WO2024043322A1

WO2024043322A1 - 目的ウイルスの製造方法、および培養組成物

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Publication number: WO2024043322A1
Application number: PCT/JP2023/030630
Authority: WO
Inventors: 勇介森; 彩也子梅谷; 圭一小野寺; 太一村口
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2022-08-25
Filing date: 2023-08-25
Publication date: 2024-02-29
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: JPWO2024043322A1; EP4578943A1; EP4578943A4; US20250188427A1; CN120092093A

Abstract

本発明の課題は、ウイルスの製造量を向上できる目的ウイルスの製造方法、並びに動物細胞とウイルスと培地とを含む培養組成物であってウイルスの製造量が向上している培養組成物を提供することである。本発明によれば、目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入された動物細胞を、ＢＥＴの機能を抑制させた状態で培地で培養するウイルス製造工程を含む、目的ウイルスの製造方法が提供される。

Description

目的ウイルスの製造方法、および培養組成物

　本発明は、動物細胞を所定の状態で培養することを含む、目的ウイルスの製造方法に関する。さらに本発明は、動物細胞とウイルスと培地とを含む培養組成物に関する。

　アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属する直鎖状一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶゲノムは、複製の調節遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子）とカプシドの構造遺伝子（Ｃａｐ遺伝子）を含み、ウイルスの複製とパッケージングのために逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。ＡＡＶベクターは増殖又は非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能であり、特に非分裂細胞においては長期間の発現が可能である。また、ＡＡＶは、非病原性であると考えられており、免疫原性が低い。上記のことから、ＡＡＶベクターは、遺伝子治療用ベクターとして臨床応用が進んでいる。

　一方で、組み換えタンパク質の製造量を向上させる方法としては、特許文献１には、抗体遺伝子を導入したＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）をＢＥＴ（ブロモドメインおよびエクストラターミナルモチーフ）阻害剤で処理することにより、抗体の製造量（力価）を向上させることが記載されている。特許文献２には、ヒトに感染したＨＳＶのウイルス製造をブロモドメイン阻害剤により向上させることが記載されている。特許文献３および特許文献４には、細胞に潜在するＨＩＶを再活性化して感染細胞を除去する治療方法が記載され、ブロモドメインタンパク質ＰＣＡＦの阻害剤またはＪＱ１を使用することが記載されている。

ＷＯ２０１７／１９２６９１Ａ号公報ＣＮ１０６５５１９３９Ａ号公報ＵＳ２０１５／０１３３４３４号公報ＵＳ２０１８／０００２６９９号公報

　現在、ＡＡＶベクターによる遺伝子治療薬が上市されるようになり、ＡＡＶベクターなどのウイルスの製造量を向上させた製造方法の開発が望まれている。本発明は、ウイルスの製造量を向上できる目的ウイルスの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、動物細胞とウイルスと培地とを含む培養組成物であって、ウイルスの製造量が向上している培養組成物を提供することを解決すべき課題とする。

　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入された動物細胞を、ＢＥＴの機能を抑制させた状態で培地で培養することによって、目的ウイルスの製造量を向上できることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。

　本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入された動物細胞を、ＢＥＴの機能を抑制させた状態で培地で培養するウイルス製造工程を含む、目的ウイルスの製造方法。
＜２＞　上記ＢＥＴの機能を抑制することによりＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写が促進される、＜１＞に記載の方法。
＜３＞　培地がＢＥＴ阻害剤を含有することにより、上記ＢＥＴの機能が抑制される、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞　ＢＥＴ阻害剤のＢＲＤ２、ＢＲＤ３またはＢＲＤ４のいずれかに対する平衡解離定数：Ｋｄ値が１５０ｎｍｏｌ／Ｌ以下である、＜１＞～＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞　ＢＥＴ阻害剤が、
（Ｓ）－（＋）－ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセテート、
２－メトキシ－Ｎ－（３－メチル－２－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロ－キナゾリン－６－イル）－ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ－［６－（３－メタンスルホンアミド－４－メチルフェニル）－３－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジン－８－イル］カルバメート、
（４Ｓ）－６－（４－クロロフェニル）－Ｎ－エチル－８－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン－４－　アセトアミド、
７，３，５－ジメチル－４－イソキサゾリル－１，３－ジヒドロ－８－メトキシ－１－［１Ｒ－１－（２－ピリジニル）エチル］－２Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン、および
６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－アセトアミド
からなる群のうちの少なくとも一つである、＜１＞～＜４＞のいずれか一に記載の方法。
＜６＞　ＢＥＴ阻害剤が、
（Ｓ）－（＋）－ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセテート、
２－メトキシ－Ｎ－（３－メチル－２－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロ－キナゾリン－６－イル）－ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ－［６－（３－メタンスルホンアミド－４－メチルフェニル）－３－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジン－８－イル］カルバメート、および
（４Ｓ）－６－（４－クロロフェニル）－Ｎ－エチル－８－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン－４－　アセトアミド
からなる群のうちの少なくとも一つである、＜１＞～＜５＞のいずれか一に記載の方法。
＜７＞　培地中におけるＢＥＴ阻害剤の濃度が０．０１μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌである、＜３＞～＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞　動物細胞において、上記外来性組み換え核酸が恒常発現系で発現されている、＜１＞～＜７＞のいずれか一に記載の方法。
＜９＞　上記外来性組み換え核酸の少なくとも一つが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩで制御されるプロモーターを含む、＜１＞～＜８＞のいずれか一に記載の方法。
＜１０＞　上記目的ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、＜１＞～＜９＞のいずれか一に記載の方法。
＜１１＞　上記外来性組み換え核酸が、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ－ＲＮＡ、ＲｅｐおよびＣａｐをコードする核酸である、＜１＞～＜１０＞のいずれか一に記載の方法。
＜１２＞　上記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩで制御されるプロモーターから転写される遺伝子がＶＡ－ＲＮＡＩである、＜９＞に記載の方法。
＜１３＞　上記外来性組み換え核酸の遺伝子転写産物である少なくとも一つのＲＮＡの発現が、ＢＥＴの機能を抑制させていない状態で培養した場合と比較して１０倍以上である、＜１＞～＜１２＞のいずれか一に記載の方法。
＜１４＞　上記外来性組み換え核酸が少なくともＥ２ＡおよびＶＡ－ＲＮＡＩをコードする核酸を含み、Ｅ２ＡとＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子のＲＮＡ発現比率がＥ２Ａ：ＶＡ－ＲＮＡＩ＝１：１～１：１０である、＜１＞～＜１３＞のいずれか一に記載の方法。
＜１５＞　動物細胞がＨＥＫ２９３細胞である、＜１＞～＜１４＞のいずれか一に記載の方法。
＜１６＞　上記外来性組み換え核酸のうちの少なくとも一つが、条件特異的に発現を誘導する核酸配列を含む、＜１＞～＜１５＞のいずれか一に記載の方法。
＜１７＞　条件特異的に発現を誘導する刺激を付与することにより、条件特異的に発現を誘導する、＜１６＞に記載の方法。
＜１８＞　条件特異的に発現を誘導する刺激が、培地がドキシサイクリンを含むことである、＜１＞～＜１７＞のいずれか一に記載の方法。
＜１９＞　培地にＢＥＴ阻害剤を含む期間が１時間以上である、＜１＞～＜１８＞のいずれか一に記載の方法。
＜２０＞　製造したウイルスを回収する前に、ＢＥＴの機能の抑制を停止することを含む、＜１＞～＜１９＞のいずれか一に記載の方法。
＜２１＞　ＢＥＴ阻害剤を低減又は除去した培地で培養することにより、ＢＥＴの機能の抑制を停止する、＜２０＞に記載の方法。
＜２２＞　ＢＥＴ阻害剤を低減又は除去した培地で１時間以上培養する、＜２１＞に記載の方法。
＜２３＞　培養中に培地を供給し、供給される培地がドキシサイクリンとＢＥＴ阻害剤とを含む、＜１＞～＜２２＞の何れか一に記載の方法。
＜２４＞　細胞の播種時の細胞密度が１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、＜１＞～＜２３＞のいずれか一に記載の方法。
＜２５＞　ウイルス製造工程の前に、細胞を増殖させる増殖工程を含む、＜１＞～＜２４＞のいずれか一に記載の方法。
＜２６＞　ウイルス製造工程の前に、ドキシサイクリン及びＢＥＴ阻害剤を含まない培地で細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上になるまで培養する増殖工程を含み、ウイルス製造工程での培地がドキシサイクリン及びＢＥＴ阻害剤を含む、＜２５＞に記載の方法。
＜２７＞　ウイルス製造工程の少なくとも一部が、灌流培養である、＜１＞～＜２６＞のいずれか一に記載の方法。
＜２８＞　ウイルス製造工程の期間が、２４時間以上３０日以下である、＜１＞～＜２７＞のいずれか一に記載の方法。
＜２９＞　ウイルスを回収することを含む、＜１＞～＜２８＞のいずれか一に記載の方法。
＜３０＞　目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入され、かつＢＥＴの機能が抑制されている動物細胞と、
ウイルスと、
培地とを、
含む培養組成物。
＜３１＞　ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、＜３０＞に記載の培養組成物。
＜３２＞　培地がＢＥＴ阻害剤を含む、＜３０＞または＜３１＞に記載の培養組成物。

　本発明によれば、目的ウイルスの製造量を向上させることができる。

図１は、２４ｗｅｌｌプレートで培養した細胞を用いた化合物処理時におけるＡＡＶ製造量を示す。図２は、２４ｗｅｌｌプレートで培養した細胞を用いた化合物処理時における遺伝子発現量を示す。各欄は、左からＥ４、ＶＡ―ＲＮＡ、Ｅ２Ａ、ＲｅｐおよびＣａｐの発現を示す。図３は、９６ｗｅｌｌプレートで培養した細胞を用いた化合物処理時におけるＡＡＶ製造量を示す。各欄は、左から１．３５μｍｏｌ／Ｌ（図中では１．３５μＭ）、０．４５μｍｏｌ／Ｌ（図中では０．４５μＭ）、０．１５μｍｏｌ／Ｌ（図中では０．１５μＭ）の結果を示す。図４は、化合物処理（４μｍｏｌ／Ｌ（図中では４μＭ）のＪＱ１）におけるＡＡＶ製造量を示す。

　以下、本開示の実施形態の一例について説明する。但し、本開示は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本開示の目的の範囲内において、適宜、変更を加えて実施することができる。本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。

＜用語の説明＞
　プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させることができ、下流のコード配列又は非コード配列の転写開始に関与するＤＮＡ制御領域／配列を意味する。

　ベクターとは、外来遺伝子を別の細胞に人為的に運ぶために利用されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。遺伝子を発現するためのベクターを発現ベクターという。導入したい外来遺伝子を含むベクターが細胞内に導入されると、細胞内において外来遺伝子の複製及び／又は発現が行われる。ベクターとしては、エピソーム性（例えばプラスミド）ベクター、及び非エピソーム性ベクターが挙げられる。ベクターは、トランスフェクション、トランスダクション、細胞融合及びリポフェクションなどの方法により、宿主細胞に導入することができる。

　本明細書において、遺伝子は、ポリペプチドもしくはＲＮＡをコードする核酸分子を意味し、例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡといった核酸分子が挙げられる。

＜目的ウイルスの製造方法＞
　本発明の目的ウイルスの製造方法は、目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入された動物細胞を、ＢＥＴの機能を抑制させた状態で培地で培養するウイルス製造工程を含む。

　ＢＥＴの機能を抑制する方法としては、（１）ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）による処理によるＢＥＴの機能の抑制、（２）ｓｉＲＮＡもしくは遺伝子編集による、ＢＥＴの発現の阻害（ＢＥＴ関連遺伝子に変異を加える、もしくは、発現量を変更する）、（３）ペプチドもしくはタンパク質の過剰発現による競合阻害などが挙げられる。また、上記の同様の方法を用いてＢＥＴによる分子シグナルの上流もしくは下流のタンパク質（例えば、アセチル化ヒストン、Ｐ－ＴＥＦｂ）を制御することでＢＥＴの機能を抑制する方法が挙げられる。上記の中でも、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）による処理によるＢＥＴの機能の抑制が好ましい。
　ブロモドメインは、ヒストンのアセチル化リジンを認識し、制御タンパク質を集めてクロマチン構造および遺伝子発現を制御する機能が知られているタンパク質ドメインである。ヒトでは約５０種類のブロモドメイン含有タンパク質が存在する。ブロモドメインを含むタンパク質としては、ブロモドメイン繰り返し配列および特異的末端配列を持つｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａ－ｔｅｒｍｉｎａｌファミリータンパク質（ＢＥＴ）が挙げられる。ＢＥＴとしては、ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２（ＢＲＤ２）、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４およびＢＲＤＴが知られている。これらのタンパク質は、それぞれＮ末端ブロモドメインであるＢｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ１（ＢＤ１）およびＢｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ２（ＢＤ２）を有する。

　好ましくは、培地にＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を含有させることにより、ＢＥＴの機能を抑制することができる。ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）とは、タンパク質のブロモドメインに結合してブロモドメインの機能を阻害する物質である。ＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４はブロモドメインを有しており、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３および／またはＢＲＤ４の機能が、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）により阻害される。

　ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）については、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３またはＢＲＤ４のいずれかに対する平衡解離定数：Ｋｄ値が１５０ｎｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、５０ｎｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましい。

　好ましくは、ＢＲＤ４内のブロモドメイン１に対するＫｄ値が１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であって、ブロモドメイン２に対するＫｄ値が２５０ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。より好ましくは、ブロモドメイン１に対するＫｄ値が７０ｎｍｏｌ／Ｌ以下であって、ブロモドメイン２に対するＫｄ値が２００ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。

　表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定装置において、センサーチップの金属薄膜表面で全反射するように偏光を照射すると、反射光の一部に反射光強度が低下したＳＰＲシグナルが観察される。ＳＰＲシグナルの生じる角度はセンサーチップ上の質量に依存して変化することから、センサーチップ上に固定したリガンドと添加したアナライトが結合又は解離することにより、ＳＰＲシグナルの生じる角度が変化する。測定結果は，ＳＰＲシグナルの角度変化や、角度変化から換算されるレスポンスユニット（ＲＵ）を経時的に示したセンサーグラムとして取得することができる。取得された結合及び解離のセンサーグラムを理論曲線にフィッティングさせることにより、リガンドとアナライトの結合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）を求めることができ、さらに平衡解離定数（Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ）を求めることができる。

　ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）については、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３またはＢＲＤ４のいずれかに対するＩＣ５０が１μｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、５００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、２００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましく、５０ｎｍｏｌ／Ｌ以下であることが特に好ましい。

　ＢＲＤ２、ＢＲＤ３またはＢＲＤ４のいずれかに対するＩＣ５０は、阻害剤の濃度に対してアセチル化ヒストンとブロモドメインの結合阻害値をプロットし、阻害率５０％に相当する濃度を算出することで求めることができる。

　ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）としては、特に限定されないが、
（＋）－ＪＱ１（別名（Ｓ）－（＋）－ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセテート［Ｃａｓ＃：１２６８５２４－７０－４］）、
ＰＦＩ－１（別名２－メトキシ－Ｎ－（３－メチル－２－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロ－キナゾリン－６－イル）－ベンゼンスルホンアミド［Ｃａｓ＃：１４０３７６４－７２－６］）、
Ｂｒｏｍｏｓｐｏｒｉｎｅ（別名Ｎ－［６－（３－メタンスルホンアミド－４－メチルフェニル）－３－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジン－８－イル］カルバメート［Ｃａｓ＃：１６１９９９４－６９－２］）、
Ｉ－ＢＥＴ７６２（別名（４Ｓ）－６－（４－クロロフェニル）－Ｎ－エチル－８－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン－４－　アセトアミド［Ｃａｓ＃：１２６０９０７－１７－２］）
Ｉ－ＢＥＴ１５１（別名７，３，５－ジメチル－４－イソキサゾリル－１，３－ジヒドロ－８－メトキシ－１－［１Ｒ－１－（２－ピリジニル）エチル］－２Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン［Ｃａｓ＃：１３０００３１－４９－５］））、及び
ＯＴＸ０１５（別名６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－アセトアミド［Ｃａｓ＃：２０２５９０－９８－５］）
などが挙げられる。その他化合物として、ＣＰＩ－２０３［Ｃａｓ＃：１４４６１４４－０４－２］、ＲＶＸ－２０８［Ｃａｓ＃：１０４４８７０－３９－４］、ＢＩ－２５３６［Ｃａｓ＃：７５５０３８－０２－９］、ＡＺＤ　５１５３［Ｃａｓ＃：１８６９９１２－３９－９］が挙げられる。
　上記の中でも、（＋）－ＪＱ１、ＰＦＩ－１、Ｂｒｏｍｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｉ－ＢＥＴ７６２、Ｉ－ＢＥＴ１５１及びＯＴＸ０１５が好ましく、（＋）－ＪＱ１、ＰＦＩ－１、Ｂｒｏｍｏｓｐｏｒｉｎｅ及びＩ－ＢＥＴ７６２がより好ましく、（＋）－ＪＱ１、ＰＦＩ－１がさらに好ましい。

　培地中におけるＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）の濃度は、好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌである。

　ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）による処理期間、即ち培地にＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を含む期間は、好ましくは１時間以上２４０時間以下であり、より好ましくは６時間以上２４０時間時間以下であり、さらに好ましくは１２時間以上２４０時間以下であり、さらに好ましくは２４時間以上１２０時間以下であり、特に好ましくは４８時間以上９６時間以下である。培地にＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を含む期間の上限は特に限定されいないが、一般的には２４０時間以下であり、好ましくは１２０時間以下であり、特に好ましくは９６時間以下である。

　外来性組み換え核酸を発現させるためにドキシサイクリン誘導プロモーターを使用する場合には、培地は、ドキシサイクリンを含んでいてもよい。ドキシサイクリンの濃度は、好ましくは５μｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは７００ｎｇ／ｍＬ以下であり、特に好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ以下である。
　ドキシサイクリンの添加時間は、１時間以上が好ましく、さらに好ましくは６時間以上、さらに好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上、さらに好ましくは４８時間以上である。

　本発明においては、好ましくは培養中に培地を供給し、供給される培地がドキシサイクリンとＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）とを含むものでもよい。
　供給される培地とは、細胞培養中に添加する培地のことである。供給される培地を用いる培養方法は特に限定されないが、灌流培養が望ましい。
　ドキシサイクリンとＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を作用させる期間としては、１時間以上が好ましく、さらに好ましくは６時間以上、さらに好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上、さらに好ましくは４８時間以上である。

　本発明の方法は、製造したウイルスを回収する前に、ＢＥＴの機能の抑制を停止することを含んでいてもよい。ＢＥＴの機能の抑制を停止するとは、ＢＥＴの発現を阻害する因子の除去、もしくは培地中から阻害剤を除去することを意味する。除去の方法は特に限定されないが、細胞を培養している培地を全部もしくは部分的に交換することが好ましい。好ましくは、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を低減又は除去した培地で培養することにより、ＢＥＴの機能の抑制を停止することができる。これにより、遺伝子治療薬として使用するウイルス組成物に、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）が混入することを回避することができる。
ＢＥＴの機能の抑制を停止する期間は、２４～７２時間が好ましい。

　細胞を培養している培地を全部もしくは部分的に交換することで、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を低減又は除去した培地で培養する期間は１時間以上が好ましく、１～２４０時間がより好ましく、１２～１２０時間がさらに好ましく、２４～７２時間が特に好ましい。

　また、ＢＥＴの機能を停止する間に後述するような条件特異的に発現を誘導する刺激を行っている場合には、ＢＥＴの機能の抑制を停止した後にも、条件特異的に発現を誘導する刺激を続けることが好ましい。

　逆に、ＢＥＴの機能の抑制を停止に伴って、条件特異的に発現を誘導する刺激を停止させてもよい。条件特異的に発現を誘導する刺激がテトラサイクリン系薬剤を添加することによる場合には、テトラサイクリン系薬剤を培地中から低減させるために、テトラサイクリン系薬剤を含まない培地で置換することで、条件特異的に発現を誘導する刺激を停止することができる。また、テトラサイクリン系薬剤がドキシサイクリンである場合も同様にドキシサイクリンを含まない培地へと置換することができる。

　好ましくは、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）及びテトラサイクリン系薬剤を含む培地で１２～４８時間培養した後に、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を含まない培地へ置換し、２４～７２時間培養することが好ましい。

　本発明においては、好ましくは、ＢＥＴの機能を抑制することによりＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写が促進される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩとは、真核細胞内に存在するＲＮＡ転写因子である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写を促進するプロモーターとしては、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーターが挙げられる。促進とは、好ましくはＲＮＡレベルで２倍以上増加することである。
　後記するＶＡ－ＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより発現誘導されることが知られている。

　本発明においては、目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入された動物細胞を使用する。
　目的ウイルスとは、外来核酸を細胞に導入して製造させるウイルスを意味する。目的ウイルスとしては、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスなどが挙げられ、上記の中でもアデノ随伴ウイルスが好ましい。

　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科及びディペンドパルボウイルス属のファミリーの約４７００塩基からなる一本鎖ＤＮＡを含む、小型の、複製能の不完全な、非エンベロープ型ウイルスを指す。ＡＡＶには１００を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。血清型２（ＡＡＶ２）は古くから広く研究されてきた血清型の一つであり、宿主域が非常に広いことが知られている。血清型１（ＡＡＶ１）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）は、より高い組織指向性を持った血清型である。ＡＡＶ１は筋肉、肝臓、気道、中枢神経系等、ＡＡＶ５は中枢神経系、肝臓、網膜等、ＡＡＶ６は心臓、筋肉、肝臓等への遺伝子導入効率が高いと言われている。本発明においては血清型２または血清型５で用いることが好ましい。特に好ましくは血清型５である。

　アデノ随伴ウイルス遺伝子とは、一つ又は複数のアデノ随伴ウイルスの血清型に由来する一つ又は複数の核酸配列から構成される遺伝子を指す。アデノ随伴ウイルス遺伝子は、好ましくは、ＡＡＶの複製及びパッケージングに関与する遺伝子、及びＡＡＶ構成タンパク質をコードする遺伝子である。

　ＡＡＶは、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下で増殖する非エンベロープウイルスである。遺伝子治療もしくは核酸導入に用いるＡＡＶを作製する際には、古典的にはアデノウイルスを宿主細胞に共感染させて、ＡＡＶ複製が行なわれていた。また、アデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子が明らかにされ、この遺伝子を組み込んだプラスミドも使用されている。例えば、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含むプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、および治療又は予防用遺伝子を含むプラスミドを同時に細胞にトランスフェクションすることで組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）へとパッケージングすることができる。

　Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子は、ビリオンの複製とパッケージングに関与するタンパク質をコードしている。Ｒｅｐ遺伝子は野生型では、Ｐ５プロモーターおよびｐ１９プロモーターから発現される。Ｃａｐ領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を発現させる。Ｃａｐ遺伝子が天然に保持するプロモーターとしてはｐ４０プロモーターを挙げることができる。

　アデノ随伴ウイルス遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子など）は、野生型の遺伝子でもよいが、本来有する機能を発揮するものである限り、野生型の遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変がなされた遺伝子を使用してもよい。

　野生型のアデノ随伴ウイルス遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子など）に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変を行う場合、改変される塩基の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～３個である。改変を加えたアデノ随伴ウイルス遺伝子の塩基配列は、野生型のアデノ随伴ウイルス遺伝子の塩基配列と、好ましくは８５％以上の配列同一性を示し、より好ましくは９０％以上の配列同一性を示し、更に好ましくは、９５％以上の配列同一性を示し、更により好ましくは９８％以上の配列同一性を示す。

　Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を細胞に導入する場合、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含むベクターを細胞に導入することができる。ベクターにおけるＲｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子の配置は特に限定されず、Ｒｅｐ遺伝子は、Ｃａｐ遺伝子の上流に位置してもよいし、Ｃａｐ遺伝子の下流に位置してもよいが、好ましくは、Ｒｅｐ遺伝子は、Ｃａｐ遺伝子の上流に位置する。

　Ｒｅｐ遺伝子は、当業者に公知の、ウイルスゲノムの複製に集合的に必要とされるウイルスの複製タンパク質、又は、例えばヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）Ｒｅｐ遺伝子など（ＡＡＶ－２ＤＮＡ複製を媒介することが公知）の、その機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。したがって、Ｒｅｐ遺伝子のコード領域は少なくとも、ＡＡＶのＲＥＰ７８及びＲＥＰ６８（長い形態のＲＥＰタンパク質）並びにＲＥＰ５２及びＲＥＰ４０（短い形態のＲＥＰタンパク質）をコードする遺伝子又はその機能的ホモログを含む。本発明で用いられるＲｅｐ遺伝子のコード領域は、いかなるＡＡＶ血清型に由来するものでもよいが、ＡＡＶ２に由来するものが好ましい。ＡＡＶ２に由来するものとしては、ＲＥＰ７８及びＲＥＰ６８並びにＲＥＰ５２及びＲＥＰ４０、ＩＴＲが挙げられる。

　Ｃａｐ遺伝子は、当業者に公知のウイルスのカプシドタンパク質をコードするＡＡＶゲノム中の領域を意味する。これらのカプシドタンパク質の例は、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３である。本発明において使用するＣａｐ遺伝子は、いかなるＡＡＶ血清型に由来するものでもよいが、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ５に由来するものが好ましい。特に好ましくはＡＡＶ５である。

　Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含むベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルス由来の核酸配列、人工的に設計した核酸などを使用することができ、好ましくは、プラスミドである。

　本発明においては、治療又は予防用遺伝子を細胞に導入してもよい。治療又は予防用遺伝子はＩＴＲに挟まれた状態で導入されていることが好ましい。

　治療又は予防用遺伝子としては、標的細胞のゲノムにおいては不完全であるか又は失われている遺伝子、または、所望の生物学的又は治療的効果（例えば抗ウイルス機能）を有する非天然タンパク質をコードする遺伝子などを使用することができるが、特に限定されない。治療又は予防用遺伝子の具体例としては、炎症性疾患、自己免疫、慢性及び伝染性疾患（ＡＩＤＳ、癌、神経系疾患、心血管疾患、過剰コレスタ血症などの障害を含む）、貧血及び血友病などの各種の血液疾患、遺伝子欠損（例えば嚢胞性線維形成、ゴーシェ疾患、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損、気腫など）の治療又は予防のために使用される遺伝子が挙げられる。

　治療又は予防用遺伝子としては、がんに対する、及びウイルス疾患に対するアンチセンス療法において有用であるいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）周辺の配列に対する相補的短鎖オリゴヌクレオチド）でもよい。

　治療又は予防用遺伝子は、治療又は予防用遺伝子を発現させるためのプロモーターに連結されていてもよい。治療又は予防用遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター（所望によりエンハンサーを含む）、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどを挙げることができる。治療又は予防用遺伝子および遺伝子を発現させるためのプロモーターはＩＴＲ配列に挟まれていることが好ましい。

　本発明においては、好ましくは、アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子を細胞に導入する。ウイルスヘルパー遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製及びパッケージングを可能にするための非アデノ随伴ウイルス遺伝子である。ウイルスヘルパー遺伝子としては、アデノ随伴ウイルス以外の他種ウイルスに由来する遺伝子が使用される。ウイルスヘルパー遺伝子の具体例としては、アデノウイルス又はヘルペスウイルスに由来するウイルスヘルパー遺伝子を挙げることができ、好ましくは、ウイルスヘルパー遺伝子は、アデノウイルス由来である。

　アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子としては、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ－ＲＮＡなどを挙げることができる。Ｅ１領域の全部又はその一部を有する宿主細胞において、ＡＡＶのゲノムが複製されてカプシドにパッケージングされて、ウイルスビリオンを形成するために必要なアデノウイルスゲノムの領域は、Ｅ２Ａ領域、Ｅ４領域、及びＶＡ－ＲＮＡ領域である。Ｅ４領域による機能について、Ｅ４領域のオープンリーディングフレーム６（Ｅ４ＯＲＦ６）によりコードされるＥ４　３４ｋＤａ蛋白質がＡＡＶの複製に必要とされる。好ましくは、ウイルスヘルパー遺伝子は、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子は、好ましくは、ＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子である。

　アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ－ＲＮＡなど）は、野生型の遺伝子でもよいが、本来有する機能を発揮するものである限り、野生型の遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変がなされた遺伝子を使用してもよい。

　野生型のウイルスヘルパー遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変を行う場合、改変される塩基の個数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～３個である。改変を加えたウイルスヘルパー遺伝子の塩基配列は、野生型のウイルスヘルパー遺伝子の塩基配列と、好ましくは８５％以上の配列同一性を示し、より好ましくは９０％以上の配列同一性を示し、更に好ましくは、９５％以上の配列同一性を示し、更により好ましくは９８％以上の配列同一性を示す。

　ウイルスヘルパー遺伝子を細胞に導入する場合、ウイルスヘルパー遺伝子を含むベクターを細胞に導入することができる。

　ウイルスヘルパー遺伝子を含むベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルス由来の配列、人工的に設計した核酸などを使用することができ、好ましくは、プラスミドである。

　ウイルスヘルパー遺伝子は、プロモーターの制御下にあることが好ましく、発現調節可能なプロモーターの制御下にあってもよい。

　発現調節可能なプロモーターとしては、条件特異的に発現を誘導する刺激の有無により発現のオンとオフを調節できるプロモーターを使用することができる。条件特異的に発現を誘導する刺激としては、化学的刺激または物理的刺激などを挙げることができるが、特に限定されない。化学的刺激としては、内在性ホルモン、ストレス応答、ラクトース、テトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）、クミン酸、ラパマイシン、ＦＫＣｓＡ、アブシシン酸（ＡＢＡ）、タモキシフェン／Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ（タモキシフェンにより活性化を誘導できるように改変したＣｒｅプロモーターを使用する系）、リボスイッチなどを挙げることができる。物理的刺激としては、青色光、熱などを挙げることができる。

　上記の中でも、発現調節可能なプロモーターは、薬剤により発現調節可能なプロモーターが好ましい。薬剤としては、好ましくはテトラサイクリン系薬剤であって、より好ましくはドキシサイクリンである。即ち、条件特異的に発現を誘導する刺激は、培地がドキシサイクリンを含むことでもよい。

　具体的には、発現調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン応答性プロモーター、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。具体的なテトラサイクリン応答性プロモーターには、Ｔｅｔオン／オフシステム（ＴＥＴｓｙｓｔｅｍｓ社製）が挙げられる。

　発現調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンにより発現調節可能なプロモーターであるＴｅｔオン／オフシステムでもよく、Ｔｅｔオンシステムでもよい。

　Ｔｅｔオンシステムにおいては、プロモーターは、少なくとも一つのＴｅｔオペロンを付加的に含む。Ｔｅｔオペロン（テトラサイクリン制御転写活性化）を使用することにより、抗生物質であるテトラサイクリン又はその誘導体のうちの一つ（例えば、ドキシサイクリン）の存在下において転写のオン又はオフを可逆的に切り替えることができる。細胞内に存在するＴｅｔリプレッサータンパク質は、プロモーターへと導入されるＴｅｔ　ｏｐｅｒａｔｏｒ配列に結合することによって発現を遮断する。したがって、ＴｅｔリプレッサーがＴｅｔ　ｏｐｅｒａｔｏｒ配列と結合している場合には、遺伝子発現は見られない。テトラサイクリン又はドキシサイクリンを添加すると、Ｔｅｔリプレッサーは隔離されてプロモーター活性を可能とし、遺伝子発現がオンにされる。Ｔｅｔオペロン系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅから入手可能なｐｃＤＮＡ（商標）４／ＴＯ哺乳動物発現ベクターにおいて使用されるＴｅｔオペロンなど、広く入手可能である。
　Ｔｅｔオンシステムにおいて、Ｔｅｔ　ｏｐｅｒａｔｏｒ配列は、発現を調節したいプロモーターの上流にあっても下流にあってもよい。発現をオフにしたときの発現漏れを減らすという点において、Ｔｅｔ　ｏｐｅｒａｔｏｒ配列は、発現調節可能なプロモーターの下流にあることが好ましい。

　プロモーターの具体例としては、特に限定されないが、サイトメガロウイルス由来プロモーター（ＣＭＶプロモーター）（所望によりエンハンサーを含む）、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどを挙げることができる。

　外来性組み換え核酸とは、細胞外から細胞内へ導入された組み換え核酸を意味する。外来性組み換え核酸は、外来性組み換え核酸を含むベクターの形態において、トランスフェクション、トランスダクション、リポフェクションなどの方法により、細胞に導入することができる。

　トランスフェクションとは、化学的手段（例えば、リン酸カルシウムまたはポリエチレンイミンなどの試薬を使用）、機械的手段（例えば、エレクトロポレーション）または物理的手段（例えば、生体弾（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）による送達）によって真核細胞の膜を横断して核酸を細胞に導入することをいう。

　トランスダクションとは、ウイルス由来のベクターを介して、真核細胞の膜を横断して、核酸を細胞に導入することをいう。

　リポフェクションとは、電気的な相互作用によりベクターと陽性荷電脂質などとの複合体を形成させ、エンドサイトーシスや膜融合により、核酸を細胞に導入することをいう。

　好ましくは、動物細胞において、外来性組み換え核酸は恒常発現系で発現されている。恒常発現系とは、1か月以上発現させる方法のことである。プラスミドの染色体への挿入、エピソーマルベクターの導入、もしくは人工染色体を用いて外来性の核酸を導入することにより、目的遺伝子の発現を長期間維持することが可能である。このとき、薬剤耐性遺伝子をプラスミドに導入していれば、薬剤によるセレクションが可能となる。

　組み換え核酸は、ウイルスを発現させることができる配列であれば特に限定されない。好ましくは、アデノ随伴ウイルスを発現させる配列である。アデノ随伴ウイルスを発現させる配列としては、上記した通り、ヘルパーウイルス由来の配列とアデノ随伴ウイルス由来の配列とが知られているが、これにアデノ随伴ウイルスを発現させることができればこれに限定されない。ヘルパーウイルス由来の成分としては、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４および／またはＶＡ－ＲＮＡが含まれるが、これに限定されない。アデノ随伴ウイルス由来の配列としては、Ｒｅｐ、Ｃａｐが知られているが、これに限定されない。

　本発明においては、外来性組み換え核酸の少なくとも一つが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩで制御されるプロモーターを含むことが好ましい。
　本発明において好ましくは、外来性組み換え核酸が、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ－ＲＮＡ、ＲｅｐおよびＣａｐをコードする核酸である。
　本発明においてさらに好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩで制御されるプロモーターから転写される遺伝子がＶＡ－ＲＮＡＩである。

　本発明においては、外来性組み換え核酸の遺伝子転写産物である少なくとも一つのＲＮＡの発現は、ＢＥＴの機能を抑制させていない状態で培養した場合と比較して、好ましくは１０倍以上であり、より好ましくは１０倍以上１００倍以下であり、さらに好ましくは２０倍以上５０倍以下である。好ましくは、ＶＡ－ＲＮＡＩの発現が２０倍以上である。ＢＥＴの機能を抑制させていない状態とは、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を添加していない、もしくは、内在性のＢＥＴ遺伝子変異もしくは発現抑制、外来性の野生型もしくは変異型ＢＥＴ遺伝子の全長もしくは一部を導入していない状態である。

　本発明において好ましくは、外来性組み換え核酸が少なくともＥ２ＡおよびＶＡ－ＲＮＡＩをコードする核酸を含み、Ｅ２ＡとＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子のＲＮＡ発現比率は、好ましくはＥ２Ａ：ＶＡ－ＲＮＡＩ＝１：１～１：２０であり、より好ましくはＥ２Ａ：ＶＡ－ＲＮＡＩ＝１：１～１：１５であり、さらに好ましくはＥ２Ａ：ＶＡ－ＲＮＡＩ＝１：１～１：１０である。

　外来性組み換え核酸のうちの少なくとも一つが、条件特異的に発現を誘導する核酸配列を含むことが好ましい。条件特異的に発現を誘導する核酸配列により誘導されるプロモーターとしては、特に限定されないが、好ましくはドキシサイクリン誘導型のＴＥＴプロモーターである。

　アデノ随伴ウイルスの製造方法としては、ＴＴ（Ｔｒｉｐｌｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）法、パッケージングセル法、またはＰｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌ法のいずれでもよい。本発明の効果の点でパッケージングセル法、またはＰｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌ法が好ましく、Ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌ法が最も好ましい。

　ＴＴ法とは、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含むプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、および導入遺伝子（例えば、所望の治療又は予防用遺伝子）を含むプラスミドを同時に細胞にトランスフェクションすることで組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）へとパッケージングする方法である。

　パッケージングセル法とは、ＴＴ法における一部遺伝子をあらかじめ染色体に組み込んだ細胞に対して、残りの遺伝子をトランスフェクションにより導入することで、ＡＡＶを製造する方法である。

　Ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌ法とは、追加の遺伝子導入なしでＡＡＶを産生する細胞を用いてＡＡＶを製造する方法である。好ましくは、ＴＴ法における遺伝子（少なくともＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含む）を染色体に組み込んだ細胞を用いて、トランスフェクション操作なしでＡＡＶを製造する方法である。さらに好ましくは、Ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌ法とは、ＴＴ法における全遺伝子を染色体に組み込んだ細胞を用いて、トランスフェクション操作なしでＡＡＶを製造する方法である。

　動物細胞としては特に限定されないが、好ましくは哺乳動物細胞または昆虫細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞などを挙げることができるが、特に限定されない。好ましくはヒト細胞を使用することができる。細胞の例としては、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫＪｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（乳児ハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。好ましくは、細胞はＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞であって、より好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞である。

　本発明の方法は、動物細胞を培地で培養するウイルス製造工程を含む。
　本発明における細胞の培養は、細胞の培養のための通常の条件において行うことができる。
　ウイルス製造工程における細胞の播種時の細胞密度は、好ましくは１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、特に好ましくは１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である。細胞の播種時の細胞密度の上限は特に限定されないが、一般的には、１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である。

　本発明においては、ウイルス製造工程の前に、細胞を増殖させる増殖工程を行うことができる。増殖工程の培養の形態は特に限定されないが、好ましくは、灌流培養である。

　例えば、ウイルス製造工程の前に、ドキシサイクリン及びＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を含まない培地で細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上（より好ましくは１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、特に好ましくは１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）になるまで培養する増殖工程を行い、その後に、ドキシサイクリン及びＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を含む培地を用いてでウイルス製造工程を行うことができる。

　細胞の培養温度は、特に限定されず、細胞が生存可能な温度で実施する。培養温度は、一般的には２５℃～４５℃であり、好ましくは３０℃～４２℃であり、より好ましくは３５℃～４０℃であり、一例としては３７℃である。
　ＣＯ_２濃度は、一般的には３～１０％ＣＯ_２であり、好ましくは５～１０％ＣＯ_２であり、一例としては８％ＣＯ_２である。

　ウイルス製造工程の期間は、好ましくは２４時間以上３０日以下であり、より好ましくは２４時間以上２０日以下であり、さらに好ましくは２４時間以上１０日以下であり、さらに好ましくは２４時間以上７日以下であり、特に好ましくは２４時間以上７２時間以下である。

　培養としては、バッチ培養、流加培養、灌流培養、または振とう培養を行うことができる。ウイルス製造工程の少なくとも一部は、灌流培養であることが好ましい。

　培養容器としては、フラスコまたはバイオリアクターを使用することができるが、特に限定されない。

　培養スケールは特に限定されず、任意の体積の培地において培養することができ、例えば、１ｍＬから２０００Ｌの培地において細胞を培養することができ、好ましくは１Ｌ～２５００Ｌであり、５０Ｌ～２３００Ｌがより好ましく、４００Ｌ～２２００Ｌが特に好ましい。

　培養は振盪攪拌しながら行ってもよい。振盪攪拌する場合の攪拌速度は、一般的には５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、好ましくは８０～１５０ｒｐｍである。攪拌培養は、リアクター内のプロペラ等による回転攪拌培養であっても良い。回転攪拌する場合の攪拌速度は、一般的には５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、好ましくは８０～１５０ｒｐｍである。また、波型振盪撹拌や、撹拌翼の上下動によって撹拌してもよいが、特に限定されない。

　培地の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｅｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１４３５１０１）、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、無血清ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ）、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）－３４ＳＦＭ培地、ヒト内皮－ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、ＣＤＣＨＯＡＧＴ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤＣＨＯ培地、ＣＤＤＧ４４培地、ＳＦ－９００（商標）培地、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、２９３ＳＦＭ培地、ＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）ＨＥＫ２９３培地、および任意の派生物またはその変形が挙げられる。ある特定の非限定的な実施形態において、高密度培養培地は、ＣＤＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤＣＨＯＡＧＴ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤＣＨＯ培地、ＣＤＤＧ４４培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ＬＶ－ＭＡＸ（商標）産生培地、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）Ｆ１７発現培地、ＤＹＮＡＭＩＳ（商標）培地、ＢＡＬＡＮＣＤ（登録商標）ＨＥＫ２９３培地、もしくは同様の培地、またはそれらの変形形態であってもよい。

　培地は、好ましくは、Ｅｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１４３５１０１）、または１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。

　本発明による目的ウイルスの製造方法は、ウイルスを回収することを含んでいてもよい。ウイルスを産生する細胞内で製造された目的ウイルスは、細胞内に留まるか、培養上清に放出される。

　細胞から目的ウイルスを回収する場合、例えば、細胞を超音波破砕したり、または細胞を凍結および融解して破砕することによって、または細胞と酸性の溶液とを接触させることによって、目的ウイルスを含む試料を調製することができる。このようにして調製した試料はそのまま使用してもよいし、所望により精製してもよい。
　培養上清から目的ウイルスを回収する場合には、培養上清をそのまま目的ウイルスを含む試料として使用してもよいし、所望により精製してもよい。

　目的ウイルスを精製する場合における精製法は、特に限定されないが、例えば、ＣｓＣｌ勾配超遠心法、クロマトグラフィー法、または限外ろ過法などの精製法を挙げることができる。上記の精製法により、目的ウイルスを含む試料から、目的ウイルスを精製することができる。さらに、所望により、上記のようにして精製した試料に、ＭｇＣｌ_２及びＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加して反応を行うことにより、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）や残存プラスミドを消化してもよい。

　本発明の方法により製造された目的ウイルスの力価は、当業者に公知の通常の方法により測定することができる。例えば、培養後の細胞培養液を回収し、凍結融解にて細胞を破砕した後、遠心分離によって上清を回収する。回収した上清にＭｇＣｌ_２及びＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加して反応を行うことにより、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）や残存プラスミドを消化することができる。上記により得られた目的ウイルスを含むサンプルを、ｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ）サンプルとして使用し、ｄｄＰＣＲを行うことにより目的ウイルスの力価を測定することが可能である。

　本発明の一例においては、ＢＥＴの機能を抑制することによって、従来の製造方法と比べて、ＡＡＶなどの目的ウイルスの製造量を２倍以上向上させることができる。

＜培養組成物＞
　本発明によれば、
目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入され、かつＢＥＴの機能が抑制されている動物細胞と、
ウイルスと、
培地とを、
含む培養組成物が提供される。

　「目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入され、かつＢＥＴの機能が抑制されている動物細胞」、「ウイルス」、「培地」の具体例及び好ましい態様は、本明細書に記載した通りである。
　本発明の培養組成物において、ウイルスは、アデノ随伴ウイルスであることが好ましい。
　本発明の培養組成物において、培地は、ＢＥＴ阻害剤（好ましくはブロモドメイン阻害剤）を含むことが好ましい。

　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［材料及び方法］
＜細胞培養＞
　浮遊化ＨＥＫ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｒ７９００７）を１２ｍＬのＥｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１４３５１０１）で１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、１２５ｍＬ振とうフラスコで２４時間培養した。培養液は１２０ｒｐｍで一定に攪拌しながら、３７℃、８％ＣＯ_２　条件下でインキュベートを行った。

＜プラスミド導入細胞の作製＞
　ＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３１１０１）含有ＤＭＥＭ培地（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、０４１－２９７７５）で２４ｗｅｌｌプレートに０．７５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、２４時間接着培養を行った。プラスミド（ｓｅｑ１とｓｅｑ２）をＴｒａｎｓＩＴ－２９３（Ｔａｋａｒａｂｉｏ、ＭＩＲ２７０４）試薬を用いてＨＥＫ２９３細胞に共導入した。０．５か月経過後に１細胞ごと９６ｗｅｌｌプレートに播種し、さらに１か月間の拡大培養の後、プラスミドが染色体に組み込まれたＡＡＶ　ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌ株を作製した。

ｓｅｑ１：ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅプラスミド（ＡＡＶ製造に必要な遺伝子を組み込んだ統合型プラスミド）。Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子は、野生型のＡＡＶがもつｐ５プロモーターによって制御している。Ｅ２遺伝子は、野生型のアデノウイルスがもつプロモーターによって制御している。Ｅ４ＯＲＦ６は、ＣＭＶプロモーター下、ＶＡ－ＲＮＡは、Ｈ１プロモーター下にあり、プロモーター中にＴＥＴオペレーター配列を組み込むことでドキシサイクリンによって発現制御可能な設計となっている。

ｓｅｑ２：ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ遺伝子配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターのＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミド（ＧＥＮＥＷＩＺ）。

　ｓｅｑ１の塩基配列を配列表の配列番号１に示し、ｓｅｑ２の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。

＜化合物スクリーニング１＞
　作製したＡＡＶ　ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌを５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで２４ｗｅｌｌプレートに播種し、６時間インキュベート後（細胞数は５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である）、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎ（終濃度０．５μｇ／ｍＬ）とＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＡＹＭＡＮ，１１０７６）を終濃度４μｍｏｌ／Ｌで添加した。７２時間の処理後、細胞を回収し、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲの評価およびＡＡＶ力価測定を行った。

＜Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ＞
　遺伝子導入後７２時間、３７℃、８％ＣＯ_２条件下で培養を行ったＨＥＫ細胞を３００×ｇの遠心により回収した。ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ　ｔｏ　ｃＤＮＡ　Ｋｉｔを用いた逆転写によりｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡはＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、各種遺伝子に対するプライマーおよびプローブ（Ｅ２：ｓｅｑ３，４，５、ＶＡ－ＲＮＡ：ｓｅｑ６，７，８、Ｅ４ＯＲＦ６：ｓｅｑ９，１０，１１、Ｒｅｐ：　ｓｅｑ１２，１３，１４、Ｃａｐ：ｓｅｑ１５，１６，１７）を用いて検出し、ＧＡＰＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）に対するＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙを用いた規格化によって定量評価した。ｓｅｑ３～１７の塩基配列をそれぞれ、配列表の配列番号３～１７に示す、

＜ＡＡＶ力価測定＞
　遺伝子導入後７２時間、３７℃、８％ＣＯ_２条件下で培養を行ったＨＥＫ細胞培養液を回収し、－８０℃での凍結融解にて細胞を破砕した。その後、１３，８００×ｇの遠心分離によって上清を回収し、終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ_２、２５Ｕ／ｍＬ　Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを添加し、３７℃で２時間反応を行い、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）や残存プラスミドを消化した。反応後のサンプルは、９５℃で１５分、７０℃で３分、４０℃で３分、２０℃で３分の順にインキュベーションし、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを失活させ、これをｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ）サンプルとした。ｄｄＰＣＲサンプルはＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に対して０．０５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８　および１０μｇ／ｍＬウシ胸腺ＤＮＡを混合した溶液で５０倍に希釈した。氷上でチューブにｄｄＰＣＲｔｍ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（ｎｏ　ｄＵＴＰ）（ＢＩＯＲＡＤ社）１０μＬ、希釈済みのｄｄＰＣＲサンプル２μＬ、プライマー（ｓｅｑ１８、ｓｅｑ１９、最終濃度９００ｎｍｏｌ／Ｌ）およびプローブ（ｓｅｑ２０、最終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）、ヌクレアーゼフリーｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１０９７７０１５）を混合して、総液量２２μＬに調整し、ｄｄＰＣＲを行った。ｓｅｑ１８、ｓｅｑ１９及びｓｅｑ２０の配列を、配列表の配列番号１８～２０に示す。
　ｄｄＰＣＲにおいては、ドロップレット形成機器にて調製液からドロップレット形成し、続いて９５℃で１０分、９４℃で３０秒および５５℃を４０サイクル、９８℃で１０分の順でインキュベーションした。ドロップレットリーダーにより測定を行い、ＡＡＶゲノム力価（ｖｇ／ｍＬ）を算出した。

＜化合物スクリーニング２＞
　作製したＡＡＶ　ｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌを５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで９６ｗｅｌｌプレートに播種し、６時間インキュベート後（細胞数は５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である）、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎ（終濃度０．５μｇ／ｍＬ）とＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＡＹＭＡＮ，１１０７６）を終濃度０．１５、０．４５、１．３５μｍｏｌ／Ｌで添加した。７２時間の処理後、細胞を回収し、ＡＡＶ力価の評価を行った。

［結果］
　各ブロモドメイン阻害剤添加時のＡＡＶ製造量の変化を評価した。化合物スクリーニング１におけるｄｄＰＣＲによりＡＡＶの力価を測定した結果を表１および図１に示し、ｑＰＣＲによる遺伝子発現を表２および図２に示す。

　図１及び図２の結果から、遺伝子発現量が亢進し、ＡＡＶ製造量が増加することがわかった。阻害剤添加なしの条件に対して、各遺伝子の発現量は２．５倍以上増加しており、特にＶＡ―ＲＮＡは２０倍以上発現が増加していた。

　使用したブロモドメイン阻害剤のＫｄ値として、試薬メーカーが公表している公称の数値を表３に記載した。
　使用したブロモドメイン阻害剤のＩＣ５０として、試薬メーカーが公表している公称の数値を表４に記載した。

　化合物スクリーニング２におけるｄｄＰＣＲによりＡＡＶの力価を測定した結果を図３に示す。

　さらに、作製したＡＡＶｐｒｏｄｕｃｅｒ　ｃｅｌｌを５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、６時間インキュベート後、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎ（終濃度０．５μｇ／ｍＬ）とＪＱ１（終濃度４μｍｏｌ／Ｌ）を添加した。
　以下のサンプルについて、ｄｄＰＣＲによりＡＡＶの力価を測定した結果を図４に示す。
Ｃｔｒｌ：　ＪＱ１が未添加のサンプル。
７２ｈ：　ＪＱ１による処理を７２時間行い、回収したサンプル。
Ｗａｓｈ　ｏｕｔ：　ＪＱ１による処理を２４時間した後、培地交換を行いＪＱ１不含の培地に置換し、さらに４８時間後に回収したサンプル。（交換後の培地はｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎ（終濃度０．５μｇ／ｍＬ）を含む。）
ＪＱ１処理後、培地中からＪＱ１を除くことで細胞あたりのＡＡＶ力価がより向上した。

Seq1：
ATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTACCCCACAGTGGGGCCACTAGGGTCAATTTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAAATTGAGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCCTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCAAGGCCAGCTTCCCACAATAAGTTGGGTGAATTTTGGCTCATTCCTCCTTTCTATAGGATTGAGGTCAGAGCTTTGTGATGGGAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCGCGATCGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGCCCGGGCGACCGCACCCTGTGACGAAAGCCGCCCGCAAGCTGCGCCCCTGAGTTAGTCATCTGAACTTCGGCCTGGGCGTCTCTGGGAAGTACCACAGTGGTGGGAGCGGGACTTTCCTGGTACACCAGGGCAGCGGGCCAACTACGGGGATTAAGGTTATTACGAGGTGTGGTGGTAATAGCCGCCTGTTCGAGGAGAATTCGGTTTCGGTGGGCGCGGATTCCGTTGACCCGGGATATCATGTGGGGTCCCGCGCTCATGTAGTTTATTCGGGTTGAGTAGTCTTGGGCAGCTCCAGCCGCAAGTCCCATTTGTGGCTGGTAACTCCACATGTAGGGCGTGGGAATTTCCTTGCTCATAATGGCGCTGACGACAGGTGCTGGCGCCGGGTGTGGCCGCTGGAGATGACGTAGTTTTCGCGCTTAAATTTGAGAAAGGGCGCGAAACTAGTCCTTAAGAGTCAGCGCGCAGTATTTGCTGAAGAGAGCCTCCGCGTCTTCCAGCGTGCGCCGAAGCTGATCTTCGCTTTTGTGATACAGGCAGCTGCGGGTGAGGGAGCGCAGAGACCTGTTTTTTATTTTCAGCTCTTGTTCTTGGCCCCTGCTTTGTTGAAATATAGCATACAGAGTGGGAAAAATCCTATTTCTAAGCTCGCGGGTCGATACGGGTTCGTTGGGCGCCAGACGCAGCGCTCCTCCTCCTGCTGCTGCCGCCGCTGTGGATTTCTTGGGCTTTGTCAGAGTCTTGCTATCCGGTCGCCTTTGCTTCTGTGTGACCGCTGCTGTTGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCCGGTGCAGTAGGGGCTGTAGAGATGACGGTAGTAATGCAGGATGTTACGGGGGAAGGCCACGCCGTGATGGTAGAGAAGAAAGCGGCGGGCGAAGGAGATGTTGCCCCCACAGTCTTGCAAGCAAGCAACTATGGCGTTCTTGTGCCCGCGCCACGAGCGGTAGCCTTGGCGCTGTTGTTGCTCTTGGGCTAACGGCGGCGGCTGCTTAGACTTACCGGCCCTGGTTCCAGTGGTGTCCCATCTACGGTTGGGTCGGCGAACAGGCAGTGCCGGCGGCGCCTGAGGAGCGGAGGTTGTAGCGATGCTGGGAACGGTTGCCAATTTCTGGGGCGCCGGCGAGGGGAATGCGACCGAGGGTGACGGTGTTTCGTCTGACACCTCTTCGGCCTCGGAAGCTTCGTCTAGGCTGTCCCAGTCTTCCATCATCTCCTCCTCCTCGTCCAAAACCTCCTCTGCCTGACTGTCCCAGTATTCCTCCTCGTCCGTGGGTGGCGGCGGCGGCAGCTGCAGCTTCTTTTTGGGTGCCATCCTGGGAAGCAAGGGCCCGCGGCTGCTGATAGGGCTGCGGCGGCGGGGGGATTGGGTTGAGCTCCTCGCCGGACTGGGGGTCCAGGTAAACCCCCCGTCCCTTTCGTAGCAGAAACTCTTGGCGGGCTTTGTTGATGGCTTGCAATTGGCCAAGGATGTGGCCCTGGGTAATGACGCAGGCGGTAAGCTCCGCATTTGGCGGGCGGGATTGGTCTTCGTAGAACCTAATCTCGTGGGCGTGGTAGTCCTCAGGTACAAATTTGCGAAGGTAAGCCGACGTCCACAGCCCCGGAGTGAGTTTCAACCCCGGAGCCGCGGACTTTTCGTCAGGCGAGGGACCCTGCAGCTCA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AATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCTGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTACTCAGATCTCGAGCTCAAGTAGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTGCCTCGAGCAGCGCTGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCGTAGCTGATCAATTGGCGCGCCGAATTCGTTAACAAGCTTTAATTAACGCGTACGATAAGCTTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGTGTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATACCCCGTGAGTTACCCGGCGGGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGCTCGTGTCCGATAACTGTAATTATCGGACATGATTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTT

Seq2：
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACTGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGACGCGTATTGGGATCCTGCAGGTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCCGGTACTAGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGGCCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTCTTATGGCCATGGAGGCCCGAATTCGGTCGACCATGGGTAGTTCTTTAGACGATGAGCATATCCTCTCTGCTCTTCTGCAAAGCGATGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCTGACAGTGAAATATCAGATCACGTAAGTGAAGATGACGTCCAGAGCGATACAGAAGAAGCGTTTATAGATGAGGTACATGAAGTGCAGCCAACGTCAAGCGGTAGTGAAATATTAGACGAACAAAATGTTATTGAACAACCAGGTTCTTCATTGGCTTCTAACAGAATCTTGACCTTGCCACAGAGGACTATTAGAGGTAAGAATAAACATTGTTGGTCAACTTCAAAGTCCACGAGGCGTAGCCGAGTCTCTGCACTGAACATTGTCAGATCTCAAAGAGGTCCGACGCGTATGTGCCGCAATATATATGACCCACTTTTATGCTTCAAACTATTTTTTACTGATGAGATAATTTCGGAAATTGTAAAATGGACAAATGCTGAGATATCATTGAAACGTCGGGAATCTATGACAGGTGCTACATTTCGTGACACGAATGAAGATGAAATCTATGCTTTCTTTGGTATTCTGGTAATGACAGCAGTGAGAAAAGATAACCACATGTCCACAGATGACCTCTTTGATCGATCTTTGTCAATGGTGTACGTCTCTGTAATGAGTCGTGATCGTTTTGATTTTTTGATACGATGTCTTAGAATGGATGACAAAAGTATACGGCCCACACTTCGAGAAAACGATGTATTTACTCCTGTTAGAAAAATATGGGATCTCTTTATCCATCAGTGCATACAAAATTACACTCCAGGGGCTCATTTGACCATAGATGAACAGTTACTTGGTTTTAGAGGACGGTGTCCGTTTAGGATGTATATCCCAAACAAGCCAAGTAAGTATGGAATAAAAATCCTCATGATGTGTGACAGTGGTACGAAGTATATGATAAATGGAATGCCTTATTTGGGAAGAGGAACACAGACCAACGGAGTACCACTCGGTGAATACTACGTGAAGGAGTTATCAAAGCCTGTGCACGGTAGTTGTCGTAATATTACGTGTGACAATTGGTTCACCTCAATCCCTTTGGCAAAAAACTTACTACAAGAACCGTATAAGTTAACCATTGTGGGAACCGTGCGATCAAACAAACGCGAGATACCGGAAGTACTGAAAAACAGTCGCTCCAGGCCAGTGGGAACATCGATGTTTTGTTTTGACGGACCCCTTACTCTCGTCTCATATAAACCGAAGCCAGCTAAGATGGTATACTTATTATCATCTTGTGATGAGGATGCTTCTATCAACGAAAGTACCGGTAAACCGCAAATGGTTATGTATTATAATCAAACTAAAGGCGGAGTGGACACGCTAGACCAAATGTGTTCTGTGATGACCTGCAGTAGGAAGACGAATAGGTGGCCTATGGCATTATTGTACGGAATGATAAACATTGCCTGCATAAATTCTTTTATTATATACAGCCATAATGTCAGTAGCAAGGGAGAAAAGGTTCAAAGTCGCAAAAAATTTATGAGAAACCTTTACATGAGCCTGACGTCATCGTTTATGCGTAAGCGTTTAGAAGCTCCTACTTTGAAGAGATATTTGCGCGATAATATCTCTAATATTTTGCCAAATGAAGTGCCTGGTACATCAGATGACAGTACTGAAGAGCCAGTAATGAAAAAACGTACTTACTGTACTTACTGCCCCTCTAAAATAAGGCGAAAGGCAAATGCATCGTGCAAAAAATGCAAAAAAGTTATTTGTCGAGAGCATAATATTGATATGTGCCAAAGTTGTTTCTGAGAGATCTCTCGAGGTACCGCGGCCGCGGGGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTATCCCAATGGCGCGCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTGTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGAACCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTTGTC

seq3：GCCCCAACTGCGACTTCA
seq4：CTCCACTTAAACTCAGGCACAAC
seq5：CGCACCATCACCAACGC
seq6：TCCGTGGTCTGGTGGATAAATTC
seq7：GTCTGACGTCGCACACCT
seq8：TCCGCCGTGATCCATGC
seq9：TGGTTTAGGATGGTGGTGGATG
seq10：CGCAGGTAGATTAAGTGGCGA
seq11：GAGGTAATGTTTATGTCCAGCGTG
seq12：TGGGCGTGGACTAATATGGAA
seq13：CCGGCGCATCAGAATTGG
seq14：AGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAA
seq15：TCACCAAGTCCACCCGAAC
seq16：GCGGTTAAAGTCAAAGTACCCC
seq17：GAAGCAACGCCAACGCC
seq18：GGAACCCCTA GTGATGGAGT T
seq19：CGGCCTCAGT GAGCGA
seq20：CACTCCCTCT CTGCGCGCTC G

Claims

目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入された動物細胞を、ＢＥＴの機能を抑制させた状態で培地で培養するウイルス製造工程を含む、目的ウイルスの製造方法。
前記ＢＥＴの機能を抑制することによりＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写が促進される、請求項１に記載の方法。
培地がＢＥＴ阻害剤を含有することにより、前記ＢＥＴの機能が抑制される、請求項１又は２に記載の方法。
ＢＥＴ阻害剤のＢＲＤ２、ＢＲＤ３またはＢＲＤ４のいずれかに対する平衡解離定数：Ｋｄ値が１５０ｎｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
ＢＥＴ阻害剤が、
（Ｓ）－（＋）－ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセテート、
２－メトキシ－Ｎ－（３－メチル－２－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロ－キナゾリン－６－イル）－ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ－［６－（３－メタンスルホンアミド－４－メチルフェニル）－３－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジン－８－イル］カルバメート、
（４Ｓ）－６－（４－クロロフェニル）－Ｎ－エチル－８－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン－４－　アセトアミド、
７，３，５－ジメチル－４－イソキサゾリル－１，３－ジヒドロ－８－メトキシ－１－［１Ｒ－１－（２－ピリジニル）エチル］－２Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン、および
６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－アセトアミド
からなる群のうちの少なくとも一つである、請求項１又は２に記載の方法。
ＢＥＴ阻害剤が、
（Ｓ）－（＋）－ｔｅｒｔ－ブチル２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセテート、
２－メトキシ－Ｎ－（３－メチル－２－オキソ－１，２，３，４－テトラヒドロ－キナゾリン－６－イル）－ベンゼンスルホンアミド、
Ｎ－［６－（３－メタンスルホンアミド－４－メチルフェニル）－３－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジン－８－イル］カルバメート、および
（４Ｓ）－６－（４－クロロフェニル）－Ｎ－エチル－８－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン－４－　アセトアミド
からなる群のうちの少なくとも一つである、請求項１又は２に記載の方法。
培地中におけるＢＥＴ阻害剤の濃度が０．０１μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌである、請求項３に記載の方法。
動物細胞において、前記外来性組み換え核酸が恒常発現系で発現されている、請求項１又は２に記載の方法。
前記外来性組み換え核酸の少なくとも一つが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩで制御されるプロモーターを含む、請求項１又は２に記載の方法。
前記目的ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、請求項１又は２に記載の方法。
前記外来性組み換え核酸が、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ－ＲＮＡ、ＲｅｐおよびＣａｐをコードする核酸である、請求項１又は２に記載の方法。
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩで制御されるプロモーターから転写される遺伝子がＶＡ－ＲＮＡＩである、請求項９に記載の方法。
前記外来性組み換え核酸の遺伝子転写産物である少なくとも一つのＲＮＡの発現が、ＢＥＴの機能を抑制させていない状態で培養した場合と比較して１０倍以上である、請求項１又は２に記載の方法。
前記外来性組み換え核酸が少なくともＥ２ＡおよびＶＡ－ＲＮＡＩをコードする核酸を含み、Ｅ２ＡとＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子のＲＮＡ発現比率がＥ２Ａ：ＶＡ－ＲＮＡＩ＝１：１～１：１０である、請求項１又は２に記載の方法。
動物細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
前記外来性組み換え核酸のうちの少なくとも一つが、条件特異的に発現を誘導する核酸配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
条件特異的に発現を誘導する刺激を付与することにより、条件特異的に発現を誘導する、請求項１６に記載の方法。
条件特異的に発現を誘導する刺激が、培地がドキシサイクリンを含むことである、請求項１又は２に記載の方法。
培地にＢＥＴ阻害剤を含む期間が１時間以上である、請求項１又は２に記載の方法。
製造したウイルスを回収する前に、ＢＥＴの機能の抑制を停止することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
ＢＥＴ阻害剤を低減又は除去した培地で培養することにより、ＢＥＴの機能の抑制を停止する、請求項２０に記載の方法。
ＢＥＴ阻害剤を低減又は除去した培地で１時間以上培養する、請求項２１に記載の方法。
培養中に培地を供給し、供給される培地がドキシサイクリンとＢＥＴ阻害剤とを含む、請求項１又は２に記載の方法。
細胞の播種時の細胞密度が１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項１又は２に記載の方法。
ウイルス製造工程の前に、細胞を増殖させる増殖工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
ウイルス製造工程の前に、ドキシサイクリン及びＢＥＴ阻害剤を含まない培地で細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上になるまで培養する増殖工程を含み、ウイルス製造工程での培地がドキシサイクリン及びＢＥＴ阻害剤を含む、請求項２５に記載の方法。
ウイルス製造工程の少なくとも一部が、灌流培養である、請求項１又は２に記載の方法。
ウイルス製造工程の期間が、２４時間以上３０日以下である、請求項１又は２に記載の方法。
ウイルスを回収することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
目的ウイルスをコードする外来性組み換え核酸が導入され、かつＢＥＴの機能が抑制されている動物細胞と、
ウイルスと、
培地とを、
含む培養組成物。
ウイルスがアデノ随伴ウイルスである、請求項３０に記載の培養組成物。
培地がＢＥＴ阻害剤を含む、請求項３０または３１に記載の培養組成物。