WO2024101919A1 - 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 분화 방법 - Google Patents

전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 분화 방법 Download PDF

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    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors

Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for inducing differentiation from pluripotent stem cells into natural killer cells.
  • cancer immunotherapy which has recently emerged, is a treatment that utilizes the body's own immune system to more specifically eliminate cancer cells by minimizing damage to normal cells, and is a treatment in various specific fields (antibody therapy, immune cell therapy, Research on viral immunotherapy, nanotechnology immunotherapy, etc.) is actively underway.
  • immune cell therapy includes lymphocytes obtained from the patient's blood, such as natural killer cells, natural killer T cells, T cells, B cells, dendritic cells, etc. It is a method of treating cancer by increasing the number of cells, strengthening their function in vitro, and returning them to the patient's body. Treatment using these immune cells shows good effects in regulating immune responses and is evaluated as excellent in terms of toxicity and safety.
  • NK cells are important cells responsible for innate immunity, and unlike T cells, they mature in the liver and bone marrow. In particular, it has the function of identifying and killing abnormal cells such as virus-infected cells or tumor cells.
  • natural killer cells are known to be difficult to culture and have limitations in that mass proliferation is difficult.
  • pluripotent stem cells there are attempts to differentiate into natural killer cells using pluripotent stem cells, but in these cases, the differentiation efficiency into natural killer cells is low and the expression of natural killer cell-specific markers is low, so a method of increasing expression through artificial genetic manipulation is used. are being attempted.
  • heterogeneous feeder cells are often used, so when applied as a therapeutic agent, the feeder cells may be mixed into the final product, causing safety problems.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2022-0050672
  • Patent Document 2 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2019-0060412
  • One aspect is a medium composition for inducing differentiation from pluripotent stem cells to natural killer cells, which contains a GSK inhibitor, BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), and retinoic acid ( Retinoic acid), a TGF-beta inhibitor, polyvinyl alcohol (PVA), Stem Cell Factor (SCF), or a combination thereof; a first medium composition for inducing differentiation from pluripotent stem cells into hematopoietic stem cells; and a second medium composition for inducing differentiation from hematopoietic stem cells to natural killer cells, including SCF (Stem Cell Factor), IL7 (Interleukin7), IL15 (Interleukin15), FLT3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), or a combination thereof.
  • GSK inhibitor BMP4 (Bone Morphogenetic Protein
  • Another aspect is to provide a kit containing the first medium composition and the second medium composition.
  • Another aspect includes a first step of inducing differentiation of pluripotent stem cells into hematopoietic stem cells by culturing pluripotent stem cells in the presence of the first medium composition; and a second step of inducing differentiation from hematopoietic stem cells into natural killer cells by culturing the hematopoietic stem cells in the presence of the second medium composition. It is provided.
  • Another aspect is to provide natural killer cells or a cell population thereof differentiated from pluripotent stem cells by the above method.
  • Another aspect is to provide a composition comprising the natural killer cells or a cell population thereof.
  • One aspect is a medium composition for inducing differentiation from pluripotent stem cells to natural killer cells, which contains a GSK inhibitor, BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), and retinoic acid ( Retinoic acid), a TGF-beta inhibitor, polyvinyl alcohol (PVA), Stem Cell Factor (SCF), or a combination thereof; a first medium composition for inducing differentiation from pluripotent stem cells into hematopoietic stem cells; and a second medium composition for inducing differentiation from hematopoietic stem cells to natural killer cells, including SCF (Stem Cell Factor), IL7 (Interleukin7), IL15 (Interleukin15), FLT3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), or a combination thereof.
  • GSK inhibitor BMP4 (Bone Morphogenetic Protein
  • Another aspect is to provide a kit containing the first medium composition and the second medium composition.
  • Another aspect includes a first step of inducing differentiation of pluripotent stem cells into hematopoietic stem cells by culturing pluripotent stem cells in the presence of the first medium composition; and a second step of inducing differentiation from hematopoietic stem cells into natural killer cells by culturing the hematopoietic stem cells in the presence of the second medium composition. It is provided.
  • Another aspect is to provide natural killer cells or a cell population thereof differentiated from pluripotent stem cells by the above method.
  • Another aspect is to provide a composition comprising the natural killer cells or a cell population thereof.
  • a medium composition for inducing differentiation from pluripotent stem cells into natural killer cells can improve the efficiency of differentiation into natural killer cells, and enables expression of NK-specific markers without using artificial feeders and without genetic manipulation. There is an effect that can improve.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of the process of differentiating pluripotent stem cells into natural killer cells.
  • Figure 2 shows the results of confirming CD markers specific to natural killer cells after inducing differentiation from stem cells into natural killer cells.
  • Figures 3a and 3b show the results of confirming the expression level of surface receptors and cytoplasmic granules of natural killer cells (PSC-NK cells: cells of Example 1, primary NK cells: cells of Comparative Example 3).
  • Figure 4 shows the results of evaluating the cytotoxicity of natural killer cells in K562 cells (blood cancer cells) and A2780cis cells (ovarian cancer cells) (ES-NK: cells of Example 1, Cryo NK92MI: NK92MI cells).
  • Figure 5 shows the results of evaluating the cytotoxicity of natural killer cells in SKOV3 cells (ovarian cancer cell line) (ESC-NK: cells of Example 1, CD34+ derived NK: derived using CD34 + cells isolated from UCB NK cells differentiated from pluripotent stem cells according to the method of Example 1), Cryo NK92MI: NK92MI cells).
  • SKOV3 cells ovarian cancer cell line
  • ESC-NK cells of Example 1
  • CD34+ derived NK derived using CD34 + cells isolated from UCB NK cells differentiated from pluripotent stem cells according to the method of Example 1
  • Cryo NK92MI NK92MI cells
  • One aspect is a medium composition for inducing differentiation from pluripotent stem cells into natural killer cells, which contains a GSK (Glycogen synthase kinase 3) inhibitor, BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), and bFGF (Basic Fibroblast Growth).
  • GSK Gene synthase kinase 3
  • BMP4 Bone Morphogenetic Protein 4
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • bFGF Basic Fibroblast Growth
  • First medium composition for inducing differentiation and a second medium composition for inducing differentiation from hematopoietic stem cells to natural killer cells, including SCF, IL7 (Interleukin7), IL15 (Interleukin15), FLT3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), or a combination thereof.
  • SCF Session Initiation Cell
  • IL7 Interleukin7
  • IL15 Interleukin15
  • FLT3L FLT3L
  • the first medium composition may include one or more of the following compositions:
  • each of the medium compositions (i) to (iv) can be used separately or simultaneously for differentiation of hematopoietic stem cells into natural killer cells.
  • NK cells refers to cytotoxic lymphocytes that constitute a major component of the innate immune system, and are defined as large granular lymphocytes (LGL) and lymphoid progenitor cells ( Common lymphoid progenitor (CLP) constitutes a third group of cells differentiated from producing B and T lymphocytes.
  • LGL large granular lymphocytes
  • CLP Common lymphoid progenitor
  • the “natural killer cells” or “NK cells” may include not only mature natural killer cells, but also natural killer progenitor cells.
  • the natural killer cells are activated in response to interferon or macrophage-derived cytokines, and natural killer cells are labeled with “activating receptors” and “inhibitory receptors,” which control the cytotoxic activity of the cells. Contains surface receptors.
  • the activity of natural killer cells means the occurrence or increase of the functions of natural killer cells, and refers to the ability to detect pathogenic cells, non-specific infectious pathogens, cancer cells, etc. and remove or kill them.
  • the GSK inhibitor may include a substance listed in Table 1 below.
  • ATP-competitive - Aminopyrimidines (CHIR99021 CHIR98014, CT98014, CT98023, CT99021, TWS119, etc.) - Derived from marine life (6-BIO, dibromocantharelin, hymenialdecine, indirubin, meridianin, etc.) - Arylindole maleimide (SB-216763, SB-41528, etc.), - Thiazole (AR-A014418, AZD-1080, etc.) - Paulones (Alsterpolone, Kazpolone, Kenpolone, etc.), - Aloysine Non-ATP competitive - Derived from marine life (manzamine A, palinurin, tricanthin, etc.) - Thiazolidinedione (TDZD-8, NP00111, NP031115, tidglu
  • the TGF-beta inhibitor is 4- ⁇ 4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl ⁇ -N-(tetrahydro- 2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate (4- ⁇ 4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl ⁇ -N-(tetrahydro-2H -pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline (4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol- 4-yl]-quinoline), 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine (2-[3-(6-Methyl -2-pyridinyl)-1H-pyra
  • CHIR99021 in the present invention refers to a compound having the structural formula of Formula 1 below.
  • SB-431542 in the present invention refers to a compound having the structural formula of the following formula (2).
  • medium varies depending on the purpose of use, but is a medium for culturing animal cells that basically contains inorganic salts, carbon sources, amino acids, bovine serum albumin (BSA), and cofactors, and is a general medium well known to those skilled in the art.
  • the medium contains NaCl, KCl and NaHCO3 as inorganic salts, glucose, sodium pyruvate and calcium lactate as carbon sources, and essential and non-essential amino acids including glutamine as amino acids.
  • other trace elements and buffer solutions may be included as cofactors.
  • the medium may also contain antibiotics.
  • the medium includes various known and commercialized media for animal cell culture, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM (Endothelial Differentiation Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640. , F-10, F-12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), and Iscove's Modified Dulbecco's Medium can be used as is, but are not limited thereto. In one embodiment, StemPro-34 SFM medium can be used.
  • the concentration of the GSK inhibitor (e.g., CHIR99021) in the first medium composition is 0.1 to 100 ⁇ M, 0.1 to 90 ⁇ M, 0.1 to 80 ⁇ M, 0.1 to 70 ⁇ M, 0.1 to 60 ⁇ M, 0.1 to 50 ⁇ M.
  • the concentration of BMP4 in the first medium composition is 1 to 1000 ng/ml, 1 to 900 ng/ml, 1 to 800 ng/ml, 1 to 700 ng/ml, and 1 to 600 ng/ml. , 1 to 500 ng/ml, 1 to 400 ng/ml, 1 to 300 ng/ml, 1 to 200 ng/ml, 1 to 100 ng/ml, 10 to 1000 ng/ml, 20 to 1000 ng/ml, 30 to 1000 ng/ml, 40 to 1000 ng/ml, 10 to 900 ng/ml, 20 to 800 ng/ml, 30 to 700 ng/ml, 40 to 600 ng/ml, 40 to 500 ng/ml, 40 It may be from 400 ng/ml, 40 to 300 ng/ml, 40 to 200 ng/ml, 40 to 100 ng/ml or 10 to 100 ng/ml.
  • the concentration of VEGF in the first medium composition is 1 to 1000 ng/ml, 1 to 900 ng/ml, 1 to 800 ng/ml, 1 to 700 ng/ml, and 1 to 600 ng/ml. , 1 to 500 ng/ml, 1 to 400 ng/ml, 1 to 300 ng/ml, 1 to 200 ng/ml, 1 to 100 ng/ml, 10 to 1000 ng/ml, 20 to 1000 ng/ml, 30 to 1000 ng/ml, 40 to 1000 ng/ml, 10 to 900 ng/ml, 20 to 800 ng/ml, 30 to 700 ng/ml, 40 to 600 ng/ml, 40 to 500 ng/ml, 40 It may be from 400 ng/ml, 40 to 300 ng/ml, 40 to 200 ng/ml, 40 to 100 ng/ml or 10 to 100 ng/ml.
  • the concentration of bFGF in the first medium composition is 1 to 1000 ng/ml, 1 to 900 ng/ml, 1 to 800 ng/ml, 1 to 700 ng/ml, and 1 to 600 ng/ml.
  • the concentration of retinoic acid in the first medium composition is 0.05 to 50 ⁇ M, 0.07 to 50 ⁇ M, 0.09 to 50 ⁇ M, 0.1 to 50 ⁇ M, 0.3 to 50 ⁇ M, 0.5 to 50 ⁇ M, 0.7 to 50 ⁇ M. ⁇ M, 0.9 to 50 ⁇ M, 0.05 to 40 ⁇ M, 0.05 to 30 ⁇ M, 0.05 to 20 ⁇ M, 0.05 to 10 ⁇ M, 0.05 to 5 ⁇ M, 0.07 to 40 ⁇ M, 0.09 to 30 ⁇ M, 0.1 to 20 ⁇ M, 0.3 to 20 ⁇ M It may be ⁇ M, 0.5 to 10 ⁇ M, 0.7 to 5 ⁇ M or 0.1 to 10 ⁇ M.
  • the concentration of the TGF-beta inhibitor (e.g., SB-431542) in the first medium composition is 0.1 to 500 ⁇ M, 0.1 to 400 ⁇ M, 0.1 to 300 ⁇ M, 0.1 to 200 ⁇ M, 0.1 to 100 ⁇ M , 1 to 500 ⁇ M, 5 to 500 ⁇ M, 5 to 400 ⁇ M, 5 to 300 ⁇ M, 5 to 200 ⁇ M, 5 to 100 ⁇ M, 5 to 50 ⁇ M or 1 to 100 ⁇ M.
  • the concentration of PVA in the first medium composition is 0.002 to 5% (w/v), 0.004 to 2% (w/v). 0.01 to 1% (w/v), 0.02 to 0.8% (w/v), 0.02 to 0.5% (w/v). 0.04 to 0.3% (w/v). It may be 0.05 to 0.2% (w/v), or 0.07 to 0.2% (w/v).
  • the concentration of the SCF in the first medium composition is 1 to 1000 ng/ml, 1 to 900 ng/ml, 1 to 800 ng/ml, 1 to 700 ng/ml, and 1 to 600 ng/ml. , 1 to 500 ng/ml, 1 to 400 ng/ml, 1 to 300 ng/ml, 1 to 200 ng/ml, 5 to 500 ng/ml, 10 to 1000 ng/ml, 10 to 500 ng/ml. 10 to 250 ng/ml, 10 to 100 ng/ml. It may be 20 to 100 ng/ml, 30 to 80 ng/ml.
  • the concentration of the GSK inhibitor in the first medium composition is 1 to 10 ⁇ M
  • the concentration of BMP4 is 10 to 100 ng/ml
  • the concentration of VEGF is 10 to 100 ng/ml
  • the concentration of bFGF is 10 to 10 ng/ml.
  • the concentration of retinoic acid is 0.1 to 10 ⁇ M
  • the concentration of TGF-beta inhibitor is 1 to 100 ⁇ M
  • the concentration of PVA is 0.01 to 1% (w/v)
  • the concentration of SCF is 5 to 500 ng/ It may be ml.
  • the concentration of the SCF in the second medium composition is 1 to 100 ng/ml, 1 to 90 ng/ml, 1 to 80 ng/ml, 1 to 70 ng/ml, and 1 to 60 ng/ml. , 1 to 50 ng/ml, 1 to 40 ng/ml, 1 to 30 ng/ml, 3 to 100 ng/ml, 5 to 100 ng/ml, 7 to 100 ng/ml, 9 to 100 ng/ml, 11 to 100 ng/ml, 13 to 100 ng/ml, 15 to 100 ng/ml, 3 to 90 ng/ml, 5 to 80 ng/ml, 7 to 70 ng/ml, 9 to 60 ng/ml, 11 It may be from 50 ng/ml to 50 ng/ml, from 13 to 40 ng/ml, from 15 to 30 ng/ml or from 1 to 50 ng/ml.
  • the concentration of IL7 in the second medium composition is 1 to 100 ng/ml, 1 to 90 ng/ml, 1 to 80 ng/ml, 1 to 70 ng/ml, and 1 to 60 ng/ml. , 1 to 50 ng/ml, 1 to 40 ng/ml, 1 to 30 ng/ml, 3 to 100 ng/ml, 5 to 100 ng/ml, 7 to 100 ng/ml, 9 to 100 ng/ml, 11 to 100 ng/ml, 13 to 100 ng/ml, 15 to 100 ng/ml, 3 to 90 ng/ml, 5 to 80 ng/ml, 7 to 70 ng/ml, 9 to 60 ng/ml, 11 It may be from 50 ng/ml to 50 ng/ml, from 13 to 40 ng/ml, from 15 to 30 ng/ml or from 1 to 50 ng/ml.
  • the concentration of IL15 in the second medium composition is 1 to 100 ng/ml, 1 to 90 ng/ml, 1 to 80 ng/ml, 1 to 70 ng/ml, and 1 to 60 ng/ml. , 1 to 50 ng/ml, 1 to 40 ng/ml, 1 to 30 ng/ml, 1 to 20 ng/ml, 3 to 100 ng/ml, 5 to 100 ng/ml, 7 to 100 ng/ml, It may be 9 to 100 ng/ml, 3 to 90 ng/ml, 5 to 80 ng/ml, 7 to 70 ng/ml, 9 to 60 ng/ml or 1 to 50 ng/ml.
  • the concentration of FLT3L in the second medium composition is 1 to 100 ng/ml, 1 to 90 ng/ml, 1 to 80 ng/ml, 1 to 70 ng/ml, and 1 to 60 ng/ml. , 1 to 50 ng/ml, 1 to 40 ng/ml, 1 to 30 ng/ml, 1 to 20 ng/ml, 3 to 100 ng/ml, 5 to 100 ng/ml, 7 to 100 ng/ml, It may be 9 to 100 ng/ml, 3 to 90 ng/ml, 5 to 80 ng/ml, 7 to 70 ng/ml, 9 to 60 ng/ml or 1 to 50 ng/ml.
  • the concentration of SCF in the second medium composition is 1 to 50 ng/ml
  • the concentration of IL7 is 1 to 50 ng/ml
  • the concentration of IL15 is 1 to 50 ng/ml
  • the concentration of FLT3L is 1. It may be from 50 ng/ml.
  • “positive or +” may mean that, in relation to a cell marker (marker), the marker is present in a larger amount or at a higher concentration compared to other cells for which the marker is a reference.
  • a cell can be positive for a marker if the marker can be used to distinguish the cell from one or more other cell types because it is present inside or on the surface of the cell. It may also mean that the cell has the label in an amount sufficient to produce a signal greater than the background value, for example, a signal from a cytometry device.
  • a cell can be detectably labeled with an antibody specific for CD56, and if the signal from this antibody is detectably greater than the control (e.g., background), then the cell is "positive for CD56.” " or "CD56+”.
  • the term “negative or -” may mean that even using an antibody specific for a particular cell surface marker, that marker cannot be detected compared to a background value. For example, if cells cannot be detectably labeled with antibodies specific for CD3. The cells may be indicated as “negative for CD3” or “CD3-”.
  • more than 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, or 99% of the cells may be negative for CD3 and positive for CD56.
  • our natural killer cell population is
  • NKG2D is expressed in more than 50%, 60%, or 64% of CD3 - CD56 + cells, and/or
  • NKp30 is expressed in more than 50%, 70%, 80%, or 89% of CD3 - CD56 + cells, and/or
  • NKp44 is expressed in more than 50%, 80%, 90%, or 94% of CD3-CD56+ cells, and/or
  • NKp46 is expressed in more than 50%, 60%, or 67% of CD3 - CD56 + cells, and/or
  • DNAM-1 may be expressed in more than 50%, 80%, 90%, or 94% of CD3 - CD56 + cells.
  • our natural killer cell population is
  • NKG2A is expressed in less than 5%, 2%, or 1% of CD3 - CD56 + cells
  • KIR2DL1 is expressed in less than 5%, 2%, or 1% of CD3 - CD56 + cells, and/or
  • KIR2DL2/3 is expressed in less than 20%, 15%, or 10% of CD3 - CD56 + cells, and/or
  • KIR3DL1 may be expressed in less than 10%, 6%, 5%, or 3% of CD3 - CD56 + cells.
  • our natural killer cell population is
  • Perforin is expressed in more than 50%, 80%, 90%, or 98% of CD3 - CD56 + cells, and/or
  • the granzyme ratio may be expressed in more than 50%, 80%, 90%, or 98% of CD3 - CD56 + cells.
  • the pluripotent stem cells may be embryonic stem cells (ESCs) or induced pluripotent stem cells (iPSCs). Specifically, embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells may be of human origin, but are not limited thereto.
  • ESCs embryonic stem cells
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • 'pluripotent stem cells are pluripotent that can differentiate into cells of all tissues of an individual, or have totipotent self-renewal ability.
  • stem cells may include embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells.
  • Embryonic stem cells are cells extracted from the inner cell mass of an early embryo just before the fertilized egg implants in the mother’s uterus and cultured in vitro. They are pluripotent or totipotent and can differentiate into cells of all tissues of the organism. It has the ability to self-reproduce. In a broad sense, it also includes embryoid bodies derived from embryonic stem cells.
  • Induced pluripotent stem cells refers to cells induced to have pluripotent differentiation ability through an artificial dedifferentiation process from differentiated cells, and are also called pluripotent stem cells. Artificial dedifferentiation processes include virus-mediated or non-viral vectors using retroviruses and lentiviruses; Alternatively, it may be performed by introducing non-virus-mediated dedifferentiation factors using proteins and cell extracts, or may include a dedifferentiation process using stem cell extracts, compounds, etc. Induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic stem cells. Specifically, they show similar cell shapes, have similar gene and protein expression patterns, have pluripotency in vitro and in vivo, and produce teratoma. When formed and inserted into a mouse blastocyst, a chimera mouse is formed, and germline transmission of genes is possible.
  • the medium composition may further include a third medium composition for maturation and proliferation of natural killer cells containing IL15, a Rho-associated protein kinase inhibitor (ROCK), or a combination thereof.
  • a third medium composition for maturation and proliferation of natural killer cells containing IL15 a Rho-associated protein kinase inhibitor (ROCK), or a combination thereof.
  • ROCK Rho-associated protein kinase inhibitor
  • the ROCK inhibitor is Fasudil, AT-13148, BA-210, ⁇ -Elemene, Belumosudil, Chroman 1, DJ4, GSK-576371, GSK429286A, H-1152, Hydroxyfasudil, Ibuprofen, LX-7101, Netarsudil, RKI-1447, Ripasudil, TCS-001, It may include Thiazovivin, Verosudil (AR-12286), Y-27632, Y-30141, Y-33075, Y-39983, or a combination thereof.
  • the concentration of the ROCK inhibitor (e.g., fasudil) in the third medium composition is 1 to 100 ⁇ M, 1 to 90 ⁇ M, 1 to 80 ⁇ M, 1 to 70 ⁇ M, 1 to 60 ⁇ M, 1 to 10 ⁇ M. 50 ⁇ M, 1 to 40 ⁇ M, 1 to 30 ⁇ M, 1 to 20 ⁇ M, 3 to 100 ⁇ M, 5 to 100 ⁇ M, 7 to 100 ⁇ M, 9 to 100 ⁇ M, 3 to 90 ⁇ M, 5 to 80 ⁇ M, 7 to It may be 70 ⁇ M, 9 to 60 ⁇ M or 1 to 50 ⁇ M.
  • the ROCK inhibitor e.g., fasudil
  • the concentration of IL15 in the third medium composition is 1 to 200 ⁇ g/ml, 1 to 100 ⁇ g/ml, 2 to 200 ⁇ g/ml, 5 to 80 ⁇ g/ml, and 5 to 60 ⁇ g/ml. , 5 to 40 ⁇ g/ml, 5 to 30 ⁇ g/ml, 10 to 80 ⁇ g/ml, 10 to 60 ⁇ g/ml, 10 to 40 ⁇ g/ml, or 10 to 30 ⁇ g/ml.
  • the concentration of IL15 in the third medium composition may be 2 to 200 ng/ml and the concentration of the ROCK inhibitor may be 1 to 100 ⁇ g/ml.
  • a first step of inducing differentiation from pluripotent stem cells into hematopoietic stem cells by culturing pluripotent stem cells in the presence of a first medium composition containing (Stem Cell Factor) or a combination thereof; and by culturing the hematopoietic stem cells in the presence of a second medium composition containing SCF, IL7 (Interleukin7), IL15 (Interleukin15), FLT3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), or a combination thereof, from hematopoietic stem cells to natural killer cells. It provides a method of inducing differentiation of pluripotent stem cells into natural killer cells, including
  • the first medium composition may be replaced with a first medium composition having a different composition.
  • the first medium composition may include one or more of the following compositions:
  • the first step may include the following steps:
  • steps (1) to (4) may be performed sequentially, in reverse order, or simultaneously.
  • steps (1) to (4) may be performed sequentially, in reverse order, or simultaneously.
  • cells can be cultured in a medium composition containing all the components of the medium composition of the corresponding steps.
  • bFGF may be included in the medium composition at different concentrations for each stage.
  • the first step may be performed for at least 3 days, 3 to 25 days, 5 to 20 days, or 12 to 16 days.
  • step (1) is 1 to 4 days
  • step (2) is 1 to 4 days
  • step (3) is 0.5 to 2 days
  • step (4) is 2 days. It can be performed for up to 24 days.
  • the second medium composition may include SCF, IL7, IL15, and FLT3L.
  • the second step may be performed for at least 3 days, 3 to 25 days, 5 to 20 days, or 12 to 16 days.
  • the method for inducing differentiation is IL15
  • a ROCK inhibitor eg, fasudil
  • the third step may be performed for at least 1 day, 1 to 28 days, 2 to 25 days, 3 to 21 days, 5 to 20 days, or 7 to 14 days.
  • the medium composition of the present application may include each component in various concentration combinations.
  • natural killer cells or cell populations thereof differentiated from pluripotent stem cells are provided as a method of inducing differentiation herein.
  • the natural killer cells are as described above.
  • compositions comprising natural killer cells or a cell population thereof differentiated from pluripotent stem cells as a method of inducing differentiation herein.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising natural killer cells or a cell population thereof differentiated by the method of inducing differentiation as an active ingredient is provided.
  • cancer includes tumors, blood cancers, or solid cancers, and includes those that damage the synergistic activity of NK cells of an individual or do not cause synergistic activity of NK cells as target cells under certain conditions.
  • the cancer includes glioma, gastrointestinal stromal tumor, leukemia, breast cancer, uterine cancer, cervical cancer, stomach cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, lung cancer, laryngeal cancer, rectal cancer, liver cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, and skin cancer. , it may be one or more types selected from the group consisting of bone cancer, muscle cancer, fat cancer, fibrous cell cancer, blood cancer, lymphoma, and multiple myeloma.
  • prevention refers to all actions that inhibit or delay the occurrence of cancer by administering the composition according to the present invention.
  • treatment refers to or includes the alleviation, inhibition of progression, or prevention of a disease, disorder, or condition, or one or more symptoms thereof
  • active ingredient or the term “pharmaceutically effective amount” refers to the disease, disorder, or condition. It may refer to any amount of the composition used in practicing the invention provided herein that is sufficient to alleviate, inhibit the progression of, or prevent the condition or one or more symptoms thereof.
  • the composition may further include other known immune antigen adjuvants, and other immune antigen adjuvants are preferably monophosphoryl lipid A (MPL) and GLA-SE (Glucopyranosyl Lipid Adjuvant, formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil in water).
  • MPL monophosphoryl lipid A
  • GLA-SE Glucopyranosyl Lipid Adjuvant, formulated in a stable nano-emulsion of squalene oil in water.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition is not particularly limited, but may be administered parenterally or orally, such as intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, inhaled, or topically applied, depending on the desired method.
  • the dosage range varies depending on the patient's weight, age, gender, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of the disease.
  • Daily dosage means the amount of therapeutic substance in one modality sufficient to treat the disease condition alleviated by administration to an individual in need of treatment.
  • the effective amount of a therapeutic agent will depend on the particular compound, the disease state and its severity, and the individual in need of treatment, and can be routinely determined by a person skilled in the art.
  • the dosage for a human of a composition according to one aspect may vary depending on the patient's age, weight, gender, form of administration, health status, and extent of the disease. Based on an adult patient weighing 70 kg, for example, about 1,000 to 10,000 cells/time, 1,000 to 100,000 cells/time, 1,000 to 1,000,000 cells/time, 1,000 to 10,000,000, 1,000 to 100,000,000 cells/time, 1,000 ⁇ 1,000,000,000 cells/time, 1,000 ⁇ 10,000,000,000 cells/circuit, can be administered in divided doses once or several times a day at regular time intervals, or can be administered multiple times at regular time intervals.
  • the pharmaceutical composition may include pharmaceutically acceptable carriers and/or additives.
  • it contains sterile water, physiological saline, common buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (ascorbic acid, etc.), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives. can do.
  • organic materials such as biopolymers and inorganic materials such as hydroxyapatite, specifically collagen matrices, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers, and chemical derivatives thereof. can do.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment is prepared in a formulation suitable for injection, the immune cells or substances that increase their activity may be dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier or frozen in a dissolved solution state. You can.
  • the pharmaceutical composition may be used as a suspending agent, solubilizer, stabilizer, isotonic agent, preservative, anti-adsorption agent, surfactant, diluent, excipient, pH adjuster, analgesic agent, buffer, reducing agent, if necessary depending on the administration method or formulation. Antioxidants, etc. may be appropriately included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and agents suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995.
  • the pharmaceutical composition is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art to which the invention pertains. It can be manufactured by placing it in a multi-capacity container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of powder, granules, tablets or capsules.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating infectious diseases comprising natural killer cells or a cell population thereof differentiated by a method according to the method for inducing differentiation as an active ingredient is provided.
  • disease may refer to a pathological condition, particularly cancer, infectious disease, inflammatory disease, metabolic disease, autoimmune disorder, degenerative disease, apoptosis-related disease, and graft rejection.
  • infectious disease may collectively refer to infectious diseases caused by organisms such as bacteria, viruses, molds, etc.
  • viral infections such as HIV (Hunan Immunodeficiency Virus), EBV (Epstein-Barr virus), HHV (Human Herpes Virus), IAV (Influenza A virus), and COV-19
  • natural killer cell activation receptors NKp46, NKp44, or NKp30 can bind to and activate viral glycoproteins, leading to the death of infected cells.
  • FASL and TRAIL of natural killer cells bind to the increased death receptors in virus-infected cells, can induce death.
  • kits for inducing differentiation from pluripotent stem cells into natural killer cells which includes a GSK inhibitor, BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), and retinoic acid ( Retinoic acid), a TGF-beta inhibitor, polyvinyl alcohol (PVA), Stem Cell Factor (SCF), or a combination thereof; a first medium composition for inducing differentiation from pluripotent stem cells into hematopoietic stem cells; and a kit containing a second medium composition for inducing differentiation from hematopoietic stem cells to natural killer cells containing SCF, IL7 (Interleukin7), IL15 (Interleukin15), FLT3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), or a combination thereof. to provide.
  • the first medium composition, the second medium composition, and each component are as described
  • the first medium composition and the second medium composition may be included separately in the kit. Additionally, when the first medium composition includes the medium compositions (i) to (iv), the medium compositions (i) to (iv) may also be separately included in the kit.
  • GSK inhibitors Bone Morphogenetic Protein 4 (BMP4), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), Retinoic acid, TGF-beta inhibitor, polyvinyl alcohol (PVA), SCF.
  • BMP4 Bone Morphogenetic Protein 4
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • bFGF Basic Fibroblast Growth Factor
  • Retinoic acid TGF-beta inhibitor
  • PVA polyvinyl alcohol
  • SCF polyvinyl alcohol
  • the first medium composition containing (Stem Cell Factor) or a combination thereof is used to induce differentiation from pluripotent stem cells to hematopoietic stem cells.
  • Another aspect is the use of a second medium composition containing SCF, IL7 (Interleukin7), IL15 (Interleukin 15), FLT3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), or a combination thereof to induce differentiation from hematopoietic stem cells to natural killer cells. .
  • Another aspect is the use of a third medium composition containing IL15, ROCK (Rho-associated protein kinase inhibitor) or a combination thereof for maturation and proliferation of natural killer cells.
  • ROCK Ras-associated protein kinase inhibitor
  • the first medium composition, second medium composition, third medium composition and each component are as described above.
  • a and/or B means A or B, or A and B.
  • Example 1 Natural killer cells derived from human pluripotent stem cells
  • FIG. 1 A schematic diagram of the process of differentiating pluripotent stem cells into natural killer cells is shown in Figure 1. Specifically, human pluripotent stem cells were cultured and differentiated into hematopoietic stem cells, and hematopoietic stem cells were cultured and differentiated into natural killer cells. They were differentiated into natural killer cells, then matured and proliferated.
  • HSCs hematopoietic stem cells
  • hPSCs Human pluripotent stem cells
  • the basic differentiation medium was Stempro34-SFM (+stempro sup) + 200 ⁇ g/ml human Transferrin + 2mM L-glutamine + 0.5mM L-Ascobic acid + 0.45mM MTG (1-thioglycerol) + 1% penicillin/streptomycin.
  • CHIR99021 a GSK inhibitor known to induce mesenchyme
  • CHIR99021 a GSK inhibitor known to induce mesenchyme
  • the cells were treated for 2 days in differentiation culture medium supplemented with 50 ng/ml of BMP4, 50 ng/ml of VEGF, and 100 ng/ml of bFGF.
  • the cells were cultured in culture medium supplemented with 50 ng/ml VEGF, 50 ng/ml bFGF, 10 ⁇ M SB-431542, and 1 ⁇ M retinoic acid for the next day.
  • the cells were cultured in a culture medium supplemented with 0.1% (w/v, g/ml) PVA, 50 ng/ml SCF, and 10 ng/ml bFGF, changing the medium every day.
  • the basic culture medium for differentiation after induction of HSCs was the same as that used for HSC induction. 20 ng/ml of SCF, 20 ng/ml of IL-7, 10 ng/ml of IL-15, and 10 ng/ml of FLT3L were added to the basic culture medium and cultured for 2 weeks while changing the culture medium once every 2 days.
  • IL-15 was added at 20 ⁇ g/ml and cultured for 1 to 2 weeks.
  • NK cells of Example 1 were obtained through the above method.
  • PBMC Human peripheral blood mononuclear cells
  • the isolated primary NK cells were used as Comparative Example 1.
  • Cells cryopreserved from isolated primary NK cells were used as Comparative Example 2.
  • NK cells of Comparative Example 2 were inoculated into a flask coated with ⁇ -globulin (Green-cross, Yongin, Korea) and anti-NKp46 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), which activate NK cells, and inoculated with 1000 IU/mL recombinant human Alys505NK-EX serum-free medium (CSTI; Sendai, Japan). Fresh culture medium was added every 1 to 3 days depending on cell density (2 x 10 6 cells/mL). On day 6, cells were transferred to a culture bag (NIPRO, Osaka, Japan) and cultured for 14 days. Cultured NK cells were cryopreserved using Cryostor CS5 (BioLife Solutions, Bothell, WA, USA). Cells transferred to a culture bag and cultured for 14 days were used as Comparative Example 3, and cells cryopreserved from Comparative Example 3 were used as Comparative Example 4.
  • CSTI human Alys505NK-EX serum-free medium
  • NK-92MI a human natural killer cell line, was purchased and used from ATCC (American Type Culture Collection, USA).
  • Example 2 To confirm whether the cells obtained in Example 1 were differentiated into NK cells, CD markers specific for NK cells were confirmed using FACS (Fluorescence-activated cell sorting, BD FACSCaliburTM). Specifically, on day 33 of total NK cell differentiation, all cells were harvested and CD markers were analyzed. The results are shown in Figure 2.
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • CD45 positive peripheral leukocytes As shown in Figure 2, more than 97% of the cells analyzed were differentiated into CD45 positive peripheral leukocytes, and more than 97% of CD3 - CD56 + cells, an NK cell specific marker, were identified. In addition, it was found that CD16, which induces the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) function of NK cells, was expressed by 56%.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • composition according to the present invention can effectively differentiate pluripotent stem cells into NK cells.
  • Example 1 The expression levels of surface receptors and cytoplasmic granules of the cells obtained in Example 1 were confirmed by flow cytometry. For comparison with primary NK cells, the same analysis was performed using the cells of Comparative Examples 3 and 5. The results are shown in Figures 3a and 3b.
  • the expression of activating receptors in the cells of Example 1 was confirmed to be 64% NKG2D, 89% NKp30, 94% NKp46, and 94% DNAM-1 among CD56 + cells.
  • NKG2A and KIR2DL1 were confirmed to be expressed in less than 1% of CD56 + cells, and expression of KIR2DL2/3 and 3% of KIR3DL1 was confirmed in 9%.
  • Example 1 expressed somewhat lower activation receptors (64% to 94%) compared to the activated primary NK cells of Comparative Example 3, but the NK-92MI of Comparative Example 5 (NKp46, 4%; NKp44, 27%; It showed a relatively high expression rate compared to DNAM-1 (4%). It was found that the expression of inhibitory receptors in the cells of Example 1 was much lower than that of primary NK cells. It was found that the cytoplasmic granules of the cells of Example 1 were highly expressed and had characteristics similar to primary NK cells.
  • Example 1 had superior characteristics than the NK cells of Comparative Example 5 and had similar or superior characteristics to the activated NK cells of Comparative Example 3.
  • Cytotoxicity was performed on K562 cells (human chronic myeloid leukemia cell line) and cisplatin-resistant ovarian cancer cells A2780cis (ovarian cancer cell line), which are mainly used to measure NK cell activity due to their high sensitivity to NK cells.
  • target cancer cells K562 or A2780cis
  • the cell pellet was diluted with DPBS and washed, and the washed cell pellet was suspended in culture medium containing 10% FBS in RPMI medium without phenol red.
  • NK cells 1 x 10 5 cells per condition were prepared and stained with CFSE (Life technologies) at a concentration of 5 ⁇ M by leaving them in an incubator for 10 minutes under 5% CO 2 conditions. Afterwards, the cells were washed twice with DPBS and then diluted with culture medium containing 10% FBS in RPMI medium without phenol red.
  • Activated NK cells are prepared according to the E:T (Effector cell:Target cell) ratio (0:1, 1:1, 5:1, 10:1) and placed in a 24-well plate with target cells. I was busy mixing it up. Next, activated NK cells and target cells were reacted for 4 hours, and 7AAD (7-Aminoactinomycin D) was treated 20 minutes before the end of the reaction. After the reaction was completed, the cells were collected in a 5 ml FACS tube, and the killing ability of the cells was analyzed using a flow cytometer.
  • the NK cells of Example 1 showed 91% cytotoxicity against the blood cancer K562 cell line at a 10:1 ratio, and 74% cytotoxicity against the A2780cis cell line, an anticancer drug-resistant ovarian cancer cell line. It appeared to be visible.
  • the activated primary NK cells of Comparative Examples 3 and 4 showed 93.22% and 80.5% cytotoxicity against the K562 cell line at a ratio of 10:1, respectively, and the primary NK cells of Comparative Example 2 showed 10:1 cytotoxicity against the K562 cell line. It showed 17.1% cytotoxicity at a ratio of 1. From the above results, it was found that the NK cells of Example 1 had similar or better cytotoxicity compared to the primary NK cells of Comparative Examples 2 to 4.
  • Example 1 were found to have significantly higher cytotoxicity than the NK92MI cells of Comparative Example 5, showing that the cells of Example 1 had excellent cytotoxicity.
  • Example 1 had superior characteristics than other NK cells of Comparative Example 5 and had similar or superior characteristics to the activated primary NK cells of Comparative Examples 3 and 4.
  • NK cells cytotoxicity assay
  • SKOV3 cells ovarian cancer cell line
  • activated NK cells and SKOV3 cells were reacted at an E:T ratio (0:1, 1:1, 5:1, 10:1) to analyze the killing ability of NK cells.
  • NK cells differentiated from ESCs or iPSCs according to the method of the present invention have low cytotoxic activity against the SKOV3 cell line
  • the NK cells of Example 1 (ESC-NK) and iPSC-derived NK cells (CD34+ derived NK cells) differentiated according to the method of the present invention ) showed very high cytotoxicity against the SKOV3 cell line at 65-82% at an E:T ratio of 10:1 ( Figure 5).
  • CD34 + derived NK cells are NK cells differentiated according to the method in Example 1 from iPSCs generated using CD34 + cells isolated from UCB. From these results, it can be seen that NK cells differentiated from ESCs or iPSCs according to the method of the present invention have superior cytotoxicity than other NK cells.

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Abstract

전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물에 의하면, 자연살해세포로의 분화 효율을 증진시킬 수 있고, 인위적 feeder를 사용하지 않고, 유전자 조작없이 NK의 암세포 살상력을 증가시키는 NK 특이 마커의 발현을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 분화 방법
본 발명은 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물에 관한 것이다.
현재 암의 일반적인 치료법은 외과적 수술(surgery), 방사선 요법(radiation therapy), 항암화학요법(chemotherapy) 등이 있으며, 암의 종류 및 병기에 따라 단독 혹은 복합적으로 사용되고 있지만, 환자들에게 심한 부작용과 고통을 수반하는 실정이다. 완벽한 암 치료법은 정상 세포는 손상시키지 않고 암세포만 골라서 죽이는 방법일 것이다. 하지만, 기존 치료법은 정상 세포에 어느 정도 손상을 미친다. 최근 부각되고 있는 암 면역치료법(cancer immunotherapy)은 인체 고유의 면역 시스템을 활용하여 정상 세포의 손상을 최소화하여, 암세포를 보다 특이적으로 제거하는 치료법으로, 여러 세부 분야(항체 치료법, 면역세포 치료법, 바이러스 면역치료법, 나노 기술 면역치료법 등)의 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 면역세포 치료는 환자의 혈액에서 얻어진 림프구(lymphocyte) 중, 자연살해세포(natural killer cell), 자연살생 T 세포(natural killer T cell), T 세포, B 세포, 수지상 세포(dendritic cell) 등의 세포 수를 늘리고, 체외(in vitro)에서 기능을 강화하여, 이를 다시 환자 몸에 되돌림으로써, 암을 치료하는 방법이다. 이러한 면역세포를 이용한 치료법은 면역 반응 조절 치료에 좋은 효과를 보이고, 독성 및 안전성 면에서 우수하다고 평가되고 있다. 이 중 NK 세포는 선천면역(innate immunity)을 담당하는 중요한 세포로써, T 세포와 달리 간(liver), 골수(bone marrow)에서 성숙된다. 특히, 바이러스(virus)에 감염된 세포나 종양세포(tumor cells) 등 비정상세포를 스스로 식별하여 사멸시키는 기능을 가진다. 지난 10 여 년 동안 환자들의 면역 시스템을 이용한 종양 면역치료가 꾸준히 발전되어 왔고, 이를 이용한 '세포 치료제(cell therapy product)'도 상업화되고 있다. 세포 치료제는 자가(autologous), 동종(allogeneic), 혹은 이종(xenogeneic)의 세포를 체외(in vitro)에서 증식, 선별하는 방법을 통해서, 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다(식품의약안전청 고시 제2003-26호 제2조).
한편, 자연살해세포 자체의 치료적 이점 및 안전성에도 불구하고, 자연살해세포는 배양이 잘 되지 않는 세포로 알려져 있으며, 대량 증식이 어렵다는 한계가 있다. 또한, 전분화능 줄기세포를 이용하여 자연살해세포로 분화시키는 시도들이 있으나, 이러한 경우 자연살해세포로의 분화 효율이 낮고, 자연살해세포 특이적인 마커의 발현이 낮아 인위적인 유전자 조작을 통하여 발현을 높이는 방법들이 시도되고 있다. 추가로, 자연살해세포로 분화를 유도하는 경우에 이종의 피더 세포(feeder cell)를 사용하는 경우가 많아 치료제로의 적용 시 상기 피더 세포가 최종 산물에 혼입되어 안전성에 문제를 야기할 수 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국공개특허 제10-2022-0050672호
(특허문헌 2) 대한민국공개특허 제10-2019-0060412호
일 양상은 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물로써, GSK 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 유도용 제1배지 조성물; 및 SCF(Stem Cell Factor), IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 제2배지 조성물을 포함하는 배지 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 제1배지 조성물 및 상기 제2배지 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 제1배지 조성물의 존재 하에서 전분화능 줄기세포를 배양함으로써, 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화를 유도하는 제1단계; 및 상기 제2배지 조성물의 존재 하에서 조혈모세포를 배양함으로써, 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화를 유도하는 제2단계;를 포함하는 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법으로 전분화능 줄기세포에서 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물로써, GSK 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 유도용 제1배지 조성물; 및 SCF(Stem Cell Factor), IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 제2배지 조성물을 포함하는 배지 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 제1배지 조성물 및 상기 제2배지 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 제1배지 조성물의 존재 하에서 전분화능 줄기세포를 배양함으로써, 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화를 유도하는 제1단계; 및 상기 제2배지 조성물의 존재 하에서 조혈모세포를 배양함으로써, 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화를 유도하는 제2단계;를 포함하는 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법으로 전분화능 줄기세포에서 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상에 따른 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물에 의하면, 자연살해세포로의 분화 효율을 증진시킬 수 있고, 인위적 feeder를 사용하지 않고, 유전자 조작없이 NK 특이 마커의 발현을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 전분화능 줄기세포로부터 자연살해세포로 분화시키는 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 줄기세포로부터 자연살해세포로 분화를 유도한 뒤 자연살해세포에 특이적인 CD마커를 확인한 결과이다.
도 3a 및 3b는 자연살해세포의 표면 수용체 발현도 및 세포질 과립의 발현도를 확인한 결과이다(PSC-NK 세포: 실시예 1의 세포, primary NK 세포: 비교예 3의 세포).
도 4는 K562 세포(혈액암 세포) 및 A2780cis 세포(난소암 세포)에서 자연살해세포의 세포 독성을 평가한 결과이다(ES-NK: 실시예 1의 세포, Cryo NK92MI: NK92MI 세포).
도 5는 SKOV3 세포(난소암 세포주)에서 자연살해세포의 세포 독성을 평가한 결과이다(ESC-NK: 실시예 1의 세포, CD34+ derived NK: UCB에서 분리된 CD34+ 세포를 이용하여 생성된 유도만능줄기세포로부터 실시예 1의 방법에 따라 분화된 NK 세포), Cryo NK92MI: NK92MI 세포).
일 양상은 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물로써, GSK(Glycogen synthase kinase 3) 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta(Transforming growth factor-beta) 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor), 또는 이들의 조합을 포함하는 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 유도용 제1배지 조성물; 및 SCF, IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 제2배지 조성물을 포함하는 배지 조성물을 제공한다. 제1배지 조성물과 제2배지 조성물은 각각 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 및 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화를 위해 별개로 사용된다.
일 구현예에 있어서, 제1배지 조성물은 하기 조성물 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) GSK 억제제를 포함하는 배지 조성물;
(ii) BMP4, VEGF 및 bFGF를 포함하는 배지 조성물;
(iii) VEGF, bFGF, TGF-beta 억제제 및 레티노산을 포함하는 배지 조성물; 및
(iv) PVA, SCF 및 bFGF를 포함하는 배지 조성물.
이때 (i) 내지 (iv)의 배지 조성물 각각은 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화를 위해 별개로 또는 동시에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "자연살해세포(Natural Killer cells)" 또는 "NK 세포"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. 상기 "자연살해세포" 또는 "NK 세포"는 성숙한 자연살해세포뿐 아니라, 자연살해 전구세포를 포함할 수 있다. 상기 자연살해세포는 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 자연살해 세포는 "활성화 수용체" 및 "억제성 수용체"로 표지되는, 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 표면 수용체를 포함한다.
자연살해세포의 활성이란 자연살해세포가 갖는 기능의 작용이 발생 또는 증가되는 것을 의미하는 것으로, 병인세포, 비특이적 감염 병원균, 암세포 등을 감지하고 이를 제거 또는 살상하는 능력을 말한다.
일 구현예에 있어서, GSK 억제제는 하기 표 1에 기재된 물질을 포함할 수 있다.
GSK 억제제
금속 이온 베릴륨, 구리, 리튬, 수은, 텅스텐, 아연 등
ATP-competitive - 아미노피리미딘(CHIR99021 CHIR98014, CT98014, CT98023, CT99021, TWS119 등)- 해양 생물 유래(6-BIO, 디브로모칸타렐린, 하이메니알데신, 인디루빈, 메리디아닌 등)
- 아릴린돌말레이미드(SB-216763, SB-41528 등),
- 티아졸(AR-A014418, AZD-1080 등)
- 파울로네스(알스터폴로네, 카즈폴로네, 켄폴론 등),
- 알로이신
Non-ATP competitive - 해양생물 유래(만자민 A, 팔리누린, 트리칸틴 등)- 티아졸리딘디온(TDZD-8, NP00111, NP031115, 타이드글루시브 등)
- 할로메틸케톤(HMK-32 등)
- 펩티드(L803-mts, L807-mts 등)
- Unknown Mechanism(COB-187, COB-152 등)
일 구현예에 있어서, TGF-beta 억제제는 4-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-피리딘-2-일}-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드 수화물(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline), 2-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-1,5-나프티리딘(2-[3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 수화물(4-(5-Benzol[1,3]dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)-benzamide hydrate), 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드 수화물(4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide hydrate), 및 4-[4-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드 수화물(4-[4-(3,4-Methylenedioxyphenyl)-5-(2-pyridyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide hydrate), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드(3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide), 2-(3-(6-메틸피리딘 -2-일)-1H-피라졸 -4-일)-1,5-나프티리딘(2-(3-(6-Methylpyridine-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline), 2-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-(1,1-디메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-6-메틸-피리딘(2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1-dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine), 2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-4-[(4-피리딜)아미노]프터리딘(2-(5-Chloro-2-fluorophenyl)-4-[(4-yridyl)amino]pteridine), 6-[2-터트-부틸-5-(6-메틸-피리딘-2-일)-1H-이미다졸-4-일]-퀴녹살린(6-[2-tert-Butyl-5-(6-methyl-pyridin-2-yl)-1H-imidazol-4-yl]-quinoxaline), 4-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-피리딘-2-일}-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드 수화물(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸-1-에탄올(4-[2-Fluoro-5-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]phenyl]-1H-pyrazole-1-ethanol), 3-[[5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-(6-퀴녹살리닐)-1H-이미다졸-2-일]메틸]벤즈아마이드(3-[[5-(6-Methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]benzamide) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "CHIR99021"이란, 하기 화학식 1의 구조식을 갖는 화합물을 의미한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023017981-appb-img-000001
본 발명의 용어 "SB-431542"이란, 하기 화학식 2의 구조식을 갖는 화합물을 의미한다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023017981-appb-img-000002
본 발명에서 "배지"는 사용 목적에 따라 차이가 있으나 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청알부민(BSA) 및 보조인자 등을 기본적으로 포함하는 동물세포 배양용 배지로서, 당업자들에게 잘 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다. 특히 바람직하게, 상기 배지는 무기염류로서 NaCl, KCl 및 NaHCO3 등을 포함하고, 탄소원으로서 글루코즈, 나트륨 피루베이트 및 젖산칼슘염 등을 포함하며, 아미노산으로서 글루타민을 비롯한 필수아미노산 및 비필수아미노산을 포함하며, 보조인자로서 기타 미량원소 및 완충액 등을 포함할 수 있다.
상기 배지는 또한 항생제를 포함할 수 있다. 상기 배지로는 동물 세포 배양용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등을 그대로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에 있어서, StemPro-34 SFM 배지가 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물 중에 상기 GSK 억제제(예컨대, CHIR99021)의 농도는 0.1 내지 100 μM, 0.1 내지 90 μM, 0.1 내지 80 μM, 0.1 내지 70 μM, 0.1 내지 60 μM, 0.1 내지 50 μM, 0.1 내지 40 μM, 0.1 내지 30 μM, 0.1 내지 20 μM, 0.1 내지 10 μM, 1 내지 100 μM, 2 내지 100 μM, 3 내지 100 μM, 4 내지 100 μM, 1 내지 90 μM, 2 내지 80 μM, 3 내지 70 μM, 4 내지 60 μM, 4 내지 50 μM, 4 내지 40 μM, 4 내지 30 μM, 4 내지 20 μM, 4 내지 10 μM, 또는 1 내지 10 μM일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물 중에 상기 BMP4의 농도는 1 내지 1000 ng/ml, 1 내지 900 ng/ml, 1 내지 800 ng/ml, 1 내지 700 ng/ml, 1 내지 600 ng/ml, 1 내지 500 ng/ml, 1 내지 400 ng/ml, 1 내지 300 ng/ml, 1 내지 200 ng/ml, 1 내지 100 ng/ml, 10 내지 1000 ng/ml, 20 내지 1000 ng/ml, 30 내지 1000 ng/ml, 40 내지 1000 ng/ml, 10 내지 900 ng/ml, 20 내지 800 ng/ml, 30 내지 700 ng/ml, 40 내지 600 ng/ml, 40 내지 500 ng/ml, 40 내지 400 ng/ml, 40 내지 300 ng/ml, 40 내지 200 ng/ml, 40 내지 100 ng/ml 또는 10 내지 100 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물 중에 상기 VEGF의 농도는 1 내지 1000 ng/ml, 1 내지 900 ng/ml, 1 내지 800 ng/ml, 1 내지 700 ng/ml, 1 내지 600 ng/ml, 1 내지 500 ng/ml, 1 내지 400 ng/ml, 1 내지 300 ng/ml, 1 내지 200 ng/ml, 1 내지 100 ng/ml, 10 내지 1000 ng/ml, 20 내지 1000 ng/ml, 30 내지 1000 ng/ml, 40 내지 1000 ng/ml, 10 내지 900 ng/ml, 20 내지 800 ng/ml, 30 내지 700 ng/ml, 40 내지 600 ng/ml, 40 내지 500 ng/ml, 40 내지 400 ng/ml, 40 내지 300 ng/ml, 40 내지 200 ng/ml, 40 내지 100 ng/ml 또는 10 내지 100 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물 중에 상기 bFGF의 농도는 1 내지 1000 ng/ml, 1 내지 900 ng/ml, 1 내지 800 ng/ml, 1 내지 700 ng/ml, 1 내지 600 ng/ml, 1 내지 500 ng/ml, 1 내지 400 ng/ml, 1 내지 300 ng/ml, 1 내지 200 ng/ml, 10 내지 1000 ng/ml, 20 내지 1000 ng/ml, 30 내지 1000 ng/ml, 40 내지 1000 ng/ml, 10 내지 900 ng/ml, 20 내지 800 ng/ml, 30 내지 700 ng/ml, 40 내지 600 ng/ml, 40 내지 500 ng/ml, 40 내지 400 ng/ml, 40 내지 300 ng/ml, 40 내지 200 ng/ml 또는 10 내지 200 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물 중에 상기 레티노산의 농도는 0.05 내지 50 μM, 0.07 내지 50 μM, 0.09 내지 50 μM, 0.1 내지 50 μM, 0.3 내지 50 μM, 0.5 내지 50 μM, 0.7 내지 50 μM, 0.9 내지 50 μM, 0.05 내지 40 μM, 0.05 내지 30 μM, 0.05 내지 20 μM, 0.05 내지 10 μM, 0.05 내지 5 μM, 0.07 내지 40 μM, 0.09 내지 30 μM, 0.1 내지 20 μM, 0.3 내지 20 μM, 0.5 내지 10 μM, 0.7 내지 5 μM 또는 0.1 내지 10 μM일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물 중에 상기 TGF-beta 억제제(예컨대, SB-431542)의 농도는 0.1 내지 500 μM, 0.1 내지 400 μM, 0.1 내지 300 μM, 0.1 내지 200 μM, 0.1 내지 100 μM, 1 내지 500 μM, 5 내지 500 μM, 5 내지 400 μM, 5 내지 300 μM, 5 내지 200 μM, 5 내지 100 μM, 5 내지 50 μM 또는 1 내지 100 μM일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물 중에 상기 PVA의 농도는 0.002 내지 5%(w/v), 0.004 내지 2%(w/v). 0.01 내지 1%(w/v), 0.02 내지 0.8%(w/v), 0.02 내지 0.5%(w/v). 0.04 내지 0.3%(w/v). 0.05 내지 0.2%(w/v), 또는 0.07 내지 0.2%(w/v)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물 중에 상기 SCF의 농도는 1 내지 1000 ng/ml, 1 내지 900 ng/ml, 1 내지 800 ng/ml, 1 내지 700 ng/ml, 1 내지 600 ng/ml, 1 내지 500 ng/ml, 1 내지 400 ng/ml, 1 내지 300 ng/ml, 1 내지 200 ng/ml, 5 내지 500 ng/ml, 10 내지 1000 ng/ml, 10 내지 500 ng/ml. 10 내지 250 ng/ml, 10 내지 100 ng/ml. 20 내지 100 ng/ml, 30 내지 80 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1배지 조성물 중에 GSK 억제제의 농도는 1 내지 10 μM, BMP4의 농도는 10 내지 100 ng/ml, VEGF의 농도는 10 내지 100 ng/ml, bFGF의 농도는 10 내지 200 ng/ml, 레티노산의 농도는 0.1 내지 10 μM, TGF-beta 억제제의 농도는 1 내지 100 μM, PVA의 농도는 0.01 내지 1%(w/v) 및 SCF의 농도는 5 내지 500 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제2배지 조성물 중에 상기 SCF의 농도는 1 내지 100 ng/ml, 1 내지 90 ng/ml, 1 내지 80 ng/ml, 1 내지 70 ng/ml, 1 내지 60 ng/ml, 1 내지 50 ng/ml, 1 내지 40 ng/ml, 1 내지 30 ng/ml, 3 내지 100 ng/ml, 5 내지 100 ng/ml, 7 내지 100 ng/ml, 9 내지 100 ng/ml, 11 내지 100 ng/ml, 13 내지 100 ng/ml, 15 내지 100 ng/ml, 3 내지 90 ng/ml, 5 내지 80 ng/ml, 7 내지 70 ng/ml, 9 내지 60 ng/ml, 11 내지 50 ng/ml, 13 내지 40 ng/ml, 15 내지 30 ng/ml 또는 1 내지 50 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제2배지 조성물 중에 상기 IL7의 농도는 1 내지 100 ng/ml, 1 내지 90 ng/ml, 1 내지 80 ng/ml, 1 내지 70 ng/ml, 1 내지 60 ng/ml, 1 내지 50 ng/ml, 1 내지 40 ng/ml, 1 내지 30 ng/ml, 3 내지 100 ng/ml, 5 내지 100 ng/ml, 7 내지 100 ng/ml, 9 내지 100 ng/ml, 11 내지 100 ng/ml, 13 내지 100 ng/ml, 15 내지 100 ng/ml, 3 내지 90 ng/ml, 5 내지 80 ng/ml, 7 내지 70 ng/ml, 9 내지 60 ng/ml, 11 내지 50 ng/ml, 13 내지 40 ng/ml, 15 내지 30 ng/ml 또는 1 내지 50 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제2배지 조성물 중에 상기 IL15의 농도는 1 내지 100 ng/ml, 1 내지 90 ng/ml, 1 내지 80 ng/ml, 1 내지 70 ng/ml, 1 내지 60 ng/ml, 1 내지 50 ng/ml, 1 내지 40 ng/ml, 1 내지 30 ng/ml, 1 내지 20 ng/ml, 3 내지 100 ng/ml, 5 내지 100 ng/ml, 7 내지 100 ng/ml, 9 내지 100 ng/ml, 3 내지 90 ng/ml, 5 내지 80 ng/ml, 7 내지 70 ng/ml, 9 내지 60 ng/ml 또는 1 내지 50 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제2배지 조성물 중에 상기 FLT3L의 농도는 1 내지 100 ng/ml, 1 내지 90 ng/ml, 1 내지 80 ng/ml, 1 내지 70 ng/ml, 1 내지 60 ng/ml, 1 내지 50 ng/ml, 1 내지 40 ng/ml, 1 내지 30 ng/ml, 1 내지 20 ng/ml, 3 내지 100 ng/ml, 5 내지 100 ng/ml, 7 내지 100 ng/ml, 9 내지 100 ng/ml, 3 내지 90 ng/ml, 5 내지 80 ng/ml, 7 내지 70 ng/ml, 9 내지 60 ng/ml 또는 1 내지 50 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2배지 조성물 중에 SCF의 농도는 1 내지 50 ng/ml, IL7의 농도는 1 내지 50 ng/ml, IL15의 농도는 1 내지 50 ng/ml 및 FLT3L의 농도는 1 내지 50 ng/ml일 수 있다.
본 명세서에서 "양성 또는 +"는 세포 표지(마커)와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 세포와 비교하였을 때 더 많은 양 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면, 그 표지에 대하여 양성이 될 수 있다. 또한, 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들면, 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미하는 것일 수 있다. 예를 들면, 세포를 CD56에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지 할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들면, 배경값)보다 검출 가능하게 더 크면, 그 세포는 "CD56에 대해 양성" 또는 "CD56+"으로 나타낼 수 있다. 용어, "음성 또는 -"는 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 의미하는 것 일 수 있다. 예를 들면, CD3에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지 할 수 없으면. 그 세포는 "CD3에 대해 음성" 또는 "CD3-"으로 나타낼 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물에 의해 분화된 자연살해세포의 전체 세포 집단에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 세포가 CD3에 대해 음성이고 CD56에 대해 양성인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본원의 자연살해세포 집단은
NKG2D가 CD3-CD56+ 세포 중 50%, 60%, 또는 64% 이상으로 발현되고/되거나,
NKp30가 CD3-CD56+ 세포 중 50%, 70%, 80%, 또는 89% 이상으로 발현되고/되거나,
NKp44가 CD3-CD56+ 세포 중 50%, 80%, 90%, 또는 94% 이상으로 발현되고/되거나,
NKp46가 CD3-CD56+ 세포 중 50%, 60%, 또는 67% 이상으로 발현되고/되거나,
DNAM-1이 CD3-CD56+ 세포 중 50%, 80%, 90%, 또는 94% 이상으로 발현될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본원의 자연살해세포 집단은
NKG2A가 CD3-CD56+ 세포 중 5%, 2%, 또는 1% 이하로 발현되고/되거나,
KIR2DL1가 CD3-CD56+ 세포 중 5%, 2%, 또는 1% 이하로 발현되고/되거나,
KIR2DL2/3가 CD3-CD56+ 세포 중 20%, 15%, 또는 10% 이하로 발현되고/되거나,
KIR3DL1이 CD3-CD56+ 세포 중 10%, 6%, 5%, 또는 3% 이하로 발현될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본원의 자연살해세포 집단은
퍼포린이 CD3-CD56+ 세포 중 50%, 80%, 90%, 또는 98% 이상으로 발현되고/되거나,
그랜자임 비가 CD3-CD56+ 세포 중 50%, 80%, 90%, 또는 98% 이상으로 발현될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell; ESCs) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)인 것일 수 있다. 구체적으로 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포는 인간 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 '전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells; PSCs)'는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 말하며, 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포를 포함할 수 있다. '배아줄기세포'는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 초기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성이거나 전능성이 있는 자가재생산능을 갖는다. 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. '유도만능줄기세포'는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화줄기세포라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터; 또는 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기 세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함할 수 있다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지며, 테라토마(teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라(chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물은 IL15, ROCK(Rho-associated protein kinase 억제제 또는 이들의 조합을 포함하는 자연살해세포의 성숙 및 증식용 제3배지 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), AT-13148, BA-210, β-엘레멘(β-Elemene), 벨루모수딜(Belumosudil), 크로만 1(Chroman 1), DJ4, GSK-576371, GSK429286A, H-1152, 하이드록시파수딜(Hydroxyfasudil), 이부푸로펜(Ibuprofen), LX-7101, 네타르수딜(Netarsudil), RKI-1447, 리파수딜(Ripasudil), TCS-001, 티아조비빈(Thiazovivin), 베로수딜(Verosudil; AR-12286), Y-27632, Y-30141, Y-33075, Y-39983 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제3배지 조성물 중에 상기 ROCK 억제제(예컨대, 파수딜)의 농도는 1 내지 100 μM, 1 내지 90 μM, 1 내지 80 μM, 1 내지 70 μM, 1 내지 60 μM, 1 내지 50 μM, 1 내지 40 μM, 1 내지 30 μM, 1 내지 20 μM, 3 내지 100 μM, 5 내지 100 μM, 7 내지 100 μM, 9 내지 100 μM, 3 내지 90 μM, 5 내지 80 μM, 7 내지 70 μM, 9 내지 60 μM 또는 1 내지 50 μM일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제3배지 조성물 중에 상기 IL15의 농도는 1 내지 200 μg/ml, 1 내지 100 μg/ml, 2 내지 200 μg/ml, 5 내지 80 μg/ml, 5 내지 60 μg/ml, 5 내지 40 μg/ml, 5 내지 30 μg/ml, 10 내지 80 μg/ml, 10 내지 60 μg/ml, 10 내지 40 μg/ml, 또는 10 내지 30 μg/ml일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제3배지 조성물 중에 IL15의 농도는 2 내지 200 ng/ml 및 ROCK 억제제의 농도는 1 내지 100 μg/ml일 수 있다.
다른 양상은 GSK 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 제1배지 조성물의 존재 하에서 전분화능 줄기세포를 배양함으로써, 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화를 유도하는 제1단계; 및 SCF, IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 제2배지 조성물의 존재 하에서 조혈모세포를 배양함으로써, 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화를 유도하는 제2단계;를 포함하는 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1단계에서 분화를 유도하는 동안 제1배지 조성물은 상이한 조성을 갖는 제1배지 조성물로 교체될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제1배지 조성물은 하기 조성물 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) GSK 억제제를 포함하는 배지 조성물;
(ii) BMP4, VEGF 및 bFGF를 포함하는 배지 조성물;
(iii) VEGF, bFGF, TGF-beta 억제제 및 레티노산을 포함하는 배지 조성물; 및
(iv) PVA, SCF 및 bFGF를 포함하는 배지 조성물.
일 구체예에 있어서, 제1단계는 하기 단계를 포함할 수 있다:
(1) 세포를 GSK 억제제를 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 단계:
(2) 세포를 BMP4, VEGF 및 bFGF를 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 단계:
(3) 세포를 VEGF, bFGF, TGF-beta 억제제 및 레티노산을 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 단계
(4) 세포를 PVA, SCF 및 bFGF를 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 단계.
이때 (1) 내지 (4) 단계는 순차적으로, 역순으로, 또는 동시에 수행될 수 있다. 상기 단계가 동시에 수행되는 경우 해당 단계들의 배지 조성물의 성분을 모두 포함하는 배지 조성물에서 세포를 배양할 수 있다.
일 구체예에 있어서, bFGF는 각 단계별로 다른 농도로 배지 조성물에 포함될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1단계는 적어도 3일 이상, 3 내지 25일간, 5 내지 20일간 또는 12 내지 16일 간 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (1) 단계는 1 내지 4일간, 상기 (2) 단계는 1 내지 4일간, 상기 (3) 단계는 0.5 내지 2일간, 및/또는 상기 (4) 단계는 2일 내지 24일간 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 제2배지 조성물은 SCF, IL7, IL15 및 FLT3L를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2단계는 적어도 3일 이상, 3 내지 25일간, 5 내지 20일간 또는 12 내지 16일 간 수행될 수 있다.일 구체예에 있어서, 상기 분화를 유도하는 방법은 IL15, ROCK 억제제(예컨대, 파수딜) 또는 이들의 조합을 포함하는 제3배지 조성물의 존재 하에서 자연살해세포를 배양함으로써, 자연살해세포를 성숙 및 증식하는 제3단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제3단계는 적어도 1일 이상, 1 내지 28일간, 2 내지 25일간, 3 내지 21일, 5 내지 20일, 또는 7 내지 14일간 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본원의 배지 조성물은 각 성분을 다양한 농도 조합으로 포함할 수 있다.
다른 일 양상은 본원의 분화를 유도하는 방법으로 전분화능 줄기세포에서 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 제공한다. 상기 자연살해세포는 전술한 바와 같다.
다른 일 양상은 본원의 분화를 유도하는 방법으로 전분화능 줄기세포에서 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 분화를 유도하는 방법으로 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "암"은 종양, 혈액암 또는 고형암을 포함하는 의미으로서, 개체의 NK 세포의 시너지 활성을 손상시키거나 또는 특정 조건에서 표적 세포로서 NK 세포의 시너지 활성을 일으키지 않는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 암은 교종, 위장관기질종양, 백혈병, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 위암, 대장암, 전립선암, 난소암, 폐암, 후두암, 직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 신장암, 피부암, 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암, 혈액암, 림프종, 및 다발성골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암의 발생을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효 성분" 또는 용어 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
상기 조성물은 기존에 알려져 있는 다른 면역항원보강제를 추가로 포함할 수 있으며, 다른 면역항원보강제로는 바람직하게는 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A, MPL) 및 GLA-SE(Glucopyranosyl Lipid Adjuvant, formulated in a stable nano-emulsion of squalene oilin- water) 중 하나를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 일 양상에 따른 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 일 양상에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000 세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000 세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자 (biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라 겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공 중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 면역세포, 또는 그의 활성을 증가시키는 물질은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 분화를 유도하는 방법에 따른 방법으로 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "질환"은 하나의 병리적 상태, 특히 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역성 장애, 퇴행성 질환, 세포사멸 관련 질환 및 이식편 거부를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "감염성 질환"은 박테리아, 바이러스, 곰팡이 등과 같은 유기체에 의한 감염성 질환을 통칭할 수 있다. 예를 들어, HIV(Hunan Immunodeficiency Virus), EBV(Epstein-Barr virus), HHV(Human Herpes Virus), IAV(Influenza A virus), COV-19 와 같은 바이러스성 감염의 경우, 자연살해세포의 활성화 수용체인 NKp46, NKp44, 또는 NKp30 등이 바이러스의 당단백질(viral glycoprotein)과 결합 및 활성화되어 감염세포의 사멸을 유도할 수 있다. 또한, 예를 들어 CMV(Cytomegalovirus), EMCV(Encephalomyocarditis virus)와 같은 바이러스성 감염의 경우, 자연살해세포의 FASL, TRAIL 등이 바이러스 감염 세포에서 증가된 세포사멸수용체(death receptor)와 결합하여 감염세포의 사멸을 유도할 수 있다.
다른 일 양상은 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 키트로써, GSK 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 유도용 제1배지 조성물; 및 SCF, IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 제2배지 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 제1배지 조성물, 제2배지 조성물, 및 각 성분 등에 대해서는 전술한 바와 같다.
본원에서 제1배지 조성물과 제2배지 조성물은 키트 내에 분리되어 포함될 수 있다. 또한, 제1배지 조성물이 (i) 내지 (iv)의 배지 조성물을 포함하는 경우 (i) 내지 (iv)의 배지 조성물도 서로 키트 내에 분리되어 포함될 수 있다.
다른 일 양상은 GSK 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 제1배지 조성물의 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 유도 용도이다.
다른 일 양상은 SCF, IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 제2배지 조성물의 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화 유도 용도이다.
다른 일 양상은 IL15, ROCK(Rho-associated protein kinase 억제제 또는 이들의 조합을 포함하는 제3배지 조성물의 자연살해세포의 성숙 및 증식 용도이다.
제1배지 조성물, 제2배지 조성물, 제3배지 조성물 및 각 성분 등에 대해서는 전술한 바와 같다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.
실시예 1: 인간 전분화능 줄기세포 유래 자연살해세포
전분화능 줄기세포로부터 자연살해세포로 분화시키는 과정에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다. 구체적으로 인간 전분화능 줄기세포를 배양하여 조혈모세포로 분화시키고, 조혈모세포를 배양하여 자연살해세포로 분화시켰다. 자연살해세포로 분화시킨 후 성숙 및 증식시켰다.
1.1. 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSCs)로의 분화
인간 전분화능 줄기세포(Human pluripotent stem cells; hPSCs)를 stemMACS-iPS brew media로 2일 간 유지하였다. 분화 기본 배양액은 Stempro34-SFM(+stempro sup) + 200 μg/ml human Transferrin + 2 mM L-glutamine + 0.5 mM L-Ascobic acid + 0.45 mM MTG(1-thioglycerol) + 1% penicillin/streptomycin 로 하였다.
중간엽을 유도한다고 알려진 GSK 억제제인 CHIR99021를 5 μM 농도로 단독으로 2일간 처리하였다. 추가로 세포를 BMP4 50 ng/ml, VEGF 50 ng/ml 및 bFGF 100 ng/ml로 첨가한 분화 배양액에 2일 간 처리하였다. 그 후, 다음 하루 동안 VEGF 50 ng/ml, bFGF 50 ng/ml, SB-431542 10 μM 및 레티노산(Retinoic acid) 1 μM로 첨가한 배양액에서 배양하였다. 배양 후 5일째부터 12일째까지 PVA 0.1%(w/v, g/ml), SCF 50 ng/ml 및 bFGF 10 ng/ml로 첨가한 배양액에서 매일 배양액을 교체하면서 배양하였다.
1.2. 자연살해세포로의 분화
HSCs 유도 후 분화 기본 배양액은 HSC유도와 동일한 배양액을 사용하였다. 기본 배양액에 SCF 20 ng/ml, IL-7 20 ng/ml, IL-15 10 ng/ml 및 FLT3L 10 ng/ml로 첨가하여 2일에 한 번씩 배양액을 교체하면서 2주간 배양하였다.
1.3. 자연살해세포의 성숙(maturation) 및 증식(expansion)
자연살해세포로 분화 후 부유한 세포만 수확하여 cell culture dish에 Alys505NK-EX(1000 IU/ml IL-2 함유) + 10%(w/v) FBS를 기본 배양액으로 하여, ROCK 억제제인 Fasudil을 10 μM로, IL-15를 20μg/ml로 첨가하여 1주에서 2주간 배양하였다.
상기 방법을 통하여 실시예 1의 NK 세포를 수득하였다.
비교예 1 내지 4: 인간 말초혈액에서 분리된 자연살해세포
문헌[Jung, D., Baek, Y.S., Lee, I.J. et al. Ex vivo expanded allogeneic natural killer cells have potent cytolytic activity against cancer cells through different receptor-ligand interactions. J Exp Clin Cancer Res 40, 333 (2021)]에 개시된 방법에 따라 자연살해세포를 분리하였다.
NK 세포의 분리
인간 말초혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 분리백혈구 성분채집술을 통해 4명의 건강한 기증자로부터 수집하였다. 모든 건강한 기증자는 연구를 수행하기 전에 서면 동의서를 제공하였다. CD3-CD56+ primary NK(pNK) 세포는 폐쇄 및 자동화 플랫폼인 Prodigy(Miltenyi Biotec)를 사용하여 anti-CD3 항체(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 및 anti-CD56 항체(Miltenyi Biotec)로 CD3-/CD56+ 선택을 통해 수득하였다.
분리된 primary NK 세포를 비교예 1로 하였다. 분리한 primary NK세포를 동결보존한 세포를 비교예 2로 하였다.
NK 세포의 활성화, 증식 및 동결
NK 세포를 활성화시키는 γ-글로불린(Green-cross, 한국 용인) 및 anti-NKp46(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)이 코팅된 플라스크에 비교예 2의 NK 세포를 접종하고 1000 IU/mL 재조합 인간 IL-2(Novartis, Basel, Switzerland), 50 ng/mL 재조합 인간 IL-18(R&D system, Minneapolis, MN, USA) 및 5% 가열 불활성화 자가 혈장이 첨가된 Alys505NK-EX 무혈청 배지(CSTI, Sendai, Japan)에서 배양하였다. 새로운 배양 배지를 세포 밀도(2 x 106 cells/mL)에 따라 1 내지 3일마다 첨가하였다. 6일째에 배양백(NIPRO, Osaka, Japan)에 세포를 옮겨 14일 동안 배양하였다. 배양된 NK 세포를 Cryostor CS5(BioLife Solutions, Bothell, WA, USA)로 동결보존하였다. 배양백에 옮겨 14일 동안 배양한 세포를 비교예 3으로 하였고, 비교예 3의 세포를 동결보존한 세포를 비교예 4로 하였다.
비교예 5: NK-92MI
인간 자연살해 세포주인 NK-92MI는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 사용하였다.
실험예 1: NK 세포 특이 마커의 확인
실시예 1에서 수득한 세포가 NK 세포로 분화되었는지를 확인하기 위하여, NK 세포에 특이적인 CD마커를 FACS(형광표지세포분류기, Fluorescence-activated cell sorting, BD FACSCalibur™)를 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 전체 NK 세포 분화 33일째 모든 세포를 수확하여 CD marker를 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 분석된 97% 이상의 세포가 CD45 양성인 말초 백혈구로 분화되었으며, NK 세포 특이 마커인 CD3-CD56+ 세포가 97% 이상 확인되었다. 또한, NK 세포의 항체 의존성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 기능을 유도하는 CD16이 56% 발현되었음을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 조성물을 사용함으로 인해 효과적으로 전분화능 줄기세포로부터 NK 세포로 분화시킬 수 있는 것을 알 수 있었다.
실험예 2: NK 세포 표현형 확인
상기 실시예 1에서 수득한 세포의 표면 수용체 발현도 및 세포질 과립의 발현도를 유세포분석으로 확인하였다. Primary NK 세포와의 비교를 위해 비교예 3 및 비교예 5의 세포를 이용하여 동일하게 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다.
도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 세포의 활성화 수용체(Activating receptor)의 발현은 CD56+ 세포 중 64% NKG2D, 89% NKp30, 94% NKp46, 및 94% DNAM-1의 발현이 확인되었고, 억제 수용체(Inhibitory receptor)의 발현은 CD56+ 세포 중 NKG2A와 KIR2DL1은 1% 이하로 발현이 확인되었고, 9% KIR2DL2/3 및 3% KIR3DL1의 발현이 확인되었다.
세포질 과립(Cytolytic granule)인 퍼포린(Perforin)과 그랜자임 비(Granzyme B)의 경우 각각 98%, 99% 이상의 발현이 확인되었다.
실시예 1의 세포는 비교예 3의 활성화된 primary NK 세포와 비교해서는 활성화 수용체가 64% 내지 94%로 다소 낮게 발현되었으나, 비교예 5의 NK-92MI (NKp46, 4%; NKp44, 27%; DNAM-1, 4%)와 비교하여서는 비교적 높은 발현율을 보였다. 실시예 1의 세포의 억제성 수용체의 경우 primary NK 세포 보다 훨씬 더 낮게 발현되었음을 알 수 있었다. 실시예 1의 세포의 세포질 과립은 높게 발현되어 primary NK 세포와 유사한 특징을 가지는 것을 알 수 있었다.
이를 통해, 실시예 1의 NK 세포는 비교예 5의 NK 세포보다 우수한 특징을 가지며, 활성화된 비교예 3의 NK 세포와 유사하거나 더 우수한 특징을 가짐을 알 수 있었다.
실험예 3: 세포 독성 확인
3-1. K562 세포주 및 A2780cis 세포주
세포 독성은 NK 세포에 대한 감수성이 높아 NK 세포의 활성 측정에 주로 사용되고 있는 K562 세포(인간 만성 골수성 백혈병 세포주) 및 시스플라틴-내성 난소암 세포 A2780cis(난소암 세포주)를 대상으로 수행하였다. 먼저, 타겟 암세포(K562 또는 A2780cis)를 수거하여 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그 다음 세포 펠렛을 DPBS로 희석하여 세척하고, 세척한 후의 세포 펠렛을 페놀레드가 포함되지 않은 RPMI 배지에 10% FBS가 첨가된 배양액으로 부유하였다. 조건 당 1 x 105 개의 세포를 준비하고, CFSE(Life technologies) 5μM의 농도로 5% CO2 조건에서 인큐베이터에서 10분간 정치하여 염색하였다. 이후 세포를 DPBS로 두 번 세척한 다음 페놀레드가 포함되지 않은 RPMI 배지에 10% FBS가 첨가된 배양액으로 희석하였다. 활성화 NK 세포는 타겟 세포와의 E:T(Effector cell:Target cell) 비율(0:1, 1:1, 5:1, 10:1 )에 따라 준비하고, 24-웰 플레이트에 타겟 세포와 함께 분주하여 섞어주었다. 그 다음 활성화 NK 세포와 타겟 세포를 4시간 동안 반응을 시키고, 반응이 끝나기 20분 전에 7AAD(7-Aminoactinomycin D)를 상기 세포에 처리하였다. 반응이 끝난 후에는 세포를 5 ㎖ FACS 튜브에 수거하고, 유세포 분석기를 통하여 세포의 살상능을 분석하였다.
그 결과를 도 4 및 표 2에 나타내었다.
표 2에서 알 수 있듯이, 실시예 1의 NK 세포는 혈액암인 K562 세포주에 대하여 10:1 비율에서 91%의 세포독성을 보였으며, 항암제 내성 난소암 세포주인 A2780cis 세포주에서는 74%의 세포독성을 보이는 것으로 나타났다. 활성화된 비교예 3 및 비교예 4의 primary NK 세포는 K562 세포주에 대하여 10:1 비율에서 각각 93.22% 및 80.5%의 세포독성을 나타냈고, 비교예 2의 primary NK 세포는 K562 세포주에 대하여 10:1 비율에서 17.1%의 세포독성을 나타내었다. 상기 결과로부터 실시예 1의 NK 세포는 비교예 2 내지 4의 primary NK 세포와 비교하여 유사하거나 보다 우수한 세포 독성을 갖는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 4에서 알 수 있듯이, 실시예 1의 세포는 비교예 5의 NK92MI 세포에 비하여 유의하게 세포독성이 높은 것으로 나타나, 실시예 1의 세포는 우수한 세포 독성을 갖는 것을 알 수 있었다.
세포
독성(%)
(E:T=10:1)		 실시예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
K562 91.84 17.1 93.22 80.5 34.24
A2780cis 74.3 - 60.2 58.5 34.2
-은 미측정을 의미함.
이를 통해 실시예 1의 NK 세포는 비교예 5의 다른 NK 세포보다 우수한 특징을 가지며, 비교예 3 및 4의 활성화된 primary NK 세포와 유사하거나 더 우수한 특징을 가짐을 알 수 있었다.
3-2. SKOV3 세포주
상기 실험예 3-1에 기재된 NK 세포의 활성 측정 방법(cytotoxicity assay)을 SKOV3 세포(난소암 세포주)를 대상으로 수행하였다. 구체적으로, 활성화 NK 세포와 SKOV3 세포를 E:T 비율(0:1, 1:1, 5:1, 10:1)로 반응시켜 NK 세포의 살상능을 분석하였다.
그 결과 Primary NK 세포나 NK92MI 세포의 경우 SKOV3 세포주에 대한 세포 독성 활성이 낮은 반면, 본 발명의 방법에 따라 분화된 실시예 1의 NK 세포(ESC-NK) 및 iPSC 유래 NK 세포(CD34+ derived NK 세포)는 E:T ratio 10:1 에서 SKOV3 세포주에 대한 세포 독성이 65~82%로 매우 높은 것으로 나타났다(도 5). 여기서 CD34+ derived NK 세포는 UCB에서 분리된 CD34+ 세포를 이용하여 생성된 iPSC로부터 실시예 1의 방법에 따라 분화된 NK 세포이다. 이러한 결과로부터 본 발명의 방법에 따라 ESC 또는 iPSC로부터 분화된 NK 세포는 다른 NK 세포보다 우수한 세포독성을 가짐을 알 수 있다.

Claims (18)

  1. 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 키트로써,
    GSK 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 유도용 제1배지 조성물; 및
    SCF, IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 제2배지 조성물을 포함하는, 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1배지 조성물 중에 GSK 억제제의 농도는 1 내지 10 μM, BMP4의 농도는 10 내지 100 ng/ml, VEGF의 농도는 10 내지 100 ng/ml, bFGF의 농도는 10 내지 200 ng/ml, 레티노산의 농도는 0.1 내지 10 μM, TGF-beta 억제제의 농도는 1 내지 100 μM, PVA의 농도는 0.01 내지 1%(w/v) 및 SCF의 농도는 5 내지 500 ng/ml인 것인, 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제2배지 조성물 중에 SCF의 농도는 1 내지 50 ng/ml, IL7의 농도는 1 내지 50 ng/ml, IL15의 농도는 1 내지 50 ng/ml 및 FLT3L의 농도는 1 내지 50 ng/ml인 것인, 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    분화된 자연살해세포의 전체 세포 집단 내 90% 이상의 세포가 CD3에 대해 음성이고 CD56에 대해 양성인 것인, 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전분화능 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell; ESCs) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)인 것인, 키트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1배지 조성물과 제2배지 조성물은 키트 내에 분리되어 포함되는, 키트.
  7. 제1항에 있어서,
    IL15, ROCK 억제제, 또는 이들의 조합을 포함하는 자연살해세포의 성숙 및 증식용 제3배지 조성물을 추가로 포함하는, 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제3배지 조성물 중에 상기 ROCK 억제제의 농도는 1 내지 50 μM인 것인, 키트.
  9. GSK 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 제1배지 조성물의 존재 하에서 전분화능 줄기세포를 배양함으로써, 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화를 유도하는 제1단계; 및
    SCF(Stem Cell Factor), IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 제2배지 조성물의 존재 하에서 조혈모세포를 배양함으로써, 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화를 유도하는 제2단계;
    를 포함하는 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 유도하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제1단계는 5 내지 20일간 수행되는 것인, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 제2단계는 5 내지 20일간 수행되는 것인, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    IL15, Rock 억제제, 또는 이들의 조합을 포함하는 제3배지 조성물의 존재 하에서 자연살해세포를 배양함으로써, 자연살해세포를 성숙 및 증식하는 제3단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제3단계는 5 내지 20일간 수행되는 것인, 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 전분화능 줄기세포에서 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단.
  15. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 전분화능 줄기세포에서 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 암은 교종, 위장관기질종양, 백혈병, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 위암, 대장암, 전립선암, 난소암, 폐암, 후두암, 직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 신장암, 피부암, 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암, 혈액암, 림프종, 및 다발성골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 약학적 조성물.
  17. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 전분화능 줄기세포에서 분화된 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 조성물로써,
    GSK 억제제, BMP4(Bone Morphogenetic Protein 4), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor), 레티노산(Retinoic acid), TGF-beta 억제제, PVA(polyvinyl alcohol), SCF(Stem Cell Factor) 또는 이들의 조합을 포함하는 전분화능 줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 유도용 제1배지 조성물; 및
    SCF(Stem Cell Factor), IL7(Interleukin7), IL15(Interleukin15), FLT3L(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) 또는 이들의 조합을 포함하는 조혈모세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 제2배지 조성물을 포함하는, 조성물.
PCT/KR2023/017981 2022-11-10 2023-11-09 전분화능 줄기세포에서 자연살해세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 분화 방법 Ceased WO2024101919A1 (ko)

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