WO2024135609A1 - 核酸合成用リンカー、及び担体、並びにそれらの製造方法 - Google Patents

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WO2024135609A1
WO2024135609A1 PCT/JP2023/045266 JP2023045266W WO2024135609A1 WO 2024135609 A1 WO2024135609 A1 WO 2024135609A1 JP 2023045266 W JP2023045266 W JP 2023045266W WO 2024135609 A1 WO2024135609 A1 WO 2024135609A1
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WO
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nucleic acid
solvent
substitutable position
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PCT/JP2023/045266
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French (fr)
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功幸 張
瞭平 梶野
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Syncrest Inc
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Syncrest Inc
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/08—Bridged systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support

Definitions

  • the present invention relates to a linker and carrier for nucleic acid synthesis, and a method for producing the same.
  • a solid support is used to which a nucleoside is bound via a linker that is cleaved under basic conditions such as aqueous ammonia, etc.
  • a linker that is cleaved under basic conditions such as aqueous ammonia, etc.
  • a succinyl group is widely used, and a support for solid phase nucleic acid synthesis is used in which the 3'-hydroxyl group of the nucleoside is ester-bonded to the solid support.
  • nucleic acids there are eight types: DNA (thymine: T, adenine: A, cytosine: C, guanine: G) and RNA (uracil: U, adenine: A, cytosine: C, guanine: G).
  • DNA thymine: T
  • adenine: A adenine: A
  • cytosine: C guanine: G
  • RNA uracil: U, adenine: A, cytosine: C, guanine: G
  • Patent documents 1 and 2 disclose a linker for solid-phase synthesis of nucleic acid and a support for solid-phase synthesis of nucleic acid.
  • Patent document 3 discloses universal building blocks and supports for use in the preparation of oligomeric compounds.
  • Non-Patent Document 1 discloses cleavable spacer (CS) derivatives for tandem synthesis of multiple oligonucleotides in a single column.
  • the present invention aims to provide a new linker for nucleic acid synthesis and a support for solid-phase nucleic acid synthesis.
  • the inventors have developed a new universal support that can synthesize oligonucleotides with high purity and efficiency without generating by-products derived from non-nucleoside linkers.
  • the present invention includes the following linkers for nucleic acid synthesis, supports for solid-phase nucleic acid synthesis, and methods for producing these.
  • A is present at one substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • B represents, at a substitutable position, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group, which may be the same or different.
  • a method for producing a linker precursor for nucleic acid synthesis represented by the following formula: In a solvent, In the presence of an oxidizing agent and a reoxidizing agent, The following general formula (1):
  • a method for producing a linker precursor for nucleic acid synthesis comprising a step of subjecting a compound represented by the following formula (1):
  • Item 2 The method according to item 1, wherein the oxidizing agent is at least one oxidizing agent selected from the group consisting of osmium tetroxide (OsO 4 ) and ozone (O 3 ).
  • the oxidizing agent is at least one oxidizing agent selected from the group consisting of osmium tetroxide (OsO 4 ) and ozone (O 3 ).
  • Item 3. The method according to item 1, wherein the reoxidizing agent is at least one reoxidizing agent selected from the group consisting of N-methylmorpholine-N-oxide (NMO), trimethylamine-N-oxide (Me 3 NO), and tert-butyl hydroperoxide (TBHP).
  • NMO N-methylmorpholine-N-oxide
  • Me 3 NO trimethylamine-N-oxide
  • TBHP tert-butyl hydroperoxide
  • Item 4. The method according to item 1, wherein the solvent is a mixed solvent of water and a hydrophilic organic solvent.
  • A is present at one substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • B represents, at a substitutable position, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group, which may be the same or different.
  • a linker precursor for nucleic acid synthesis represented by the formula:
  • A is present at one substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • a method for producing a linker precursor for nucleic acid synthesis represented by the following formula: In a solvent, The following general formula (2):
  • a and B are the same as those in formula (3).
  • a compound represented by the formula: A method for producing a linker precursor for nucleic acid synthesis, comprising a step of reacting with 4,4'-dimethoxytrityl chloride (DMTr-Cl), 4-methoxytrityl chloride (MMTr-Cl), or trityl chloride (Tr-Cl).
  • DMTr-Cl 4,4'-dimethoxytrityl chloride
  • MMTr-Cl 4-methoxytrityl chloride
  • Tr-Cl trityl chloride
  • Item 7. The method according to item 6, wherein the solvent is at least one organic solvent selected from the group consisting of aprotic polar solvents.
  • A is present at one substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • a linker precursor for nucleic acid synthesis represented by the formula:
  • L is present at one substitutable position and represents a -CO-OH group, a -NH-CO-OH group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OH group.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • Prot 2 represents a protecting group for a hydroxyl group.
  • a method for producing a linker for nucleic acid synthesis represented by the following formula: The following general formula (3):
  • A is present at one substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • B and Prot 1 are the same as those in formula (4).
  • a method for producing a linker for nucleic acid synthesis comprising:
  • Item 11 The method according to item 9, wherein the solvent used in step (2) is at least one solvent selected from the group consisting of aprotic polar solvents and ether solvents.
  • L is present at one substitutable position and represents a -CO-OH group, a -NH-CO-OH group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OH group.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • Prot 2 represents a protecting group for a hydroxyl group.
  • a linker for nucleic acid synthesis represented by the formula:
  • G is present at one substitutable position and represents the following formula (G1), (G2), or (G3).
  • SP represents a solid phase carrier.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • Prot 2 represents a protecting group for the hydroxyl group.
  • a method for producing a support for solid-phase synthesis of nucleic acid comprising the steps of: In a solvent, In the presence of a coupling agent, The following general formula (4):
  • L is present at one substitutable position and represents a -CO-OH group, a -NH-CO-OH group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OH group.
  • SP solid phase carrier
  • the coupling agent is 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium-3-oxide hexafluorophosphate (HATU), 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), O-(1H-6-chlorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium-3-oxide Tetrafluoroborate (TATU), 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium-3-oxide tetrafluoroborate (TBTU), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-e
  • the coupling agent is at least one selected from the group consisting of benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP), 1H-benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), and 1H-benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP).
  • BOP benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate
  • PyBOP 1H-benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate
  • PyBOP 1H-benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate
  • Item 15 The method according to item 13, wherein the solvent is at least one organic solvent selected from the group consisting of aprotic polar solvents and halogenated solvents.
  • G is present at one substitutable position and represents the following formula (G1), (G2), or (G3).
  • SP represents a solid phase carrier.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • Prot 2 represents a protecting group for a hydroxyl group.
  • the nucleic acid synthesis linker of the present invention can be used as a support for solid-phase nucleic acid synthesis.
  • the linker for nucleic acid synthesis of the present invention has no cleavable bond (ester bond) and has a non-cleavable bond (amide bond) between the linker structures (between the solid phase support and the linker structure) under conditions (such as ammonia water) for cleaving the universal linker (compound represented by general formula (4)) from the solid phase support (SP).
  • nucleic acid synthesis linker and nucleic acid solid-phase synthesis support of the present invention When used, they have a bond (amide bond) that does not cleave during the excision step under basic conditions (ammonia water, etc.) in the solid-phase synthesis of nucleic acids, suppressing the production of by-products (linker adducts) that occur when conventional universal linkers are used, making it possible to provide highly pure nucleic acids.
  • the linker for nucleic acid synthesis of the present invention has a bicyclic structure that promotes nucleophilic attack by the adjacent hydroxyl group on the phosphate group, allowing the oligonucleic acid to be released from the solid phase support with high efficiency.
  • the present invention provides a new linker for nucleic acid synthesis and a support for solid-phase nucleic acid synthesis.
  • a method for producing a linker precursor 1 for nucleic acid synthesis according to the present invention comprising the steps of:
  • A is present at one substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • B represents, at a substitutable position, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group, which may be the same or different.
  • a method for producing a linker precursor for nucleic acid synthesis represented by the following formula: In a solvent, In the presence of an oxidizing agent and a reoxidizing agent, The following general formula (1):
  • the method includes subjecting a compound represented by the following formula (1) to an oxidation reaction.
  • the method includes subjecting a compound represented by the following formula (1):
  • a linker precursor for nucleic acid synthesis is produced, which is represented by the formula:
  • one A is present at a substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • R is preferably a linear, branched or cyclic alkyl group, specifically, for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, 1-ethylpropyl, etc., a benzyl group (C 6 H 5 CH 2 -), etc.
  • R is more preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (lower alkyl, more preferably a methyl group), a benzyl group, etc.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • the lower alkyl group is preferably a linear, branched or cyclic alkyl group, specifically, for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, 1-ethylpropyl, etc.
  • the lower alkoxy group is preferably a straight-chain or branched-chain alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropyloxy, n-butoxy, isobutyloxy, sec-butoxy, tert-butoxy, or 1-ethylpropyloxy.
  • the lower alkoxy group is preferably methoxy or tert-butoxy.
  • the dialkylamino group is preferably a dialkylamino group having two linear or branched alkyl groups each having 1 to 2 carbon atoms, such as a dimethylamino group, a diethylamino group, or an ethylmethylamino group.
  • the solvent is preferably a mixed solvent of water and a hydrophilic organic solvent.
  • the hydrophilic organic solvent is preferably a hydrophilic organic solvent such as an aprotic polar solvent, an ether solvent, or an ester solvent.
  • the aprotic polar solvent is preferably acetone, acetonitrile (CH 3 CN), N,N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), pyridine, or the like.
  • the ether solvent is preferably tetrahydrofuran (THF), dioxane, diethyl ether (Et 2 O), isopropyl ether (IPE), or the like.
  • the ester solvent is preferably ethyl acetate (AcOEt) or the like.
  • the hydrophilic organic solvent is more preferably an aprotic polar solvent such as acetone, acetonitrile, DMF, or DMSO, or an ether solvent (polar solvent) such as THF, dioxane, or diethyl ether.
  • aprotic polar solvent such as acetone, acetonitrile, DMF, or DMSO
  • ether solvent such as THF, dioxane, or diethyl ether.
  • the hydrophilic organic solvent is more preferably a mixed solvent of water and acetonitrile.
  • the amount of hydrophilic solvent used is adjusted so that the concentration (molar concentration M (mol/L)) of the compound represented by general formula (1) (substrate) is preferably 0.01M to 5M, more preferably 0.1M to 2M.
  • the oxidizing agent is preferably at least one oxidizing agent selected from the group consisting of osmium tetroxide (OsO 4 ) and ozone (O 3 ).
  • an oxidizing agent is used to advance an oxidation reaction, and a hydroxyl group is added to the compound (substrate) represented by general formula (1).
  • the amount of oxidizing agent used is adjusted so that the concentration in the solvent (molar concentration M (mol/L)) is preferably 0.01M to 5M, and more preferably 0.1M to 2M.
  • the amount of oxidizing agent used is adjusted so that the concentration relative to the compound represented by general formula (1) (substrate) (when the substrate is taken as 100 mol%) is preferably 0.01 mol% to 100 mol%, more preferably 0.1 mol% to 50 mol%, and even more preferably 1 mol% to 10 mol% in molar ratio.
  • the reoxidant is preferably at least one reoxidant selected from the group consisting of N-methylmorpholine-N-oxide (NMO), trimethylamine-N-oxide ( Me3NO ), and tert-butyl hydroperoxide (TBHP).
  • NMO N-methylmorpholine-N-oxide
  • Me3NO trimethylamine-N-oxide
  • TBHP tert-butyl hydroperoxide
  • a reoxidizing agent is used to advance the oxidation reaction, and a hydroxyl group is added to the compound (substrate) represented by general formula (1).
  • the amount of reoxidizing agent used is adjusted so that the concentration in the solvent (molar concentration M (mol/L)) is preferably 0.01M to 5M, and more preferably 0.1M to 2M.
  • the amount of reoxidizing agent used is adjusted so that the concentration relative to the compound represented by general formula (1) (substrate) (when the substrate is taken as 100 mol%) is preferably 50 mol% to 10,000 mol%, more preferably 90 mol% to 1000 mol%, and even more preferably 100 mol% to 500 mol% in molar ratio.
  • the reaction temperature of the oxidation reaction is preferably 0°C to 100°C, more preferably 10°C to 80°C, and even more preferably 20°C to 60°C.
  • the reaction time for the oxidation reaction is preferably 0.1 to 100 hours, more preferably 0.1 to 50 hours, and even more preferably 0.1 to 10 hours.
  • a linker precursor for nucleic acid synthesis 1 represented by general formula (2) The present invention relates to The following general formula (2):
  • a method for producing a linker precursor 2 for nucleic acid synthesis comprising the steps of:
  • A is present at one substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • a method for producing a linker precursor for nucleic acid synthesis represented by the following formula: In a solvent, The following general formula (2):
  • a compound represented by the formula: The method includes reacting with 4,4'-dimethoxytrityl chloride (DMTr-Cl), 4-methoxytrityl chloride (MMTr-Cl), or trityl chloride (Tr-Cl).
  • DMTr-Cl 4,4'-dimethoxytrityl chloride
  • MMTr-Cl 4-methoxytrityl chloride
  • Tr-Cl trityl chloride
  • DMTr-Cl 4,4'-dimethoxytrityl chloride
  • MMTr-Cl 4-methoxytrityl chloride
  • Tr-Cl trityl chloride
  • a linker precursor for nucleic acid synthesis is produced, which is represented by the formula:
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group (DMTr group), a 4-methoxytrityl group (MMTr group), or a trityl group (Tr group).
  • DMTr group 4,4'-dimethoxytrityl group
  • MMTr group 4-methoxytrityl group
  • Tr group trityl group
  • the solvent is preferably at least one organic solvent selected from the group consisting of aprotic polar solvents.
  • the aprotic polar solvent is more preferably acetone, acetonitrile (CH 3 CN), N,N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), pyridine, tetrahydrofuran (THF), or the like.
  • the organic solvent is more preferably pyridine.
  • the amount of solvent used is adjusted so that the concentration (molar concentration M (mol/L)) of the compound represented by general formula (2) (substrate) is preferably 0.01M to 5M, more preferably 0.1M to 2M.
  • DMTr-Cl 4,4'-dimethoxytrityl chloride
  • MMTr-Cl 4-methoxytrityl chloride
  • Tr-Cl trityl chloride
  • the amount of DMTr-Cl, MMTr-Cl, or Tr-Cl used (hydroxyl group protection reaction) is adjusted so that the concentration in the solvent (molar concentration M (mol/L)) is preferably 0.01M to 5M, more preferably 0.1M to 2M.
  • the amount of DMTr-Cl, MMTr-Cl, or Tr-Cl used (hydroxyl group protection reaction) is adjusted so that the concentration relative to the compound represented by general formula (2) (substrate) (when the substrate is taken as 100 mol%) is preferably 0.01 mol% to 100 mol%, more preferably 0.1 mol% to 50 mol%, and even more preferably 1 mol% to 10 mol% in molar ratio.
  • the reaction temperature for the hydroxyl protection reaction is preferably 0°C to 100°C, more preferably 10°C to 80°C, and even more preferably 20°C to 60°C.
  • the reaction time for the hydroxyl group protection reaction is preferably 0.1 to 100 hours, more preferably 0.1 to 50 hours, and even more preferably 0.1 to 20 hours.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group (DMTr group), a 4-methoxytrityl group (MMTr group), or a trityl group (Tr group).
  • DMTr group 4,4'-dimethoxytrityl group
  • MMTr group 4-methoxytrityl group
  • Tr group trityl group
  • the DMTr group in Prot 1 is derived from DMTr-Cl used in the protection reaction of the hydroxyl group.
  • the MMTr group in Prot 1 is derived from MMTr-Cl used in the protection reaction of the hydroxyl group.
  • Tr group in Prot 1 is derived from Tr-Cl used in the protection reaction of the hydroxyl group.
  • a method for producing a linker for nucleic acid synthesis according to the present invention comprising the following general formula (4):
  • L is present at one substitutable position and represents a -CO-OH group, a -NH-CO-OH group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OH group.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • Prot 2 represents a protecting group for a hydroxyl group.
  • the method for producing a linker for nucleic acid synthesis represented by the following formula: The following general formula (3):
  • A is present at one substitutable position and represents a -CO-OR group, a -NH-CO-OR group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OR group.
  • R represents a protecting group for a carboxylic acid.
  • B and Prot 1 are the same as those in formula (4).
  • (1) a step of hydrolyzing in a solvent, followed by (2) A step of protecting a hydroxyl group in a solvent is included.
  • the present invention produces a linker for nucleic acid synthesis represented by the formula:
  • A, B, and Prot 1 are as defined above.
  • one L is present at a substitutable position and represents a -CO-OH group, a -NH-CO-OH group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OH group.
  • Prot 2 represents a protecting group for a hydroxyl group.
  • Step (1) of hydrolyzing a compound (substrate) represented by general formula (3) in a solvent a hydrolysis reaction is carried out on a compound (substrate) represented by general formula (3) in a solvent (1), and A (-CO-OR, -NH-CO-OR, or -CO-NH- CH2 -CO-OR; R: carboxylic acid protecting group) in formula (3) is hydrolyzed to L (-CO-OH, -NH-CO-OH, or -CO-NH- CH2 -CO-OH) in formula (4).
  • the solvent used in step (1) is preferably at least one solvent selected from the group consisting of an alkaline aqueous solution, an ether solvent, an alcohol solvent, and a halogen-based solvent.
  • the alkaline aqueous solution is preferably a sodium hydroxide aqueous solution, a sodium carbonate aqueous solution, a calcium hydroxide aqueous solution, a potassium hydroxide aqueous solution, an ammonia aqueous solution, a sodium hydrogen carbonate aqueous solution, etc.
  • the ether solvent is preferably tetrahydrofuran (THF), dioxane, diethyl ether (Et 2 O), isopropyl ether (IPE), or the like.
  • the alcohol-based solvent is preferably methanol (CH 3 OH), ethanol, propanol, isopropanol, hexafluoroisopropanol (HFIP), trifluoromethanol, pentafluoroethanol, or the like.
  • the halogen-based solvent is preferably dichloromethane (DCM, CH 2 Cl 2 ), trichloromethane (CHCl 3 ), or the like.
  • the amount of solvent used is adjusted so that the concentration (molar concentration M (mol/L)) of the compound represented by general formula (3) (substrate) is preferably 0.01M to 5M, more preferably 0.1M to 2M.
  • the reaction temperature for the hydrolysis reaction is preferably 0°C to 100°C, more preferably 10°C to 80°C, and even more preferably 20°C to 60°C.
  • the reaction time for the hydrolysis reaction is preferably 0.1 to 100 hours, more preferably 0.1 to 50 hours, and even more preferably 0.1 to 10 hours.
  • step (1) (2) a step of protecting the hydroxyl group in a solvent
  • a reaction for protecting the hydroxyl group in a compound (substrate) represented by general formula (3) is carried out in a solvent (2), and the hydroxyl group (-OH) in formula (3) is protected to Prot 2 (a hydroxyl-protecting group, such as an Ac group) in formula (4).
  • the solvent used in step (2) is preferably at least one solvent selected from the group consisting of aprotic polar solvents and ether solvents.
  • the aprotic polar solvent is preferably acetone, acetonitrile, N,N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), pyridine, etc.
  • the ether solvent is preferably tetrahydrofuran (THF), dioxane, diethyl ether (Et 2 O), isopropyl ether (IPE), or the like.
  • the amount of solvent used is adjusted so that the concentration (molar concentration M (mol/L)) of the compound represented by general formula (3) (substrate) is preferably 0.01M to 5M, more preferably 0.1M to 2M.
  • Hydroxyl protecting reagents For the reaction of protecting hydroxyl groups, acetic anhydride (Ac 2 O, for Ac group protection), pivaloyl chloride (PvCl, for Pv group protection), p-toluenesulfonyl isocyanate (tosyl isocyanate) (PTSI, for p-toluenesulfonylcarbamate group protection), etc. are used.
  • the amount of Ac2O , PvCl, PTSI, etc. used (hydroxyl group protection reaction) is adjusted so that the concentration in the solvent (molar concentration M (mol/L)) is preferably 0.01 M to 5 M, more preferably 0.1 M to 2 M.
  • the amount of Ac2O , PvCl, PTSI, etc. used (hydroxyl group protection reaction) is adjusted so that the concentration relative to the compound represented by general formula (3) (substrate) (when the substrate is 100 mol %) is preferably 0.01 mol % to 100 mol %, more preferably 0.1 mol % to 50 mol %, and even more preferably 1 mol % to 10 mol %.
  • the reaction temperature for the hydroxyl protection reaction is preferably 0°C to 100°C, more preferably 10°C to 80°C, and even more preferably 20°C to 60°C.
  • the reaction time for the hydroxyl group protection reaction is preferably 0.1 to 100 hours, more preferably 0.1 to 50 hours, and even more preferably 0.1 to 30 hours.
  • one L is present at a substitutable position and represents a -CO-OH group, a -NH-CO-OH group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OH group.
  • Prot 2 represents a protecting group for a hydroxyl group.
  • the hydroxyl protecting group is preferably a protecting group that can be deprotected under alkali (base conditions) and is an acyl protecting group.
  • the hydroxyl protecting group is more preferably an acetyl group (Ac group), a pivaloyl group (Pv group), a p-toluenesulfonylcarbamate group, etc.
  • Prot 2 when Prot 2 is an Ac group, it is derived from acetic anhydride (Ac 2 O) used in the protection reaction of the hydroxyl group.
  • Prot 2 when Prot 2 is a Pv group, it is derived from pivaloyl chloride (PvCl) used in the protection reaction of the hydroxyl group.
  • PvCl pivaloyl chloride
  • Prot 2 when Prot 2 is a p-toluenesulfonylcarbamate group, it is derived from p-toluenesulfonyl isocyanate (PTSI) used in the protection reaction of the hydroxyl group.
  • PTSI p-toluenesulfonyl isocyanate
  • a method for producing a support for solid-phase synthesis of nucleic acid according to the present invention comprising the steps of:
  • G is present at one substitutable position and represents the following formula (G1), (G2), or (G3).
  • SP represents a solid phase carrier.
  • B represents, identically or differently, a hydrogen atom, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a cyano group, a nitro group, or a dialkylamino group at a substitutable position.
  • Prot 1 represents a 4,4'-dimethoxytrityl group, a 4-methoxytrityl group, or a trityl group.
  • Prot 2 represents a protecting group for a hydroxyl group.
  • the method for producing a support for solid-phase synthesis of nucleic acid represented by the following formula (1) is: In a solvent, In the presence of a coupling agent, The following general formula (4):
  • L is present at one substitutable position and represents a -CO-OH group, a -NH-CO-OH group, or a -CO-NH-CH 2 -CO-OH group.
  • the method includes a step of reacting the compound represented by the formula:
  • the present invention produces a support for solid-phase synthesis of nucleic acids.
  • SP stands for solid phase carrier.
  • G is present at one substitutable position and represents the following formula (G1), (G2), or (G3).
  • SP represents a solid phase carrier.
  • the solvent is preferably at least one organic solvent selected from the group consisting of aprotic polar solvents and halogenated solvents.
  • the aprotic polar solvent is preferably N,N-diisopropylethylamine (DIPEA), acetonitrile (ACN), acetone, N,N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), pyridine, etc.
  • DIPEA N,N-diisopropylethylamine
  • ACN acetonitrile
  • DMF N,N-dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • pyridine pyridine
  • the halogen-based solvent is preferably dichloromethane (CH 2 Cl 2 ), trichloromethane (CHCl 3 ), or the like.
  • the amount of solvent used is adjusted so that the concentration (molar concentration M (mol/L)) of the compound represented by general formula (4) (substrate) is preferably 0.01M to 5M, more preferably 0.1M to 2M.
  • [4-3] Coupling Agent In the manufacturing method of the present invention, a coupling agent is used to carry out a coupling reaction, and the compound represented by general formula (4) is reacted with a solid phase support (SP- NH2 ) to produce a solid phase synthesis support for nucleic acid represented by general formula (5).
  • a coupling agent is used to carry out a coupling reaction, and the compound represented by general formula (4) is reacted with a solid phase support (SP- NH2 ) to produce a solid phase synthesis support for nucleic acid represented by general formula (5).
  • the coupling agent is preferably 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate (HATU), 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium 3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), O-(1H-6-chlorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), or O-(1H-6-chlorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU).
  • HATU 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate
  • HBTU 1-[Bis(d
  • HCTU O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Hexafluorophosphate
  • TATU 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide tetrafluoroborate
  • TBTU 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium 3-oxide tetrafluoroborate
  • TBTU oborate
  • DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide
  • the amount of coupling agent used is adjusted so that its concentration in the solvent (molar concentration M (mol/L)) is preferably 0.01M to 5M, and more preferably 0.1M to 2M.
  • the amount of coupling agent used is adjusted so that the concentration relative to the compound (substrate) represented by general formula (4) (when the substrate is taken as 100 mol%) is preferably 50 mol% to 10,000 mol%, more preferably 90 mol% to 1000 mol%, and even more preferably 100 mol% to 500 mol%, in molar ratio.
  • a compound (substrate) represented by general formula (4) is coupled with a solid phase support in a solvent in the presence of a coupling agent, so that the compound (substrate) represented by general formula (4) is bonded with the solid phase support (SP- NH2 ) via an amide bond (a bond that does not cleave under basic conditions) to produce a nucleic acid solid phase synthesis support represented by general formula (5).
  • the nucleic acid solid-phase synthesis support represented by the general formula (5) of the present invention is capable of suppressing the generation of by-products (linker adducts) by binding the solid phase support (SP) and the universal linker (compound represented by the general formula (4)) via a bond (amide bond, etc.) that is not cleaved under excision conditions (ammonia water, etc.).
  • the reaction temperature for the coupling reaction is preferably 0°C to 100°C, more preferably 10°C to 80°C, and even more preferably 20°C to 60°C.
  • the reaction time for the coupling reaction is preferably 0.1 to 100 hours, more preferably 0.1 to 50 hours, and even more preferably 0.1 to 10 hours.
  • G is present at one substitutable position and represents the following formula (G1), (G2), or (G3).
  • SP represents a solid phase carrier.
  • the present invention is a linker for nucleic acid synthesis and a support for solid-phase nucleic acid synthesis that can suppress the production of by-products (linker adducts) that are generated when using conventional universal supports.
  • the linker for nucleic acid synthesis and the support for solid-phase nucleic acid synthesis of the present invention are characterized in that the solid-phase support and the linker for nucleic acid synthesis are connected via a bond (such as an amide bond) that is not cleaved under cleavage conditions such as in aqueous ammonia.
  • the linker for nucleic acid synthesis and the support for solid-phase nucleic acid synthesis of the present invention do not generate linker adducts, and high-purity oligonucleic acids can be obtained by using the linker for nucleic acid synthesis and the support for solid-phase nucleic acid synthesis of the present invention.
  • the present invention is not limited to these.
  • reaction solution was then neutralized by adding 25% aqueous acetic acid (50 ⁇ L).
  • nucleic acid solid phase synthesis support 5-1 Compound 4 (9.5 mg, 16.8 ⁇ mol), O-(1H-6-chlorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) (7.0 mg, 16.8 ⁇ mol), and N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) (5.9 ⁇ L, 33.6 ⁇ mol) were dissolved in acetonitrile (CH 3 CN) (1 mL).
  • DIPEA N,N-diisopropylethylamine
  • this mixed solution was added to the amino group-containing CPG solid phase support (105 ⁇ mol/g, 200 mg, 21 ⁇ mol of amino groups) and shaken for 3 hours.
  • reaction solution was then filtered under suction, and the solid phase carrier was washed with acetonitrile.
  • reaction solution was then filtered by suction, and the solid phase carrier was washed with acetonitrile and dried under reduced pressure.
  • the measurement results showed that the nucleic acid solid-phase synthesis support 5 obtained was 47.1 ⁇ mol/g.
  • reaction solution was then filtered under suction, and the solid phase carrier was washed with acetonitrile.
  • reaction solution was then filtered by suction, and the solid phase carrier was washed with acetonitrile and dried under reduced pressure.
  • nucleic acid solid phase synthesis support 5-2 carrying compound 4 was prepared in the same manner as nucleic acid solid phase synthesis support 5-1.
  • the measurement results showed that the nucleic acid solid-phase synthesis support 5-2 obtained was 37.5 ⁇ mol/g.
  • the present invention is a linker for nucleic acid synthesis and a support for solid-phase nucleic acid synthesis that can suppress the production of by-products (linker adducts) that are generated when using conventional universal supports.
  • the linker for nucleic acid synthesis and the support for solid-phase nucleic acid synthesis of the present invention are characterized in that the solid-phase support and the linker for nucleic acid synthesis are connected via a bond (such as an amide bond) that is not cleaved under cleavage conditions such as in aqueous ammonia.
  • the linker for nucleic acid synthesis and the support for solid-phase nucleic acid synthesis of the present invention do not generate linker adducts, and high-purity oligonucleic acids can be obtained by using the linker for nucleic acid synthesis and the support for solid-phase nucleic acid synthesis of the present invention.

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Abstract

本発明は、新たに、核酸合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体を提供する事を目的とする。核酸合成用リンカー前駆体、核酸合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体。

Description

核酸合成用リンカー、及び担体、並びにそれらの製造方法
　本発明は、核酸合成用リンカー、及び担体、並びにそれらの製造方法に関する。
　従来、DNA、RNA等のオリゴ核酸の化学合成では、ホスホロアミダイト化合物を使用した固相合成方法が使用されている。ホスホロアミダイト法を使用した固相合成では、以下の工程に依り、オリゴ核酸を伸長させる。
　1：デブロッキング工程（5'水酸基の保護基を除去する）
　2：カップリング工程（活性化剤存在下で、核酸アミダイトを縮合し、伸長させる）
　3：キャッピング工程（未反応水酸基を無水酢酸等で保護する）
　4：酸化、又は硫化工程（ホスファイトを酸化剤、又は硫化剤と反応させる）
　これらの工程を行った後、アンモニア水等に依り、固相担体からオリゴ核酸を溶液中へ放出させる。従って、上記固相合成法では、アンモニア水等の塩基性条件下で開裂するリンカーを介してヌクレオシドを結合させた固相担体を使用する。この開裂性リンカーとしては、スクシニル基が広く使用されており、ヌクレオシド3'位水酸基と固相担体とをエステル結合させた核酸固相合成用担体が使用されている。
　一般に、DNA（チミン：T、アデニン：A、シトシン：C、グアニン：G）、及びRNA（ウラシル：U、アデニン：A、シトシン：C、グアニン：G）の計8種類、更に修飾核酸を使用する際には、それに応じた種類の核酸固相合成用担体を準備する必要が有る。
　そこで、固相担体へ非ヌクレオシドリンカーを結合させたユニバーサルサポートが開発されている。このユニバーサルサポートを使用する事に依り、1種類の固相担体で、理論上、全ての核酸配列を合成する事が可能と成る。
　特許文献1、及び2は、核酸固相合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体を開示する。
　特許文献3は、オリゴマー化合物の調製に用いるユニバーサルビルディングブロックと支持体を開示する。
　非特許文献1は、単一のカラムで複数のオリゴヌクレオチドのタンデム合成の為の切断可能なスペーサー（cleavable spacer, CS）誘導体を開示している。
JP2016-202097A JP2016-204316A US2004/0152905A1
Synthesis 2021; 53(23): 4440-4448
　本発明は、新たに、核酸合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体を提供する事を目的とする。
　従来、ユニバーサルサポートを利用する固相合成法では、オリゴ核酸の固相担体からの切り出し効率が低いという点、或は非ヌクレオシドリンカー由来の副生成物が生成し、この副生成物と目的物との分離が困難であるという点が、検討すべき課題であった。
　本発明者は、非ヌクレオシドリンカー由来の副生成物が発生せず、高純度、及び高効率に、オリゴ核酸を合成する事が出来る、新たなユニバーサルサポートを開発した。
　即ち、本発明は、以下の核酸合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体、並びにこれらの製造方法を包含する。
　項１．
　下記一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式（2）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
　式（2）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法であって、
　溶媒中で、
　酸化剤、及び再酸化剤の存在下、
　下記一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式（1）中、A、及びBは、前記式（2）と同じ。）
で表される化合物を酸化反応させる工程
を含む、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法。
　項２．
　前記酸化剤は、四酸化オスミウム（OsO4）、及びオゾン（O3）から成る群から選択される少なくとも一種の酸化剤である、前記項1に記載の製造方法。
　項３．
　前記再酸化剤は、N-メチルモルホリン-N-オキシド（NMO）、トリメチルアミン-N-オキシド（Me3NO）、及びtert-ブチルヒドロペルオキシド（TBHP）から成る群から選択される少なくとも一種の再酸化剤である、前記項1に記載の製造方法。
　項４．
　前記溶媒は、水と親水性有機溶媒との混合溶媒である、前記項1に記載の製造方法。
　項５．
　下記一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式（2）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
　式（2）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカー前駆体。
　項６．
　下記一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式（3）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
　式（3）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（3）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法であって、
　溶媒中で、
　下記一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式（2）中、A、及びBは、前記式（3）と同じ。）
で表される化合物と、
　4,4'-ジメトキシトリチルクロリド（DMTr-Cl）、4-メトキシトリチルクロリド（MMTr-Cl）、又はトリチルクロリド（Tr-Cl）とを反応させる工程
を含む、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法。
　項７．
　前記溶媒は、非プロトン性極性溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の有機溶媒である、前記項6に記載の製造方法。
　項８．
　下記一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式（3）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
　式（3）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（3）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカー前駆体。
　項９．
　下記一般式（4）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
　式（4）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（4）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
　式（4）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカーの製造方法であって、
　下記一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式（3）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
　式（3）中、B、及びProt1は、前記式（4）と同じ。）
で表される化合物（2 steps）に対して、
　（1）溶媒中で、加水分解する工程、次いで、
　（2）溶媒中で、水酸基を保護する工程、
を含む、核酸合成用リンカーの製造方法。
　項１０．
　前記工程（1）で使用する溶媒は、アルカリ水溶液、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒、及びハロゲン系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の溶媒である、前記項9に記載の製造方法。
　項１１．
　前記工程（2）で使用する溶媒は、非プロトン性極性溶媒、及びエーテル系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の溶媒である、前記項9に記載の製造方法。
　項１２．
　下記一般式（4）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
　式（4）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（4）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
　式（4）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカー。
　項１３．
　下記一般式（5）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（式（5）中、Gは、置換可能な位置に一つ存在し、下記式（G1）、（G2）、又は（G3）を示す。
　式（G1）、（G2）、又は（G3）中、SPは、固相担体を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　式（5）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（5）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
　Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
で表される、核酸固相合成用担体の製造方法であって、
　溶媒中で、
　カップリング剤の存在下、
　下記一般式（4）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
　式（4）中、B、Prot1、及びProt2は、前記式（5）と同じ。）
で表される化合物と、
　下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（SPは、固相担体を示す。）
で表される固相担体とを反応させる工程
を含む、核酸固相合成用担体の製造方法。
　項１４．
　前記カップリング剤は、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム-3-オキシドヘキサフルオロホスフェート（HATU）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキサイドヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、O-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HCTU）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム-3-オキシド テトラフルオロボレート（TATU）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシドテトラフルオロボレート（TBTU）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl）、エチル-2-シアノ-2-((ジメチルイミニオ)(モルホリノ)メチルオキシイミノ)アセテートヘキサフルオロホスフェート（COMU）、ジフェニルホスホリルアジド（DPPA）、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP）、及び1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBOP）から成る群から選択される少なくとも一種のカップリング剤である、前記項13に記載の製造方法。
　項１５．
　前記溶媒は、非プロトン性極性溶媒、及びハロゲン系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の有機溶媒である、前記項13に記載の製造方法。
　項１６．
　下記一般式（5）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（式（5）中、Gは、置換可能な位置に一つ存在し、下記式（G1）、（G2）、又は（G3）を示す。
　式（G1）、（G2）、又は（G3）中、SPは、固相担体を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　式（5）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（5）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
　式（5）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
で表される、核酸固相合成用担体。
　本発明の核酸合成用リンカーは、核酸固相合成用担体として利用する事が出来る。
　本発明の核酸合成用リンカーは、固相担体（SP）からユニバーサルリンカー（一般式（4）で表される化合物）を切り出す条件下（アンモニア水等）で、リンカー構造間（固相担体とリンカー構造間）に、開裂する結合(エステル結合)を有さず、開裂しない結合（アミド結合）を有する。
　本発明の核酸合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体を用いると、核酸の固相合成法における塩基性条件下（アンモニア水等）での切り出し工程において、開裂しない結合（アミド結合）を有しており、従来のユニバーサルリンカーを用いた場合に生じる副生成物（リンカー付加体）の生成を抑制し、高純度な核酸の提供を可能とする。
　本発明の核酸合成用リンカーは、二環性構造に依り、隣接する水酸基に依るリン酸基への求核攻撃が促進され、高効率にオリゴ核酸が固相担体から放出される。
　本発明は、新たに、核酸合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体を提供する事が出来る。
　以下に本発明を詳細に説明する。
　本明細書において、「含む」及び「含有」は、「含む（comprise）」、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」のいずれも包含する概念である。
　本明細書において、数値範囲を「A～B」で示す場合、「A以上、B以下」を意味する。
　［1］核酸合成用リンカー前駆体1の製造方法
　本発明の
　下記一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（式（2）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
　式（2）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法は、
　溶媒中で、
　酸化剤、及び再酸化剤の存在下、
　下記一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（式（1）中、A、及びBは、前記式（2）と同じ。）
で表される化合物を酸化反応させる工程を含む。
　［1-1］一般式（1）で表される化合物
　本発明は、溶媒中で、酸化剤、及び再酸化剤の存在下、
　下記一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
で表される化合物を酸化反応させる工程を含み、
　下記一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
で表される、核酸合成用リンカー前駆体を製造する。
　式（1）、及び式（2）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。
　Rは、カルボン酸の保護基を示す。Rは、好ましくは、直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基が挙げられ、具体的には、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、1-エチルプロピル等の炭素数1～4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基、ベンジル基（C6H5CH2-）等である。Rは、より好ましくは、炭素数1～4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基（低級アルキル、更に好ましくは、メチル基）、ベンジル基等である。
　式（1）、及び式（2）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　低級アルキル基は、好ましくは、直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基が挙げられ、具体的には、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、1-エチルプロピル等の炭素数1～4の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基である。
　低級アルコキシ基は、好ましくは、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロピルオキシ、n-ブトキシ、イソブチルオキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、1-エチルプロピルオキシ等の炭素数1～4の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基である。低級アルコキシ基は、好ましくは、メトキシ、tert-ブトキシである。
　ジアルキルアミノ基は、好ましくは、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基等の直鎖状又は分岐鎖状の炭素数1～2程度のアルキル基を2つ有するジアルキルアミノ基等である。
　［1-2］溶媒
　本発明の製造方法では、溶媒は、好ましくは、水と親水性有機溶媒との混合溶媒である。
　親水性有機溶媒は、好ましくは、非プロトン性極性溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒等の親水性有機溶媒である。
　非プロトン性極性溶媒は、好ましくは、アセトン、アセトニトリル（CH3CN）、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ピリジン（pyridine）等である。
　エーテル系溶媒は、好ましくは、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、ジエチルエーテル（Et2O）、イソプロピルエーテル（IPE）等である。
　エステル系溶媒は、好ましくは、酢酸エチル（AcOEt）等である。
　親水性有機溶媒は、より好ましくは、アセトン、アセトニトリル、DMF、DMSO等の非プロトン性極性溶媒、THF、ジオキサン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒（極性溶媒）である。
　水と親水性有機溶媒との配合比は、体積比で、好ましくは、水：親水性有機溶媒＝3：7～9：1であり、より好ましくは、水：親水性有機溶媒＝4：6～8：2であり、更に好ましくは、水：親水性有機溶媒＝5：5～7：3である。
　親水性有機溶媒は、更に好ましくは、水とアセトニトリルとの混合溶媒である。
　親水性溶媒の使用量は、一般式（1）で表される化合物（基質）の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　［1-3］酸化剤
　本発明の製造方法では、酸化剤は、好ましくは、四酸化オスミウム（OsO4）、及びオゾン（O3）から成る群から選択される少なくとも一種の酸化剤である。
　本発明の製造方法では、酸化剤を用いて、酸化反応を進め、一般式（1）で表される化合物（基質）に、水酸基を付加する。
　酸化剤の使用量（酸化反応）は、溶媒中の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　酸化剤の使用量（酸化反応）は、一般式（1）で表される化合物（基質）に対する濃度として（基質を100モル%とする時に）、モル比で、好ましくは、0.01モル%～100モル%に、より好ましくは、0.1モル%～50モル%に、更に好ましくは、1モル%～10モル%に成る様に調整する。
　［1-4］再酸化剤
　本発明の製造方法では、再酸化剤は、好ましくは、N-メチルモルホリン-N-オキシド（NMO）、トリメチルアミン-N-オキシド（Me3NO）、及びtert-ブチルヒドロペルオキシド（TBHP）から成る群から選択される少なくとも一種の再酸化剤である。
　本発明の製造方法では、再酸化剤を用いて、酸化反応を進め、一般式（1）で表される化合物（基質）に、水酸基を付加する。
　再酸化剤の使用量（酸化反応）は、溶媒中の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　再酸化剤の使用量（酸化反応）は、一般式（1）で表される化合物（基質）に対する濃度として（基質を100モル%とする時に）、モル比で、好ましくは、50モル%～10,000モル%に、より好ましくは、90モル%～1000モル%に、更に好ましくは、100モル%～500モル%に成る様に調整する。
　［1-5］酸化反応の工程
　酸化反応の反応温度は、好ましくは、0℃～100℃であり、より好ましくは、10℃～80℃であり、更に好ましくは、20℃～60℃である。
　酸化反応の反応時間は、好ましくは、0.1時間～100時間であり、より好ましくは、0.1時間～50時間であり、更に好ましくは、0.1時間～10時間である。
　［1-6］一般式（2）で表される、核酸合成用リンカー前駆体1
　本発明は、
　下記一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
で表される、核酸合成用リンカー前駆体を包含する。
　式（2）中、A、及びBは、前記説明の通りである。
　［2］核酸合成用リンカー前駆体2の製造方法
　本発明の
　下記一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
（式（3）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
　式（3）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（3）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法は、
　溶媒中で、
　下記一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
（式（2）中、A、及びBは、前記式（3）と同じ。）
で表される化合物と、
　4,4'-ジメトキシトリチルクロリド（DMTr-Cl）、4-メトキシトリチルクロリド（MMTr-Cl）、又はトリチルクロリド（Tr-Cl）とを反応させる工程を含む。
　［2-1］一般式（2）で表される化合物
　本発明は、溶媒中で、
　下記一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
で表される化合物と、
　4,4'-ジメトキシトリチルクロリド（DMTr-Cl）、4-メトキシトリチルクロリド（MMTr-Cl）、又はトリチルクロリド（Tr-Cl）とを反応させる工程を含み、
　下記一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
で表される、核酸合成用リンカー前駆体を製造する。
　式（2）中、A、及びBは、前記説明の通りである。
　式（3）中、A、及びBは、前記式（2）と同じである。
　式（3）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基（DMTr基）、4-メトキシトリチル基（MMTr基）、又はトリチル基（Tr基）を示す。
　［2-2］溶媒
　本発明の製造方法では、溶媒は、好ましくは、非プロトン性極性溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の有機溶媒である。
　非プロトン性極性溶媒は、より好ましくは、アセトン、アセトニトリル（CH3CN）、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ピリジン（pyridine）、テトラヒドロフラン（THF）等である。
　有機溶媒は、更に好ましくは、ピリジンである。
　溶媒の使用量は、一般式（2）で表される化合物（基質）の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　［2-3］4,4'-ジメトキシトリチルクロリド（DMTr-Cl）、4-メトキシトリチルクロリド（MMTr-Cl）、又はトリチルクロリド（Tr-Cl）
　本発明の製造方法では、DMTr-Cl、MMTr-Cl、又はTr-Clを用いて、一般式（2）で表される化合物（基質）の水酸基を保護する。
　DMTr-Cl、MMTr-Cl、又はTr-Clの使用量（水酸基の保護反応）は、溶媒中の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　DMTr-Cl、MMTr-Cl、又はTr-Clの使用量（水酸基の保護反応）は、一般式（2）で表される化合物（基質）に対する濃度として（基質を100モル%とする時に）、モル比で、好ましくは、0.01モル%～100モル%に、より好ましくは、0.1モル%～50モル%に、更に好ましくは、1モル%～10モル%に成る様に調整する。
　［2-4］水酸基の保護反応の工程
　水酸基の保護反応の反応温度は、好ましくは、0℃～100℃であり、より好ましくは、10℃～80℃であり、更に好ましくは、20℃～60℃である。
　水酸基の保護反応の反応時間は、好ましくは、0.1時間～100時間であり、より好ましくは、0.1時間～50時間であり、更に好ましくは、0.1時間～20時間である。
　［2-5］核酸合成用リンカー前駆体2
　本発明は、
　下記一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
で表される、核酸合成用リンカー前駆体を包含する。
　式（3）中、A、及びBは、前記式（2）と同じである。
　式（3）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基（DMTr基）、4-メトキシトリチル基（MMTr基）、又はトリチル基（Tr基）を示す。
　式（3）中、Prot1の内、DMTr基は、水酸基の保護反応に用いるDMTr-Clに由来する。
　式（3）中、Prot1の内、MMTr基は、水酸基の保護反応に用いるMMTr-Clに由来する。
　式（3）中、Prot1の内、Tr基は、水酸基の保護反応に用いるTr-Clに由来する。
　［3］核酸合成用リンカーの製造方法
　本発明の
　下記一般式（4）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
（式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
　式（4）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（4）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
　式（4）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
で表される、核酸合成用リンカーの製造方法は、
　下記一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
（式（3）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
　式（3）中、B、及びProt1は、前記式（4）と同じ。）
で表される化合物（2 steps）に対して、
　（1）溶媒中で、加水分解する工程、次いで、
　（2）溶媒中で、水酸基を保護する工程を含む。
　［3-1］一般式（3）で表される化合物
　本発明は、
　下記一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
で表される化合物（2 steps）に対して、
　（1）溶媒中で、加水分解する工程、次いで、
　（2）溶媒中で、水酸基を保護する工程を含み、
　下記一般式（4）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
で表される、核酸合成用リンカーを製造する。
　式（3）中、A、B、及びProt1は、前記説明の通りである。
　式（4）中、B、及びProt1は、前記式（3）と同じである。
　式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
　式（4）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。
　［3-2］一般式（3）で表される化合物（基質）に対して、（1）溶媒中で、加水分解する工程
　本発明の製造方法では、一般式（3）で表される化合物（基質）に対して、（1）溶媒中で、加水分解反応を進め、式（3）中のA（基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-OR、R：カルボン酸の保護基）を加水分解し、式（4）中のL（基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OH）に加水分解する。
　溶媒
　本発明の製造方法では、工程（1）で使用する溶媒は、好ましくは、アルカリ水溶液、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒、及びハロゲン系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の溶媒である。
　アルカリ水溶液は、好ましくは、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム水溶液等である。
　エーテル系溶媒は、好ましくは、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、ジエチルエーテル（Et2O）、イソプロピルエーテル（IPE）等である。
　アルコール系溶媒は、好ましくは、メタノール（CH3OH）、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）、トリフルオロメタノール、ペンタフルオロエタノール等である。
　ハロゲン系溶媒は、好ましくは、ジクロロメタン（DCM、CH2Cl2）、トリクロロメタン（CHCl3）等である。
　溶媒の使用量は、一般式（3）で表される化合物（基質）の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　加水分解する反応
　加水分解反応の反応温度は、好ましくは、0℃～100℃であり、より好ましくは、10℃～80℃であり、更に好ましくは、20℃～60℃である。
　加水分解反応の反応時間は、好ましくは、0.1時間～100時間であり、より好ましくは、0.1時間～50時間であり、更に好ましくは、0.1時間～10時間である。
　［3-3］工程（1）の後、（2）溶媒中で、水酸基を保護する工程
　本発明の製造方法では、工程（1）の後、一般式（3）で表される化合物（基質）に対して、（2）溶媒中で、水酸基を保護する反応を進め、式（3）中の水酸基（-OH）を保護し、式（4）中のProt2（水酸基の保護基、Ac基等）に保護する。
　溶媒
　本発明の製造方法では、工程（2）で使用する溶媒は、好ましくは、非プロトン性極性溶媒、及びエーテル系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の溶媒である。
　非プロトン性極性溶媒は、好ましくは、アセトン、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ピリジン（pyridine）等である。
　エーテル系溶媒は、好ましくは、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、ジエチルエーテル（Et2O）、イソプロピルエーテル（IPE）等である。
　溶媒の使用量は、一般式（3）で表される化合物（基質）の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　水酸基の保護試薬
　水酸基を保護する反応には、無水酢酸（Ac2O、Ac基保護）、ピバロイルクロリド（PvCl、Pv基保護）、イソシアン酸p-トルエンスルホニル（イソシアン酸トシル）（PTSI、p-トルエンスルホニルカルバマート基保護）等を使う。
　Ac2O、PvCl、PTSI等の使用量（水酸基の保護反応）は、溶媒中の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　Ac2O、PvCl、PTSI等の使用量（水酸基の保護反応）は、一般式（3）で表される化合物（基質）に対する濃度として（基質を100モル%とする時に）、モル比で、好ましくは、0.01モル%～100モル%に、より好ましくは、0.1モル%～50モル%に、更に好ましくは、1モル%～10モル%に成る様に調整する。
　水酸基の保護反応
　水酸基の保護反応の反応温度は、好ましくは、0℃～100℃であり、より好ましくは、10℃～80℃であり、更に好ましくは、20℃～60℃である。
　水酸基の保護反応の反応時間は、好ましくは、0.1時間～100時間であり、より好ましくは、0.1時間～50時間であり、更に好ましくは、0.1時間～30時間である。
　［3-4］核酸合成用リンカー
　本発明は、
　下記一般式（4）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
で表される、核酸合成用リンカーを包含する。
　式（4）中、B、及びProt1は、前記式（3）と同じである。
　式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
　式（4）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。
　水酸基の保護基は、好ましくは、アルカリ（塩基条件）で脱保護が可能な保護基であり、アシル系の保護基である。水酸基の保護基は、より好ましくは、アセチル基（Ac基）、ピバロイル基（Pv基）、p-トルエンスルホニルカルバマート基等である。
　式（4）中、Prot2がAc基と成る時、水酸基の保護反応に用いる無水酢酸（Ac2O）に由来する。
　式（4）中、Prot2がPv基と成る時、水酸基の保護反応に用いるピバロイルクロリド（PvCl）に由来する。
　式（4）中、Prot2がp-トルエンスルホニルカルバマート基と成る時、水酸基の保護反応に用いるイソシアン酸 p-トルエンスルホニル（PTSI）に由来する。
　［4］核酸固相合成用担体の製造方法
　本発明の
　下記一般式（5）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
（式（5）中、Gは、置換可能な位置に一つ存在し、下記式（G1）、（G2）、又は（G3）を示す。
　式（G1）、（G2）、又は（G3）中、SPは、固相担体を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　式（4）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
　式（4）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
　式（4）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
で表される、核酸固相合成用担体の製造方法は、
　溶媒中で、
　カップリング剤の存在下、
　下記一般式（4）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
（式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
　式（4）中、B、Prot1、及びProt2は、前記式（5）と同じ。）
で表される化合物と、
　下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
（SPは、固相担体を示す。）
で表される固相担体とを反応させる工程を含む。
　［4-1］一般式（4）で表される化合物
　本発明は、溶媒中で、カップリング剤の存在下、
　下記一般式（4）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
で表される化合物と、
　下記：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
で表される固相担体とを反応させる工程を含み、
　下記一般式（5）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
で表される、核酸固相合成用担体を製造する。
　式（4）中、B、L、Prot1、及びProt2は、前記説明の通りである。
　式（5）中、B、Prot1、及びProt2は、前記式（4）と同じである。
　SPは、固相担体を示す。
　式（5）中、Gは、置換可能な位置に一つ存在し、下記式（G1）、（G2）、又は（G3）を示す。式（G1）、（G2）、又は（G3）中、SPは、固相担体を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　［4-2］溶媒
　本発明の製造方法では、溶媒は、好ましくは、非プロトン性極性溶媒、及びハロゲン系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の有機溶媒である。
　非プロトン性極性溶媒は、好ましくは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）、アセトニトリル（ACN）、アセトン、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ピリジン（pyridine）等である。
　ハロゲン系溶媒は、好ましくは、ジクロロメタン（CH2Cl2）、トリクロロメタン（CHCl3）等である。
　溶媒の使用量は、一般式（4）で表される化合物（基質）の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　［4-3］カップリング剤
　本発明の製造方法では、カップリング剤を用いて、カップリング反応を進め、一般式（4）で表される化合物と固相担体（SP-NH2）とを反応させて、一般式（5）で表される、核酸固相合成用担体を製造する。
　本発明の製造方法では、カップリング剤は、好ましくは、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム-3-オキシドヘキサフルオロホスフェート（HATU、1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-Oxide Hexafluorophosphate）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキサイドヘキサフルオロホスフェート（HBTU、1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium 3-Oxide Hexafluorophosphate）、O-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HCTU、O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Hexafluorophosphate）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム-3-オキシド テトラフルオロボレート（TATU、1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-Oxide Tetrafluoroborate）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシドテトラフルオロボレート（TBTU、1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium 3-Oxide Tetrafluoroborate）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride）、エチル-2-シアノ-2-((ジメチルイミニオ)(モルホリノ)メチルオキシイミノ)アセテートヘキサフルオロホスフェート（COMU、Ethyl 2-cyano-2-((dimethyliminio)(morpholino)methyloxyimino)acetate Hexafluorophosphate）、ジフェニルホスホリルアジド（DPPA、Diphenylphosphoryl Azide）、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM、4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium Chloride）、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP、Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)-phosphonium Hexafluorophosphate）、及び1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBOP、1H-Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate）から成る群から選択される少なくとも一種のカップリング剤である。
　カップリング剤の使用量（カップリング反応）は、溶媒中の濃度（モル濃度M（mol／L））が、好ましくは、0.01M～5Mの濃度に、より好ましくは、0.1M～2Mの濃度に成る様に調整する。
　カップリング剤の使用量（カップリング剤反応）は、一般式（4）で表される化合物（基質）に対する濃度として（基質を100モル%とする時に）、モル比で、好ましくは、50モル%～10,000モル%に、より好ましくは、90モル%～1000モル%に、更に好ましくは、100モル%～500モル%に成る様に調整する。
　［4-4］カップリング反応の工程
　本発明の製造方法では、溶媒中で、カップリング剤の存在下、一般式（4）で表される化合物（基質）と固相担体とをカップリングさせる事に依り、一般式（4）で表される化合物（基質）と固相担体（SP-NH2）とが、アミド結合（塩基性条件下で開裂しない結合）を介して結合させて、一般式（5）で表される核酸固相合成用担体を製造すする。
　本発明の一般式（5）で表される核酸固相合成用担体は、固相担体（SP）とユニバーサルリンカー（一般式（4）で表される化合物）を切り出し条件下（アンモニア水等）で開裂しない結合（アミド結合等）を介して結合する事で、副生成物（リンカー付加体）の生成を抑制させる事が出来る。
　カップリング反応の反応温度は、好ましくは、0℃～100℃であり、より好ましくは、10℃～80℃であり、更に好ましくは、20℃～60℃である。
　カップリング反応の反応時間は、好ましくは、0.1時間～100時間であり、より好ましくは、0.1時間～50時間であり、更に好ましくは、0.1時間～10時間である。
　［4-5］核酸固相合成用担体
　本発明は、
　下記一般式（5）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
で表される、核酸固相合成用担体を包含する。
　式（5）中、B、Prot1、及びProt2は、前記式（4）と同じである。
　式（5）中、Gは、置換可能な位置に一つ存在し、下記式（G1）、（G2）、又は（G3）を示す。式（G1）、（G2）、又は（G3）中、SPは、固相担体を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　従来、一種類の固相担体を用いて、理論上、全ての核酸配列を合成する事が可能なユニバーサルサポートが開発されている。しかし、従来のユニバーサルサポートは、固相担体へ非ヌクレオシドリンカーを結合させており、この非ヌクレオシドリンカー由来の副生成物が生成する事、或はオリゴ核酸の固相担体からの切り出し効率が低い事、生成した副生成物は、目的物（Full Length Product）との分離が困難である事等、改良すべき点が有った。
　本発明は、従来のユニバーサルサポートを用いる際に生成する副生成物（リンカー付加体）の生成を抑制させる事が出来る核酸合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体である。
　本発明の核酸合成用リンカー、核酸固相合成用担体は、固相担体と核酸合成用リンカーとを、アンモニア水中等の切り出し条件下で開裂しない結合（アミド結合等）を介するという特徴を有する。本発明の核酸合成用リンカー、核酸固相合成用担体は、リンカー付加体を発生させず、本発明の核酸合成用リンカー、核酸固相合成用担体を用いると、高純度なオリゴ核酸を得ることが出来る。
　以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこうした例に何ら限定されるものではない。本発明は、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々なる形態で実施し得ることは勿論である。
　以下、実施例に基づき、本発明の実施形態をより具体的に説明する。
　本発明がこれらに限定されるものではない。
　［1］核酸合成用リンカー前駆体1の製造
　本発明の一般式（2）で表される核酸合成用リンカー前駆体1を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　化合物2の製造
　化合物1（1.03 g, 5.09 mmol）のアセトニトリル（CH3CN）溶液（10 mL）に、0.1M 四酸化オスミウム（Os4O）／t-ブチルアルコール溶液（50.94 μL, 5.094 μmol）、50%N-メチルモルホリンオキシド（NMO）水溶液（2.65 mL, 12.735 mmol）を加えて、40℃で10分間撹拌した。
　次いで、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液0.5mL加えて、反応を停止した後、酢酸エチルで希釈し、有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄した。
　次いで、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去して化合物2（1.09 g, 4.61 mmol, 91%）を、白色固体として得た。
　1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.90 (s, 1H), 7.83 (dd, J=7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.48 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.13 (d, J=13.0 Hz, 2H), 5.07 (t, J=5.0 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.74-3.70 (m, 2H).
　［2］核酸合成用リンカー前駆体2の製造
　本発明の一般式（3）で表される核酸合成用リンカー前駆体2を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　化合物3の製造
　化合物2（112 mg, 0.475 mmol）のピリジン（pyridine）溶液（4 mL）に、4,4’-ジメトキシトリチルクロリド（DMTrCl）（193 mg, 0.570 mmol）を加えて、室温で20時間撹拌した。
　次いで、酢酸エチルで希釈し、有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄した。
　次いで、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去した。
　次いで、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝80／20／1）で精製し、化合物3（173 mg, 0.322 mmol, 68%）を、黄色固体として得た。
　1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.83-7.78 (m, 3H), 7.47-7.42(m, 5H), 7.37-7.33(m, 12H), 7.30-7.29 (m, 2H), 6.92-6.88 (m, 8H), 5.18 (d, J=5.5Hz, 2H),3.95-3.92 (m, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.84-3.79 (m, 14H), 3.74 (dd, J=7.5, 4.0Hz, 2H).
　［3］核酸合成用リンカーの製造（2 steps）
　本発明の一般式（4）で表される核酸合成用リンカーを製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　化合物4の製造
　（1）溶媒中で、加水分解する工程
　化合物3（54 mg, 0.10mmol）のジクロロメタン（DCM）溶液（0.54mL）に、メタノール（CH3OH）（0.54mL）、1M水酸化ナトリウム水溶液（NaOH aq）（0.20mL）を加えて、45℃で2.5時間撹拌した。
　次いで、25%酢酸水溶液（50μL）を加える事で、反応液を中和した。
　次いで、酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。
　次いで、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去した。
　（2）溶媒中で、水酸基を保護する工程
　次いで、得られた残渣を、ピリジン（pyridine）（1.0mL）に溶かし、4-ジメチルアミノピリジン（11.2mg）、無水酢酸（Ac2O）（86μL）加えて、室温で23時間撹拌した。
　次いで、酢酸エチルで希釈し、有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄した。
　次いで、硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去した。
　次いで、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝60／1）で精製し、化合物4（40.7 mg, 0.072 mmol, 78%）を、黄色固体として得た。
　1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 7.93 (s, 1H), 7.91-7.86 (m, 2H), 7.51-7.47 (m, 5H), 7.40-7.31 (m, 14H), 6.91-6.86 (m, 10H), 5.26 (d, J=7.0Hz, 2H), 5.09 (dd, J=11.0,  6.0Hz, 2H), 3.92 (dd, J=6.0, 1.5Hz, 2H), 3.83-3.78 (m, 14H).
　［4］核酸固相合成用担体の製造1
　本発明の一般式（5）で表される核酸固相合成用担体を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　核酸固相合成用担体5-1の製造
　化合物4（9.5 mg, 16.8 μmol）、O-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HCTU）（7.0 mg, 16.8 μmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（5.9μL, 33.6 μmol）を、アセトニトリル（CH3CN）（1 mL）溶解させた。
　次いで、この混合溶液を、アミノ基含有CPG固相担体（105μmol／g, 200mg, アミノ基が21μmol）へ加えて、3時間振とうした。
　次いで、反応溶液を吸引ろ過し、固相担体をアセトニトリルで洗浄した。
　次いで、CapMixA（無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフラン＝10／10／80）1mL、CapMixB（16% 1-メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン溶液）1mLを使用して、未反応アミノ基をアセチル基で保護した。
　次いで、反応溶液を吸引ろ過した後、固相担体をアセトニトリルで洗浄し、減圧乾燥した。
　次いで、得られた核酸固相合成用担体5-1を、デブロッキング溶液（3%トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液）で処理した後、生成したトリチルカチオンの吸光度を測定する事で、化合物4の担持量を測定した（n=3）。
　核酸固相合成用担体5-1の化学構造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
　測定結果より、得られた核酸固相合成用担体5は、47.1μmol／gであった。
　核酸固相合成用担体5-2の製造
　グリシンFmoc保護体（47 mg, 158 μmol）、HCTU（59 mg, 189 μmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（55 μL, 420 μmol）を、N,N’-ジメチルホルムアミド（1 mL）溶解させた。
　次いで、この混合溶液を、アミノ基含有CPG固相担体（105μmol／g, 150mg, アミノ基が15.8 μmol）へ加えて、2時間振とうした。
　次いで、反応溶液を吸引ろ過し、固相担体をアセトニトリルで洗浄した。
　次いで、CapMixA（無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフラン＝10／10／80）1mL、CapMixB（16% 1-メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン溶液）1mLを使用して、未反応アミノ基をアセチル基で保護した。
　次いで、反応溶液を吸引ろ過した後、固相担体をアセトニトリルで洗浄し、減圧乾燥した。
　次いで、得られたグリシンを担持した固相担体を使用して、核酸固相合成用担体5-1と同様の方法で化合物4を担持した核酸固相合成用担体5-2を作製した。
　次いで、得られた核酸固相合成用担体5-2を、デブロッキング溶液（3%トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液）で処理した後、生成したトリチルカチオンの吸光度を測定する事で、化合物4の担持量を測定した（n=3）。
　核酸固相合成用担体5-2の化学構造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
　測定結果より、得られた核酸固相合成用担体5-2は、37.5μmol／gであった。
　［5］比較例（従来品）の核酸固相合成用担体の化学構造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　［6］核酸の合成、及び切り出し効率検討
　DNA（5’-TTT TTT TTT T-3’）
　切り出し条件：アンモニア水、15時間（55℃）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000065
　RNA（5’-UGU GAC UGA CUG UGA CUG AC-3’）
　切り出し条件：アンモニア水／メチルアミン（v／v＝1／1）、90分（室温）
　→10分（65℃）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
　結果より、本発明の核酸固相合成用担体5-1、及び核酸固相合成用担体5-2を使用すると、DNA、及びRNA共に、Universal SupportIIIを使用した場合に比べて、高い切り出し効率（90%以上）を達成した。
　［7］核酸のCrude純度解析
　DNA（5’-TTT TTT TTT T-3’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
　RNA（5’-UGU GAC UGA CUG UGA CUG AC-3’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000068
　結果より、本発明の核酸固相合成用担体5-1、及び核酸固相合成用担体5-2を使用すると、RNA合成時でも、副生成物（リンカー付加体）が生成せず、従来品のGlen Unysupportを使用した場合に比べて、高純度なCrudeが得られることが確認できた。
　本発明は、従来のユニバーサルサポートを用いる際に生成する副生成物（リンカー付加体）の生成を抑制させる事が出来る核酸合成用リンカー、及び核酸固相合成用担体である。
　本発明の核酸合成用リンカー、核酸固相合成用担体は、固相担体と核酸合成用リンカーとを、アンモニア水中等の切り出し条件下で開裂しない結合（アミド結合等）を介するという特徴を有する。本発明の核酸合成用リンカー、核酸固相合成用担体は、リンカー付加体を発生させず、本発明の核酸合成用リンカー、核酸固相合成用担体を用いると、高純度なオリゴ核酸を得ることが出来る。

Claims (16)

  1. 　下記一般式（2）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（2）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
    　式（2）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。）
    で表される、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法であって、
    　溶媒中で、
    　酸化剤、及び再酸化剤の存在下、
    　下記一般式（1）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（1）中、A、及びBは、前記式（2）と同じ。）
    で表される化合物を酸化反応させる工程
    を含む、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法。
  2. 　前記酸化剤は、四酸化オスミウム（OsO4）、及びオゾン（O3）から成る群から選択される少なくとも一種の酸化剤である、請求項1に記載の製造方法。
  3. 　前記再酸化剤は、N-メチルモルホリン-N-オキシド（NMO）、トリメチルアミン-N-オキシド（Me3NO）、及びtert-ブチルヒドロペルオキシド（TBHP）から成る群から選択される少なくとも一種の再酸化剤である、請求項1に記載の製造方法。
  4. 　前記溶媒は、水と親水性有機溶媒との混合溶媒である、請求項1に記載の製造方法。
  5. 　下記一般式（2）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（2）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
    　式（2）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。）
    で表される、核酸合成用リンカー前駆体。
  6. 　下記一般式（3）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式（3）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
    　式（3）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
    　式（3）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。）
    で表される、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法であって、
    　溶媒中で、
    　下記一般式（2）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式（2）中、A、及びBは、前記式（3）と同じ。）
    で表される化合物と、
    　4,4'-ジメトキシトリチルクロリド（DMTr-Cl）、4-メトキシトリチルクロリド（MMTr-Cl）、又はトリチルクロリド（Tr-Cl）とを反応させる工程
    を含む、核酸合成用リンカー前駆体の製造方法。
  7. 　前記溶媒は、非プロトン性極性溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の有機溶媒である、請求項6に記載の製造方法。
  8. 　下記一般式（3）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式（3）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
    　式（3）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
    　式（3）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。）
    で表される、核酸合成用リンカー前駆体。
  9. 　下記一般式（4）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
    　式（4）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
    　式（4）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
    　式（4）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
    で表される、核酸合成用リンカーの製造方法であって、
    　下記一般式（3）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式（3）中、Aは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OR、基-NH-CO-OR、又は基-CO-NH-CH2-CO-ORを示す。Rは、カルボン酸の保護基を示す。
    　式（3）中、B、及びProt1は、前記式（4）と同じ。）
    で表される化合物に対して、
    　（1）溶媒中で、加水分解する工程、次いで、
    　（2）溶媒中で、水酸基を保護する工程、
    を含む、核酸合成用リンカーの製造方法。
  10. 　前記工程（1）で使用する溶媒は、アルカリ水溶液、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒、及びハロゲン系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の溶媒である、請求項9に記載の製造方法。
  11. 　前記工程（2）で使用する溶媒は、非プロトン性極性溶媒、及びエーテル系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の溶媒である、請求項9に記載の製造方法。
  12. 　下記一般式（4）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
    　式（4）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
    　式（4）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
    　式（4）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
    で表される、核酸合成用リンカー。
  13. 　下記一般式（5）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     （式（5）中、Gは、置換可能な位置に一つ存在し、下記式（G1）、（G2）、又は（G3）を示す。
    　式（G1）、（G2）、又は（G3）中、SPは、固相担体を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     　式（5）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
    　式（5）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
    　式（5）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
    で表される、核酸固相合成用担体の製造方法であって、
    　溶媒中で、
    　カップリング剤の存在下、
    　下記一般式（4）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     （式（4）中、Lは、置換可能な位置に一つ存在し、基-CO-OH、基-NH-CO-OH、又は基-CO-NH-CH2-CO-OHを示す。
    　式（4）中、B、Prot1、及びProt2は、前記式（5）と同じ。）
    で表される化合物と、
    　下記：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     （SPは、固相担体を示す。）
    で表される固相担体とを反応させる工程
    を含む、核酸固相合成用担体の製造方法。
  14. 　前記カップリング剤は、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム-3-オキシドヘキサフルオロホスフェート（HATU）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキサイドヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、O-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HCTU）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム-3-オキシド テトラフルオロボレート（TATU）、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-ベンゾトリアゾリウム-3-オキシドテトラフルオロボレート（TBTU）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl）、エチル-2-シアノ-2-((ジメチルイミニオ)(モルホリノ)メチルオキシイミノ)アセテートヘキサフルオロホスフェート（COMU）、ジフェニルホスホリルアジド（DPPA）、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP）、及び1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBOP）から成る群から選択される少なくとも一種のカップリング剤である、請求項13に記載の製造方法。
  15. 　前記溶媒は、非プロトン性極性溶媒、及びハロゲン系溶媒から成る群から選択される少なくとも一種の有機溶媒である、請求項13に記載の製造方法。
  16. 　下記一般式（5）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     （式（5）中、Gは、置換可能な位置に一つ存在し、下記式（G1）、（G2）、又は（G3）を示す。
    　式（G1）、（G2）、又は（G3）中、SPは、固相担体を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     　式（5）中、Bは、置換可能な位置に、同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、又はジアルキルアミノ基を示す。
    　式（5）中、Prot1は、4,4'-ジメトキシトリチル基、4-メトキシトリチル基、又はトリチル基を示す。
    　式（5）中、Prot2は、水酸基の保護基を示す。）
    で表される、核酸固相合成用担体。
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