same meaning and can be used interchangeably without limitation.
  • microorganism that produces L-valine refers to a prokaryotic or eukaryotic microbial strain capable of producing L-valine in a living organism, a microorganism in which the ability to produce L-valine is imparted to the parent strain that does not have the ability to produce L-valine. , or may include all microorganisms that inherently have the ability to produce L-valine. L-valine production capacity can be conferred or enhanced by species improvement.
  • the microorganism of the present application is a microorganism that naturally has the ability to produce ketol acid reductoisomerase or L-valine; Or, the variant of the present application or a polynucleotide (or a vector containing the polynucleotide) encoding the same is introduced into the parent strain that does not have the ability to produce ketol acid reductoisomerase or L-valine, and/or the ability to produce L-valine is imparted. It may be a microorganism, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application is a microorganism in which the gene on the chromosome encoding ketol acid reductoisomerase is mutated and contains the ketol acid reductoisomerase variant sequence of the present application and/or the ketol acid of the present application.
  • the microorganism provided in the present application may be a microorganism genetically modified to express the ketolic acid reductoisomerase of the present application.
  • non-modified microorganism does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and is either a wild-type strain or a natural strain itself, or a strain that has a genetic mutation caused by natural or artificial factors. It may refer to the strain before change.
  • the unmodified microorganism may refer to a strain in which the ketol acid reductoisomerase variant described herein is not introduced or before it is introduced.
  • the “non-modified microorganism” may be used interchangeably with “pre-transformed strain”, “pre-transformed microorganism”, “non-mutated strain”, “non-modified strain”, “non-mutated microorganism” or “reference microorganism”.
  • Microorganisms having the ability to produce L-valine of the present application include microorganisms containing at least one of the variants of the present application, the polynucleotide of the present application, and the vector containing the polynucleotide of the present application; Microorganisms modified to express variants of the present application or polynucleotides of the present application; Microorganisms (e.g., recombinant strains) expressing variants of the present application, or polynucleotides of the present application; Or it may be a microorganism (e.g., a recombinant strain) having variant activity of the present application, but is not limited thereto.
  • the strain of the present application is a cell or microorganism that is transformed with a vector containing a polynucleotide encoding the polynucleotide of the present application or the variant of the present application and expresses the variant of the present application, and the strain of the present application is the polynucleotide of the present application. It may include all microorganisms capable of producing L-valine, including variants in the application.
  • the microorganism of the present application is a natural wild-type microorganism or a microorganism with the ability to produce L-valine, by introducing a polynucleotide encoding the variant of the present application, thereby expressing a ketolic acid reductoisomerase variant, thereby producing L-valine. It may be a recombinant strain with increased production capacity.
  • the strain with increased L-valine production ability is a natural wild-type microorganism or a non-modified ketol acid reductoisomerase microorganism (e.g., a microorganism expressing wild-type ketol acid reductoisomerase or a variant of the present application) It may be a microorganism with an increased L-valine production ability compared to a microorganism that does not, but is not limited thereto.
  • the microorganism with increased L-valine production ability of the present application may be a microorganism with increased L-valine production ability compared to a microorganism containing the polypeptide of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same, but is limited thereto. That is not the case.
  • the microorganism with an increased L-valine production ability is about 1% or more, about 2% or more, about 2.5% or more, and about 3% or more (the upper limit is There is no particular limitation, for example, about 200% or less, about 150% or less, about 100% or less, about 50% or less, about 45% or less, about 40% or less, about 35% or less, about 30% or less, about 25% or less. Hereinafter, it may be about 20% or less), but it is not limited thereto as long as it has a positive increase compared to the production capacity of the parent strain or unmodified microorganism before mutation.
  • the recombinant strain with increased L-valine production ability has an L-valine production ability of about 1.01 times more, about 1.02 times more, and about 1.03 times more than the parent strain or unmodified microorganism before mutation (the upper limit is a special limitation) There is no, for example, it may be about 10 times or less, about 5 times or less, about 3 times or less, about 2 times or less, about 1.5 times or less) may be increased, but is not limited thereto.
  • Examples of the parent strain or unmodified microorganism before mutation for comparing the increase in L-valine production ability include a microorganism containing the polypeptide of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the same, and other examples include Corynebacterium Examples include, but are not limited to, E. glutamicum KCCM11201P (US 8465962 B), Corynebacterium glutamicum ATCC13869, and Corynebacterium glutamicum ATCC14067.
  • the microorganism of the present application may include all microorganisms capable of expressing the ketolic acid reductoisomerase variant of the present application by various known methods in addition to the nucleic acid or vector introduction.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the microorganism of the present application is Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis , Corynebacterium deserti , Corynebacterium Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis , Corynebacterium singulare , Corynebacterium halotolerans ( Corynebacterium halotolerans ), Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans , It may be Corynebacterium testudinoris or Corynebacterium flavescens . In any one of the foregoing embodiments, the microorganism of the present application may be Corynebacterium glutamicum .
  • Microorganisms of the Corynebacterium genus having the ability to produce L-valine in the present application include natural wild-type microorganisms themselves; Microorganisms of the genus Corynebacterium that have improved L-valine production ability by strengthening or weakening the activity of genes related to the L-valine production mechanism; Alternatively, it includes all microorganisms of the genus Corynebacterium that have improved L-valine production ability by introducing or enhancing the activity of foreign genes.
  • the microorganism of the present application may include acetohydroxy acid synthase modified to have enhanced L-valine production ability.
  • the microorganism of the present application may include a modified acetohydroxy acid synthase subunit (ilvN).
  • the acetohydroxy acid synthase subunit may include a mutation in which amino acid number 42 is substituted with valine (A42V). However, it is not limited to this.
  • Microorganisms of the present application may have enhanced activity of ketolic acid reductoisomerase variants of the present application.
  • the term “enhancement” of polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased compared to the intrinsic activity.
  • the enhancement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include showing an activity that it did not originally have, or showing improved activity compared to the intrinsic activity or activity before modification.
  • intrinsic activity refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the change in trait when the trait changes due to genetic mutation due to natural or artificial factors.
  • “Enhanced,” “upregulated,” “overexpressed,” or “increased” in the activity of a polypeptide compared to its intrinsic activity means the activity and/or concentration (expression) of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the transformation. It means an improvement compared to the amount).
  • the enhancement can be achieved by introducing an exogenous polypeptide or enhancing the activity and/or concentration (expression amount) of the endogenous polypeptide. Whether the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed by increasing the activity level of the polypeptide, the expression level, or the amount of product released from the polypeptide.
  • Enhancement of the activity of the polypeptide can be done by applying various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target polypeptide can be enhanced compared to that of the microorganism before modification.
  • genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which are routine methods of molecular biology, may be used, but are not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • the reinforcement of the polypeptide of the present application is
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide e.g., modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide modified to enhance the activity of the polypeptide;
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is achieved by the introduction into the host cell of a vector capable of replicating and functioning independently of the host to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked. It may be possible. Alternatively, this may be achieved by introducing one or two or more copies of the polynucleotide encoding the polypeptide into the chromosome of the host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited to this.
  • the vector is the same as described above.
  • the expression control region is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates the termination of transcription and translation.
  • the original promoter may be replaced with a strong promoter, but the method is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include CJ1 to CJ7 promoters (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13. (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but is not limited thereto.
  • the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base sequence encoding another start codon with a higher polypeptide expression rate than the internal start codon. It may be a substitution, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) includes deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide.
  • the combination of these may result in a mutation in the sequence, or a replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used at this time may additionally include a selection marker to check whether chromosome insertion has occurred. The selection marker is as described above.
  • Introduction of a foreign polynucleotide showing the activity of the polypeptide may be introduction into the host cell of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide showing the same/similar activity as the polypeptide. There are no restrictions on the origin or sequence of the foreign polynucleotide as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and by expressing the introduced polynucleotide in the host cell, a polypeptide can be produced and its activity can be increased.
  • Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon optimization of the native polynucleotide to increase transcription or translation within the host cell, or optimized transcription and translation of the foreign polynucleotide within the host cell. It may be that the codons have been optimized to allow this.
  • Analyzing the tertiary structure of a polypeptide and selecting exposed sites to modify or chemically modify the sequence information for example, by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database storing the sequence information of known proteins to determine the degree of sequence similarity. Accordingly, a template protein candidate may be determined, the structure confirmed based on this, and an exposed site to be modified or chemically modified may be selected and modified or modified.
  • Such enhancement of polypeptide activity means that the activity or concentration of the corresponding polypeptide is increased based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild type or unmodified microbial strain, or the amount of the product produced from the polypeptide is increased. However, it is not limited to this.
  • Modification of part or all of the polynucleotide in the microorganism of the present application is (a) homologous recombination using a vector for chromosome insertion into the microorganism or genome editing using engineered nuclease (e.g., CRISPR-Cas9) and/or (b) It may be induced by, but is not limited to, light and/or chemical treatment, such as ultraviolet rays and radiation.
  • the method of modifying part or all of the gene may include a method using DNA recombination technology.
  • a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to the gene of interest is injected into the microorganism to cause homologous recombination, thereby causing deletion of part or all of the gene.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include, but is not limited to, a dominant selection marker.
  • the variants, polynucleotides, L-valine, etc. are as described in the other embodiments above.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing L-valine, comprising culturing the microorganism of the present application in a medium.
  • the L-valine production method of the present application may include, but is not limited to, the step of culturing a microorganism containing the variant of the present application, the polynucleotide of the present application, or the vector of the present application in a medium.
  • the term “culturing” means growing the microorganism of this application under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application can be carried out according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art depending on the strain selected. Specifically, the culture may be batch, continuous, and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material that is mainly mixed with nutrients necessary for cultivating the microorganisms of this application, and supplies nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and development.
  • the medium and other culture conditions used for cultivating the microorganisms of the present application can be any medium used for cultivating ordinary microorganisms without particular restrictions, but the microorganisms of the present application can be grown with an appropriate carbon source, nitrogen source, personnel, and inorganic substances. It can be cultured under aerobic conditions in a typical medium containing compounds, amino acids, and/or vitamins, while controlling temperature, pH, etc.
  • culture media for strains of the genus Corynebacterium can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, etc.; Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc., organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, etc. may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice bran, cassava, bagasse and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e. converted to reducing sugars).
  • Carbohydrates such as molasses
  • various other carbon sources in an appropriate amount can be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • the nitrogen source includes inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its decomposition products, defatted soybean cake or its decomposition products, etc. can be used These nitrogen sources may be used individually or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast
  • the agent may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a corresponding sodium-containing salt.
  • Inorganic compounds may include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, and calcium carbonate, and may also include amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors. These components or precursors can be added to the medium batchwise or continuously. However, it is not limited to this.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. can be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium.
  • foam generation can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the medium, or to maintain the anaerobic and microaerobic state, nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas can be injected without gas injection, and is limited thereto. That is not the case.
  • the culture temperature can be maintained at 20 to 45°C, specifically 25 to 40°C, and culture can be performed for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • L-valine produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain within the cell.
  • the L-valine production method of the present application includes preparing the microorganism of the present application, preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (in any order), for example, It may be additionally included before the culturing step.
  • the L-valine production method of the present application may further include the step of recovering L-valine from the culture medium (medium in which the culture was performed) or the microorganism of the present application.
  • the recovering step may be additionally included after the culturing step.
  • the recovery may be to collect L-valine using a suitable method known in the art according to the microorganism culture method of the present application, such as a batch, continuous, or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art such as a batch, continuous, or fed-batch culture method.
  • Various chromatography such as chromatography, HPLC, or a combination of these methods can be used, and L-valine can be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the L-valine production method of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification can be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed sequentially or discontinuously regardless of the order, simultaneously, or integrated into one step. may be performed, but is not limited thereto.
  • the variants, polynucleotides, microorganisms, L-valine, etc. are as described in the other embodiments above.
  • Another aspect of the present application is a microorganism comprising a ketol acid reductoisomerase variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant; The medium in which it was cultured; Alternatively, a composition for producing L-valine comprising a combination of two or more of these is provided.
  • composition of the present application may further include any suitable excipients commonly used in compositions for producing amino acids, and such excipients may be, for example, preservatives, wetting agents, dispersants, suspending agents, buffers, stabilizers, or isotonic agents. However, it is not limited to this.
  • composition of the present application the variants, polynucleotides, microorganisms, L-valine, etc. are as described in the other embodiments above.
  • Another aspect of the present application is to provide a use of the ketol acid reductoisomerase variant of the present application for producing L-valine.
  • the above variants are as described above.
  • Example 1-1 Artificial mutagenesis through UV irradiation
  • Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (US 8465962 B), a valine producing strain, was plated on a nutrient medium containing agar and cultured at 30 o C for 36 hours. Hundreds of colonies obtained in this way were irradiated with UV light at room temperature to induce random mutations in the genome of the strain.
  • Example 1-2 Mutagenic strain fermentation titer evaluation and strain selection
  • the C12 strain with the highest increase in valine production was selected compared to the control strain KCCM11201P.
  • the major genes of the strain were sequenced and compared with the KCCM11201P strain and the Corynebacterium glutamicum ATCC14067 wild type strain. As a result, it was confirmed that the strain with increased valine production ability contained a base sequence mutation at a specific position in the ORF (open reading frame) region of the ilvC gene. Specifically, the C12 strain with the greatest increase in valine production had three mutations introduced into the nucleotide sequence located 259 to 261 bp downstream from the start codon of the ilvC gene, changing the existing CAG (SEQ ID NO: 66) to GTT (SEQ ID NO: 2). , it was confirmed that the 87th amino acid glutamine was substituted with valine (SEQ ID NO: 3).
  • valine a branched chain amino acid
  • Example 3-1 Construction of a strain introducing the ilvC mutation in Corynebacterium glutamicum KCCM11201P strain and evaluation of L-valine production ability
  • a vector containing the target mutation was constructed. Specifically, the genomic DNA of the C12 strain was extracted using the G-spin Total DNA Extraction Mini Kit (Intron, Cat. No 17045) according to the protocol provided in the kit, and the genomic DNA was used as a template. PCR was performed.
  • the conditions for PCR were denaturation at 94°C for 5 minutes; After 25 cycles of denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 150 seconds; Polymerization reaction was performed at 72°C for 7 minutes, and a 1010 bp PCR product (hereinafter referred to as “mutation introduction fragment 1”) was obtained using SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
  • the obtained mutation introduction fragment 1 was processed with the restriction enzyme SmaI (New England Biolabs, Beverly, MA) into pDCM2 vector (Korea Publication No. 10-2020-0136813) and Infusion Cloning Kit (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). After ligating using , it was transformed into E. coli DH5 ⁇ . After transforming the above-constructed gene into E. coli DH5 ⁇ , it was selected in LB medium containing kanamycin, and DNA was obtained using a DNA-spin plasmid DNA purification kit (iNtRON) to produce vector pDCM2-ilvC containing the mutation introduction fragment 1. (Q87V) was prepared.
  • primer base sequence SEQ ID NO: 4 CCCGGG GCACTGCTTGATGTGATGGATGGAACCAT SEQ ID NO: 5 CCCGGG GTCAACGATGAGCTTGAGCTCGT
  • the pDCM2-ilvC(Q87V) was transformed into Corynebacterium glutamicum KCCM11201P by homologous recombination on the chromosome (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Strains in which the vector was inserted into the chromosome by recombination of homologous sequences were selected in a medium containing 25 mg/l of kanamycin.
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of production medium, and cultured at 30°C for 72 hours with shaking at 200 rpm. Afterwards, the concentration of L-valine was analyzed using HPLC, and the analyzed concentration of L-valine is shown in Table 3 below.
  • KCCM11201P and KCCM11201P :: ilvC (Q87V) L-valine production capacity strain L-Valine (g/L) Batch 1 Batch 2 Batch 3 average KCCM11201P 2.8 2.7 2.8 2.7 KCCM11201P:: ilvC (Q87V) 3.1 3.2 3.3 3.2
  • Example 3-2 Construction of a strain into which the ilvC mutation was introduced in Corynebacterium glutamicum CJ7V strain and evaluation of L-valine production ability
  • genomic DNA of the Corynebacterium glutamicum wild type strain ATCC14067 was extracted using the G-spin Total DNA Extraction Mini Kit (Intron, Cat. No 17045) according to the protocol provided in the kit. PCR was performed using the genomic DNA as a template.
  • gene fragments (A and B) were obtained using the primer pair of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and the primer pair of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • the conditions for PCR were denaturation at 94°C for 5 minutes; After 25 cycles of denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds; Polymerization was performed at 72°C for 7 minutes.
  • the obtained mutation introduction fragment 2 was treated with the restriction enzyme SmaI (New England Biolabs, Beverly, MA), and then ligated using the pDCM2 vector treated with the same restriction enzyme and T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA). did.
  • SmaI New England Biolabs, Beverly, MA
  • T4 ligase New England Biolabs, Beverly, MA
  • transforming the gene produced above into E. coli DH5 ⁇ it was selected in LB medium containing kanamycin, and DNA was obtained using a DNA-spin plasmid DNA purification kit (iNtRON).
  • the vector for the purpose of introducing the A42V mutation of the ilvN gene was named pDCM2-ilvN(A42V).
  • the pDCM2-ilvN(A42V) was transformed into wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC14067 by homologous recombination on the chromosome (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Strains in which the vector was inserted into the chromosome by recombination of homologous sequences were selected in a medium containing 25 mg/l of kanamycin.
  • the gene fragment was amplified through PCR using SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9 for the Corynebacterium glutamicum transformant for which secondary recombination was completed, and then the mutant insertion strain was confirmed through gene sequence analysis. .
  • the recombinant strain was named Corynebacterium glutamicum CJ7V.
  • a strain obtained by transforming the Corynebacterium glutamicum CJ7V with a vector in the same manner as in Example 3-1 was created and named Corynebacterium glutamicum CJ7V:: ilvC (Q87V).
  • they were cultured in the same manner as in Example 3-1 above and the concentration of L-valine was analyzed. The analyzed L-valine concentrations are shown in Table 5 below.
  • Example 3-3 Construction of a strain into which the ilvC mutation was introduced in Corynebacterium glutamicum CJ8V strain and evaluation of L-valine production ability
  • Example 3-2 the constructed vector pDCM2-ilvN(A42V) was transformed into the wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 strain to induce homologous recombination on the chromosome (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999).
  • Strains in which the vector was inserted into the chromosome by recombination of homologous sequences were selected in a medium containing 25 mg/l of kanamycin.
  • the gene fragment was amplified through PCR using a primer pair of SEQ ID NOs: 10 and 11 for the selected Corynebacterium glutamicum transformant, and then it was confirmed that the mutation was properly introduced through gene sequence analysis.
  • the recombinant strains were named Corynebacterium glutamicum CJ8V, respectively.
  • the sequences of the primers used in this example are listed in Table 6 below.
  • primer base sequence SEQ ID NO: 10 CCGCGTCACCAAAGCGGA SEQ ID NO: 11 TTAGATCTTGGCCGGAGCCA
  • Example 3-1 a strain obtained by transforming the Corynebacterium glutamicum CJ8V with a vector in the same manner as in Example 3-1 was created and named Corynebacterium glutamicum CJ8V:: ilvC (Q87V).
  • Corynebacterium glutamicum CJ8V:: ilvC Q87V.
  • the analyzed L-valine concentrations are shown in Table 7 below.
  • site-directed mutagenesis was performed using pDCM2-ilvC(Q87V) used in Example 3-1 as a template. Site-directed mutagenesis was performed as follows.
  • valine the 87th amino acid of ilvC, glutamine, other amino acids alanine (A) (SEQ ID NO: 12), valine (V) (SEQ ID NO: 3), isoleucine (I) (SEQ ID NO: 13), and glycine (G) (SEQ ID NO: 14) ), phenylalanine (F) (SEQ ID NO: 15), methionine (M) (SEQ ID NO: 16), serine (S) (SEQ ID NO: 17), proline (P) (SEQ ID NO: 18), threonine (T) (SEQ ID NO: Number 19), tyrosine (Y) (SEQ ID NO: 20), histidine (H) (SEQ ID NO: 21), glutamine (Q) (SEQ ID NO: 22), asparagine (N) (SEQ ID NO: 23), lysine (K) ( SEQ ID NO: 24), aspartate (D) (SEQ ID NO: 25), cysteine (C) (
  • Mutagenic primer set for producing plasmid with variant 87 amino acid of ilvC amino acid sequence Mutant ilvC plasmid sequence number Sequence (5'-3') pDCM2_ilvC(Q87A) 30 CAGACACCTCCgcgGCAGAAATCTTCACCAAC 31 AAGATTTCTGCCgcGGAGGTGTCTGGAGCCAG pDCM2_ilvC(Q87I) 32 CAGACACCTCCattGCAGAAATCTTCACCAAC 33 AAGATTTCTGCaatGGAGGTGTCTGGAGCCAG pDCM2_ilvC(Q87G) 34 CAGACACCTCCggaGCAGAAATCTTCACCAAC 35 AAGATTTCTGCtccGGAGGTGTCTGGAGCCAG pDCM2_ilvC(Q87F) 36 CAGACACCTCCttcGCAGAAATCTTCACCAAC 37 AAGATTTCTGCgaaGGAGGTGTCTGGAGCCAG pDCM2_il
  • KCCM11201P :: ILVC (Q87A), KCCM11201P :: ILVC (Q87I), KCM11201P :: ILVC (Q87G), KCCM11201P :: ILV C (Q87M), KCCM11201P: :ilvC(Q87S), KCCM11201P::ilvC(Q87P), KCCM11201P::ilvC(Q87T), KCCM11201P::ilvC(Q87Y), KCCM11201P::ilvC(Q87H), KCCM11201P::ilvC(Q87Q), KCCM11201 P::ilvC (Q87N), KCCM11201P::ilvC(Q87K), KCCM11201P::ilvC(Q87D), KCCM11201P::ilvC(Q87C), KCCM11201P::ilvC(Q87W), KCCM11201P::ilv
  • the L-valine production ability of the KCCM11201P::ilvC(Q87V) strain increased by 16% compared to KCCM11201P, and the L-valine production ability of the KCCM11201P::ilvC(Q87D) strain was also confirmed to increase with KCCM11201P.
  • Strains into which other mutations were introduced showed equivalent production capacity to KCCM11201P or had minimal effect.
  • the variant of the present application can increase microbial L-valine production.

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Abstract

본 출원은 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체, 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물 및 본 출원의 미생물을 이용한 L-발린의 생산방법에 관한 것이다.

Description

케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 및 이를 이용한 L-발린 생산 방법
본 출원은 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체, 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물 및 본 출원의 미생물을 이용한 L-발린의 생산방법에 관한 것이다.
L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 특히 분지쇄 아미노산(Brached Chain Amino Acids, BCAA)는 필수 아미노산인 L-발린, L-류신, L-이소류신을 총칭하는 것으로, 상기 분지쇄 아미노산은 항산화 효과 및 근육세포의 단백질 합성작용을 촉진시키는 효과가 있다.
미생물을 이용한 분지쇄 아미노산의 생산은, 주로 코리네박테리움속 미생물을 통해 이루어지며, 피루브산으로부터 여러 단계를 거쳐 생합성된다고 알려져 있다. [APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2010, p. 8053-8061].
미생물을 통한 분지쇄 아미노산의 생산은 공업적으로 대량 제조가 쉽지 않은 문제가 있다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)로 치환된, 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-발린 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 미생물, 본 출원의 미생물을 배양한 배지 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-발린 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 변이체를 이용하여 고수율의 L-발린 생산이 가능하다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함하는, 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체를 제공한다.
본 출원에서 용어, "케톨산 리덕토아이소머라제 변이체"는, 케톨산 리덕토아이소머라제 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 케톨산 리덕토아이소머라제에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 87번째 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 변이체를 의미한다.
본 출원의 변이체는 "케톨산 리덕토아이소머라제 변이체", "케톨산 리덕토아이소머라제 활성을 갖는 (변이형) 폴리펩티드", "IlvC 변이체" 로도 기재될 수 있다.
본 출원에서 용어 "케톨산 리덕토아이소머라제 (Ketol-acid reductoisomerase)"는 "아세토하이드록시산 아이소머로리덕테이즈(acetohydroxy acid isomeroreductase)", "KARI", "AHAIR"로도 지칭되는 효소로 L-분지쇄 아미노산의 생합성에 관여하는 효소이다. 상기 케톨산 리덕토아이소머라제는 EC 1.1.1.86으로 분류될 수 있다.
L-분지쇄 아미노산의 생합성 경로를 살피면, 먼저 아세토하이드록시산 신타아제(acetohydroxy acid synthase)가 피루브산의 디카르복실화(decarboyxlation)와 다른 피루브산 분자와의 축합 반응을 촉매하여 발린의 전구체인 아세토락테이트(acetolactate)을 생산하거나 피루브산의 디카르복실화와 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)와의 축합 반응을 촉매하여 이소류신의 전구체인 아세토하이드록시부티레이트(acetohydroxybutyrate)를 생산할 수 있다. 케톨산 리덕토아이소머라제는 이렇게 생성된 아세토젖산 또는 아세토하이드록시부티레이트를 기질로 하여 L-발린, L-류신 및 L-이소류신을 생성시킬 수 있는 반응을 진행시킨다.
구체적으로, 케톨산 리덕토아이소머라제는 2-아세토-2-하이드록시부티레이트(2-aceto-2-hydroxybutyrate)를 2,3-디하이드록시-3-메틸발러레이트(2,3-dihydroxy-3-methylvalerate)로 전환시키거나, 2-아세토락테이트(2-acetolactate)를 2,3-디하이드록시아이소발러레이트(2,3-dihydroxyisovalerate)로 전환시킬 수 있다.
상기 2,3-디하이드록시-3-메틸발러레이트(2,3-dihydroxy-3-methylvalerate)가 디하이드록시산 디하이드라타제(dihydroxy acid dehydratase), 트랜스아미나제 B(transaminase B)에 의해 촉매된 반응을 거치면 L-이소류신이 생성된다. 상기 2,3-디하이드록시아이소발러레이트(2,3-dihydroxyisovalerate)가 디하이드록시산 디하이드라타제 (dihydroxy acid dehydratase)에 의해 매개되는 반응을 거치면 2-케토이소발러레이트(2-ketoisovalerate)가 생성되며 2-케토이소발러레이트는 트랜스아미나제 B에 의해 L-발린으로 전환되거나, 2-케토이소카프산(2- ketoisocaproate)로 전환된 후 효소의 전환작용을 거쳐 L-류신으로 전환될 수 있다. 따라서, 케톨산 리덕토아이소머라제는 L-발린, L-류신 및 L-이소류신을 포함하는 분지쇄 아미노산 생산에 중요한 효소이다.
본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제의 아미노산 서열은 ilvC 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열일 수 있으며, 이를 "IlvC 단백질"로도 지칭할 수 있다. 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 상기 케톨산 리덕토아이소머라제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 일 예로, 상기 케톨산 리덕토아이소머라제는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있고, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다. 그 예로 WP_003854117.1, 6JX2_A, HJE10081.1, WP_059289140.1, WP_060564426.1, WP_006286981.1, WP_096455581.1, WP_066565326.1, WP_015651057.1, WP_053544709.1, WP_006769331.1, BAC18177.1, WP_156227806.1, WP_191733749.1, WP_042621277.1, WP_126119396.1, NLZ56857.1 또는 WP_015400720.1 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 아미노산 서열과 동일한 케톨산 리덕토아이소머라제 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함할 수 있다.
구체적인 예를 들어, 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상, 또는 99% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원에서 변이 대상이 되는 케톨산 리덕토아이소머라제의 일 예로 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제에 해당됨은 당업자에게 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 용어, "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 유니터리 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 출원에서 사용된 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)을 나타낸다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)" 또는 "변이형 폴리펩티드(modified polypeptide)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다.
상기 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 통상적으로, 보존적 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
이러한 분류의 예로, 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘; 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파테이트; 비극성 곁사슬(nonpolar side chain)을 갖는 아미노산(비극성 아미노산)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린; 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 곁사슬을 갖는 아미노산(극성 아미노산)은 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 속하는 것으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 전하를 띠는 곁사슬을 가지는 아미노산인(electrically charged amino acid) 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파테이트와, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산(uncharged amino acid; neutral amino acid로도 지칭)인 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 방향족 아미노산(aromatic amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 발린, 류신, 이소류신은 분지쇄 아미노산(branched amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 20종 아미노산을 크기에 따라 분류하여 상대적으로 부피(volume)가 작은 아미노산 그룹부터 글리신, 알라닌, 세린; 시스테인, 프롤린, 쓰레오닌, 아스파테이트, 아스파라긴; 발린, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민; 이소류신, 류신, 메치오닌, 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신의 5군으로 분류할 수 있다. 그러나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
하나의 구현예로, 본 출원의 변이체는 전술한 케톨산 리덕토아이소머라제 중, 서열번호 1의 N-말단으로부터 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 또는 케톨산 리덕토아이소머라제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다.
앞선 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 변이 전의 단백질, 야생형 단백질, 천연형 폴리펩티드 또는 비변형 폴리펩티드에 비해 L-발린 생산량을 증가시킬 수 있는 것일 수 있다.
본 출원에서, '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
앞선 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 "다른 아미노산"은 글루타민(Q)을 제외한 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 다른 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 아스파테이트, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 중 선택되는 것일 수 있다.
앞선 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)로 치환된, 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 일 수 있다.
본 출원의 "N번 위치"는 N번 위치 및 N번 위치와 상응(corresponding)하는 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 예를 들면 특정 아미노산 서열에 개시된 성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)에서 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 상기 특정 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
본 출원에서, 본 출원에 사용되는 단백질 내의 아미노산 잔기 위치에 특정 넘버링이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비교하고자 하는 대상 단백질과 본 출원의 단백질의 폴리펩티드 서열을 정렬함으로써, 본 출원의 단백질의 아미노산 잔기 위치에 상응하는 위치에 대해 재넘버링 하는 것이 가능하다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체는 서열번호 1의 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)로 치환되고, 서열번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 서열을 포함하는 변이체일 수 있다. 상기 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체는, 서열번호 1과 100% 미만의 상동성 또는 동일성을 가지는 변이체일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체는 서열번호 1의 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)로 치환되고, 서열번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지며, 케톨산 리덕토아이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체는 서열번호 1의 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)이고, 서열번호 1과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지며 케톨산 리덕토아이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다.
또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3 또는 서열번호 25로 기재된 아미노산 서열을 가지거나(having), 포함하거나(comprising), 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지거나(essentially consisting of), 이루어질 수 있다.
본 출원에서 "특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질"이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3 또는 서열번호 25와 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상동성 또는 동일성을 가지는 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 변이체에서, 상기 서열번호 3 또는 25의 87번 위치에 상응하는 아미노산은 발린(V) 또는 아스파테이트(D)일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체는 케톨산 리덕토아이소머라제 활성이 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체는 케톨산 리덕토아이소머라제 활성을 갖는 야생형, 천연형 혹은 비변형 폴리펩티드에 비해 L-발린 생산능이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 변이체에 대해서는 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 본 출원의 변이체의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다.
예를 들어, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 66의 폴리뉴클레오티드 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이고 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에서, 서열번호 1의 87번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 발린(V) 또는 아스파테이트(D)를 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 변이체 및 폴리뉴클레오티드에 대해서는 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 미생물에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 미생물 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 미생물 혹은 미생물 내에 도입하여 미생물 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 미생물에 도입되어 미생물에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원에서 용어, "도입"은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 CaCl2침전법, CaCl2방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 상기 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공한다.
일 구현예로, 상기 미생물은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 미생물은 L-발린 생산능을 가지는 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, "L-발린"은 필수 아미노산의 하나로 구조적으로 L-류신, L-이소류신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 (CH3)2CHCH(NH2)COOH인 L-아미노산을 의미한다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다. 본 출원에서 "미생물", "균주", "미생물"은 동일한 의미로서 제한 없이 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "L-발린을 생산하는 미생물"은 L-발린을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서,　L-발린　생산능이 없는 모균주에　L-발린의 생산능이 부여된 미생물, 또는 내재적으로　L-발린　생산능을 갖는 미생물을 모두 포함할 수 있다.　L-발린　생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 미생물은 자연적으로 케톨산 리덕토아이소머라제 또는 L-발린 생산능을 가지고 있는 미생물; 또는 케톨산 리덕토아이소머라제 또는 L-발린 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 L-발린 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 출원의 미생물은 케톨산 리덕토아이소머라제를 암호화하는 염색체상의 유전자가 돌연변이되어 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 서열을 포함하는 미생물 및/또는 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시켜 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체를 포함하는 미생물을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로서, 본 출원에서 제공하는 미생물은 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제를 발현하도록 유전적으로 변형된(genetically modified) 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 L-발린 생산능을 가지는 미생물은 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 미생물; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물(예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 미생물(예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 L-발린을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 미생물은 천연의 야생형 미생물 또는 L-발린 생산능을 가지는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체가 발현되어, L-발린 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다.
상기 L-발린 생산능이 증가된 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 케톨산 리덕토아이소머라제 비변형 미생물(예를 들어, 야생형 케톨산 리덕토아이소머라제를 발현하는 미생물 또는 본 출원의 변이체를 발현하지 않는 미생물)에 비하여 L-발린 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 본 출원의 L-발린 생산능이 증가된 미생물은 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물과 비교하여 L-발린 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 L-발린 생산능이 증가된 미생물은 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 L-발린 생산능에 비하여 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 2.5% 이상, 약 3% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하, 약 20% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 L-발린 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-발린 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.02배 이상, 약 1.03배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L-발린 생산능의 증가를 비교하기 위한 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 예시로, 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 들 수 있으며, 다른 예시로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(US 8465962 B), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 상기 핵산 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현에로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
본 출원의 L-발린 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은, 천연의 야생형 미생물 자체; L-발린 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 약화시켜 향상된 L-발린 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물; 또는 외부 유전자의 활성을 도입 또는 강화시켜 향상된 L-발린 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 모두 포함한다.
일 구현예로, 본 출원의 미생물은, 강화된 L-발린 생산능을 갖도록 변형된 아세토하이드록시산 신타아제를 포함할 수 있다. 전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 출원의 미생물은, 변형된 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체(ilvN)를 포함할 수 있다. 상기 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체는 42번 아미노산이 발린으로 치환된(A42V) 변이를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체의 강화된 활성을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서, 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드 및 L-발린 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-발린 생산방법을 제공한다.
구체적으로, 본 출원의 L-발린 생산방법은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
예를 들어, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-발린은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-발린 생산방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-발린 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 미생물로부터 L-발린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 L-발린을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 L-발린을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-발린 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-발린 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 미생물, L-발린 등에 대해서는 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-발린 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 미생물, L-발린 등에 대해서는 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체의 L-발린 생산 용도를 제공하는 것이다. 상기 변이체에 대해서는 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1-1. UV조사를 통한 인공 돌연변이 유발
발린 생산능 증가된 변이주를 선별하기 위하여 발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(US 8465962 B)를 한천을 포함하는 영양배지에 도말하여 30oC에서 36시간 배양하였다. 이렇게 획득한 수백 개의 콜로니를 실온에서 UV를 조사하여 균주 내 게놈상에 무작위 돌연변이를 유발시켰다.
실시예 1-2. 돌연변이 유발 균주 발효역가 평가 및 균주 선별
모균주로 사용된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 대비하여 L-발린의 생산능이 증가된 변이주를 선별하고자 무작위 돌연변이가 유발된 균주들을 대상으로 발효 역가 실험을 실시하였다. 각각의 콜로니는 영양배지에서 계대 배양된 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표1에 나타내었다.
[영양배지 (pH 7.2)]
포도당 10g, 육추출물 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모추출물 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
[생산배지 (pH 7.0)]
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
균주명 L-발린(g/L)
대조군 KCCM11201P 2.9
실험군 C1 3.0
C2 2.5
C3 2.3
C4 2.6
C5 2.3
C6 1.9
C7 1.2
C8 3.8
C9 3.0
C10 3.1
C11 1.8
C12 4.3
C13 3.5
C14 2.9
C15 1.6
C16 2.2
C17 2.7
C18 2.5
C19 2.7
C20 3.4
C21 2.3
표 1을 참고하면, 대조군인 KCCM11201P 균주에 비하여 발린 생산량이 가장 많이 증가한 C12균주를 선별하였다.
실시예 2. 유전자 시퀀싱을 통한 변이 확인
상기 균주의 주요 유전자들을 시퀀싱하여 KCCM11201P 균주 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 야생형 균주와 비교하였다. 그 결과, 발린 생산능이 증가된 상기 균주는 ilvC 유전자 ORF(open reading frame) 영역의 특정 위치에 염기서열 변이를 포함하고 있음을 확인하였다. 구체적으로, 발린 생산량이 가장 많이 증가한 C12 균주는 상기 ilvC 유전자의 개시코돈으로부터 하위 259~261bp 에 위치한 염기서열에 3개의 변이가 도입되어 기존 CAG(서열번호 66) 에서 GTT로 바뀐(서열번호 2), 87번째 아미노산 글루타민이 발린으로 치환된 형태(서열번호 3) 임을 확인하였다.
서열번호 2의 변이 영역을 분석해 본 결과, 발린 생합성 효소의 Effector binding domain 에 영향을 주는 것으로 확인되어, 해당 단백질의 활성이 강화될 것으로 예상하였다. 이하 실시예 에서는 상기 ilvC 유전자 내 ORF 특정 위치에 삽입된 Q87V 변이의 적용 시 코리네박테리움 속 미생물의 분지쇄 아미노산인 발린의 생산능에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 또한 87번째 아미노산 글루타민 위치 변이에 대해 발린 외의 다른 아미노산으로 치환될 경우 코리네박테리움 속 미생물의 분지쇄 아미노산인 발린의 생산능에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
실시예 3. ilvC 변이가 도입된 KCCM11201P 균주 제작 및 발린 생상능 확인
실시예 3-1. 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주에서 ilvC 변이가 도입된 균주 제작 및 L-발린 생산능 평가
서열번호 2로 표시되는 ilvC(Q87V) 변이형을 글루타미쿰 KCCM11201P에 삽입하기 위하여 타겟 변이를 포함한 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 C12균주의 게노믹(genomic) DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하고, 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 150초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였으며, 서열번호 4 와 서열번호 5를 이용하여 1010 bp의 PCR 결과물(이하, "변이 도입 단편 1"이라 명명함)을 얻었다.
상기 얻어진 변이 도입 단편 1을 제한효소 SmaI (New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리된 pDCM2벡터 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)와 Infusion Cloning Kit (Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하여 상기 변이 도입 단편 1을 포함하는 벡터 pDCM2-ilvC(Q87V)를 제조하였다.
프라이머 염기 서열
서열번호 4 CCCGGG GCACTGCTTGATGTGATGGAACCAT
서열번호 5 CCCGGG GTCAACGATGAGCTTGAGCTCGT
상기 pDCM2-ilvC(Q87V)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(Kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 4와 서열번호 5를 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 ilvC 유전자의 ORF 내 서열번호 1의 아미노산 87번 위치에 글루타민이 발린으로 치환된 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P::ilvC(Q87V) 라 명명하였다.발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P, KCCM11201P::ilvC(Q87V)의 발린 생산능을 비교하기 위하여 플라스크 평가를 수행하였다. 각각 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표3에 나타내었다.
[영양배지 (pH 7.2)]
포도당 10g, 육추출물 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모추출물 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
[생산배지 (pH 7.0)]
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
KCCM11201P 및 KCCM11201P::ilvC(Q87V) L-발린 생산능
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
KCCM11201P 2.8 2.7 2.8 2.7
KCCM11201P::ilvC(Q87V) 3.1 3.2 3.3 3.2
그 결과, KCCM11201P::ilvC(Q87V) 균주의 L-발린 생산능은 KCCM11201P 대비 16% 증가함을 확인하였다.
실시예3-2: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V 균주에서 ilvC 변이가 도입된 균주 제작 및 L-발린 생산능 평가
L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 L-발린 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 1종의 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 상기 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. ilvN 유전자에 A42V 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서, 서열번호 6와 서열번호 7의 프라이머 쌍 및 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 단편(A, B)을 각각 얻었다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 단편 A, B 각각 528 bp, 509bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 상기 두 단편을 주형으로 서열번호 6과 서열번호 9를 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하여 1010bp의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편 2"라 명명함)을 얻었다.
상기 얻어진 변이 도입 단편 2를 제한효소 SmaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDCM2벡터와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-spin 플라스미드 DNA 정제 키트(iNtRON 사)로 DNA를 획득하였다. 상기 ilvN 유전자의 A42V 변이 도입을 목적으로 하는 벡터를 pDCM2-ilvN(A42V)라 명명하였다.
프라이머 염기 서열
서열번호 6 cggggatcccccgggAGGACGGTACTCAAATACTAAACTTC
서열번호 7 TGCCGAGTGTTTCGGTCTTTACAGACACGAGGGACACG
서열번호 8 TGTCTGTAAAGACCGAAACACTCGGCATCAA
서열번호 9 cggggatcccccgggGACAACTACATTATTATTATACCACA
이후, 상기 pDCM2-ilvN(A42V)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 6와 서열번호 9를 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이 삽입 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V라 명명하였다. 마지막으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V를 상기 실시예 3-1와 같은 방법으로 벡터를 형질전환시킨 균주를 제작하고 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V::ilvC(Q87V)라 명명하였다. 제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 5에 나타내었다.
CJ7V, CJ7V::ilvC(Q87V)의 L-발린 생산능
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
CJ7V 2.2 2.1 2.2 2.2
CJ7V::ilvC(Q87V) 2.6 2.5 2.6 2.6
그 결과, CJ7V::ilvC(Q87V) 균주의 L-발린 생산능은 CJ7V 대비 18% 증가함을 확인하였다.
실시예3-3: 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V 균주에서 ilvC 변이가 도입된 균주 제작 및 L-발린 생산능 평가
L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 L-발린 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 1종의 변이 [ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주를 제작하였다(KR 10-1947945 B1).
구체적으로 실시예 3-2 에서 상기 제작한 벡터 pDCM2-ilvN(A42V)를 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주에 형질전환시켜 염색체 상에서 상동성 재조합을 유도하였다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 10 및 11 서열의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이가 제대로 도입되었음을 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V라고 각각 명명하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 6에 기재하였다.
프라이머 염기 서열
서열번호 10 CCGCGTCACCAAAGCGGA
서열번호 11 TTAGATCTTGGCCGGAGCCA
마지막으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V를 상기 실시예 3-1와 같은 방법으로 벡터를 형질전환시킨 균주를 제작하고 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V::ilvC(Q87V)라 명명하였다. 제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 7에 나타내었다.
CJ8V, CJ8V::ilvC(Q87V)의 L-발린 생산능
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
CJ8V 1.9 1.8 1.9 1.9
CJ8V::ilvC(Q87V) 2.3 2.3 2.3 2.3
그 결과, CJ8V::ilvC(Q87V) 균주의 L-발린 생산능은 CJ8V 대비 21% 증가함을 확인하였다.
실시예 4. Q87X 변이가 도입된 KCCM11201P 균주 제작 및 발린 생상능 확인
ilvC의 87번째 아미노산인 글루타민을 발린 이외 다른 아미노산으로 변이를 주기 위해서 상기 실시예 3-1에서 사용된 pDCM2-ilvC(Q87V) 를 주형으로 Site-Directed Mutagenesis 를 수행하였다. Site-Directed mutagenesis는 아래의 방법으로 수행되었다.
Site-Direction Mutagenesis PCR 조성
단위 (ul)
10X pfu-X Buffer 5
10mM dNTP Mix 1
pfu-X Polymerase 1
Mutagenic forward primer(5pmol) 2
Mutagenic reverse primer(5pmol) 2
pDCM2-ilvC(Q87V) (template DNA, 200ng/ul) 1
dH2O 38
Total 50
Site-Direction Mutagenesis PCR cycle
Cycle Temperature Time
1 95 ℃ 1 min
18 95 ℃ 50 sec
60 ℃ 50 sec
68 ℃ 9 min
1 68 ℃ 7 min
ilvC 87번째 아미노산인 글루타민을 발린 이외 다른 아미노산인 알라닌(A) (서열번호 12), 발린(V) (서열번호 3), 이소류신(I) (서열번호 13), 글리신(G) (서열번호 14), 페닐알라닌(F) (서열번호 15), 메치오닌(M) (서열번호 16), 세린(S) (서열번호 17), 프롤린(P) (서열번호 18), 쓰레오닌(T) (서열번호 19), 타이로신(Y) (서열번호 20), 히스티딘(H) (서열번호 21), 글루타민(Q) (서열번호 22), 아스파라진(N) (서열번호 23), 라이신(K) (서열번호 24), 아스파테이트(D) (서열번호 25), 시스테인(C) (서열번호 26), 트립토판(W) (서열번호 27), 알지닌(R) (서열번호 28), 글루타메이트(E) (서열번호 29)으로 치환하기 위해서 [표 10] 에서 표기한 각각의 mutagenic primer 세트를 이용해서 [표 8]과 같은 PCR mixture를 만들고 [표 9]의 cycle로 PCR 을 수행하였다. PCR이 종료되고 Infusion Cloning Kit (Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 transformation하여 확보한 pDCM2_ilvC 변이형 플라스미드를 시퀀싱을 통해서 [표 10]에 표기한 각각의 변이로 교체되었음을 확인하였다.
ilvC 아미노산 서열의 87번 아미노산 변이형 플라스미드 제작을 위한 mutagenic primer 세트
변이형 ilvC 플라스미드 서열번호 서열(5'-3')
pDCM2_ilvC(Q87A) 30 CAGACACCTCCgcgGCAGAAATCTTCACCAAC
31 AAGATTTCTGCcgcGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87I) 32 CAGACACCTCCattGCAGAAATCTTCACCAAC
33 AAGATTTCTGCaatGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87G) 34 CAGACACCTCCggaGCAGAAATCTTCACCAAC
35 AAGATTTCTGCtccGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87F) 36 CAGACACCTCCttcGCAGAAATCTTCACCAAC
37 AAGATTTCTGCgaaGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87M) 38 CAGACACCTCCatgGCAGAAATCTTCACCAAC
39 AAGATTTCTGCcatGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87S) 40 CAGACACCTCCtctGCAGAAATCTTCACCAAC
41 AAGATTTCTGCagaGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87P) 42 CAGACACCTCCcctGCAGAAATCTTCACCAAC
43 AAGATTTCTGCaggGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87T) 44 CAGACACCTCCaccGCAGAAATCTTCACCAAC
45 AAGATTTCTGCggtGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87Y) 46 CAGACACCTCCtatGCAGAAATCTTCACCAAC
47 AAGATTTCTGCataGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87H) 48 CAGACACCTCCcatGCAGAAATCTTCACCAAC
49 AAGATTTCTGCatgGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87Q) 50 CAGACACCTCCcagGCAGAAATCTTCACCAAC
51 AAGATTTCTGCctgGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87N) 52 CAGACACCTCCaatGCAGAAATCTTCACCAAC
53 AAGATTTCTGCattGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87K) 54 CAGACACCTCCaagGCAGAAATCTTCACCAAC
55 AAGATTTCTGCcttGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87D) 56 CAGACACCTCCgatGCAGAAATCTTCACCAAC
57 AAGATTTCTGCatcGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87C) 58 CAGACACCTCCtgtGCAGAAATCTTCACCAAC
59 AAGATTTCTGCacaGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87W) 60 CAGACACCTCCtggGCAGAAATCTTCACCAAC
61 AAGATTTCTGCccaGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87R) 62 CAGACACCTCCagaGCAGAAATCTTCACCAAC
63 AAGATTTCTGCtctGGAGGTGTCTGGAGCCAG
pDCM2_ilvC(Q87E) 64 CAGACACCTCCgaaGCAGAAATCTTCACCAAC
65 AAGATTTCTGCttcGGAGGTGTCTGGAGCCAG
상기 [표10]과 같이 제작된 pDCM2_ilvC(Q87A), pDCM2_ilvC(Q87I), pDCM2_ilvC(Q87G), pDCM2_ilvC(Q87F), pDCM2_ilvC(Q87M), pDCM2_ilvC(Q87S), pDCM2_ilvC(Q87P), pDCM2_ilvC(Q87T), pDCM2_ilvC(Q87Y), pDCM2_ilvC(Q87H), pDCM2_ilvC(Q87Q), pDCM2_ilvC(Q87N), pDCM2_ilvC(Q87K), pDCM2_ilvC(Q87D), pDCM2_ilvC(Q87C), pDCM2_ilvC(Q87W), pDCM2_ilvC(Q87R), pDCM2_ilvC(Q87E) 벡터를 KCCM11201P 에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 ilvC 유전자가 삽입된 18종의 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 up stream 지역과 down stream 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다.
이렇게 수득한 형질전환 균주를 각각 KCCM11201P::ilvC(Q87A), KCCM11201P::ilvC(Q87I), KCCM11201P::ilvC(Q87G), KCCM11201P::ilvC(Q87F), KCCM11201P::ilvC(Q87M), KCCM11201P::ilvC(Q87S), KCCM11201P::ilvC(Q87P), KCCM11201P::ilvC(Q87T), KCCM11201P::ilvC(Q87Y), KCCM11201P::ilvC(Q87H), KCCM11201P::ilvC(Q87Q), KCCM11201P::ilvC(Q87N), KCCM11201P::ilvC(Q87K), KCCM11201P::ilvC(Q87D), KCCM11201P::ilvC(Q87C), KCCM11201P::ilvC(Q87W), KCCM11201P::ilvC(Q87R), KCCM11201P::ilvC(Q87E) 라 명명하였다.
실시예 3-1 에서 만들어진 KCCM11201P::ilvC(Q87V) 와 KCCM11201P::ilvC(Q87A), KCCM11201P::ilvC(Q87I), KCCM11201P::ilvC(Q87G), KCCM11201P::ilvC(Q87F), KCCM11201P::ilvC(Q87M), KCCM11201P::ilvC(Q87S), KCCM11201P::ilvC(Q87P), KCCM11201P::ilvC(Q87T), KCCM11201P::ilvC(Q87Y), KCCM11201P::ilvC(Q87H), KCCM11201P::ilvC(Q87Q), KCCM11201P::ilvC(Q87N), KCCM11201P::ilvC(Q87K), KCCM11201P::ilvC(Q87D), KCCM11201P::ilvC(Q87C), KCCM11201P::ilvC(Q87W), KCCM11201P::ilvC(Q87R), KCCM11201P::ilvC(Q87E) 균주의 발린 생산량을 확인하고자 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 11에 나타내었다.
ilvC 아미노산 서열의 87번 아미노산이 변이형으로 교체된 균주의 L-발린 생산능
　 균주명 L-발린(g/L)
대조군 KCCM11201P 2.8
실험군 KCCM11201P::ilvC(Q87V) 3.3
KCCM11201P::ilvC(Q87A) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87I) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87G) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87F) 2.3
KCCM11201P::ilvC(Q87M) 2.4
KCCM11201P::ilvC(Q87S) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87P) 2.4
KCCM11201P::ilvC(Q87T) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87Y) 2.5
KCCM11201P::ilvC(Q87H) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87Q) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87N) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87K) 2.8
KCCM11201P::ilvC(Q87D) 2.9
KCCM11201P::ilvC(Q87C) 2.5
KCCM11201P::ilvC(Q87W) 2.5
KCCM11201P::ilvC(Q87R) 2.7
KCCM11201P::ilvC(Q87E) 2.8
그 결과, KCCM11201P::ilvC(Q87V) 균주의 L-발린 생산능은 KCCM11201P 대비 16% 증가하였고, KCCM11201P::ilvC(Q87D) 균주의 L-발린 생산능 역시 KCCM11201P 증가함을 확인하였다. 그 외 다른 변이가 도입된 균주는 KCCM11201P 와 동등한 생산능을 보이거나 효과가 미미하였다.
이를 통해, 본 출원의 변이체가 미생물의 L-발린 생산을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)로 치환된, 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 3 또는 서열번호 25; 또는 이와 80% 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)로 치환된 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인, 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 미생물.
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)로 치환된 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-발린 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서 상기 방법은 L-발린을 회수하는 단계를 더 포함하는, L-발린 생산 방법.
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 87번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린(V) 또는 아스파테이트(D)로 치환된 케톨산 리덕토아이소머라제 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물; 상기 미생물을 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는, L-발린 생산용 조성물.
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