WO2024072157A1 - 오가노이드 제작 방법 - Google Patents

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정재욱
박동일
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a method of producing organoids from biological tissue. More specifically, the present invention relates to a method of producing organoids from biological tissue. More specifically, the dissociation of cells by enzymatic treatment for conventional organoid production is replaced by physical dissociation, thereby solving the problem of low organoid production rate by enzymatic treatment. This is about a new organoid production method that solves the problem.
  • Organoids are experimental models similar to cell lines and have the advantage of being capable of long-term culture and cryopreservation and of being easy to manipulate and observe. In addition, it is an experimental model that can study physiological phenomena at a level higher than that of cells by maintaining the original characteristics of cells and reproducing cellular hierarchical and histological structures that were only seen in vivo.
  • Organoids can be used in two ways: as a disease model using similarity to actual organs, and as a regenerative treatment using tissue regeneration ability.
  • Organoid-based disease models are human organ models that can be produced using human tissue, and can yield results more similar to living organisms than research using animal experiments or monolayer culture experiments. Organoids can be used to study development and regeneration mechanisms through normal organ modeling, and to study pathogenesis and drug development through disease modeling of organs. In particular, in the case of cancer organoids, most areas are possible, including tumor formation mechanisms, precision medicine, and anticancer drug development. It can be used in the field of tumor research. The second application area, organoid-based regenerative therapy, can be a fundamental treatment that can repair tissue damage by transplanting organoids directly into damaged tissue.
  • organoid production including salivary glands, liver, lacrimal glands, biliary tract, thyroid, hair follicles, pancreas, stomach, and endometrium
  • the success rate of organoid culture varies considerably depending on the organ or the size of the target cell sample. It is known that For example, when making organoids using surgical tissue as the source, the culture success rate is high, but when making organoids using small specimens such as biopsy specimens, the culture success rate is quite low (Cells. 2021 Nov 4;10(11): 3012).
  • organoids do not simulate the actual tumor microenvironment (Nat. Commun.2019,10, 3991).
  • cancer tissue is usually cut into small pieces (mechanical dissociation) with scissors or a knife, and then treated with an enzyme such as dispase to separate cells by cutting fibronectin and collagen on the cell surface.
  • an enzyme such as dispase to separate cells by cutting fibronectin and collagen on the cell surface.
  • the payment organization was dismantled. According to this conventional method, tissues are easily decomposed into single cells, but some cells die due to the cytotoxicity of enzymes, and living cells often deteriorate and do not divide well.
  • lung cancer treatment outcomes have improved significantly over the past 10 years due to the development of innovative treatments such as targeted therapy and immunotherapy, it is still the most common cause of cancer death, and the 5-year survival rate for lung cancer as a whole is only 32.5%. Accordingly, research is being actively conducted on lung cancer using organoids to identify the mechanism of cancer development, screen new drugs, and provide personalized anticancer treatment.
  • organoids to identify the mechanism of cancer development, screen new drugs, and provide personalized anticancer treatment.
  • the culture success rate is very low, around 10-20% (Cell Rep.2020,31, 10758 / NPJ Precis. Oncol.2021 ,5, 29).
  • US 2021-0087532 A1 relates to a technology for producing organoids without time constraints from cryogenically preserved tissue, including the steps of thawing the cryopreserved tissue suspended in a preservation medium to obtain isolated cells, and washing the freezing medium. It goes through the step of dissociating the epithelial cells underlying the mesenchyme by treating it with an enzyme (Dispase).
  • Dissociating the epithelial cells underlying the mesenchyme by treating it with an enzyme (Dispase).
  • This document reports that it is possible to produce organoids from long-term cryopreserved tissue, although they are smaller and have less structured (crypts) compared to organoids from fresh tissue that has not been cryopreserved.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for easily producing organoids from biological tissue, especially biopsy tissue.
  • the purpose of the present invention is to provide a method for producing organoids without enzymatic treatment and therefore without hazards caused by enzymatic treatment.
  • step (A) Quick freezing of biological tissue; (B) thawing the rapidly frozen sample; (C) mechanically dissociating the thawed sample to obtain dissociated cells; (D) manufacturing an organoid using the dissociated cells.
  • step (A) all or a local portion of the biological tissue separated by surgery or biopsy may be rapidly frozen, or it may be locally rapidly frozen before the tissue is separated through surgery or biopsy and then separated. will be.
  • steps (A) and (B) there may be a time gap between steps (A) and (B). That is, in the present invention, a 'frozen specimen' may be obtained immediately from a living body, or may be a tissue obtained and cryopreserved.
  • the step (A) includes a substep of locally freezing a predetermined area for obtaining dissociated cells from biological tissue by contacting a cryoprobe tip, and a substep of isolating only the locally frozen area from the biological tissue. It may be.
  • the cryoprobe tip temperature is preferably -40 to -130°C and the contact time is preferably 3 to 5 seconds. Since the types of cryogenic probes, handling temperatures, etc. are widely known in the technical field to which the present invention pertains, detailed descriptions thereof will be omitted.
  • a cryogenic probe it is possible to obtain a cell mass in a local area of interest among biological tissues, thereby maximizing the identity of cells among the obtained samples. For example, it is possible to isolate and obtain only the lesion area where cancer cells are expressed among biological tissues with high purity.
  • the biological tissue may be separated by a percutaneous or endoscopic biopsy method (frozen biopsy or forceps biopsy), but acquisition by a surgical method is not excluded.
  • the biological tissue may be cancer tissue, more specifically, lung cancer tissue, but is not limited thereto.
  • the lung cancer tissue is preferably obtained through a non-surgical biopsy procedure, but is not limited thereto.
  • the lung cancer tissue may be obtained through a non-surgical frozen biopsy procedure.
  • cancer organoids such as cancer cells from a malignant pleural effusion or metastatic lesions that do not have normal cells.
  • Creating cancer organoids from tissue for example, only 8-12% of non-small cell lung cancer cases have malignant pleural effusion at the time of diagnosis, and the characteristics of cancer cells in metastatic lesions and cancer cells in the primary site may be different. Therefore, non-surgical tissue samples obtained through percutaneous biopsy, endoscopy, and ultrasound endoscopy, which selectively biopsy only cancerous lesions as much as possible, are good samples for making high-purity cancer organoids.
  • organoids can be produced from cells obtained through physical dissociation rather than 'enzymatic dissociation', so organoids can be produced without adverse effects due to 'enzymatic dissociation'.
  • organoids can be easily produced not only from surgically obtained specimens but also from biological tissue through biopsy, and by using this, lung cancer can be obtained from lung cancer biopsy specimens from stage 3 and 4 lung cancer patients, which was previously almost impossible. It is possible to produce organoids, and using them, personalized anticancer treatment and screening for new anticancer drugs become possible.
  • Figures 1 and 2 are photographs showing the process of preprocessing surgical tissue and small biopsy tissue, respectively.
  • Figure 3 is a photograph showing the process of generating organoids in an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a conceptual diagram showing the structure of the cryoprobe used in the example and a photograph showing the rapid freezing process.
  • 5 to 7 are various photos of organoids produced by the method according to the present invention.
  • Figures 8 and 9 are holotomography photos of organoids produced by the method according to the present invention.
  • Figure 10 shows the results of single cell RNA sequencing of organoids according to the example.
  • Figure 11 is UMAP showing the type and state of organoid cells according to the example.
  • Figure 12 is a conceptual diagram showing the drug sensitivity test situation of organoids according to an example.
  • Figures 13 and 14 are photographs and graphs showing the viability and survival rate of organoids to drugs according to examples, respectively.
  • the present invention is a tissue sample dissociation method for successful culturing of organoids derived from biopsy specimens, which had previously had a low culture success rate, through a process of rapid freezing and thawing of tissues.
  • the present invention improves the success rate of organoid culture of organs by eliminating the enzymatic dissociation process that has been commonly performed and applying rapid freezing and thawing to sample tissues. To date, no cases of using quick freezing and thawing methods for organoid culture have been confirmed.
  • tissue organoids were generated larger and faster than when using the existing enzyme dissociation method.
  • the organoid production method according to the present invention can be used in a variety of ways.
  • it can be used in lung cancer treatment as follows:
  • a re-biopsy is performed to check for new genetic mutations or drug resistance mechanisms to select the next treatment drug.
  • a typical example is that if the disease progresses after EGFR-TKI treatment, Osimertinib treatment is started when the EGFR T790M mutation is confirmed through rebiopsy.
  • Osimertinib treatment is started when the EGFR T790M mutation is confirmed through rebiopsy.
  • lung cancer organoids created at various locations and at various times allow for the heterogeneity and drug sensitivity patterns of cancer cells in various regions to be discovered and the characteristics of anticancer drug-resistant cancer cells to be studied more in-depth.
  • a lung cancer organoid cluster that collects organoids made from various parts and time points of a patient, we can select the optimal group of lung cancer organoids needed for the study not only for customized treatment for each patient but also for candidate drug screening to conduct various studies. You can proceed.
  • lung cancer stages 1 to 4 Lung cancer tissues (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer) obtained from lung cancer patients were used as specimens with the consent of the patients. Lung cancer tissue isolated from the patient's body was stored in DMEM/F12 medium (Gibco, Waltham, MA, USA) containing 1% penicillin and streptomycin, and the following processes were performed within 12 hours.
  • Example type 1 surgical tissue acquisition ⁇ freezing ⁇ thawing ⁇ mechanical dissociation
  • Example Type 2 Endoscopic frozen biopsy ⁇ thawing ⁇ mechanical dissociation
  • step 1 1 ml of Dissociation Buffer with the composition shown in the table below was added to the lung cancer tissue lesion, cut into small pieces with scissors, and enzyme digestion (DNase (sigma; AMPD1), liberase) was performed at 37°C for 30 minutes. 'Enzymatic dissociation' was performed in the same process as ).
  • organoids In the case of the example (generating organoids through 'dissociation by freezing-thawing'), the organoids grew significantly (see FIGS. 5 to 9), but in the comparative example where organoid generation was attempted through 'enzymatic dissociation' (FIG. In (see 5), organoids were not formed well in both normal lungs and lung cancer, so the characteristics of various organoids such as those in the examples could not be confirmed.
  • the organoids of the example after 10 days of culture were stained with hematoxylin and eosin according to a known method (see Nat. Commun. 2019, 10, 3991.) and then analyzed under a microscope (see FIG. 6).
  • Normal lung organoid is a normal lung organoid produced using a cancer-free part of a resected lung
  • small cell lung cancer and non-small cell lung cancer are organoids derived from small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, respectively.
  • organoids were not formed in neither normal lung nor lung cancer.
  • normal lung organoids have the cross-sectional shape of a normal airway, while lung cancer organoids have various cells compactly clustered together.
  • small cell lung cancer is mainly composed of cells with large nuclei and little cytoplasm, while non-small cell lung cancer has smaller nuclei and more cytoplasm than small cell lung cancer.
  • normal lung organoid which has a structure similar to the cross section of a normal airway, small cell lung cancer, and lung cancer organoid, which has a structure similar to non-small cell lung cancer.
  • Refractive index tomography was performed to confirm the three-dimensional structure of the organoid, the lumen structure in the center of the organoid, and the surrounding cells.
  • Holotomographic imaging of non-small cell lung cancer organoids after 10 days of culture was performed (see Figures 8 and 9). Holotomography was carried out as follows: organoids were harvested from cold DPBS (Welgene) on plates and centrifuged at 500 ⁇ g for 5 min at 4°C. The pellet was washed once with cold DPBS and centrifuged again (repeated 3 times). The organoid pellet was fixed in 4% paraformaldehyde (Biosesang) at 4°C for 24 hours, centrifuged at 500 ⁇ g for 5 minutes at 4°C, washed once with DPBS, and centrifuged again (repeated twice) ).
  • organoids were harvested from cold DPBS (Welgene) on plates and centrifuged at 500 ⁇ g for 5 min at 4°C. The pellet was washed once with cold DPBS and centrifuged again (repeated 3 times). The organoid pellet was fixed in 4% paraformaldehyde (
  • Organoid pellets in DPBS were transferred to a 50 mm imaging dish with a 1.5 bottom coverslip (TomoDish; Tomocube).
  • Three-dimensional refractive index tomograms with a 140 ⁇ m Z-scan range were acquired using an HT-X1 holotomography (Tomocube) and visualized through image analysis software (TomoAnalysis version 1.5; Tomocube).
  • lung cancer organoids of various shapes composed of various cells were generated (FIG. 8). Additionally, holotomography of lung cancer organoids taken from multiple Z sections ( Figure 9) shows various intracellular features such as (a) mucosal layer, (b) apicobasal polarization, ciliated cells (red arrows), (c) mitochondria, and lipid droplets. Shows organelles. Looking at this in more detail, the following characteristics can be identified: The mucus secreted in the lumen was distinguished by a slightly higher refractive index distribution than the mucus in the respiratory tract.
  • ciliated cells were clearly identified based on their multiciliated structure. Subcellular structures of each cell, such as nucleus, nucleolus, mitochondria, and lipid droplets, were also observed.
  • organoids reproduced the structure and function of the human lung in vivo.
  • Figure 5 in the comparative example in which organoid production was attempted through 'enzymatic dissociation', organoids were not formed well in both normal lung and lung cancer, and various characteristics of organoids such as those in the example could not be confirmed. .
  • lung cancer organoids and lung cancer organoids were separated into single cells and single cell RNA sequencing was performed.
  • lung organoids include tumor cells (cancer cells), cycling cells (proliferating cells), and normal lung cells (basal cells, neuroendocrine cells, suprabasal cells. It includes club cells, goblet cells, multiciliated cells, deuterosomal cells, etc.
  • the results of single cell RNA sequencing and UMAP (Uniform Manifold approximation and projection; Cell 2019, 177, 1888-1902.e21. reference) of the type and state of organoid cells are shown in Figures 10 and 11, respectively.
  • the lung cancer organoid according to the present invention was composed of cancer cells of very high purity.
  • organoids were not formed in the comparative example.
  • Lung cancer organoids composed of highly purified cancer cells obtained by the present invention can be used in drug screening to determine the most effective drug for treating lung cancer patients.
  • lung cancer tissue showing EGFR mutation was used as a lung cancer organoid obtained according to the method of the present invention (producing organoids by obtaining cancer cells through 'dissociation by freezing-thawing') as follows.
  • a drug sensitivity test was conducted. An overview of the experiment is conceptually shown in Figure 12.
  • Organoid spots were scanned with an automated optical fluorescence scanner (ASFA® scanner, Korea Medical & Bio Decision). The scanner's microscope moved in the z direction to automatically focus on cell spots, and 384 individual pictures were taken at 4x magnification from one stained column/well plate. The photos were then combined into a single JPEG image for data analysis. Scanned images were analyzed using CellAnalyzer version 2.0 (Medical and Bio Decision). After scanning the cells, the organoid spots were transferred to a new 384-well plate containing CellTiter-Glo® 3D reagent, and intracellular ATP levels were measured through luminescence activity.
  • lung cancer organoids from EGFR mutant lung cancer patients were clinically identical to actual EGFR mutant lung cancer patients. It was confirmed that it was sensitive to EGFR-TKI (Afatinib, osimertinib) but not to ALK inhibitors (Alectinib, crizotinib) (see table below).

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Abstract

본 발명은 종래 오가노이드 제작을 위한 효소적 처리에 의한 세포의 해리를 물리적 해리로 대체함으로써 효소적 처리에 의한 낮은 오가노이드 생성률 문제를 해결한 새로운 오가노이드 제작방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (A) 생체조직을 급속 냉동처리하는 단계; (B) 상기 급속 냉동처리된 검체를 해동하는 단계; (C) 상기 해동된 검체를 기계적으로 해리하여 해리된 세포를 획득하는 단계; (D) 상기 해리된 세포를 이용하여 오가노이드를 제작하는 단계:를 포함하는 오가노이드제작 방법에 관한 것이다.

Description

오가노이드 제작 방법
본 발명은 생체 조직으로부터 오가노이드를 제작하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 종래 오가노이드 제작을 위한 효소적 처리에 의한 세포의 해리를 물리적 해리로 대체함으로써 효소적 처리에 의한 낮은 오가노이드 생성률 문제를 해결한 새로운 오가노이드 제작방법에 관한 것이다.
오가노이드(organoid)는 세포를 3차원 배양하여 만들어지는 장기(organ) 모사체이다. 오가노이드는 세포주와 비슷한 실험모델로서 장기배양 및 동결보존이 가능하고 조작과 관찰이 용이하다는 장점을 가진다. 또한 세포의 본래 특성이 유지됨은 물론 생체 내에서만 볼 수 있었던 세포 계층적, 조직학적 구조를 재현함으로써 세포보다 한 단계 높은 차원의 생리현상을 연구할 수 있는 실험모델이다.
오가노이드는 실제 장기와의 유사성을 활용한 질병 모델과 조직 재생능을 활용한 재생치료제 두 가지 측면에서 활용이 가능하다.
오가노이드 기반의 질병 모델은 인체 조직을 이용하여 제작 가능한 인간 장기 모델로서 동물실험이나 단층배양 실험에 의한 연구보다 더욱 생체와 유사한 결과를 얻을 수 있다. 오가노이드는 정상 장기 모델링을 통한 발달 및 재생 기전 연구, 장기의 질병 모델링을 통한 병인 기전 연구 및 약물 개발 등이 가능하고, 특히 암 오가노이드의 경우에는 종양 생성 기전부터 정밀의학, 항암제 개발 등 대부분의 종양 연구 분야에 활용될 수 있다. 두 번째 활용 분야인 오가노이드 기반의 재생치료제는 오가노이드를 직접 손상된 조직에 이식하여 조직 손상을 복구할 수 있는 근원적 치료제가 될 수 있다.
현재까지 침샘, 간, 눈물샘, 담도, 갑상선, 모낭, 췌장, 위, 자궁내막 등 다양한 형태의 오가노이드 제작 사례가 있지만, 오가노이드 배양 성공률은 장기마다 또는 대상 세포 샘플의 크기에 따라 상당히 차이가 큰 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 수술 조직을 source로 하여 만드는 경우 배양 성공률이 높은 편이지만, 조직검사 검체처럼 작은 검체를 source로 하여 오가노이드를 만들면 배양 성공이 상당히 낮다 (Cells. 2021 Nov 4;10(11):3012). 특히 종양 연구에 있어서는 오가노이드가 실제 종양 미세환경(tumor environment)을 모사하지 못한다는 큰 제약이 있다 (Nat. Commun.2019,10, 3991). 또한 암세포 오가노이드를 만들기 위해서 통상적으로 가위나 칼로 암 조직을 잘게 자른(mechanical dissociation) 다음 dispase와 같은 효소로 처리하여 세포 표면의 fibronectin, collagen 등을 절단함으로써 세포를 분리시키는 효소 처리를 하여서 암 조직의 결제 조직을 분해했다. 이러한 종래 방식에 의하면 조직들이 단세포(single cell)로 잘 분해되기는 하지만 효소의 세포 독성 때문에 일부 세포들은 사멸하기도 하고 살아 있는 세포들도 상태가 나빠져서 잘 분열하지 못하는 경우도 많다.
폐암은 최근 10 여년간 표적치료제 및 면역치료제 등 혁신적인 치료법의 개발로 인해서 치료 성적이 많이 향상되었지만, 여전히 암 사망의 가장 흔한 원인이며 폐암 전체의 5년 생존률은 32.5%에 불과하다. 이에 폐암에 대해서도 오가노이드를 이용하여서 암의 발생 기전 규명 및 새로운 약제 스크리닝, 개인별 맞춤항암치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 진행성, 전이성 폐암 환자의 조직검사 검체를 이용하여서 폐암 오가노이드를 만들려는 노력들이 있었으나 배양 성공률이 10~20% 정도로 매우 낮은 편이다 (Cell Rep.2020,31, 10758 / NPJ Precis. Oncol.2021,5, 29).
US 2021-0087532 A1은 극저온 보존된 조직으로부터 시간제약 없이 오가노이드를 제작하는 기술에 관한 것으로, 분리된 세포 획득을 위해서 보존매체에 현탁된 상태로 냉동보존된 조직을 해동하는 단계, 냉동매체를 세척하는 단계, 효소(Dispase)를 처리하여 중간엽 기저의 상피세포를 해리하는 단계를 거치고 있다. 이 문헌은, 냉동보존과정을 거치지 않은 신선한(fresh) 조직으로부터의 오가노이드에 비해 더 작고 덜 구조화(crypts)되었지만, 장기 냉동보존된 조직으로부터 오가노이드 제작이 가능함을 보고하고 있다.
본 발명은 생체 조직, 특히 조직검사 조직으로부터 용이하게 오가노이드를 제작할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 효소적 처리가 없이, 따라서 효소처리에 의한 위해요소 없이 오가노이드를 제작할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은
(A) 생체 조직을 급속 냉동처리하는 단계; (B) 상기 급속 냉동처리된 검체를 해동하는 단계; (C) 상기 해동된 검체를 기계적으로 해리하여 해리된 세포를 획득하는 단계; (D) 상기 해리된 세포를 이용하여 오가노이드를 제작하는 단계:를 포함하는 오가노이드 제작 방법에 관한 것이다. 이때 상기 단계(A)는, 수술 또는 생검으로 분리된 생체 조직의 전부 또는 국소부위가 급속 냉동처리될 수도 있고, 수술 또는 생검에서 조직을 분리하기 전에 국소적으로 급속 냉동처리된 다음 분리될 수도 있을 것이다. 본 발명에서 단계(A)와 (B) 사이에 시간적 이격이 있을 수 있다. 즉, 본 발명에서 '냉동처리된 검체'는 생체로부터 즉석에서 획득될 수도 있고, 획득되어 동결보존된 조직일 수도 있다.
본 발명에서 상기 단계(A)는, 생체 조직의 해리 세포 획득을 위한 소정 부위에 극저온프로브(cryoprobe) tip을 접촉시켜 국소 냉동시키는 소단계와, 생체 조직으로부터 국소 냉동 부위만을 분리하는 소단계를 포함하는 것일 수 있다. 이때 상기 극저온프로브(cryoprobe) tip 온도는 -40~-130℃이고 접촉시간은 3~5초인 것이 바람직하다. 극저온프로브의 종류, 취급온도 등은 본 발명이 속한 기술분야에서 널리 알려진 것이므로 이에 대한 상세한 설명을 생략한다. 본 발명에서는 극저온프로브를 활용함으로써 생체 조직 중에서 관심의 대상이 되는 국소부위의 세포덩어리를 획득할 수 있게 되며, 이에 의해 획득되는 시료 중 세포의 동일성을 최대화 할 수 있다. 예를 들면, 생체 조직 중에서 암세포가 발현된 병변부위만을 고순도로 분리하여 획득할 수 있게 된다.
본 발명에서 상기 생체 조직은 경피적 또는 내시경적 생검법(냉동생검 또는 겸자생검)에 의해 분리된 것일 수 있지만, 수술적 방법에 의해 획득되는 것을 배제하는 것은 아니다. 이때 본 발명에서 상기 생체 조직은 암 조직, 보다 구체적으로는 폐암 조직일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 폐암 조직은 비수술적 생검 시술에 의해 획득된 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 폐암 조직은 비수술적 냉동 생검 시술에 의해 획득된 것일 수 있다.
암 세포의 순도에 대한 논란을 피할 수 있는 방법 중 가장 좋은 방법은 처음 암 오가노이드를 만들기 시작할 때 정상 세포가 최대한 없는 조직을 이용하는 것 즉, 정상 세포가 없는 악성 흉수의 암 세포나 전이성 병변에서 얻은 조직으로 암 오가노이드를 만드는 것이다. 그러나 예를 들면, 진단 당시 비소세포폐암의 8-12%만 악성 흉수가 있으며, 전이병변의 암세포와 암 원발부위의 암세포의 특성이 다를 수 있다. 따라서 최대한 암 병변만 선택적으로 생검을 하는 경피적 생검, 내시경, 초음파 내시경 등을 통해서 얻는 비수술 조직 검체는 고순도 암 오가노이드를 만들기 위한 좋은 시료가 된다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 '효소적 해리'가 아닌 물리적 해리를 통해 획득된 세포로 오가노이드를 제작할 수 있으므로 '효소적 해리'에 의한 악영향 없이 오가노이드를 제작할 수 있다.
또한 본 발명에 의하면 '효소적 해리'를 거치지 않기 때문에 보다 간단하고 효율적으로 원하는 오가노이드의 제작이 가능하게 된다.
또한 본 발명에 의하면 수술적으로 획득한 검체뿐 아니라, 생검에 의한 생체 조직으로부터 용이하게 오가노이드를 제작할 수 있으며, 이를 활용하여 기존에는 거의 불가능했던 3 ,4기 폐암 환자의 폐암 조직검사 검체로부터 폐암 오가노이드의 제작이 가능하고, 이를 이용한 개인 맞춤형 항암 치료 및 항암제 신약 스크리닝이 가능해진다.
도 1, 2는 각각 수술조직 및 작은 생검조직을 전처리하는 과정을 보여주는 사진.
도 3은 본 발명의 실시예에서 오가노이드를 생성하는 과정을 보여주는 사진.
도 4는 실시예에서 사용된 cryoprobe의 구조를 보여주는 개념도 및 급속 동결하는 과정을 보여주는 사진.
도 5 내지 7은 본 발명에 의한 방식으로 제작된 오가노이드의 각종 사진.
도 8, 9는 본 발명에 의한 방식으로 제작된 오가노이드의 Holotomography 사진.
도 10은 실시예에 의한 오가노이드의 Single cell RNA sequencing 결과도.
도 11은 실시예에 의한 오가노이드 세포의 유형과 상태를 보여주는 UMAP.
도 12는 실시예에 의한 오가노이드의 약물 민감도 테스트 상황을 보여주는 개념도.
도 13 및 14는 각각 실시예에 의한 오가노이드의 약물에 대한 생존력과 생존비율을 보여주는 사진 및 그래프.
전술하였듯이 본 발명은, 조직의 급속 동결-해동의 과정을 통해 종래 배양 성공률이 저조했던 조직검사 검체 유래 오가노이드의 성공적인 배양을 위한 조직 검체 해리 방법이다. 즉, 본 발명은 기존에 통상적으로 시행되어온 효소적 해리 과정을 없애고 검체 조직에 급속 냉동 및 해동을 적용하여 기관의 오가노이드 배양 성공률을 향상시킨 것이다. 현재까지 오가노이드 배양에 급속 냉동 및 해동방법을 이용한 사례는 확인되지 않았다.
아래 실시예에서 확인되었듯이, 조직을 급속 냉동-해동 처리하고 효소 처리없이 물리적으로만 단세포로 분해한 다음 오가노이드를 유도하였을 때 기존의 효소 해리 방법으로 했을 때에 비해서 조직 오가노이드가 크고 빠르게 생성되었다.
이러한 본 발명에 의한 오가노이드 제작방법은 다양하게 활용 가능하다. 예를 들면 폐암 치료에 다음과 같이 활용될 수 있다.
최근에는 항암치료 이후에 폐암이 진행하면 재조직검사(re-biopsy)를 시행해서 새로운 유전자 변이나 약제 내성 기전을 확인해서 다음 치료 약제를 선정하게 된다. EGFR-TKI 치료 이후 병이 진행하는 경우 재조직검사를 통해 EGFR T790M변이가 확인되면 Osimertinib 치료를 시작하는 것이 대표적인 예이다. 또한 수술이나 항암/방사선 치료 이후 다양한 부위에서 재발이 의심되는 경우 해당 병변을 조직검사 해서 재발 여부를 확인하는 것이 통상적이다. 이러한 조직검사 검체를 이용해서 폐암 오가노이드를 만들 수 있으면 환자들에게 폐암의 진행 또는 재발 시점에 가장 적합한 치료 약제를 선정하는데 큰 도움이 될 수 있을 것이다.
또한 다양한 위치와 다양한 시점에 만든 폐암 오가노이드는 여러 부위 암세포들의 이질성(Heterogeneity) 및 약제 감수성의 패턴을 찾고 항암제 내성 암세포들의 특성을 보다 심도 깊게 연구할 수 있게 된다.
나아가 한 환자의 다양한 부위와 시점에 만든 오가노이드들을 모은 폐암 오가노이드 클러스터를 구축하여서 환자 개인의 맞춤형 치료뿐만 아니라 후보 약제 스크리닝을 할 때도 해당 연구에 필요한 최적의 폐암 오가노이드 그룹을 선별하여 다양한 연구를 진행할 수 있게 된다.
이하 첨부된 도면과 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
[실시예]
1. 폐암 조직의 획득
① 폐결절, 폐암으로 기관지내시경검사, 폐조직검사 또는 수술을 받는 환자 ② 간질성 폐질환, 기흉으로 기관지내시경검사, 폐조직검사 또는 수술을 받는 환자 ③ 만 19세 이상의 남녀, 폐암 1~4기, 폐암 환자로부터 얻어진 폐암 조직(비소세포폐암, 소세포폐암)을 환자의 동의하에 검체로 사용하였다. 환자 인체로부터 분리된 폐암 조직을 1% 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 DMEM/F12 배지(Gibco, Waltham, MA, USA)에 보관하고 12시간 이내에 다음의 과정을 진행하였다.
2. 폐암 조직의 해리(dissociation)
(1) 전처리
획득된 폐암 조직의 병변부위만을 분리한 후 최대한 균일하게 둘로 절단하여 각각 본 발명에 의한 실시예(냉동-해동 해리법 이용)를 위한 검체 및 통상적인 효소처리법에 의한 비교예를 위한 검체로 활용하였다. 수술조직 및 작은 생검조직을 전처리하는 과정을 보여주는 사진을 도 1, 2에 각각 도시하였다. 이와 별도로, 절제한 폐에서 암이 없는 부분을 이용해서 폐 오가노이드(정상 폐 세포 유래의 오가노이드)를 제작하였다.
한편, 수회의 사전 실험에서 획득된 폐암 조직의 병변부위만을 분리한 후 그 일부를 냉동-해동법으로 해리한 시료(실시예 유형1: 수술적 조직획득→냉동→해동→기계적 해리)와, 처음부터 냉동생검으로 획득한 조직(냉동됨)을 해동하여 해리한 시료(실시예 유형2: 내시경 냉동생검→해동→기계적 해리)를 이용한 오가노이드 생성에 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 이에 실시예에는 상황에 따라서 유형1 또는 유형2가 적용되었다. 예를 들어 도 5 내지 8의 실시예는 유형1이고, 나머지의 실시예는 유형2이다.
(2) 실시예를 위한 검체의 해리
다음과 같은 과정으로 '냉동-해동에 의한 해리'를 수행하였다. 해동 후 기계적으로 해리하고 이로부터 오가노이드를 생성하는 과정을 도 3에 도시하였다.
① 폐암 조직 병변에 팁 온도가 약 -90℃인 cryoprobe tip을 3~5초간 접촉시켜서 급속 동결 후 자동 해동(팁을 떼면 자동 해동)시킨다. 본 실시예에서는 환자 인체로부터 분리된 폐암 조직을 대상으로 하였으나, 사전 실험에 의하면 인체로부터 직접 냉동생검(cryobiopsy)으로 획득한 조직으로 다음 단계를 진행해도 유사한 결과를 나타내었다. 본 실시예에서 사용된 cryoprobe(1.9mm 저온 탐침, CRYO2; Erbe Elektromedizin GmbH, Tubingen, Germany)의 구조를 보여주는 개념도 및 급속 동결하는 과정을 보여주는 사진을 도 4에 도시하였다. 급속 동결 및 해동은 다른 다양한 방법을 택할 수 있을 것이다.
② 검체에 2% antibiotics (sigma; A5955) 함유 DMEM/F12(Gibco ; 11330032) 1ml을 가하고 가위로 잘게 자른 다음 Handy homogenizer로 한번 더 파쇄한다.
③ 조직 조각을 70㎛ cell strainer로 걸러준 후 DMEM/F12+ (contain Antibiotics)로 세척하면서 세포를 모은다.
④ 4℃에서 300×g로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거한다. 이때 상등액이 붉은 색이면 pellet에 적혈구가 섞여 있는 것이므로 적혈구를 용해해준다.
적혈구 용해는, 1 × RBC lysis buffer(10 × lysis buffer 1ml + D.D.W 9ml) 1ml을 넣고 tapping 해준 후 5분 후 10% FBS를 넣은 DPBS(without calcium and magnesium; Dulbecco's phosphate-buffered saline, Thermo Fisher, USA)로 RBC lysis를 중단한다.
⑤ 4℃에서 300×g로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 DPBS 1ml을 넣고 세척한다. 이후 획득된 세포를 계수한다.
(3) 비교예를 위한 검체의 해리
단계①에서 폐암 조직 병변에 아래 표와 같은 조성의 Dissociation Buffer 1ml을 넣고 가위로 잘게 자른 후 37℃에서 30분간 enzyme digestion (DNase (sigma; AMPD1), liberase)를 진행한 것을 제외하고는 위 (1)과 동일한 과정으로 '효소적 해리'를 수행하였다.
Figure PCTKR2023015128-appb-img-000001
3. 세포 배양 및 오가노이드 제작
다음의 방식에 따라 세포를 배양하고 오가노이드를 제작하였다(도 3 참조).
① Cell pellets(약 1000 세포가 되도록 조절)에 20ul Matrigel (Corning, 354230)을 넣고 bubble이 생기지 않게 섞어준다.
② Mixture 20ul를 37℃로 보온된 48 well plate에 bubble이 생기지 않게 떨어트린다.
③ Plate 뚜껑을 닫고 뒤집어서 37℃ 배양기에 5분간 dome 형태로 굳힌다.
④ Plate를 꺼내서 정방향으로 뒤집은 후, 아래 표와 같은 조성의 배지(airway organoid media) 200ul를 matrigel에 닿지 않게 well side 쪽으로 넣어준다.
Figure PCTKR2023015128-appb-img-000002
⑤ 5% 이산화탄소, 37℃ 조건에서 배양하였다. 배지는 4일에 한번씩 바꿔주며, organoid마다 자라는 속도가 다르기 때문에 배양 동안 현미경으로 확인하여 organoid 갯수가 많아지고 커지면 1~3주 간격으로 다음과 같이 계대배양하는 과정(passage)을 진행하였다: 오가노이드(배양 시작 후 2~3주)를 DPBS(웰진)에서 수확하고 4℃에서 5분간 500×g으로 원심분리하였다. 펠릿에 200㎕ TrypLE Express(Gibco)를 가하고 37℃에서 10분 동안 분해한 후 10% FBS(Welgene)를 함유하는 1㎖의 차가운 DPBS를 첨가하여 분해를 중지시켰다. 이어서 위와 동일한 조건으로 원심분리하여 펠릿을 분리하고 차가운 DPBS로 세척한 다음 원심분리하였다. 획득한 펠릿을 위와 같은 조건에서 계대배양하였다.
4. 제작된 오가노이드
(1) 오가노이드의 생성
① 오가노이드 생성
실시예('냉동-해동에 의한 해리'를 통해 오가노이드 생성)의 경우 오가노이드가 크게 잘 자랐으나(도 5 내지 9 참조), '효소적 해리'를 통해 오가노이드 생성을 시도한 비교예(도 5 참조)에서는 정상 폐, 폐암 모두 오가노이드가 잘 형성되지 않아 실시예와 같은 다양한 오가노이드의 특징을 확인할 수 없었다.
② 실시예에 의한 정상 폐 오가노이드, 폐암 오가노이드 H&E 분석
배양 10일 경과된 실시예의 오가노이드를 알려진 방법(Nat. Commun. 2019, 10, 3991. 참조)에 따라 Hematoxylin and eosin 염색한 후 현미경으로 분석하였다(도 6 참조). 사진에서 Normal lung organoid는 절제한 폐에서 암이 없는 부분을 이용해서 제작된 정상 폐 오가노이드이고, small cell lung cancer와 non small cell lung cancer는 각각 소세포폐암과 비소세포폐암으로부터 유래된 오가노이드이다. 이에 반하여, 비교예에서는 정상 폐, 폐암 모두 오가노이드가 형성되지 않았다.
도 6을 보면, normal lung organoid는 정상적인 기도(airway)의 단면의 모양을 가지고 있는 반면, 폐암 오가노이드들은 다양한 세포들이 compact하게 뭉쳐 있다. 또한 소세포폐암은 핵이 크고 세포질이 적은 세포들로 주로 구성되어 있고, 비소세포폐암은 소세포폐암에 비해서 핵이 작고 세포질이 많다. 즉, 사진으로부터 정상 기도 단면과 비슷한 구조를 가지는 normal lung organoid, 소세포폐암 그리고 비소세포폐암 구조를 닮은 lung cancer organoid를 확인할 수 있다.
③ 실시예에 의한 폐 오가노이드, 폐암 오가노이드 Bright Field Microscopy
배양 10일 경과 후 광학현미경으로 관찰하였다(도 7 참조). 사진에서 볼 수 있듯이, 모두 상당한 크기의 오가노이드가 생성되었다. 비교예에서는 오가노이드가 생성되지 않았다.
④ 실시예에 의한 폐 오가노이드, 폐암 오가노이드 Holotomography
오가노이드의 3차원 구조, 오가노이드 중앙의 루멘 구조 및 주변 세포를 확인하기 위하여 굴절률 단층 촬영을 진행하였다.
배양 10일 경과된 non small cell lung cancer 오가노이드의 홀로토모그래피 촬영을 수행하였다(도 8, 9 참조). 홀로토모그래피는 다음과 같이 진행되었다: 오가노이드를 플레이트에서 차가운 DPBS(웰진)로부터 채취하고 4℃에서 5분간 500×g으로 원심분리하였다. 펠릿을 차가운 DPBS로 한번 세척한 후 다시 원심분리하였다(3회 반복). 오가노이드 펠릿을 4% 파라포름알데히드(바이오세상)에 4℃에서 24시간 동안 고정하고, 4℃에서 5분간 500×g으로 원심분리하고, DPBS로 한번 세척한 후 다시 원심분리하였다(2회 반복). DPBS에 담긴 오가노이드 펠릿을 1.5 하단 커버슬립(TomoDish; Tomocube)이 있는 50mm 이미징 접시로 옮겼다. HT-X1 홀로토모그래피(Tomocube)를 사용하여 140 μm Z 스캔 범위의 3차원 굴절률 단층 촬영을 획득하고 이미지 분석 소프트웨어(TomoAnalysis 버전 1.5; Tomocube)를 통해 시각화하였다.
도면에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 '냉동-해동에 의한 해리' 과정을 거친 경우 다양한 세포로 구성된 다양한 모양의 폐암 오가노이드가 생성되었다(도 8). 또한 복수의 Z 섹션에서 촬영한 폐암 오가노이드의 홀로토모그래피(도 9)는 (a) 점막층, (b) 아피코 기저부 분극, 섬모 세포(빨간색 화살표) (c) 미토콘드리아 및 지질 방울과 같은 다양한 세포 내 소기관을 보여준다. 이를 좀 더 자세히 살펴보면, 다음과 같은 특징을 확인할 수 있다: 내강에서 분비되는 점액은 기도의 점액보다 약간 높은 굴절률 분포로 구별되었다. 깨끗한 내강을 둘러싼 세포에서 아피코 기저부 분극이 관찰되었으며 섬모 세포는 다섬모 구조에 따라 명확하게 식별되었다. 핵, 핵소체, 미토콘드리아, 지질 방울과 같은 각 세포의 아세포 구조도 관찰되었다.
이러한 이미지를 통해 성장한 오가노이드가 생체 내 인간 폐의 구조와 기능을 재현하고 있음을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 도 5에 도시되어 있듯이, '효소적 해리'를 통해 오가노이드 생성을 시도한 비교예에서는 정상 폐, 폐암 모두 오가노이드가 잘 형성되지 않아 실시예와 같은 다양한 오가노이드의 특징을 확인할 수 없었다.
(2) 오가노이드의 암세포 순도 분석
실시예에 의해 제작된 정상 폐 오가노이드, 폐암 오가노이드(4~5주에 걸쳐 2~3번 계대배양됨)에 대해 선행문헌(Rev Physiol Biochem Pharmacol 2021;179:189-210)에 제시된 방법에 따라, 폐암 오가노이드와 정상 폐 오가노이드를 single cell로 분리하고 singel cell RNA sequencing을 시행하였다.
마커 유전자 발현에 기반한 세포 유형 주석(Cancers 2021, 13, 3069.)에 따르면 폐 오가노이드는 tumor cell (암세포), cycling cell (증식하는 세포), 정상 폐세포 (basal cell, neuroendocrine cell, suprabasal cell. club cell. goblet cell. multiciliated cell, deuterosomal cell) 등을 포함하고 있다. singel cell RNA sequencing 결과와 오가노이드 세포의 유형과 상태의 UMAP(Uniform Manifold approximation and projection; Cell 2019, 177, 1888-1902.e21. 참조함)를 각각 도 10, 11에 도시하였다.
도면에서 볼 수 있듯이, 정상 폐 오가노이드 실시예에서는 암세포는 거의 없고 대부분 다양한 정상 폐 세포들로 구성되어 있고, 폐암 오가노이드 실시예에서는 대부분 tumor cell, proliferating cell들로 구성되어 있다. 즉, 본 발명에 의한 폐암 오가노이드는 매우 고순도의 암세포로 이루어져 있음이 확인되었다.
도 5에서 볼 수 있듯이, 비교예에서는 오가노이드가 형성되지 않았다.
(3) 오가노이드의 약물 민감도 분석
본 발명에 의해 획득된, 고순도의 암세포로 이루어진 폐암 오가노이드는 폐암 환자 치료에 가장 효과적인 약물을 결정하기 위한 약물 스크리닝에 사용될 수 있을 것이다. 이를 확인하기 위해 예시적으로, EGFR 돌연변이가 나타난 폐암 조직을 본 발명의 방법('냉동-해동에 의한 해리'를 통해 암세포를 획득하여 오가노이드 생성)에 따라 얻어진 폐암 오가노이드를 활용하여 다음과 같이 약물 민감도 테스트를 진행하였다. 실험 개관을 도 12에 개념적으로 도시하였다.
오가노이드를 채취하여 Matrigel(미국 코닝 생명과학 카탈로그 #354263)과 혼합하여 기둥(pillar) 플레이트에 5×105 세포/mL로 맞추었다. 다음으로, 예냉된 ASFA® spotter(Medical & Bio Decision, 수원, 대한민국)를 사용하여 Matrigel-세포 혼합물(1.5 μL)을 코팅된 기둥 플레이트에 스팟 처리한 다음, 스팟의 바닥에 세포가 응집되도록 4℃에서 15분간 뒤집어 배양하였다. 이어서 스팟이 겔화될 수 있도록 37℃의 습도 챔버에 플레이트를 두었다. 이어서 플레이트를 신선한 배지가 들어있는 웰 플레이트와 결합하였다. 3일 후, 세포를 ASFA® 스팟터를 사용하여 6가지 농도의 EGFR 또는 ALK 표적 약제로 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 0.5 μM calcein-AM으로 염색하고 20분 동안 PBS로 두번 세척하여 세포 생존력을 측정하였다. 오가노이드 스팟을 자동 광학 형광 스캐너(ASFA® 스캐너, 한국 메디컬 앤 바이오 디시전)로 스캔하였다. 스캐너의 현미경은 z 방향으로 이동하여 세포 스팟에 자동으로 초점을 맞췄고, 염색된 기둥/웰 플레이트 하나에서 4배율로 384장의 개별 사진을 촬영하였다. 그런 다음 데이터 분석을 위해 사진들을 단일 JPEG 이미지로 통합하였다. 스캔한 이미지는 CellAnalyzer 버전 2.0(의료 및 바이오 디시전)을 사용하여 분석하였다. 세포를 스캔한 후, 오가노이드 스팟을 CellTiter-Glo® 3D 시약이 포함된 새로운 384웰 플레이트에 옮겨 발광 활성을 통해 세포 내 ATP 수준을 측정하였다.
간단히 정리하면, 플레이트의 기둥(pillar) 당 총 5000개의 단일 세포를 1.5μL 배지에 접종하고 3일간 배양하였다. 그 다음, 여러 가지 EGFR-TKI 및 ALK 억제제를 3일 동안 다중 용량으로 처리하여 IC50와 AUC(area under the curve)를 확인하였다. 6일째 되는 날 형광 염료 Calcein-AM을 사용하여 오가노이드의 생존력을 확인하고(도 13 참조), CellTiter-Glo 3D 세포 생존력 분석(G9681; Promega)으로 각 약물에 대한 생존비율을 측정하였다(도 14 참조).
그 결과, EGFR 돌연변이 폐암 환자의 폐암 오가노이드는 실제 EGFR 돌연변이 폐암 환자의 임상과 동일하게 EGFR-TKI(Afatinib, osimertinib)에는 민감하지만 ALK 억제제(Alectinib, crizotinib)에는 민감하지 않다는 것이 확인되었다(아래 표 참조).
Figure PCTKR2023015128-appb-img-000003
이상의 결과는 본 발명이 제안하는'냉동-해동에 의한 해리'를 통해 획득한 세포는 종래 효소적 방법에 의해 획득한 세포에 비해 오가노이드를 더욱 잘 생성하며, 본 발명에 의한 방법으로 생성된 암세포 오가노이드는 약물 스크리닝 및 개인 맞춤 의학에 사용될 수 있음을 시사한다.

Claims (8)

  1. (A) 생체 조직을 급속 냉동처리하는 단계;
    (B) 상기 급속 냉동처리된 검체를 해동하는 단계;
    (C) 상기 해동된 검체를 기계적으로 해리하여 해리된 세포를 획득하는 단계;
    (D) 상기 해리된 세포를 이용하여 오가노이드를 제작하는 단계:를
    포함하는 것을 특징으로 하는 오가노이드 제작 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계(A)는,
    생체 조직의 해리 세포 획득을 위한 소정 부위에 극저온프로브(cryoprobe) tip을 접촉시켜 국소 냉동시키는 소단계와,
    생체 조직으로부터 국소 냉동 부위만을 분리하는 소단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 오가노이드 제작 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 극저온프로브(cryoprobe) tip 온도는 -40~-130℃이고 접촉시간은 3~5초인 것을 특징으로 하는 오가노이드 제작 방법.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 생체 조직은 생검법에 의해 분리된 것을 특징으로 하는 오가노이드 제작 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 생체 조직은 암 조직인 것을 특징으로 하는 오가노이드 제작 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 생체 조직은 폐암 조직인 것을 특징으로 하는 오가노이드 제작 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 폐암 조직은 비수술적 생검 시술에 의해 획득된 것을 특징으로 하는 오가노이드 제작 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 폐암 조직은 비수술적 냉동 생검 시술에 의해 획득된 것을 특징으로 하는 오가노이드 제작 방법.
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