WO2024123109A1 - 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 - Google Patents

퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 Download PDF

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이지현
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김도연
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    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present application relates to microorganisms whose serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity; A method for producing purine nucleotides comprising culturing the microorganism in a medium; A composition for producing purine nucleotides comprising the microorganism, a culture of the microorganism, a fermentation product of the microorganism, or a combination of two or more thereof; and the use of said microorganism for producing purine nucleotides.
  • the above-mentioned methods for producing purine nucleotides include (1) enzymatically decomposing ribonucleic acid (RNA) extracted from yeast cells, (2) cultivating microorganisms that produce them and directly recovering purine nucleotides in the culture medium. There are a fermentation production method, (3) a method of chemically phosphorylating nucleosides produced by fermentation, and (4) a method of enzymatically phosphorylating nucleosides produced by fermentation (Korean Patent Registration No. 10-1049023). Ho, Japanese Patent Publication No. 4363042, Korean Patent Registration No. 10-1210704, Agri. Chem., 36(9), 1511-1522).
  • method (1) has problems with raw material supply and economic feasibility, while method (2) is widely used because it is economically and environmentally advantageous.
  • GMP production which is one of the purine nucleotides
  • a method of producing GMP by enzymatically converting XMP produced through microbial fermentation is also used.
  • ROS reactive oxygen species
  • the present inventors have disclosed a microorganism whose serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity, a method for producing purine nucleotides comprising culturing the microorganism in a medium, the microorganism, a culture of the microorganism, and a fermented product of the microorganism. Or, the present application was completed by developing a composition for producing purine nucleotides containing a combination of two or more of them and a use of the microorganism for producing purine nucleotides.
  • One aspect of the present application provides a microorganism having a purine nucleotide production ability in which serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity.
  • the microorganism may be one in which the activity of any one or more proteins selected from the group consisting of the following (a) to (d) is adjusted:
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the microorganism of the Corynebacterium genus may be Corynebacterium stationis.
  • the microorganism may have an increased ability to produce purine nucleotides compared to an unmodified microorganism.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing purine nucleotides, comprising culturing in a medium a microorganism whose serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity.
  • the method may additionally include the step of recovering the target substance from the cultured microorganism, a culture of the microorganism, a fermentation product of the microorganism, or the culture medium.
  • compositions for producing purine nucleotides comprising a microorganism whose serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity, a culture of the microorganism, a fermentation product of the microorganism, or a combination of two or more of these. to provide.
  • Another aspect of the present application provides the use of a microorganism whose serine dehydratase protein activity is weakened compared to its intrinsic activity for producing purine nucleotides.
  • the term “about” may appear before a specific numeric value.
  • the term “about” includes not only the exact number written after the term, but also a range that is approximately that number or close to that number. By considering the context in which the number is presented, one can determine whether it is close to or close to the specific number mentioned.
  • the term “about” may refer to a range of -10% to +10% of a numeric value.
  • the term “about” may refer to a range of -5% to +5% of a given numeric value. However, it is not limited to this.
  • the terms “first, second, third,,” “i), ii), iii)...” or descriptions such as “(a), (b), (c), (d)...” is used to distinguish similar configurations, and these terms are not intended to be performed sequentially or in sequence.
  • the steps may be performed simultaneously, with no time interval, or may be performed in seconds, minutes, hours, days, or Alternatively, it may be performed several months apart.
  • the term “consisting essentially of” means that an unspecified component may be present if the characteristics of the subject matter claimed in the present application are not substantially affected by the presence of the unspecified component.
  • the term “consisting of” means that the proportion of a particular ingredient(s) totals 100%. Ingredients or features that follow the term “consisting of” may be essential or obligatory. In some embodiments, in addition to the components or features listed below as “consisting of” any other optional or non-essential components may be excluded.
  • the term “comprising” means the presence of a feature, step, or component described below the term, and does not exclude the presence or addition of one or more features, steps, or components.
  • Components or features described below as “including” in this application may be essential or mandatory, but in some embodiments, other optional or non-essential components or features may be further included.
  • One aspect of the present application provides a microorganism having a purine nucleotide production ability in which serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity.
  • the attenuated serine dehydratase protein activity is a natural wild-type microorganism or an unmodified microorganism (e.g., a microorganism expressing a polypeptide having wild-type serine dehydratase protein activity (e.g., the polypeptide of SEQ ID NO: 66) or It may be defined as the increased purine nucleotide production capacity of the microorganism of the present application compared to the production capacity of the strain (the strain before the serine dehydratase protein activity is weakened or weakened compared to the intrinsic activity), but is not limited thereto.
  • the serine dehydratase protein activity can be measured by measuring purine nucleotide production ability or yield, but is not limited thereto.
  • the term “serine dehydratase (L-serine dehydratase)” is an enzyme that catalyzes the chemical reaction of L-serine ⁇ pyruvate + NH 3 .
  • the serine dehydratase of this application can be used interchangeably with SdaA or L-serine ammonia decomposition enzyme.
  • the serine dehydratase of the present application may be a protein having serine dehydratase activity encoded by the sdaA gene, but the type is not particularly limited as long as it has an activity corresponding to serine dehydratase.
  • the serine dehydratase encoded by the sdaA gene is known in the art, and the amino acid and polynucleotide sequences of the serine dehydratase can be obtained from known databases, examples of which include GenBank of NCBI, but are limited thereto. It doesn't work.
  • the serine dehydratase protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 or an amino acid sequence with more than 60% homology or identity, but as long as it has serine dehydratase protein activity. , but is not limited to this.
  • the polypeptide having serine dehydratase protein activity is SEQ ID NO: 66 or at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of SEQ ID NO: 66, Alternatively, it may have, include, consist of, or essentially consist of an amino acid sequence having at least 99% homology or identity.
  • the serine dehydratase protein may refer to a protein inherently present in Corynebacterium genus microorganisms or Corynebacterium stasis, but is not limited thereto, and specifically, Corynebacterium genus It may be a serine dehydratase protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66, which is inherently present in microorganisms or Corynebacterium stasis, but is not limited thereto.
  • sequences that do not change the function of the protein are added before and after the amino acid sequence, mutations that may occur naturally, silent mutations, or preservation thereof. Substitutions are not excluded, and it is obvious that such sequence additions or mutations are within the scope of the present application.
  • a polypeptide can be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of a protein that is involved in the transfer of the protein co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
  • conservative substitution means replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. These amino acid substitutions may generally occur based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine
  • Negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and aspartic acid
  • Amino acids with nonpolar side chains include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline
  • Amino acids with polar or hydrophilic side chains (polar amino acids) can be classified into serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • amino acids with electrically charged side chains such as arginine, lysine, histidine, glutamic acid, and aspartic acid
  • amino acids with uncharged side chains also referred to as neutral amino acids
  • It can be classified into glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be classified as aromatic amino acids.
  • valine, leucine, and isoleucine can be classified as branched amino acids.
  • 20 types of amino acids are classified according to size, starting from the amino acid group with relatively small volume; glycine, alanine, serine; Cysteine, proline, threonine, aspartic acid, asparagine; Valine, histidine, glutamic acid, glutamine; Isoleucine, leucine, methionine, lysine, arginine; and phenylalanine, tryptophan, and tyrosine.
  • conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the polypeptide.
  • the base sequence encoding the serine dehydratase may be a base sequence encoding a protein exhibiting serine dehydratase activity.
  • the serine dehydratase protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 has 60% or more, 70%, 75%, or 80% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 67 or the sequence of SEQ ID NO: 67. or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% of the nucleotide sequence, or may consist of or consist essentially of the nucleotide sequence. It may be encoded by a polynucleotide, but is not limited thereto. Additionally, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 can be obtained from known databases, examples of which include NCBI's GenBank, but are not limited thereto.
  • the gene containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 is a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67, a gene or polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67, and a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67.
  • it can be used in combination with polynucleotide.
  • the polynucleotide of the present application does not change the amino acid sequence of the serine dehydratase of the present application due to codon degeneracy or in consideration of the preferred codon in the organism in which the serine dehydratase of the present application is to be expressed.
  • Various modifications may be made to the coding area within the scope not permitted. Therefore, it is obvious that a polynucleotide that can be translated into a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the serine dehydratase of the present application or a polypeptide having homology or identity thereto due to codon degeneracy may also be included.
  • the polynucleotide of the present application may be SEQ ID NO: 67 or a degenerated sequence thereof.
  • the polynucleotide of the present application has at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, and at least 96% homology or identity with SEQ ID NO: 67. , has or includes a nucleotide sequence that is 97% or more, 98% or more, and less than 100%, or has 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, or 85% or more homology or identity to SEQ ID NO: 67. , 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% of base sequences, but is not limited thereto.
  • polynucleotide of the present application can be hybridized under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known genetic sequence, for example, a complementary sequence to all or part of the polynucleotide sequence of the present application, and the serine dehydration of the present application Any sequence encoding a chemical enzyme may be included without limitation.
  • homology refers to the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related and may be expressed as a percentage.
  • homology and identity can often be used interchangeably.
  • sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and may be used with a default gap penalty established by the program used.
  • Substantially homologous or identical sequences generally undergo moderate or high stringency conditions along the entire sequence or at least about 50%, 60%, 70%, 80%, or 90% of the full-length. It can hybridize under stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes polynucleotides containing common codons or codons taking codon degeneracy into account.
  • Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity, or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: It can be determined using a known computer algorithm such as the "FASTA” program using default parameters as in 2444. Or, as performed in the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later), It can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
  • a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) unitary matrices (containing values 1 for identity and 0 for non-identity), PAM Matrix (Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence) And Structure, disclosed by the National Biomedical Research Foundation (1978)), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: Weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) permutation matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10 and a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity, or identity can be confirmed by comparing the sequences by Southern hybridization experiments under defined stringent conditions, and the appropriate hybridization conditions defined are within the scope of the relevant technology. , can be determined by methods well known to those skilled in the art (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). , but is not limited to this.
  • stringent condition refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8. For example, among polynucleotides with high homology or identity, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, Conditions in which polynucleotides with 98% or more or 99% or more homology or identity hybridize with each other, and polynucleotides with lower homology or identity do not hybridize with each other, or washing conditions for normal southern hybridization 1 time at a salt concentration and temperature equivalent to 60°C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, Specifically, conditions for washing 2 to 3 times can be listed.
  • hybridization requires that two nucleotides have complementary sequences, although mismatches between bases may be possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other.
  • adenosine is complementary to thymine
  • cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotide of the present application may also include substantially similar base sequences as well as isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence.
  • a polynucleotide having homology or identity to the polynucleotide of the present application can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55°C and using the conditions described above.
  • the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art depending on the purpose.
  • the appropriate stringency to hybridize the polynucleotide depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, variables that are well known in the art (e.g., J. Sambrook et al., supra).
  • purine nucleotide specifically refers to 5'-inosine acid (5'-inosine monophosphate; hereinafter IMP), 5'-xanthosine monophosphate (5'-xanthosine monophosphate; hereinafter XMP), and 5'-guanic acid (5'-guanic acid). It may be any one or more nucleotides selected from the group consisting of '-guanosine monophosphate (hereinafter referred to as GMP).
  • GMP '-guanosine monophosphate
  • the IMP is a compound in which adenine is deaminated and means a nucleotide composed of one molecule each of hypoxanthine, ribose, and phosphate.
  • the XMP refers to a nucleotide dehydrogenated from IMP. It can be synthesized from IMP by 5'-inosine-5'-monophosphate dehydrogenase.
  • the GMP refers to a nucleotide having a structure in which a phosphate group forms an ester bond to the ribose portion of a guanosine molecule.
  • the GMP can be synthesized by adding ammonia molecules to XMP by 5'-guanic acid biosynthetic enzyme (GMP synthase).
  • GMP synthase 5'-guanic acid biosynthetic enzyme
  • the method for producing GMP from XMP and/or the means used in the method may be selected from known techniques.
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and microorganisms that have undergone natural or artificial genetic modification, and can be caused by insertion of foreign genes or increased activity or inactivation of intrinsic genes. It is a microorganism in which a specific mechanism is weakened or increased, and may be a microorganism that includes genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein, or product.
  • microorganism and strain have the same meaning and can be used interchangeably without limitation.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism (e.g., a recombinant strain) in which the serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity, but is not limited thereto.
  • a microorganism e.g., a recombinant strain
  • the serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity, but is not limited thereto.
  • microorganism having the ability to produce purine nucleotides refers to a prokaryotic or eukaryotic microbial strain capable of producing purine nucleotides within a living organism, a microorganism in which the ability to produce purine nucleotides is imparted to a parent strain that does not have the ability to produce purine nucleotides, or an intrinsic microorganism. Therefore, it can include all microorganisms that have the ability to produce purine nucleotides. The ability to produce purine nucleotides can be conferred or enhanced by species improvement.
  • non-modified microorganism does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and is either a wild-type strain or a natural strain itself, or a strain that is transformed by genetic mutation due to natural or artificial factors. It may refer to the strain before change.
  • non-transformed microorganism refers to “pre-transformed strain”, “pre-transformed microorganism”, “non-mutated strain”, “non-modified strain”, “non-mutated microorganism”, “pre-mutated parent strain”, “wild-type microorganism”, “ May be used interchangeably with “reference microorganism” or “reference microorganism.”
  • the unmodified microorganism may refer to a strain in which the serine dehydratase protein activity of the present application is not weakened or is not weakened compared to the intrinsic activity, but is not limited thereto.
  • the unmodified microorganism may be a microorganism containing an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 66 or a polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 67, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application may include all microorganisms in which the serine dehydratase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity and can produce the desired purine nucleotide.
  • the microorganism of the present application is characterized by increased purine nucleotide production ability by weakening the serine dehydratase protein activity compared to the intrinsic activity, and may be a genetically modified microorganism or a recombinant microorganism, but is not limited thereto. .
  • the recombinant strain with increased purine nucleotide production ability may be a microorganism with increased purine nucleotide production ability compared to a natural wild-type microorganism or an unmodified microorganism with intrinsic activity of serine dehydratase protein, but is not limited thereto. .
  • a microorganism having the ability to produce purine nucleotides is a prokaryotic or eukaryotic microbial strain capable of producing purine nucleotides within a living organism, and the weakened microbial strain of the present application is a microorganism that inherently has the ability to produce purine nucleotides or a parent strain that does not have the ability to produce purine nucleotides. It may include all microorganisms endowed with the ability to produce purine nucleotides due to serine dehydratase protein activity. The ability to produce purine nucleotides can be conferred or enhanced by species improvement.
  • the “intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the change in trait when the trait changes due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This refers to the activity of “activity before modification” and Can be used interchangeably.
  • weakening of polypeptide activity is a concept that includes both weakening of activity or absence of activity compared to intrinsic activity.
  • the weakening may include deficiency, inactivation, deletion, disruption, down-regulation, decrease, attenuation, repression, reduction, etc.
  • the terms may be used interchangeably.
  • the weakening may mean that the protein is active but not completely inactivated by deletion, and the protein's activity is weakened compared to the unmodified microorganism, wild-type strain, or parent strain, but is limited to this. It doesn't work.
  • the weakening may be, but is not limited to, inactivation.
  • the inactivation may mean that the protein is not expressed at all compared to the parent strain or a strain in which the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66 is not modified, or even if expressed, its activity is absent or weakened.
  • the weakening occurs when the activity of the polypeptide itself is weakened or eliminated compared to the activity of the polypeptide originally possessed by the microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, inhibition of expression of the gene encoding the polypeptide, or translation into a polypeptide. This may also include cases where the overall level of polypeptide activity within the cell is lower than that of the natural strain due to inhibition, etc., cases where the gene is not expressed at all, and cases where there is no polypeptide activity even when the gene is expressed.
  • the fact that the activity of a polypeptide is weakened compared to the intrinsic activity means that it is lowered compared to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the transformation.
  • the weakening of the activity of the polypeptide can be confirmed by weakening the degree of activity of the polypeptide, the expression level, or the amount of product released from the polypeptide.
  • the weakening is such that the activity of the serine dehydratase protein is less than about 100%, about 90% or less, about 80% or less, about 70% of the activity of the serine dehydratase protein of the parent strain or unmodified microorganism before the change in character.
  • it may be about 60% or less, about 50% or less, about 40% or less, about 30% or less, about 20% or less, about 10% or less, about 5% or less, or 0%, but is not limited thereto.
  • the inactivation may mean that the expression of the serine dehydratase protein is not expressed at all compared to an unmodified microorganism, or that even if it is expressed, the activity is absent or weakened.
  • Attenuation of the activity of such a polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by applying various methods well known in the art (e.g., Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. 2014;15(2):2773-2793, Molecular Cloning 2012, etc.
  • Modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to eliminate or weaken the activity of the polypeptide e.g., one or more nucleic acids on the nucleotide sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide modified to eliminate or weaken the activity of the polypeptide) deletion/substitution/addition of base;
  • antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • Deletion of part or all of the gene encoding the polypeptide may be removal of the entire polynucleotide encoding the target polypeptide endogenous in the chromosome, replacement with a polynucleotide with a partial nucleotide sequence deleted, or replacement with a marker gene.
  • Methods for deleting part or all of these polynucleotides include deleting polynucleotides by homologous recombination using vectors for inserting chromosomes into microorganisms, inducing mutations using light such as ultraviolet rays or chemicals, and deleting the polynucleotides from the resulting mutants. This may be performed by selecting a strain lacking the target gene, but is not limited to this.
  • the method for deleting part or all of the gene may include a method using DNA recombination technology.
  • a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to the gene of interest is injected into the microorganism to cause homologous recombination, thereby causing deletion of part or the entire gene.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include, but is not limited to, a dominant selection marker.
  • modification of the expression control sequence includes mutation in the expression control region (or expression control sequence) due to deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, or change to a sequence with weaker activity. It could be a replacement.
  • the expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates the termination of transcription and translation.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 3) and 4) includes deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to weaken the activity of the polypeptide.
  • a combination thereof may result in a mutation in the sequence, or a replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
  • gene expression can be inhibited or weakened by introducing a mutation in the polynucleotide sequence to form a stop codon, but is not limited thereto.
  • modification of the base sequence of the start codon or 5'-UTR region of the gene encoding the polypeptide may be, for example, substitution of another start codon with a lower polypeptide expression rate than the internal start codon. Not limited.
  • antisense oligonucleotide e.g., antisense RNA
  • antisense RNA binds complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • Weintraub, H. et al. Antisense-RNA as a molecular tool. for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
  • Modification of part or all of the polynucleotide in the microorganism of the present application is (a) homologous recombination using a vector for chromosome insertion into the microorganism or genome editing using engineered nuclease (e.g., CRISPR-Cas9) and/or (b) It may be induced by, but is not limited to, light and/or chemical treatment, such as ultraviolet rays and radiation.
  • the method of modifying part or all of the gene may include a method using DNA recombination technology.
  • a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to the gene of interest is injected into the microorganism to cause homologous recombination, thereby causing deletion of part or the entire gene.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include, but is not limited to, a dominant selection marker.
  • the recombinant microorganism having the ability to produce purine nucleotides of the present application may include all microorganisms that can produce purine nucleotides by being transformed through a vector and weakening the serine dehydratase protein activity of the present application.
  • the vector of the present application may include a DNA preparation containing the base sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) to enable expression of the target polypeptide in a suitable host.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in this application is not particularly limited, and any vector known in the art can be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors can be used.
  • pBluescriptII series pGEM series
  • pTZ series pCL series
  • pSK series pSKH series
  • pET series pET series
  • pDZ pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pSK, pSKH130, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors, etc.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be inserted into a chromosome using a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker may be additionally included to confirm whether the chromosome has been inserted. The selection marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to confirm the insertion of the target nucleic acid molecule, and to display selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface polypeptides. Markers that provide may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or show other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • the term “transformation” refers to introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism so that the polypeptide encoding the polynucleotide can be expressed within the host cell.
  • the transformed polynucleotide can include both of these, regardless of whether it is inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding the polypeptide of interest.
  • the polynucleotide can be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide can be introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic structure containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may typically include a promoter, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal that are operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked refers to a configuration in which a control sequence is placed in an appropriate position so that the control sequence directs the expression of the coding sequence.
  • operably linked means that a regulatory region of a functional domain with known or desired activity, such as a promoter, terminator, signal sequence, or enhancer region, controls the expression, secretion, or function of a target (gene or polypeptide). It includes being attached to or connected to the target so that it can be adjusted according to the desired activity.
  • the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of the polynucleotide encoding the target variant polypeptide of the present application.
  • expression includes, but is not limited to, any step involved in the production of a polypeptide, such as transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.
  • expression vector refers to a linear or circular nucleic acid molecule containing a coding sequence and a regulatory sequence operably linked for expression thereof.
  • regulatory sequence refers to a polynucleotide sequence required for the expression of a coding sequence.
  • Each regulatory sequence may be native (identical in origin) or foreign (derived from a different gene) to the coding sequence.
  • the regulatory sequences include a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a signal peptide sequence, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates transcription and translation termination. Includes sequence.
  • the minimum unit of the regulatory sequence may include a promoter, transcription and translation termination sequences.
  • the term "recombinant" in this application means that a cell, polynucleotide, polypeptide, or vector is modified by introduction of a heterologous nucleic acid or polypeptide or alteration of a native polynucleotide or polypeptide. means that the cell is derived from a cell that has been so modified.
  • a recombinant cell may express genes not found within the native (non-recombinant) form of the cell, or may express native genes that are expressed or not expressed at all, or are otherwise abnormally expressed.
  • the microorganism that produces the purine nucleotide is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66, or at least 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 of SEQ ID NO: 66. It may be a microorganism that inherently contains a protein consisting of an amino acid sequence having more than %, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity.
  • the microorganism that produces the purine nucleotide is a polynucleotide sequence capable of encoding a protein containing an amino acid sequence with at least 80% homology to SEQ ID NO: 66, the base sequence of SEQ ID NO: 67, or SEQ ID NO: 67 Homology or identity with the base sequence is 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and It may be a microorganism that inherently contains less than 100% of its base sequence.
  • microorganisms of the present application may include all microorganisms whose serine dehydratase protein activity has been weakened compared to the intrinsic activity by various known methods.
  • the microorganism whose serine dehydratase protein activity of the present application is weakened compared to the intrinsic activity may be a microorganism in which the polynucleotide encoding the serine dehydratase protein is missing or modified, but is not limited thereto. Specifically, it may be a microorganism that lacks serine dehydratase protein activity due to a deletion in the base sequence of SEQ ID NO: 67, but is not limited thereto.
  • the microorganism with an increased ability to produce purine nucleotides in the present application may be a microorganism with an increased ability to produce purine nucleotides compared to an unmodified microorganism, but is not limited thereto.
  • the unmodified microorganism that is the target strain for comparing the increase in purine nucleotide production ability may be the CJX1664 strain or the KCCM12151P strain, but is not limited thereto.
  • the microorganism with an increased purine nucleotide production ability is about 1% or more, specifically about 1% or more, about 2.5% or more, about 5% or more, about 1% or more compared to the purine nucleotide production ability of the parent strain or unmodified microorganism before mutation. 6% or more, about 7% or more, about 8% or more, about 9% or more, about 10% or more, about 15% or more, about 20% or more, about 25% or more, about 30% or more, or about 35% or more ( The upper limit is not particularly limited and may be, for example, about 200% or less, about 150% or less, about 100% or less, about 50% or less, about 45% or less, or about 40% or less), but may be increased.
  • the recombinant strain with increased purine nucleotide production ability has a purine nucleotide production ability of about 1.1 times or more, about 1.15 times or more, about 1.2 times or more, about 1.25 times or more, or about 1.2 times or more than the parent strain or unmodified microorganism before mutation.
  • the upper limit is not particularly limited and may be, for example, about 10 times or less, about 5 times or less, about 3 times or less, about 2 times or less, about 1.5 times or less, or about 1.4 times or less) It may be increased, but is not limited to this.
  • the microorganism having the ability to produce purine nucleotides may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, but may specifically be a prokaryotic cell.
  • the prokaryotic cells are, for example, Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., and Corynebacterium genus.
  • Corynebacteria sp. Pseudomonas sp., Leptospira , Salmonella sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacter Microorganism strains belonging to the genus Chromobacterium sp. and Norcardia sp., or fungi or yeast may be included. Specifically, they are microbial strains and yeast of the genus Escherichia, Corynebacterium, and Leptospira. More specifically, it may be a microbial strain of the genus Corynebacterium .
  • the microorganism of the present application may be a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the microorganism of the present application is Corynebacterium stationis, Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium crudilactis , Corynebacterium Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae , Corynebacterium singulare , Corynebacterium halotolerans ( Corynebacterium halotolerans ), Corynebacterium striatum , Corynebacterium ammoniagenes , Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans , Corynebacterium testudinoris or Corynebacterium flavescens.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism of the genus Corynebacterium, more specifically Corynebacterium stationis or Corynebacterium glutamicum , but is
  • the microorganism having purine nucleotide production ability of the present application may be a microorganism with improved purine nucleotide production ability by controlling the activity of any one or more proteins selected from the group consisting of (a) to (d) below, but is limited thereto. no:
  • the term “increase” of polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is enhanced compared to the intrinsic activity.
  • the enhancement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and enhancement.
  • the enhancement may include showing an activity that it did not originally have, or showing improved activity compared to the intrinsic activity or activity before modification.
  • the term “exhibiting an activity that it did not originally have” may mean “introduction of a protein,” but is not limited thereto.
  • the introduction of the protein means that a gene that the microorganism did not originally possess is expressed within the microorganism, thereby causing the activity of a specific protein to appear, or to exhibit enhanced or improved activity compared to the intrinsic activity or activity before modification of the protein. do.
  • a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into a chromosome within a microorganism, or a vector containing a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into the microorganism to exhibit its activity.
  • the “intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the change in trait when the trait changes due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This refers to the activity of “activity before modification” and Can be used interchangeably.
  • Enhancing the activity of a polypeptide compared to the intrinsic activity means that it is improved compared to the activity and/or concentration (expression amount) of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the change.
  • the enhancement may indicate the absence of activity of the corresponding protein, or its activity or concentration may be reduced by about 1%, about 10%, or about 1%, based on the activity or concentration of the wild-type protein or the initial microbial strain. It may be strengthened by 25%, about 50%, about 75%, about 100%, about 150%, about 200%, about 300%, about 400% or about 500%, up to about 1000% or about 2000% or more. , but is not limited to this.
  • Enhancement of the activity of the polypeptide can be achieved by introducing a foreign polypeptide or enhancing the activity of an endogenous polypeptide. Whether the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed by strengthening the activity level of the polypeptide, the expression level, or the amount of product released from the polypeptide.
  • Enhancement of the activity of the polypeptide can be done by applying various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target polypeptide can be enhanced compared to that of the microorganism before modification.
  • genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which are routine methods of molecular biology, may be used, but are not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology 2010, Vol. 2. 1-16, Molecular Cloning 2012, etc.
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide e.g., modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide modified to enhance the activity of the polypeptide;
  • Enhancement of the copy number in the cell of the polynucleotide encoding the polypeptide may be due to the introduction into the host cell of a vector capable of replicating and functioning independently of the host to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked. .
  • one or more copies of the polynucleotide encoding the polypeptide may be introduced into the chromosome of the host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited to this.
  • the vector is the same as described above.
  • the expression control region is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that regulates the termination of transcription and translation.
  • the original promoter may be replaced with a strong promoter, but the method is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include cj1 to cj7 promoters (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13. (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but is not limited thereto.
  • modification of the base sequence of the start codon or 5'-UTR region of the gene encoding the polypeptide may, for example, be substitution of another start codon with a higher polypeptide expression rate than the internal start codon, but is not limited thereto. No.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) includes deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide.
  • the combination of these may result in a mutation in the sequence, or a replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to enhance activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used at this time may additionally include a selection marker to check whether chromosome insertion has occurred.
  • the selection marker is as described above.
  • Introduction of a foreign polynucleotide showing the activity of the polypeptide may be introduction into the host cell of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide showing the same/similar activity as the polypeptide. There are no restrictions on the origin or sequence of the foreign polynucleotide as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by a person skilled in the art by appropriately selecting a known transformation method, and by expressing the introduced polynucleotide in the host cell, a polypeptide can be produced and its activity can be enhanced.
  • Codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon optimization of the native polynucleotide to enhance transcription or translation within the host cell, or optimized transcription and translation of the foreign polynucleotide within the host cell. It may be that the codons have been optimized to allow this.
  • Such enhancement of polypeptide activity may mean that the activity or concentration of the corresponding polypeptide is enhanced based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in a wild-type or unmodified microbial strain, or the amount of product produced from the polypeptide may be increased. However, it is not limited to this.
  • the microorganism having purine nucleotide production ability of the present application may be a microorganism with improved purine nucleotide production ability due to weakened formic acid dehydrogenase protein activity compared to the intrinsic activity, but is not limited thereto.
  • formate dehydrogenase refers to formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3). It is an enzyme that uses formic acid as a substrate to catalyze an oxidation reaction to reduce NAD + and produce NADH and CO 2 .
  • the formic acid dehydrogenase of the present application is selected from the group consisting of formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3). It may be one or more proteins, but is not limited thereto.
  • the formic acid dehydrogenase of the present application refers to the complex of formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3). It can be used, and can be used interchangeably with Fdh.
  • the " fdh gene” of the present application may be used to mean a gene encoding the formic acid dehydrogenase of the present application, which consists of the fdh 1, fdh 2, and fdh 3 genes.
  • the fdh gene of the present application is a complex of formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3) complex of the present application. ) can be used to mean a gene that encodes.
  • the formic acid dehydrogenase of the present application includes formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid encoded by the fdh 1, fdh 2, and fdh 3 genes, respectively. It may be a protein having dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3) activity, but the type is not particularly limited as long as it has activity corresponding to formic acid dehydrogenase.
  • Formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1)
  • formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2)
  • formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3) encoded by the fdh 1, fdh 2, and fdh 3 genes, respectively.
  • Fdh subunit 1 formic acid dehydrogenase subunit 1
  • Fdh subunit 2 formic acid dehydrogenase subunit 2
  • Fdh subunit 3 formic acid dehydrogenase subunit 3
  • Polynucleotide sequences can be obtained from known databases, examples of which include, but are not limited to, NCBI's GenBank.
  • the formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3) are SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, and It may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72 or an amino acid sequence with more than 60% homology or identity thereto, but is not limited thereto, as long as it has formic acid dehydrogenase protein activity.
  • polypeptides having formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3) activities are SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 70, and SEQ ID NO: 72, or at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, and SEQ ID NO: 72, respectively, Alternatively, it may have, include, consist of, or essentially consist of an amino acid sequence having at least 99% homology or identity.
  • the formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3) proteins are microorganisms of the genus Corynebacterium or Corynebacterium. It may refer to a protein that is inherently present in Bacteria stationis, but is not limited thereto, and specifically, the amino acid of SEQ ID NO: 68, which is inherently present in Corynebacterium genus microorganisms or Corynebacterium stationis.
  • Formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1) protein consisting of the sequence
  • formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70
  • formic acid dehydrogenase subunit consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72 3 (Fdh subunit 3) protein, but is not limited thereto.
  • the base sequence encoding the formic acid dehydrogenase may be a base sequence encoding a protein showing the activity of formic acid dehydrogenase.
  • the base sequences encoding formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3) have formic acid dehydrogenase activity. It may be a base sequence encoding a protein representing .
  • Formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2) and formic acid dehydrogenase subunit 3 ( Fdh subunit 3) has at least 60%, 70% or more homology or identity with the sequences of SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, and SEQ ID NO: 73, respectively, or with the sequences of SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, and SEQ ID NO: 73, respectively; It has or includes at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and less than 100% of the base sequence, or consists of the above base sequence.
  • nucleotide sequences of SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, and SEQ ID NO: 73, respectively, can be obtained from known databases, examples of which include NCBI's GenBank, but are not limited thereto.
  • the microorganism having the ability to produce purine nucleotides of the present application may be a microorganism in which the glycine decomposition enzyme protein activity is enhanced compared to the intrinsic activity, and the purine nucleotide production ability is improved, but is not limited thereto.
  • the term “glycine decomposition enzyme protein” refers to a protein that is directly or indirectly involved in the glycine decomposition pathway, and refers to each protein constituting the glycine decomposition system, a complex of the proteins, or the glycine decomposition system itself.
  • the glycine decomposition enzyme protein includes T-protein (GcvT), P-protein (GcvP), L-protein (GcvL), H-protein (GcvH), and It may be any one or more proteins selected from the group consisting of LipB and LipA, which are coenzymes of the glycine decomposition system, but is not limited thereto (John E. Cronan, Microbiology and Molecular Biology Reviews., 13 April 2016).
  • Degradative enzyme proteins can be used interchangeably with GcvPTH or glycine cleavage systems.
  • GCV glycine cleavage system
  • the glycine degrading enzyme protein of the present application may be a protein having GcvP, GcvT, and GcvH protein activities encoded by the gcvP, gcvT, and gcvH genes, respectively.
  • the type is not particularly limited to.
  • GcvP, GcvT and GcvH proteins encoded by the gcvP, gcvT and gcvH genes, respectively, are known in the art, and the amino acid and polynucleotide sequences of each of the GcvP, GcvT and GcvH proteins can be obtained from known databases, Examples include, but are not limited to, NCBI's GenBank.
  • the GcvP, GcvT, and GcvH proteins may include amino acid sequences of SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: 78, respectively, or amino acid sequences with more than 60% homology or identity thereto. , as long as it has glycine decomposition enzyme protein activity, but is not limited thereto.
  • the polypeptides having GcvP, GcvT and GcvH protein activities are SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: 78, respectively, or at least 60%, 70%, 80% of SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: 78, respectively.
  • the GcvP, GcvT, and GcvH proteins may refer to proteins inherently present in Corynebacterium genus microorganisms or Corynebacterium stasis, but are not limited thereto, and specifically, Corynebacterium It may be the GcvP protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, the GcvT protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76, and the GcvH protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78, which are inherently present in the genus microorganism or Corynebacterium stationanis. , but is not limited to this.
  • the base sequences encoding the GcvP, GcvT, and GcvH proteins may be base sequences encoding proteins that exhibit the activity of glycine decomposition enzyme protein.
  • the GcvP, GcvT, and GcvH proteins having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, and SEQ ID NO: 78, respectively have the sequences of SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: 79, respectively, or SEQ ID NO: 75, sequence, respectively.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: 79, respectively can be obtained from known databases, examples of which include NCBI's GenBank, but are not limited thereto.
  • the microorganism having the ability to produce purine nucleotides of the present application may be a microorganism in which the serine hydroxymethyltransferase protein activity is further enhanced compared to the intrinsic activity, and the purine nucleotide production ability is improved, but is limited thereto. no.
  • the term “Serine Hydroxymethyltransferase” is an enzyme that catalyzes the conversion of serine to glycine.
  • the serine hydroxymethyltransferase of this application can be used interchangeably with GlyA.
  • the serine hydroxymethyltransferase of the present application may be a protein having serine hydroxymethyltransferase activity encoded by the glyA gene, but if it has an activity corresponding to serine hydroxymethyltransferase, There is no particular limitation to the type.
  • the serine hydroxymethyltransferase encoded by the glyA gene is known in the art, and the amino acid and polynucleotide sequences of the serine hydroxymethyltransferase can be obtained from known databases, such as NCBI's GenBank. etc., but is not limited thereto.
  • the serine hydroxymethyltransferase protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80 or an amino acid sequence with more than 60% homology or identity thereto, but serine hydroxymethyltransferase As long as it has lase protein activity, it is not limited thereto.
  • the polypeptide having serine hydroxymethyltransferase protein activity is SEQ ID NO: 80 or at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% of SEQ ID NO: 80, It may have, include, consist of, or consist essentially of an amino acid sequence having 98%, or 99% or more homology or identity.
  • the serine hydroxymethyltransferase protein may refer to a protein inherently present in Corynebacterium genus microorganisms or Corynebacterium stasis, but is not limited thereto, and specifically, Corynebacterium stasis. It may be, but is not limited to, a serine hydroxymethyltransferase protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80, which is inherently present in Bacteria microorganisms or Corynebacterium stasis.
  • the base sequence encoding the serine hydroxymethyltransferase may be a base sequence encoding a protein showing the activity of serine hydroxymethyltransferase.
  • the serine hydroxymethyltransferase protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80 has at least 60%, 70%, or 75% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 81 or the sequence of SEQ ID NO: 81. , 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% of the base sequence, consists of or is essentially the base sequence. It may be encoded by a polynucleotide, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 81 can be obtained from known databases, examples of which include NCBI's GenBank, but are not limited thereto.
  • the microorganism having the ability to produce purine nucleotides of the present application may be a microorganism in which the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase protein activity is enhanced compared to the intrinsic activity, and the purine nucleotide production ability is improved. It is not limited to this.
  • formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase refers to 10-formyltetrahydrofolate + N1-(5-phospho-D-ribosyl)glycinamide ⁇ tetrahydrofolate + N2-formyl-N1 -(5-phospho-D-ribosyl)glycinamide has the activity of catalyzing chemical reactions.
  • the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase of the present application can be used interchangeably with PurT.
  • the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase of the present application may be a protein having formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase activity encoded by the purT gene, but the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase There is no particular limitation to the type as long as it has an activity corresponding to amide formyl transferase.
  • the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase encoded by the purT gene is known in the art, and the amino acid and polynucleotide sequences of the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase can be obtained from known databases. Examples include NCBI's GenBank, but are not limited thereto.
  • the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase protein may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82 or an amino acid sequence with more than 60% homology or identity thereto, but the formate It is not limited thereto, as long as it has dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase protein activity.
  • the polypeptide having formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase protein activity is SEQ ID NO: 82 or at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% of SEQ ID NO: 82.
  • the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase protein may refer to a protein inherently present in Corynebacterium genus microorganisms or Corynebacterium stasis, but is not limited thereto, and is specifically It may be, but is not limited to, a formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82, which is inherently present in Corynebacterium genus microorganisms or Corynebacterium stasis.
  • the base sequence encoding the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase may be a base sequence encoding a protein showing the activity of the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase.
  • the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82 has at least 60%, 70% or more homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 83 or the sequence of SEQ ID NO: 83. , 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% of the nucleotide sequence, or consists of the nucleotide sequence. It may be encoded by a polynucleotide or may be essentially composed of polynucleotides, but is not limited thereto. Additionally, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 83 can be obtained from known databases, examples of which include NCBI's GenBank, but are not limited thereto.
  • the microorganism having the ability to produce purine nucleotides of the present application has a serine dehydratase protein activity weakened compared to the intrinsic activity, and a serine hydroxymethyltransferase protein activity compared to the intrinsic activity. It may be a microorganism with enhanced purine nucleotide production ability, but is not limited thereto.
  • the microorganism having the ability to produce purine nucleotides of the present application has a serine dehydratase protein activity weakened compared to the intrinsic activity, and a serine hydroxymethyltransferase protein activity compared to the intrinsic activity. It may be a microorganism with improved purine nucleotide production ability due to enhanced glycine decomposition enzyme protein activity compared to the intrinsic activity, but is not limited thereto.
  • the microorganism having the ability to produce purine nucleotides of the present application has a serine dehydratase protein activity weakened compared to the intrinsic activity, and a serine hydroxymethyltransferase protein activity compared to the intrinsic activity.
  • the glycine degrading enzyme protein activity is enhanced compared to the intrinsic activity
  • the formic acid dehydrogenase protein activity is weakened compared to the intrinsic activity
  • the formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyl transferase protein activity is enhanced compared to the intrinsic activity, It may be a microorganism with improved purine nucleotide production ability, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing purine nucleotides, comprising culturing a microorganism in a medium in which the serine dehydratase protein activity of the present application is weakened compared to the intrinsic activity.
  • the term “culturing” means growing the strain of the present application under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application can be carried out according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by a person skilled in the art depending on the strain selected. Specifically, the culture may be batch, continuous, and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material that is mainly mixed with nutrients necessary for cultivating the microorganisms of this application, and supplies nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and development.
  • the medium and other culture conditions used for cultivating the strain of the present application can be any medium used for cultivating ordinary microorganisms without particular limitation, but the microorganism of the present application can be grown with an appropriate carbon source, nitrogen source, personnel, and inorganic substances. It can be cultured under aerobic conditions in a typical medium containing compounds, amino acids, and/or vitamins while controlling temperature, pH, etc.
  • culture media for strains of the genus Corynebacterium can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, etc.; Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc., organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, etc. may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice bran, cassava, bagasse and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e. converted to reducing sugars).
  • Carbohydrates such as molasses
  • various other carbon sources in an appropriate amount can be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • the nitrogen source includes inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its decomposition products, defatted soybean cake or its decomposition products, etc. can be used These nitrogen sources may be used individually or in combination of two or more types, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast
  • the agent may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a corresponding sodium-containing salt.
  • Inorganic compounds may include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc.
  • amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors may be included. These components or precursors can be added to the medium batchwise or continuously. However, it is not limited to this.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. can be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium.
  • foam generation can be suppressed by using an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas can be injected into the medium, or to maintain the anaerobic and microaerobic state, nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas can be injected without gas injection, and is limited thereto. That is not the case.
  • the culture temperature can be maintained at 27 to 37°C, specifically 30 to 33°C, and culture can be performed for about 20 to 120 hours, but is not limited thereto.
  • the term "culture” means a culture solution, concentrated culture solution, dried product of the culture solution, culture filtrate, concentrated culture filtrate, or dried product of the culture filtrate obtained by culturing a specific microorganism in a culture medium, and the culture solution means containing specific microorganisms, and the culture filtrate substantially excludes specific microorganisms (here, substantially, meaning that specific microorganisms separated by filtration, etc. are excluded, meaning that microorganisms are completely excluded from the filtrate) It does not.) It means not including.
  • the formulation of the culture is not limited, and may be, for example, a liquid, emulsion, or solid. Specifically, for the purposes of the present application, the culture may contain purine nucleotides.
  • fertilization means that it is not a putrefaction reaction during the process in which microorganisms decompose organic matter using their own enzymes. Fermentation and putrefaction reactions proceed through similar processes, but when useful substances are produced as a result of decomposition, it is called fermentation, and when foul-smelling or harmful substances are produced, it is called putrefaction.
  • the method of obtaining the fermented product from the strain is not particularly limited, and can be obtained according to a method commonly used in the relevant technical field or similar fields.
  • the term "fermented product” refers not only to the fermented material itself, but also to the culture medium of the strain in which the strain and the culture coexist, the fermented product obtained by filtering the strain from the culture medium, and the sterilizing and filtering of the strain from the culture medium.
  • fermented product an extract obtained from the fermented product or a culture medium containing the same, a diluted solution obtained by diluting the fermented product or an extract thereof, a concentrate, a dried product obtained by drying the fermented product or an extract thereof, and the cells of the strain collected and crushed. It includes all types of substances including fermented products generated from the above-mentioned strains, such as lysates.
  • any culture conditions and culture methods known in the art can be used to culture microorganisms.
  • This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • Purine nucleotides produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain within the cells.
  • the purine nucleotide production method of the present application includes preparing the microorganism of the present application, preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (in any order), For example, it may be additionally included before the culturing step.
  • the purine nucleotide production method of the present application may further include the step of recovering the target substance, specifically purine nucleotides, from the cultured microorganism, a culture of the microorganism, a fermentation product of the microorganism, or the culture medium.
  • the recovering step may be additionally included after the culturing step.
  • the recovery may be to collect the desired purine nucleotide using a suitable method known in the art according to the microorganism culture method of the present application, such as a batch, continuous, or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art such as a batch, continuous, or fed-batch culture method.
  • Various chromatographies such as chromatography, HPLC, or a combination of these methods can be used, and the target substance, specifically purine nucleotides, can be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the purine nucleotide production method of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification can be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed sequentially or discontinuously, simultaneously or integrated into one step, regardless of the order. It may be performed, but is not limited to this.
  • Another aspect of the present application is purine nucleotide production comprising a microorganism in which the serine dehydratase protein activity of the present application is weakened compared to the intrinsic activity, a culture of the microorganism, a fermentation product of the microorganism, or a combination of two or more thereof.
  • a composition for purine nucleotide production comprising a microorganism in which the serine dehydratase protein activity of the present application is weakened compared to the intrinsic activity, a culture of the microorganism, a fermentation product of the microorganism, or a combination of two or more thereof.
  • composition of the present application may further comprise any suitable excipients commonly used in compositions for producing purine nucleotides, such excipients may be, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents, or isotonic agents. However, it is not limited to this.
  • each component present in the composition of the present application may be included in a microbiologically effective amount, or in an amount that can be appropriately present in the composition for production.
  • composition of the present application attenuation of serine dehydratase protein activity and purine nucleotides are the same as described in the other embodiments above.
  • Another aspect of the present application provides the use of a microorganism in which the serine dehydratase protein activity of the present application is weakened compared to the intrinsic activity for producing purine nucleotides.
  • Example 1 Production of sdaA-deficient microorganism and confirmation of XMP production ability
  • Example 1-1 Construction of recombinant vector enhanced by sdaA deletion and glyA addition
  • a strain lacking the endogenous gene sdaA of Corynebacterium stasis was created, and a strain was created adding the number of copies of the glyA gene to the sdaA gene position to show the effects of sdaA deletion and glyA addition enhancement in the XMP producing strain. I wanted to check.
  • the vector for this was constructed as follows using the plasmid pDCM2 (Korea Publication No. 10-2020-0136813) for insertion and replacement of genes in the Corynebacterium chromosome.
  • PCR was performed using the gDNA (genomic DNA) of wild-type Corynebacterium stasis ATCC6872 as a template, using primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 and primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively. PCR was performed at 94°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute and 30 seconds, followed by 72°C for 5 minutes.
  • the pDCM2 vector was treated with XbaI and the PCR product obtained above was fusion cloned. Fusion cloning used the In-Fusion® HD cloning kit (Clontech). The resulting plasmid was named pDCM2-del sdaA.
  • PCR and cloning were performed in the same manner using primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 1 and 5, primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 6 and 7, and primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 8 and 4.
  • the resulting plasmid was named pDCM2-del sdaA-Pn-glyA.
  • sequences of the primers used for vector construction are as follows.
  • Example 1-2 Construction of sdaA deletion and glyA additional enrichment strains
  • Example 1-1 After transforming the two vectors prepared in Example 1-1 into Corynebacterium stationanis CJX1664 strain (KR 10-1950141 B1) by electroporation, selection medium containing 25 mg/L of kanamycin was added. Strains with vectors inserted into the chromosome were selected as primary candidates. Afterwards, in strains in which homologous recombination occurred, strains with a deletion of the sdaA gene were selected using the primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, and the sdaA gene was deleted using the primer pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 7, and the corresponding position A strain was selected in which the glyA gene linked to its own promoter was inserted.
  • sequence number designation order 9 primer 5'- GTCAACGCGCACTTGGATCT-3'
  • Example 1-3 Evaluation of XMP production capacity of sdaA deletion and glyA addition enrichment strains
  • the XMP production ability of the strain and parent strain prepared in Example 1-2 was evaluated through flask fermentation titer evaluation. First, each strain was inoculated into a test tube with a diameter of 18 mm containing 2 ml of seed medium, cultured with shaking at 30°C for 24 hours, and used as a seed culture. 0.7 ml of the seed culture was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 32 ml of the following production medium (24 ml of main medium + 8 ml of separate sterilization medium) and cultured at 170 rmp for 75 hours at 30°C. After completion of culture, the production capacity of XMP was measured by HPLC.
  • the sdaA deletion strain showed a 2.32% increased XMP production ability compared to the control group, and the strain with sdaA deletion and an increased glyA copy number showed a 7.47% increased XMP production ability compared to the control group. It can be seen that sdaA deletion is effective in improving XMP production ability, and at the same time, enhancing glyA expression further improves XMP production ability. Through this, it was confirmed that deleting sdaA and strengthening glyA can be useful in producing XMP.
  • Example 2 Production of gcvPTH enhanced strain based on sdaA deletion and glyA addition enhanced strain
  • Example 2-1 Construction of gcvPTH copy additional recombinant vector and 5’-xanthylic acid producing strain
  • a vector was created to add a copy of the gcvPTH gene of the Corynebacterium stasis strain in the form of a native promoter.
  • the plasmid pDCM2 (Korea Publication No. 10-2020-0136813) for insertion and replacement of genes in the Corynebacterium chromosome was constructed as follows.
  • the chromosomal gene of the Corynebacterium stasis wild type strain ATCC6872 was isolated according to the protocol provided in the kit using Intron's G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045), and the sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 were isolated according to the protocol provided in the kit.
  • a gene fragment (Pn/gcvPTH) was generated through polymerase chain reaction using a primer pair, a primer pair of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, a primer pair of SEQ ID NO: 14, a primer pair of SEQ ID NO: 15, and a primer pair of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17.
  • the fragment of the gene obtained above was cut with restriction enzyme XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA). Using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA), the above gene fragment was ligated into linear pDCM2 (Korean Publication No. 10-2020-0136813) cut with XbaI restriction enzyme.
  • the prepared vector was named pDCM2-gcvPTH.
  • sequences of primers used for vector construction are as follows.
  • the pDCM2-gcvPTH vector constructed above was transformed into an sdaA-deficient and glyA-enhanced strain by electroporation, and then through PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 in a selection medium containing 25 mg/L of kanamycin. After initial confirmation, final confirmation was made through genetic sequence analysis.
  • sequences of primers used to create strains are as follows.
  • sequence number designation order 18 primer 5'-CCAGTACATTGTCATGGGAT-3' 19 primer 5'- GATTGGCATATCGCACCGAG -3'
  • Flask titer evaluation was performed to measure the 5'-xanthyl acid production ability of the strain and parent strain prepared in Example 2.
  • the strain was inoculated into a 14 ml tube containing 2.5 ml of the following seed medium and cultured with shaking at 170 rpm for 24 hours at 30°C.
  • 2 ml of the seed culture was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 29 ml of the following production medium (24 ml of main medium + 5 ml of Byeolsal medium) and cultured with shaking at 170 rpm for 72 hours at 30°C.
  • XMP production was measured using HPLC.
  • composition of the seed medium and fermentation medium is the same as in Examples 1-3.
  • Example 4 Construction of gcvPTH-enhanced, fdh-deleted, and purT-enhanced strains based on sdaA deletion and glyA addition enrichment strains.
  • Example 4-1 Construction of fdh deletion and purT addition-enhanced recombinant vector and 5’-xanthyl acid producing strain
  • Formic acid dehydrogenase from Corynebacterium stasis may be composed of formic acid dehydrogenase subunit 1 (Fdh subunit 1), formic acid dehydrogenase subunit 2 (Fdh subunit 2), and formic acid dehydrogenase subunit 3 (Fdh subunit 3). there is.
  • Fdh subunit 1 formic acid dehydrogenase subunit 1
  • Fdh subunit 2 formic acid dehydrogenase subunit 2
  • Fdh subunit 3 formic acid dehydrogenase subunit 3
  • formic acid dehydrogenase subunit 1 formic acid dehydrogenase subunit 1
  • formic acid dehydrogenase subunit 2 formic acid dehydrogenase subunit 2
  • formic acid dehydrogenase subunit 3 formic acid dehydrogenase subunit 3
  • fdh genes formic acid dehydrogenase subunit 1
  • fdh genes formic acid dehydrogenase fdh 1, fdh 2, and fdh 3 genes
  • the chromosomal gene of the Corynebacterium stasis wild type ATCC6872 strain was isolated according to the protocol provided in the kit using Intron's G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045), and the sequences of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 were isolated according to the protocol provided in the kit.
  • a gene fragment (del_fdh:: Pcj7/purT-A, del_fdh::Pcj7/purT-B, del_fdh::Pcj7/purT-C, del_fdh::Pcj7/purT-D) were obtained, respectively.
  • the conditions of the PCR method were denaturation at 94°C for 5 minutes, followed by 20 repetitions of denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute and 30 seconds, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a 2nd PCR was performed using the four fragments obtained above as templates, and the resulting gene fragment was cut with restriction enzyme XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA).
  • restriction enzyme XbaI New England Biolabs, Beverly, MA
  • T4 ligase New England Biolabs, Beverly, MA
  • the resulting plasmid was named pDCM2-del_fdh-Pcj7/purT.
  • sequences of the primers used for vector construction are as follows.
  • the pDCM2-del_fdh-Pcj7/purT vector was transformed into the strain (CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA-Pn/gcvPTH) prepared in Example 2 by electroporation, followed by selection containing 25 mg/L of kanamycin. Strains in which the mutant gene and vector were inserted together on the chromosome were selected as primary candidates in the culture medium. Afterwards, in the strain in which homologous recombination occurred, the primer pair of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 was used to select a strain in which the fdh gene was deleted and the purT gene linked to the Pcj7 promoter was inserted at the corresponding position.
  • sequences of primers used to create strains are as follows.
  • Example 5 Evaluation of 5'-xanthyl acid production capacity of sdaA deletion and glyA enhanced strain, gcvPTH enrichment, purT enrichment, and fdh deletion integrated strain
  • a flask titer evaluation was performed to measure the XMP production ability of the strains and parent strains produced in Examples 2 and 4 above.
  • Each strain was inoculated into a 14 ml tube containing 2.5 ml of the following seed medium and cultured with shaking at 170 rpm for 24 hours at 30°C.
  • 2 ml of the seed culture was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 29 ml of the following production medium (24 ml of main medium + 5 ml of Byeolsal medium) and cultured with shaking at 170 rpm for 72 hours at 30°C.
  • XMP production was measured using HPLC.
  • composition of the seed medium and fermentation medium is the same as Example 1-3.
  • the strain was cultured using the fermentation titer evaluation method of Example 1-3. After completion of the culture, the production amount of XMP (5'-xanthylic acid) was measured using HPLC.
  • Phytic acid 1.8g/L, magnesium sulfate 4.8g/L, nymeen 3ml/L, xylene 2%, adenine 100mg/L, sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) 7.7g/L , glutamine 2g/L, glucose 46g/L
  • Example 7 Production of sdaA-deficient microorganism and confirmation of IMP production ability
  • Example 7-1 Construction of sdaA gene deletion vector
  • plasmid pDCM2 (Korea Publication No. 10-2020-0136813) was used to construct as follows.
  • PCR was performed using the gDNA (genomic DNA) of wild-type Corynebacterium stasis ATCC6872 as a template, using primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 30 and 31 and primer pairs of sequences of SEQ ID NOs: 32 and 33, respectively. PCR was performed at 94°C for 5 minutes, then repeated 30 times at 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute, and then at 72°C for 5 minutes.
  • the pDCM2 vector was treated with XbaI and the PCR product obtained above was fusion cloned. Fusion cloning used the In-Fusion® HD cloning kit (Clontech). The resulting plasmid was named pDCM2-del sdaA(I).
  • sequences of the primers used for vector construction are as follows.
  • sequence number designation order 30 primer 5'- AATTCGAGCTCGGTACCCCATTTCGTGACCATTAGCGT-3' 31 primer 5'- CTTTGTACTTGGTGAGATCATGCCAATAGCGCCAG-3' 32 primer 5'- GCTATTGGCATGATCTCACCAAGTACAAAGAGACT-3' 33 primer 5'- CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTACCGCGCATTAGGACT-3'
  • Example 7-2 Construction of sdaA gene deletion strain
  • Example 7-1 After transforming the vector prepared in Example 7-1 into Corynebacterium stasis KCCM12151P by electroporation, the strain with the vector inserted into the chromosome was selected in a selection medium containing 25 mg/L of kanamycin. It was selected as a secondary candidate group. Afterwards, a strain lacking the sdaA gene was selected from the strain in which homologous recombination occurred using the primer pair of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35. The serine dehydratase-deficient strain obtained using the above method was named CJI-3176 (KCCM12151P_sda_deletion).
  • sequence number designation order 34 primer 5’-TAATCCCCCCAGCTCACCGGC-3’ 35 primer 5’- TTTGGATGCCGAGGTCGTAG -3’
  • Example 7-3 Evaluation of IMP production ability of sdaA gene deletion strain
  • the IMP production ability of the strain and parent strain prepared in Example 7-2 was evaluated through flask fermentation titer evaluation.
  • Corynebacterium stationanis KCCM12151P and CJI-3176 were inoculated into a 14 ml tube containing 2.5 ml of the following seed medium and cultured with shaking at 170 rpm for 24 hours at 30°C.
  • 2 ml of the seed culture was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 29 ml of the following production medium (24 ml of main medium + 5 ml of Byeolsal medium) and cultured with shaking at 170 rp at 30°C for 72 hours.
  • the production amount of 5'-inosic acid was measured using HPLC.
  • composition of the seed medium and fermentation medium is as follows.
  • Example 8 Construction of sdaA deletion and glyA additional enrichment strains and evaluation of IMP production ability
  • Example 8-1 Construction of sdaA deletion and glyA addition enhanced recombinant vector and 5’-inosic acid producing strain
  • the chromosomal genes of the Corynebacterium stasis wild type ATCC6872 strain were isolated according to the protocol provided in the kit using Intron's G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045), and the sequences of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37 were isolated according to the protocol provided in the kit.
  • a gene fragment (del_sda:: Pcj7/glyA-A, del_sda::Pcj7/glyA -B, del_sda::Pcj7/glyA -C, del_sda::Pcj7/glyA -D) were obtained, respectively.
  • the conditions for the PCR method were denaturation at 94°C for 5 minutes, followed by denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 20 times, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a 2nd PCR was performed using the four fragments obtained above as templates, and the resulting gene fragment was cut with restriction enzyme XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA).
  • restriction enzyme XbaI New England Biolabs, Beverly, MA
  • T4 ligase New England Biolabs, Beverly, MA
  • the resulting plasmid was named pDCM2-del_sdaA-Pn/glyA.
  • sequences of the primers used for vector construction are as follows.
  • the mutant gene on the chromosome was grown in a selection medium containing 25 mg/L of kanamycin. Strains in which the vector was also inserted were selected as primary candidates. Afterwards, in the strain in which homologous recombination occurred, the primer pair of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 was used to select a strain in which the sdaA gene was deleted and the glyA gene linked to the Pcj7 promoter was inserted at the corresponding position. The strain obtained in the same manner as above was named CJI-3177 (CJI-3176_del_sdaA-Pn/glyA).
  • sequences of primers used to create strains are as follows.
  • sequence number designation order 44 primer 5’-TAATCCCCGAGCTCACCGGC-3’ 45 primer 5’-TTTGGATGCCGAGGTCGTAG-3’
  • Example 8-2 Evaluation of IMP production ability of strains constructed with sdaA deletion and glyA addition enrichment
  • Example 7-2 and Example 8-1 The IMP production ability of the strains and parent strains prepared in Example 7-2 and Example 8-1 was evaluated through flask fermentation titer evaluation.
  • Corynebacterium stationanis KCCM12151P, CJI-3176, and CJI-3177 were inoculated into a 14 ml tube containing 2.5 ml of the following seed medium and cultured with shaking at 170 rpm for 24 hours at 30°C.
  • 2 ml of the seed culture was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 29 ml of the following production medium (24 ml of main medium + 5 ml of Byeolsal medium) and cultured with shaking at 170 rp at 30°C for 72 hours.
  • the production amount of 5'-inosic acid was measured using HPLC.
  • composition of the seed medium and fermentation medium is as follows.
  • Example 9 Construction and evaluation of gcvPTH-enhanced, fdh-deleted, and purT-enhanced strains based on sdaA deletion and glyA additional enrichment strains (IMP)
  • Example 9-1 Construction of gcvPTH additionally enhanced recombinant vector and 5’-inosic acid strain
  • a vector was created to add a copy of the endogenous gcvPTH gene of the Corynebacterium stasis strain in the form of a native promoter.
  • the plasmid pDCM2 (Korea Publication No. 10-2020-0136813) for insertion and replacement of genes in the Corynebacterium chromosome was constructed as follows.
  • the chromosomal gene of the Corynebacterium stasis wild type ATCC6872 strain was isolated using Intron's G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045) according to the protocol provided in the kit, and sequenced as SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47.
  • Gene fragment Pn/ gcvPTH-A, Pn/gcvPTH -B, Pn/gcvPTH -C, Pn/gcvPTH-D) were obtained, respectively.
  • the conditions for the PCR method were denaturation at 94°C for 5 minutes, followed by denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 20 times, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • the fragment of the gene obtained above was cut with restriction enzyme XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA). Using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly, MA), the above gene fragment was ligated into linear pDCM2 (Korean Publication No. 10-2020-0136813) cut with XbaI restriction enzyme.
  • the prepared vector was named pDCM2-Pn/gcvPTH.
  • sequences of the primers used for vector construction are as follows.
  • Example 9-2 Construction of a 5’-inosine acid producing strain with enhanced gcvPTH gene
  • strain in which homologous recombination occurred was first confirmed through PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55, and was finally confirmed through gene sequence analysis.
  • the selected strains were each named CJI-3192 (CJI-3177_Pn/gcvPTH).
  • Example 9-3 Construction of fdh deletion and purT addition enhanced recombinant vector and 5’-inosic acid producing strain
  • the chromosomal genes of the Corynebacterium stasis wild type ATCC6872 strain were isolated according to the protocol provided in the kit using Intron's G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045), and the genes of SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 were isolated according to the protocol provided in the kit.
  • a gene fragment (del_fdh:: Pcj7/purT-A, del_fdh::Pcj7/purT-B, del_fdh::Pcj7/purT-C, del_fdh::Pcj7/purT-D) were obtained, respectively.
  • the conditions of the PCR method were denaturation at 94°C for 5 minutes, followed by 20 repetitions of denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute and 30 seconds, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a 2nd PCR was performed using the four fragments obtained above as templates, and the resulting gene fragment was cut with restriction enzyme XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA).
  • restriction enzyme XbaI New England Biolabs, Beverly, MA
  • T4 ligase New England Biolabs, Beverly, MA
  • the resulting plasmid was named pDCM2-del_fdh-Pcj7/purT.
  • sequences of the primers used for vector construction are as follows.
  • the chromosome was grown in a selection medium containing 25 mg/L of kanamycin. Strains in which the mutant gene and vector were inserted together were selected as primary candidates. Afterwards, from the strain in which homologous recombination occurred, a strain in which the fdh gene was deleted and the purT gene linked to the Pcj7 promoter was inserted at the corresponding position was selected using the primer pair of SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 65. The strain obtained by the above method was named CJI-3193 (CJI-3192-del_fdh-Pcj7/purT).
  • sequences of primers used to create strains are as follows.
  • Example 10 Confirmation of 5’-inosic acid production ability of gcvPTH-enhanced, fdh-deleted, and purT-enhanced strains based on glyA-enhanced and sda-deleted strains
  • a flask titer evaluation was performed to measure the 5'-inosic acid production ability of the strains and parent strains prepared in Examples 9-2 and 9-3.
  • Corynebacterium stationanis KCCM12151P, CJI-3192, and CJI-3193 were inoculated into a 14 ml tube containing 2.5 ml of the following seed medium and cultured with shaking at 170 rpm for 24 hours at 30°C.
  • 2 ml of the seed culture was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 29 ml of the following production medium (24 ml of main medium + 5 ml of Byeolsal medium) and cultured with shaking at 170 rpm for 72 hours at 30°C.
  • the production amount of 5'-inosic acid was measured using HPLC.
  • composition of the seed medium and fermentation medium was the same as Example 8-2.

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Abstract

본 출원은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물; 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법; 상기 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 퓨린 뉴클레오티드 생산용 조성물; 및 상기 미생물의 퓨린 뉴클레오티드 생산 용도에 관한 것이다.

Description

퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법
본 출원은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물; 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법; 상기 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 퓨린 뉴클레오티드 생산용 조성물; 및 상기 미생물의 퓨린 뉴클레오티드 생산 용도에 관한 것이다.
퓨린　뉴클레오티드, 예를 들어, 5'-이노신산 (5'-inosine monophosphate; 이하 IMP), 5'-크산틸산 (5'-xanthosine monophosphate; 이하 XMP) 및 5'-구아닌산 (5'-guanosine monophosphate; 이하 GMP)은 핵산 생합성 대사계의 중간 물질로서, 체내에서 생리적으로 중요한 역할을 수행하고, 식품, 의약품 등에 널리 이용되고 있다. 구체적으로, IMP는 자체로 소고기 맛을 내며, XMP에서 유래되는 GMP는 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으며, 두 물질 모두 모노소디움 글루탐산 (MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 정미성 핵산계 조미료로 각광 받고 있다.
한편, 상기의　퓨린　뉴클레오티드를 생산하는 방법으로는 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)을 효소적으로 분해하는 방법, (2) 이를 생산하는 미생물을 배양하고 배양액 내의　퓨린　뉴클레오티드를 직접 회수하는 발효 제조 방법, (3) 발효에 의해 생산된 뉴클레오사이드을 화학적으로 인산화 하는 방법, (4) 발효에 의해 생산된 뉴클레오사이드을 효소적으로 인산화 하는 방법 등이 있다(대한민국 특허 등록 번호 제10-1049023호, 일본 등록특허공보 제4363042호, 대한민국 특허 등록 번호 제10-1210704호, Agri. Biol. Chem., 36(9),1511-1522). 이 중에서도, (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법이 경제적으로도 환경적으로도 유리하여 널리 사용되고 있다. 한편,　퓨린　뉴클레오티드 중 하나인 GMP생산의 경우 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 미생물 발효를 통해 생산된 XMP를 효소적으로 전환하여 GMP를 생산하는 방법도 활용되고 있다.
그러나, 미생물을 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 발효 생산 동안, 미생물은 온도, pH, 삼투압, 영양 결핍, 산화적 요인으로 인한 스트레스를 겪게 된다. 이 가운데 특히 산화적 스트레스는 발효 생산 중에 생성되는 피해갈 수 없는 요소인 활성 산소(reactive oxygen species; ROS)가 주된 원인이 되며, 이로 인한 미생물의 비정상적 생장이 야기될 수 있다.
따라서, 효과적인　퓨린　뉴클레오티드 생산을 위한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명자들은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된, 미생물, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법, 상기 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 퓨린 뉴클레오티드 생산용 조성물 및 상기 미생물의 퓨린 뉴클레오티드 생산 용도를 개발하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 양태는 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물을 제공한다.
하나의 구체예에서, 상기 세린 탈수화효소는 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 상기 미생물은 추가로 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 활성이 조절된 것일 수 있다:
(a) 포름산 탈수소효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화;
(b) 글리신 분해 효소 단백질 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화;
(c) 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화; 및
(d) 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인 것일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스인 것일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 상기 미생물은 비변형 미생물과 비교하여 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가된 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법을 제공한다.
하나의 구체예에서, 상기 방법은 상기 배양된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 상기 배양 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 퓨린 뉴클레오티드 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물의 퓨린 뉴클레오티드 생산 용도를 제공한다.
본 출원의 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물은 퓨린 뉴클레오티드를 고수율로 생산할 수 있어, 퓨린 뉴클레오티드의 공업적 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 관사("a", "an", 및 "the")에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 참조대상이 포함된다. 문맥상 달리 언급되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고 복수형 용어는 단수형을 포함한다. 본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "제1, 제2, 제3,," "i), ii), iii)…" 또는 "(a), (b), (c), (d)…"와 같은 기재는 유사한 구성을 구별하기 위해 사용되었으며, 이들 용어는 연속적이거나 순서대로 수행되는 것을 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 상기 용어가 방법, 용도 또는 분석의 단계(step)와 관련하여 사용되었을 경우, 이들 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간, 수 일, 또는 수 개월 간격을 두고 수행될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 본 출원에서 청구하는 대상의 특징이 불특정 성분의 존재에 실질적으로 영향을 받지 않는 경우, 상기 불특정 성분이 존재할 수 있음을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "이루어지는(consisting of)"은 특정 성분(들)의 비율이 총 100%인 것을 의미한다. 용어 "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있다. 일부 구체예에서, "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징 외에, 다른 임의의 성분 또는 필수적이지 않은 성분은 배제될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 의미하며, 하나 이상의 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 본 출원에서 "포함하는" 이하에 기재되는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있으나, 일부 구체예에서는 다른 임의의 혹은 필수적이지 않은 성분 또는 특징을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 하나의 양태는 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물을 제공한다.
상기 약화된 세린 탈수화효소 단백질 활성은, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물(예를 들어, 야생형 세린 탈수화효소 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 66의 폴리펩티드)를 발현하는 미생물 또는 본 출원의 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되지 않거나, 약화되기 전의 균주)의 생산능에 비하여, 본 출원의 미생물의 증가된 퓨린 뉴클레오티드 생산능으로 정의될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 세린 탈수화효소 단백질 활성은 퓨린 뉴클레오티드 생산능 또는 수율을 측정함으로써 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "세린 탈수화효소(L-serine dehydratase)"는 L-serine ↔ pyruvate + NH3의 화학 반응을 촉매하는 효소이다. 본 출원의 세린 탈수화효소는 SdaA 또는 L-세린 암모니아 분해 효소로 혼용하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 세린 탈수화효소는 sdaA 유전자에 의해 코딩되는 세린 탈수화효소 활성을 갖는 단백질일 수 있으나, 세린 탈수화효소에 상응하는 활성을 가지는 것이라면, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상기 sdaA 유전자에 의해 코딩되는 세린 탈수화효소는 당업계에 공지되어 있으며, 상기 세린 탈수화효소의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 세린 탈수화효소 단백질은 서열번호 66의 아미노산 서열 또는 이와 60% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 세린 탈수화효소 단백질 활성을 갖는 한, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 세린 탈수화효소 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 66 또는 상기 서열번호 66과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 일 예로, 상기 세린 탈수화효소 단백질은 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로는 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어진 세린 탈수화효소 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 아미노산 서열과 관련하여, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 "이루어진" 폴리펩티드, 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "갖는" 폴리펩티드 또는 단백질이라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체 폴리펩티드의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들어, 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘; 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산; 비극성 곁사슬(nonpolar side chain)을 갖는 아미노산(비극성 아미노산)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린; 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 곁사슬을 갖는 아미노산(극성 아미노산)은 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 속하는 것으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 전하를 띠는 곁사슬을 가지는 아미노산인(electrically charged amino acid) 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산과, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산(uncharged amino acid; neutral amino acid로도 지칭)인 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 방향족 아미노산(aromatic amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 발린, 류신, 이소류신은 분지쇄 아미노산(branched amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 20종 아미노산을 크기에 따라 분류하여 상대적으로 부피(volume)가 작은 아미노산 그룹부터 글리신, 알라닌, 세린; 시스테인, 프롤린, 쓰레오닌, 아스파르트산, 아스파라긴; 발린, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민; 이소류신, 류신, 메치오닌, 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신의 5군으로 분류할 수 있다. 그러나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 통상적으로, 보존적 치환은 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
또한, 상기 세린 탈수화효소를 암호화하는 염기 서열은 세린 탈수화효소의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 세린 탈수화효소 단백질은 서열번호 67의 서열 또는 서열번호 67의 서열과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기 서열을 가지거나 포함하거나, 상기 염기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 서열번호 67의 염기 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 상기 서열번호 67의 염기 서열을 포함하는 유전자는 서열번호 67의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 67의 염기 서열을 가지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 67의 염기 서열로 이루어지는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 본 출원의 세린 탈수화효소를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 세린 탈수화효소의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 본 출원의 세린 탈수화효소의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 67 또는 이의 축퇴성 서열(degenerated sequence)일 수 있다.
다른 예시로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 67과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기 서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 67과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기 서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 본 출원의 세린 탈수화효소를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성 (homology)" 또는 "동일성 (identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 유니터리 매트릭스(unitary matrices)(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함), PAM Matrix (Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation (1978)에 의해 개시된 내용 참조), Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서, 용어 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
상기 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 염기 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원에서 용어, "퓨린 뉴클레오티드"는 구체적으로 5'-이노신산 (5'-inosine monophosphate; 이하 IMP), 5'-크산틸산 (5'-xanthosine monophosphate; 이하 XMP) 및 5'-구아닌산 (5'-guanosine monophosphate; 이하 GMP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 IMP는 아데닌이 탈아미노된 화합물로 히포잔틴ㆍ리보스ㆍ인산 각 1분자로 구성된 뉴클레오타이드를 의미한다. 5'-포스포라이보실-1-파이로포스페이트 (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate; PRPP)로부터 생합성될 수 있으며, 구체적으로 PRPP의 1번 탄소에 결합되어 있던 피로인산기가 질소 원자로 치환되고, 9단계에 걸쳐 이미다졸 고리와 피리미딘 고리를 구성하여 형성될 수 있다. 상기 XMP는 IMP에서 탈수소화된 뉴클레오타이드를 의미한다. 5'-이노신산 탈수소효소 (inosine-5'-monophosphate dehydrogenase)에 의해 IMP로부터 합성될 수 있다. 상기 GMP는 구아노신 분자 내의 리보오스 부분에 인산기가 에스테르 결합을 이루고 있는 구조를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 GMP는 5'-구아닌산 생합성효소 (GMP synthase)에 의해 XMP에 암모니아 분자가 추가되어 합성될 수 있다. XMP로부터 GMP를 제조하는 방법 및/또는 상기 방법에 사용되는 수단은 공지되어 있는 기술 중에서 선택될 수 있다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 증가되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 증가된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다. 본 출원에서 "미생물", "균주"는 동일한 의미로서 제한 없이 혼용되어 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 미생물은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물(예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물"은 퓨린 뉴클레오티드를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서,　퓨린 뉴클레오티드　생산능이 없는 모균주에 퓨린 뉴클레오티드의 생산능이 부여된 미생물, 또는 내재적으로 퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물을 모두 포함할 수 있다.　퓨린 뉴클레오티드　생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "변이 전 모균주", "야생형 미생물", "참조 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다. 본 출원에서 비변형 미생물은 본 출원의 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되지 않거나, 약화되기 전의 균주를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원에서 비변형 미생물은 서열번호 66으로 이루어진 아미노산 서열 또는 서열번호 67로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 목적상, 본 출원의 미생물은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되어, 목적하는 퓨린 뉴클레오티드를 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 미생물은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화됨으로써, 퓨린 뉴클레오티드　생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 세린 탈수화효소 단백질의 내재적 활성을 가지는 비변형 미생물에 비하여 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물은 퓨린 뉴클레오티드를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서,　내재적으로 퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물 또는 퓨린 뉴클레오티드　생산능이 없는 모균주에 본 출원의 약화된 세린 탈수화효소 단백질 활성으로 인해 퓨린 뉴클레오티드의 생산능이 부여된 미생물을 모두 포함할 수 있다.　퓨린 뉴클레오티드　생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다.
상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "약화(weakening)"는 내재적 활성에 비하여 활성이 약화되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(deficiency, inactivation), 결실(deletion), 파괴(disruption), 하향조절(down-regulation), 저하(decrease), 감쇠(attenuation), 억압(repression), 감소(reducion) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
예를 들어, 상기 약화는 단백질이 활성을 나타내지만 결실에 의해 완전히 불활성화되지 않은 상태로서, 단백질의 활성이 비변형 미생물, 야생형 균주 또는 모균주에 비하여 약화된 경우를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 약화는 불활성화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 불활성화는 단백질의 발현이 모균주 또는 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 약화된 것을 의미할 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 약화 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 유전자의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및 유전자의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다.
폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다. 상기 폴리펩티드의 활성의 약화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 약화로부터 확인할 수 있다.
일 예로, 상기 약화는 세린 탈수화효소 단백질의 활성이 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물의 세린 탈수화효소 단백질의 활성의 약 100% 미만, 약 90% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하이거나 또는 0%인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 불활성화는 세린 탈수화효소 단백질의 발현이 비변형 미생물에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 약화된 것을 의미할 수 있다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 약화하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예를 들어, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하도록 2차 구조물을 형성하기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예를 들어,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결손하는 방법은 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법, 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 목적 유전자가 결손된 균주를 선별하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 2) 발현 조절 서열의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하도록 2차 구조물을 형성하기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 재조합 미생물은 벡터를 통해 형질전환되어 본 출원의 세린 탈수화효소 단백질 활성이 약화되어 퓨린 뉴클레오티드를 생산할 수 있는 모든 미생물을 포함할 수 있다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pSK계, pSKH계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pSK, pSKH130, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 조절 서열이 적절한 위치에 배치되는 구성을 의미한다. 따라서 "작동가능하게 연결된"은, 프로모터, 종결자, 신호 서열 또는 인핸서 영역과 같이 알려진 혹은 원하는 활성을 가진 기능적 도메인의 조절 영역이 타겟(유전자 또는 폴리펩티드)의 발현, 분비 또는 기능을 상기의 알려진 혹은 원하는 활성에 따라 조절할 수 있도록 그 타겟에 부착되거나 연결된 것을 포함한다. 예를 들어, 본 출원의 목적 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원에서 용어, "발현"은 폴리펩티드의 생성에 관여하는 임의의 단계, 예를 들어 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "발현 벡터"는 코딩 서열 및 이의 발현을 위해 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 선형 혹은 환형 핵산 분자를 의미한다.
본 출원에서 용어, "조절 서열(regulatory sequence)"은 코딩 서열의 발현에 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 각각의 조절 서열은 코딩 서열에 대해 천연형이거나(기원이 동일함) 또는 외래(foreign; 다른 유전자에서 유래함) 서열일 수 있다. 상기 조절 서열의 예시는 리더 서열(leader sequence), 폴리아데닐레이션 서열(polyadenylation sequence), 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 번역 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 조절 서열의 최소 단위는 프로모터, 전사 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다.
세포, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 벡터와 관련하여, 본 출원에서 용어 "재조합"은 세포, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 벡터가 이종(heterologous) 핵산 또는 폴리펩티드의 도입 또는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변경에 의해 변형된 것, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유도되는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 발현되거나 전혀 발현되지 않는, 다르게는 비정상적으로 발현되는 천연 유전자를 발현할 수 있다.
예를 들어, 상기 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물은 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 또는 서열번호 66과 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 내재적으로 포함하는 미생물일 수 있다.
예를 들어, 상기 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물은 상기 서열번호 66과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 67의 염기서열, 또는 서열번호 67의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 내재적으로 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 다양한 공지의 방법에 의해 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물을 모두 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원의 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물은 세린 탈수화효소 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손되거나 변형된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 서열번호 67의 염기서열이 결손되어 세린 탈수화효소 단백질의 활성이 없는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가된 미생물은 비변형 미생물과 비교하여 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로, 상기 퓨린 뉴클레오티드 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 비변형 미생물은 CJX1664 균주 또는 KCCM12151P 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가된 미생물은 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 퓨린 뉴클레오티드 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25%이상, 약 30% 이상, 또는 약 35% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하 또는 약 40% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.25배 이상, 약 1.3배 이상 또는 약 1.35배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하 또는 약 1.4배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기　퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는, 일 예로 에스케리치아 속(Escherichiasp.), 어위니아 속(Erwiniasp.), 세라티아 속(Serratiasp.), 프로비덴시아 속(Providenciasp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteriasp.), 슈도모나스 속(Pseudomonassp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellasp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteriasp.), 하이포모나스 속(Hypomononassp.), 크로모박테리움 속(Chromobacteriumsp.) 및 노카디아 속(Norcardiasp.), 또는 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모이다. 더욱 구체적으로는, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 균주일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속 미생물, 보다 구체적으로 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의　퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은 추가로 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 활성이 조절되어, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
(a) 포름산 탈수소효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화;
(b) 글리신 분해 효소 단백질 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화;
(c) 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화; 및
(d) 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화(increase)"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(enhancement) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 강화는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 "본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것"은 "단백질의 도입"일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질의 도입은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 유전자가 그 미생물내에서 발현됨에 따라 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 강화 또는 향상된 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다.
상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다.
폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
일 예로, 상기 강화는 상응하는 단백질의 활성이 없던 것이 나타나거나, 또는 이의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 약 1 %, 약 10 %, 약 25 %, 약 50 %, 약 75 %, 약 100 %, 약 150 %, 약 200 %, 약 300 %, 약 400 % 또는 약 500 %, 최대 약 1000 % 또는 약 2000 % 이상까지 강화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 강화로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 활성의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 강화;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역의 변형(예를 들어, 발현조절영역 내 변이 발생, 더욱 강한 활성을 갖는 서열로의 교체, 또는 더욱 강한 활성을 갖는 서열 삽입);
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예를 들어,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 강화는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내 도입된 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입된 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 강화하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 강화될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 강화하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 강화되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양이 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은 추가로 포름산 탈수소효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되어, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, “포름산 탈수소효소 (formate dehydrogenase)”는 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3)로 구성되어, 포름산을 기질로 하여, 산화반응을 촉매시켜 NAD+를 환원시키고 NADH 및 CO2를 생성하는 효소이다. 구체적으로, 본 출원의 포름산 탈수소효소는 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원의 포름산 탈수소효소는 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3) 복합체(complex)를 의미하는 것으로 사용될 수 있고, Fdh로 혼용하여 사용할 수 있다.
본 출원의 "fdh 유전자"는 fdh 1, fdh 2, 및 fdh 3 유전자로 구성되어, 본 출원의 포름산 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 fdh 유전자는 본 출원의 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3) 복합체(complex)를 암호화하는 유전자를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 포름산 탈수소효소는 fdh 1, fdh 2, 및 fdh 3 유전자 각각에 의해 코딩되는 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3) 활성을 갖는 단백질일 수 있으나, 포름산 탈수소효소에 상응하는 활성을 가지는 것이라면, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상기 fdh 1, fdh 2, 및 fdh 3 유전자 각각에 의해 코딩되는 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3)는 각각 당업계에 공지되어 있으며, 상기 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3) 각각의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3)는 각각 서열번호 68, 서열번호 70, 및 서열번호 72의 아미노산 서열 또는 이와 60% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 포름산 탈수소효소 단백질 활성을 갖는 한, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3) 활성을 갖는 폴리펩티드는 각각 서열번호 68, 서열번호 70, 및 서열번호 72 또는 각각 상기 서열번호 68, 서열번호 70, 및 서열번호 72과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 일 예로, 상기 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3) 단백질은 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로는 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 서열번호 68의 아미노산 서열로 이루어진 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1) 단백질, 서열번호 70의 아미노산 서열로 이루어진 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 단백질, 서열번호 72의 아미노산 서열로 이루어진 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3) 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 포름산 탈수소효소를 암호화하는 염기 서열은 포름산 탈수소효소의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3)를 암호화하는 염기 서열은 포름산 탈수소효소 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열일 수 있다.
상기 각각 서열번호 68, 서열번호 70, 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3)는 각각 서열번호 69, 서열번호 71, 및 서열번호 73의 서열 또는 각각 서열번호 69, 서열번호 71, 및 서열번호 73의 서열과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기 서열을 가지거나 포함하거나, 상기 염기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 각각 서열번호 69, 서열번호 71, 및 서열번호 73의 염기 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은 추가로 글리신 분해 효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되어, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, “글리신 분해 효소 단백질"은 글리신 분해 경로에 직접 또는 간접적으로 관여하는 단백질로, 글리신 분해 시스템을 구성하는 각각의 단백질, 또는 상기 단백질의 복합체(complex) 또는 상기 글리신 분해 시스템 자체를 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 글리신 분해 효소 단백질은 글리신 분해 시스템을 구성하는 T-단백질(GcvT), P-단백질(GcvP), L-단백질(GcvL), H-단백질(GcvH) 및 상기 글리신 분해 시스템의 조효소인 LipB, LipA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(John E. Cronan, Microbiology and Molecular Biology Reviews., 13 April 2016). 본 출원의 글리신 분해 효소 단백질은 GcvPTH 또는 글리신 절단 시스템으로 혼용하여 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, “글리신 절단 시스템(glycine cleavage system, GCV)”은 2 개 이상의 서브 유닛, 즉 서브 유닛 GcvP, GcvT 및 GcvH 로 구성되어, 글리신의 이산화탄소, 암모늄 이온 및 N5-10-메틸렌 테트라히드로폴레이트로의 산화적 탈카르복실화 및 탈아민화를 촉매하는 다중-효소 복합체이다. 본 출원의 글리신 절단 시스템은 글리신 분해 시스템으로 혼용하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 글리신 분해 효소 단백질은 gcvP, gcvT 및 gcvH 유전자 각각에 의해 코딩되는 GcvP, GcvT 및 GcvH 단백질 활성을 갖는 단백질일 수 있으나, 글리신 분해 효소 단백질에 상응하는 활성을 가지는 것이라면, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상기 gcvP, gcvT 및 gcvH 유전자 각각에 의해 코딩되는 GcvP, GcvT 및 GcvH 단백질은 각각 당업계에 공지되어 있으며, 상기 GcvP, GcvT 및 GcvH 단백질 각각의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 GcvP, GcvT 및 GcvH 단백질은 각각 서열번호 74, 서열번호 76 및 서열번호 78의 아미노산 서열 또는 이와 60% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 글리신 분해 효소 단백질 활성을 갖는 한, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 GcvP, GcvT 및 GcvH 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드는 각각 서열번호 74, 서열번호 76 및 서열번호 78 또는 상기 서열번호 74, 서열번호 76 및 서열번호 78과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 일 예로, 상기 GcvP, GcvT 및 GcvH 단백질은 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로는 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어진 GcvP 단백질, 서열번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 GcvT 단백질, 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어진 GcvH 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 GcvP, GcvT 및 GcvH 단백질을 암호화하는 염기 서열은 글리신 분해 효소 단백질의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 각각 서열번호 74, 서열번호 76 및 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 GcvP, GcvT 및 GcvH 단백질은 각각 서열번호 75, 서열번호 77 및 서열번호 79의 서열 또는 각각 서열번호 75, 서열번호 77 및 서열번호 79의 서열과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기 서열을 가지거나 포함하거나, 상기 염기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 각각 서열번호 75, 서열번호 77 및 서열번호 79의 염기 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은 추가로 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되어, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, “세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 (Serine Hydroxymethyltransferase)”는 세린에서 글리신으로의 전환을 촉매하는 효소이다. 본 출원의 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제는 GlyA로 혼용하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제는 glyA 유전자에 의해 코딩되는 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 활성을 갖는 단백질일 수 있으나, 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제에 상응하는 활성을 가지는 것이라면, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상기 glyA 유전자에 의해 코딩되는 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제는 당업계에 공지되어 있으며, 상기 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질은 서열번호 80의 아미노산 서열 또는 이와 60% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성을 갖는 한, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 80 또는 상기 서열번호 80과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 일 예로, 상기 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질은 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로는 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 서열번호 80의 아미노산 서열로 이루어진 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제를 암호화하는 염기 서열은 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질은 서열번호 81의 서열 또는 서열번호 81의 서열과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기 서열을 가지거나 포함하거나, 상기 염기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 서열번호 81의 염기 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은 추가로 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되어, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, “포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 (formate-dependent phosphoribosylglycinamide formyltransferase)”는 10-formyltetrahydrofolate + N1-(5-phospho-D-ribosyl)glycinamide ⇔ tetrahydrofolate + N2-formyl-N1-(5-phospho-D-ribosyl)glycinamide 화학 반응을 촉매하는 활성을 갖는다. 본 출원의 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소는 PurT로 혼용하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소는 purT 유전자에 의해 코딩되는 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 활성을 갖는 단백질일 수 있으나, 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소에 상응하는 활성을 가지는 것이라면, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상기 purT 유전자에 의해 코딩되는 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소는 당업계에 공지되어 있으며, 상기 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질은 서열번호 82의 아미노산 서열 또는 이와 60% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질 활성을 갖는 한, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 82 또는 상기 서열번호 82와 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 일 예로, 상기 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질은 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 단백질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로는 코리네박테리움 속 미생물 또는 코리네박테리움 스테이셔니스에 내재적으로 존재하는 서열번호 82의 아미노산 서열로 이루어진 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소를 암호화하는 염기 서열은 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소의 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 서열번호 82의 아미노산 서열을 갖는 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질은 서열번호 83의 서열 또는 서열번호 83의 서열과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기 서열을 가지거나 포함하거나, 상기 염기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 서열번호 83의 염기 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 본 출원의　퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되고, 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되어, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 본 출원의　퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되고, 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되고, 글리신 분해 효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되어, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 본 출원의　퓨린 뉴클레오티드　생산능을 갖는 미생물은 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되고, 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되고, 글리신 분해 효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되고, 포름산 탈수소효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되고, 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되어, 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 향상된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법을 제공한다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 예를 들어, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 27 내지 37℃구체적으로는 30 내지 33℃를 유지할 수 있고, 약 20 내지 120 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 용어 "배양물"이란 특정 미생물을 배양 배지에서 배양하여 수득한 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하며, 상기 배양액은 특정 미생물을 포함하는 것을 의미하고, 상기 배양 여과액은 특정 미생물을 실질적으로(여기서, 실질적으로는 여과등에 의해 분리되는 특정 미생물을 배제한다는 것을 의미하는 것으로서 여과액에 미생물이 완전히 배제된다는 것을 의미하지는 않는다.) 포함하지 않는 것을 의미한다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체, 에멀젼, 또는 고체일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 목적상 상기 배양물은 퓨린 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "발효"는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시키는 과정 중 부패반응이 아닌 것을 의미한다. 발효 반응과 부패 반응은 비슷한 과정에 의해 진행되지만, 분해 결과 유용한 물질이 만들어지면 발효라 하고 악취가 나거나 유해한 물질이 만들어지면 부패라고 한다.
본 출원에서 상기 균주로부터 발효물을 수득하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야 또는 유사 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수득할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "발효물"은 발효된 물질 자체뿐만 아니라, 균주 및　배양물이 공존하는 균주의 배양 배지, 상기 배양 배지로부터 균주를 여과시킨 발효물, 상기 배양 배지로부터 균주을 멸균처리하고 이를 여과시킨 발효물, 상기 발효물 또는 이를 포함하는 배양 배지를 추출한 추출물, 상기 발효물 또는 이의 추출물을 희석시킨 희석액, 농축액, 상기 발효물 또는 이의 추출물을 건조시킨 건조물, 상기 균주의 균체를 포집해서 파쇄시킨 용해물 등, 상기 균주로부터 발생한 발효물을 포함하는 모든 종류의 물질을 포함한다.
본 출원의 방법에 있어서, 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 퓨린 뉴클레오티드는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드 생산 방법은 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 퓨린 뉴클레오티드 생산방법은, 상기 배양된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 상기 배양 배지에서 목적 물질, 구체적으로는 퓨린 뉴클레오티드를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 퓨린 뉴클레오티드를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적물질, 구체적으로는 퓨린 뉴클레오티드를 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 퓨린 뉴클레오티드 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 세린 탈수화효소 단백질 활성의 약화 및 퓨린 뉴클레오티드 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 퓨린 뉴클레오티드 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 조성물은 퓨린 뉴클레오티드 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 구체예로, 본 출원의 조성물에 존재하는 각 구성요소는 미생물학적으로 유효한 양, 또는 생산용 조성물에서 적절하게 존재할 수 있는 양으로 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물에서, 세린 탈수화효소 단백질 활성의 약화 및 퓨린 뉴클레오티드 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물의 퓨린 뉴클레오티드 생산 용도를 제공한다.
본 출원의 용도에서, 세린 탈수화효소 단백질 활성의 약화 및 퓨린 뉴클레오티드 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. sdaA 결손 미생물 제작 및 XMP 생산능 확인
실시예 1-1. sdaA 결손 및 glyA추가 강화 재조합 벡터 제작
코리네박테리움 스테이셔니스의 내재적 유전자 sdaA를 결손한 균주를 제작하고, 또한 sdaA 유전자 위치에 glyA 유전자의 copy수를 추가하는 균주를 제작하여 XMP 생산주에서 sdaA 결손과 glyA 추가 강화의 효과를 함께 확인하고자 하였다. 이를 위한 벡터를 코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위한 플라스미드 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)를 이용하여 하기와 같이 제작하였다.
야생형 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872의 gDNA(genomic DNA)를 주형으로 서열번호 1 및 2의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 3 및 4의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1 분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다. pDCM2 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-del sdaA라 명명하였다.
또한 서열번호 1 및 5의 서열의 프라이머 쌍, 서열번호 6 및 7의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 8 및 4의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 방법으로 PCR 및 클로닝을 진행하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-del sdaA-Pn-glyA라 명명하였다.
벡터제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
1 primer 5'- acccggggatcctctagaGTGCCGTTACCTCCCGC-3'
2 primer 5'- TGGAGTGCGTAGCGTGCGAAATGACTCCTTTCTAAA-3'
3 primer 5'- TTTAGAAAGGAGTCATTTCGCACGCTACGCACTCCA-3'
4 primer 5'- AAGCTTGCATGCCTGCAGCGTCACCGCGCGGAGATA-3'
5 primer 5'- GAAATGACTCCTTTCTAAAAAGGGG -3'
6 primer 5'- TTAGAAAGGAGTCATTTCGAACTTGCAGCAAACGTGCTG -3'
7 primer 5'- CCTTGGTGAGGCACTTTGTG -3'
8 primer 5'- CAAAGTGCCTCACCAAGGGCACGCTACGCACTCCATATA -3'
실시예 1-2. sdaA 결손 및 glyA 추가 강화 균주 제작
상기 실시예 1-1에서 제작한 벡터 2종을 각각 코리네박테리움 스테이셔니스 CJX1664 균주 (KR 10-1950141 B1) 에 일렉트로포레이션법으로 형질전환 한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 벡터가 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 상동성 재조합이 일어난 균주에서 서열번호 1와 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 sdaA 유전자가 결손된 균주를 선별하고 서열번호 9와 서열번호 7의 프라이머 쌍을 이용하여 sdaA 유전자가 결손되고 해당 위치에 자가 프로모터와 연결된 glyA 유전자가 삽입된 균주를 선별하였다.
서열번호 명칭 서열
9 primer 5'- GTCAACGCGCACTTGGATCT-3'
실시예 1-3. sdaA 결손 및 glyA추가 강화 균주의 XMP 생산능 평가
상기 실시예 1-2에서 제작된 균주 및 모균주에 대해 플라스크 발효역가 평가를 통해 XMP 생산능을 평가하였다. 먼저, 종배지 2ml을 함유하는 지름 18mm 시험관에 각 균주를 접종하고, 30℃에서 24시간 동안, 진탕 배양하여 종 배양액으로 사용하였다. 하기의 생산배지 32 ml (본배지 24 ml + 별도살균배지 8 ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 0.7 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 75시간동안 170 rmp으로 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC로 XMP의 생산능을 측정하였다.
<종배지 (pH7.5)>
포도당 1%, 펩톤 1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l (증류수 1 리터 기준)
<XMP 플라스크 생산배지 (본배지)>
포도당 40 g/L, 황산마그네슘 10 g/L, 염화칼슘 100 mg/L, 황산철 20 mg/L, 황산망간 10 mg/L, 황산아연 10 mg/L, 황산구리 0.8 mg/L, 히스티딘 20 mg/L, 시스틴 15 mg/L, 베타-알라닌 15 mg/L, 비오틴 100 ug/L, 티아민 5 mg/L, 아데닌 50 mg/L, 구아닌 25 mg/L, 니아신 15 mg/L, pH 7.0
<XMP 플라스크 생산배지 (별도 살균 배지)>
인산 제1칼륨 18 g/L, 인산 제2칼륨 42 g/L, 우레아 7 g/L, 황산암모늄 5 g/L (증류수 1리터 기준)
상기 실험은 3번 반복하였으며, 그 분석 결과의 평균값을 하기 표 3에 나타내었다.
sdaA 결손 및 glyA의 copy 추가 균주의 XMP 생산능 비교
균주번호 도입형태 XMP(g/L) 농도증가율 (%)
CJX1664 Control 4.32 -
CJX1664-del_sdaA 4.42 2.32
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA 4.64 7.47
상기 표 3과 같이, sdaA 결손 균주는 대조군에 비해 2.32% 증가된 XMP 생산능을 나타내었고, sdaA 결손과 glyA 카피수를 증가한 균주는 대조군 대비 7.47% 증가된 XMP 생산능을 나타냈다. sdaA 결손이 XMP 생산능 향상에 효과가 있고, 동시에 glyA 발현을 강화하면 XMP 생산능이 추가적으로 향상되는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 sdaA를 결손하고 glyA를 강화하는 것이 XMP 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. sdaA 결손 및 glyA추가 강화 균주 기반 gcvPTH 강화주 제작
실시예 2-1. gcvPTH copy 추가 재조합 벡터 및 5’-크산틸산 생산 균주 제작
gcvPTH 유전자의 강화가 XMP 생산량 증가로 이어질 수 있는지 확인하기 위하여 코리네박테리움 스테이셔니스 균주의 gcvPTH 유전자를 native 프로모터 형태로 copy 추가하는 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위한 플라스미드 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)를 이용하여 하기와 같이 제작하였다.
코리네박테리움 스테이셔니스 야생형인 ATCC6872 균주의 염색체 유전자를 Intron사의 G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045)를 이용하여 kit에 제공된 protocol에 따라 분리하고 서열번호 10과 서열번호 11의 프라이머 쌍 및 서열번호 12와 서열번호 13 의 프라이머 쌍 및 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머 쌍, 서열번호 16와 서열번호 17의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편(Pn/gcvPTH-A, Pn/gcvPTH -B, Pn/gcvPTH -C, Pn/gcvPTH-D)을 각각 얻었다. PCR법의 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
상기에서 수득한 유전자의 단편을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. T4 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDCM2(대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)에 접합 하였다. 제조된 벡터를 pDCM2-gcvPTH로 명명하였다.
벡터제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
10 primer 5'- AATTCGAGCTCGGTACCCAGGCACAGCCGACATTACGG -3'
11 primer 5'- GTAGCACATCTGACGAATGTCCAAGTCTAAGGAAA -3'
12 primer 5'- TTAGACTTGGACATTCGTCAGATGTGCTACTTGCC -3'
13 primer 5'- TGCGCCATTAGCGTGTTACTTCTCGCGGCTATAGA -3'
14 primer 5'- AGCCGCGAGAAGTAACACGCTAATGGCGCATTGAA -3'
15 primer 5'- TGAATTATCCGCGTCTTAGATGCCGTTTTCTGCCG-3'
16 primer 5'- GAAAACGGCATCTAAGACGCGGATAATTCAGCTGT -3'
17 primer 5'- CGACTCTAGAGGATCCCCGATGAAGCGAACACTTAAAT -3'
gcvPTH 유전자의 추가 강화가 XMP 생산량 증가로 이어질 수 있는지 확인하기 위하여 sdaA 결손 및 glyA추가 강화 균주에 gcvPTH를 강화하는 실험을 진행하였다.
상기에서 제작한 pDCM2-gcvPTH 벡터를 sdaA 결손 및 glyA추가 강화 균주에 일렉트로포레이션법으로 형질 전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 서열번호 18 서열번호 19 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 1차 확인 후 유전자 서열분석을 통해 최종 확인하였다.
균주 제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
18 primer 5'- CCAGTACATTGTCATGGGAT -3'
19 primer 5'- GATTGGCATATCGCACCGAG -3'
실시예 3. glyA 강화 및 sda 결손 균주 기반 gcvPTH 강화주의 5'-크산틸산 생산능 평가
상기 실시예 2에서 제작된 균주 및 모균주의 5’-크산틸산 생산능을 측정하기 위하여 플라스크 역가 평가를 실시하였다. 하기 종배지 2.5 ml을 함유하는 14 ml tube에 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 29 ml (본배지 24 ml + 별살배지 5 ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 2ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 XMP 생산량을 측정하였다.
상기 종배지 및 발효배지의 조성은 상기 실시예 1-3과 동일하다.
XMP 생산균주인 코리네박테리움 스테이셔니스 KCCM12151P에서의 glyA 강화, sdaA 결손 통합 및 gcvPTH 강화에 따른 배양 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
glyA 강화, sdaA 결손 및 gcvPTH 강화 통합에 따른 5’-크산틸산 생산량 확인
균주번호 도입형태 XMP(g/L) 농도증가율 (%)
CJX1664 Control 4.51 -
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA 4.85 7.45
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA- Pn/gcvPTH 5.48 21.5
XMP 생산균주에서의 sdaA 결손 및 glyA 강화는 5’-크산틸산 생산량 증가로 이어질 수 있으며, 추가적으로 gcvPTH를 함께 강화해주었을 때 5’-크산틸산의 농도가 추가적으로 증가함을 확인하였다.
실시예 4. sdaA 결손 및 glyA 추가 강화 균주 기반, gcvPTH 강화, fdh 결손 및 purT 추가 강화 균주 제작
실시예 4-1. fdh 결손 및 purT추가 강화 재조합 벡터 및 5’-크산틸산 생산 균주 제작
코리네박테리움 스테이셔니스 유래 포름산 탈수소효소는 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3)로 이루어질 수 있다.
포름산 탈수소효소 서브유닛 1, 포름산 탈수소효소 서브유닛 2 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(이하, 포름산 탈수소효소로 표기)의 결손을 위하여, 상기 포름산 탈수소효소 서브유닛 1(Fdh subunit 1), 포름산 탈수소효소 서브유닛 2(Fdh subunit 2) 및 포름산 탈수소효소 서브유닛 3(Fdh subunit 3)을 각각 암호화하는 코리네박테리움 스테이셔니스의 내재적 유전자인 fdh 1, fdh 2, 및 fdh 3 유전자(이하, fdh 유전자로 표기)를 결손하고, 해당 유전자 위치에 purT 유전자의 copy 수를 추가하는 형태로 벡터를 제작하여, 최종적으로 XMP 생산주에서 gcvPTH 강화와의 시너지 효과를 확인하고자 하였다. 따라서, fdh를 결손하고, 해당 유전자 위치에 purT의 copy 수를 추가하는 실험을 진행하였다.
코리네박테리움 스테이셔니스 야생형인 ATCC6872 균주의 염색체 유전자를 Intron사의 G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045)를 이용하여 kit에 제공된 protocol에 따라 분리하고 서열번호 20과 서열번호 21의 프라이머 쌍 및 서열번호 22와 서열번호 23의 프라이머 쌍 및 서열번호 24와 서열번호 25의 프라이머 쌍, 서열번호 26와 서열번호 27의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편(del_fdh::Pcj7/purT-A, del_fdh::Pcj7/purT-B, del_fdh::Pcj7/purT-C, del_fdh::Pcj7/purT-D)을 각각 얻었다. PCR법의 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
상기에서 수득한 네 단편을 주형으로 2nd PCR을 실시하여 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. T4 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)에 접합 하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-del_fdh-Pcj7/purT라 명명하였다.
벡터제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
20 primer 5'- TCGAGCTCGGTACCCGTTGCCGTATCAGACATGCTCAG -3'
21 primer 5’- GATTAGCCTGAAGGAATTGATTTATCTCGACCAAACAG -3’
22 primer 5’- GGTCGAGATAAATCAATTCCTTCAGGCTAATCTTTTCC -3’
23 primer 5’- CGATATAAGACTCCATCATATGTGTTTCCTTTCGTTGG-3’
24 primer 5’- AAAGGAAACACATATGATGGAGTCTTATATCGGTAGCC -3’
25 primer 5'- CTCATAGGTGCCGAACTTACTCGGAGATTTCGACCTCA-3'
26 primer 5'- CGAAATCTCCGAGTAAGTTCGGCACCTATGAGAATATG -3'
27 primer 5'- CTCTAGAGGATCCCCGGCAAGTGTTTCTTGGCGCCATTC-3'
상기 pDCM2-del_fdh-Pcj7/purT 벡터를 상기 실시예 2에서 제작된 균주 (CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA- Pn/gcvPTH)에 일렉트로포레이션법으로 형질 전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 변이 유전자와 벡터가 함께 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 상동성 재조합이 일어난 균주에서 서열번호 28와 서열번호 29의 프라이머 쌍을 이용하여 fdh 유전자가 결손되고, 해당 위치에 Pcj7 프로모터와 연결된 purT 유전자가 삽입된 균주를 선별하였다.
균주 제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
28 primer 5’-TAATCCCCCAGCTCACCGGC-3’
29 primer 5’- TTTGGATGCCGAGGTCGTAG-3’
실시예 5. sdaA 결손 및 glyA 강화주 기반, gcvPTH 강화, purT 강화 및 fdh 결손 통합주 5’-크산틸산 생산능 평가
상기 실시예 2 및 실시예 4에서 제작된 균주 및 모균주의 XMP 생산능을 측정하기 위하여 플라스크 역가 평가를 실시하였다. 하기 종배지 2.5 ml을 함유하는 14 ml tube에 각 균주들을 접종하고 30℃에서 24시간 동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 29 ml (본배지 24 ml + 별살배지 5 ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 2ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 XMP 생산량을 측정하였다
상기 종배지 및 발효배지의 조성은 실시예 1-3과 동일하다.
XMP 생산 균주에서의 sdaA 결손 및 glyA 강화 균주 기반, gcvPTH 강화, purT 강화 및 fdh 결손 통합에 따른 배양 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
gcvPTH 강화, sdaA 결손 및 glyA 강화 및 purT 강화, fdh 결손 통합에 따른 5’-크산틸산 생산량 확인
균주번호 도입형태 XMP(g/L) 농도증가율 (%)
CJX1664 Control 4.48 -
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA 4.81 7.39
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA- Pn/gcvPTH 5.47 22.2
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA- Pn/gcvPTH-del_fdh-Pcj7/purT 5.59 24.8
XMP 생산균주에서의 sdaA 결손, glyA 강화 및 gcvPTH 강화를 통합해주었을 때, XMP 생산량 증가로 이어질 수 있으며, 추가적으로 fdh를 결손해주면서 해당 위치에 purT를 copy 수 증가의 방법으로 강화해주었을 때 XMP 농도가 추가적으로 증가함을 확인하였다.
실시예 6. sdaA 결손 및 glyA 강화주 기반, gcvPTH 강화, purT 강화 및 fdh 결손 통합주 GMP 생산능 확인
상기 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 4에서 제작된 균주 및 대조군 모균주의 XMP 배양액을 이용하여 아래와 같은 방법으로 GMP 생산을 확인하기 위해 먼저 플라스크 발효역가 평가를 통해 XMP 생산능을 분석하였다. (한국특허공개번호 10-2011-0105662 A 참고).
구체적으로, 상기 실시예 1-3의 발효역가 평가 방법으로 균주를 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 XMP(5'-크산틸산)의 생산량을 측정하였다.
이어서, GMP 생산능을 분석하였다. 구체적으로, 생성된 XMP를 GMP로 전환하기 위하여 상기 플라스크 발효액에 하기의 전환 반응 첨가물과 대장균의 XMP 아미나아제(XMP aminase)를 첨가하여 40℃에서 2.5시간 동안 전환반응을 수행하였다. 상기 실험 수행의 결과, XMP 소모량 대비 GMP의 생성량을 의미하는 전환율 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
sdaA 결손 및 glyA의 copy 추가 균주의 GMP 생산능 확인
균주번호 도입형태 XMP(g/L) GMP(g/L) 전환율(%)
(GMP생성량/XMP소모량)
CJX1664 Control 4.43 3.23 72.9
CJX1664-del_sdaA 4.53 3.31 73.0
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA 4.76 3.48 73.1
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA- Pn/gcvPTH 5.42 3.96 73.0
CJX1664-del_sdaA-Pn-glyA- Pn/gcvPTH-del_fdh-Pcj7/purT 5.54 4.06 73.2
상기 표 10에서 나타낸 바와 같이, 균주에 의해 생성된 XMP로부터 전환반응을 통해 GMP가 생성되는 것을 확인하였다.
<전환반응 첨가물>
피틱산(phytic acid) 1.8g/L, 황산마그네슘 4.8g/L, 니민(nymeen) 3㎖/L, 자이렌(xylene) 2%, 아데닌 100mg/L, 인산수소나트륨(Na2HPO4) 7.7g/L, 글루타민 2g/L, 포도당 46g/L
실시예 7. sdaA 결손 미생물 제작 및 IMP 생산능 확인
실시예 7-1. sdaA 유전자 결손 벡터 제작
코리네박테리움 스테이셔니스의 내재적 유전자 sdaA를 결손하기 위해 플라스미드 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)를 이용하여 하기와 같이 제작하였다.
야생형 코리네박테리움 스테이셔니스 ATCC6872의 gDNA(genomic DNA)를 주형으로 서열번호 30 및 31의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 32 및 33의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1 분를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다. pDCM2 벡터는 XbaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-del sdaA(I)라 명명하였다.
벡터제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
30 primer 5'- AATTCGAGCTCGGTACCCCATTTCGTGACCATTAGCGT-3'
31 primer 5'- CTTTGTACTTGGTGAGATCATGCCAATAGCGCCAG-3'
32 primer 5'- GCTATTGGCATGATCTCACCAAGTACAAAGAGACT-3'
33 primer 5'- CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTACCGCGCATTAGGACT-3'
실시예 7-2. sdaA 유전자 결손 균주 제작
상기 실시예 7-1에서 제작한 벡터를 코리네박테리움 스테이셔니스 KCCM12151P에 일렉트로포레이션법으로 형질전환 한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 벡터가 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 상동성 재조합이 일어난 균주에서 서열번호 34와 서열번호 35의 프라이머 쌍을 이용하여 sdaA 유전자가 결손된 균주를 선별하였다. 위와 같은 방법으로 획득된 세린 탈수화효소가 결손된 균주를 CJI-3176(KCCM12151P_sda_deletion)라 명명하였다.
서열번호 명칭 서열
34 primer 5’- TAATCCCCCAGCTCACCGGC -3’
35 primer 5’- TTTGGATGCCGAGGTCGTAG -3’
실시예 7-3. sdaA 유전자 결손 균주의 IMP 생산능 평가
상기 실시예 7-2에서 제작된 균주 및 모균주에 대해 플라스크 발효역가 평가를 통해 IMP 생산능을 평가하였다. 하기 종배지 2.5 ml을 함유하는 14 ml tube에 코리네박테리움 스테이셔니스 KCCM12151P, CJI-3176을 접종하고 30℃에서 24시간 동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 29 ml (본배지 24 ml + 별살배지 5 ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 2ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간동안 170 rp으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 5’-이노신산의 생산량을 측정하였다.
상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.
<IMP종배지>
포도당 1%, 펩톤1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100㎎/L, 구아닌100㎎/L, pH7.2
<IMP 플라스크 발효배지>
글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘1 .2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20㎎/L, 황산망간 20㎎/L, 황산아연 20㎎/L, 황산구리 5㎎/L, L-시스테인 23㎎/L, 베타알라닌 24㎎/L, 니코틴산 8㎎/L, 비오틴 45㎍/L, 티아민염산 5㎎/L, 아데닌 30㎎/L, 인산(85%) 1.9%, 포도당4.2%, 과당 2.4% 첨가
코리네박테리움 스테이셔니스의 세린 탈수화효소 결손에 따른 배양 결과는 하기 표 13에 나타내었다.
세린 탈수화효소 결손에 따른 5’-이노신산 생산량 확인
균주번호 도입형태 OD 5’-이노신산(g/L) 농도증가율 (%)
KCCM12151P Control 41.3 5.2 -
CJI-3176 △sda 40.8 5.5 5.7
IMP 생산균주 내부의 세린 탈수화효소의 결손으로 인한 세린 풀의 증가는 5’-이노신산 생산량 증가로 이어질 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. sdaA 결손 및 glyA 추가 강화 균주 제작 및 IMP 생산능 평가
실시예 8-1. sdaA 결손 및 glyA 추가 강화 재조합 벡터 및 5’-이노신산 생산 균주 제작
코리네박테리움 스테이셔니스의 내재적 유전자인 sdaA를 결손하고, 해당 유전자 위치에 glyA 유전자의 copy 수를 추가하는 형태로 시너지 효과를 확인하고자 하였다. 따라서, 상기 실시예 7-2에서 제조한의 CJI-3176에 sdaA를 결손하고, 해당 유전자 위치에 glyA의 copy 수를 추가하는 실험을 진행하였다.
코리네박테리움 스테이셔니스 야생형인 ATCC6872 균주의 염색체 유전자를 Intron사의 G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045)를 이용하여 kit에 제공된 protocol에 따라 분리하고 서열번호 36과 서열번호 37의 프라이머 쌍 및 서열번호 38과 서열번호 39의 프라이머 쌍 및 서열번호 40와 서열번호 41의 프라이머 쌍, 서열번호 42와 서열번호 43의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편(del_sda::Pcj7/glyA-A, del_sda::Pcj7/glyA -B, del_sda::Pcj7/glyA -C, del_sda::Pcj7/glyA -D)을 각각 얻었다. PCR법의 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
상기에서 수득한 네 단편을 주형으로 2nd PCR을 실시하여 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. T4 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)에 접합 하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-del_sdaA-Pn/glyA라 명명하였다.
벡터제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
36 primer 5’- AATTCGAGCTCGGTACCCCATTTCGTGACCATTAGCGT -3’
37 primer 5’- ATTAGCCTGAAGGAAGATCATGCCAATAGCGCCAG -3’
38 primer 5’- GCTATTGGCATGATCTTCCTTCAGGCTAATCTTTT -3’
39 primer 5’-ATTCTGGGTAGTCATCATATGTGTTTCCTTTCGTT-3’
40 primer 5’- AAGGAAACACATATGATGACTACCCAGAATTCTTC -3’
41 primer 5’- CTTTGTACTTGGTGACCAAGAGTCAGGATGCCGAA-3’
42 primer 5’- CATCCTGACTCTTGGTCACCAAGTACAAAGAGACT -3’
43 primer 5’- CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTACCGCGCATTAGGACT-3’
상기 pDCM2-del_sdaA-Pcj7/glyA 벡터를 상기 실시예 7-2에서 제작된 CJI-3176 균주에 일렉트로포레이션법으로 형질 전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 변이 유전자와 벡터가 함께 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 상동성 재조합이 일어난 균주에서 서열번호 44와 서열번호 45의 프라이머 쌍을 이용하여 sdaA 유전자가 결손되고, 해당 위치에 Pcj7 프로모터와 연결된 glyA 유전자가 삽입된 균주를 선별하였다. 위와 같은 방법으로 획득된 균주를 CJI-3177(CJI-3176_del_sdaA-Pn/glyA)으로 명명하였다.
균주 제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
44 primer 5’-TAATCCCCCAGCTCACCGGC-3’
45 primer 5’- TTTGGATGCCGAGGTCGTAG-3’
실시예 8-2. sdaA 결손 및 glyA 추가 강화 균주 제작 균주의 IMP 생산능 평가
상기 실시예 7-2 및 상기 실시예 8-1에서 제작된 균주 및 모균주에 대해 플라스크 발효역가 평가를 통해 IMP 생산능을 평가하였다. 하기 종배지 2.5 ml을 함유하는 14 ml tube에 코리네박테리움 스테이셔니스 KCCM12151P, CJI-3176, CJI-3177을 접종하고 30℃에서 24시간 동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 29 ml (본배지 24 ml + 별살배지 5 ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 2ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간동안 170 rp으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 5’-이노신산의 생산량을 측정하였다
상기 종배지 및 발효배지의 조성은 다음과 같다.
<IMP종배지>
포도당 1%, 펩톤1%, 육즙 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100㎎/L, 구아닌100㎎/L, pH7.2
<IMP 플라스크 발효배지>
글루타민산 나트륨 0.1%, 암모늄클로라이드 1%, 황산마그네슘1 .2%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 20㎎/L, 황산망간 20㎎/L, 황산아연 20㎎/L, 황산구리 5㎎/L, L-시스테인 23㎎/L, 베타알라닌 24㎎/L, 니코틴산 8㎎/L, 비오틴 45㎍/L, 티아민염산 5㎎/L, 아데닌 30㎎/L, 인산(85%) 1.9%, 포도당4.2%, 과당 2.4% 첨가
코리네박테리움 스테이셔니스의 세린 탈수화효소 결손에 따른 배양 결과는 하기 표 16에 나타내었다.
세린 탈수화효소 결손에 따른 5’-이노신산 생산량 확인
균주번호 도입형태 OD 5’-이노신산(g/L) 농도증가율 (%)
KCCM12151P Control 41.3 5.2 -
CJI-3176 △sda 40.8 5.5 5.7
CJI-3177 CJI-3176 -del_sdaA- Pcj7/glyA 39.2 5.9 13.4
IMP 생산균주 내부의 세린 탈수화효소의 결손으로 인한 세린 풀의 증가와 더불어 glyA의 copy 추가로의 강화는 5’-이노신산 생산량 증가에 시너지 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 9. sdaA 결손 및 glyA 추가 강화 균주 기반 gcvPTH 강화, fdh결손, purT 강화 균주 제작 및 평가 (IMP)
실시예 9-1. gcvPTH 추가 강화 재조합 벡터 및 5’-이노신산 균주 제작
코리네박테리움 스테이셔니스 균주의 내재적 gcvPTH 유전자를 native 프로모터 형태로 copy 추가하는 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위한 플라스미드 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)를 이용하여 하기와 같이 제작하였다.
코리네박테리움 스테이셔니스 야생형인 ATCC6872 균주의 염색체 유전자를 Intron사의 G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045)를 이용하여 kit에 제공된 protocol에 따라 분리하고, 서열번호 46과 서열번호 47의 프라이머 쌍 및 서열번호48 과 서열번호49 의 프라이머 쌍 및 서열번호 50와 서열번호 51의 프라이머 쌍, 서열번호 52와 서열번호 53의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편(Pn/gcvPTH-A, Pn/gcvPTH -B, Pn/gcvPTH -C, Pn/gcvPTH-D)을 각각 얻었다. PCR법의 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
상기에서 수득한 유전자의 단편을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. T4 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDCM2(대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)에 접합 하였다. 제조된 벡터를 pDCM2-Pn/gcvPTH로 명명하였다.
벡터제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
46 Pn/gcvPTH-A-F 5’- AATTCGAGCTCGGTACCCAGGCACAGCCGACATTACGG -3’
47 Pn/gcvPTH-A-R 5’- GTAGCACATCTGACGAATGTCCAAGTCTAAGGAAA -3’
48 Pn/gcvPTH-B-F 5’- TTAGACTTGGACATTCGTCAGATGTGCTACTTGCC -3’
49 Pn/gcvPTH-B-R 5’- TGCGCCATTAGCGTGTTACTTCTCGCGGCTATAGA -3’
50 Pn/gcvPTH-C-F 5’- AGCCGCGAGAAGTAACACGCTAATGGCGCATTGAA -3’
51 Pn/gcvPTH-C-R 5’- TGAATTATCCGCGTCTTAGATGCCGTTTTCTGCCG-3’
52 Pn/gcvPTH-D-F 5’- GAAAACGGCATCTAAGACGCGGATAATTCAGCTGT -3’
53 Pn/gcvPTH-D-R 5’- CGACTCTAGAGGATCCCCGATGAAGCGAACACTTAAAT -3’
실시예 9-2. gcvPTH 유전자가 강화된 5’-이노신산 생산 균주 제작
상기 실시예 8-1에서 제작한 CJI-3177 (CJI-3176_del_sdaA-Pn/glyA) 균주에 gcvPTH를 강화하는 실험을 진행하였다. 상기 실시예 9-1에서 제작한 pDCM2-Pn/gcvPTH 벡터를 상기 실시예 8-1에서 제작한 CJI-3177 (CJI-3176_del_sdaA-Pn/glyA) 균주에 일렉트로포레이션법으로 형질 전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 변이 유전자와 벡터가 함께 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 상동성 재조합이 일어난 균주에서 서열번호 54 서열번호 55 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 1차 확인 후 유전자 서열분석을 통해 최종 확인하였다. 선별된 균주를 각각 CJI-3192(CJI-3177_Pn/gcvPTH)로 명명하였다.
서열번호 명칭 서열
54 primer 5’- CCAGTACATTGTCATGGGAT-3’
55 primer 5’- GATTGGCATATCGCACCGAG -3’
실시예 9-3. fdh 결손 및 purT 추가 강화 재조합 벡터 및 5’-이노신산 생산 균주 제작
코리네박테리움 스테이셔니스의 내재적 유전자인 fdh를 결손하고, 해당 유전자 위치에 purT 유전자의 copy 수를 추가하는 형태로 벡터를 제작하여, 최종적으로 IMP 생산주에서 gcvPTH 강화와의 시너지 효과를 확인하고자 하였다. 따라서, 상기 실시예 9-2에서 제작한 CJI-3192에 fdh를 결손하고, 해당 유전자 위치에 purT의 copy 수를 추가하는 실험을 진행하였다.
코리네박테리움 스테이셔니스 야생형인 ATCC6872 균주의 염색체 유전자를 Intron사의 G-spin Total DNA extraction mini kit (Cat. No 17045)를 이용하여 kit에 제공된 protocol에 따라 분리하고 서열번호 56과 서열번호 57의 프라이머 쌍 및 서열번호 58과 서열번호 59의 프라이머 쌍 및 서열번호 60와 서열번호 61의 프라이머 쌍, 서열번호 62와 서열번호 63의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 유전자 단편(del_fdh::Pcj7/purT-A, del_fdh::Pcj7/purT-B, del_fdh::Pcj7/purT-C, del_fdh::Pcj7/purT-D)을 각각 얻었다. PCR법의 조건은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
상기에서 수득한 네 단편을 주형으로 2nd PCR을 실시하여 얻어진 유전자의 단편을 제한효소 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)으로 절단하였다. T4 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 상기 유전자 단편으로 XbaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDCM2 (대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)에 접합 하였다. 결과로 얻은 플라스미드를 pDCM2-del_fdh-Pcj7/purT라 명명하였다.
벡터제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
56 primer 5’- TCGAGCTCGGTACCCGTTGCCGTATCAGACATGCTCAG -3’
57 primer 5’- GATTAGCCTGAAGGAATTGATTTATCTCGACCAAACAG -3’
58 primer 5’- GGTCGAGATAAATCAATTCCTTCAGGCTAATCTTTTCC -3’
59 primer 5’- CGATATAAGACTCCATCATATGTGTTTCCTTTCGTTGG-3’
60 primer 5’- AAAGGAAACACATATGATGGAGTCTTATATCGGTAGCC -3’
61 primer 5’- CTCATAGGTGCCGAACTTACTCGGAGATTTCGACCTCA-3’
62 primer 5’- CGAAATCTCCGAGTAAGTTCGGCACCTATGAGAATATG -3’
63 primer 5’- CTCTAGAGGATCCCCGGCAAGTGTTTCTTGGCGCCATTC-3’
상기 pDCM2-del_fdh-Pcj7/purT 벡터를 상기 실시예 9-2에서 제작된 CJI-3192 균주(IMP 생산균주)에 일렉트로포레이션법으로 형질 전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상에 변이 유전자와 벡터가 함께 삽입된 균주를 1차 후보군으로 선별하였다. 이후 상동성 재조합이 일어난 균주에서 서열번호 64와 서열번호 65의 프라이머 쌍을 이용하여 fdh 유전자가 결손되고, 해당 위치에 Pcj7 프로모터와 연결된 purT 유전자가 삽입된 균주를 선별하였다. 위와 같은 방법으로 획득된 균주를 CJI-3193(CJI-3192-del_fdh-Pcj7/purT)으로 명명하였다.
균주 제작을 위해 사용된 프라이머의 서열들은 각각 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
64 primer 5’-GCGAGGGGGAAGAAAAGTA -3’
65 primer 5’- CGTTGCCCTTTTTCTTCT -3’
실시예 10. glyA 강화 및 sda 결손 균주 기반 gcvPTH 강화, fdh결손, purT 강화 균주의 5’-이노신산 생산능 확인
상기 실시예 9-2 및 실시예 9-3에서 제작된 균주 및 모균주의 5’-이노신산 생산능을 측정하기 위하여 플라스크 역가 평가를 실시하였다. 하기 종배지 2.5 ml을 함유하는 14 ml tube에 코리네박테리움 스테이셔니스 KCCM12151P, CJI-3192, CJI-3193을 접종하고 30℃에서 24시간 동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 29 ml (본배지 24 ml + 별살배지 5 ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 2ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간동안 170 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 5’-이노신산의 생산량을 측정하였다.
상기 종배지 및 발효배지의 조성은 실시예 8-2와 동일하다.
코리네박테리움 스테이셔니스의 포름산 탈수소효소 결손 및 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 강화와 gcvPTH강화, glyA 강화 및 sda결손 조합에에 따른 배양 결과는 하기 표 21에 나타내었다.
포름산 탈수소효소 결손 및 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 강화 및 gcvPTH강화, glyA 강화 및 sda 결손 조합에 따른 5’-이노신산 생산량 확인
균주번호 도입형태 OD 5’-이노신산(g/L) 농도증가율 (%)
KCCM12151P Control 40.1 5.3 -
CJI-3192 CJI-3177_Pn/gcvPTH 39.1 6.2 16.9
CJI-3193 CJI-3192_del_fdh-Pcj7/PurT 39.4 6.9 30.1
IMP 생산균주에서의 sdaA 결손, glyA 강화 및 gcvPTH 강화를 통합해주었을 때, IMP 생산량 증가로 이어질 수 있으며, 추가적으로 fdh를 결손해주면서 해당 위치에 purT를 copy 수 증가의 방법으로 강화해주었을 때 IMP 농도가 추가적으로 증가함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세린 탈수화효소는 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 활성이 조절된 것인, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물:
    (a) 포름산 탈수소효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화;
    (b) 글리신 분해 효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화;
    (c) 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화; 및
    (d) 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 강화.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인 것인, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 스테이셔니스인 것인, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 비변형 미생물과 비교하여 퓨린 뉴클레오티드 생산능이 증가된 것인, 퓨린 뉴클레오티드 생산능을 가지는 미생물.
  7. 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 퓨린 뉴클레오티드의 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 배양된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 상기 배양 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
  9. 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 퓨린 뉴클레오티드 생산용 조성물.
  10. 세린 탈수화효소 단백질 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 미생물의 퓨린 뉴클레오티드 생산 용도.
PCT/KR2023/020106 2022-12-08 2023-12-07 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 Ceased WO2024123109A1 (ko)

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