WO2024111635A1 - 血液がんに対する抗体 - Google Patents

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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to an antibody against blood cancer. More specifically, the present invention relates to an antibody or a functional fragment thereof that recognizes HLA-DR. The present invention also relates to a chimeric antigen receptor that retains the antibody or a functional fragment thereof, or an immune cell that expresses the chimeric antigen receptor. Furthermore, the present invention relates to a multispecific antibody that contains the antibody or a functional fragment thereof and an antigen recognition site for an immune cell. The present invention also relates to a pharmaceutical composition that contains these antibodies, etc.
  • AML Acute myeloid leukemia
  • CAR-T chimeric antigen receptor T
  • Non-Patent Documents 1 and 2 CD19 CAR-T cells have been shown to be highly effective against relapsed/refractory B-cell leukemia and malignant lymphoma. However, there are no CAR-T cells that are effective against AML. To date, CAR-T cells for AML have been developed that target CD33, CD123, etc., but all of these have problems such as strong hematotoxicity due to their expression in a portion of normal blood cells (Non-Patent Documents 3 and 4).
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 5
  • the present invention was made in consideration of the problems with the prior art, and aims to identify cell surface antigens specific to blood cancers such as AML, and provide antibodies or functional fragments thereof that recognize the antigens, as well as effective means for immunotherapy of blood cancers using the antibodies, etc.
  • Non-Patent Documents 6 and 7 The inventors have previously found that even if a protein itself is not cancer-specific, cancer-specific epitopes formed by post-translational changes can be targets for immunotherapy.
  • the inventors aimed to isolate AML-specific antibodies and develop CAR-T cells based on them by creating a large number of antibodies that bind to AML cells, identifying from among them AML-specific antibodies, and identifying the antigens that they recognize.
  • mAbs monoclonal antibodies
  • BM bone marrow
  • AML cell lines various AML cell lines.
  • 1,078 mAbs that do not bind to cells other than B cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • KG2032 attempts were made to identify the antigen recognized by the antibody, using the loss of binding to lymphoma cells (Daudi cells) that had been comprehensively knocked out using the CRISPR-Cas9 system as an indicator.
  • the antigen recognized by KG2032 is HLA-DR.
  • the antigen recognized by eight of the 32 clones other than KG2032 was also HLA-DR.
  • HLA-DR is a highly polymorphic molecule
  • KG2032 binds to chronic myeloid leukemia cell lines (K562 cells) expressing HLA-DRB1*0405, 0410, 0701, 0803, 0901, 1201, or 1454, but does not bind to K562 cells expressing HLA-DRB1*0101, 0301, 0403, 0404, 0802, 1101, 1301, 1302, 1403, 1405, 1406, 1501, or 1502.
  • KG2032 does not bind to some monocytes and T cells that express HLA-DR.
  • a chimeric antigen receptor was designed in which the region was fused with CD28 and CD3 ⁇ , or CD8 ⁇ , 4-1BB and CD3 ⁇ .
  • T cells expressing the chimeric antigen receptor were then prepared and co-cultured with a cell line derived from human acute myeloid leukemia (KG1a cells).
  • KG1a cells human acute myeloid leukemia
  • a vector was created for co-expressing a chimeric antigen receptor in which CD28 and CD3 ⁇ were fused to the variable region of KG2032, and IL-15.
  • NK cells expressing the chimeric antigen receptor were then prepared and co-cultured with a cell line derived from human acute myeloid leukemia (KG1a cells).
  • KG1a cells human acute myeloid leukemia
  • anti-HLA-DR antibodies in AML patients who have relapsed after HLA-DR mismatched allogeneic transplantation, if the recipient (leukemia patient) HLA-DR is positive for the anti-HLA-DR antibody and the donor's HLA-DR type is negative for the anti-HLA-DR antibody, it is believed that the anti-HLA-DR antibody-derived CAR-T cells made from T cells derived from the transplanted patient himself or the donor will specifically attack the recipient's leukemia.
  • the present invention provides the following aspects:
  • composition for treating blood cancer comprising an antibody or a functional fragment thereof that recognizes HLA-DR.
  • a composition administered to a blood cancer patient who has received hematopoietic stem cells comprising: The antibody or functional fragment thereof that recognizes HLA-DR is included.
  • the donor of the hematopoietic stem cells and the patient have different HLA-DR allele types,
  • a composition, wherein the antibody or a functional fragment thereof binds to HLA-DR of the patient and does not bind to HLA-DR of the donor.
  • the antibody or functional fragment thereof is selected from the group consisting of HLA-DRB1*0405, HLA-DRB1*0410, HLA-DRB1*0701, HLA-DRB1*0803, HLA-DRB1*0901, HLA-DRB1*1201, HLA-DRB1*1454, HLA-DRB1*0101, HLA-DRB1*0301, HLA-DRB1*0403, HLA-DRB1*0404, HLA -The composition described in [1] or [2] binds to at least one HLA-DRB1 allele type selected from the group consisting of HLA-DRB1*0802, HLA-DRB1*1101, HLA-DRB1*1301, HLA-DRB1*1302, HLA-DRB1*1403, HLA-DRB1*1405, HLA-DRB1*1406, HLA-DRB1*1501, and HLA-DRB1*1502.
  • the antibody or functional fragment thereof binds to at least one HLA-DRB1 allele type selected from the group consisting of HLA-DRB1*0405, HLA-DRB1*0410, HLA-DRB1*0701, HLA-DRB1*0803, HLA-DRB1*0901, HLA-DRB1*1201, and HLA-DRB1*1454, and binds to at least one HLA-DRB1 allele type selected from the group consisting of HLA-DRB1*0101, HLA-DRB1*0301, HLA-DRB1*040 3.
  • composition according to any one of [1] to [7], comprising an immune cell expressing a chimeric antigen receptor carrying the antibody or a functional fragment thereof.
  • composition described in [8], wherein the immune cells are prepared from cells derived from a donor of the hematopoietic stem cells.
  • composition described in [9] wherein the cells derived from the hematopoietic stem cell donor are pluripotent stem cells.
  • composition according to any one of [1] to [7], comprising a multispecific antibody that retains the antibody or a functional fragment thereof and an antigen recognition site on an immune cell.
  • composition described in [13] comprising immune cells expressing a chimeric antigen receptor that retains the antibody or a functional fragment thereof.
  • composition according to [13] comprising a multispecific antibody comprising the antibody or a functional fragment thereof and an antigen recognition site for an immune cell.
  • An antibody or a functional fragment thereof that recognizes HLA-DR which binds to a region containing the amino acid sequence of positions 74 to 89 of HLA-DRB1 in which the amino acid at position 86 is an amino acid other than aspartic acid, but does not bind to a region containing the amino acid sequence of positions 74 to 89 of HLA-DRB1 in which the amino acid at position 86 is aspartic acid.
  • An antibody or a functional fragment thereof that recognizes HLA-DR having any of the following characteristics (a) to (i): (a) a heavy chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3, and a light chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 to 7; (b) a heavy chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 34 to 36, and a light chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 38 to 40; (c) a heavy chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 42 to 44, and a light chain variable region comprising complementarity determining regions 1 to 3 each comprising the
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody or functional fragment thereof described in [16] or [17], or the immune cell described in any one of [19] to [21].
  • the present invention by targeting HLA-DR, a cell surface antigen specific to blood cancer, it becomes possible to treat the above-mentioned diseases by using an antibody or a functional fragment thereof that recognizes the antigen, or a chimeric antigen receptor that retains the antibody or a chimeric antigen receptor that retains the antibody or a chimeric antigen receptor that recognizes the antibody or a chimeric antigen receptor that retain ... chimeric antigen receptor, etc.
  • such antibodies can exhibit allele specificity for HLA-DR, so in the case of a blood cancer patient who has relapsed after HLA-DR mismatched allogeneic transplant, if the recipient's (blood cancer patient's) HLA-DR is a positive type to which the antibody of the present invention binds, and the donor's HLA-DR is a negative type to which the antibody of the present invention does not bind, then CAR-T cells derived from the antibody of the present invention produced from donor-derived cells, including pluripotent stem cells, will be able to specifically attack the recipient's blood cancer.
  • the antibody of the present invention is used in treatment of blood cancer patients with positive HLA-DR to which the antibody of the present invention binds, using normal autologous CAR-T cells, etc., blood cancer cells are eliminated and normal hematopoiesis is maintained by negative cells to which the antibody of the present invention does not bind, making it possible to treat the patient.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of KG2032 to peripheral blood from healthy subjects, in which T represents T cells, B represents B cells, Mo represents monocytes, and Neu represents neutrophils.
  • T represents T cells
  • B represents B cells
  • Mo represents monocytes
  • Neu represents neutrophils.
  • 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of KG2032 to AML specimens.
  • Unique patient numbers (UPN) 1 to 14 indicate leukemia cells derived from each AML patient.
  • FIG. 1 shows an overview of the process for identifying the antigen recognized by KG2032 using a CRISPR guide RNA (gRNA) library. This is a diagram showing the results of analyzing the binding of KG2032 to the Cas9-expressing Daudi cells shown in Figure 2A by flow cytometry.
  • gRNA CRISPR guide RNA
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of KG2032 or an existing anti-HLA-DR antibody (L243) to Daudi cells in which HLA-DR molecules have been knocked out.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of KG2032 or an existing anti-HLA-DR antibody (L243) to Daudi cells in which HLA-DR molecules have been knocked out.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of KG2053, KG1982, KG19122, KG19130, KG19214, KG19833, aAML191870, or aAML191872 to Daudi cells in which HLA-DR molecules have been knocked out.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of KG2032 or L243 to K562 cells expressing various HLA-DRB1 molecules.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of KG2032 or L243 to each peripheral blood fraction of a healthy subject (donor 1) with KG2032-negative HLA-DRB1 (0403/0802) or to each peripheral blood fraction of a healthy subject (donor 2) with KG2032-positive HLA-DRB1 (0403/0901).
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding of KG2032 to bone marrow cells from AML patients with KG2032-positive HLA-DRB1.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometric analysis of the binding of KG2032 to each fraction of bone marrow cells from healthy individuals who are KG2032-positive, HLA-DRB1 positive.
  • FIG. 1 shows an overview of the use of KG2032 in the treatment of AML.
  • FIG. 1 shows an overview of another mode of use of KG2032 in the treatment of AML.
  • 1 shows the results of comparing the amino acid sequences of DRB1*1454 (KG2032 positive) and DRB1*1502 (KG2032 negative), in which Regions 1 to 5 each indicate a region with many differences in the amino acid sequence.
  • FIG. 1 shows an outline of a chimeric protein in which HLA-DRB1*1454 (KG2032 positive) and HLA-DRB1*1502 (KG2032 negative) are partially fused.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the binding ability of KG2032 or L243 to K562 cells expressing each of the above chimeric proteins.
  • FIG. 1 shows the results of comparing the amino acid sequences of Region 3 between those that bind to KG2032 and those that do not when various HLA-DRB1 molecules are expressed in K562 cells.
  • FIG. 13 shows the results of expressing a mutant in which the amino acid serine (S) at position 86 of DRB1*0405 (KG2032 positive) was replaced with aspartic acid (D) in K562 cells and comparing the binding of KG2032 or L243.
  • FIG. 1 shows an outline of a chimeric antigen receptor containing the variable region of KG2032 (KG2032-CAR).
  • FIG. 1 shows the results of analyzing the introduction rate of KG2032-CAR.
  • FIG. 1 is a graph showing the proliferation rate of T cells expressing KG2032-CAR (KG2032-CAR-T cells).
  • Control indicates T cells that were not transfected with a gene.
  • This is a graph showing the results of analyzing cytokine production after co-culturing KG2032-CAR-T cells with leukemia cell lines KG1a (KG2032 positive) or THP-1 (KG2032 negative) for 24 hours.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of analyzing the proliferation of KG2032-CAR-T cells with and without the addition of dasatinib. Note that in the figures from Fig. 8F onwards, the results are shown using "BB ⁇ " shown in Fig. 8A as KG2032-CAR-T.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the expression of T cell exhaustion markers (PD-1, LAG-3, TIM-3) in KG2032-CAR-T cells with and without the addition of dasatinib.
  • This is a graph showing the results of analyzing IL-2 production in coculture of KG2032-CAR-T cells and KG1a cells with and without the addition of dasatinib.
  • FIG. 1 shows the results of analyzing the effect of administration of KG2032-CAR-T cells in a xenograft model in which luciferase-expressing KG1a cells were transplanted into NOG mice, by detecting bioluminescence using an in vivo imaging system (IVIS).
  • IVIS in vivo imaging system
  • 1 is a graph showing the results of analyzing the effect of administration of KG2032-CAR-T cells in a xenograft model in which luciferase-expressing KG1a cells were transplanted into NOG mice. The graph shows the time course of luminescence intensity detected by IVIS.
  • FIG. 1 shows an overview of the manufacturing process of KG2032 CAR-T2A-IL-15 and NK cells into which the CAR has been introduced.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of analyzing the proliferation of KG2032 CAR-T2A-IL-15-introduced NK cells (KG2032 CAR-NK) or control (non-introduced (NT)) NK cells during in vitro culture.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry analysis of the expression of CD56, CD3, and KG2032 CAR in KG2032 CAR-NK. This is a graph showing the results of measuring CD107a degranulation by flow cytometry when KG2032 CAR-NK or control NK cells were co-cultured with target cells.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the cytotoxic activity of KG2032 CAR-NK or control NK cells when co-cultured with target cells by a 51 Cr release assay.
  • FIG. 1 shows the timing of transplantation of KG1a AML cells (KG1a-luc) and administration of KG2032 CAR-NK to immunodeficient mice. This is a graph showing the survival rate of KG1a transplanted mice administered KG2032 CAR-NK.
  • FIG. 1 shows the timing of transplantation of bone marrow cells from AML patients and administration of modified KG2032 CAR-T cells into immunodeficient mice.
  • the present invention relates to an antibody or a functional fragment thereof that recognizes HLA-DR, which is one of the major histocompatibility complexes (MHC) of class II.
  • recognizing HLA-DR means binding to at least one allele type in HLA-DR, and also includes binding to at least one allele type in HLA-DR and not binding to at least one other allele type.
  • HLA-DR allele types include, for example, HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR5, HLA-DR6, HLA-DR7, HLA-DR8, HLA-DR9, HLA-DR10, HLA-DR11, HLA-DR12, HLA-DR13, HLA-DR14, HLA-DR15, HLA-DR52, and HLA-DR53.
  • HLA-DR is, for example, a complex of an ⁇ chain and a ⁇ chain, and more specifically, the ⁇ chain includes HLA-DRA such as HLA-DRA1.
  • HLA-DRB such as HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, and HLA-DRB5.
  • HLA-DRB1 include HLA-DRB1*0405 (SEQ ID NO: 11), HLA-DRB1*0410 (SEQ ID NO: 12), HLA-DRB1*0701 (SEQ ID NO: 13), HLA-DRB1*0803 (SEQ ID NO: 14), HLA-DRB1*0901 (SEQ ID NO: 15), HLA-DRB1*1201 (SEQ ID NO: 16), HLA-DRB1*1454 (SEQ ID NO: 17), HLA-DRB1*0101 (SEQ ID NO: 18), HLA-DRB1*0301 (SEQ ID NO: 19), and HLA-DRB1*0403 (SEQ ID NO: 20).
  • HLA-DRB1*0404 SEQ ID NO: 21
  • HLA-DRB1*0802 SEQ ID NO: 22
  • HLA-DRB1*1101 SEQ ID NO: 23
  • HLA-DRB1*1301 SEQ ID NO: 24
  • HLA-DRB1*1302 SEQ ID NO: 25
  • HLA-DRB1*1403 SEQ ID NO: 26
  • HLA-DRB1*1405 SEQ ID NO: 27
  • HLA-DRB1*1406 SEQ ID NO: 28
  • HLA-DRB1*1501 SEQ ID NO: 29
  • HLA-DRB1*1502 SEQ ID NO: 30
  • an example of the antibody of the present invention is an antibody that binds to an allele of HLA-DRB1 in which the 86th position is an amino acid other than aspartic acid. Furthermore, the antibody may not bind to an allele of HLA-DRB1 in which the 86th position is aspartic acid.
  • the "amino acid other than aspartic acid" at the 86th position is preferably serine, valine, or alanine.
  • a more specific example is an antibody that binds to at least one (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7) HLA-DRB1 selected from the group consisting of HLA-DRB1*0405 (SEQ ID NO: 11), HLA-DRB1*0410 (SEQ ID NO: 12), HLA-DRB1*0701 (SEQ ID NO: 13), HLA-DRB1*0803 (SEQ ID NO: 14), HLA-DRB1*0901 (SEQ ID NO: 15), HLA-DRB1*1201 (SEQ ID NO: 16) and HLA-DRB1*1454 (SEQ ID NO: 17).
  • HLA-DRB1*0405 SEQ ID NO: 11
  • HLA-DRB1*0410 SEQ ID NO: 12
  • HLA-DRB1*0701 SEQ ID NO: 13
  • HLA-DRB1*0803 SEQ ID NO: 14
  • HLA-DRB1*0901 SEQ ID NO: 15
  • HLA-DRB1*0101 SEQ ID NO: 18
  • HLA-DRB1*0301 SEQ ID NO: 19
  • HLA-DRB1*0403 SEQ ID NO: 20
  • HLA-DRB1*0404 SEQ ID NO: 21
  • HLA-DRB1*0802 SEQ ID NO: 22
  • HLA-DRB1*1101 SEQ ID NO: 23
  • HLA-DRB1*1301 SEQ ID NO: 24
  • HLA-DRB1*1302 SEQ ID NO: 25
  • the antibody may be one that does not bind to at least one HLA-DRB1 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 13) selected from the group consisting of HLA-DRB1*1403 (SEQ ID NO: 26), HLA-DRB1*1405 (SEQ ID NO: 27), HLA-DRB1*1406 (SEQ ID NO: 28), HLA-DRB1*1501 (SEQ ID NO:
  • the antibody of the present invention can recognize a region including the amino acid sequence at positions 74 to 89 of HLA-DRB1.
  • the antibody of the present invention may also be one that does not bind to a portion of monocytes and T cells.
  • test antibody in antigen analysis by flow cytometry, if the peak derived from the test antibody is shifted to the side of stronger fluorescence intensity compared to the peak derived from its isotype control antibody, it can be determined that the test antibody (substantially) binds to the antigen. On the other hand, if no such shift is observed, it can be determined that the test antibody does not (substantially) bind to the antigen.
  • the binding affinity of the antibody of the present invention is preferably 10 ⁇ 7 or less, more preferably 10 ⁇ 8 or less, in terms of K D (dissociation constant).
  • ka and kd are rate constants in a binding/dissociation reaction between two molecules, and can be determined, for example, by measurement using surface plasmon resonance (SPR). SPR measurement of binding between an antibody and an antigen is well known, and a person skilled in the art can determine the ka and kd of an antibody based on such well-known techniques, and can further calculate the K D .
  • antibody as used herein includes all classes and subclasses of immunoglobulins.
  • Antibody includes polyclonal and monoclonal antibodies.
  • a “polyclonal antibody” is an antibody preparation that includes different antibodies against different epitopes.
  • a “monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. In contrast to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies recognize a single determinant on an antigen.
  • the antibodies of the present invention are preferably monoclonal antibodies.
  • the antibodies of the present invention are antibodies that have been separated and/or recovered (i.e., isolated) from a component of their natural environment.
  • the antibody of the present invention may have at least one cytotoxic activity selected from ADCC activity and CDC activity, or may have both ADCC activity and CDC activity.
  • ADCC activity antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC activity complement-dependent cytotoxicity
  • the antibody of the present invention may also have antitumor activity.
  • antitumor activity means at least one of the activities of suppressing the proliferation of cancer cells, inducing the death of cancer cells, and suppressing the metastasis of cancer cells.
  • Antitumor activity can be evaluated, for example, by analysis using a cancer-bearing model as shown in the Examples below. Even without such an in vivo system, if tumor cells are cultured in the presence or absence of the test antibody and the number of tumor cells in the former is reduced compared to that in the latter, the antibody can be determined to have antitumor activity.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as to its origin, type, shape, etc., as long as it can recognize HLA-DR.
  • Specific examples include antibodies derived from non-human animals (e.g., mouse antibodies, rabbit antibodies, rat antibodies, camel antibodies), antibodies derived from humans, chimeric antibodies, and humanized antibodies.
  • examples of "antibodies derived from non-human animals” include, for example, KG2032, KG2053, KG1982, KG19130, KG19214, KG19833, aAML191870, aAML191872, and KG19122, which are shown in the Examples described later, and more specifically, examples of antibodies having a variable region containing the following amino acid sequences: (a) An antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • Further examples include antibodies that recognize HLA-DR having the following complementarity determining regions (CDRs): (a) An antibody having heavy chain CDR1 to 3 determined from a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and light chain CDR1 to 3 determined from a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. (b) An antibody having heavy chain CDR1 to 3 determined from a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37, and light chain CDR1 to 3 determined from a light chain variable region comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the method for determining CDRs based on the amino acid sequences of the variable regions is not particularly limited, and examples include known numbering schemes such as Kabat, Chothia, IMGT, and Aho. More specifically, examples of CDRs determined by Kabat include antibodies that recognize HLA-DR having the following CDRs: (a) An antibody having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3 as heavy chain CDRs 1 to 3, respectively, and the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 to 7 as light chain CDRs 1 to 3, respectively.
  • the present invention includes not only antibodies that have a variable region and/or CDR consisting of such a specific amino acid sequence, but also antibodies whose amino acid sequence has been modified without reducing the desired activity (such as reactivity to an antigen).
  • Such amino acid sequence variants can be prepared, for example, by introducing a mutation into DNA encoding the above-mentioned variable region, etc., or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, substitution, deletion, addition, and/or insertion of residues in the amino acid sequence of the antibody.
  • the site at which the amino acid sequence of the antibody is modified may be the constant region of the heavy or light chain of the antibody, or may be the variable region (framework region (FR) and CDR) as long as the activity is equivalent to that of the antibody before modification.
  • Modification of amino acids other than CDR is considered to have a relatively small effect on reactivity with antigens, so the modification is usually made to the FR.
  • PNAS, 102: 8466-8471 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 485-493 (2008), International Publication No. 2002/051870, J. Biol.
  • the number of amino acids to be modified in the variable region is preferably 10 amino acids or less, more preferably 5 amino acids or less, and even more preferably 3 amino acids or less (e.g., 2 amino acids or less, 1 amino acid or less). Furthermore, from the viewpoint of having little effect on the binding to the antigen, it is preferable that all such modifications are made outside the CDR, i.e., in the FR. Furthermore, the number of amino acids to be modified in the CDR is preferably 5 amino acids or less, and more preferably 3 amino acids or less (e.g., 2 amino acids or less, 1 amino acid or less).
  • the amino acid modification is preferably a conservative substitution.
  • conservative substitution means substitution with another amino acid residue that is similar (having a chemically similar side chain).
  • Groups of amino acid residues that have chemically similar amino acid side chains are well known in the technical field to which the present invention belongs.
  • acidic amino acids (aspartic acid and glutamic acid), basic amino acids (lysine, arginine, histidine), and neutral amino acids can be classified into amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), amino acids with hydroxyl groups (serine, threonine), amino acids containing sulfur (cysteine, methionine), amino acids with amide groups (asparagine, glutamine), amino acids with imino groups (proline), and amino acids with aromatic groups (phenylalanine, tyrosine, tryptophan).
  • amino acids with hydrocarbon chains glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline
  • amino acids with hydroxyl groups (serine, threonine)
  • amino acids containing sulfur (cysteine, methionine)
  • amino acids with amide groups (asparagine, glutamine), amino acids with imino groups
  • Antibodies having a variable region containing an amino acid sequence that has 80% or more homology or identity at the amino acid sequence level with the variable region consisting of the above-mentioned specific amino acid sequence after modification are also included in the antibodies of the present invention, so long as they have the same activity as the antibody before modification.
  • Such homology or identity may be at least 80%, but is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more). It is preferable that the modification in the variable region of such an antibody is made in a region other than the CDR, i.e., the FR, from the viewpoint of having little effect on the binding to the antigen.
  • identity means the proportion of sites where the type of amino acid is the same between the amino acid sequences being compared
  • homoology means the proportion including the proportion of sites where similar amino acids are the same.
  • the homology or identity of sequences can be determined using the BLASTP (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990). The program is based on the BLAST algorithm by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993).
  • the method can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
  • the default parameters of each program are used. Specific techniques for these analysis methods are publicly known.
  • Having equivalent activity means, for example, that the binding ability to an antigen is equivalent (e.g., 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more) to that of a target antibody (e.g., KG2032, KG2053, KG1982, KG19130, KG19214, KG19833, aAML 191870, aAML 191872, KG19122).
  • a target antibody e.g., KG2032, KG2053, KG1982, KG19130, KG19214, KG19833, aAML 191870, aAML 191872, KG19122.
  • Modification of the antibody of the present invention may be, for example, modification of the post-translational process of the antibody, such as changing the number or position of glycosylation sites. This can improve, for example, the ADCC activity of the antibody.
  • Glycosylation of the antibody is typically N-linked or O-linked. Glycosylation of the antibody is highly dependent on the host cell used to express the antibody.
  • Modification of the glycosylation pattern can be performed by known methods such as introduction or deletion of specific enzymes involved in sugar production (JP Patent Publication 2008-113663, U.S. Patent No. 5,047,335, U.S. Patent No. 5,510,261, U.S. Patent No. 5,278,299, International Publication No. 99/54342).
  • deamidation may be suppressed by substituting the amino acid to be deamidated or the amino acid adjacent to the amino acid to be deamidated with another amino acid for the purpose of increasing the stability of the antibody.
  • glutamic acid can be substituted with another amino acid to increase the stability of the antibody.
  • the present invention also provides an antibody stabilized in this way.
  • a "chimeric antibody” is an antibody in which the variable region of a certain antibody is linked to the constant region of a heterologous antibody.
  • Chimeric antibodies can be obtained, for example, by immunizing a mouse with an antigen, excising the antibody variable region (variable region) that binds to the antigen from the mouse monoclonal antibody gene, combining it with an antibody constant region (constant region) gene derived from human bone marrow, incorporating it into an expression vector, and introducing it into a host for production (for example, JP-A-8-280387, U.S. Pat. No. 4,816,397, U.S. Pat. No. 4,816,567, U.S. Pat. No. 5,807,715).
  • the constant region of a chimeric antibody is usually that of a human-derived antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ can be used as the constant region.
  • C ⁇ and C ⁇ can be used as the constant region.
  • the amino acid sequences of these constant regions and the base sequences encoding them are publicly known.
  • one or several amino acids in the constant region of a human-derived antibody can be substituted, deleted, added, and/or inserted.
  • a “humanized antibody” refers to an antibody in which the gene sequence of the CDR of an antibody derived from a non-human animal is grafted onto an antibody gene derived from a human (CDR grafting), and the method for producing the antibody is known, such as overlap extension PCR (e.g., EP 239400, EP 125023, WO 90/07861, WO 96/02576).
  • the variable region of an antibody is usually composed of three CDRs sandwiched between four FRs.
  • the CDR is essentially the region that determines the binding specificity of the antibody. While the amino acid sequences of the CDRs are highly diverse, the amino acid sequences constituting the FRs often show high homology or identity even between antibodies with different binding specificities.
  • the binding specificity of one antibody can be grafted onto another antibody by CDR grafting.
  • a human FR that is highly homologous or identical to the non-human animal-derived FR is selected. That is, since the amino acids in the CDR not only recognize the antigen but also coordinate with the amino acids in the FR adjacent to the CDR and are involved in maintaining the loop structure of the CDR, it is preferable to use a human FR that has an amino acid sequence that is highly homologous or identical to the amino acid sequence of the FR adjacent to the CDR to be transplanted.
  • a search for known human FRs that are highly homologous or identical to non-human animal-derived FRs can be carried out, for example, using an antibody-specific search system available on the Internet (http://www.bioinf.org.uk/abysis/). Mutations can be introduced into sequences other than the CDRs of the non-human-derived antibody so that they match the sequence of the human FR thus obtained. Alternatively, if a gene (cDNA) encoding the amino acid sequence of the human FR obtained by the search is available, the non-human-derived CDRs may be introduced into that sequence. Introduction of mutations can be carried out using techniques known in the art, such as nucleic acid synthesis and site-specific mutagenesis.
  • the FR of a human-derived antibody that will form a good antigen-binding site when linked via the CDR.
  • amino acid residues in the FR can be substituted so that the CDR of the humanized antibody will form a suitable antigen-binding site, according to the method described in Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856, etc., and a mutant FR sequence having the desired properties can be selected by measuring and evaluating the antigen-binding activity of the mutant antibody in which the amino acids have been substituted.
  • the antibody of the present invention may take the form of an antibody that competes in binding to HLA-DR with an antibody that has a variable region or CDR that includes the above-mentioned specific amino acid sequence or a modified version thereof.
  • the antibody may take the form of an antibody that binds to an epitope to which an antibody that has a variable region or CDR that includes the above-mentioned specific amino acid sequence or a modified version thereof exhibits binding activity.
  • epitope means an antigenic determinant present in an antigen, i.e., a site on an antigen to which an antigen-binding domain in an antibody binds.
  • an epitope in the present invention may be a polypeptide consisting of multiple consecutive amino acids in the primary amino acid sequence (linear epitope), or a polypeptide formed when amino acids that are not adjacent in the primary amino acid sequence come into close proximity due to a three-dimensional structure such as folding of a peptide or protein (discontinuous epitope, structural epitope).
  • such epitopes typically consist of at least three (e.g., four), and most usually at least five (e.g., 6-20, 7-15, 8-10) amino acids.
  • an antibody is obtained, a person skilled in the art can identify the peptide region (epitope) on the antigen to which the antibody shows reactivity, and prepare various antibodies that bind to that peptide region. Furthermore, whether two antibodies bind to the same or sterically overlapping epitopes can be determined by a competitive assay method.
  • a "functional fragment" of an antibody refers to a part (partial fragment) of an antibody that recognizes HLA-DR.
  • Specific examples include Fab, Fab', F(ab')2, variable region fragment (Fv), disulfide-linked Fv, single-chain variable region fragment (single-chain Fv, scFv), sc(Fv)2, and polymers thereof.
  • Fab here means a monovalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin consisting of one light chain and part of a heavy chain. It can be obtained by papain digestion of an antibody and by recombinant methods. "Fab'” differs from Fab by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteines in the hinge region of the antibody. "F(ab')2” means a bivalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin consisting of both light chains and part of both heavy chains.
  • a “variable region fragment (Fv)” is the smallest antibody fragment that has a complete antigen recognition and binding site. Fv is a dimer in which the heavy chain variable region and the light chain variable region are strongly linked by non-covalent bonds.
  • a “single-chain variable region fragment (single-chain Fv, scFv)” contains the heavy chain variable region and the light chain variable region of an antibody, and these regions are present in a single polypeptide chain.
  • An “sc(Fv)2" is a single chain formed by linking two heavy chain variable regions and two light chain variable regions with a linker or the like.
  • the antibody of the present invention can be produced by the hybridoma method or by the recombinant DNA method.
  • a representative example of the hybridoma method is the method of Kohler and Milstein (Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975)).
  • the antibody-producing cells used in the cell fusion step in this method are spleen cells, lymph node cells, peripheral blood leukocytes, etc. of animals (e.g., mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, goats) immunized with an antigen (HLA-DR, partial peptides thereof, proteins fused with Fc protein, etc., or cells expressing these, etc.).
  • antibody-producing cells obtained by allowing an antigen to act in a culture medium on the above-mentioned cells or lymphocytes, etc., previously isolated from an animal that has not been immunized.
  • Various known cell lines can be used as myeloma cells.
  • the antibody-producing cells and myeloma cells may be of different animal species origin as long as they are fusible, but are preferably of the same animal species origin.
  • Hybridomas are produced, for example, by cell fusion between spleen cells obtained from a mouse immunized with an antigen and mouse myeloma cells, and then screening can be performed to obtain hybridomas that produce monoclonal antibodies that recognize HLA-DR.
  • Monoclonal antibodies that recognize HLA-DR can be obtained by culturing hybridomas or from the ascites of a mammal to which the hybridoma has been administered.
  • the recombinant DNA method is a technique in which DNA encoding the antibody of the present invention is cloned from hybridomas or B cells, etc., incorporated into an appropriate vector, and then introduced into host cells (e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, E. coli, yeast cells, insect cells, plant cells, etc.) to produce the antibody of the present invention as a recombinant antibody (e.g., P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Vandamme A. M. et al., Eur. J. Biochem.
  • host cells e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, E. coli, yeast cells, insect cells, plant cells, etc.
  • host cells e.g., mammalian cell lines such as HEK cells, E. coli, yeast cells, insect cells
  • the DNA encoding the heavy chain or the light chain may be separately incorporated into an expression vector to transform the host cell, or the DNA encoding the heavy chain and the light chain may be incorporated into a single expression vector to transform the host cell (see WO 94/11523).
  • the antibody of the present invention can be obtained in a substantially pure and homogenous form by culturing the host cell and isolating and purifying it from within the host cell or the culture medium.
  • the antibody can be isolated and purified by a method used for the purification of ordinary polypeptides.
  • transgenic animal production technique is used to produce a transgenic animal (cow, goat, sheep, pig, etc.) into which an antibody gene has been incorporated, it is also possible to obtain a large amount of monoclonal antibodies derived from the antibody gene from the milk of the transgenic animal.
  • the present invention can also provide DNA encoding the antibody of the present invention, a vector containing the DNA, a host cell harboring the DNA, and a method for producing the antibody, comprising culturing the host cell and recovering the antibody.
  • HLA-DR which is the target of the antibody of the present invention
  • the variable region of the antibody of the present invention is useful in chimeric antigen receptors (CARs) and T cells expressing the same (so-called CAR-Ts).
  • CARs chimeric antigen receptors
  • T cells expressing the same
  • the present invention may take the form of a CAR comprising an antibody that binds to HLA-DR or its variable region, a transmembrane region, and an intracellular signal region.
  • chimeric antigen receptor refers to a chimeric protein in which an extracellular domain that binds to HLA-DR, a transmembrane domain, and an intracellular signal domain are arranged in that order from the N-terminus and linked directly or indirectly.
  • the "region that binds to HLA-DR (antigen-binding region)" can be, for example, the above-mentioned antibody or a functional fragment thereof, but typically, an scFv is used for CAR.
  • an "scFv” is a structure in which the light chain variable region and heavy chain variable region of a monoclonal antibody (immunoglobulin) are linked via a linker, and retains the ability to bind to an antigen.
  • the order on the N-terminal side of the scFv may be light chain variable region, linker, heavy chain variable region, or heavy chain variable region, linker, light chain variable region.
  • a peptide linker can be used as the "linker” in scFv.
  • the length of the linker is not particularly limited.
  • a linker having 5 to 25 amino acids can be used.
  • the length of the linker is preferably 8 to 25 amino acids, more preferably 15 to 20 amino acids.
  • Suitable examples of peptide linkers include peptide linkers containing glycine or glycine and serine (GGS linker, GS linker, GGG linker, Whitlow/218 linker, etc.).
  • the amino acids glycine and serine that make up these linkers have the advantage that they are small in size and are less likely to form higher-order structures within the linker.
  • the monoclonal antibody on which the scFv is based is not particularly limited, but examples include the above-mentioned antibodies derived from non-human animals, human antibodies, and humanized antibodies. Preferred examples are as described above.
  • the "transmembrane domain” is not particularly limited as long as it is a polypeptide that has the function of penetrating a cell membrane and can anchor the CAR to the cell membrane.
  • proteins from which the polypeptide carrying the membrane domain is derived include CD28, CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , 4-1BB, CD45, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR, and the ⁇ and ⁇ chains of the T cell receptor.
  • the "intracellular signal region” is a region that is arranged inside a cell when the CAR is arranged on the cell membrane, and is capable of transmitting a signal necessary for the immune cell to exert its effector function, that is, a region that is capable of transmitting a signal (so-called primary signal) necessary for activating the immune cell when the antigen-binding region binds to an antigen (HLA-DR).
  • Such intracellular signal regions generally include those that have only an activation signaling domain such as a T cell receptor (TCR) and a CD3 complex (first generation CAR), those that have a costimulatory signaling domain derived from a costimulatory molecule in addition to an activation signaling domain (e.g., the intracellular domain of CD28 or 4-1BB) (second generation CAR), and those that have multiple costimulatory signaling domains in addition to an activation signaling domain (e.g., the intracellular domains of CD28 and 4-1BB) (third generation CAR). Also included are those that include a CD79A intracellular region and a CD40 intracellular region (see Mol Ther 2021 Sep 1; 29 (9): 2677-2690).
  • the "intracellular signal region” may be capable of transmitting a primary signal, and may be an activation signaling domain of a protein involved in the signal.
  • Primary signaling is known to involve immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs).
  • ITAMs immunoreceptor tyrosine-based activation motifs
  • proteins that have ITAMs include CD3 ⁇ , FcR ⁇ , FcR ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, DAP10, and DAP12.
  • the number of intracellular signal regions contained in a CAR is not limited to one, and the CAR may contain multiple intracellular signal regions (for example, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2 signal transduction factors). In this case, the multiple intracellular signal regions contained may be the same or different.
  • the CAR of the present invention may contain other domains in addition to the above-mentioned antigen-binding domain, transmembrane domain, and intracellular signal domain.
  • other domains include, but are not limited to, costimulatory domains, spacer sequences, signal peptides, etc.
  • Co-stimulatory molecules expressed on T cells are known to transmit costimulatory signals intracellularly by binding to ligands specific to each costimulatory molecule expressed on antigen-presenting cells, thereby assisting in T cell activation (secondary signal transduction).
  • the term "co-stimulatory transmission region" refers to an intracellular domain involved in the costimulatory signal transduction of the above-mentioned costimulatory molecules.
  • costimulatory molecules include CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), ICOS, CD2, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD154, etc.
  • the CAR of the present invention can include the costimulatory transmission regions of these costimulatory molecules.
  • the number of costimulatory transmission regions that the CAR of the present invention may contain is not limited to one, and may be multiple.
  • the CAR of the present invention may contain, for example, 1 to 5, 1 to 3, or 1 or 2 costimulatory transmission regions.
  • the regions may be the same or different.
  • spacer refers to a sequence that links each region, etc., and is not particularly limited as long as it does not suppress the function of each region, and the number of amino acids is also not particularly limited, but it is usually 1 to 500 amino acids, preferably 5 to 300 amino acids, and more preferably 10 to 100 amino acids.
  • the spacer sequence is not particularly limited, but may be, for example, the sequence of the hinge region or a part thereof of IgG, preferably human IgG (e.g., subtypes IgG1 and IgG4), the hinge region and a part of CH2, or a part of a factor used in a transmembrane domain (e.g., CD28).
  • IgG preferably human IgG
  • CH2 a part of a factor used in a transmembrane domain
  • CD28 transmembrane domain
  • a "signal peptide” refers to a peptide for promoting secretion of CAR or directing localization to the cell membrane, and is also referred to as a leader sequence.
  • the signal peptide can usually be directly or indirectly bound to the N-terminus of the antigen-binding region.
  • the signal peptide may be cleaved from the antigen-binding region during cell processing and localization of the CAR to the cell membrane.
  • signal peptides examples include signal peptides of immunoglobulins (IgK, etc.), human GM-CSF receptor, ⁇ -chain and ⁇ -chain of T-cell receptor, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3 ⁇ , CD28, CD3 ⁇ , CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR, etc.
  • IgK immunoglobulins
  • human GM-CSF receptor ⁇ -chain and ⁇ -chain of T-cell receptor
  • the regions, etc. in the CAR of the present invention can appropriately obtain the specific amino acid sequences of these regions, etc. by searching known literature or databases such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). Furthermore, specific sequences are also disclosed in the sequence table of the present application. Furthermore, the regions, etc. of the present invention are not limited to such typical amino acid sequences (e.g., NCBI reference sequences), and may also include variants and homologues of these typical amino acid sequences as long as the functions carried out by the regions are maintained. Furthermore, such variants and homologues usually have high homology or identity to the typical amino acid sequences.
  • the high homology or identity is usually 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and even more preferably 90% or more (e.g., 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the CAR of the present invention may be a molecule consisting of one type of polypeptide, or may be a molecule consisting of a complex of two or more types of polypeptides.
  • the CAR of the present invention may be a molecule consisting of a polypeptide or a complex thereof, or may be a molecule consisting of a polypeptide or a complex thereof linked to another substance (e.g., a fluorescent substance, a radioactive substance, an inorganic particle, etc.).
  • the CAR of the present invention may be chemically modified.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO-), an amide (-CONH 2 ), and an ester (-COOR).
  • examples of R in the ester include C1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and n-butyl; C3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl; C6-12 aryl groups such as phenyl and ⁇ -naphthyl; C1-2 phenyl-C1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C7-14 aralkyl groups such as ⁇ -naphthyl-C1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; and pivaloyloxymethyl groups.
  • C1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and n-butyl
  • C3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl
  • C6-12 aryl groups such
  • a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus may be amidated or esterified.
  • ester examples include the above-mentioned C-terminal esters.
  • the polypeptide constituting the CAR of the present invention also includes one in which the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group (e.g., a C1-6 acyl group such as a formyl group, a C1-6 alkanoyl group such as an acetyl group), one in which the N-terminal glutamine residue which may be generated by cleavage in the body is pyroglutamated, and one in which a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (e.g., -OH, -SH, an amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) is protected with an appropriate protecting group (e.g., a C1-6 acyl group such as a C1-6 alkanoyl group such as a formyl group, an acetyl group, etc.).
  • a protecting group e.g., a C1-6 acyl group such as a formy
  • the CAR of the present invention may also have other functional proteins.
  • functional proteins There are no particular limitations on the other functional proteins, and they are appropriately selected depending on the function to be imparted to the CAR of the present invention.
  • functional proteins used to facilitate purification and detection of the CAR include Myc tags, His tags, HA tags, FLAG tags (registered trademark, Sigma-Aldrich), fluorescent protein tags (GFP, etc.), etc.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be in the form of a pharma- ceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharma- ceutically acceptable salt, and both acid salts and basic salts can be used.
  • acid salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; organic acid salts such as acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, malate, citrate, methanesulfonate, and paratoluenesulfonate; and amino acid salts such as aspartate and glutamate.
  • Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; and alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharma- ceutically acceptable, and examples of the solvent include water, ethanol, glycerol, and acetic acid.
  • the CAR of the present invention can be constructed by referring to these reports.
  • specific sequences and the like are shown in the examples described later, so the CAR of the present invention can also be constructed by referring to these.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the CAR of the present invention.
  • Information on the nucleotide sequence encoding the antigen-binding region such as scFv can be obtained, for example, by analyzing the nucleotide sequence of a hybridoma producing the monoclonal antibody on which the CAR is based.
  • nucleotide sequences encoding each region, etc., of the CAR of the present invention other than the antigen-binding region by searching known literature or databases such as NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).
  • the nucleotide sequences encoding the above-mentioned regions, etc. are not limited to known ones, and any nucleotide sequence encoding each of the above-mentioned regions, etc. can be used. Due to the degeneracy of the genetic code, there are multiple codons corresponding to one amino acid. Therefore, there are many nucleotide sequences that encode the same amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention may be any of multiple nucleotide sequences generated by the degeneracy of the genetic code, so long as it encodes the CAR of the present invention. Furthermore, in order to optimize expression in cells expressing CAR, the codons selected to encode amino acids in the nucleotide sequences encoding each region, etc. of the CAR of the present invention may be modified.
  • a person skilled in the art can prepare polynucleotides encoding each region, etc., using known techniques such as a chemical synthesis method (phosphoramidite method, etc.) or a PCR amplification method. Furthermore, a polynucleotide encoding the CAR of the present invention can be obtained by linking the polynucleotides encoding each region, etc. obtained in this manner, directly or via a spacer. Note that linking of polynucleotides encoding each region, etc. can be performed using known methods such as overlap extension PCR, as shown in the examples described later.
  • the present invention provides a vector comprising the above-mentioned polynucleotide.
  • the vector of the present invention may be linear or circular, and includes, for example, a virus vector, a plasmid vector, an episomal vector, an artificial chromosome vector, and a transposon vector.
  • viral vectors examples include retroviral vectors such as lentivirus, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, Sindbis virus vectors, rhabdovirus vectors, paramyxovirus vectors, and orthomyxovirus vectors.
  • retroviral vectors such as lentivirus, Sendai virus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, Sindbis virus vectors, rhabdovirus vectors, paramyxovirus vectors, and orthomyxovirus vectors.
  • plasmid vectors include plasmid vectors for expression in animal cells, such as pcDNA3.1, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, and pcDNAI/Neo.
  • Episomal vectors are vectors that can autonomously replicate outside of a chromosome. Specific means for using episomal vectors are known (see Yu et al., Science, 2009, 324, pp. 797-801). Examples of episomal vectors include vectors that contain sequences necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40, etc. as vector elements. Specific examples of vector elements necessary for autonomous replication are a replication origin and a gene that encodes a protein that binds to the replication origin and controls replication, such as the replication origin oriP and EBNA-1 gene for EBV, and the replication origin ori and SV40LT gene for SV40.
  • artificial chromosome vectors examples include YAC (Yeast artificial chromosome) vectors, BAC (Bacterial artificial chromosome) vectors, and PAC (P1-derived artificial chromosome) vectors.
  • retroviral vectors are preferred because they allow for efficient gene transfer even into slowly growing cells and allow for the ease of establishing stable expression strains.
  • the vector of the present invention may also contain expression control sequences such as a promoter, an enhancer, a polyA addition signal, and a terminator, a nucleotide sequence encoding a replication origin or a protein that binds to the replication origin and controls replication, and nucleotides encoding other proteins.
  • expression control sequences such as a promoter, an enhancer, a polyA addition signal, and a terminator, a nucleotide sequence encoding a replication origin or a protein that binds to the replication origin and controls replication, and nucleotides encoding other proteins.
  • the polynucleotides encoding the above-mentioned CAR and the nucleotides encoding other proteins described below can be operably positioned downstream of a promoter to efficiently transcribe each polynucleotide.
  • promoters include the CMV (cytomegalovirus) promoter, the SR ⁇ promoter, the SV40 early promoter, retroviral LTR, the Rous sarcoma virus (RSV) promoter, the HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter, the EF1 ⁇ promoter, the metallothionein promoter, and the heat shock promoter.
  • Nucleotides encoding other proteins include, for example, marker genes such as fluorescent protein genes, reporter genes, and drug resistance genes, and genes encoding molecules involved in T cell activation such as cytokines. Further examples include EGFR without an intracellular domain (truncated EGFR, tEGFR), as shown in the examples below.
  • marker genes such as fluorescent protein genes, reporter genes, and drug resistance genes
  • genes encoding molecules involved in T cell activation such as cytokines.
  • Further examples include EGFR without an intracellular domain (truncated EGFR, tEGFR), as shown in the examples below.
  • tEGFR truncated EGFR
  • the other proteins can be expressed polycistronically together with the above-mentioned CAR.
  • the vector of the present invention may contain a suicide gene as a "nucleotide encoding another protein.”
  • suicide genes include herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) and inducible caspase 9 (iCasp9).
  • drugs that activate the functions of such genes include ganciclovir for HSV-TK and AP1903, a chemical induction of dimerization (CID) compound for iCasp9 (Cooper LJ et al., Cytotherapy. 2006; 8(2): pp.
  • the present invention provides a cell expressing the CAR of the present invention.
  • the cell of the present invention can be obtained by introducing a polynucleotide or vector encoding the above-mentioned CAR of the present invention into a cell.
  • the "cells" into which the polynucleotide or vector of the present invention is introduced are preferably cells derived from a mammal, and for example, cells derived from humans or cells derived from non-human mammals such as rodents (mouse, rat, etc.), cows, sheep, horses, dogs, pigs, monkeys, etc., can be used.
  • the type of cells is not particularly limited, and cells collected from body fluids such as blood and bone marrow fluid, tissues such as the spleen, thymus, lymph nodes, tumors, cancerous ascites, etc., can be used.
  • a preferred example of a cell for expressing CAR is an immune cell.
  • Immuno cells include CD4 positive CD8 negative T cells, CD4 negative CD8 positive T cells, T cells, ⁇ -T cells, ⁇ -T cells, NK cells, NKT cells, etc.
  • Such immune cells include those prepared from pluripotent stem cells such as iPS cells.
  • various cell populations can be used as long as they contain lymphocytes or precursor cells as described above.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells collected from peripheral blood are also an example of immune cells.
  • CAR-expressing cells may be activated before the introduction of the polynucleotide of the present invention.
  • CAR-expressing cells can be activated by stimulating them with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. More specifically, stimulation with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies can be added by culturing the cells in a culture vessel (e.g., a culture dish) whose culture surface is coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Such stimulation can also be performed using magnetic beads coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies (e.g., Dynabeads T-Activator CD3/CD28 provided by VERITAS).
  • a tyrosine kinase inhibitor may be added to the medium during the production of the cells.
  • An example of such a tyrosine kinase inhibitor is dasatinib.
  • a culture medium containing a T cell growth factor may be used during activation treatment.
  • IL-2, IL-15, IL-7, etc. can be used as the T cell growth factor.
  • IL-2, IL-15, IL-7, etc. can be prepared according to standard methods. Commercially available products can also be used. Although the use of T cell growth factors from animal species other than human is not excluded, T cell growth factors of human origin (which may be recombinant) are usually used.
  • the cells after introduction of the polynucleotide of the present invention are grown.
  • the cells into which the polynucleotide of the present invention has been introduced are cultured (subcultured as necessary) using a culture medium to which a T cell growth factor has been added.
  • a treatment (reactivation) similar to that used in the activation of the cells for expressing CAR may be performed.
  • a medium containing added serum (human serum, fetal bovine serum, etc.) may be used, but by using a serum-free medium, it is possible to prepare cells that have the advantages of being highly safe for clinical application and being less susceptible to differences in culture efficiency due to differences between serum lots.
  • serum it is preferable to use autologous serum, i.e., serum collected from the subject who will receive the cells of the present invention.
  • the cells of the present invention may also be cells in which the function of a protein (such as an immune checkpoint substance) that suppresses excessive immune responses is suppressed.
  • a protein such as an immune checkpoint substance
  • proteins include Programmed Death 1 (PD-1), PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, etc.), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 or CD270), KIR, A2aR, MHC class I, MHC class II, and GAL9.
  • PD-1 Programmed Death 1
  • CEACAM CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, etc.
  • LAG-3 VISTA
  • BTLA TIGIT
  • the cells of the present invention may also be cells in which the functions of endogenous proteins such as TCR and HLA are suppressed in order to facilitate allogeneic transplantation.
  • Methods for suppressing the function of a protein include a knockout method that targets a gene encoding the protein, a method that uses dsRNA (double-stranded RNA, for example, siRNA) that is complementary to the transcription product of the gene, a method that uses antisense RNA that is complementary to the transcription product, and a method that uses RNA with ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product.
  • dsRNA double-stranded RNA, for example, siRNA
  • antisense RNA that is complementary to the transcription product
  • RNA with ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product.
  • genome editing which is a method of modifying a target gene using a site-specific nuclease (for example, zinc finger nuclease (ZFN), transcription activation-like effector nuclease (TALEN), DNA double-strand cleavage enzyme such as CRISPR-Cas9), is also preferably used to suppress the function of the substance.
  • a site-specific nuclease for example, zinc finger nuclease (ZFN), transcription activation-like effector nuclease (TALEN), DNA double-strand cleavage enzyme such as CRISPR-Cas9
  • Methods for introducing the polynucleotide or vector of the present invention into cells include lipofection, microinjection, calcium phosphate, DEAE-dextran, electroporation, and particle gun methods.
  • the vector of the present invention is a retrovirus vector
  • appropriate packaging cells may be selected based on the LTR sequence and packaging signal sequence possessed by the vector, and used to prepare retrovirus particles. Examples of packaging cells include PG13, PA317, GP+E-86, GP+envAm-12, and Psi-Crip. 293 cells and 293T cells, which have high transfection efficiency, can also be used as packaging cells.
  • the expression of CAR in the cell can be confirmed by known methods such as flow cytometry, RT-PCR, Northern blotting, Western blotting, ELISA, and fluorescent immunostaining.
  • HLA-DR which is the target of the antibody of the present invention
  • HLA-DR is a cell surface antigen specific to blood cancer. Therefore, if immune cells can be directed to blood cancer cells using this antigen as a marker and cytotoxicity or the like can be achieved, this will contribute to the treatment of the disease.
  • An example of an embodiment that enables such immunotherapy is a multispecific antibody.
  • Multispecific antibody refers to a monoclonal antibody that possesses multiple antigen recognition sites and has binding specificity for at least two different antigens.
  • the multispecific antibody retains the above-mentioned antibody of the present invention or a functional fragment thereof and an antigen recognition site on an immune cell.
  • immune cells are not particularly limited and are as exemplified in the above ⁇ Cells expressing chimeric antigen receptors>, but are preferably effector cells from the viewpoint of being able to exert cytotoxicity on target cells such as blood cancer cells.
  • effector cells include NK (natural killer) cells, monocytes, macrophages, eosinophils, etc., and in such cells, antigens that can be recognized by the multispecific antibody of the present invention include stimulatory or inhibitory receptors present on the surface of the cells.
  • examples include CD3, CD16, B7-H4, BTLA, CD4, CD8, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG-3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM-3, VISTA, 4-1BB, NK-expressing KIR, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, and TNFSF9.
  • Preferred embodiments of the multispecific antibodies of the present invention include bispecific antibodies, more specifically BsDb (bispecific diabody), scBsDb (single-chain bispecific diabody), scBsTaFv (single-chain bispecific tandem variable domain), DNL-(Fab)3 (dock-and-lock trivalent Fab), sdAb (single domain antibody), BssdAb (double single-chain complex antibody), knobs-into-holes BsAb IgG, Ig-scFv fusion type, diabody-Fc fusion type, and dual variable domain antibody (DVD-IgG).
  • bispecific antibodies can be prepared by those skilled in the art by using appropriate known techniques.
  • known techniques include a method (quadroma method) in which a hybridoma producing an antibody that recognizes HLA-DR and a hybridoma producing an antibody that recognizes immune cells are further fused to produce the antibody from the fused cells.
  • Another example is a method in which functional fragments (e.g., Fab) of these different antibodies are chemically crosslinked.
  • Still another example is a method in which DNAs encoding functional fragments of these different antibodies are fused via a linker, the resulting DNA construct is introduced into a host cell, and the antibody is produced from the cell.
  • Knob-into-Hole (Genentech), Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), CrossMAb (Roche), electrostatic-matched (Amgen), LUZ-Y (Genentech), Strand Exchange Engineered Domain body (SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) Duo
  • methods include a method for promoting heterodimerization of different antibodies or functional fragments thereof, such as Fab-Arm Body (GenmabA/S), the controlled Fab-Arm exchange method (CFAF method) described in WO 2008/119353, WO 2011/131746, and the method described in Chengbin, Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig TM ) Molecule, Springer Nature Experiments, 2010.
  • HLA-DR which is the target of the antibody of the present invention
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the "drug” that can be conjugated to the antibody is not particularly limited, and examples include cytotoxic substances known in the art.
  • cytotoxic substances include anticancer agents, for example, irinotecan (CPT-11), irinotecan metabolite SN-38 (10-hydroxy-7-ethylcamptothecin), alkylating agents such as adriamycin, taxol, 5-fluorouracil, nimustine, laministine, temozolomide, and the like, metabolic antagonists such as gemcitabine and hydroxycarbamide, plant alkaloids such as etoposide and vincristine, anticancer antibiotics such as mitomycin and bleomycin, platinum preparations such as cisplatin, molecular targeted agents such as sorafenib and erlotinib, methotrexate, cytosine arabinoside, 6-thioguanine, 6-mercaptopurine, cyclo
  • anticancer agents for example,
  • the cytotoxic substance may also include radioisotopes such as 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, 186 Re, 188 Re, 10 B, 111 In, and 90 Y.
  • the cytotoxic substance may be a photosensitive substance that exerts cytotoxic activity, more specifically, a substance that is activated by light irradiation and changes into a form that exhibits cytotoxicity (cytotoxicity), or may be a substance that produces a cytotoxic substance (cytotoxic substance).
  • cytotoxic substance may include toxic peptides such as ribosome inactivating proteins (RIPs) such as saporin, ricin, and Shiga poison.
  • RIPs ribosome inactivating proteins
  • the antibody and the cytotoxic substance can also be bound by a method known in the art, and may be bound directly or indirectly.
  • a covalent bond can be used as a direct bond.
  • a linker-mediated bond can be used as an indirect bond.
  • General techniques regarding linkers are described, for example, in Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; Harris, J. M. and Zalipsky, S. (eds.), Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series, 1997; Veronese, F. and Harris, J. M. This is described in Peptide and Protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Review 54(4), 2002.
  • the linker may be a linear linker (divalent linker) or a branched linker (trivalent or higher linker).
  • compositions e.g., anticancer agents
  • the present invention also provides pharmaceutical compositions (e.g., anticancer agents) containing, as an active ingredient, the antibody of the present invention or a variable region thereof, or an antibody construct carrying same (such as the above-mentioned cells expressing a chimeric antigen receptor, a multispecific antibody, or an antibody-drug conjugate (ADC); hereinafter, also simply referred to as "the antibody of the present invention, etc.”), as well as methods for treating diseases (e.g., blood cancers such as acute myeloid leukemia) comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the antibody of the present invention, etc., to a subject.
  • diseases e.g., blood cancers such as acute myeloid leukemia
  • the "disease” targeted by the present invention is not particularly limited as long as it is a disease related to cells that retain HLA-DR as a specific surface antigen, but examples include blood cancer, and more specifically, acute myeloid leukemia and its related diseases (myelodysplastic syndrome (MDS), acute lymphocytic leukemia (ALL), B-cell malignant lymphoma, multiple myeloma, etc.).
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • B-cell malignant lymphoma multiple myeloma, etc.
  • Blood cancer may be a primary cancer, a recurrent cancer, a secondary cancer, or a metastatic cancer.
  • AML acute myeloid leukemia
  • AML AML
  • the "pharmaceutical composition" of the present invention may contain other pharmacologically acceptable components in addition to the antibody of the present invention.
  • examples of such other components include carriers, emulsifiers, wetting agents, pH buffering agents, culture media, excipients, disintegrants, buffering agents, isotonicity agents, suspending agents, solubilizers, soothing agents, stabilizers, preservatives, and antiseptics.
  • examples of other pharmacologically acceptable components in the case of liquid preparations such as injections include aqueous solutions (physiological saline, water for injection, phosphate buffer, aqueous glucose solution, aqueous glycerol solution, etc.), aluminum hydroxide, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of a kit in which the above components can be mixed before administration.
  • it when used as an injection, it may be in a form introduced into a syringe.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain only the antibody etc. of the present invention as an active ingredient, or may contain the antibody etc. and at least one other anticancer agent.
  • the antibody etc. of the present invention may also be administered together with another anticancer agent, thereby enhancing the antitumor effect.
  • the other anticancer agent used for such a purpose may be administered to the subject simultaneously with the antibody etc. of the present invention, separately or consecutively, or may be administered at different administration intervals.
  • anticancer drugs include venetoclax, azacitidine, dasatinib, cytarabine (Ara-C, Cytosar-U), enocitabine, quizartinib (AC220), sorafenib (BAY 43-906), lestaurtinib (CEP-701), midostaurin (PKC412), carboplatin, carmustine, chlorambucil, dacarbazine, ifosfamide, lomustine, mechlorethamine, procarbazine, pentostatin, (2' deoxycoformycin), etoposide, teniposide, topotecan, vinblastine, vincristine, paclitaxel, dexamethasone, methylprednisolone, prednisone, all-trans retinoic acid, trioxide,
  • antitumor agent include arsenic, interferon ⁇ , rituximab
  • a pharmaceutical composition containing the cells of the present invention other components may be included, such as dimethyl sulfoxide (DMSO) or serum albumin for the purpose of protecting the cells, and antibiotics for the purpose of preventing bacterial contamination.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • antibiotics for the purpose of preventing bacterial contamination.
  • cytokines, growth factors, T cell activating factors such as steroids, vitamins, immunostimulants, and immune checkpoint inhibitors may be included, and the cells of the present invention may be used in combination with these other components.
  • the method of administration of a pharmaceutical composition varies depending on the type of substance to be administered, the form of the composition, and the age, weight, sex, and health condition of the subject, but can be administered either parenterally (e.g., intravenous administration, arterial administration, local administration) or orally.
  • parenterally e.g., intravenous administration, arterial administration, local administration
  • the preferred administration method is parenteral administration, and more preferably intravenous administration.
  • Local administration may also be used instead of systemic administration.
  • An example of local administration is direct injection into the target tissue (bone marrow, etc.).
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the age, weight, sex, health condition, and degree of progression of symptoms of the subject, as well as the components of the pharmaceutical composition to be administered.
  • the administration schedule may also be adjusted appropriately depending on these conditions, and may be administered once or multiple times continuously or periodically.
  • the dosage when an antibody is administered intravenously, the dosage is 0.1 to 1000 mg, preferably 1 to 100 mg, per kg of body weight per day for an adult.
  • the dosage is 0.001 to 1000 mg, preferably 0.01 to 100 mg, per kg of body weight per day for an adult, calculated in terms of the amount of drug contained.
  • the frequency of administration of these antibodies or ADCs may be, for example, once, or multiple times at intervals of once a day to once a year (for example, once a week, every 10 to 30 days, once a month, every 3 to 6 months, every six months, or once a year).
  • the dosage of cells (e.g., cells expressing a chimeric antigen receptor) in the treatment method of the present invention can be, for example, 1x10 3 to 1x10 10 cells (preferably 1x10 4 to 1x10 9 cells, more preferably 1x10 5 to 1x10 8 cells) per kg of body weight in a single administration to an adult.
  • the administration interval can be, for example, once a week, every 10 to 30 days, once a month, every 3 to 6 months, once a year, etc.
  • the cells of the present invention can grow autonomously in the body of the subject to be administered, they can be administered only once.
  • the number of cells of the present invention in the body after administration can be monitored, and the administration time can be determined depending on the results.
  • the "subject" to which the antibody or the like of the present invention is administered may be, for example, a human suffering from blood cancer or the like, a human at risk of recurrence of blood cancer or the like, or a human who has recurred from blood cancer or the like.
  • “treatment” includes alleviating (alleviating) symptoms characteristic of blood cancer or the like or accompanying symptoms, preventing or delaying the worsening of symptoms, improving abnormalities in clinical test results such as an increase in blood cancer cells, and the like. Furthermore, it also includes preventing, delaying, or reducing the risk of recurrence of blood cancer.
  • the antibodies and the like of the present invention can show allele specificity for HLA-DR, in cases where a recipient (such as a patient with blood cancer) has a positive HLA-DR type to which the antibodies and the like of the present invention bind, and the donor has a negative HLA-DR type to which the antibodies and the like of the present invention do not bind, in cases where the recipient's (such as a patient with blood cancer) HLA-DR type is a positive type to which the antibodies and the like of the present invention bind, and the donor's HLA-DR type is a negative type to which the antibodies and the like of the present invention do not bind, CAR-T cells and the like made from cells derived from the transplanted patient or the donor can specifically attack the recipient's blood cancer.
  • the antibody of the present invention only binds to some normal blood cells such as B cells, and does not bind to monocytes, etc., and only binds to a portion of hematopoietic stem cells, which are the source of all blood cells. Therefore, even if normal autologous CAR-T cells, etc., are used in treatment of blood cancer patients who have positive HLA-DR to which the antibody of the present invention binds, blood cancer cells are eliminated and normal hematopoiesis is maintained by negative cells to which the antibody of the present invention does not bind, making it possible to treat the patient.
  • Bone marrow from acute myeloid leukemia (AML) patients was collected from the iliac bone after obtaining informed consent.
  • Mononuclear cells were isolated using Ficoll Paque (GE Healthcare) and used for analysis.
  • AML cell lines (KG1a, THP-1, U937, HL60, MOLM-13) were injected into the soles of 6-week-old BALB/c mice (CLEA Japan) for immunization. After four immunizations, lymphocytes collected from popliteal lymph nodes and SP2/0 mouse myeloma cells were fused using PEG1500 (Roche Applied Science), and then the cells were seeded in a 96-well plate in HAT medium to select hybridomas.
  • the AML cell lines were first reacted with monoclonal antibodies in each hybridoma supernatant, and then reacted with PE-labeled anti-mouse IgG antibody (BioLegend 405307) and analyzed by flow cytometry.
  • PE-labeled anti-mouse IgG antibody BioLegend 405307
  • flow cytometry Next, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy individuals were stained in the same manner, and hybridomas producing monoclonal antibodies that do not bind to normal blood cells were selected. The cells and supernatants were then preserved and used for subsequent analysis.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs derived from healthy subjects were stimulated at 1 ⁇ 10 6 /ml in the presence of 3 ⁇ g/ml PHA for 3 days.
  • Daudi cells expressing Cas9 protein were first infected with a Cas9-expressing lentiviral vector, 10 ⁇ g/ml of blasticidin was added for 4 days to select cells into which the vector had been introduced, and single-cell sorting was then performed on a 96-well plate. After amplifying them, a clone with good knockout efficiency was selected by introducing a Cas9 reporter (see Tzelepis K et al., Cell Rep. 2016; 17 (4): 1193-205.).
  • gRNA guide RNA
  • HLA-DRB1*1454 (KG2032 positive) and HLA-DRB1*1502 (KG2032 negative) were created by overlapping PCR.
  • the created chimeras were transfected into K562 cells using a retroviral vector, and two days later, the cells were stained with KG2032 and L243, and the presence or absence of binding was analyzed by flow cytometry.
  • CARs Chimeric Antigen Receptors
  • KG2032-CAR expression vector also referred to as "KG2032-CD28-CD3 ⁇ -CAR” and "KG2032-BBz-CAR", respectively.
  • KG2032-CD28-CD3 ⁇ -CAR also referred to as "KG2032-CD28-CD3 ⁇ -CAR” and "KG2032-BBz-CAR", respectively.
  • an EGFR sequence with its intracellular domain deleted was added subsequent to the T2A sequence after CD3 ⁇ of the KG2032-CAR expression vector.
  • CAR-T cells Each KG2032 CAR expression vector was introduced into 293T cells together with a Gag-pol vector and a VSV-G vector using Lipofectamine 2000 (Invitrogen), and the supernatant was collected 48 hours and 72 hours later to prepare a viral vector.
  • PBMCs derived from healthy subjects were stimulated with an anti-CD3 antibody (OKT3, eBioscience) and an anti-CD28 antibody (CD28.2, eBioscience) to prepare activated T cells, which were then infected with the virus-containing supernatant. Thereafter, the CAR-introduced T cells were cultured for 6 days in a medium supplemented with 100 IU/ml of IL-2.
  • Cytokine production of KG2032 CAR-T cells or control T cells was measured using Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit/Human IL-2 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems). Specifically, effector cells and target cells were co-cultured at 1 x 105 cells each in a 96-well plate, and the supernatant after 16 to 24 hours was diluted to fall within the range of the standard curve and measured.
  • the tumor cytotoxicity of T cells was measured by 51Cr release assay. 25 ⁇ Ci of 51Cr sodium chromate solution (PerkinElmer) was added to 5x105 target cells and incubated at 37°C for 1.5h, and 1x104 labeled target cells and effector cells were co-cultured at various effector/target ratios. After 4 hours, 51Cr released into the supernatant was counted using a gamma counter. Total or spontaneously released 51Cr was measured by culturing 1x104 labeled cells in 1% Triton X-100 or medium. The cytotoxic activity was calculated by [(specific 51 Cr release-spontaneous 51 Cr release)/(total 51 Cr release-spontaneous 51 Cr release)] ⁇ 100.
  • KG1a-luc/venus was prepared by introducing a luciferase gene into KG1a cells using a lentivirus vector.
  • 6-8 week old female NOD/SCID/IL-2R ⁇ cnull (NOG) mice (Nippon CLEA) were irradiated with 1.2 Gy radiation, and then 4 ⁇ 10 6 KG1a cells expressing luciferase (KG1a-luc/venus) were injected into the tail vein.
  • NOG NOD/SCID/IL-2R ⁇ cnull mice
  • KG1a-luc/venus expressing luciferase
  • VivoGlo Luciferin Promega, 150 mg/kg body weight
  • images were taken using an in vivo imaging system (IVIS) and analyzed using Living Image software (PerkinElmer).
  • IVIS in vivo imaging system
  • PerkinElmer Living Image software
  • CARs Contastruction and Production of Chimeric Antigen Receptors (CARs) 2
  • the cDNAs of the light and heavy chain variable regions of KG2032 were fused to the cDNAs of CD28 and CD3 ⁇ by overlap PCR. Additionally, the T2A-IL-15 cDNA was also fused to the KG2032 CAR by overlap PCR.
  • CB Cord blood
  • CB Cord blood
  • T cell-depleted CB mononuclear cells were stimulated with 100 Gy irradiated K562-mb15-41BBL cells and cultured in the presence of 20 IU/mL IL-2.
  • retrovirus expressing KG2032 CAR-T2A-IL-15 cDNA was introduced into CB-derived NK cells using RetroNectin. The cells were then restimulated with 100 Gy irradiated K562-mb15-41BBL cells, cultured for another week, and used for further experiments.
  • the tumor cytotoxicity of NK cells was measured by 51Cr release assay. 6x105 target cells were labeled with 25 ⁇ Ci of [ 51Cr ] sodium chromate (PerkinElmer) for 1.5 hours at 37°C. Labeled target cells ( 1x104 ) were incubated with effector cells for 4 hours, and 51Cr release in the harvested supernatant was counted in a gamma counter. Total 51Cr release and spontaneous 51Cr release were measured by incubating 1x104 labeled targets in 1% Triton X-100 or culture medium. The cytotoxic activity was calculated as [(specific 51 Cr release-spontaneous 51 Cr release)/(total 51 Cr release-spontaneous 51 Cr release)] ⁇ 100.
  • CD107a Degranulation Assay KG2032 CAR NK cells or control NK cells (2.5 ⁇ 10 5 cells) were co-cultured with KG1a AML cells or bone marrow cells of an AML patient (5 ⁇ 10 4 cells) in a 96-well plate at an effector:target ratio of 5:1. Anti-CD107a Alexa Fluor 647 (1:50) and monensin (BD Biosciences, 1:1500) were added at the start of the culture. After 5 hours of culture, the cells were stained with anti-CD56-PE and analyzed by flow cytometry. The HLA-DR allele type of the AML patient was DRB1*08:02/12:01.
  • Xenograft Mouse Model 2 Disseminated AML models were established by intravenous implantation of KG1a AML cells into NOD/SCID/IL-2R ⁇ null (NOG) mice (In Vivo Science). 1 ⁇ 10 6 luciferase-expressing KG1a cells were injected intravenously via the tail vein into 6-8 week old female NOG mice (irradiated with 1.0-2.4 Gy 4-24 hours prior to implantation). In experiments using KG2032 CAR NK cells, 1.0-1.4 ⁇ 10 6 KG2032 CAR NK cells or control NK cells were injected 1 and 3 days after AML cell implantation. Tumor growth in mice was measured by measuring the fluorescence emission upon administration of luciferin using IVIS.
  • the cDNA of KG2032 CAR was constructed by fusing the variable region cDNA of KG2032 light chain and heavy chain with CD8 ⁇ , 4-1BB, and CD3 ⁇ cDNA by overlap PCR.
  • a mutation to replace tyrosine in the CD3z ITAM motif in the KG2032 CAR sequence with phenylalanine was introduced using PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (Takara).
  • cytotoxic activity 3 The cytotoxic activity of modified KG2032 CAR-T cells was measured by 51Cr release assay. 6x105 target cells were labeled with 25 ⁇ Ci of [ 51Cr ] sodium chromate (PerkinElmer) for 1.5 hours at 37°C. Labeled target cells ( 1x104 ) were incubated with effector cells for 4 hours, and 51Cr release in harvested supernatants was counted in a gamma counter. Total 51Cr release and spontaneous 51Cr release were measured by incubating 1x104 labeled targets in 1% TritonX-100 or culture medium. Cytotoxic activity was calculated as ([specific 51Cr release-spontaneous 51Cr release]/[total 51Cr release-spontaneous 51Cr release]) x 100.
  • Xenograft Mouse Model 3 A disseminated AML model was established by intravenously implanting KG1a AML cells into NOD/SCID/IL-2R ⁇ null (NOG) mice (In Vivo Science). 1-4 ⁇ 106 luciferase-expressing KG1a cells were injected intravenously via the tail vein into 6-8 week-old female NOG mice (irradiated 4-24 hours prior to implantation with 1.0-2.4 Gy). On day 5, mice were intraperitoneally injected with VivoGlo Luciferin (Promega, 150 mg/kg body weight), and tumor growth was measured by observing tumor fluorescence using an in vivo imaging system (IVIS) with Living Image software (PerkinElmer). Mice were then intravenously injected with 1.1-2.2 ⁇ 10 6 modified KG2032 CAR-T cells or control T cells.
  • IVIS in vivo imaging system
  • Xenograft Mouse Model 4 DNA of AML cells was extracted from the cells using DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). HLA-DRB1 typing was performed at HLA Institute (Kyoto, Japan), and AML cells with KG2032-reactive HLA-DRB1 were used in the experiment.
  • BM cells from AML patients were transplanted into the bone marrow of NOG mice. 6-8 week old female NOG mice were irradiated with 1.2 Gy 4-24 hours before transplantation, and then 4x105 AML cells, from which CD3 positive T cells had been removed, were injected into the left tibia. Six days later, the mice were intravenously injected with 2x106 modified KG2032 CAR-T cells or control T cells.
  • BM cells were stained with anti-human CD45-Cy7APC (2D1, BioLegend), anti-human CD34-APC (8G12, BD Biosciences), anti-human CD3-PE (HIT3a, BioLegend), anti-mouse Ter119-PerCPCy5.5 (Ter-119, BioLegend), and anti-mouse CD45-Cy7PE (30-F11, BioLegend) and analyzed by flow cytometry.
  • anti-human CD45-Cy7APC (2D1, BioLegend
  • anti-human CD34-APC 8G12, BD Biosciences
  • anti-human CD3-PE HIT3a, BioLegend
  • anti-mouse Ter119-PerCPCy5.5 Ter-119, BioLegend
  • anti-mouse CD45-Cy7PE (30-F11, BioLegend
  • AML-specific monoclonal antibody KG2032 To obtain AML-specific monoclonal antibodies (mAbs), first, approximately 14,000 hybridomas secreting monoclonal antibodies (mAbs) that bind to various AML cell lines and AML cells were established from bone marrow (BM) cells of AML patients.
  • mAbs hybridomas secreting monoclonal antibodies
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • KG2032 did not bind to PBMCs from a healthy donor used in screening.
  • Figure 1B KG2032 bound to almost all leukemia cells in 7 out of 14 AML patients.
  • HLA-DRA, HLA-DRB1, CIITA, and CD74 were identified as the molecules targeted by the inserted gRNA that was significantly enriched in the KG2032low cells ( Figure 2C).
  • Figure 2C the binding of KG2032 to Daudi cells in which HLA-DR was deleted was analyzed, and as shown in Figure 2D, no binding was observed, making it clear that the antigen recognized by KG2032 is HLA-DR.
  • Figure 2E it was revealed that the antigen recognized by 8 clones other than KG2032 out of the 32 clones was also HLA-DR.
  • amino acid sequences of the variable regions of these anti-HLA-DR antibodies of the present invention are shown in Tables 1 and 2 below. Furthermore, the amino acid sequences of the CDRs determined by Kabat from these variable regions are shown in Tables 3 and 4.
  • HLA-DRB1 allele specificity recognized by KG2032 Since HLA-DRB1 is a highly polymorphic molecule, we investigated which allele of HLA-DRB1 is recognized. As a result, as shown in Figure 3, KG2032 bound to K562 cells expressing HLA-DRB1*0404, 0405, 0410, 0803, 0901, or 1454. On the other hand, KG2032 did not bind to K562 cells expressing HLA-DRB1*0101, 0403, 0802, 1101, or 1502.
  • KG2032 did not bind to any of the PBMC cells from a donor with the KG2032-negative HLA-DRB1 gene (0403/0802).
  • peripheral blood from a donor with the KG2032-positive HLA-DRB1 gene 0901 was stained, binding to B cells and activated T cells was observed, but the binding was extremely weak compared to that of the existing anti-HLA-DR antibody L243.
  • KG2032 did not bind to some of the monocytes and T cells to which L243 binds, that is, to which HLA-DR is expressed. Also, as shown in Figure 4B, binding of KG2032 to leukemia cells was observed in AML patients with KG2032-positive HLA-DRB1 gene.
  • the amino acid at position 86 in Region 3 must be an amino acid other than aspartic acid (serine, valine, alanine, etc.).
  • a chimeric antigen receptor (KG2032-CAR) containing the variable region of KG2032 was prepared. First, cDNA of the variable region of KG2032 was obtained by 5'RACE using SMARTer RACE 5'/3' Kit (Takara), and the sequence was identified. Next, as shown in FIG.
  • KG2032-CD28-CD3 ⁇ -CAR KG2032-BBz-CAR
  • the KG2032 CAR was introduced into T lymphocytes derived from a KG2032-negative HLA-DRB1 (0403/0802) donor using a retroviral vector to generate KG2032-CAR-T cells ( Figures 8B and 8C).
  • the CAR-T cells prepared in this manner produced IFN- ⁇ and IL-2 and exhibited cytotoxic activity when co-cultured with KG1a cells to which KG2032 binds.
  • cytotoxic activity was observed when co-cultured with THP-1 cells to which KG2032 does not bind.
  • dasatinib a tyrosine kinase inhibitor
  • treatment with 1 ⁇ M dasatinib promoted the proliferation of KG2032-BBz-CAR-T cells while decreasing the expression of exhaustion marker molecules (PD-1, TIM-3, LAG-3).
  • IL-2 cytokine production was increased when co-cultured with KG1a.
  • luciferase-expressing KG1a cells were transferred into NOG mice, and KG2032-BBz CAR-T cells were administered to evaluate their anti-leukemia effect.
  • Figures 8I and J a significant anti-leukemia effect was observed.
  • CAR-NK cells (Development of CAR-NK cells derived from KG2032 non-responsive DR donors) A vector was prepared for co-expressing a chimeric antigen receptor in which CD28 and CD3 ⁇ were fused to the variable region of KG2032, and IL-15. Then, NK cells expressing the chimeric antigen receptor (CAR-NK cells) were prepared and co-cultured with a cell line derived from human acute myeloid leukemia (KG1a cells). As a result, although not shown in the figure, it was revealed that the CAR-NK cells also exhibited cytotoxic activity. Furthermore, it was also revealed that a significant antitumor effect was achieved when the CAR-NK cells were administered to mice transferred with KG1a cells.
  • variable region of KG2032, CD28, and CD3 ⁇ were fused to generate the KG2032 CAR construct for CAR-NK cells.
  • a retroviral vector was designed to co-express IL-15 with KG2032 CAR to enhance the proliferation and survival of CAR-NK cells.
  • T cells were removed from human umbilical cord blood (CB) cells with KG2032-unreactive HLA-DRB1, and NK cells were expanded by stimulation with 4-1BB ligand and irradiated K562 cells expressing membrane-bound IL-15. After 14 days of culture, CB-derived NK cells retrovirally transduced with KG2032 CAR/IL-15 were analyzed ( Figures 9A-9C).
  • CD107a degranulation was significantly increased in KG2032 CAR-NK cells compared to control (non-CAR-transduced) NK cells, but not when co-cultured with HLA-DR-deficient KG1a cells ( Figure 9D).
  • KG2032 CAR-NK cells showed significant cytotoxicity against KG1a cells and primary AML cells derived from patients, but not against HLA-DR-deficient KG1a cells (Figure 9E).
  • the KG2032 CAR construct was modified by changing the order of the heavy (VH) and light (VL) chains in the antigen recognition domain and extending the length of the CD8 ⁇ hinge/transmembrane domain. Furthermore, to weaken the activation signal of the CAR, mutations were introduced into two of the three immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) domains in the CD3 ⁇ sequence (Feucht, J. et al. Calibration of CAR activation potential directs alternative T cell fate and therapeutic potency. Nat Med 25, 82-88 (2019)). The configuration of this modified KG2032 CAR is shown in Table 5.
  • ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • the secretion of IFN- ⁇ by the original or modified KG2032 CAR-T cells after co-culture with KG1a AML cells was analyzed.
  • the secretion of IFN- ⁇ by the modified KG2032 CAR-T cells was reduced compared to that by the original, confirming that the mutation weakened the CAR activation signal.
  • modified KG2032 CAR-T cells were analyzed after co-culture with normal intestinal epithelial cells or KG1a cells purified from normal small intestine obtained from resected specimens of patients with colon cancer.
  • modified KG2032 CAR-T cells were not activated when co-cultured with normal intestinal epithelial cells with KG2032-reactive HLA-DRB1.
  • modified KG2032 CAR-T cells retained cytotoxic activity against KG1a AML cells and primary AML cells derived from patients.
  • Modified KG2032 CAR-T cells were also administered to mice transplanted with KG1a AML cells. As a result, administration of modified KG2032 CAR-T cells significantly reduced the number of KG1a AML cells engrafted in the mice, and extended their survival time. Furthermore, no obvious toxicity was observed in mice treated with modified KG2032 CAR-T cells.
  • the modified KG2032 CAR-T cells were administered to immunodeficient mice transplanted with patient-derived AML cells ( Figure 10A).
  • the modified KG2032 CAR-T cells eradicated the patient-derived AML cells transplanted into the immunodeficient mice ( Figures 10B and 10C). No obvious toxicity was observed in the mice administered with the modified KG2032 CAR-T cells.
  • HLA-DR which is a cell surface antigen specific to blood cancers such as acute myeloid leukemia
  • such antibodies can exhibit allele specificity for HLA-DR, so in the case of a blood cancer patient who has relapsed after HLA-DR mismatched allogeneic transplant, if the recipient's (blood cancer patient's) HLA-DR is a positive type to which the antibody of the present invention binds, and the donor's HLA-DR is a negative type to which the antibody of the present invention does not bind, then CAR-T cells derived from the antibody of the present invention made from donor-derived cells will be able to specifically attack the recipient's blood cancer cells.
  • the antibody of the present invention only binds to some normal blood cells, such as B cells, and does not bind to monocytes, etc., even if normal autologous CAR-T cells, etc., of a blood cancer patient who has positive HLA-DR to which the antibody of the present invention binds are used for treatment, blood cancer cells will be eliminated and normal hematopoiesis will be maintained by negative cells to which the antibody of the present invention does not bind, making treatment possible.
  • the present invention is therefore useful in the development and preparation of therapeutic agents for blood cancer.

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Abstract

ＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体若しくはその機能的断片、前記抗体若しくはその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体、当該キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞、前記抗体若しくはその機能的断片と免疫細胞に対する抗原認識部位とを含む多重特異性抗体、又は、これら抗体等を含む医薬組成物。

Description

血液がんに対する抗体
　本発明は、血液がんに対する抗体に関する。より詳しくは、ＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体又はその機能的断片に関する。本発明はまた、前記抗体若しくはその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体、又は、当該キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞に関する。さらに、本発明は、前記抗体又はその機能的断片と免疫細胞に対する抗原認識部位とを含む、多重特異性抗体に関する。また、本発明は、これら抗体等を含む医薬組成物に関する。
　急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、代表的な血液がんの一つである。化学療法で治癒しない場合、同種造血幹細胞移植の適応となり、それにより多くの人が治癒するが、それでも治せない人は数多く存在する。そのような患者の治癒を目指した一つの有望なアプローチに、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞を用いた免疫療法がある。
　ＣＤ１９　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、再発／難治性のＢ細胞性白血病、悪性リンパ腫に対して著明な効果を上げている（非特許文献１、２）。しかし、ＡＭＬに対して有効性なＣＡＲ－Ｔ細胞はまだ存在しない。これまでに、ＣＤ３３、ＣＤ１２３等を標的としてＡＭＬに対するＣＡＲ－Ｔ細胞が開発されているが、いずれも正常血液細胞の一部において発現が見られるために血液毒性が強いこと等が問題となっている（非特許文献３、４）。
　そのため、ＣＡＲ－Ｔ療法に有用なＡＭＬ特異的細胞表面抗原を探索する試みが、世界中で数多くなされている。しかしながら、トランスクリプトーム解析、あるいはプロテオーム解析といった網羅的方法を用いて精力的になされたにもかかわらず、良い標的は見つかっていない（非特許文献５）。
Ｓｃｈｕｓｔｅｒ　ＳＪ，Ｂｉｓｈｏｐ　ＭＲ，Ｔａｍ　ＣＳ，Ｗａｌｌｅｒ　ＥＫ，Ｂｏｒｃｈｍａｎｎ　Ｐ，ＭｃＧｕｉｒｋ　ＪＰ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ　ｉｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｒｅｌａｐｓｅｄ　ｏｒ　Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　Ｄｉｆｆｕｓｅ　Ｌａｒｇｅ　Ｂ－Ｃｅｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．２０１９；３８０（１）：４５－５６． Ｐａｒｋ　ＪＨ，　Ｒｉｖｉｅｒｅ　Ｉ，Ｇｏｎｅｎ　Ｍ，Ｗａｎｇ　Ｘ，Ｓｅｎｅｃｈａｌ　Ｂ，Ｃｕｒｒａｎ　ＫＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ　Ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ　ｏｆ　ＣＤ１９　ＣＡＲ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　Ａｃｕｔｅ　Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．２０１８；３７８（５）：４４９－５９． Ｗａｎｇ，　Ｑ．Ｓ．，　Ｙ．　Ｗａｎｇ，　Ｈ．Ｙ．　Ｌｖ，　Ｑ．Ｗ．　Ｈａｎ，　Ｈ．　Ｆａｎ，　Ｂ．　Ｇｕｏ，　Ｌ．Ｌ．　Ｗａｎｇ，　ａｎｄ　Ｗ．Ｄ．　Ｈａｎ．２０１５．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣＤ３３－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｏｎｅ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｒｅｌａｐｓｅｄ　ａｎｄ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ａｃｕｔｅ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ．　Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　２３：１８４－１９１． Ｌｏｆｆ，　Ｓ．，　Ｊ．　Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，　Ｊ．Ｅ．　Ｍｅｙｅｒ，　Ｊ．　Ｒｉｅｗａｌｄｔ，　Ｊ．　Ｓｐｅｈｒ，　Ｍ．　ｖｏｎ　Ｂｏｎｉｎ，　Ｃ．　Ｇｒｕｎｄｅｒ，　Ｍ．　Ｓｗａｙａｍｐａｋｕｌａ，　Ｋ．　Ｆｒａｎｋｅ，　Ａ．　Ｆｅｌｄｍａｎｎ，　Ｍ．　Ｂａｃｈｍａｎｎ，　Ｇ．　Ｅｈｎｉｎｇｅｒ，　Ａ．　Ｅｈｎｉｎｇｅｒ，　ａｎｄ　Ｍ．　Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ．２０２０．　Ｒａｐｉｄｌｙ　Ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＣＡＲ－Ｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＣＤ１２３－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ．　Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ　１７：４０８－４２０． Ｐｅｒｎａ　Ｆ，　Ｂｅｒｍａｎ　ＳＨ，　Ｓｏｎｉ　ＲＫ，Ｍａｎｓｉｌｌａ－Ｓｏｔｏ　Ｊ，Ｅｙｑｕｅｍ　Ｊ，Ｈａｍｉｅｈ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ　ｆｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　ＡＭＬ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ．２０１７；３２（４）：５０６－１９　ｅ５． Ｈａｓｅｇａｗａ　Ｋ，Ｉｋｅｄａ　Ｓ，Ｙａｇａ　Ｍ，Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｋ，Ｕｒａｋａｗａ　Ｒ，Ｉｅｈａｒａ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣＤ９８　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ．Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ．２０２２；１４（６３２）：ｅａａｘ７７０６． Ｈｏｓｅｎ　Ｎ，　Ｍａｔｓｕｎａｇａ　Ｙ，Ｈａｓｅｇａｗａ　Ｋ，Ｍａｔｓｕｎｏ　Ｈ，Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｙ，Ｍａｋｉｔａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｂｅｔａ７　ｉｓ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｏｒ　ＣＡＲ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ　Ｍｅｄ．２０１７；２３（１２）：１４３６－４３．
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＡＭＬ等の血液がんに特異的な細胞表面抗原を同定し、当該抗原を認識する抗体又はその機能的断片、及び当該抗体等を用いた血液がんの免疫療法に有効な手段を、提供することを目的とする。
　本発明者らは従前、タンパク質自体はがん特異的でなくても、その翻訳後の変化によって形成されるがん特異的エピトープが免疫療法の標的となり得ることを見出している（非特許文献６、７）。
　そこで、前記目的を達成すべく、ＡＭＬ細胞に結合する抗体を数多く作製し、それらの中からＡＭＬ特異的な抗体を同定し、その認識抗原を同定するというアプローチにより、ＡＭＬ特異的抗体の単離とそれを元にしたＣＡＲ－Ｔ細胞の開発等を、本発明者らは目指した。
　具体的には先ず、ＡＭＬ患者の骨髄（ＢＭ）細胞あるいは様々なＡＭＬ細胞株に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌する約１４，０００のハイブリドーマを確立した。次に、これらｍＡｂから、健常ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＢ細胞以外の細胞には結合しない１，０７８個のｍＡｂを選択した。さらに、ＡＭＬ患者のＢＭ細胞をこれら候補ｍＡｂで染色し、最終的にＡＭＬに特異的に結合するｍＡｂを３２クローン同定した。
　そして、そのうちの１クローン　ＫＧ２０３２に関し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系によって網羅的な遺伝子ノックアウトを行ったリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）に対する結合性の喪失を指標として、前記抗体が認識する抗原の同定を試みた。その結果、ＫＧ２０３２が認識する抗原はＨＬＡ－ＤＲであることが明らかになった。また、前記３２クローンのうち、ＫＧ２０３２とは異なる８クローンの認識する抗原も、ＨＬＡ－ＤＲであることが明らかになった。
　さらに、ＨＬＡ－ＤＲは多型性の高い分子であるため、ＫＧ２０３２は、ＨＬＡ－ＤＲのどのアレルを認識できるのかを調べた。その結果、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５、０４１０、０７０１、０８０３、０９０１、１２０１又は１４５４を発現させた慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２細胞）にＫＧ２０３２は結合する一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１、０３０１、０４０３、０４０４、０８０２、１１０１、１３０１、１３０２、１４０３、１４０５、１４０６、１５０１又は１５０２を発現させたＫ５６２細胞にはＫＧ２０３２は結合しないことが明らかになった。
　また、ＨＬＡ－ＤＲが発現している単球やＴ細胞の一部に対しては、ＫＧ２０３２は結合しないことも明らかになった。
　また、ＫＧ２０３２の可変領域のアミノ酸配列を特定し、当該領域にＣＤ２８及びＣＤ３ζ、又は、ＣＤ８α、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζとを融合させたキメラ抗原受容体を設計した。そして、当該キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を調製し、ヒト急性骨髄性白血病由来の細胞株（ＫＧ１ａ細胞）と共培養させた。その結果、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２といったサイトカインを産生し、また細胞傷害活性を示すことが明らかになった。さらに、ＫＧ１ａ細胞を移入したマウスに、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した結果、顕著な抗腫瘍効果が奏されることを見出した。
　さらに、ＫＧ２０３２の可変領域にＣＤ２８及びＣＤ３ζを融合させたキメラ抗原受容体とＩＬ－１５を共発現させるためのベクターを作製した。そして、当該キメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を調製し、ヒト急性骨髄性白血病由来の細胞株（ＫＧ１ａ細胞）と共培養させた。その結果、前記ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、細胞傷害活性を示すことが明らかになった。さらに、ＫＧ１ａ細胞を移入したマウスに、前記ＣＡＲ－ＮＫ細胞を投与した結果、顕著な抗腫瘍効果が奏されることも見出した。
　これらの結果から、血液がん治療において、ＫＧ２０３２のようなＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体を用いることで、以下のような利用態様（１）及び（２）が可能になり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　（１）抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体を用いることで、ＨＬＡ－ＤＲ不一致同種移植後再発のＡＭＬ患者でレシピエント（白血病患者）のＨＬＡ－ＤＲが該抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体陽性型で、ドナーのＨＬＡ－ＤＲ型が該抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体陰性型である場合には、移植を受けた患者自身あるいはドナー由来Ｔ細胞から作った該抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体由来ＣＡＲ－Ｔ細胞はレシピエントの白血病を特異的に攻撃すると考えられる。
　（２）正常血液細胞においてはＢ細胞など一部の細胞にしか結合せず、また全ての血液細胞の源となる造血幹細胞においてはその一部にしか結合しない抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体を用いることで、該抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体陽性のＨＬＡ－ＤＲ型を有するＡＭＬ患者における通常の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞を治療に用いたとしても、白血病細胞は排除され、正常造血は該抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体陰性細胞で保たれると考えられるので、治療として成立すると考えられる。
　すなわち、本発明は以下の態様を提供する。
　［１］　ＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体又はその機能的断片を含む、血液がんを治療するための組成物。
　［２］　造血幹細胞が移植された血液がん患者に投与される組成物であって、
　ＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体又はその機能的断片を含み、
　前記造血幹細胞の提供者と前記患者とはＨＬＡ－ＤＲのアレル型が異なり、
　前記抗体又はその機能的断片が、前記患者のＨＬＡ－ＤＲに結合し、かつ、前記提供者のＨＬＡ－ＤＲに結合しない、組成物。
　［３］　前記抗体又はその機能的断片が、ＨＬＡ－ＤＲＢを認識する、［１］又は［２］に記載の組成物。
　［４］　前記抗体又はその機能的断片が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１を認識する、［１］又は［２］に記載の組成物。
　［５］　前記抗体又はその機能的断片が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４１０、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４５４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０６、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２からなる群から選択される少なくとも１のＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型に結合する、［１］又は［２］に記載の組成物。
　［６］　前記抗体又はその機能的断片が、８６位がアスパラギン酸以外のアミノ酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型に結合し、かつ、８６位がアスパラギン酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型には結合しない、［１］又は［２］に記載の組成物。
　［７］　前記抗体又はその機能的断片が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４１０、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４５４からなる群から選択される少なくとも１のＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型に結合し、かつ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０５、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０６、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２からなる群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型には結合しない、［１］又は［２］に記載の組成物。
　［８］　前記抗体又はその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体を、発現する免疫細胞を含む、［１］～［７］のうちのいずれか１項に記載の組成物。
　［９］　前記免疫細胞は、前記造血幹細胞の提供者由来の細胞から調製される、［８］に記載の組成物。
　［１０］　前記造血幹細胞の提供者由来の細胞は、多能性幹細胞である、［９］に記載の組成物。
　［１１］　前記抗体又はその機能的断片と免疫細胞に対する抗原認識部位とを保持する、多重特異性抗体を含む、［１］～［７］のうちのいずれか１項に記載の組成物。
　［１２］　前記抗体又はその機能的断片が一部の正常血液細胞に結合しない、［１］～［７］のうちのいずれか１項に記載の組成物。
　［１３］　前記抗体又はその機能的断片が単球に結合しない、［１］～［７］のうちのいずれか１項に記載の組成物。
　［１４］　前記抗体又はその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体を、発現する免疫細胞を含む、［１３］に記載の組成物。
　［１５］　前記抗体又はその機能的断片と免疫細胞に対する抗原認識部位とを含む、多重特異性抗体を含む、［１３］に記載の組成物。
　［１６］　８６位のアミノ酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１の７４～８９位のアミノ酸配列を含む領域に結合し、かつ
　８６位のアミノ酸がアスパラギン酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１の７４～８９位のアミノ酸配列を含む領域には結合しない、ＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体又はその機能的断片。
　［１７］　下記（ａ）～（ｉ）のうちのいずれかの特徴を有する、ＨＬＡ－ＤＲを認識する、抗体又はその機能的断片
（ａ）配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
（ｂ）配列番号：３４～３６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：３８～４０に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
（ｃ）配列番号：４２～４４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：４６～４８に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
（ｄ）配列番号：５０～５２に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：５４～５６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
（ｅ）配列番号：５８～６０に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
（ｆ）配列番号：６６～６８に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
（ｇ）配列番号：７０～７２に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
（ｈ）配列番号：７４～７６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
（ｉ）配列番号：６６～６８に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２、７８及び６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する。
　［１８］　［１６］又は［１７］に記載の抗体又はその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体。
　［１９］　［１６］又は［１７］に記載の抗体又はその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体を発現する、免疫細胞。
　［２０］　［１６］又は［１７］に記載の抗体又はその機能的断片が結合しない、［１９］に記載の免疫細胞。
　［２１］　Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞である、［１９］又は［２０］に記載の免疫細胞。
　［２２］　［１６］又は［１７］に記載の抗体若しくはその機能的断片、又は、［１９］～［２１］のうちのいずれか１項に記載の免疫細胞を含む、医薬組成物。
　［２３］　血液がんを治療するための、［２２］に記載の医薬組成物。
　［２４］　前記免疫細胞は、治療対象である血液がん患者とは異なるヒトに由来する細胞から調製される、［２３］に記載の医薬組成物。
　［２５］　前記免疫細胞は、治療対象である血液がん患者から採取された細胞から調製される、［２３］に記載の医薬組成物。
　［２６］　［２３］に記載の医薬組成物を製造する方法であって、［１６］又は［１７］に記載の抗体又はその機能的断片が結合しない免疫細胞を、［１８］に記載のキメラ抗原受容体を発現させるように改変する工程を含む、方法。
　［２７］　前記免疫細胞は、治療対象である血液がん患者とは異なるヒトに由来する細胞である、［２６］に記載の方法。
　［２８］　前記免疫細胞は、治療対象である血液がん患者から採取された細胞である、［２６］に記載の方法。
　［２９］　前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞である、［２６］～［２８］のうちのいずれか１項に記載の方法。
　本発明によれば、血液がん特異的な細胞表面抗原となるＨＬＡ－ＤＲを標的とすることにより、当該抗原を認識する抗体若しくはその機能的断片、又はそれを保持するキメラ抗原受容体等を用いることにより、前記疾患の治療等が可能となる。
　特に、かかる抗体は、ＨＬＡ－ＤＲに対してアレル特異性を示し得るので、ＨＬＡ－ＤＲ不一致同種移植後再発の血液がん患者で、レシピエント（血液がん患者）のＨＬＡ－ＤＲが本発明の抗体が結合する陽性型で、ドナーのＨＬＡ－ＤＲが本発明の抗体が結合しない陰性型である場合には、多能性幹細胞を含むドナー由来細胞から作った本発明の抗体由来のＣＡＲ－Ｔ細胞等はレシピエントの血液がんを特異的に攻撃することが可能となる。
　また、本発明の抗体が結合する陽性のＨＬＡ－ＤＲを有する血液がん患者における通常の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞等による治療に、本発明の抗体を用いたとしても、血液がん細胞は排除され、正常造血は本発明の抗体が結合しない陰性細胞で保たれ、治療することが可能となる。
健常人末梢血に対するＫＧ２０３２の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。図中、ＴはＴ細胞、ＢはＢ細胞、Ｍｏは単球、Ｎｅｕは好中球を各々示す。 ＡＭＬ検体に対するＫＧ２０３２の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。症例番号（ｕｎｉｑｕｅ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｎｕｍｂｅｒ：ＵＰＮ）１～１４は、各ＡＭＬ患者由来の白血病細胞を示す。 ＣＲＩＳＰＲ　ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ライブラリーを用いた、ＫＧ２０３２が認識する抗原を同定するための工程の概要を示す図である。 図２Ａに示すＣａｓ９発現Ｄａｕｄｉ細胞に対するＫＧ２０３２の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。より具体的には、図２Ａに示すｇＲＮＡライブラリー導入後、ＫＧ２０３２の結合が低下した細胞分画をソーティングした。そのソート前、ソート後の細胞のＫＧ２０３２の結合を解析した結果を示す。 前記ソート後、ソート前の細胞に導入されているｇＲＮＡの頻度をプロットした図である。 ＨＬＡ－ＤＲ分子がノックアウトされたＤａｕｄｉ細胞に対する、ＫＧ２０３２又は既存の抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（Ｌ２４３）の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 ＨＬＡ－ＤＲ分子がノックアウトされたＤａｕｄｉ細胞に対する、ＫＧ２０５３、ＫＧ１９８２、ＫＧ１９１２２、ＫＧ１９１３０、ＫＧ１９２１４、ＫＧ１９８３３、ａＡＭＬ１９１８７０又はａＡＭＬ１９１８７２の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 各種ＨＬＡ－ＤＲＢ１分子を発現させたＫ５６２細胞に対する、ＫＧ２０３２又はＬ２４３の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 ＫＧ２０３２陰性ＨＬＡ－ＤＲＢ１（０４０３／０８０２）を有する健常人（ドナー１）の末梢血各分画、又は、ＫＧ２０３２陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１（０４０３／０９０１）を有する健常人（ドナー２）の末梢血各分画に対する、ＫＧ２０３２又はＬ２４３の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 ＫＧ２０３２陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１を有するＡＭＬ患者骨髄細胞に対する、ＫＧ２０３２の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 ＫＧ２０３２陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１を有する健常人骨髄細胞の各分画に対する、ＫＧ２０３２の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 ＫＧ２０３２のＡＭＬ治療における利用態様の概要を示す図である。 ＫＧ２０３２のＡＭＬ治療における別の利用態様の概要を示す図である。 ＤＲＢ１＊１４５４（ＫＧ２０３２陽性）とＤＲＢ１＊１５０２（ＫＧ２０３２陰性）のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。図中、Ｒｅｇｉｏｎ１～５は、アミノ酸配列において違いの多い領域を各々示す。 ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４５４（ＫＧ２０３２陽性）とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２（ＫＧ２０３２陰性）とを部分的に融合させたキメラタンパク質の概要を示す図である。 前記各種キメラタンパク質を各々発現させたＫ５６２細胞に対する、ＫＧ２０３２又はＬ２４３の結合性を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 各種ＨＬＡ－ＤＲＢ１分子をＫ５６２細胞に発現させた際に、ＫＧ２０３２が結合するものとしないものについて、Ｒｅｇｉｏｎ３のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。 ＤＲＢ１＊０４０５（ＫＧ２０３２陽性）の８６位のアミノ酸セリン（Ｓ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換した変異体をＫ５６２細胞に発現させ、ＫＧ２０３２あるいはＬ２４３の結合を比較した結果を示す図である。 ＫＧ２０３２の可変領域を含むキメラ抗原受容体（ＫＧ２０３２－ＣＡＲ）の概要を示す図である。 ＫＧ２０３２－ＣＡＲの導入率を解析した結果を示す図である。 ＫＧ２０３２－ＣＡＲを発現させたＴ細胞（ＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞）の増殖率を示す、グラフである。図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は遺伝子導入されていないＴ細胞を示す。 ＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞と白血病細胞株　ＫＧ１ａ（ＫＧ２０３２陽性）又はＴＨＰ－１（ＫＧ２０３２陰性）とを２４時間共培養した後、サイトカイン産生を解析した結果を示すグラフである。 ＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞と白血病細胞株ＫＧ１ａ又はＴＨＰ－１とを４時間共培養した後、細胞傷害活性を解析した結果を示すグラフである。 ダサチニブ添加時、非添加時のＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖性を解析した結果を示すグラフである。なお、図８Ｆ以降の図面においては、ＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔとして、図８Ａに示す「ＢＢζ」を用いた結果を示す。 ダサチニブ添加時、非添加時のＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊マーカー（ＰＤ－１，ＬＡＧ－３，ＴＩＭ－３）の発現を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 ダサチニブ添加時、非添加時の、ＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞とＫＧ１ａ細胞との共培養における、ＩＬ－２産生を解析した結果を示すグラフである。 ルシフェラーゼ発現ＫＧ１ａ細胞をＮＯＧマウスに移植した異種移植モデルにおける、ＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞投与の効果を、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）によって生物発光を検出して解析した結果を示す図である。 ルシフェラーゼ発現ＫＧ１ａ細胞をＮＯＧマウスに移植した異種移植モデルにおける、ＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞投与の効果を解析した結果を示すグラフである。当該グラフにおいて、ＩＶＩＳによって検出された発光強度の推移を示す。 ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１５、及び、当該ＣＡＲを導入したＮＫ細胞の製造工程の概要を示す図である。 ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１５を導入したＮＫ細胞（ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫ）又はコントロール（非導入（ＮＴ））ＮＫ細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養中の増殖性を解析した結果を示すグラフである。 ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫにおけるＣＤ５６、ＣＤ３、ＫＧ２０３２　ＣＡＲの発現についてフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。 ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫ又はコントロールＮＫ細胞を標的細胞と共培養した際のＣＤ１０７ａ脱顆粒についてフローサイトメトリーによって測定した結果を示すグラフである。 ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫ又はコントロールＮＫ細胞を標的細胞と共培養した際の細胞傷害活性を、５１Ｃｒ放出アッセイによって測定した結果を示すグラフである。 免疫不全マウスへの、ＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞（ＫＧ１ａ－ｌｕｃ）の移植及びＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫの投与のタイミングを示す図である。 ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫを投与したＫＧ１ａ移植マウスの生存率を示すグラフである。 ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫ又はコントロールＮＫ細胞を注入したマウスの生物発光を検出して解析した結果を示す図である（各群ｎ＝４）。 免疫不全マウスへの、ＡＭＬ患者由来の骨髄細胞の移植及び改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与のタイミングを示す図である。 改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞又はコントロールＴ細胞を注入したマウスの骨髄細胞をフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。マウスＣＤ４５陰性細胞として予めゲートされた細胞集団の解析を示す。 ＡＭＬ細胞移植３１日後の骨髄細胞中、マウスＣＤ４５陰性細胞中のヒトＣＤ４５＋ヒトＣＤ３－ヒトＣＤ３４＋ＡＭＬ細胞の割合を示すドット図である。
　＜抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体＞
　本発明は、クラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）のひとつであるＨＬＡ－ＤＲを、認識する抗体又はその機能的断片に関する。本発明において「ＨＬＡ－ＤＲを認識する」とは、ＨＬＡ－ＤＲにおける少なくとも１のアレル型に結合することを意味し、また、ＨＬＡ－ＤＲにおける少なくとも１のアレル型に結合し、かつ少なくとも１の他のアレル型に結合しないことも含む。
　ＨＬＡ－ＤＲのアレル型として、例えば、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＨＬＡ－ＤＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ５、ＨＬＡ－ＤＲ６、ＨＬＡ－ＤＲ７、ＨＬＡ－ＤＲ８、ＨＬＡ－ＤＲ９、ＨＬＡ－ＤＲ１０、ＨＬＡ－ＤＲ１１、ＨＬＡ－ＤＲ１２、ＨＬＡ－ＤＲ１３、ＨＬＡ－ＤＲ１４、ＨＬＡ－ＤＲ１５、ＨＬＡ－ＤＲ５２、ＨＬＡ－ＤＲ５３が挙げられる。また、ＨＬＡ－ＤＲは、例えば、α鎖及びβ鎖の複合体であり、より具体的には、α鎖として、ＨＬＡ－ＤＲＡ１等のＨＬＡ－ＤＲＡが挙げられる。β鎖として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５等のＨＬＡ－ＤＲＢが挙げられる。さらに、ＨＬＡ－ＤＲＢ１としては、例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５（配列番号：１１）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４１０（配列番号：１２）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１（配列番号：１３）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０３（配列番号：１４）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１（配列番号：１５）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１（配列番号：１６）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４５４（配列番号：１７）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１（配列番号：１８）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３０１（配列番号：１９）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０３（配列番号：２０）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４（配列番号：２１）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２（配列番号：２２）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１０１（配列番号：２３）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０１（配列番号：２４）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号：２５）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０３（配列番号：２６）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０５（配列番号：２７）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０６（配列番号：２８）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１（配列番号：２９）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２（配列番号：３０）が挙げられる。
　本発明の抗体として、例えば、８６位がアスパラギン酸以外のアミノ酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型に結合する抗体が挙げられる。さらに、当該抗体は、８６位がアスパラギン酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型には結合しない抗体であっても良い。なお、８６位における「アスパラギン酸以外のアミノ酸」は、好ましくは、セリン、バリン又はアラニンである。
　より具体的な例として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５（配列番号：１１）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４１０（配列番号：１２）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０７０１（配列番号：１３）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０３（配列番号：１４）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９０１（配列番号：１５）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２０１（配列番号：１６）及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４５４（配列番号：１７）からなる群から選択される少なくとも１（例えば、１、２、３、４、５、６又は７）のＨＬＡ－ＤＲに結合する抗体が挙げられる。また、その一方で、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１（配列番号：１８）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０３０１（配列番号：１９）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０３（配列番号：２０）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４（配列番号：２１）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８０２（配列番号：２２）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１１０１（配列番号：２３）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０１（配列番号：２４）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号：２５）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０３（配列番号：２６）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０５（配列番号：２７）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４０６（配列番号：２８）、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０１（配列番号：２９）及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２（配列番号：３０）からなる群から選択される少なくとも１（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３）のＨＬＡ－ＤＲには結合しない抗体であっても良い。さらに、後述の実施例に示すように、本発明の抗体はＨＬＡ－ＤＲＢ１の７４～８９位のアミノ酸配列を含む領域を認識し得る。また、本発明の抗体は、単球、Ｔ細胞の一部に結合しないものであってもよい。
　なお、抗体のかかる結合性の有無については、当業者であれば免疫学的手法を用いることにより解析することができる。例えば、後述の実施例に示すとおり、フローサイトメトリーによる抗原分析において、被検抗体に由来するピークが、そのアイソタイプコントロール抗体に由来するピークと比較して、蛍光強度が強い側にシフトしている場合は、被検抗体は抗原に（実質的に）結合すると判断することができる。一方、かかるシフトが認められない場合は、被検抗体は抗原に（実質的に）結合しないと判断することができる。
　また、本発明の抗体の結合性は、ＫＤ（解離定数）として１０－７以下であることが好ましく、１０－８以下であることがより好ましい。ＫＤは、ｋａ（結合速度定数）及びｋｄ（解離速度定数）から算出される（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）。ｋａ及びｋｄは、２分子間の結合解離反応における速度定数であり、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）による測定によって決定することができる。抗体と抗原間の結合のＳＰＲ測定は周知であり、当業者であればかかる周知技術に基づいて抗体のｋａ及びｋｄを求めることができ、更にはＫＤを算出することができる。
　本発明における「抗体」は、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれる。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（すなわち、単離された）抗体である。
　本発明の抗体は、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性から選択される少なくとも１つの細胞傷害活性を有していてもよく、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の双方を有していてもよい。
　本発明において「ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞傷害活性）」とは、標的細胞の細胞表面抗原に抗体が結合した際、その抗体のＦｃ領域にエフェクター細胞（ＮＫ細胞、単球等の免疫細胞）がさらに結合することにより、当該細胞が活性化され、それに伴い、因子を放出して標的細胞を殺傷する活性を意味する。他方、「ＣＤＣ活性（補体依存性細胞傷害活性）」とは、抗体が標的細胞に結合すると補体系が活性化し、その結果、標的細胞を溶解する活性を意味する。
　本発明の抗体はまた、抗腫瘍活性を有していてもよい。本発明において「抗腫瘍活性」とは、がん細胞の増殖を抑制する活性、がん細胞の死を誘導する活性及びがん細胞の転移を抑制する活性のうちの少なくともいずれか一つの活性を意味する。抗腫瘍活性は、例えば、後述の実施例に示すような担がんモデルを用いた分析により評価することができる。また、かかるインビボの系でなくとも、被検抗体の存在下又は非存在下にて腫瘍細胞を培養し、前者における腫瘍細胞数が、後者におけるそれと比較して低減した場合、当該抗体は抗腫瘍活性を有すると判断することが出来る。
　本発明の抗体は、ＨＬＡ－ＤＲを認識できればよく、その由来、種類、形状等は特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体が含まれる。
　本発明において「非ヒト動物由来の抗体」としては、例えば、後述の実施例に示す、ＫＧ２０３２、ＫＧ２０５３、ＫＧ１９８２、ＫＧ１９１３０、ＫＧ１９２１４、ＫＧ１９８３３、ａＡＭＬ１９１８７０、ａＡＭＬ１９１８７２、ＫＧ１９１２２を挙げることができ、より具体的には、以下のアミノ酸アミノ酸配列を含む可変領域を保持する抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｂ）配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｃ）配列番号：４５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｄ）配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｅ）配列番号：６１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｆ）配列番号：６９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｇ）配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
（ｈ）配列番号：７７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体
（ｉ）配列番号：６９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：７９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを保持する抗体。
　さらに、以下のような相補性決定領域（ＣＤＲ）を保持するＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体も、例として挙げることができる。
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｂ）配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：４１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｃ）配列番号：４５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｄ）配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｅ）配列番号：６１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｆ）配列番号：６９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｇ）配列番号：７３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
（ｈ）配列番号：７７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：６５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体
（ｉ）配列番号：６９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から決定される重鎖ＣＤＲ１～３と、配列番号：７９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域から決定される軽鎖ＣＤＲ１～３とを保持する抗体。
　なお、かかる抗体に関し、可変領域のアミノ酸配列に基づきＣＤＲを決定する方法としては特に制限はないが、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、Ａｈｏ等の公知のナンバリングスキームが挙げられ、より具体的に、Ｋａｂａｔによって決定された例として、以下のようなＣＤＲを保持するＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体を挙げることができる。
（ａ）配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
（ｂ）配列番号：３４～３６に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：３８～４０に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
（ｃ）配列番号：４２～４４に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：４６～４８に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
（ｄ）配列番号：５０～５２に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：５４～５６に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
（ｅ）配列番号：５８～６０に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
（ｆ）配列番号：６６～６８に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
（ｇ）配列番号：７０～７２に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
（ｈ）配列番号：７４～７６に記載のアミノ酸配列を各々重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体
（ｉ）配列番号：６６～６８に記載のアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲ１～３として保持し、かつ、配列番号：６２、７８及び６４に記載のアミノ酸配列を各々軽鎖ＣＤＲ１～３として保持する抗体。
　また、本発明においては、このような特定のアミノ酸配列からなる可変領域及び／又はＣＤＲを保持する抗体のみならず、望ましい活性（抗原に対する反応性等）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。このようなアミノ酸配列変異体は、例えば、上述の可変領域等をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域（ＦＲ）及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との反応性への影響が相対的に少ないと考えられるため、通常改変はＦＲに施される。しかしながら、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６－８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５－４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０－２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５－３５１（２００８）、ＭＡｂｓ．Ｍａｒ－Ａｐｒ；６（２）：４３７－４５（２０１４））。また、現在では、統合計算化学システム等（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ、カナダＣＣＧ社製）を利用することにより、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をモデリングすることもできる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｓｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｋａｇａｋｕ／ｃｓ／ｃｃｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ　参照）。さらに、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　Ｄｅｓ　Ｓｅｌ．２０１０　Ａｕｇ；２３（８）：６４３－５１に記載のとおり、抗原へのアフィニティーにおいて、重鎖可変領域のＣＤＲ１及び軽鎖可変領域のＣＤＲ３は関与していない例が知られている。また同様に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４４：１０７５－１０８４（２００７）には、大抵の抗体においては、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は抗原へのアフィニティーに関与していないということが報告されている。このように、抗体の抗原へのアフィニティーにおいては、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域各々のＣＤＲ１～３の全てを要せずとも、同等の活性を発揮し得る。実際に、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２００３　Ｊｕｌ　１８；３０７（１）：１９８－２０５、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００４　Ｊｕｌ　９；３４０（３）：５２５－４２、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００３　Ａｕｇ　２９；３３１（５）：１１０９－２０においては、元の抗体の少なくとも１のＣＤＲを保持することによって、抗原へのアフィニティーが維持された例が報告されている。
　また、本発明の抗体に関し、可変領域において改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。さらに、かかる改変は全て、抗原との結合性への影響が少ないという観点から、ＣＤＲ以外、すなわちＦＲに施されていることが好ましい。また、ＣＤＲにおいて改変されるアミノ酸数は、好ましくは５アミノ酸以内、より好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
　アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、類似する（化学的に同様な側鎖を有する）他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
　また、改変後のアミノ酸配列が、上述の特定のアミノ酸配列からなる可変領域とアミノ酸配列レベルで８０％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含む可変領域を保持する抗体も、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。かかる相同性又は同一性としては、少なくとも８０％であればよいが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。なお、かかる抗体の可変領域における改変は、抗原との結合性への影響が少ないという観点から、ＣＤＲ以外、すなわちＦＲに施されていることが好ましい。また、「同一性」は、比較するアミノ酸配列間においてアミノ酸の種類が同一な部位の割合を意味し、「相同性」は、さらに類似するアミノ酸が同一な部位の割合を加えた割合を意味する。配列の相同性又は同一性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　また、「同等の活性を有する」とは、例えば、抗原への結合性が、対象抗体（例えば、ＫＧ２０３２、ＫＧ２０５３、ＫＧ１９８２、ＫＧ１９１３０、ＫＧ１９２１４、ＫＧ１９８３３、ａＡＭＬ　１９１８７０、ａＡＭＬ　１９１８７２、ＫＧ１９１２２）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。
　また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ－結合又はＯ－結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８－１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
　本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８－２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
　キメラ抗体の定常領域には、通常、ヒト由来の抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、及びＣεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはＣκやＣλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、並びにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、又は抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト由来の抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入をすることができる。
　本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来の抗体のＣＤＲの遺伝子配列をヒト由来の抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法（ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲ）等、公知である（例えば、欧州特許出願公開第２３９４００号明細書、欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書、国際公開第９０／０７８６１号、国際公開第９６／０２５７６号）。抗体の可変領域は、通常、４つのＦＲにはさまれた３つのＣＤＲで構成されている。ＣＤＲは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。ＣＤＲのアミノ酸配列は多様性に富む一方、ＦＲを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性又は同一性を示すことが多い。そのため、一般に、ＣＤＲの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。また、ＣＤＲの機能の維持の観点から、非ヒト由来ＣＤＲのヒトＦＲへの移植においては、その非ヒト動物由来のＦＲと相同性又は同一性の高いヒトＦＲが選択される。すなわち、ＣＤＲ内のアミノ酸は、抗原を認識するばかりでなく、ＣＤＲの近傍にあるＦＲのアミノ酸と配位し、ＣＤＲのループ構造の維持にも関与しているため、移植すべきＣＤＲに隣接しているＦＲのアミノ酸配列と相同性又は同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトＦＲを利用することが好ましい。
　非ヒト動物由来のＦＲと相同性又は同一性の高い公知のヒトＦＲの検索を、例えば、インターネットで利用可能な抗体に特化した検索システム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）を利用して行うことができる。このようにして得られたヒトＦＲの配列と一致するように、非ヒト由来の抗体のＣＤＲ以外の配列に変異を導入することができる。あるいは、検索によって得られたヒトＦＲのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）が入手可能な場合は、その配列中に非ヒト由来ＣＤＲを導入してもよい。変異の導入等は核酸合成、部位特異的変異誘発などの当該分野で公知の技術を用いて行うことができる。
　このようにして作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、ＣＤＲを介して連結されたときに該ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト由来の抗体のＦＲが好適に選択できる。また必要に応じ、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６等に記載の方法に沿って、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するようにＦＲのアミノ酸残基を置換することもでき、さらに当該アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を測定して評価することによって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列を選択することができる。
　さらに、本発明の抗体としては、上述の特定のアミノ酸配列又はその改変体を含む、可変領域又はＣＤＲを保持する抗体に対し、ＨＬＡ－ＤＲへの結合において競合する抗体の態様もとり得る。言い換えれば、上述の特定のアミノ酸配列又はその改変体を含む、可変領域又はＣＤＲを保持する抗体が結合性を示すエピトープに結合する抗体の態様もとり得る。
　本発明において「エピトープ」とは、抗原中に存在する抗原決定基、すなわち抗体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。したがって、本発明におけるエピトープは、アミノ酸の一次配列中において連続する複数のアミノ酸からなるポリペプチド（線状エピトープ）であってもよく、アミノ酸の一次配列中において隣接していないアミノ酸が、ペプチド又はタンパク質の折り畳み等の三次元構造によって近傍にくることにより形成されるポリペプチド（不連続エピトープ、構造的エピトープ）であってもよい。また、かかるエピトープとしては、典型的には、少なくとも３つ（例えば４つ）、最も普通には少なくとも５つ（例えば、６～２０個、７～１５個、８～１０個）のアミノ酸からなる。
　また、抗体が得られた場合、当業者であれば、その抗体が反応性を示す抗原上のペプチド領域（エピトープ）を特定して、そのペプチド領域に結合する種々の抗体を作製し得る。さらに、二つの抗体が同一又は立体的に重なり合ったエピトープと結合するかどうかは、競合アッセイ法により決定することができる。
　本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ＨＬＡ－ＤＲを認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖可変領域断片（一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びこれらの重合体等が挙げられる。
　ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
　「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「単鎖可変領域断片（一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。
　本発明の抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができ、また組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ＨＬＡ－ＤＲ、その部分ペプチド、それらにＦｃタンパク質等が融合してあるタンパク質、またはこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ＨＬＡ－ＤＲを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ＨＬＡ－ＤＲを認識するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
　組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号　参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
　本発明は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ＤＮＡを保持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供することができる。
　＜キメラ抗原受容体＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明の抗体の標的であるＨＬＡ－ＤＲは、血液がん特異的な細胞表面抗原となる。また、本発明の抗体の可変領域は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれを発現するＴ細胞（所謂ＣＡＲ－Ｔ）において有用である。よって、本発明は、ＨＬＡ－ＤＲに結合する抗体又はその可変領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とを含む、ＣＡＲの態様もとり得る。
　本発明において、「キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）」は、細胞外領域となるＨＬＡ－ＤＲに結合する領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域とが、その順にてＮ末端側から配置され、直接又は間接的に連結されてなる、キメラタンパク質を意味する。
　本発明において、「ＨＬＡ－ＤＲに結合する領域（抗原結合性領域）」は、例えば、上述の抗体又はその機能的断片を用いることができるが、通常ＣＡＲには、ｓｃＦｖが用いられる。
　「ｓｃＦｖ」は、上述のとおり、モノクローナル抗体（免疫グロブリン）の軽鎖可変領域と重鎖可変領域がリンカーを介して連結された構造体であり、抗原との結合能を保持している。ｓｃＦｖにおけるＮ末端側の順としては、軽鎖可変領域、リンカー、重鎖可変領域であってもよく、また重鎖可変領域、リンカー、軽鎖可変領域であってもよい。
　ｓｃＦｖにおける「リンカー」としては、例えばペプチドリンカーを用いることができる。リンカーの長さは特に限定されない。例えば、アミノ酸数が５～２５個のリンカーを用いることができる。リンカーの長さは好ましくは８～２５アミノ酸、さらに好ましくは１５～２０アミノ酸である。ペプチドリンカーの好適な例として、グリシン又はグリシン及びセリンを含むペプチドリンカー（ＧＧＳリンカー、ＧＳリンカー、ＧＧＧリンカー、Ｗｈｉｔｌｏｗ／２１８リンカー等）が挙げられる。これらリンカーを構成するアミノ酸であるグリシンとセリンは、それ自体のサイズが小さく、リンカー内で高次構造が形成されにくいという利点を有する。
　ｓｃＦｖの基となるモノクローナル抗体としては、特に制限はないが、例えば、上述の非ヒト動物由来の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体が挙げられる。また、好適な例としても上述のとおりである。
　本発明において「膜貫通領域」は、細胞膜を貫通する機能を有し、ＣＡＲを細胞膜に繋留し得るポリペプチドであれば特に制限はない。膜貫通領域を担うポリペプチドの由来となるタンパク質としては、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、４－１ＢＢ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖が挙げられる。
　本発明において「細胞内シグナル領域」は、ＣＡＲが細胞膜上に配置された際に細胞内に配置される領域であり、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達すること、すなわち、抗原結合性領域が抗原（ＨＬＡ－ＤＲ）と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナル（所謂一次シグナル）を伝達することが可能な領域である。このような細胞内シグナル領域としては、一般的に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３複合体といった活性化シグナル伝達ドメインのみを有するもの（第１世代ＣＡＲ）、活性化シグナル伝達ドメインに加えて共刺激分子由来の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８又は４－１ＢＢの細胞内ドメイン）を有するもの（第２世代ＣＡＲ）、活性化シグナル伝達ドメインに加えて複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８及び４－１ＢＢの細胞内ドメイン）を有するもの（第３世代ＣＡＲ）がある。また、ＣＤ７９Ａ細胞内領域及びＣＤ４０細胞内領域を含むものも挙げられる（Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　２０２１　Ｓｅｐ　１；２９（９）：２６７７－２６９０．参照）。
　「細胞内シグナル領域」は、前記のように、一次シグナルを伝達することが出来ればよく、当該シグナルに関与するタンパク質の活性化シグナル伝達ドメインを用いることができる。一次シグナル伝達には、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）が関与することが知られている。ＩＴＡＭを有するタンパク質としては、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２が挙げられる。
　本発明においてＣＡＲが含む細胞内シグナル領域の数は、１つに限定されず、複数の細胞内シグナル領域を含むこともできる（例えば、１～５個、１～３個、又は１個若しくは２個のシグナル伝達因子を含むこともできる）。この場合、含む複数の細胞内シグナル領域は、同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。
　本発明のＣＡＲは、上述の抗原結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域に加えて、他のドメインを含むこともできる。他のドメインの例としては、共刺激伝達領域、スペーサー配列、シグナルペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
　Ｔ細胞上に発現する共刺激分子は、抗原提示細胞上に発現する各共刺激分子に特異的なリガンドとの結合により、細胞内に共刺激シグナルを伝達し、Ｔ細胞の活性化を補助することが知られている（二次シグナル伝達）。本発明において「共刺激伝達領域」とは、前記のような共刺激分子の共刺激シグナル伝達に関与する細胞内ドメインを意味する。共刺激分子の例としては、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１５４等が挙げられる。本発明のＣＡＲは、これら共刺激分子の共刺激伝達領域を含むことができる。
　本発明のＣＡＲが含み得る共刺激伝達領域の数は、１つに限定されず、複数であってもよい。本発明のＣＡＲは、共刺激伝達領域を、例えば、１～５個、１～３個、又は１個若しくは２個含むことができる。本発明のＣＡＲが、複数の共刺激シグナル伝達域を含む場合、当該域は、同じものであってもよく、また異なるものであってもよい。
　本発明において「スペーサー」は、各領域等の間を連結する配列を意味し、各領域の機能を抑制しない限り特に制限はなく、またそのアミノ酸数も特に制限されるものではないが、通常１～５００アミノ酸、好ましく５～３００アミノ酸であり、さらに好ましくは１０～１００アミノ酸である。
　スペーサーの配列は特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ、好ましくはヒトＩｇＧ（例えばサブタイプＩｇＧ１やＩｇＧ４）のヒンジ部又はその一部、ヒンジ部とＣＨ２の一部、或いは膜貫通ドメインに利用する因子（例えばＣＤ２８）の一部等の配列をスペーサーに用いることができる。なお、ヒンジ部又はその一部の配列を利用することにより、柔軟性に富むスペーサーが構成されることを期待できる。
　本発明において「シグナルペプチド」は、ＣＡＲの分泌を促すため、または細胞膜への局在化を指示するためのペプチドを意味し、リーダー配列とも称される。シグナルペプチドは、通常、抗原結合領域のＮ末端に直接又は間接的に結合され得る。また任意で、細胞プロセシング及び細胞膜へのＣＡＲの局在化中に抗原結合領域から、シグナルペプチドは切断されてもよい。かかるシグナルペプチドの例としては、免疫グロブリン（ＩｇＫ等）、ヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ等のシグナルペプチドが挙げられる。
　以上、本発明のＣＡＲにおける各領域等の例について説明したが、これら領域等に関する具体的なアミノ酸配列は、当業者であれば、公知の文献やＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。さらに、本願の配列表において具体的な配列も開示してある。また、このような典型的なアミノ酸配列（例えば、ＮＣＢＩ　レファレンスシークエンス）に限らず、本発明に係る領域等は、当該領域が担う機能を維持している限り、それら典型的なアミノ酸配列に対する改変体、相同体も含み得る。また、かかる改変体、相同体は、典型的なアミノ酸配列に対し、通常高い相同性又は同一性を有する。高い相同性又は同一性は、通常６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
　また、本発明のＣＡＲは、１種のポリペプチドからなる分子であってもよいし、２種以上のポリペプチドの複合体からなる分子であってもよい。また、本発明のＣＡＲは、ポリペプチド又はその複合体からなる分子であってもよいし、ポリペプチド又はその複合体に、他の物質（例えば、蛍光物質、放射性物質、無機粒子等）が連結してなるものであってもよい。
　本発明のＣＡＲは、化学修飾されたものであってもよい。本発明のＣＡＲを構成するポリペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ２）、エステル（－ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル等のＣ１－６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３－８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチル等のＣ６－１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル－Ｃ１－２アルキル基；α－ナフチルメチル等のα－ナフチル－Ｃ１－２アルキル基等のＣ７－１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明のＣＡＲを構成するポリペプチドは、Ｃ末端以外のカルボキシル基（又はカルボキシレート）が、アミド化又はエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明のＣＡＲを構成するポリペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ１－６アルカノイル等のＣ１－６アシル基等）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば－ＯＨ、－ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等のＣ１－６アルカノイル基などのＣ１－６アシル基等）で保護されているものも包含される。
　また、本発明のＣＡＲは、他の機能性タンパク質を有していてもよい。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明のＣＡＲに付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、ＣＡＲの精製及び検出を容易にする目的で用いる機能性タンパク質としては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ（登録商標、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、蛍光タンパク質タグ（ＧＦＰ等）等が挙げられる。
　本発明のキメラ抗原受容体は、酸又は塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば、酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。本発明のキメラ抗原受容体は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　なお、これまでにＣＡＲを利用した実験、臨床研究等の報告がいくつかあり（例えば、Ｒｏｓｓｉｇ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１０：５－１８，２００４；Ｄｏｔｔｉ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　２０：１２２９－１２３９，２００９；Ｎｇｏ　ＭＣ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　２０（Ｒ１）：Ｒ９３－９９，２０１１；Ａｈｍｅｄ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　１７：１７７９－１７８７，２００９；Ｐｕｌｅ　ＭＡ，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｍｅｄ　１４：１２６４－１２７０，２００８；Ｌｏｕｉｓ　ＣＵ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ　１１８：６０５０－６０５６，２０１１；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ　ＪＮ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ　１１６：４０９９－４１０２，２０１０；ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ　１１９：２７０９－２７２０，２０１２；　Ｐｏｒｔｅｒ　ＤＬ，ｅｔ　ａｌ．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ３６５：７２５－７３３，２０１１；Ｋａｌｏｓ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ　３：９５ｒａ７３，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ　ＲＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ　１１８：４８１７－４８２８，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ　ＲＪ，ｅｔ　ａｌ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ　５：１７７　ｒａ３８，２０１３）、これらの報告を参考にして、本発明のＣＡＲを構築することができる。また、後述の実施例において、具体的な配列等も示しているため、これらを参考にして本発明のＣＡＲを構築することもできる。
　＜キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド＞
　本発明は、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。ｓｃＦｖ等の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列の情報については、例えば、それの基となるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのヌクレオチド配列を解析することによって入手することができる。
　また、抗原結合性領域以外の、本発明のＣＡＲにおける各領域等をコードする具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば、公知の文献やＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／）等のデータベースを検索しても適宜入手することができる。さらに、上記領域等をコードするヌクレオチド配列は、公知のものに限定されず、上記各領域等をコードするヌクレオチド配列であれば用いることができる。遺伝子コードの縮重により、１つのアミノ酸に対応するコドンは複数存在する。したがって、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は多数存在する。本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、本発明のＣＡＲをコードする限り、遺伝子コードの縮重によって生じる複数のヌクレオチド配列のいずれであってもよい。さらにまた、ＣＡＲを発現する細胞における発現を最適化するために、本発明のＣＡＲにおける各領域等をコードするヌクレオチド配列において、アミノ酸をコードするために選択されるコドンは改変されてもよい。
　そして、当業者であれば、このようなヌクレオチド配列情報に基づき、化学合成する方法（ホスホロアミダイト法等）や、ＰＣＲによって増幅する方法等の公知の技術を用い、各領域等をコードするポリヌクレオチドを作製することができる。さらに、このようにして得られた各領域等をコードするポリヌクレオチドを、直接又はスペーサーを介して連結することにより、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。なお、各領域等をコードするポリヌクレオチドの連結は、後述の実施例において示すように、例えば、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法等の公知の方法を用いて行うことができる。
　＜キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター＞
　本発明は、上述のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明のベクターとしては直鎖状でも環状でもよく、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。
　ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス等のレトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクターが挙げられる。
　プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。
　エピソーマルベクターは、染色体外で自律複製可能なベクターである。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、公知である（Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、３２４，７９７－８０１ページ　参照）。エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、ＥＢＶにあっては複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ－１遺伝子、ＳＶ４０にあっては複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ＬＴ遺伝子が挙げられる。
　人工染色体ベクターとしては、例えば、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、ＰＡＣ（Ｐ１－ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターが挙げられる。
　これらベクターにおいて、増殖が緩やかな細胞であっても高効率に遺伝子を導入し易く、また安定発現株の樹立が容易であるという観点から、レトロウイルスベクターが好ましい。
　本発明のベクターには、上述のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの他に、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の発現制御配列、複製開始点や複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、他のタンパク質をコードするヌクレオチド等を含んでいてもよい。
　上述のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドや後述の他のタンパク質をコードするヌクレオチドは、プロモーターの下流に作動可能に配置することで、各ポリヌクレオチドを効率よく転写することが可能となる。かかる「プロモーター」としては、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。
　「他のタンパク質をコードするヌクレオチド」としては、例えば、蛍光タンパク質遺伝子、レポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子、サイトカイン等のＴ細胞活性化に関与する分子をコードする遺伝子等を挙げることができる。さらに、後述の実施例に示す、細胞内ドメインを持たないＥＧＦＲ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＥＧＦＲ，ｔＥＧＦＲ）も挙げられる。また、例えば、ＩＲＥＳ、２Ａペプチド配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ　ａｓｉｇｎａ由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ））をコードするＤＮＡ等を用いることにより、前記他のタンパク質は上述のＣＡＲと共にポリシストロニックに発現させることが可能となる。
　さらに、ＣＡＲを発現する細胞を投与した対象（血液がん患者等）の体内で、投与したＣＡＲ発現細胞のアポトーシスを適宜誘導するため、自殺遺伝子を「他のタンパク質をコードするヌクレオチド」として、本発明のベクターは含み得る。自殺遺伝子としては、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｃａｓｐａｓｅ９：ｉＣａｓｐ９）が挙げられる。また、かかる遺伝子の機能を活性化する薬剤としては、ＨＳＶ－ＴＫに対してはガンシクロビル、ｉＣａｓｐ９に対しては二量体誘導化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）であるＡＰ１９０３等を挙げることができる（Ｃｏｏｐｅｒ　ＬＪ．ら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２００６；８（２）：１０５－１７ページ、Ｊｅｎｓｅｎ　Ｍ．Ｃ．ら．Ｂｉｏｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１０　Ｓｅｐ；１６（９）：１２４５－５６ページ、ＪｏｎｅｓＢＳ．、Ｆｒｏｎｔ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４　Ｎｏｖ　２７；５：２５４．、Ｍｉｎａｇａｗａ　Ｋ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１５　Ｍａｙ　８；８（２）：２３０－４９ページ、Ｂｏｌｅ－Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｅ．、Ｆｒｏｎｔ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５　Ａｕｇ　２５；６：１７４　参照）。
　＜キメラ抗原受容体を発現する細胞＞
　本発明は、本発明のＣＡＲを発現する細胞を提供する。本発明の細胞は、上述の本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド又はベクターを、細胞に導入することにより得ることができる。
　本発明のポリヌクレオチド又はベクターが導入される「細胞」は、哺乳動物由来の細胞であることが好ましく、例えば、ヒト由来の細胞、又は齧歯類（マウス、ラット等）、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳動物由来の細胞を用いることができる。細胞の種類は、特に限定されず、血液、骨髄液等の体液や、脾臓、胸腺、リンパ節等の組織、腫瘍やがん性腹水等から採取された細胞等を使用することができる。好ましい例としては、ＣＡＲ発現用細胞として、免疫細胞を挙げることができる。
　「免疫細胞」としては、ＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞、γδ－Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞等を挙げることができる。かかる免疫細胞は、ｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞から調製されたものを含む。また、上記の如きリンパ球又は前駆細胞を含むものであれば、様々な細胞集団を用いることができる。すなわち、末梢血から採取されるＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）も免疫細胞の例として挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドの導入の前にＣＡＲ発現用細胞を活性化させてもよい。例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激し、ＣＡＲ発現用細胞を活性化させることができる。より具体的には、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体で培養面をコートした培養容器（例えば培養皿）で培養することによって、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による刺激を加えることができる。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体がコートされた磁気ビーズ（例えば、ＶＥＲＩＴＡＳ社が提供するＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＣＤ３／ＣＤ２８）を利用して当該刺激を行うことも可能である。
　また、後述の実施例に示すように、本発明の細胞の疲弊を防止するために、当該細胞の製造中に、チロシンキナーゼ阻害剤を培地に添加してもよい。かかるチロシンキナーゼ阻害剤としては、例えば、ダサチニブが挙げられる。
　細胞の生存率／増殖率を高めるために、活性化処理の際、Ｔ細胞増殖因子が添加された培養液を使用してもよい。Ｔ細胞増殖因子としてはＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７等を用いることができる。ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７等のＴ細胞増殖因子は常法に従って調製することができる。また、市販品を利用することもできる。ヒト以外の動物種のＴ細胞増殖因子の使用を排除するものではないが、通常、Ｔ細胞増殖因子はヒト由来のもの（組換え体であってもよい）を用いる。
　典型的には、その適用（対象への投与）のため、本発明のポリヌクレオチド導入後の細胞を増殖させる。例えば、Ｔ細胞増殖因子が添加された培養液を用いて本発明のポリヌクレオチド導入細胞を培養する（必要に応じて継代培養する）。この培養に加え、ＣＡＲ発現用細胞の活性化の場合と同様の処理（再活性化）を行うことにしてもよい。
　なお、本発明の細胞の培養には、血清（ヒト血清、ウシ胎仔血清等）を添加した培地を用いてもよいが、無血清培地を採用することにより、臨床応用する際の安全性が高く、かつ血清ロット間の差による培養効率の違いが出にくいという利点を有する細胞を調製することが可能になる。血清を用いる場合には、自己血清、すなわち、本発明の細胞の投与を受ける対象から採取した血清を用いることが好ましい。
　また、本発明の細胞は、過剰な免疫反応等を抑えるタンパク質（免疫チェックポイント物質等）の機能が抑制されている細胞であってもよい。かかるタンパク質としては、例えば、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　Ｄｅａｔｈ　１（ＰＤ－１）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、ＣＥＡＣＡＭ－５等）、ＬＡＧ－３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９が挙げられる。
　また、本発明の細胞は、他家移植をし易くするために、内在性のＴＣＲ、ＨＬＡ等のタンパク質の機能が抑制されている細胞であってもよい。
　タンパク質の機能を抑制する方法としては、前記タンパク質をコードする遺伝子を標的とするノックアウト法、前記遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ）を用いる方法、当該転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡを用いる方法、前記転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡを用いる方法が挙げられる。また、部位特異的なヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等のＤＮＡ二本鎖切断酵素）を利用して、標的遺伝子を改変する方法であるゲノム編集法も、前記物質の機能を抑制するために好適に用いられる。
　本発明のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入する方法としては、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を挙げることができる。また、本発明のベクターがレトロウイルスベクターである場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製してもよい。パッケージング細胞としては、例えば、ＰＧ１３、ＰＡ３１７、ＧＰ＋Ｅ－８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐが挙げられる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞をパッケージング細胞として用いることもできる。
　また、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを細胞に導入した後、当該細胞のＣＡＲの発現は、フローサイトメトリー、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫染色等の公知の方法により確認することができる。
　＜多重特異性抗体＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明の抗体の標的であるＨＬＡ－ＤＲは、血液がん特異的な細胞表面抗原となる。よって、当該抗原を目印として血液がん細胞に免疫細胞を誘導し、細胞傷害等を奏することが出来れば、当該疾患の治療等に資する。かかる免疫療法を可能とする態様として、多重特異性抗体が挙げられる。
　「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、複数の抗原認識部位を保持するモノクローナル抗体を意味する。
　本発明において、多重特異性抗体は、上述の本発明の抗体又はその機能的断片と免疫細胞に対する抗原認識部位とを保持する。かかる免疫細胞としては、特に制限はなく、上記＜キメラ抗原受容体を発現する細胞＞における例示のとおりであるが、血液がん細胞等の標的細胞に細胞傷害等を奏し得るという観点から、エフェクター細胞であることが好ましい。エフェクター細胞としては、例えば、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、単球、マクロファージ、好酸球等が挙げられる、また、かかる細胞において、本発明の多重特異性抗体が認識し得る抗原としては、前記細胞の表面上に存在する刺激又は阻害受容体が挙げられる。より具体的には、ＣＤ３、ＣＤ１６、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ－３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢ、ＮＫ－発現ＫＩＲ、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＮＦＳＦ９等が例示される。
　本発明の多重特異性抗体の好ましい態様としては、二重特異性抗体（バイスペシフィック抗体）が挙げられ、より具体的には、ＢｓＤｂ（二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＤｂ（単鎖二重特異性ダイアボディ）、ｓｃＢｓＴａＦｖ（単鎖二重特異性タンデム可変ドメイン）、ＤＮＬ－（Ｆａｂ）３（ドック＆ロック三価Ｆａｂ）、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、ＢｓｓｄＡｂ（二重単鎖複合体抗体）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ　ＢｓＡｂ　ＩｇＧ、Ｉｇ－ｓｃＦｖ融合型、Ｄｉａｂｏｄｙ－Ｆｃ融合型、二重可変領域抗体（ＤＶＤ－ＩｇＧ）が挙げられる。
　また、かかる二重特異性抗体は、当業者であれば適宜公知の手法を用いることによって作製することが出来る。かかる公知の手法としては、例えば、ＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体等を産生するハイブリドーマと免疫細胞を認識する抗体等を産生するハイブリドーマとの更なる融合細胞から産生させる方法（クワドローマ法）が挙げられる。また、これら異なる抗体の機能的断片（例えば、Ｆａｂ）を化学的に架橋させる方法が挙げられる。さらに、これら異なる抗体の機能的断片をコードするＤＮＡをリンカーを介して融合させ、得られたＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入し、当該細胞から産生させる方法が挙げられる。さらにまた、Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ　Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ－ｍａｔｃｈｅｄ（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｓｔｒａｎｄ　Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ　Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）Ｄｕｏ　Ｂｏｄｙ（ＧｅｎｍａｂＡ／Ｓ）等の、異なる抗体又はその機能的断片のヘテロ二量体化を促進させる方法、国際公開第２００８／１１９３５３号、国際公開第２０１１／１３１７４６号等に記載の、制御されたＦａｂ－ＡＲＭ交換法（ＣＦＡＦ法）、Ｃｈｅｎｇｂｉｎ　Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｄｕａｌ　Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－ＩｇＴＭ）Ｍｏｌｅｃｕｌｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｎａｔｕｒｅ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、２０１０に記載の方法が、挙げられる。
　＜抗体薬物複合体＞
　後述の実施例に示すとおり、本発明の抗体の標的であるＨＬＡ－ＤＲは、血液がん特異的な細胞表面抗原となる。よって、本発明は、本発明の抗体（特にヒト化抗体）又はその機能的断片と、薬物とを結合させてなる、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の態様もとり得る。
　本発明のＡＤＣにおいて、抗体と結合させることができる「薬物」は、特に制限されるものではないが、例えば、当技術分野で公知の細胞傷害性物質が挙げられる。「細胞傷害性物質」としては、抗がん剤、例えば、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、イリノテカンの代謝産物ＳＮ－３８（１０－ヒドロキシ－７－エチルカンプトテシン）、アドリアマイシン、タキソール、５－フルオロウラシル、ニムスチン、ラミニスチン、テモゾロミド等のアルキル化剤、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド等の代謝拮抗剤、エトポシド、ビンクリスチン等の植物アルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン等の抗がん性抗生物質、シスプラチン等の白金製剤、ソラフェニブ、エルロチニブ等の分子標的剤、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン、シクロフォスファミド、イフォスファミド、ブスルファン、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＤＭ１（メルタンシン）、カリキアマイシンが挙げられる。細胞傷害性物質としては、放射性同位体、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０Ｂ、１１１Ｉｎ、９０Ｙも挙げられる。細胞傷害性物質としては、細胞傷害活性を機能させる光感受性物質、より具体的には、光照射により活性化されることにより、それ自体が細胞傷害性（細胞毒性）を示す形態に変化する物質であってもよく、また細胞傷害性物質（細胞毒性物質）を生じさせる物質であってもよい。例えば、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎｓ）、クロリンｅ６、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィンナトリウム、ベルテポルフィン、及びこれらの前駆体及び誘導体が挙げられる。また、細胞傷害性物質としては、毒性ペプチド、例えば、サポリン、リシン、志賀毒等のリボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）が挙げられる。
　また、抗体と細胞傷害性物質との結合も、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、直接的結合及び間接的結合のいずれでもよい。例えば、直接的な結合として、共有結合を利用することができる。間接的な結合としては、リンカーを介した結合を利用することができる。リンカーについての一般的な技術は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９９６；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．編，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡＣＳ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ，１９９７；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．　ａｎｄ　Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．編，Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗ　５４（４），２００２に記載されている。また、リンカーは、直鎖状のリンカー（２価のリンカー）であってもよく、分枝状のリンカー（３価以上のリンカー）であってもよい。
　＜医薬組成物＞
　本発明は、本発明の抗体若しくはその可変領域、又は、それを保持する抗体構築物（上述の、キメラ抗原受容体を発現する細胞、多重特異性抗体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）等。以下、単に「本発明の抗体等」とも称する）を有効成分とする医薬組成物（例えば、抗がん剤）、並びに本発明の抗体等の治療上の有効量を、対象に投与する工程を含んでなる、疾患（例えば、急性骨髄性白血病等の血液がん）の治療の方法をも提供するものである。
　本発明が対象とする「疾患」としては、ＨＬＡ－ＤＲを特異的な表面抗原として保持する細胞に関連する疾患であれば特に制限はないが、例えば、血液がんが挙げられ、より具体的には、急性骨髄性白血病、その類縁疾患（骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等）が挙げられる。「血液がん」は、原発性のがんであってもよく、再発性のがんであってもよく、続発性のがんであってもよく、転移性のがんであってもよい。「急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）」は、分化・成熟能が障害された幼若骨髄系細胞のクローナルな自律性増殖を特徴とする多様性に富む血液腫瘍を意味する。また、骨髄における異常な白血病細胞の急速な増殖、及びそれに伴い、正常な造血機能は著しく阻害されることを特徴とする血球の骨髄性系統のがんでもあり、白血球減少、貧血、血小板減少に伴う症状等を呈する。
　本発明の「医薬組成物」は、本発明の抗体等の他、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、乳化剤、湿潤剤、ｐＨ緩衝化剤、培地、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、懸濁剤、可溶化剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤が挙げられる。より具体的に、薬理学上許容される他の成分としては、注射剤等の液状製剤の場合には、水溶液（生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、葡萄糖水溶液、グリセロール水溶液等）、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができる。また、凍結乾燥した製剤の場合、糖（マンニトール、ラクトース、サッカロース等）、アルブミン等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の医薬組成物は、上記成分が投与前に混合され得るような、キットの態様であってもよい。また、注射剤として用いる場合には、シリンジに導入された形態であり得る。
　本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明の抗体等のみを含むものであってもよいし、当該抗体等及び少なくとも一つの他の抗がん剤を含むものであってもよい。また、本発明の抗体等は、他の抗がん剤と共に投与することもでき、これによって抗腫瘍効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の抗がん剤は、本発明の抗体等と同時に、別々に、あるいは連続して対象に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このような「抗がん剤」として、例えば、べネトクラックス、アザシチジン、ダサチニブ、シタラビン（Ａｒａ－Ｃ、Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ）、エノシタビン、キザルチニブ（ＡＣ２２０）、ソラフェニブ（ＢＡＹ　４３－９０６）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ－７０１）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、ダカルバジン、イフォスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、プロカルバジン、ペントスタチン、（２‘　デオキシコホルマイシン）、エトポシド、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、パクリタキセル、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニソン、オールトランスレチノイン酸、三酸化ヒ素、インターフェロンα、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン、メシル酸イマチニブ、シトサール－Ｕ、メルファラン、ブスルファン（ミレラン（登録商標））、チオテパ、ブレオマイシン、プラチナ（シスプラチン）、シクロホスファミド、サイトキサン（登録商標）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、５－アザシチジン、クラドリビン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、６－チオグアニン、免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体等）、又は、それらの任意の組み合わせを挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。また、本発明の医薬組成物、本発明の抗体等は、前述の抗がん剤を用いる化学療法に限らず、放射性療法、がん免疫療法等の他のがん治療方法と併用してもよい。
　さらに、本発明の細胞を含む医薬組成物の場合には、他の成分として、細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等、細菌の混入を阻止する目的で抗生物質等を含んでいてもよい。さらにまた、細胞の活性化、増殖又は分化誘導等を目的として、サイトカイン、成長因子、ステロイド等のＴ細胞活性化因子、ビタミン類、免疫賦活剤、免疫チェックポイント阻害剤を含んでもよく、また、本発明の細胞とこれら他の成分を併用してもよい。
　医薬組成物の投与方法は、投与する物質の種類、組成物の態様、対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）、経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与であり、より好ましくは静脈投与である。また、全身投与によらず、局所投与を行ってもよい。局所投与として、標的とする組織（骨髄等）への直接注入を例示することができる。
　医薬組成物の投与量は、対象の年齢、体重、性別、健康状態、症状の進行の程度及び投与する医薬組成物の成分により変動しうる。また、投与スケジュールも、これら条件によって適宜調整され、単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与してもよいが、一般的に、抗体を静脈内投与の場合、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～１００ｍｇである。また、ＡＤＣを投与する場合には、含有する薬物量換算にて、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．００１～１０００ｍｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇである。これら抗体又はＡＤＣの投与回数としては、例えば、１回、又は１日～１年間に１回の間隔（例えば、１週毎、１０～３０日毎、１月毎、３～６月毎、半年毎、１年毎）で複数回投与してもよい。
　また、本発明の治療方法における細胞（例えば、キメラ抗原受容体を発現する細胞）の投与量としては、例えば、１回の投与において、成人には体重１ｋｇ当たり投与細胞の個数として、１ｘ１０３～１ｘ１０１０個（好ましくは１ｘ１０４～１ｘ１０９個、より好ましくは１ｘ１０５～１ｘ１０８個）とすることができる。投与間隔としては、例えば、１週毎、１０～３０日毎、１月毎、３～６月毎、１年毎等とすることができる。また、本発明の細胞は、投与対象の体内で自律的に増殖できるため、１回きりの投与とすることもできる。また、投与後に体内の本発明の細胞数をモニタリングし、その結果に応じて投与時期を決定するようにしてもよい。
　本発明において、本発明の抗体等を投与される「対象」としては、例えば、血液がん等に罹患しているヒト、血液がん等が再発するおそれがあるヒト、血液がん等が再発したヒトが挙げられる。また本発明において、「治療」とは、血液がん等に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること、血液がん細胞増多等の臨床検査値異常を改善すること等が含まれる。さらに、血液がんの再発の防止、遅延又は危険性の低下も含まれる。
　特に、本発明の抗体等体は、ＨＬＡ－ＤＲに対してアレル特異性を示し得るので、ＨＬＡ－ＤＲ不一致同種移植後再発の血液がん患者等で、レシピエント（血液がん患者等）のＨＬＡ－ＤＲ型が本発明の抗体等が結合する陽性型で、ドナーのＨＬＡ－ＤＲ型が本発明の抗体等が結合しない陰性型である場合には、移植を受けた患者本人あるいはドナー由来の細胞から作ったＣＡＲ－Ｔ細胞等はレシピエントの血液がんを特異的に攻撃することが可能となる。
　また、本発明の抗体は、正常血液細胞の中では、Ｂ細胞など一部の細胞にしか結合せず、単球等には結合しないうえ、全ての血液細胞の源となる造血幹細胞の一部にしか結合しないので、本発明の抗体等が結合する陽性型のＨＬＡ－ＤＲを有する血液がん患者等における通常の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞等を治療に用いたとしても、血液がん細胞は排除され、正常造血は本発明の抗体等が結合しない陰性型の細胞で保たれ、治療することが可能となる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例は、以下に示す材料及び方法を用いて行った。
　（患者検体）
　急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者由来の骨髄は同意を取った後、腸骨から採取した。単核球細胞はＦｉｃｏｌｌ　Ｐａｑｕｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分離し、解析に用いた。
　（抗ＡＭＬモノクローナル抗体の作製）
　６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ）の足底にＡＭＬ細胞株（ＫＧ１ａ、ＴＨＰ－１、Ｕ９３７、ＨＬ６０、ＭＯＬＭ－１３）を注入して免疫した。４回の免疫後に膝窩リンパ節から採取したリンパ球とＳＰ２／０マウスミエローマ細胞をＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞融合した後、ＨＡＴ培地で９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種し、ハイブリドーマを選択した。ＡＭＬ細胞に結合し、正常血液細胞に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、先ず、ＡＭＬ細胞株を各ハイブリドーマ上清中のモノクローナル抗体と反応させ、その後、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　４０５３０７）と反応させフローサイトメトリーで解析した。次に、健常人由来末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を同様に染色し、正常血液細胞に結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した後、細胞と上清を保存し、その後の解析に用いた。
　（フローサイトメトリー解析）
　単細胞浮遊液を蛍光標識抗体で染色した。染色には、ａｎｔｉ－ＣＤ３４－ＡＰＣ（８Ｇ１２，ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），ａｎｔｉ－ＣＤ３８－ＦＩＴＣ（ＨＩＴ２，　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＣＤ３－Ｃｙ７ＰＥ（ＵＣＨＴ１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＣＤ１９－Ｃｙ７ＡＰＣ（ＨＩＢ１９，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＣＤ１４－ＢＶ５１０（Ｍ５Ｅ２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＰＣ（Ｌ２４３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＣＤ１１ｃ－ＦＩＴＣ（Ｂｕ１５，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＣＤ１９－ＰＥ（ＨＩＢ１９，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＣＤ２７９－ＢＶ５１０　（ＥＨ１２．２Ｈ７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＣＤ２２３－ＦＩＴＣ（１１Ｃ３Ｃ６５，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ａｎｔｉ－ＣＤ３６６－ＰＥ（Ｆ３８－２Ｅ２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ），ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＰＥ（４０５３０７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ），ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　Ｆ（ａｂ‘）２‐Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７（１１５－６０５－０７２，Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ），Ｂｉｏｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｅｒｂｉｔｕｘ），Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥ　（４０５２０４，　Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いた。ＫＧ２０３２（ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ）はＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、１０μｇ／ｍｌの濃度で染色に用いた。解析と細胞のｓｏｒｔｉｎｇはＦＡＣＳ　Ｃａｎｔｏ　ＩＩあるいはＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。データはＦｌｏｗＪｏ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。活性化Ｔ細胞を用いた解析のためには、健常人由来ＰＢＭＣを１×１０６／ｍｌで３μｇ／ｍｌのＰＨＡ存在下で３日間刺激した。
　（ＣＲＩＳＰＲ　ｇＲＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙを用いたＫＧ２０３２の抗原の同定）
　始めに、Ｃａｓ９タンパクを発現するＤａｕｄｉ細胞のクローンの取得を行った。具体的には先ず、Ｄａｕｄｉ細胞にＣａｓ９発現レンチウイルスベクター感染させ、１０μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎを４日間加えてベクターが導入された細胞を選択した後、９６ｗｅｌｌプレートにてｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇを行った。それらを増幅した後、Ｃａｓ９　ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｔｚｅｌｅｐｉｓ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．,Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．２０１６；１７（４）：１１９３－２０５．参照）を導入することによりノックアウト効率の良いクローンを選択した。
　次に、このようにして得られた、Ｃａｓ９タンパクを発現するＤａｕｄｉ細胞のクローンに、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｌｉｂｒａｒｙ（京都大学　遊佐研究室から供与）を約３０％の導入効率になるように感染させた後、０．５μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを３日間加えＣＲＩＳＰＲ　ｌｉｂｒａｒｙが導入された細胞の選択を行った。その細胞をさらに増やし、２×１０８個の細胞をＫＧ２０３２で染色し、ＫＧ２０３２の結合が弱い（ＫＧ２０３２ｌｏｗ）５％の分画から５×１０６個ｓｏｒｔｉｎｇした。Ｓｏｒｔ後の細胞からＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔｓ　（ＱＩＡＧＥＮ）でＤＮＡ抽出を行い、ＮＧＳ解析を行った。Ｓｏｒｔ前の５×１０７細胞からも、Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＤＮＡ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いＤＮＡ抽出を行い、コントロールとした。
　（ノックアウト細胞の作製）
　ＨＬＡ－ＤＲのノックアウトを行うためのｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の合成を、ＧｅｎｅＡｒｔ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｇＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。ｇＲＮＡは以下の２種類を作製した：
ｇＲＮＡ配列（１）：ＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴ（配列番号：３１），
ｇＲＮＡ配列（２）：ＧＡＣＧＧＡＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣ（配列番号：３２）。
　２×１０５個のＤａｕｄｉ細胞にＴｒｕｅＣｕｔ　Ｃａｓ９　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１μｇと作製したｇＲＮＡ　２００ｎｇを、ＮＥＯＮ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により遺伝子導入した。９日後にａｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＰＣで染色し、ＨＬＡ－ＤＲがノックアウトされた細胞をｓｏｒｔｉｎｇし、解析に用いた。
　（ＫＧ２０３２のエピトープの同定）
　ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４５４（ＫＧ２０３２陽性）とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２（ＫＧ２０３２陰性）の５種類のキメラをｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＰＣＲにより作製した。作製したキメラをレトロウイルスベクターによりＫ５６２に遺伝子導入し、２日後にＫＧ２０３２とＬ２４３で染色し、結合の有無をフローサイトメトリーで解析した。
　（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築と作製　１）
　ＫＧ２０３２の可変部をコードするｃＤＮＡをＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５‘／３’　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用い、５‘ＲＡＣＥ法により取得し、配列を同定した。そして、図８Ａに示すとおり、軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）とを、リンカー配列を介して、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＰＣＲ法を用い、融合した。さらに、それと、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ、又は、ＣＤ８α、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζとを、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＰＣＲ法により融合したもの（図８Ａに示す「２８ζ」、「ＢＢζ」）をレトロウィルスベクターに挿入し、ＫＧ２０３２－ＣＡＲ発現ベクターを作製した（なお、各々「ＫＧ２０３２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－ＣＡＲ」、「ＫＧ２０３２－ＢＢｚ－ＣＡＲ」とも称する）。抗ＥＧＦＲ抗体で導入効率を測定できるようにするため、細胞内領域を欠損させたＥＧＦＲの配列を、ＫＧ２０３２－ＣＡＲ発現ベクターのＣＤ３ζの後にＴ２Ａ配列に引き続く形で付加した。
　（ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製）
　各ＫＧ２０３２　ＣＡＲ発現ベクターを、Ｇａｇ－ｐｏｌベクター、ＶＳＶ－Ｇベクターと一緒にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２９３Ｔ細胞に導入した後、４８時間及び７２時間後の上清を回収し、ウィルスベクターを作製した。健常人由来ＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で刺激し、活性化したＴ細胞を作製しておき、ウイルスが含まれる上清を感染させた。その後、ＣＡＲが導入されたＴ細胞を１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を添加したｍｅｄｉｕｍで６日間培養した。Ｄａｓａｔｉｎｉｂを加える場合は、４－６日目に１μＭの濃度で添加した。６日目に、ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　Ｆ（ａｂ‘）２‐Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７（１１５－６０５－０７２，Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）あるいはｂｉｏｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ　ａｎｔｉｂｏｄｙを用いてＣＡＲの導入効率を解析した。
　（サイトカイン産生の測定　１）
　ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞あるいはコントロールＴ細胞のサイトカイン産生をＨｕｍａｎ　ＩＦＮ－ｇａｍｍａ　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ／Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｍｔｅｍｓ）で測定した。具体的には、エフェクター細胞とターゲット細胞をそれぞれ１×１０５個ずつ９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで共培養し、１６～２４時間後の上清を標準曲線の範囲に収まるように希釈して測定した。
　（細胞傷害活性の測定　１）
　Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害能は５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓｓａｙにより測定した。５×１０５のｔａｒｇｅｔ細胞に２５μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を加え、３７℃で１．５ｈインキュベートし、ラベルされたｔａｒｇｅｔ細胞１×１０４個とｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞を、様々なＥｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔａｒｇｅｔ比で共培養した。４時間後に上清に放出された５１Ｃｒをｇａｍｍａ　ｃｏｕｎｔｅｒでカウントした。Ｔｏｔａｌあるいはｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓに放出される５１Ｃｒはラベルされた１×１０４個の細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００あるいはメディウムで培養して測定した。細胞傷害活性は、［（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ）／（ｔｏｔａｌ　５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ）］×１００で計算した。
　（異種移植マウスモデル　１）
　ＫＧ１ａ－ｌｕｃ／ｖｅｎｕｓは、ＫＧ１ａ細胞にルシフェラーゼ遺伝子をレンチウイルスベクターを用いて遺伝子導入して作製した。６－８週齢のメスのＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγｃｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（日本クレア）に１．２Ｇｙの放射線を照射した後、４×１０６個のルシフェラーゼを発現させたＫＧ１ａ細胞（ＫＧ１ａ－ｌｕｃ／ｖｅｎｕｓ）を尾静脈から注入した。５日後にＶｉｖｏＧｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ　（Ｐｒｏｍｅｇａ，１５０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内に投与し、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）により撮影し、Ｌｉｖｉｎｇ　Ｉｍａｇｅ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で解析した。翌日、ＣＡＲ－Ｔ細胞あるいはコントロールＴ細胞を１－２×１０６個静脈内投与し、その後毎週ＩＶＩＳによる撮影を行った。
　（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築と作製　２）
　ＫＧ２０３２の軽鎖及び重鎖の可変領域のｃＤＮＡを、オーバーラップＰＣＲによってＣＤ２８及びＣＤ３ζのｃＤＮＡと融合させた。さらに、Ｔ２Ａ－ＩＬ－１５　ｃＤＮＡもオーバーラップＰＣＲによってＫＧ２０３２　ＣＡＲと融合させた。
　（ＣＡＲ　ＮＫ細胞の作製）
　ＫＧ２０３２非反応性のＨＬＡを有する臍帯血（ＣＢ）を、フローサイトメトリーでＣＤ１９＋　Ｂ細胞に対するＫＧ２０３２反応性を測定することにより同定した。Ｔ細胞はＣＤ３　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて除去した。Ｔ細胞を除去したＣＢ単核球を１００Ｇｙ照射したＫ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ細胞で刺激し、２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２存在下で培養した。１週間後、ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＩＬ－１５　ｃＤＮＡを発現するレトロウイルスを、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを用いてＣＢ由来ＮＫ細胞に導入した。その後、１００Ｇｙ照射したＫ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ細胞で細胞を再刺激し、さらに１週間培養し、さらなる実験に使用した。
　（細胞傷害活性の測定　２）
　ＮＫ細胞の腫瘍細胞傷害能は５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓｓａｙにより測定した。６×１０５個の標的細胞を３７℃で１．５時間、２５μＣｉの［５１Ｃｒ］クロム酸ナトリウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識した。標識された標的細胞（１×１０４個）をエフェクター細胞と４時間インキュベートし、採取した上清中の５１Ｃｒ放出をガンマカウンターでカウントした。全５１Ｃｒ放出及び自発的５１Ｃｒ放出は、１×１０４標識標的を１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００又は培養液中でインキュベートすることにより測定した。細胞傷害活性は、［（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ）／（ｔｏｔａｌ　５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ－ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　５１Ｃｒ　ｒｅｌｅａｓｅ）］×１００として計算した。
　（ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ）
　ＫＧ２０３２　ＣＡＲ　ＮＫ細胞又はコントロールＮＫ細胞（２．５×１０５細胞）を、ＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞又はＡＭＬ患者の骨髄細胞（５×１０４細胞）と、エフェクター：ターゲット比が５：１になるように９６ウェルプレートで共培養した。培養開始時に抗ＣＤ１０７ａ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７（１：５０）とモネンシン（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１５００）を添加した。５時間培養後、細胞を抗ＣＤ５６－ＰＥで染色し、フローサイトメトリーで解析した。なお、前記ＡＭＬ患者のＨＬＡ－ＤＲのアレル型はＤＲＢ１＊０８：０２／１２：０１である。
　（異種移植マウスモデル　２）
　ＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に静脈内移植することにより、播種性ＡＭＬモデルを樹立した。６～８週齢の雌性ＮＯＧマウス（移植の４～２４時間前に１．０～２．４Ｇｙの放射線を照射）に１×１０６個のルシフェラーゼ発現ＫＧ１ａ細胞を尾静脈から静脈内注射した。ＫＧ２０３２　ＣＡＲ　ＮＫ細胞を用いた実験では、１．０～１．４×１０６個のＫＧ２０３２　ＣＡＲ　ＮＫ細胞またはコントロールＮＫ細胞を、ＡＭＬ細胞移植後１日目と３日目に注入した。マウスにおける腫瘍の増殖はＩＶＩＳによりルシフェリン投与時の蛍光発光を測定することにより測定された。
　（改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製）
　ＫＧ２０３２のｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎとｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎの可変領域ｃＤＮＡを、オーバーラップＰＣＲによってＣＤ８α，４－１ＢＢ，ＣＤ３ζ　ｃＤＮＡと融合することによりＫＧ２０３２　ＣＡＲのｃＤＮＡを構築した。ＫＧ２０３２　ＣＡＲ　配列中ＣＤ３ｚ　ＩＴＡＭモチーフ内のチロシンをフェニルアラニンに置換するための変異は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ　（Ｔａｋａｒａ）を用いて導入した。
　（腸管粘膜上皮細胞の単細胞懸濁液の調製）
　腸管粘膜上皮細胞の単細胞懸濁液を調製するために、粘膜を３ｍｍの厚さに切り、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ナカライテスク）で３回洗浄し、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ（ナカライテスク）で３７℃、３０分間インキュベートした。その後、上皮細胞を振盪して剥がし、回収した。４００ｇで５分間遠心した後、細胞を５００Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　Ｉを含むＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、単細胞懸濁液を得た。腸管上皮細胞のＤＮＡはＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。ＨＬＡ－ＤＲＢ１のタイピングは、ＨＬＡ研究所（日本、京都）で行った。
　（サイトカイン産生の測定　２）
　改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞又はコントロールＴ細胞を、腸管上皮細胞あるいは白血病細胞　各１×１０５個と１６時間共培養した。その培養上清に分泌されたサイトカインをＥＬＩＳＡキット（ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２；Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
　（細胞傷害活性の測定　３）
　改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性は、５１Ｃｒ放出アッセイで測定した。６×１０５個の標的細胞を３７℃で１．５時間、２５μＣｉの［５１Ｃｒ］クロム酸ナトリウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識した。標識された標的細胞（１×１０４）をエフェクター細胞と４時間インキュベートし、採取した上清中の５１Ｃｒ放出をガンマカウンターでカウントした。全５１Ｃｒ放出及び自発的５１Ｃｒ放出は、１×１０４標識標的を１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００又は培養液中でインキュベートすることにより測定した。細胞傷害活性は、（［特異的５１Ｃｒ放出－自発的５１Ｃｒ放出］／［全５１Ｃｒ放出－自発的５１Ｃｒ放出］）×１００として計算した。
　（異種移植マウスモデル　３）
　ＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）に静脈内移植することにより、播種性ＡＭＬモデルを樹立した。６～８週齢の雌性ＮＯＧマウス（移植の４～２４時間前に１．０～２．４Ｇｙの放射線を照射）に１～４×１０６個のルシフェラーゼ発現ＫＧ１ａ細胞を尾静脈から静脈内注射した。５日目に、マウスにＶｉｖｏＧｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、１５０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注入し、Ｌｉｖｉｎｇ　Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を備えたｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて腫瘍が放つ蛍光を観察することにより、腫瘍の増殖を測定した。その後、マウスに１．１～２．２×１０６個の改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞又はコントロールＴ細胞を静脈内注射した。
　（異種移植マウスモデル　４）
　ＡＭＬ細胞のＤＮＡはＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて細胞から抽出した。ＨＬＡ－ＤＲＢ１のタイピングは、ＨＬＡ研究所（日本、京都）で行い、ＫＧ２０３２反応性のＨＬＡ－ＤＲＢ１を有するＡＭＬ細胞を実験に用いた。ＡＭＬ患者からのＢＭ細胞をＮＯＧマウスの骨髄内に移植した。６～８週齢の雌性ＮＯＧマウスに、移植の４～２４時間前に１．２Ｇｙの放射線を照射した後、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を除いたＡＭＬ細胞を４×１０５個左脛骨に注射した。その６日後、マウスに２×１０６個の改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞又はコントロールＴ細胞を静脈内注射した。注入１ヵ月後、ＢＭ細胞を抗ヒトＣＤ４５－Ｃｙ７ＡＰＣ（２Ｄ１，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ３４－ＡＰＣ（８Ｇ１２，　ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ヒトＣＤ３－ＰＥ（ＨＩＴ３ａ，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＴｅｒ１１９－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（Ｔｅｒ－１１９，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗マウスＣＤ４５－Ｃｙ７ＰＥ（３０－Ｆ１１，　ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、フローサイトメトリーで解析した。
　上記材料及び方法を用いて行った実験の結果を、以下に示す。
　（ＡＭＬ特異的モノクローナル抗体　ＫＧ２０３２の同定）
　ＡＭＬ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の取得を目的として、先ず、ＡＭＬ患者の骨髄（ＢＭ）細胞から、様々なＡＭＬ細胞株及びＡＭＬ細胞に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌する約１４，０００のハイブリドーマを確立した。
　次に、これらｍＡｂから、健常ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＢ細胞以外の細胞には結合しない１，０７８個のｍＡｂを選択した。さらに、ＡＭＬ患者のＢＭ細胞をこれら候補ｍＡｂで染色し、最終的にＡＭＬに特異的に結合するｍＡｂとしてＫＧ２０３２というクローンを同定した。
　ＫＧ２０３２は、図１Ａに示すとおり、スクリーニングに用いたある健常ドナー由来ＰＢＭＣ中においては結合性が認められなかった。一方、図１Ｂに示すとおり、ＫＧ２０３２は、ＡＭＬ患者１４人中７人において、ほぼすべての白血病細胞に結合した。
　（ＫＧ２０３２が認識する抗原の同定）
　図２Ａに示す工程にて、ＫＧ２０３２が認識する抗原の同定を試みた。先ず、Ｃａｓ９タンパクを発現するＤａｕｄｉ細胞にＨｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ＣＲＩＳＰＲ　Ｌｉｂｒａｒｙを導入し、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎにより当該ライブラリーが導入された細胞を濃縮した。それら細胞をさらに増やし、２×１０８個の細胞をＫＧ２０３２で染色し、ＫＧ２０３２ｌｏｗ　５％の分画を５×１０６個ソーティングした（図２Ｂ）。
　次に、ソーティング前の細胞とソーティング後のＫＧ２０３２ｌｏｗ細胞に導入されているｇＲＮＡの配列を次世代シーケンス（ＮＧＳ）によって解析した結果、ＫＧ２０３２ｌｏｗ細胞において有意に濃縮されていたインサートｇＲＮＡが標的とする分子として、ＨＬＡ－ＤＲＡ，ＨＬＡ－ＤＲＢ１，ＣＩＩＴＡ，ＣＤ７４が同定された（図２Ｃ）。後者２つはＨＬＡ－ＤＲが細胞表面に発現するために必要な分子であることを考えると、ＫＧ２０３２はＨＬＡ－ＤＲを認識しているということが示唆された。そこで、ＨＬＡ－ＤＲを欠損させたＤａｕｄｉ細胞に対するＫＧ２０３２の結合性を解析したところ、図２Ｄに示すとおり、当該結合性は認められず、ＫＧ２０３２が認識する抗原はＨＬＡ－ＤＲであることが明らかになった。さらに、図２Ｅに示すとおり、前記３２クローンのうち、ＫＧ２０３２とは異なる８クローンの認識する抗原も、ＨＬＡ－ＤＲであることが明らかになった。
　これら本発明の抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体の可変領域のアミノ酸配列を、下記表１及び２に示す。さらに、これら可変領域からＫａｂａｔによって決定されたＣＤＲｓのアミノ酸配列を表３及び４に示す。
　（ＫＧ２０３２が認識するＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル特異性）
　ＨＬＡ－ＤＲＢ１は多型性の高い分子であるため、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のどのアレルが認識されるかを調べた。その結果、図３に示すとおり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０４、０４０５、０４１０、０８０３、０９０１又は１４５４を発現させたＫ５６２細胞にはＫＧ２０３２が結合した。一方、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１、０４０３、０８０２、１１０１又は１５０２を発現させたＫ５６２細胞にはＫＧ２０３２は結合しなかった。
　さらに、図４Ａに示すとおり、ＫＧ２０３２陰性ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子（０４０３／０８０２）を有するドナーからのＰＢＭＣの細胞のいずれにもＫＧ２０３２は結合しなかった。また、ＫＧ２０３２陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子である０９０１を有するドナーの末梢血を染色したところ、Ｂ細胞及び活性化Ｔ細胞への結合は見られたものの、既存の抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体Ｌ２４３と比較して極めて弱い結合であった。
　さらに、図４Ａに示すとおり、Ｌ２４３が結合する、すなわちＨＬＡ－ＤＲが発現している単球やＴ細胞の一部に対し、ＫＧ２０３２は結合しなかった。また、図４Ｂに示すとおり、ＫＧ２０３２陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子を有するＡＭＬ患者において、白血病細胞へのＫＧ２０３２の結合が観察された。
　ＫＧ２０３２陽性ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子である０４１０及び０８０３を有するドナーの骨髄細胞を染色したところ、造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－）及び造血前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）への結合は見られたものの、既存の抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体Ｌ２４３と比較して極めて弱い結合であった。さらに、図４Ｃに示すとおり、Ｌ２４３が結合する、すなわちＨＬＡ－ＤＲが発現している造血幹細胞のうちごく一部の細胞にしか、ＫＧ２０３２は結合しなかった。
　これらの結果から、ＡＭＬ治療において、以下のようなＫＧ２０３２の利用例（１）及び（２）が考えられる。
　（１）ＨＬＡ－ＤＲ不一致同種移植後再発のＡＭＬ患者でレシピエント（白血病患者）のＨＬＡ－ＤＲがＫＧ２０３２陽性型で、ドナーのＨＬＡ－ＤＲ型がＫＧ２０３２陰性型である場合には、移植を受けた患者自身あるいはドナー由来Ｔ細胞から作ったＫＧ２０３２由来ＣＡＲ－Ｔ細胞はレシピエントの白血病を特異的に攻撃すると考えられる（図５Ａ）。
　（２）正常血液細胞においては、ＫＧ２０３２は、Ｂ細胞など一部の細胞にしか結合せず、また全ての血液細胞の源となる造血幹細胞においてはその一部にしか結合しないので、ＫＧ２０３２陽性のＨＬＡ－ＤＲＢ１型を有するＡＭＬ患者における通常の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞を治療に用いたとしても、白血病細胞は排除され、正常造血はＫＧ２０３２陰性細胞で保たれると考えられるので、治療として成立すると考えられる（図５Ｂ）。
　（ＫＧ２０３２が認識するエピトープの同定）
　ＫＧ２０３２が認識するエピトープを同定すべく、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４５４（ＫＧ２０３２陽性）とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２（ＫＧ２０３２陰性）のアミノ酸配列を比較した（図６）。さらに、図７Ａに示すようなＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４５４とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５０２のキメラタンパク質を発現する発現ベクターをｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＰＣＲにより作製した。そして、それらをレトロウイルスによりＫ５６２細胞に遺伝子導入し、２日後にＫＧ２０３２とＬ２４３で染色し、結合の有無をフローサイトメトリーで解析した。その結果、図７Ｂに示すとおり、図６に示すＲｅｇｉｏｎ３（Ａ．Ａ．７４－８９）がＫＧ２０３２の結合に必須であることが示された。
　さらに、ＫＧ２０３２が結合するＨＬＡ－ＤＲＢ１と結合しないＨＬＡ－ＤＲＢ１とのＲｅｇｉｏｎ３のアミノ酸配列を比較したところ、図７Ｃに示すように、８６位のアミノ酸がＫＧ２０３２が結合しないＨＬＡ－ＤＲでは常にアスパラギン酸（Ｄ）なのに対して、結合するＨＬＡ－ＤＲでは、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）であることが分かった。
　そこで、ＫＧ２０３２が結合するＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０５の８６位のセリン（Ｓ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換したものを、Ｋ５６２細胞に発現させた。その結果、図７Ｄに示すように、Ｌ２４３の結合は保たれるが、ＫＧ２０３２の結合は失われることが明らかになった。
　これらのことからＫＧ２０３２が結合するためには、Ｒｅｇｉｏｎ３のうち８６位のアミノ酸はアスパラギン酸以外のアミノ酸（セリン、バリン、アラニン等）であることが必須であることが示された。
　（ＫＧ２０３２非反応性ＤＲドナーに由来するＣＡＲ－Ｔ細胞の開発）
　ＫＧ２０３２の可変領域を含むキメラ抗原受容体（ＫＧ２０３２－ＣＡＲ）を作製した。先ず、ＫＧ２０３２の可変部のｃＤＮＡをＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いた５’ＲＡＣＥ法により取得し、配列を同定した。次に、図８Ａに示すとおり、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）を、リンカー配列を介し、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＰＣＲ法を用いて融合させた後、それと、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ、又は、ＣＤ８α、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζとを、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ　ＰＣＲ法により融合し、２種類のＫＧ２０３２－ＣＡＲ（ＫＧ２０３２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－ＣＡＲ、ＫＧ２０３２－ＢＢｚ－ＣＡＲ）を作製した。なお、これらＣＡＲの構成は、下記表５に示す。
　次に、ＫＧ２０３２陰性ＨＬＡ－ＤＲＢ１（０４０３／０８０２）ドナー由来のＴリンパ球に、ＫＧ２０３２　ＣＡＲをレトロウイルスベクターを用いて導入し、ＫＧ２０３２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した（図８Ｂ及び８Ｃ）。
　このようにして作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、図８Ｄ及び８Ｅに示すとおり、ＫＧ２０３２が結合するＫＧ１ａ細胞と共培養することにより、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２を産生し、細胞傷害活性を示した。一方、ＫＧ２０３２が結合しないＴＨＰ－１細胞との共培養では、サイトカイン産生及び細胞傷害活性ともに見られなかった。
　なお、これらの結果は、共刺激分子がＣＤ２８であっても４－１ＢＢであっても見られたので、以降の実験では４－１ＢＢが共刺激分子であるＫＧ２０３２－ＣＡＲ（ＫＧ２０３２－ＢＢｚ－ＣＡＲ）についてのみ評価した。
　次に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊を防止するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造中にチロシンキナーゼ阻害剤であるダサチニブを加えることを試みた。その結果、図８Ｆ～Ｈに示すとおり、１μＭのダサチニブで処理により、ＫＧ２０３２－ＢＢｚ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖は促進する一方で、疲弊マーカー分子（ＰＤ－１，ＴＩＭ－３，ＬＡＧ－３）の発現は減少した。また、ＫＧ１ａとの共培養時のＩＬ－２サイトカイン産生も増加した。
　次に、ＮＯＧマウスにルシフェラーゼを発現するＫＧ１ａ細胞を移入した後、ＫＧ２０３２－ＢＢｚ　ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、その抗白血病効果を評価した。その結果、図８Ｉ及びＪに示すとおり、著明な抗白血病効果が見られた。
　（ＫＧ２０３２非反応性ＤＲドナーに由来するＣＡＲ－ＮＫ細胞の開発）
　ＫＧ２０３２の可変領域にＣＤ２８及びＣＤ３ζを融合させたキメラ抗原受容体とＩＬ－１５を共発現させるためのベクターを作製した。そして、当該キメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を調製し、ヒト急性骨髄性白血病由来の細胞株（ＫＧ１ａ細胞）と共培養させた。その結果、図には示していないが、前記ＣＡＲ－ＮＫ細胞も、細胞傷害活性を示すことが明らかになった。さらに、ＫＧ１ａ細胞を移入したマウスに、前記ＣＡＲ－ＮＫ細胞を投与した結果、顕著な抗腫瘍効果が奏されることも明らかになった。
　具体的に説明すると、ＫＧ２０３２の可変領域、ＣＤ２８、ＣＤ３ζを融合して、ＣＡＲ－ＮＫ細胞用のＫＧ２０３２　ＣＡＲコンストラクトを作製した。さらに、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の増殖と生存を高めるために、ＩＬ－１５をＫＧ２０３２　ＣＡＲとともに共発現させるレトロウイルスベクターを設計した。ＫＧ２０３２－非反応性ＨＬＡ－ＤＲＢ１を持つヒト臍帯血（ＣＢ）細胞からＴ細胞を除き、４－１ＢＢリガンドと膜結合ＩＬ－１５を発現するＫ５６２細胞（放射線照射した）で刺激してＮＫ細胞を増殖させた。培養開始から１４日後、ＫＧ２０３２　ＣＡＲ／ＩＬ－１５をレトロウイルス導入したＣＢ由来ＮＫ細胞を分析した（図９Ａ～９Ｃ）。
　ＫＧ１ａ細胞又は患者由来の初代ＡＭＬ細胞と共培養すると、コントロール（ＣＡＲを導入していない）ＮＫ細胞と比較して、ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫ細胞でＣＤ１０７ａ脱顆粒が有意に増加したが、ＨＬＡ－ＤＲ欠損ＫＧ１ａ細胞との共培養では増加しなかった（図９Ｄ）。
　ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＫＧ１ａ細胞及び患者由来の初代ＡＭＬ細胞に対して有意な細胞傷害性を示したが、ＨＬＡ－ＤＲ欠損ＫＧ１ａ細胞に対しては示さなかった（図９Ｅ）。
　さらに、ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－ＮＫ細胞を、ＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞を移植した免疫不全マウスに投与すると、白血病細胞を有意に減少し、マウスの生存期間は延長された（図９Ｆ～９Ｈ）。
　（改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞の開発）
　重篤なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は非血液系組織においてＨＬＡ－ＤＲの発現を亢進させる可能性があるため、ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞の安全性を最大限に高めるためには、重症ＣＲＳを避けるべきである。ＣＡＲコンストラクトを改変することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を失うことなく、重篤なＣＲＳを防ぐことができると報告されている（Ｙｉｎｇ，Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｓａｆｅ　ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔ　ａｎｔｉ－ＣＤ１９　ＣＡＲ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｔｈｅｒａｐｙ．　Ｎａｔ　Ｍｅｄ　２５，　９４７－９５３　（２０１９）．　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１９－０４２１－７）。そこで、ＡＭＬ細胞との共培養時にＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン産生を減少させるため、抗原認識ドメインにおける重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の順序を変更し、ＣＤ８αヒンジ／膜貫通ドメインの長さを延長することにより、ＫＧ２０３２　ＣＡＲコンストラクトを改変した。さらに、ＣＡＲの活性化シグナルを弱めるために、ＣＤ３ζ配列の３つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）ドメインのうち２つに変異を導入した（Ｆｅｕｃｈｔ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＡＲ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｄｉｒｅｃｔｓ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｆａｔｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｐｏｔｅｎｃｙ．Ｎａｔ　Ｍｅｄ　２５，８２－８８（２０１９））。なお、この改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲの構成は、前記表５に示される。
　先ず、ＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞との共培養後の、オリジナル又は改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を分析した。その結果、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの分泌は、オリジナルによるそれと比較して低減しており、前記変異によって、ＣＡＲの活性化シグナルが弱められたことが、確認された。
　次に、大腸がん患者切除標本から得た正常小腸から精製した正常腸管上皮細胞又はＫＧ１ａ細胞と共培養した後の、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ及びＩＬ－２の分泌量を分析した。その結果、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＫＧ２０３２反応性ＨＬＡ－ＤＲＢ１を持つ正常腸管上皮細胞との共培養では活性化されなかった。一方、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞及び患者由来の初代ＡＭＬ細胞に対する細胞傷害活性を保持していた。
　また、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞を移植したマウスに投与した。その結果、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与により、マウスに生着したＫＧ１ａ　ＡＭＬ細胞は有意に減少し、生存期間が延長した。なお、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞で治療したマウスでは明らかな毒性は観察されなかった。
　さらに、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞を、患者由来ＡＭＬ細胞を移植した免疫不全マウスに投与した（図１０Ａ）。その結果、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫不全マウスに移植された患者由来ＡＭＬ細胞を根絶した（図１０Ｂ及び１０Ｃ）。なお、改変ＫＧ２０３２　ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスに明らかな毒性は観察されなかった。
　以上説明したように、本発明によれば、急性骨髄性白血病等の血液がんに特異的な細胞表面抗原となるＨＬＡ－ＤＲを標的とすることにより、当該抗原を認識する抗体若しくはその機能的断片、又はそれを保持するキメラ抗原受容体等を用いることにより、前記疾患の治療等が可能となる。
　特に、かかる抗体は、ＨＬＡ－ＤＲに対してアレル特異性を示し得るので、ＨＬＡ－ＤＲ不一致同種移植後再発の血液がん患者で、レシピエント（血液がん患者）のＨＬＡ－ＤＲが本発明の抗体が結合する陽性型で、ドナーのＨＬＡ－ＤＲが本発明の抗体が結合しない陰性型である場合には、ドナー由来細胞から作った本発明の抗体由来のＣＡＲ－Ｔ細胞等はレシピエントの血液がん細胞を特異的に攻撃することが可能となる。
　また、本発明の抗体が、正常血液細胞においては、Ｂ細胞など一部の細胞にしか結合せず、単球等には結合しない場合、本発明の抗体が結合する陽性のＨＬＡ－ＤＲを有する血液がん患者における通常の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞等を治療に用いたとしても、血液がん細胞は排除され、正常造血は本発明の抗体が結合しない陰性細胞で保たれ、治療が可能となる。
　よって、本発明は、血液がんに対する治療薬及びその開発等において、有用である。

Claims (12)

  1. 　ＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体又はその機能的断片を含む、血液がんを治療するための組成物。
  2. 　前記抗体又はその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体を、発現する免疫細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記抗体又はその機能的断片と免疫細胞に対する抗原認識部位とを保持する、多重特異性抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 　前記抗体又はその機能的断片が単球に結合しない、請求項１に記載の組成物。
  5. 　前記抗体又はその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体を、発現する免疫細胞を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 　前記抗体又はその機能的断片と免疫細胞に対する抗原認識部位とを保持する、多重特異性抗体を含む、請求項４に記載の組成物。
  7. 　前記抗体又はその機能的断片が、８６位がアスパラギン酸以外のアミノ酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型に結合し、かつ、８６位がアスパラギン酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１のアレル型には結合しない、請求項１に記載の組成物。
  8. 　前記抗体又はその機能的断片が、８６位のアミノ酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１の７４～８９位のアミノ酸配列を含む領域に結合し、かつ
    　８６位のアミノ酸がアスパラギン酸であるＨＬＡ－ＤＲＢ１の７４～８９位のアミノ酸配列を含む領域には結合しない、請求項１に記載の組成物。
  9. 　下記（ａ）～（ｉ）のうちのいずれかの特徴を有する、ＨＬＡ－ＤＲを認識する、抗体又はその機能的断片
    （ａ）配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：５～７に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
    （ｂ）配列番号：３４～３６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：３８～４０に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
    （ｃ）配列番号：４２～４４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：４６～４８に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
    （ｄ）配列番号：５０～５２に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：５４～５６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
    （ｅ）配列番号：５８～６０に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
    （ｆ）配列番号：６６～６８に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
    （ｇ）配列番号：７０～７２に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
    （ｈ）配列番号：７４～７６に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２～６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する
    （ｉ）配列番号：６６～６８に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む重鎖可変領域と、配列番号：６２、７８及び６４に記載のアミノ酸配列を各々含む相補性決定領域１～３を含む軽鎖可変領域とを有する。
  10. 　請求項８又は９に記載の抗体又はその機能的断片を保持するキメラ抗原受容体を発現する、免疫細胞。
  11. 　請求項８若しくは９に記載の抗体若しくはその機能的断片、又は、前記抗体若しくはその機能的断片を含むキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を含む、医薬組成物。
  12. 　造血幹細胞が移植された血液がん患者に投与される組成物であって、
    　ＨＬＡ－ＤＲを認識する抗体又はその機能的断片を含み、
    　前記造血幹細胞の提供者と前記患者とはＨＬＡ－ＤＲのアレル型が異なり、
    　前記抗体又はその機能的断片が、前記患者のＨＬＡ－ＤＲに結合し、かつ、前記提供者のＨＬＡ－ＤＲに結合しない、組成物。

     
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