WO2024111982A1 - Fgf5의 전사체 변이체-2 및 이의 단백질의 간섬유화증의 예방, 억제, 및 치료 용도 - Google Patents

Fgf5의 전사체 변이체-2 및 이의 단백질의 간섬유화증의 예방, 억제, 및 치료 용도 Download PDF

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이대호
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Definitions

  • the present invention relates to the use of transcript variants of FGF5 (fibroblast growth factor 5) and proteins expressed therefrom to prevent, inhibit, and treat liver fibrosis.
  • FGF5 fibroblast growth factor 5
  • Liver fibrosis results from the high accumulation of extracellular matrix, including collagen, which occurs in most types of chronic liver disease.
  • Representative cells involved in liver fibrosis include hepatic stellate cells, Kupffer cells, and endothelial cells.
  • Hepatic stellate cells are the main producer of extracellular matrix and are involved in increasing the production of various extracellular matrices, including collagen.
  • Kupffer cells exist within the sinusoidal space within the liver, and substances produced by activated Kupffer cells affect surrounding hepatocytes, endothelial cells, and hepatic stellate cells, thereby promoting liver fibrosis.
  • Endothelial cells play an important role in regulating blood flow within the liver, and are also involved in the production of growth factors and extracellular matrix that are involved in the proliferation of hepatic stellate cells due to inflammation or liver fibrosis.
  • activated hepatic stellate cells increase exponentially, and these cells secrete profibrogenic cytokines, resulting in ⁇ -SMA, collagen, and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs).
  • TRIPs tissue inhibitor of metalloproteinases
  • Non-alcoholic fatty liver disease is a disease that progresses to Nonalcholic steatohepatitis (NASH) and cirrhosis, and is not caused by drinking. It is highly related to metabolic diseases such as obesity, diabetes, and hyperlipidemia.
  • Non-alcoholic steatohepatitis causes hepatocyte degeneration/necrosis as fat accumulates within the liver cells, and the resulting inflammation and liver fibrosis develop into liver cirrhosis (or cirrhosis) and liver cancer. For this reason, it is recognized as a serious disease worldwide.
  • NASH occurs due to two separate events that progress from steatosis to fibrosis, which is referred to as a “two-hit process” (Exp Anim. 2014; 63(1): 85-92.).
  • FGF fibroblast growth factor
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • FGF5 fibroblast growth factor 5
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the purpose of the present invention is to provide a FGF5-v2 transcript variant and its protein (also referred to as “FGF5-v2 protein”), which consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule (i.e., gene of FGF5-v2) encoding the FGF5-v2 protein.
  • Another object of the present invention is to provide a carrier containing the FGF5-v2 gene, its transcript, or protein of the present invention (or carrying the gene, transcript, or protein); Alternatively, a composition containing the delivery vehicle is provided.
  • Another object of the present invention is to provide FGF5-v2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list of the present invention;
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis (or liver fibrosis), which contains isolated cells into which the expression vector has been introduced as an active ingredient.
  • the present invention provides FGF5-v2 protein, which consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein.
  • the nucleic acid molecule may include the base sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence list, but is not limited thereto.
  • the present invention provides an expression vector containing the above nucleic acid molecule.
  • the present invention provides cells into which the above expression vector has been introduced.
  • the cells are isolated cells.
  • the present invention provides FGF5-v2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list; A nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein; An expression vector containing the nucleic acid molecule; Alternatively, it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis, comprising isolated cells into which the expression vector has been introduced as an active ingredient.
  • the FGF5-v2 protein, the nucleic acid molecule, the expression vector, or the cell may be carried in a delivery vehicle, but is not limited thereto.
  • the composition includes FGF5-v2 protein, the nucleic acid molecule, or the expression vector as an active ingredient, and the delivery vehicle is a virus particle, vesicles, nanoparticle, microparticle, liposome, It may be one or more selected from the group consisting of transposons, micelles, antibodies, and exosomes, but is not limited thereto.
  • the liver fibrosis is caused by alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic fatty liver disease, hepatitis C, hepatitis B, autoimmune hepatitis, hepatic encephalopathy, primary biliary cirrhosis, liver cancer, and hepatocellular carcinoma. It may be liver fibrosis in one or more selected from the group consisting of, but is not limited to this.
  • the non-alcoholic fatty liver disease is non-alcoholic steatohepatitis (NASH), non-alcoholic fatty liver (NAFL), hepatic steatosis, acute At least one selected from the group consisting of Acute Fatty Liver of Pregnancy (AFLP), NAFLD-related liver failure, NAFLD-related liver fibrosis, NAFLD-related cirrhosis, and NAFLD-related liver cancer.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • NAFL non-alcoholic fatty liver
  • hepatic steatosis acute At least one selected from the group consisting of Acute Fatty Liver of Pregnancy (AFLP), NAFLD-related liver failure, NAFLD-related liver fibrosis, NAFLD-related cirrhosis, and NAFLD-related liver cancer.
  • AFLP Acute Fatty Liver of Pregnancy
  • NAFLD-related liver failure NAFLD-related liver failure
  • NAFLD-related liver fibrosis
  • composition may be administered in combination with an anti-inflammatory agent, but is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory agent may be a steroidal anti-inflammatory agent or a non-steroidal anti-inflammatory agent, but is not limited thereto.
  • the present invention provides FGF5-v2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list; A nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein; An expression vector containing the nucleic acid molecule; Alternatively, a method for preventing or treating liver fibrosis is provided, comprising the step of administering a composition containing the isolated cells into which the expression vector has been introduced as an active ingredient to an individual in need thereof.
  • the FGF5-v2 gene (nucleic acid molecule), transcript, and/or protein of the present invention can be administered to an individual using various carriers (delivery vehicles) known in the art in addition to vectors.
  • the carrier for example, expression vectors, viruses, vesicles (or vesicles), nanoparticles, microparticles, liposomes, transposons, micelles, exosomes, antibodies, etc. can be used.
  • FGF5-v2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein; An expression vector containing the nucleic acid molecule; Alternatively, a composition comprising isolated cells into which the expression vector has been introduced as an active ingredient is provided for the prevention or treatment of liver fibrosis.
  • FGF5-v2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; A nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein; An expression vector containing the nucleic acid molecule; Alternatively, a composition containing isolated cells into which the expression vector has been introduced as an active ingredient is provided for preparing a preparation for preventing or treating liver fibrosis.
  • the present invention provides an FGF5-v2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list for the prevention or treatment of liver fibrosis; A nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein; An expression vector containing the nucleic acid molecule; Alternatively, it provides a use of isolated cells into which the expression vector has been introduced.
  • the present invention provides an FGF5-v2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list for the production of a drug for preventing or treating liver fibrosis; A nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein; An expression vector containing the nucleic acid molecule; Alternatively, it provides a use of isolated cells into which the expression vector has been introduced.
  • the transcript variant FGF5-v2 of fibroblast growth factor 5 (FGF5) and its protein according to the present invention were developed by adjusting the amino acid sequence of full-length FGF5. It was confirmed that the transcript variant and its protein are effective in suppressing the progression of liver fibrosis and improving liver function abnormalities accompanying liver fibrosis, as well as increases in various inflammation- and fibrosis-related cytokines. Therefore, by administering the gene encoding FGF5-v2, its transcript, protein, and/or various carriers (e.g., AAV) carrying them to the patient, liver fibrosis is suppressed and various diseases including cirrhosis and liver cancer are prevented. , improvement, and therapeutic effect are expected to be achieved.
  • various carriers e.g., AAV
  • Figure 1 shows a recombinant expression vector for delivery and expression (transcript to protein expression) of the FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2” or “FGF5-S”) coding gene of the present invention into cells.
  • FGF5-v2 the FGF5-v2 variant
  • FIG. 2a shows the creation of an in vivo model of liver fibrosis (an in vivo NAFLD mouse model induced by a CDAA-HFD diet), and the production of the FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2” or “FGF5-S”) of the present invention.
  • FGF5-v2 an in vivo NAFLD mouse model induced by a CDAA-HFD diet
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • FIG 2b shows the time-dependent changes after injection of a carrier containing the gene for full-length FGF5 (“FGF5-F”) or FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2” or “FGF5-S”) into a NAFLD mouse model. This is the result showing the change in body weight (Normal, normal mouse; Control, untreated control; same below).
  • FGF5-F full-length FGF5
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • Figure 2c shows glucose tolerance (referred to as normal mice, comparison group, FGF5-F administered group, and FGF5-v2 mutant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) administered group) when glucose was injected after 12 hours of fasting. indicates a change in glucose tolerance.
  • Figure 3a shows the results of comparing the NAFLD activity score (NAS) after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into a NAFLD mouse model.
  • NAS NAFLD activity score
  • Figure 3b shows the results of comparing Fibrosis scores after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2" or “FGF5-S”) into a NAFLD mouse model, specifically FGF5
  • FGF5-v2 the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant
  • FGF5-S the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant
  • Figure 4a shows liver function evaluation in the serum of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-v2
  • Figure 4b shows ALT during liver function evaluation in the serum of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant
  • FGF5-S the gene of FGF5-v2 variant
  • Figure 4c shows the AST/ALT ratio in the serum of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or "FGF5-S”) into the NAFLD mouse model. It is a result.
  • Figure 4d shows the level of TG (Triglyceride) in lipids in the serum of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or "FGF5-S”) into the NAFLD mouse model. This is the result of comparing levels.
  • Figure 4e shows that after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into a NAFLD mouse model, HDL (High- This is a graph comparatively showing the level of density lipoprotein.
  • Figure 4f shows the LDL (Low- This is a graph comparatively showing the level of density lipoprotein.
  • Figure 4g shows the glucose level in the serum of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model. This is a comparative graph.
  • Figure 5a shows fibrosis-related biomarkers in liver tissue mRNA of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-v2
  • Figure 5b shows fibrosis-related biomarkers in liver tissue mRNA of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-v2
  • Figure 5c shows fibrosis-related biomarkers in liver tissue mRNA of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or "FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • Figure 5d shows fibrosis-related biomarkers in liver tissue mRNA of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or "FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • Figure 6a shows an ELISA experiment using the liver tissue of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • Figure 6b shows an ELISA experiment using the liver tissue of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • Figure 6c shows Western blot analysis using liver tissue of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-v2
  • Figure 7a shows the expression of various cytokines and chemokines in the serum of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • Figure 7b shows the expression of various cytokines and chemokines in the liver tissue of the NAFLD mouse model after injecting the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2" or “FGF5-S”) into the NAFLD mouse model.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • Figure 8a is an image showing the results of Sirius red staining of liver tissue sections of a NAFLD mouse model injected with the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”), The liver fibrosis inhibition effect of the FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2” or “FGF5-S”) was confirmed.
  • Figure 8b is an image showing the results of H&E staining of liver tissue sections of a NAFLD mouse model injected with the gene of FGF5-F or FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S").
  • FIG 9 shows the full-length FGF5 sequence and indicates the regions corresponding to the FGF5-v2 variant (referred to as "FGF5-v2" or “FGF5-S”) (underlined) and FGF5-v3 (boxed).
  • Figure 10a shows the results of a stimulation experiment using human hepatic stellate cell line (LX2 cells), where the x-axis represents the time (minutes) after FGF5 treatment and the y-axis represents the fold value for the control experiment.
  • LX2 cells human hepatic stellate cell line
  • Figure 10b shows the results of a stimulation experiment using human hepatic stellate cell line (LX2 cells), and the x-axis is the time after treatment with FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2" or “FGF5-S”) protein. and the y-axis represents the fold value for the control experiment.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • Figure 10c shows the results of a stimulation experiment using human hepatic stellate cell line (LX2 cells), and the x-axis shows the FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2" or “FGF5-S”) for FGF5 treatment. It shows pretreatment with 1, 3, and 5 times the protein concentration, and the y-axis shows the fold value for the control experiment. It was confirmed that the FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2” or “FGF5-S”) protein antagonizes the signal transduction function of the full-length FGF5 protein. From this, the liver fibrosis inhibition effect of the FGF5-v2 variant (referred to as “FGF5-v2” or “FGF5-S”) was confirmed.
  • FGF5-v2 human hepatic stellate cell line
  • 'protein' is used interchangeably with 'polypeptide' and refers to, for example, a polymer of amino acid residues as commonly found in proteins in their natural state.
  • the present invention provides a mutant gene for fibroblast growth factor 5 (FGF5), a FGF5 transcript variant expressed therefrom, and a protein translated therefrom. That is, the purpose of the present invention is to provide the FGF5-v2 (FGF5 transcript variant 2) gene, which is an FGF5 fragment newly identified by the present inventors, a transcript expressed therefrom, and a protein translated therefrom.
  • FGF5-v2 FGF5 transcript variant 2
  • the FGF5-v2 variant of the present invention is an FGF5 fragment newly identified by the present inventors. It may be referred to as “FGF5-v2” or “FGF5-S”.
  • FGF5-v2 FGF5-v2
  • FGF5-S FGF5-S
  • the present inventors have discovered that the FGF5-v2 protein not only has different characteristics from the full-length FGF5 protein or other fragments (FGF5-v1 or FGF5-v3), but also has a liver fibrosis improvement and treatment effect completely different from the parent protein, FGF5. It was clearly identified.
  • the full-length FGF5 is a known protein, and specific information can be found in public databases such as NCBI (registration number NM_004464.4).
  • the FGF5-v2 protein of the present invention is characterized in that it contains or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list.
  • FGF5-v2 protein is meant to include its functional equivalents.
  • the functional equivalent refers to an amino acid sequence constituting the FGF5-v2 protein (a preferred example is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence list) and at least 50%, 70%, preferably 80% or more.
  • it refers to a polypeptide having at least 90% sequence homology (i.e., identity). For example, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65.
  • substantially similar physiological activity may preferably mean the effect of preventing, improving, or treating liver fibrosis.
  • the functional equivalent of the FGF5-v2 protein in the present invention may be one produced as a result of addition, substitution, or deletion of part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence list.
  • the substitution of amino acids is preferably a conservative substitution.
  • the functional equivalent of the FGF5-v2 protein also includes variants in which some amino acids are deleted in the amino acid sequence of the FGF5-v2 protein (i.e., shorter functional fragments).
  • the deletion or substitution of the amino acid may preferably be located in a region not directly related to the physiological activity of the FGF5-v2 protein.
  • deletion or substitution can be made within a range that does not affect the physiological activity of the FGF5-v2 protein.
  • variants in which several amino acids are added to both ends of the FGF5-v2 protein amino acid sequence or within the sequence are also included.
  • the scope of functional equivalents of the present invention also includes polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide are modified while maintaining the basic framework of the FGF5-v2 protein and its physiological activity. For example, this includes structural changes to change the stability, storage, volatility or solubility of the protein.
  • sequence homology and homology are defined by aligning the candidate sequence with the original sequence (SEQ ID NO. It is defined as the percentage of identical matching residues (amino acid residues or bases) of the candidate sequence to the original sequence after introducing (gaps). When necessary, conservative substitutions are not considered as part of sequence identity to obtain maximum percent sequence identity. Additionally, in the case of determining protein sequence homology or homology, the N-terminus, C-terminus, or internal extension, deletion, or insertion of the FGF5-v2 protein amino acid sequence is not interpreted as a sequence affecting sequence identity or homology. Additionally, the sequence identity can be determined by common standard methods used to compare similar portions of the amino acid sequences of two polypeptides.
  • Computer programs such as BLAST or FASTA align two polypeptides such that each amino acid is optimally matched (either along the full length of one or both sequences or along a predicted portion of one or both sequences).
  • the program provides a default opening penalty and a default gap penalty and can be used in conjunction with a computer program called PAM250 (standard scoring matrix; Dayhoff et al., in Atlas of Protein). It provides a scoring matrix such as Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978).
  • percent homogeneity can be calculated as follows: Multiply the total number of identical matches by 100, then the sum of the length of the longer sequence in the matched span and the number of gaps introduced into the longer sequence to align the two sequences. Share.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein of the present invention.
  • nucleic acid', 'gene sequence', 'DNA sequence', 'RNA sequence' or 'polynucleotide' refer to deoxyribonucleotides or ribonucleotides in single- or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides are also included.
  • the FGF5-v2 gene may be characterized as including the base sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence list. In another embodiment of the present invention, the FGF5-v2 gene may consist of the base sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence list.
  • polynucleotides encoding the proteins of interest for expression are amino acids of the protein expressed from the coding region due to codon degeneracy or in consideration of the preferred codon in the organism in which the protein is to be expressed.
  • Various modifications may be made to the coding region within the scope of not changing the sequence, and various modifications may be made to parts other than the coding region within the scope of not affecting the expression of the gene, and such modified genes are also within the scope of the present invention. Those skilled in the art will be able to understand well that it is included in .
  • nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included within the scope of the present invention.
  • nucleic acid molecule indicated by a specific sequence herein may include not only that sequence but also its biological equivalent.
  • one aspect of the nucleic acid molecule is interpreted to include sequences that show substantial identity with the sequences listed in the sequence numbers in the sequence list.
  • a nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence represented by a specific sequence number is not limited to the nucleotide sequence, and variants of the nucleotide sequence are included within the scope of the present invention.
  • a nucleic acid molecule consisting of a nucleotide sequence indicated by a specific sequence number in the sequence list of the present invention is a functional equivalent of the nucleic acid molecule constituting it, for example, a deletion or substitution of some nucleotide sequences of the nucleic acid molecule.
  • it is a concept that includes variants that have been modified by insertion but can have the same functional effect as the corresponding nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule disclosed in the present invention contains at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% of the amino acid sequence indicated by a specific sequence number in the sequence list.
  • the “% sequence homology” for a nucleic acid molecule is determined by comparing a comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the nucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (with additions or deletions) for the optimal alignment of the two sequences. may contain additions or deletions (i.e. gaps) compared to those that do not contain (i.e., gaps).
  • the gene (nucleic acid molecule) of the FGF5-v2 variant of the present invention, its transcript, and/or its protein can be delivered directly to the subject through various carriers (carriers) or as such.
  • the carrier delivers the gene, transcript, and/or protein of FGF5-v2 to a host cell or other subject so that the gene is expressed in the cell or the transcript or protein has its original physiological activity (inhibition of liver fibrosis). It is sufficient as long as it is active, and it is not limited to specific types.
  • carriers for delivery of FGF5-v2 variants include expression vectors, viruses (viral particles), vesicles, nanoparticles, microparticles, liposomes, transposons, micelles, antibodies, or exosomes. etc. may be used, but are not limited thereto, and gene, transcript, and protein delivery methods known in the art may be applied without limitation. Additionally, proteins can be delivered directly along with preservation materials.
  • the present invention provides an expression vector (recombinant expression vector) containing the FGF5-v2 gene (i.e., a nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein) according to the present invention. That is, the present invention is a promoter; and an expression vector (recombinant expression vector) containing an FGF5-v2 gene (FGF5-v2 polynucleotide) operably linked thereto.
  • the present invention is a promoter; and an expression vector (recombinant expression vector) containing an FGF5-v2 gene (FGF5-v2 polynucleotide) operably linked thereto.
  • the term 'expression' refers to the production of proteins or nucleic acids in cells.
  • recombinant vector refers to a vector capable of expressing a peptide or protein encoded by a heterogeneous nucleic acid inserted into the vector, preferably the target protein (in the present invention, FGF5 -v2 protein) refers to a vector manufactured to express.
  • the "vector” refers to any medium for the introduction and/or transfer of bases into a host cell in vitro, in vitro or in vivo, and is a replication unit ( replicon), and a “replication unit” is any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosomes, viruses, etc.).
  • the vector according to the present invention may be linear DNA, plasmid DNA, or recombinant viral vector, but is not limited thereto.
  • Such vectors include, for example, plasmid vectors, cosmid vectors and viral vectors such as bacteriophage vectors, adenoviral vectors, lentiviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors.
  • the vector is an adenovirus vector.
  • the present inventors used the pADTrack vector in specific examples.
  • the term 'promoter' refers to a DNA sequence that regulates the expression of an operably linked nucleic acid sequence in a specific host cell. In addition, it may further include an optional operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • a promoter that consistently induces the expression of the target gene at all times (constitutive promoter) or a promoter that induces the expression of the target gene at a specific location and time (inducible promoter) can be used. Examples include the SV40 promoter. , CMV promoter, CAG promoter, CaMV 35S promoter, Rsyn7 promoter (US Patent Application No.
  • the recombinant vector of the present invention may include any operator sequence for controlling transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, a sequence controlling the termination of transcription and translation, a terminator, etc., and more preferably It may additionally include a polyhistidine tag (an amino acid motif consisting of at least 5 histidine residues), a signal peptide gene, an endoplasmic reticulum retention signal peptide, a cloning site, etc. It may additionally include a marker gene for selection, such as a tag gene or an antibiotic resistance gene for selecting transformants.
  • the polynucleotide sequences of each gene are operably linked to a promoter.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence, such as a promoter sequence, and another nucleotide sequence, whereby the control sequence is used to regulate transcription of the other nucleotide sequence. and/or regulate detoxification.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a transcription/translation termination sequence e.g., a strong promoter capable of advancing transcription (e.g., pL ⁇ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc. ), a ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription/translation termination sequence.
  • the origin of replication at which the vector operates in the eukaryotic cell may include, but is limited to, the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication, and the BBV origin of replication. It doesn't work.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothioneine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter SV40 promoter
  • the cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV can be used and typically have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.
  • tags include Avi tag, Calmodulin tag, polyglutamate tag, E tag, FLAG tag, HA tag, His tag (polyhistidine tag), Myc tag, S tag, SBP tag, IgG-Fc tag, and CTB.
  • Tags Softag 1 tag, Softag 3 tag, Strep tag, TC tag, V5 tag, VSV tag, Xpress tag, etc. may be included.
  • the vector according to the invention may contain a myc tag.
  • the expression vector can be introduced into target cells (host cells) in an expression form by methods known in the art, such as infection, transfection, or transduction.
  • the gene delivery method using a plasmid expression vector is a method of directly delivering plasmid DNA to mammalian cells, and is a method that can be used in humans approved by the FDA. Unlike viral vectors, plasmid DNA has the advantage of being able to be purified homogeneously.
  • a mammalian expression plasmid known in the art can be used as a plasmid expression vector that can be used in the present invention.
  • pRK5 European Patent No. 307,247
  • pSV16B International Patent Publication No. 91/08291
  • pVL1392 are representative examples.
  • the plasmid expression vector may be used by methods known in the art, including but not limited to transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, and calcium phosphate precipitation. , liposome-mediated transfection, DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, It can be introduced into target cells by a gene gun and other known methods for introducing DNA into cells.
  • the viral expression vector containing the above nucleic acid is not limited thereto, but includes, but is not limited to, retrovirus, adenovirus, herpes virus, and avipox virus. ), lenti virus, etc.
  • the retroviral vector is constructed so that all viral genes are removed or altered so that non-viral proteins are produced within cells infected by the viral vector.
  • the main advantages of retroviral vectors for gene therapy are that they deliver large amounts of genes into replicating cells, accurately integrate the transferred genes into cellular DNA, and do not cause continuous infection after gene transfection.
  • the retroviral vector certified by the FDA was manufactured using PA317 amphotropic retrovirus packaging cells.
  • Non-retroviral vectors include adenovirus as mentioned above.
  • the main advantage of adenovirus is that it carries large amounts of DNA fragments (36 kb genome) and has the ability to infect non-replicating cells at very high titers.
  • the herpes virus can also be usefully used for human gene therapy.
  • known suitable viral vectors can be used in the present invention.
  • the vector When the expression vector is a viral recombinant vector, the vector can be transfected or transfected into a virus producing cell, that is, a packaging cell line.
  • a virus producing cell that is, a packaging cell line.
  • exogenous nucleic acids DNA or RNA
  • the virus containing the target gene FGF5-v2 gene
  • the viral nucleic acid that has been “transduced” into the cell is used to produce the desired transcript or protein (FGF5-v2 transcript or protein), with or without insertion into the cell's genome.
  • isolated cells into which the expression vector according to the present invention has been introduced can be provided.
  • the cell refers to a cell for proliferating (amplifying) the expression vector.
  • the cell represents a host cell directly transduced/transformed/transfected with the above-mentioned nucleic acid molecule or expression vector.
  • the expression vector is a viral vector
  • the cell may be a packaging cell for producing a virus containing the viral vector.
  • the present invention provides an expression vector comprising an FGF5-v2 transcript according to the present invention, an FGF5-v2 protein, and a nucleic acid molecule encoding the FGF5-v2 protein; And/or provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis (liver fibrosis), which includes isolated cells into which the expression vector has been introduced as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may contain various carriers for delivering the FGF5-v2 gene, transcript, and/or protein of the present invention to target cells. That is, the pharmaceutical composition may include the FGF5-v2 gene, transcript, and/or protein supported on a carrier. Since the detailed description of the carrier has been described above, it is omitted.
  • liver fibrosis refers to a disease in which fibrosis accumulates and the form or function of the liver is damaged due to continuous damage to liver tissue due to various causes.
  • the term “liver fibrosis” may be used interchangeably with “liver fibrosis”.
  • the fibrosis is a phenomenon in which excessive fibrous connective tissue is formed in organs or tissues during the wound recovery process due to repetitive damage to cells or tissues. Since the continuous accumulation of liver fibrosis is the cause of various liver diseases, including liver cancer and cirrhosis, the development of serious diseases can be prevented or liver dysfunction can be treated by suppressing and improving liver fibrosis.
  • the liver fibrosis includes alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic fatty liver disease, hepatitis C, hepatitis B, autoimmune hepatitis, hepatic encephalopathy, primary biliary cirrhosis, liver cancer, and hepatocellular carcinoma.
  • other causes of unknown or unspecified liver fibrosis or chronic liver disease, etc. but are not limited thereto, and any disease that is directly or indirectly caused by liver fibrosis or is accompanied by liver fibrosis may be included without limitation.
  • the non-alcoholic fatty liver disease is non-alcoholic steatohepatitis (NASH), non-alcoholic fatty liver (NAFL), hepatic steatosis, acute At least one selected from the group consisting of Acute Fatty Liver of Pregnancy (AFLP), NAFLD-related liver failure, NAFLD-related liver fibrosis, NAFLD-related cirrhosis, and NAFLD-related liver cancer. It may be, but is not limited to this.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • NAFL non-alcoholic fatty liver
  • hepatic steatosis acute At least one selected from the group consisting of Acute Fatty Liver of Pregnancy (AFLP), NAFLD-related liver failure, NAFLD-related liver fibrosis, NAFLD-related cirrhosis, and NAFLD-related liver cancer. It may be, but is not limited to this.
  • the pharmaceutical composition of the present invention i.e., FGF5-v2 protein or expression vector thereof, etc.
  • an anti-inflammatory agent i.e., FGF5-v2 protein or expression vector thereof, etc.
  • FGF5-v2 of the present invention can achieve a more excellent anti-fibrotic effect by using it in combination with existing anti-inflammatory agents.
  • the term “combined administration” can be achieved by administering the individual components of the treatment regimen simultaneously, sequentially, or separately.
  • the combination treatment effect is obtained by administering two or more drugs simultaneously or sequentially, or alternately at regular or undetermined intervals.
  • the combination treatment is not limited to this, but includes, for example, degree of response and speed of response. , which is defined as one in which the efficacy measured through the time to disease progression or survival period is therapeutically superior to and can provide a synergistic effect over the efficacy that can be obtained by administering one or the remaining components of the combination therapy at a conventional dose. You can.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered simultaneously, separately, or sequentially with an anti-inflammatory agent, and even when administered sequentially with an anti-inflammatory agent, the order of administration is not limited, but the type of anti-inflammatory agent,
  • the dosage regimen can be appropriately adjusted depending on the patient's condition, patient's gender, age, etc.
  • the present invention provides (i) an expression vector containing the FGF5-v2 protein of the present invention, a nucleic acid molecule encoding the same, or an isolated cell into which the expression vector has been introduced; and (ii) an anti-inflammatory agent as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver fibrosis.
  • the composition is in the form of a mixture of (i) FGF5-v2 protein and (ii) anti-inflammatory agent, and may be for simultaneous administration of (i) FGF5-v2 protein and (ii) anti-inflammatory agent.
  • the (i) FGF5-v2 protein and (ii) the anti-inflammatory agent may be a single formulation prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable adjuvant, diluent, or carrier.
  • the (i) FGF5-v2 protein and (ii) anti-inflammatory agent may contain various ingredients within the scope of each drug.
  • the single dosage form may be administered together with a separate preparation containing another therapeutic agent as a separate dosage form.
  • the composition may be formulated with (i) FGF5-v2 protein and (ii) anti-inflammatory agents and administered simultaneously, separately, or sequentially.
  • the composition includes (i) a first pharmaceutical composition containing a pharmaceutically effective amount of FGF5-v2 protein as an active ingredient; and a second pharmaceutical composition containing a pharmaceutically effective amount of the anti-inflammatory agent (ii) as an active ingredient. It may be a pharmaceutical composition for combined administration for simultaneous or sequential administration.
  • Anti-inflammatory agents according to the invention may be steroidal anti-inflammatory agents and/or non-steroidal anti-inflammatory agents.
  • the non-steroidal anti-inflammatory agent may be selected from salicylic acid, acetic acid, propionic acid, mefenamic acid, oxicam series, or non-acidic acid series, and specific examples include, but are limited to, aspirin, ibuprofen, naproxen, ketoprofen, fenoprofen, etc. It doesn't work.
  • the present invention provides a kit for preventing or treating liver fibrosis, comprising the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the kit according to the present invention is not limited to the specific form as long as it is for the prevention or treatment of liver fibrosis, and can be used to manufacture, store, express, and administer the FGF5-v2 gene, transcript, protein, and expression vector according to the present invention. It may include any ingredients and devices for the purpose without limitation.
  • the content of the FGF5-v2 gene, its transcript, its protein, and/or the expression vector in the composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptom, the patient's condition, etc., for example, the entire composition. It may be 0.0001 to 99.9% by weight, or 0.001 to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount with the solvent removed.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, lubricants, adsorbents, humectants, film-coating materials, and controlled-release additives.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared as powder, granules, sustained-release granules, enteric-coated granules, solutions, eye drops, ellipsis, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese according to conventional methods.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, and calcium. These include phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives to tablets, powders, granules, capsules, pills, and troches according to the present invention include corn starch, potato starch, wheat starch, lactose, white sugar, glucose, fructose, di-mannitol, precipitated calcium carbonate, synthetic aluminum silicate, and phosphoric acid.
  • Excipients such as cellulose (HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, propylene glycol, casein, calcium lactate, and Primogel; Gelatin, gum arabic, ethanol, agar powder, cellulose acetate phthalate, carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, glucose, purified water, sodium caseinate, glycerin, stearic acid, sodium carboxymethyl cellulose, sodium methyl cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, dextrin.
  • binders can be used, Hydroxypropyl methyl cellulose, corn starch, agar powder, methyl cellulose, bentonite, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, sodium alginate, calcium carboxymethyl cellulose, calcium citrate, sodium lauryl sulfate, silicic anhydride, 1-hydroxy Propylcellulose, dextran, ion exchange resin, polyvinyl acetate, formaldehyde-treated casein and gelatin, alginic acid, amylose, guar gum, sodium bicarbonate, polyvinylpyrrolidone, calcium phosphate, gelled starch, gum arabic, Disintegrants such as amylopectin, pectin, sodium polyphosphate, ethyl cellulose
  • soybean oil (Lubri wax), aluminum stearate, zinc stearate, sodium lauryl sulfate, magnesium oxide, Macrogol, synthetic aluminum silicate, silicic anhydride, higher fatty acids, higher alcohol, silicone oil, paraffin oil, polyethylene glycol fatty acid ether, Lubricants such as starch, sodium chloride, sodium acetate, sodium oleate, dl-leucine, and light anhydrous silicic acid may be used.
  • Additives to the liquid according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (twin esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, etc. can be used.
  • a solution of white sugar, other sugars, or sweeteners, etc. may be used in the syrup according to the present invention, and if necessary, flavoring agents, colorants, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickening agents, etc. may be used.
  • Purified water can be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. can be used as needed.
  • Suspensions according to the present invention include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc. Topics may be used, and surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV solution, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV solution, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil - sesame oil.
  • solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristic acid, and benzene benzoate; Solubilizing agents such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, Tween, nicotinic acid amide, hexamine, and dimethylacetamide; Weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and buffering agents such as gums; Isotonic agents such as sodium chloride; Stabilizers such as sodium bisulfite (NaHSO 3 ) carbon dioxide gas, sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 5 ), sodium sulfite (Na 2 SO 3 ), nitrogen gas (N 2 ), and
  • Suppositories according to the present invention include cacao oil, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, Subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, lecithin, Lanet wax, glycerol monostearate, Tween or Span, Imhausen, monolene (propylene glycol monostearate), glycerin, Adeps solidus, Buytyrum Tego -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydrocote SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), Hydro Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Massaupol, Masupol-15, Neosupostal-
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include the extract with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, and sucrose. ) or prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, activity of the drug, and the type of patient's disease. It can be determined based on factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to an individual through various routes. All modes of administration are contemplated, including oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal injection, vaginal injection. It can be administered by internal insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined depending on the type of drug as the active ingredient along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, gender, weight, and severity of the disease.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, gender, and weight, and is generally administered at 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg, per kg of body weight every day or every other day, or 1 It can be administered in divided doses 1 to 3 times a day.
  • the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • “individual” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, cows, etc. refers to mammals of
  • “administration” means providing a given composition of the present invention to an individual by any suitable method.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of the desired disease
  • treatment refers to the improvement or improvement of the desired disease and its associated metabolic abnormalities by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. It refers to all actions that are beneficially changed, and “improvement” refers to all actions that reduce parameters related to the target disease, such as the degree of symptoms, by administering the composition according to the present invention.
  • PN 5'-AAAGGTACCATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC-3' primer corresponding to FGF5 variant 2 SEQ ID NO. 19 in the sequence list
  • 5'-AAAAAGCTTTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTCTGTGAACTTGGCTTAACATATTGGCTTCGT-' primer SEQ ID NO. 19 in the sequence list
  • the gene was synthesized using number 20), cut with restriction enzymes KpnI and HindII, and then ligated.
  • the prepared recombinant vector (pAdTrack-CMV hFGF5-2) was amplified by transformation into E.
  • E. coli BJ5183 cells E. coli BJ5183 cells
  • hFGF5- Transformed E. coli BJ5183 cells-hFGF5-2 expressing 2 were selected.
  • aderovirus hFGF5-2 was produced using 293T cells.
  • Example 2 Production and gene injection of in vivo diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) as a liver fibrosis model.
  • NAFLD non-alcoholic fatty liver disease
  • CDAA-HFD A06071302, Research Diets, NJ, USA.
  • CDAA-HFD is a high-fat diet containing choline-deficient L-amino acids and methionine, which induces NAFLD (Nonalcoholic fatty liver disease), simple fatty liver disease, steatohepatitis, and liver fibrosis (cirrhosis associated with fatty liver disease).
  • NAFLD Nonalcoholic fatty liver disease
  • simple fatty liver disease simple fatty liver disease
  • steatohepatitis steatohepatitis
  • liver fibrosis cirrhosis associated with fatty liver disease.
  • the liver fibrosis group was again the empty vector administration group; Full-length FGF5 (also referred to as FGF5-F; FGF5 full sequence) administration group;
  • the experiment was conducted by dividing the subjects into groups administered FGF5 variant FGF5-v2 (also referred to as FGF5-S).
  • FGF5-v2 also referred to as FGF5-S.
  • mice A group of normal mice that did not consume a high-fat diet were administered PBS. After 12 days, a glucose tolerance test was performed on all mice, and after 2 days, the animals were euthanized with CO 2 . All mice were weighed weekly. Mice were raised in a temperature (23 ⁇ 3°C) and relative humidity (40-60%) controlled room under specific pathogen-free conditions.
  • mice or NAFLD mice were treated with empty vector (control), full-length FGF5 (FGF5-F), or FGF5-v2 (FGF5-S), and a glucose tolerance test (GTT) was performed on each mouse.
  • Liver tissue was collected and NAS score and Fibrosis sicore, indicators of fatty liver, were measured. Specifically, the degree of steatosis and fibrosis of the tissue was assessed by a pathologist viewing and scoring photographs of stained mouse tissue. Steatosis was scored numerically according to quantitative pathological criteria (steatosis, inflammation and hepatocyte swelling).
  • Fibrosis was diagnosed by staining mouse liver tissue fragments with Sirius Red and observing them into stages F0 (no fibrosis), F1 (mild), F2 (moderate), F3 (fibrosis bridging), and F4 (cirrhosis). It was evaluated by scoring.
  • NAFLD mice fed CDAA-HFD had a significantly increased NAS score, an indicator of fatty liver, compared to mice fed a normal diet.
  • the NAS score was significantly higher among the untreated control group, FGF5-F treated group, and FGF5-S treated group. No significant difference was found.
  • Example 4 Confirmation of inhibition of non-alcoholic fatty liver fibrosis in the serum of an in vivo NAFLD mouse model by FGF5-v2 gene injection.
  • the effect of suppressing liver fibrosis by the FGF5 transcript variant of the present invention was confirmed through serum analysis of mouse models. Specifically, the serum levels of biomarkers indicating the degree of fatty liver fibrosis were quantified.
  • mice were anesthetized with isoflurane using a respiratory anesthesia machine and then euthanized, and blood was collected through cardiac puncture.
  • the collected blood was centrifuged at 4,000 rpm for 30 minutes at 4°C, and serum was collected, stored at -80°C, and used for later analysis.
  • the levels of all metabolism-related factors (AST, ALT, TG, HDL, LDL, and glucose, etc.) present in serum were obtained as above using the Advia 1800 Chemistry System according to the manufacturer's protocol (Siemens Healthcare, Er Weg, Germany). It was measured in serum samples.
  • Example 5 Confirmation of inhibition of liver fibrosis markers in liver tissue mRNA of in vivo NAFLD mouse model by FGF5-v2 gene injection
  • the mRNA level of fibrosis-related factors in the liver tissue of each mouse model was analyzed to confirm the inhibitory effect of liver fibrosis by the FGF5 transcript variant of the present invention at the RNA level.
  • the information of the primers is as follows: m ⁇ -SMA forward 5'- TGC TGA CAG AGG CAC CAC TGA A-3' and reverse 5'- CAG TTG TAC GTC CAG AGG CAT AG-3'; mCol1 ⁇ 1 forward 5'-CCT CAG GGT ATT GCT GGA CAA C-3' and reverse 5'- CAG AAG GAC CTT GTT TGC CAG G-3'; mFibronectin forward 5'-CCC TAT CTC TGA TAC CGT TGT CC -3' and reverse 5'- TGC CGC AAC TAC TGT GAT TCG G -3'; mVimentin forward 5'-CGG AAA GTG GAA TCC TTG CAG G-3' and reverse 5' AGC AGT GAG GTC AGG CTT GGA A-3'; mHPRT forward 5' CTG GTG AAA AGG ACC TCT CGA AG-3' and reverse 5'- CCA GTT TCA CTA ATG ACA CAA A
  • Example 6 Confirmation of inhibition of liver fibrosis at the liver tissue protein level in an in vivo NAFLD mouse model by FGF5-v2 gene injection
  • the protein levels of fibrosis-related factors in the liver tissue of each mouse model were analyzed by ELISA and Western blot to confirm the inhibitory effect of liver fibrosis by the FGF5 transcript variant of the present invention at the protein level.
  • liver tissue isolated from mice was lysed in T-PER buffer (Thermo, MA, USA) supplemented with PhosSTOP and protease inhibitors (Roche, Basel, Switzerland) and centrifuged at 15,000 rpm for 10 min at 4°C. . Protein concentration was quantified by BCA assay (Thermo). For tissue proteins of a certain concentration, the amounts of IL-6 and IL-1 ⁇ (R&D systems, MA, USA) were measured using ELISA or immunoblot testing using SDS-PAGE. Antibodies such as ⁇ -SMA (abcam, Cambridge, UK) and ⁇ -actin (Cell signaling, MA, USA) were used.
  • Example 7 Confirmation of cytokine and chemokine protein expression in serum and liver tissue of FGF5-v2 gene injection in vivo NAFLD mouse model
  • the levels of cytokines and chemokines were analyzed in the serum and liver tissue of each mouse model to confirm the therapeutic effect of administration of the FGF5 transcript variant of the present invention.
  • Example 6 serum was obtained from each mouse as described in Example 4, and liver tissue fractions were obtained in the same manner as the experimental method described in Example 6. Cytokine and chemokine protein expression levels were measured using the MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Kit (R&D systems). Fluorescence intensity was read on MAGPIX ® (Luminex Corporation, Austin, TX).
  • NAFLD mice administered FGF5-v2 had higher levels of cytokines and chemokines (CCL2, CCL5, CCL11, and The level of CXCL2) was significantly reduced.
  • CXCL1 and fibroblast growth factor 21 (FGF21) which are involved in fibrosis, were also found to be significantly decreased in the FGF5-v2 administration group.
  • FGF21 fibroblast growth factor 21
  • the FGF5-v2 administration group showed higher serum levels of IL-10, an anti-inflammatory cytokine, than other groups.
  • the FGF5 transcript variant of the present invention can improve and treat liver fibrosis by suppressing the production and secretion of cytokines and chemokines that promote fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease and increasing the level of anti-inflammatory cytokines. .
  • Example 8 Comparison of liver tissue staining of FGF5-v2 gene injection in vivo NAFLD mouse model (Sirius red staining and H&E staining)
  • liver fibrosis was confirmed through Sirius red staining, which is known as an indicator of fibrosis, in the liver tissue of a NAFLD mouse model, and the progression of fatty liver disease was confirmed through H&E staining.
  • liver tissue samples were obtained from each mouse, fixed in 10% buffered formalin, embedded in paraffin, and cut to a thickness of 5 ⁇ m to obtain tissue sections.
  • Each tissue section was stained with Sirius Red using the Picro Sirius Red Staining Kit (abcam) according to the manufacturer's instructions. H&E staining was performed according to conventional methods.
  • a stimulation experiment using hepatic stellate cell line was performed to confirm the inhibitory effect of liver fibrosis by the FGF5 transcript variant of the present invention at the protein level.
  • Hepatic stellate cells LX2 cells were seeded the previous day, then starvated for about 1 hour the next day, treated with 100 ng/ml of recombinant protein FGF5, and protein levels of total ERK and phospho-ERK were checked as time points. At this time, hepatoblastoma (HepG2) was also performed as a control.
  • FGF5 and FGF5-v2 protein were treated together at 1, 3, and 5 times each.
  • FGF5 alone was treated, the phospho-ERK level increased, but in the group treated with FGF5-v2, the phospho-ERK level decreased, and when a larger amount of FGF5-v2 was treated than when the same amount was treated.
  • FGF5-v2 had an antagonistic effect on FGF5 (FIG. 10c).
  • HepG2 hepatoblastoma
  • the FGF5 transcript variant according to the present invention FGF5-v2
  • FGF-v2 effectively suppresses and improves liver fibrosis by suppressing the level of fibrosis-promoting factors and increasing the level of anti-inflammatory cytokines in a non-alcoholic fatty liver animal model. can do. Therefore, FGF-v2 of the present invention is expected to be useful in the prevention and treatment of various liver fibrosis-related diseases such as cirrhosis and liver cancer through its excellent liver fibrosis inhibition effect.
  • the transcript variant FGF5-v2 of fibroblast growth factor 5 (FGF5) and its protein according to the present invention were developed by adjusting the amino acid sequence of full-length FGF5. It was confirmed that the transcript variant and its protein are effective in suppressing the progression of liver fibrosis and improving liver function abnormalities accompanying liver fibrosis, as well as increases in various inflammation- and fibrosis-related cytokines. Therefore, by administering the gene encoding FGF5-v2, its transcript, protein, and/or various carriers (e.g., AAV) carrying them to the patient, liver fibrosis is suppressed and various diseases including cirrhosis and liver cancer are prevented. , improvement, and therapeutic effects are expected to be achieved and have industrial applicability.
  • various carriers e.g., AAV

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Abstract

본 발명은 FGF5-v2(FGF5 transcript variant 2) 유전자 및 이의 단백질의 간섬유화 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명의 FGF5-v2 단편 유전자 (이로부터 발현되는 전사체 및 단백질)는 섬유아세포성장인자 5 (Fibroblast growth factor 5, FGF5)의 아미노산 서열이 변형된 변이 유전자로서, 간 섬유화의 진행 및 증식을 억제하는 효과가 있다. 따라서 FGF5-v2는 벡터(일례로 AVV) 등을 통해 지방간이 있는 환자에게 투여 시 간 섬유화를 예방 및 치료 하여 간경변과 간암으로까지 진행하는 것을 차단할 수 있을 것으로 예측되는 바, 간 섬유화의 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

FGF5의 전사체 변이체-2 및 이의 단백질의 간섬유화증의 예방, 억제, 및 치료 용도
본 발명은 FGF5 (fibroblast growth factor 5)의 전사체 변이체 (transcript variant) 및 이로부터 발현되는 단백질 등의 간섬유화증의 예방, 억제, 및 치료 용도 등에 관한 것이다.
본 발명은 2022년 11월 25일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0159875호 및 2023년 11월 13일에 출원된 한국특허출원 제10-2023-0156822호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
간 섬유화(liver fibrosis)는 대부분의 유형의 만성 간 질환에서 발생하는 콜라겐을 포함한 세포 외 매트릭스(extracellular matrix, 세포 외 기질)의 고도한 축적으로부터 발생한다. 간섬유화에 관여하는 대표적인 세포로는 간성상세포(hepatic stellate cell), 쿠퍼세포(kupffer cell), 내피 세포(endothelial cell)등이 있다. 간 성상세포는 세포 외 기질을 생산하는 주 생산원으로, 교원질을 포함한 각종 세포 외 기질의 생성 증가에 관여한다. 쿠퍼세포는 간 내 동모양 혈관강(sinusoidal space) 내에 존재하며 활성화된 쿠퍼 세포에서 생성된 물질들을 주위 간세포 (hepatocytes), 내피세포, 그리고 간성상세포에 영향을 주게 되어 간섬유화를 촉진시킨다. 내피세포는 간 내 혈류 조절에 중요한 역할을 하며, 이 외에도 염증이나 간섬유화 등에 의한 간성상세포의 증식에 관여하는 성장인자와 세포 외 기질의 생성에도 관여한다. 간섬유화가 일어나게 되면 활성화된 간성상 세포가 기하급수적으로 증가하게 되고 이 세포는 전섬유생성(profibrogenic) 사이토카인을 분비하여 결과적으로 α-SMA, 콜라겐, 그리고 메탈로프로테이나제 조직 억제제(TIMP)와 같은 세포 외 기질 관련 분자들을 생산한다.
특히, 간질환 (liver disease) 중 비알콜성 지방간 질환 (Non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD)은 비알콜성 지방간염 (Nonalcholic steatohepatitis; NASH) 및 간경화증 (cirrhosis)등으로 진행하는 질환으로서 음주가 아닌 비만증, 당뇨병, 고지혈증 등의 대사질환과 관련성이 높다. 비알콜성 지방간염은 간세포 내에 지방이 축적되면서 간세포 변성/괴사가 발생하고, 이로 인한 염증 및 간섬유화(liver fibrosis)에 의해, 간경화증(또는 간경변증; cirrhosis) 및 간암(liver cancer)으로 발전하게 되기 때문에, 전세계적으로 심각한 질환으로 인식되고 있다. NASH는 지방증에서 섬유증으로 발전하는 2가지 별개의 사건으로 인해 발생하며, 이를 "투-히트 과정(two-hit process)"이라고 한다 (Exp Anim. 2014; 63(1): 85-92.).
한편, 섬유아세포 성장인자 (Fibroblast growth factor, FGF)는 성장인자 종류 중 하나로 23종류로 이루어진 패밀리를 형성하고 있는데, 각각의 종류마다 생체 내 기능 및 활성이 다양한 것으로 알려지고 있으며, 이들의 구체적인 역할들에 대해서는 완전히 규명되지 못한 상태이다. 이러한 상황에서 기존에 FGF5 (fibroblast growth factor 5)는 비알코올성 지방간염(NASH)에서 간 섬유증의 진행에 참여하는 것으로 알려져 있다(Exp Anim. 2014; 63(1): 85-92.). 그러나, 본 발명자들이 새롭게 규명한 FGF5 변이체는 오히려 간에서의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인한 바, 이에 착안하여 상기 FGF5 변이체의 우수한 항-섬유화 효과에 기반한 간 질환 치료제로서의 잠재성을 확인하였다.
이에 본 발명자들은, 간 섬유화를 제어할 수 있는 치료전략을 연구하던 중, 기존에 FGF5 (fibroblast growth factor 5)가 비알코올성 지방간염 (NASH)에서 간 섬유증의 진행에 참여하는 것으로 알려진 것과는 달리, 본 발명에 따른 FGF5 전사체 변이체이자 FGF5의 단편 (short variant)인 FGF-v2 (FGF5 transcript variant 2)는 간 섬유화를 현저히 억제하는 것을 신규하게 규명하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은, 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는, FGF5-v2 전사체 변이체 및 이의 단백질 ("FGF5-v2 단백질"로도 지칭됨)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는, 핵산 분자 (즉, FGF5-v2의 유전자)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 본 발명의 FGF5-v2 유전자, 이의 전사체, 또는 이의 단백질을 포함하는 (혹은, 상기 유전자, 전사체, 또는 단백질이 담지된) 전달체; 또는 상기 전달체를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 본 발명의 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는, 간 섬유화증 (혹은 간 섬유화)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는, FGF5-v2 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는, 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 핵산분자는 서열목록 중에서 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 도입된 세포를 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포는 단리된 세포이다.
또한, 본 발명은 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는, 간 섬유화증 (liver fibrosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 FGF5-v2 단백질, 상기 핵산 분자, 상기 발현벡터, 또는 상기 세포는 전달체에 담지될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 FGF5-v2 단백질, 상기 핵산 분자, 또는 상기 발현벡터를 유효성분으로 포함하고, 상기 전달체는 바이러스 입자, 소포체 (vesicles), 나노입자, 마이크로입자, 리포좀, 트랜스포존, 마이셀 (micelle), 항체, 및 엑소좀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 간 섬유화증은 알코올성 지방간 질환, 비알코올성 지방간 질환, C형 간염, B형 간염, 자가면역성 간염, 간성 뇌증, 원발성 담즙성 경화증, 간암, 및 간세포성암종으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서의 간 섬유화증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 비알콜성 지방간 질환은 비알코올성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis; NASH), 비알코올성 지방간 (non-alcoholic fatty liver; NAFL), 간지방증 (hepatic steatosis), 급성 임신성 지방간 (Acute Fatty Liver of Pregnancy; AFLP), NAFLD-연관 간부전 (liver failure), NAFLD-연관 간 섬유증 (liver fibrosis), NAFLD-연관 간경화, 및 NAFLD-연관 간암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 항염증제와 병용 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항염증제는 스테로이드성 항염증제 또는 비스테로이드성 항염증제일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
뿐만 아니라, 본 발명은 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 섬유화증의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 다만 본 발명의 FGF5-v2 유전자 (핵산 분자), 전사체, 및/또는 단백질은 벡터 외에 당업계에 공지된 다양한 담체 (전달체)를 이용하여 개체에 투여될 수 있다. 상기 담체로, 예컨대, 발현 벡터, 바이러스, 베시클 (혹은 소포; vesicles), 나노입자, 마이크로입자, 리포좀 (liposome), 트랜스포존, 마이셀 (micelle), 엑소좀, 항체 등이 이용될 수 있다.
뿐만 아니라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 간 섬유화증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 간 섬유화증의 예방 또는 치료 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 간 섬유화증의 예방 또는 치료를 위한, 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포의 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 간 섬유화증의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한, 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 섬유아세포성장인자 (fibroblast growth factor 5, FGF5)의 전사체 변이체 FGF5-v2 및 이의 단백질은 전장 FGF5의 아미노산 서열을 조절하여 개발한 것이다. 상기 전사체 변이체 및 이의 단백질은 간 섬유화의 진행을 억제하고 간 섬유화 등과 동반된 간기능 이상, 그리고 여러가지 염증 및 섬유화관련 싸이토카인 증가 등을 개선하는 효과가 있음이 확인되었다. 따라서, FGF5-v2를 코딩하는 유전자, 이의 전사체, 단백질, 및/또는 이들이 담지된 다양한 전달체 (예, AAV)를 환자에게 투여함으로써 간 섬유화를 억제하여 간경변증이나 간암 등을 포함한 다양한 질환에 대해 예방, 개선, 및 치료 효과를 달성할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 코딩 유전자의 세포 내로의 전달 및 발현 (전사체 내지 단백질 발현)을 위한 재조합 발현벡터를 나타낸다.
도 2a는 간섬유화 in vivo 모델 (CDAA-HFD 식이로 유도한 in vivo NAFLD 마우스 모델)을 제작하고, 본 발명의 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 간섬유화 억제 효과를 확인하는 일련의 실험 스케쥴을 나타낸 모식도이다.
도 2b는 NAFLD 마우스 모델에 전장 FGF5 ("FGF5-F") 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 포함한 전달체를 주입한 후, 시간에 따른 체중 변화를 나타낸 결과이다 (Normal, 정상 마우스; Control, 미처리 대조군; 이하 동일).
도 2c는 정상 마우스, 비교군, FGF5-F 투여군, 및 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 투여군에서, 12시간 공복후, 글루코오스를 주사하였을 때 내당능(glucose tolerance)의 변화를 나타낸다.
도 3a는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD activity score (NAS)를 비교한 결과이다.
도 3b는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, Fibrosis score를 비교한 결과로, 특이적으로 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 주입에 의한 간섬유화 억제 효과를 확인하였다.
도 4a는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 혈청 (serum)에서 간기능평가 지표 중 AST를 비교한 결과로, 특이적으로 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 주입에 의한 AST 억제 효과 (즉, 간 손상 및 간 기능 개선 효과)를 확인하였다.
도 4b는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 혈청에서 간기능평가 중 ALT를 비교한 결과로, 특이적으로 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 주입에 의한 ALT 억제 효과 (즉, 간 손상 및 간 기능 개선 효과)를 확인하였다.
도 4c는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 혈청 내 AST/ALT 비율을 확인한 결과이다.
도 4d는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 혈청에서 지질 중 TG (Triglyceride) 수준을 비교한 결과이다.
도 4e는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 혈청에서 지질 중 HDL (High-density lipoprotein) 수준을 비교적으로 나타낸 그래프이다.
도 4f는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 혈청에서 지질 중 LDL(Low-density lipoprotein) 수준을 비교적으로 나타낸 그래프이다.
도 4g는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 혈청에서 글루코오스 (glucose) 수준을 비교적으로 나타낸 그래프이다.
도 5a는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 간 조직 mRNA에서 섬유화 관련 바이오마커 중 α-SMA의 수준을 비교적으로 나타낸 그래프이다. 특이적으로 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 주입에 의한 α-SMA의 억제 효과를 mRNA 수준에서 확인하였다.
도 5b는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 간 조직 mRNA에서 섬유화 관련 바이오마커 중 Col1α1의 수준을 비교적으로 나타낸 그래프이다. 특이적으로 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 주입에 의한 Col1α1의 억제 효과를 확인하였다.
도 5c는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 간 조직 mRNA에서 섬유화 관련 바이오마커 중 Fibronectin의 수준을 비교적으로 나타낸 그래프이다.
도 5d는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 간 조직 mRNA에서 섬유화 관련 바이오마커 중 Vimentin의 수준을 비교적으로 나타낸 그래프이다.
도 5e 및 5f는 FGF5-F (도 5e) 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) (도 5f)의 유전자가 주입된 NAFLD 마우스 (각 그룹당 n=8)에서 각각 FGF5-F 및 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 전사체의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6a는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 간 조직을 이용하여 ELISA 실험을 통해 염증성 마커인 IL-1β 단백질의 발현을 정량분석한 결과를 나타낸다.
도 6b는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 간 조직을 이용하여 ELISA 실험을 통해 염증성 마커인 IL-6 단백질의 발현을 정량분석한 결과를 나타낸다.
도 6c는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 간 조직을 이용하여 Western blot법을 이용해 α-SMA 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸다. 특이적으로 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 주입에 의한 α-SMA의 단백질 수준에서의 억제 효과를 확인하였다.
도 7a는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 혈청에서 다양한 싸이토카인 및 케모카인의 발현을 비교한 결과를 나타내는 것으로, 이로부터 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 간 섬유증 억제 효과가 확인되었다.
도 7b는 NAFLD 마우스 모델에 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자를 주입한 후, NAFLD 마우스 모델의 간조직에서 다양한 싸이토카인 및 케모카인의 단백질 수준에서의 발현을 비교한 결과를 나타내는 것으로, 이로부터 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 간 섬유화 관련 싸이토카인의 억제 효과가 확인되었다.
도 8a는 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자가 주입된 NAFLD 마우스 모델의 간조직 절편을 Sirius red 염색한 결과를 나타낸 이미지로, FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 간 섬유화 억제 효과를 확인하였다.
도 8b는 FGF5-F 또는 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 유전자가 주입된 NAFLD 마우스 모델의 간조직 절편을 H&E 염색한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 전장 FGF5 서열을 나타내고, FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) (밑줄) 및 FGF5-v3 (박스)에 해당하는 부위를 표시한 그림이다.
도 10a는 인간 간성상세포주(LX2 세포)를 활용한 자극 실험을 진행한 결과를 나타낸 것으로, x축은 FGF5 처리 후 시간(분)을 나타내고 y축은 대조실험에 대한 fold 값을 나타낸다. Erk 인산화 반응을 통해 FGF5 전장단백질은 신호전달 작용이 존재함을 확인했다.
도 10b는 인간 간성상세포주(LX2 세포)를 활용한 자극 실험을 진행한 결과를 나타낸 것으로, x축은 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 단백질 처리 후 시간을 나타내고 y축은 대조실험에 대한 fold 값을 나타낸다. Erk 인산화 반응을 통해 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 단백질은 신호전달 작용이 존재하지 않음을 확인했다.
도 10c는 인간 간성상세포주(LX2 세포)를 활용한 자극 실험을 진행한 결과를 나타낸 것으로, x축은 FGF5 처리에 대한 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 단백질의 농도를 1, 3, 5배 전처리한 것을 나타내고 y축은 대조실험에 대한 fold값을 나타낸다. FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨) 단백질이 FGF5 전장단백질의 신호전달 작용을 길항하는 것을 확인했다. 이로부터 FGF5-v2 변이체 ("FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭됨)의 간 섬유증 억제 효과가 확인되었다.
다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 용어 '단백질'은 '폴리펩티드 (polypeptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명은, FGF5 (fibroblast growth factor 5)의 변이 유전자, 이로부터 발현되는 FGF5 전사체 변이체, 및 이로부터 번역되는 단백질을 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명자들이 새롭게 규명한 FGF5 단편인 FGF5-v2 (FGF5 transcript variant 2) 유전자, 이로부터 발현되는 전사체, 및 이로부터 번역되는 단백질 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 FGF5-v2 변이체는 본 발명자들이 새롭게 규명한 FGF5 단편이다. "FGF5-v2" 혹은 "FGF5-S"로 지칭될 수 있다. 본 발명자들은 FGF5-v2 단백질이 전장 FGF5 단백질이나 다른 단편 (FGF5-v1 혹은 FGF5-v3)과도 그 특성이 상이할 뿐만 아니라, 모체 단백질인 FGF5와도 전혀 다르게 간 섬유화 개선 및 치료 작용효과를 가지는 것을 신규하게 규명하였다. 상기 전장 FGF5는 공지된 단백질로서, 구체적인 정보는 NCBI와 같은 공공 데이터베이스에서 확인할 수 있다 (등록번호 NM_004464.4).
본 발명의 FGF5-v2 단백질은 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 FGF5-v2 단백질은, 이의 기능적 동등물을 포함하는 의미이다. 상기 기능적 동등물이란, FGF5-v2 단백질을 구성하는 아미노산 서열 (바람직한 일례로, 서열목록 중에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)과 적어도 50% 이상, 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 모태가 된 상기 FGF5-v2 단백질 (바람직한 일례로, 서열목록 중에서 서열번호 1로 표시되는 표시되는 폴리펩티드)과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서 '실질적으로 동질의 생리활성'이란 바람직하게는 간 섬유화의 예방, 개선 또는 치료 효과를 의미할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서 FGF5-v2 단백질의 기능적 동등물은 서열목록 중에서 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys,Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 FGF5-v2 단백질의 기능적 동등물에는, FGF5-v2 단백질의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다(즉, 더욱 짧은 기능적 단편). 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 FGF5-v2 단백질의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치할 수 있다. 즉, 상기 결실 또는 치환은 FGF5-v2 단백질의 생리활성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 이루어질 수 있다. 아울러 상기 FGF5-v2 단백질 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 FGF5-v2 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은, 원본 서열 (아미노산 서열의 경우 바람직한 일례로서 서열목록 중에서 서열번호 1, 또는 핵산 서열의 경우 바람직한 일례로서, 서열목록 중에서 서열번호 2)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후, 원본 서열에 대한 후보 서열의 동일 매칭 잔기(아민노산 잔기 또는 염기)의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한 단백질 서열 상동성 또는 동질성 판단의 경우에 있어서, FGF5-v2 단백질 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다 (하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
또한 본 발명은, 상기 본 발명의 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산분자를 제공한다.
본 발명에서 용어 '핵산', '유전자 서열', 'DNA 서열', 'RNA 서열' 또는 '폴리뉴클레오티드'는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 상기 FGF5-v2 유전자는, 서열목록 중에서 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 본 발명의 다른 일 실시양태에서 상기 FGF5-v2 유전자는, 서열목록 중에서 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 목적 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈(codon)의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
즉, 본 명세서에서 특정 서열로 표시된 핵산 분자 (유전자)는 해당 서열뿐만 아니라 이의 생물학적 균등물을 포함할 수 있다. 즉, 핵산 분자의 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 일 양상의 핵산 분자는 서열목록 중에서 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 해당 뉴클레오티드 서열에만 제한되지 않으며, 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열목록 중에서 특정 서열번호로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자란, 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 뉴클레오티드 서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 해당 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 본 발명에 개시된 핵산 분자는 서열목록 중에서 특정 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 FGF5-v2 변이체의 유전자 (핵산 분자), 이의 전사체, 및/또는 이의 단백질은 다양한 담체 (전달체)를 통해 혹은 그 자체로 직접 개체에 전달될 수 있다. 상기 담체는 상기 FGF5-v2의 유전자, 전사체, 및/또는 단백질을 숙주 세포 또는 기타 대상체에 전달하여 상기 유전자가 세포 내에서 발현되게 하거나 상기 전사체 또는 단백질이 본래의 생리학적 활성 (간 섬유화 억제 활성)을 발휘하게 하는 것이면 충분하고, 구체적인 종류로 제한되는 것은 아니다. 예컨대, FGF5-v2 변이체의 전달을 위한 담체로, 발현 벡터, 바이러스 (바이러스 입자), 소포체 (vesicles), 나노입자, 마이크로입자, 리포좀 (liposome), 트랜스포존, 마이셀 (micelle), 항체, 또는 엑소좀 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 유전자, 전사체, 및 단백질 전달 방법이 제한 없이 적용될 수 있다. 또한 단백질을 보존 물질과 함께 직접 전달 할 수 있다.
예컨대, 본 발명은 본 발명에 따른 FGF5-v2 유전자 (즉, FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자)를 포함하는 발현벡터 (재조합 발현벡터)를 제공한다. 즉, 본 발명은 프로모터; 및 이와 작동가능하게 연결된 FGF5-v2 유전자(FGF5-v2 폴리뉴클레오티드) 등을 포함하는 발현벡터 (재조합 발현벡터)를 제공한다.
본 발명에서 용어 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 발명에 있어서, "재조합 벡터 (recombinant vector)"란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 단백질 (본 발명에서는, FGF5-v2 단백질)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있으며, "복제 단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.
본 발명에 따른 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 본 발명자들은 구체적인 실시예에서 pADTrack 벡터를 사용하였다.
상기 '프로모터'란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 (inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터, CaMV 35S 프로모터, Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 상기 프로모터 외에도 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 (최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 신호 펩타이드 (signal peptide) 유전자, 소포체 잔류 신호 펩타이드 (endoplasmic reticulum retention signal peptide), 클로닝 사이트 (cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있고, 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터에서 상기 각 유전자들의 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된 (operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 재조합 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵세포를 숙주로 하는 경우, 벡터가 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 태그용 유전자로는, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그 (폴리히스티딘 태그), Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터는 myc 태그를 포함할 수 있다.
한편. 상기 발현벡터는 감염 (infection), 형질감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포 (숙주 세포) 내에 도입시킬 수 있다.
플라스미드 발현 벡터를 이용한 유전자 전달 방법은 포유동물 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서, FDA로부터 승인받은 인간에게 사용할 수 있는 방법이다. 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다. 상기 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다.
또한 본 발명에 적용 가능한 방법으로서, 상기 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus), 렌티바이러스(Lenti virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제 (제작)된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다. FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다. 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다. 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다. 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.
상기 발현벡터가 바이러스성 재조합 벡터인 경우, 상기 벡터는 바이러스 생산세포, 즉, 패키징 세포 (packaging cell line)에 형질주입 또는 트랜스펙션 (transfection)될 수 있다. "형질주입" 또는 "트랜스펙션"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산 (DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 목적 유전자 (FGF5-v2 유전자)를 포함하는 바이러스는 상기 패키징 세포주 내에서 증식하여 세포 외로 방출될 수 있으며, 상기 바이러스는 목적세포에 트랜스덕션 (transduction)될 수 있다. 세포 내로 "트랜스덕션"된 바이러스의 핵산은 세포의 게놈에 삽입되거나 혹은 삽입되지 않은 채로 목적 전사체 또는 단백질 (FGF5-v2 전사체 또는 단백질)을 생산하는 데 사용된다.
또한, 본 발명에 따른 발현 벡터가 도입된 (형질전환, 형질감염, 형질주입 등), 단리된 세포를 제공할 수 있다. 상기 세포는 상기 발현 벡터를 증식 (증폭)하기 위한 세포를 의미한다. 즉, 상기 세포는 전술한 핵산 분자 또는 발현 벡터가 직접 형질도입/형질전환/형질감염된 숙주세포를 나타낸다. 예컨대, 상기 발현 벡터가 바이러스 벡터인 경우, 상기 세포는 상기 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스를 생성하기 위한 패키징 세포일 수 있다. 적합한 숙주의 선택은 본원의 시사내용으로부터 당업계의 통상의 기술자에게 자명한 것으로 여겨진다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 본 발명에 따른 FGF5-v2 전사체, FGF5-v2 단백질, 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 및/또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는, 간 섬유화증 (간 섬유화)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 언급한 성분 외에도 본 발명의 FGF5-v2 유전자, 전사체, 및/또는 단백질을 대상 세포로 전달하기 위한 다양한 담체를 포함할 수 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 담체에 담지된 FGF5-v2 유전자, 전사체, 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 담체에 관한 구체적인 설명은 전술하였으므로 생략한다.
본 발명에 있어서, "간 섬유화 (liver fibrosis 또는 liver fibrotic disease)"는 다양한 원인으로 인한 간 조직의 지속적인 손상으로 인해 섬유화 (fibrosis)가 축적되어 간이 형태나 기능이 손상된 질환을 의미한다. 상기 용어 "간 섬유화"는 "간 섬유화증"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 섬유화는 세포나 조직의 반복적인 손상에 대한 상처 회복 과정에서 기관이나 조직에 과도한 섬유성 결합조직이 형성되는 현상이다. 지속적인 간 섬유화의 축적은 간암, 간경변 등을 포함한 다양한 간 질환의 원인이 되므로, 간 섬유화의 억제 및 개선을 통해 심각한 질환으로의 발달을 예방하거나, 간의 기능 부전 등을 치료할 수 있다. 본 발명자들은, 본 발명의 FGF5-v2가 간 질환 동물모델에서 간 조직 내 섬유화를 효과적으로 억제하고, 섬유화 및 염증 등과 관련된 싸이토카인 등의 발현을 억제하여 질병을 호전시키는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 간 섬유화증은 알코올성 지방간 질환, 비알코올성 지방간 질환, C형 간염, B형 간염, 자가면역성 간염, 간성 뇌증, 원발성 담즙성 경화증, 간암, 및 간세포성암종은 물론, 기타 원인 불명 혹은 상세 불명의 간 섬유화 내지 만성 간질환 등을 모두 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 간 섬유화에 의해 직간접적으로 유발되거나, 간 섬유화를 동반하는 질환이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 비알콜성 지방간 질환은, 비알코올성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis; NASH), 비알코올성 지방간 (non-alcoholic fatty liver; NAFL), 간지방증 (hepatic steatosis), 급성 임신성 지방간 (Acute Fatty Liver of Pregnancy; AFLP), NAFLD-연관 간부전 (liver failure), NAFLD-연관 간 섬유증 (liver fibrosis), NAFLD-연관 간경화, 및 NAFLD-연관 간암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 본 발명의 약학적 조성물 (즉, FGF5-v2 단백질 또는 이의 발현 벡터 등)은 항염증제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 FGF5-v2는 기존의 항염증제와 병용함으로써 더욱 우수한 항-섬유화 효과를 달성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "병용투여"는, 치료 요법의 개별 성분들을 동시, 순차적으로, 또는 개별적으로 투여하는 방식으로 이룰 수 있다. 2 이상의 약물을 동시에 또는 순차적으로 투여하거나, 또는 일정한 또는 정해지지 않은 간격으로 교대로 투여하는 등의 방법으로 병용 치료 효과를 얻는 것으로, 병용 치료법은 이에 한정되지 아니하지만, 예를 들어 반응 정도, 반응 속도, 질병 진행까지의 기간 또는 생존 기간을 통해 측정된 효능이 병용 치료법의 성분 중 하나 또는 나머지를 통상적인 용량으로 투약하여 얻을 수 있는 효능보다 치료학적으로 우수하면서 상승효과를 제공할 수 있는 것으로 정의될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 항염증제와 동시에 (simultaneously), 별도로 (separately), 또는 순차적 (sequentiallly)으로 투여될 수 있으며, 항염증제와 순차적으로 투여되는 경우에도 투여 순서에 제한되는 것은 아니나, 항염증제의 종류, 환자의 상태, 환자의 성별, 나이 등에 따라 투여 요법은 적절하게 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 (i) 본 발명의 FGF5-v2 단백질, 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현벡터, 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포; 및 (ii) 항염증제를 유효성분으로 포함하는, 간 섬유화증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 (i) FGF5-v2 단백질 등과 (ii) 항염증제가 혼합된 혼합제 형태로서, 상기 (i) FGF5-v2 단백질 등과 (ii) 항염증제 의 동시 (simultaneous) 투여를 위한 형태일 수 있다. 예컨대, 상기 (i) FGF5-v2 단백질 등과 (ii) 항염증제는 약학적으로 허용 가능한 보조제, 희석제, 또는 담체 등과 혼합하여 제조된 단일 제형일 수 있다. 이 때 상기 (i) FGF5-v2 단백질 등과 (ii) 항염증제는 각각 해당 약제의 범주 내에서 여러가지 성분이 포함될 수 있다. 또한, 상기 단일 제형은 이러한 제형과 분리된 제형으로서 다른 치료제를 포함하는 별도의 제제와 함께 투여될 수 있다.
또는, 상기 조성물은 (i) FGF5-v2 단백질 등과 (ii) 항염증제가 각각 제제화되어 동시에 (simultaneously), 별도로 (separately), 또는 순차적으로 (sequentially) 투여되는 형태일 수 있다. 이 경우, 상기 조성물은 유효성분으로 상기 (i) FGF5-v2 단백질 등의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학적 조성물; 및 유효성분으로 상기 (ii) 항염증제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학적 조성물을 포함하는, 동시 또는 순차적 투여를 위한 병용투여용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 항염증제는 스테로이드성 항염증제 및/또는 비스테로이드성 항염증제일 수 있다. 상기 비스테로이드성 항염증제는 살리실산, 아세트산, 프로피온산, 메페남산, 옥시캄 계열 또는 비산성 계열에서 선택될 수 있으며, 구체적인 예로는 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 페노프로펜 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 포함하는, 간 섬유증의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 간 섬유화의 예방 또는 치료를 위한 것이라면 구체적인 형태에 제한이 없으며, 본 발명에 따른 FGF5-v2 유전자, 전사체, 단백질, 및 발현벡터 등의 제조, 보관, 발현, 투여 등을 위한 임의의 성분 및 기기를 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 FGF5-v2 유전자, 이의 전사체, 이의 단백질, 및/또는 발현벡터 등의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 "투여"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. FGF5-v2(FGF5 transcript variant 2) 제작 및 유전자 주입 준비
pAdTrack-CMV 벡터를 제한효소 KpnI과 HindII 를 이용하여, FGF5 varient 2에 해당하는 PN 5'-AAAGGTACCATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC-3' primer (서열목록 중에서 서열번호 19)와 5'-AAAAAGCTTTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTCTGTGAACTTGGCTTAACATATTGGCTTCGT-' primer (서열목록 중에서 서열번호 20)를 이용하여 유전자를 합성하고, 제한효소 KpnI과 HindII로 절단후 ligation하였다. 제조된 재조합 벡터 (pAdTrack-CMV hFGF5-2)는 대장균에 형질전환하여 증폭시켰으며, PmeI 제한효소로 절단한 pAdTrack-CMV hFGF5-2 벡터와 pAdEASY 벡터를 E. coli BJ5183 cells에 형질전환하여 hFGF5-2를 발현하는 형질전환된 E. coli BJ5183 cells-hFGF5-2를 선별하였다, 이후, 목적 유전자를 분리 후 293T 세포를 이용하여 아데로바이러스 hFGF5-2를 제작하였다.
실시예 2. 간섬유증 모델로서 In vivo 식이유도 비알콜성 지방간질환(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: 이하 NAFLD)의 제작 및 유전자 주입
특정 병원체가 없는 수컷 C57BL/6J 생쥐 (6주령)는 DBL (충청도, 한국)에서 구입하여 치료 시작 1주일 전에 사육 환경에 적응시켰다. 생후 7주에 마우스를 무작위로 두 그룹으로 나누었다. 6주 동안, 정상 그룹 (n=8)에게는 상업용 표준 식단을 공급했고, 간섬유화 그룹 (n=24)에게는 CDAA-HFD (A06071302, Research Diets, NJ, USA)를 공급하였다. CDAA-HFD는 콜린이 결핍된 L-아미노산 및 메티오닌을 포함하는 고지방 식단으로, NAFLD (Nonalcoholic fatty liver disease; 단순 지방간, 지방간염, 간섬유증 (지발코올 지방간 연관 간경변증)을 유도한다.
간섬유화 그룹은 다시 공벡터 투여군; 전장 FGF5 (FGF5-F로도 지칭됨; FGF5 full sequence) 투여군; 및 FGF5 변이체 FGF5-v2 (FGF5-S로도 지칭됨) 투여군으로 나누어 실험을 진행했다. 이를 위해, 상기 실시예 1에서 제조된 pAd-GFP-대조군 (n=8), pAd-hFGF5 (FGF5-F 발현용 벡터) (n=8), 또는 pAd-hFGF5-v2 (FGF5-v2 발현용 벡터) (n=8)를 1Х109개씩 마우스의 꼬리 정맥을 통해 한 번에 주입했다. 고지방 식이를 섭취하지 않은 정상 마우스 그룹에게는 PBS를 투여했다. 12일 후 모든 마우스를 대상으로 내당능 테스트를 수행하였으며, 2일 후 동물을 CO2로 안락사시켰다. 모든 마우스는 매주 체중을 측정하였다. 마우스는 특정 병원균이 없는 조건에서 온도 (23 ± 3℃)와 상대 습도 (40-60%)가 제어되는 방에서 사육되었다.
실시예 3. In vivo NAFLD 마우스 모델에서 FGF5-v2 유전자 주입으로 인한 간섬유증 억제 효과 확인
상술한 바와 같이, 정상 마우스 또는 NAFLD 마우스에 공벡터 (control), 전장 FGF5 (FGF5-F), 또는 FGF5-v2 (FGF5-S)를 처리하고, 포도당 부하 검사 (GTT)를 수행한 후 각 마우스의 간조직을 채취하여 지방간 지표인 NAS score와 Fibrosis sicore를 측정하였다. 구체적으로, 조직의 지방증 및 섬유증 정도는 병리학자가 염색된 마우스 조직의 사진을 보고 채점하는 방식으로 평가되었다. 지방증은 정량적 병리학적 표준에 따라 (지방증, 염증 및 간세포 팽창) 수치적으로 점수를 매겼다. 섬유증은 마우스의 간조직 단편을 Sirius Red로 염색한 후, 이를 관찰하여 F0기(섬유증 없음), F1기(경증), F2기(중등도), F3기(섬유화 가교) 및 F4기(간경변증)로 점수를 매겨 평가됐다.
먼저, 지방증 평가 결과는 도 3a에 나타냈다. CDAA-HFD가 공급된 NAFLD 마우스는 정상 식이가 공급된 마우스에 비해 지방간의 지표인 NAS score가 현저하게 증가하였으며, NAFLD 마우스 중 미처리 대조군, FGF5-F 처리군, 및 FGF5-S 처리군 간에 NAS score의 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 반면, 섬유증 정도를 비교한 결과, 도 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이, CDAA-HFD 식이에 의해 현저하게 증가했던 섬유화 정도가 전장 FGF5-F를 처리하였을 때에는 미처리 대조군과 유의미한 차이가 없었으나, 본 발명의 FGF5 전사체 변이체인 FGF5-v2를 처리하였을 때에는 섬유화 정도가 크게 감소한 것으로 나타났다. 상기 결과로부터 FGF5-v2가 지방간 자체에 대한 효과 보다는 지방간에서 나타나는 간섬유화에 특이적으로 현저한 개선효과가 있음을 확인하였다.
실시예 4. FGF5-v2 유전자 주입에 의한, in vivo NAFLD 마우스 모델의 혈청 (serum) 내 비알콜성 지방간 섬유증 억제 확인
본 실시예에서는 마우스 모델들의 혈청 분석을 통해 본 발명의 FGF5 전사체 변이체에 의한 간섬유화 억제 효과를 확인하였다. 구체적으로, 지방간 섬유화 정도를 나타내는 바이오마커의 혈청 내 수준을 정량하였다.
구체적으로, 마우스를 호흡 마취기를 사용하여 이소플루란으로 마취한 후 안락사시켰으며, 심장 천자에서 혈액을 채취했다. 채취된 혈액은 4℃에서 4,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하였으며, 혈청을 수집하고, -80℃에 보관한 후 추후 분석에 사용하였다. 혈청 내에 존재하는 모든 대사 관련 인자 (AST, ALT, TG, HDL, LDL, 및 포도당 등)의 수준은 제조사의 프로토콜 (Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)에 따라 Advia 1800 Chemistry System을 사용하여 상기와 같이 확보된 혈청 샘플에서 측정되었다.
그 결과, HDL과 LDL은 미처리 대조군 (Control)과 전장 FGF5 또는 FGF5-v2 처리군간에 유의한 차이가 확인되지 않았으나 (도 4e 및 4f), 지방간 질환에서 간세포 손상 마커로 사용되는 AST 및 ALT의 분석 결과, 미처리 대조군이나 전장 FGF5 처리군 대비 FGF5-v2 처리군에서 이들의 수준이 현저하게 감소한 것으로 나타났다 (도 4a 내지 4c). 또한, 중성지방 (triglyceride, TG) 및 글루코오스 역시 기타 그룹 대비 FGF5-v2 처리군에서 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 4d 및 4g). 상기 결과들은 본 발명의 FGF5-v2가 비알콜성 지방간과 관련된 질환에서 간섬유화 억제에 특히 우수한 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 5. FGF5-v2 유전자 주입에 의한, in vivo NAFLD 마우스 모델의 간 조직 mRNA에서 간 섬유화 마커의 억제 확인
본 실시예에서는 각 마우스 모델의 간조직에서 섬유화 관련 인자들의 mRNA 수준을 분석하여 본 발명의 FGF5 전사체 변이체에 의한 간섬유화 억제 효과를 RNA 수준에서 확인하였다.
RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 분리되었다. NanoDrop 분광광도계(Thermo, MA, USA)를 사용하여 RNA 품질 및 총 RNA 수율, 260/280 및 260/230 비율을 측정했다. 총 RNA는 제조업체의 프로토콜 (Takara, Shiga, Japan)에 따라 PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit를 사용하여 상보적 DNA로 역전사되었다. 상보적 DNA 주형의 정량화는 CFX384 기기(Bio-Rad, CA, USA)에서 SYBR 녹색 형광(Takara)을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행되었다. 프라이머의 정보는 다음과 같다: mα-SMA forward 5'- TGC TGA CAG AGG CAC CAC TGA A-3' 및 reverse 5'- CAG TTG TAC GTC CAG AGG CAT AG-3'; mCol1α1 forward 5'-CCT CAG GGT ATT GCT GGA CAA C-3' 및 reverse 5'- CAG AAG GAC CTT GTT TGC CAG G-3'; mFibronectin forward 5'-CCC TAT CTC TGA TAC CGT TGT CC -3' 및 reverse 5'- TGC CGC AAC TAC TGT GAT TCG G -3'; mVimentin forward 5'-CGG AAA GTG GAA TCC TTG CAG G-3' 및 reverse 5' AGC AGT GAG GTC AGG CTT GGA A-3'; mHPRT forward 5' CTG GTG AAA AGG ACC TCT CGA AG-3' 및 reverse 5'- CCA GTT TCA CTA ATG ACA CAA ACG-3'.
그 결과, 대조군이나 FGF5 (Full) 처리군 대비 FGF5-v2 처리군에서 섬유화의 주요 마커인 α-SMA 및 Col1α1가 유의미하게 감소한 것으로 나타났다 (도 5a 및 5b). EMT marker로도 알려져 있는 Fibronectin 및 Vimentin의 경우, FGF5 (Full) 처리군은 미처리 대조군에 비해 오히려 증가한 수준을 보였으나, 반면 FGF5-v2 처리군의 경우 대조군과 유사한 수준을 나타냈다 (도 5c 및 5d). 상기 결과는 본 발명의 FGF5 전사체 변이체가 비알콜성 지방간 질환에서 간섬유화 관련 인자들의 발현을 억제하여 간섬유화를 억제할 수 있음을 보여주는 것이다. 한편, 전장 FGF5 또는 FGF5-v2의 유전자가 도입된 각 마우스 모델에서 전장 FGF5 및 FGF5-v2의 전사체 발현을 각각 측정한 결과, 전장 FGF5 유전자 주입군은 FGF5-v2 전사체는 검출되지 않고 전장 FGF5만 검출된 반면, FGF5-v2 유전자 주입군은 전장 FGF5 전사체는 검출되지 않고 FGF5-v2만 검출되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5e 및 5f).
실시예 6. FGF5-v2 유전자 주입에 의한, in vivo NAFLD 마우스 모델의 간 조직 단백질 수준에서 간 섬유증의 억제 확인
본 실시예에서는 각 마우스 모델의 간조직에서 섬유화 관련 인자들의 단백질 수준을 ELISA 및 Western blot으로 분석하여 본 발명의 FGF5 전사체 변이체에 의한 간섬유화 억제 효과를 단백질 수준에서 확인하였다.
구체적으로, 마우스로부터 분리된 간조직을 PhosSTOP 및 프로테아제 억제제 (Roche, Basel, Switzerland)가 보충된 T-PER 완충액 (Thermo, MA, USA)에서 용해시키고 4℃에서 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리했다. 단백질 농도는 BCA 분석(Thermo)에 의해 정량되었다. 일정한 농도의 조직 단백질에 대해 ELISA 실험 기법으로 IL-6 및 IL-1β (R&D systems, MA, USA)의 양을 측정하거나, SDS-PAGE를 이용한 Immuno blot실험을 통해 측정하였다. α-SMA (abcam, Cambridge, UK) 및 β-액틴 (Cell signaling, MA, USA) 등의 항체를 사용하였다.
그 결과, 염증성 마커인 IL-1β 및 IL-6의 경우 control 대비 FGF5-v2 처리군에서 유의한 차이를 나타내지는 않았으나 (도 6a 및 도 6b 참조), 섬유화 마커 α-SMA의 경우 기타 그룹 대비 FGF5-v2가 주입된 마우스 모델에서 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 6c). 상기 결과는 마우스 모델의 비알콜성 지방간에서, 본 발명의 FGF5 전사체 변이체의 투여는 염증 개선에 비해 간섬유화 감소에 특히 효과적임을 의미한다.
실시예 7. FGF5-v2 유전자 주입 in vivo NAFLD 마우스 모델의 혈청 및 간 조직에서, cytokine 및 chemokine 단백질 발현 확인
본 실시예에서는 각 마우스 모델의 혈청 및 간조직에서 싸이토카인 및 케모카인의 수준을 분석하여, 본 발명의 FGF5 전사체 변이체의 투여에 따른 치료 효과를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 4에 기재된 바와 같이 각 마우스로부터 혈청을 획득하였으며, 실시예 6에 기재된 실험방법과 동일한 방식으로 간조직 분획물을 수득하였다. cytokine과 chemokine 단백질 발현 수준은 MILLIPLEX MAP 마우스 Mouse Cytokine/Chemokine Kit (R&D systems)를 사용하여 측정되었다. 형광 강도는 MAGPIX® (Luminex Corporation, Austin, TX)에서 판독되었다.
그 결과, 도 7a에서 확인할 수 있는 바와 같이, FGF5-v2 가 투여된 NAFLD 마우스는 기타 NAFLD 마우스 그룹에 비해 간섬유증 관련 주요 세포인 간성상세포가 분비하는 싸이토카인 및 케모카인들 (CCL2, CCL5, CCL11, 및 CXCL2)의 수준이 두드러지게 감소하였다. 뿐만 아니라, 섬유화에 관여하는 CXCL1 및 섬유아세포성장인자 21 (FGF21) 또한 FGF5-v2 투여군에서 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 나아가, FGF5-v2 투여군은 항염증 싸이토카인인 IL-10의 혈청 내 수준이 기타 그룹에 비해 높은 것으로 나타났다.
도 7b에서 확인할 수 있는 바와 같이 간 조직의 단백질 수준에서도, 기타 그룹 대비 FGF5-v2 투여군의 CCL2, CCL5, CCL11, 및 CXCL2의 발현이 감소하였으며, 섬유아세포성장인자 21 (FGF21)의 수준 역시 유의하게 감소하였다.
상기 결과들은, 본 발명의 FGF5 전사체 변이체는 비알콜성 지방간질환에서 섬유화를 촉진하는 싸이토카인 및 케모카인의 생성 및 분비를 억제하고, 항염 싸이토카인의 수준은 증가시켜 간섬유증을 개선 및 치료할 수 있음을 보여준다.
실시예 8. FGF5-v2 유전자 주입 in vivo NAFLD 마우스 모델의 간 조직 염색 비교 (Sirius red staining 및 H&E staining)
본 실시예에서는 NAFLD 마우스 모델의 간조직에서 섬유화의 지표로 알려져 있는 Sirius red staining을 통해 간섬유증의 진행 정도, H&E staining을 통해 지방간 질환의 진행 정도를 확인하였다.
구체적으로, 앞선 실시예와 같이 각 마우스로부터 간조직 표본을 확보한 후, 이를 10% 완충 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후 5 μm 두께로 절단하여 조직 절편을 확보하였다. 각 조직 절편은 제조사의 지시에 따라 피크로 시리우스 레드 염색 키트 (abcam)를 사용하여 시리우스 레드로 염색하였다. H&E staining은 통상의 방법에 따라 진행하였다.
Sirius red staining 결과는 도 8a에, H&E staining 결과는 도 8b에 나타냈다. 조직 절편의 Sirius red로 염색된 간 조직을 100배율 또는 400배율로 확대하여 비교 분석한 결과, FGF5 full 유전자가 주입된 그룹의 간조직은 미처리 대조군과 비교하여 Sirius red의 염색 정도에 별다른 차이를 보이지 않았다. 반면, FGF5-v2 유전자가 주입된 마우스의 간조직은 기타 그룹에 비해 Sirius red의 염색 정도가 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었다 (도 8a). 상기 결과는 FGF5-v2가 간에서의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
H&E staining을 수행한 간 조직을 100배율 또는 400배율로 확대하여 비교 병리 조직 분석한 결과, FGF5 full 유전자가 주입된 그룹의 간조직, FGF5-v2 유전자가 주입된 그룹의 간조직 및 미처리 대조군 간에 H&E staining의 병리조직분석에서 지방간(steatosis) 정도는 유의미한 차이가 나타나지 않았음을 확인할 수 있었다 (도 8b). 상기 결과는 FGF5-v2 유전자가 지방간 자체에 대한 효과가 있기 보다는 지방간에서 나타나는 간섬유화에 특이적으로 현저한 개선효과가 있음을 보여준다.
실시예 9. FGF5-v2 단백질의 간성상세포주 실험을 통한 FGF5 길항작용 확인
본 실시예에는 간성상세포주(LX2 세포)를 활용한 자극 실험을 진행하여, 본 발명의 FGF5 전사체 변이체에 의한 간 섬유화 억제 효과를 단백질 수준에서 확인하였다.
간성상세포(LX2 세포)를 동일하게 전날 seeding한 뒤 다음날 starvation 과정을 1시간 정도 주고 recombinant protein FGF5를 100ng/ml로 처리해 time point로 total ERK와 phospho-ERK의 단백질 수준을 확인해 보았다. 이때 control로 간모세포종(HepG2)도 같이 진행하였다.
그 결과 total ERK의 수준은 변화되지 않았지만 짧게 5분만 처리해준 군에서 phospho-ERK 수준이 증가되었다가 10분 이후 처리해준 군부터는 점차 감소됨을 확인해 볼 수 있었다 (도 10a). 하지만 간모세포종(HepG2)에서는 큰 차이가 없었다.
또한 FGF5-v2의 작용을 알아보기 위해 위와 동일한 조건에서 FGF5-v2 단백질만(FGF5s)을 처리해 주었을 때는 간성상세포 자극반응을 phospho-ERK 반응으로 반정량한 결과 변이단백질에 대해서 반응 수준이 유의한 차이를 보이지 않았다(도 10b).
그리고 동일한 조건에서 FGF5와 FGF5-v2 protein(FGF5s)을 1배, 3배, 5배씩 같이 처리해 주었다. 그 결과 FGF5만 처리해 주었을 때는 phospho-ERK 수준이 증가되었지만 FGF5-v2를 같이 처리해준 군에서 phospho-ERK의 수준이 감소되었고, 같은 양을 처리 하였을 때 보다 FGF5-v2의 양을 더 많이 처리해 주었을 때 phospho-ERK의 수준이 더 많이 감소됨을 확인함으로써 FGF5-v2가 FGF5의 길항작용을 한다고 확인할 수 있었다(도 10c). 동일하게 진행한 간모세포종(HepG2)에서는 변화가 없었다.
간성상세포(LX2 세포) 실험 결과를 total ERK로 반정량 값을 이용하여 보정한 후 phospho-ERK의 발현 값을 확인해 보았을 때 유의한 차이를 확인해 볼 수 있었다. 이 결과는 위에서 진행한 동물실험 결과들로 유추할 수 있는 기전과 같은 결과로서 FGF5-v2 단백질이 FGF5의 간성상세포에 대한 작용을 길항하여 간섬유화 억제 작용하는데 효과적임을 보여준다.
이상의 실시예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 FGF5 전사체 변이체, FGF5-v2는 비알코올성 지방간 동물모델에서 섬유화 촉진 인자들의 수준을 억제하고, 항염 싸이토카인의 수준은 증가시켜 간섬유화를 효과적으로 억제 및 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명의 FGF-v2는 우수한 간섬유화 억제 효과를 통해 간경변증이나 간암과 같은 다양한 간섬유화 관련 질환의 예방 및 치료에 유용히 활용될 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명과 관련된 서열정보는 아래 표 1에 나타냈다.
Figure PCTKR2023018303-appb-img-000001
Figure PCTKR2023018303-appb-img-000002
Figure PCTKR2023018303-appb-img-000003
Figure PCTKR2023018303-appb-img-000004
Figure PCTKR2023018303-appb-img-000005
Figure PCTKR2023018303-appb-img-000006
본 발명에 따른 섬유아세포성장인자 (fibroblast growth factor 5, FGF5)의 전사체 변이체 FGF5-v2 및 이의 단백질은 전장 FGF5의 아미노산 서열을 조절하여 개발한 것이다. 상기 전사체 변이체 및 이의 단백질은 간 섬유화의 진행을 억제하고 간 섬유화 등과 동반된 간기능 이상, 그리고 여러가지 염증 및 섬유화관련 싸이토카인 증가 등을 개선하는 효과가 있음이 확인되었다. 따라서, FGF5-v2를 코딩하는 유전자, 이의 전사체, 단백질, 및/또는 이들이 담지된 다양한 전달체 (예, AAV)를 환자에게 투여함으로써 간 섬유화를 억제하여 간경변증이나 간암 등을 포함한 다양한 질환에 대해 예방, 개선, 및 치료 효과를 달성할 수 있을 것으로 기대되는 바 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는, FGF5-v2 단백질.
  2. 제1항의 FGF5-v2 단백질을 암호화하는, 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 핵산분자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
  4. 제2항 또는 제3항의 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
  5. 제4항의 발현벡터가 도입된, 단리된 세포.
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는, 간 섬유화증 (liver fibrosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 FGF5-v2 단백질, 상기 핵산 분자, 상기 발현벡터, 또는 상기 세포는 전달체에 담지된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 FGF5-v2 단백질, 상기 핵산 분자, 또는 상기 발현벡터를 유효성분으로 포함하고, 상기 전달체는 바이러스 입자, 소포체 (vesicles), 나노입자, 마이크로입자, 리포좀, 트랜스포존, 마이셀 (micelle), 항체, 및 엑소좀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 약학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 간 섬유화증은 알코올성 지방간 질환, 비알코올성 지방간 질환, C형 간염, B형 간염, 자가면역성 간염, 간성 뇌증, 원발성 담즙성 경화증, 간암, 및 간세포성암종으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서의 간 섬유화증인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 비알콜성 지방간 질환은 비알코올성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis; NASH), 비알코올성 지방간 (non-alcoholic fatty liver; NAFL), 간지방증 (hepatic steatosis), 급성 임신성 지방간 (Acute Fatty Liver of Pregnancy; AFLP), NAFLD-연관 간부전 (liver failure), NAFLD-연관 간 섬유증 (liver fibrosis), NAFLD-연관 간경화, 및 NAFLD-연관 간암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 항염증제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항염증제는 스테로이드성 항염증제 또는 비스테로이드성 항염증제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 섬유화증의 예방 또는 치료방법.
  14. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 간 섬유화증의 예방 또는 치료 용도.
  15. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 FGF5-v2 단백질; 상기 FGF5-v2 단백질을 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터; 또는 상기 발현벡터가 도입된 단리된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 간 섬유화증의 예방 또는 치료 제제를 제조하기 위한 용도.
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