WO2024140627A1 - 抗多种血清型aav衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

抗多种血清型aav衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途 Download PDF

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Definitions

  • the heavy chain CDR and light chain CDR are selected from the following sequences:
  • the monoclonal antibody or its functional fragment against multiple serotypes of AAV capsid proteins comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region are selected from the group consisting of variable regions of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 7 and variants thereof each comprising an amino acid sequence with at least 80% identity, and the combination of the group is defined by A and/or B:
  • the heavy chain variable region sequence comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4 or 6;
  • the light chain variable region sequence comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 or 7.
  • the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the sequence shown in SEQ ID NO:4, and the light chain variable region comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the sequence shown in SEQ ID NO:5. An amino acid sequence with 97%, 98% or 99% identity; or
  • the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4, and the light chain variable region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5; or
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are selected from the following sequences:
  • the monoclonal antibody against multiple serotypes of AAV capsid proteins or a functional fragment thereof is a rabbit antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • “Rabbit antibody” refers to the variable region and constant region (if present) derived from rabbit immunoglobulin
  • the rabbit antibody can be conveniently obtained by immunizing a rabbit with the corresponding antigen and isolating the target antibody therefrom.
  • the cells expressing the target antibody such as B cells
  • the cells expressing the target antibody are isolated and cultured, and the cells are fused with immortalized cells such as myeloma cells to obtain hybridoma cells.
  • the target antibody (such as monoclonal antibody) can be obtained for a long time and in large quantities by culturing the hybridoma cells.
  • chimeric antibody refers to an antibody formed by fusing the variable region of a first animal-derived antibody with the constant region of a second animal-derived antibody.
  • a hybridoma that secretes a specific monoclonal antibody of the first animal must first be established, and then the variable region gene must be cloned from the hybridoma cell, and then the constant region gene of the second animal-derived antibody must be cloned as needed, and the variable region gene of the first animal-derived variable region gene and the constant region gene of the second animal-derived constant region gene must be connected into a chimeric gene and inserted into an expression vector, and finally the chimeric antibody molecule is expressed in a eukaryotic system or a prokaryotic system.
  • humanized antibody also known as CDR-grafted antibody, refers to an antibody produced by transplanting the CDR sequence of the first animal origin into the human antibody variable region framework, that is, different types of human germline antibody framework sequences. It can overcome the heterologous reaction induced by chimeric antibodies due to carrying a large amount of rabbit protein components.
  • framework sequences can be obtained from public DNA databases including germline antibody gene sequences or published references.
  • the germline DNA sequences of human heavy chain and light chain variable region genes can be obtained in the "VBase" human germline sequence database (www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), and in Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition.
  • the human antibody variable region framework sequence can be subjected to minimal reverse mutation or back mutation to maintain activity.
  • the monoclonal antibodies or functional fragments thereof raised against multiple serotype AAV capsid proteins are detectably labeled.
  • Animal viruses that can be used as vectors include but are not limited to retroviruses (including lentiviruses), adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses (such as herpes simplex virus), poxviruses, baculoviruses, papillomaviruses, papillomas (such as SV40).
  • the present invention provides a host cell or a cell-free expression system comprising the expression vector.
  • Host cells or cell lines suitable for expressing the antigen-binding proteins of the present invention include mammalian cells such as NS0, Sp2/0, CHO, COS, HEK, fibroblasts and myeloma cells. Human cells can be used, thus allowing the molecules to be modified with human glycosylation patterns. Alternatively, other eukaryotic cell lines can be used. The selection of suitable mammalian host cells, as well as methods for transformation, cultivation, amplification, screening and product production and purification, are known in the art.
  • the matrix support comprises any one of agar, agarose, agarose derivatives, magnetic beads, silica, titanium dioxide, alginate, cellulose, cellulose derivatives, dextran, starch, cyclodextrin, chitosan, carrageenan, guar gum, gum arabic, gum ghatti, tragacanth gum, karaya gum, locust bean gum, xanthan gum, pectin, mucin, heparin, gelatin, silicon, ceramic, glass (e.g., borosilicate glass), polyurethane, polystyrene, polystyrene divinylbenzene, polymethyl methacrylate, polyacrylamide, polyethylene terephthalate, polyvinyl acetate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyvinyl pyrrolidone, or copolymers of any of the above.
  • agar agarose, agarose derivatives, magnetic beads, silic
  • chromatographic separation devices including but not limited to the following: SPE solid phase extraction columns, centrifuge tubes with separation membranes, magnetic beads, separation membranes, rapid detection bio-chips, fiber bundle columns, and the chromatographic separation device is preferably columnar, such as a monolithic column and a conventional analytical or preparative grade chromatography column.
  • FIG3 shows the ELISA reaction results of 24F7-1 monoclonal antibody and AAV of different serotypes
  • AAV adeno-associated virus
  • Parvoviridae a non-enveloped single-stranded linear DNA virus. The genome is about 4.7 kb long, and the Cap gene encodes three viral capsid proteins: VP1, VP2, and VP3.
  • AAVrh.1 is an AAV virus isolated from rhesus monkeys, and like other AAV viruses, it is susceptible to multiple tissues and organs in the human body.
  • isolated polynucleotide refers to a polynucleotide that does not exist naturally in nature, including polynucleotides isolated from nature (including organisms) by biological techniques, and also includes artificially synthesized polynucleotides.
  • the isolated polynucleotide can be genomic DNA, cDNA, mRNA or other synthetic RNA, or a combination thereof. It should be noted that those skilled in the art can design nucleotide sequences that are not completely identical to the nucleotide sequences provided based on the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region provided herein, based on codon degeneracy, but all encode the same amino acid sequence. These modified nucleotide sequences are also included in the scope of the present invention.
  • New Zealand white rabbits were immunized with 100 ⁇ g of recombinant rh.1 AAV virus-like particles (AAVrh.1 VLP, capsid protein VP1, VP2 and VP3 protein sequences are shown in SEQ ID NO: 1, 2 and 3). Subsequently, the immunization was repeated every other week to boost the experimental rabbits for a total of 3 times. The serum titers of the two rabbits reached more than 10 5 after 3 immunizations (Figure 1). Sterile blood was collected from the experimental rabbit numbered R05999 7 days after the last immunization for subsequent antibody discovery.
  • Amino acid sequence of AAV capsid protein VP1 of rh.1 serotype (SEQ ID NO: 1):
  • Amino acid sequence of AAV capsid protein VP3 of rh.1 serotype (SEQ ID NO: 3):
  • Indirect ELISA was used to evaluate the binding ability of antibodies in the supernatant to VLPs.
  • AAVrh.1 VLPs were diluted to 1 ⁇ g/mL with PBS and 100 ⁇ L per well was coated on a 96-well ELISA plate overnight at 4°C. After washing with PBST (0.05% Tween), 150 ⁇ L/well of PBST containing 1% BSA was blocked at 37°C for 1 hour. The blocking solution was then discarded, and 100 ⁇ L of B cell culture supernatant was added to each plate, followed by incubation at 37°C for 1 hour.
  • TRIzol Life Technology, 15596-026 was used to extract RNA from total cells in wells with OD values greater than 1.0, and reverse transcribed into cDNA using universal primers (Prime Script TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit, Takara). Rabbit immunoglobulin heavy and light chain V-region fragments were subsequently amplified by RACE PCR, and the amplified fragments were homologously recombined into the pCDNA3.4 vector, and the insert fragments were sequenced using vector-specific primers. Finally, the unique V-region protein amino acid sequences and plasmids of clones 5G4-1 and 24F7-1 were obtained.
  • 5G4-1 light chain variable region amino acid sequence (SEQ ID NO: 5):
  • Plasmids containing the heavy and light chains of the antibody were co-transfected into ExpiCHO-S TM Cells (Gibco, A29133) cells, and after culturing in a shake flask at 37°C for 6 days, the supernatant was collected for antibody purification.
  • Antibody purification steps The protein A column was balanced with a buffer containing 0.05M Tris and 1.5M NaCl (pH8.0). The harvested cell culture supernatant was then diluted 1:1 with 2 ⁇ the above buffer and sterilized by filtration.
  • Indirect ELISA was used to evaluate the binding ability of purified antibodies to VLPs of AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVDJ, and AAVrh.1.
  • 100 ⁇ L of 1 ⁇ g/mL VLP diluted in PBS was added to each well of a 96-well ELISA plate and coated overnight at 4°C. After washing the plate with PBS-T (0.05% Tween), 150 ⁇ L of 1% BSA in PBST was added to each well and blocked at 37°C for 1 hour. The blocking solution was then discarded and 100 ⁇ L of 1 ⁇ g/mL recombinant ELISA was added to each plate. The antibody was added and then incubated at 37°C for 1 hour.
  • Example 6 EC 50 test of monoclonal antibodies binding to various serotypes of AAV virus VLPs
  • Indirect ELISA was used to evaluate the binding ability of purified antibodies to VLPs of various serotypes of AAV viruses.
  • 1 ⁇ g/mL of VLPs of each serotype of AAV were coated on 96-well ELISA plates and coated overnight at 4°C. After washing with PBS-T (0.05% Tween), 250 ⁇ L of PBST containing 1% BSA was added to each well and blocked at 37°C for 2 hours. The blocking solution was then discarded, and 100 ⁇ L of 1 ⁇ g/mL purified antibody was added to the first well and diluted in a 3-fold gradient, with a total of 11 test concentration gradients plus a control well with only PBST added. Then incubate at 37°C for 1 hour.
  • VLPs of AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVDJ and AAVrh.1 were diluted to 0.015 mg/mL, and each sample was mixed with reducing 2 ⁇ loading buffer at a ratio of 1:1 and then boiled in a water bath for 5 min. 10 ⁇ L of the treated samples were added to the sample wells of 10% precast gel (GenScript, M42012C) for SDS-PAGE electrophoresis and transferred to the NC membrane.

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Abstract

本发明属于病毒检测诊断领域，涉及抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明提供了抗多种血清型AAV衣壳蛋白的兔单克隆抗体、其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。本发明提供的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的兔单克隆抗体能够特异性地与多种血清型AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3结合，可以用于AAV病毒抗原的检测。本发明提供的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体为基因治疗载体研发过程以及基础科研中AAV的检测提供了可能和便利。

Description

抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途
交叉引用信息
本申请要求2022年12月26日提交的申请号为202211686491.0的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明属于病毒检测诊断领域，涉及一种抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体。本发明还涉及该抗多种血清型衣壳蛋白单克隆抗体的制备方法和用途。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)属于细小病毒科，为无包膜的单链线状DNA病毒。基因组全长约4.7kb，主要包括Rep和Cap两个基因，其中Cap基因编码VP1、VP2和VP3三种病毒衣壳蛋白。VP1、VP2蛋白的C末端序列和VP3蛋白的序列相同，在病毒衣壳中以VP3的含量最高，而VP1、VP2的含量分别只有VP3的十分之一。
AAV病毒是非致病性病毒，可以感染人和多种其他脊椎动物。AAV的血清型众多，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVDJ和AAVrh10等。由于免疫原性低并且不同血清型AAV对不同的组织、器官具有不同的靶向性和表达效率，AAV成为当前常用的基因操作工具，在递送抗原的主动免疫疗法和递送抗体被动免疫疗法中都发挥关键作用。AAV病毒还可以通过血脑屏障，为中枢神经系统疾病 的治疗提供了新方法。AAV病毒搭载的CRISPR-Cas9系统还为在脑、耳蜗和肌肉等器官组织的基因编辑提供了新手段。
由于AAV病毒血清型众多，新发现和新开发的AAV载体也在不断出现。抗多种血清型AAV衣壳蛋白单克隆抗体是AAV基因治疗载体研发过程中便捷的检测工具。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段包含重链CDR和轻链CDR，所述重链CDR和轻链CDR选自由SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列的CDR和其各自包含至多三个氨基酸突变的变体所组成的组，且所述组的组合方式由a和/或d所限定：
在一些实施方案中，所述重链CDR和轻链CDR选自由SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列的CDR所组成的组。
在一些实施方案中，所述重链CDR和轻链CDR选自如下序列：
a.重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8，9，10，11，12和13所示；或
b.重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2及 轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14，15，16，17，18和19所示。在一些实施方案中，所述的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区选自由SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的可变区和其各自包含至少80％一致性的氨基酸序列的变体所组成的组，且所述组的组合方式由A和/或B所限定：
在一些实施方案中，所述重链可变区序列包含与SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列；以及所述轻链可变区序列包含与SEQ ID NO:5或7所示氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区序列包含与SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；所述轻链可变区序列包含与SEQ ID NO:5或7所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列：
(A)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％一致性的氨基酸序列；或
(B)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区序列包含SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列；所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:5或7所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列：
A.所述重链可变区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或
B.所述重链可变区包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列：
A.所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或
B.所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在一些实施方式中，所述抗体具有恒定区，重链恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的恒定区序列；轻链恒定区为κ或λ链。
在一些实施方案中，抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段是兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或者人抗体。
“兔源抗体”是指可变区和恒定区(如果存在的话)衍生自兔免疫球蛋白 序列的抗体。兔抗体可方便地以相应抗原免疫兔并从其分离目的抗体而获得。或者，在以相应抗原免疫兔后，分离并培养表达目的抗体的细胞(如B细胞)而获得。又或者，在以相应抗原免疫兔后，分离并培养表达目的抗体的细胞，将其与永生化细胞如骨髓瘤细胞融合而获得杂交瘤细胞，培养杂交瘤细胞则可长期和大量获得目的抗体(如单克隆抗体)。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将第一动物源性抗体的可变区与第二动物源性的抗体的恒定区融合而成的抗体。建立嵌合抗体，要先建立分泌第一动物源性特异性单抗的杂交瘤，然后从杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆第二动物源性抗体的恒定区基因，将第一动物源性可变区基因与第二动物源性恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，第一动物源性为兔源，第二动物源性优选为人源，可以减轻第一动物源性抗体诱发的免疫应答反应。所述嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将第一动物源性的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量兔蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)获得，以及在Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
本发明的人源化抗体当其人源化程度进一步提升，也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体(人抗体)。在本发明一 个优选的实施方案中，第一动物源性为兔源。人的抗体可变区框架经过设计选择，例如，其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV1-18*01和hjh6.1的组合序列，或人种系重链IGHV1-3*01和hjh6.1的组合序列；其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系重链IGKV1-39*01和hjk4.1的组合序列。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
在一些实施方案中，所述抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段具有可检测的标记。
可检测的标记可选自发色团、地高辛标记探针、电子致密物质、胶体金或酶中的任一种或多种。下面非限定部分列出这些标记：
·产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
·发色团，如荧光、量子点、荧光微球、发光化合物和染料。
·具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团。
·可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。
·电子致密物质，如放射性分子(如32P，35S或125I)。
在一些实施方式中，可检测的标记选自碱性磷酸酶、吖啶酯、辣根过氧化物酶、三联吡啶钌、异鲁米诺或稀土元素中的一种或多种，优选为碱性磷酸酶、吖啶酯或辣根过氧化物酶。
在另一方面，本发明提供了编码上述的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码上述抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段的重链可变区的核苷酸序列，和编码抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段的轻链可变区的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了包含所述多核苷酸的表达载体。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
在另一方面，本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
适用于表达本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞或细胞系包括：哺乳动物细胞诸如NS0、Sp2/0、CHO、COS、HEK、成纤维细胞和骨髓瘤细胞。可以使用人细胞，因而允许分子用人糖基化模式来修饰。或者，可以采用其他真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择，以及用于转化、培养、扩增、筛选和产物产生和纯化的方法，是本领域已知的。
可以证明，细菌细胞可用作宿主细胞，其适合表达本发明的重组Fab或其他实施方案。但是，由于在细菌细胞中表达的蛋白倾向于未折叠的形式或不正确地折叠的形式或非糖基化形式，必须筛选在细菌细胞中产生的任何重组Fab，以保留抗原结合能力。如果细菌细胞表达的分子以适当地折叠的形式产生，该细菌细胞将是期望的宿主，或者，在可替代的实施方案 中，可以在细菌宿主中表达分子，随后进行重新折叠。例如，用于表达的各种大肠杆菌菌株，是生物技术领域中众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌属、其他芽孢杆菌属等的各种菌株，也可以用于该方法中。
如果需要，本领域技术人员已知的酵母细胞菌株以及昆虫细胞，例如果蝇和鳞翅目昆虫和病毒表达系统，也可用作宿主细胞。
在一些实施方式中，所述细胞基因组中插入有所述核酸，并且能稳定表达。
插入的方式可选用如上所述的载体，或者核酸不连入载体直接转入细胞内(例如脂质体介导的转染技术)。
在另一方面，本发明提供了一种制备抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段的方法，包括：
在合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；以及
从培养基中或从所培养的细胞中回收如此产生的抗体或其抗原结合片段。
本发明培养方法通常是无血清培养方法，通常通过无血清悬浮培养细胞。同样地，一旦产生本发明抗体，可将其根据本领域标准程序从细胞培养内容物纯化出，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这类技术在本领域技术范围内，不限定本发明。表达抗体的另一种方法可以利用在动物(特别是转基因动物或者裸鼠)中的表达。这涉及利用动物酪蛋白启动子的表达系统，当其被转基因地并入哺乳动物中时，允许雌性动物在其奶中产生希望的重组蛋白。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
在另一方面，本发明提供了一种检测多种血清型AAV的试剂盒，所述试剂盒中包含如上所述的单克隆抗体或其功能片段。
本发明还涉及用于分离多种血清型AAV的层析介质，所述层析介质包括基体支持物和固定于所述基体支持物上的如上所述的单克隆抗体或其功能片段。
在一些实施方式中，所述基体支持物包括琼脂、琼脂糖、琼脂糖衍生物、磁珠、二氧化硅、二氧化钛、藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、葡聚糖、淀粉、环糊精、壳聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、肝硫酯、明胶、硅、陶瓷、玻璃(例如硼硅酸盐玻璃)、聚氨酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇对苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的任一种，或任意几种形成的共聚物。
基体支持物可以是任何形状，例如基本球形，基本立方体形等。
本发明还涉及层析分离装置，其含有如上所述的层析介质。
层析分离装置种类较多，包括但不限于以下种类：SPE固相萃取柱，带分离膜的离心管，磁珠，分离膜(membranes)，快速检测生物芯片(bio-chips)，纤维束柱，层析分离装置优选为柱状，例如整体柱及常规分析级或制备级层析色谱柱。
在另一方面，本发明提供了如上所述抗体或其抗原结合片段在检测和/或纯化多种血清型AAV中的应用；
所述多种血清型AAV包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVDJ和AAVrh.1中的至少一种；
或者所述多种血清型AAV包括AAV1、AAV2、AAV6、AAVDJ和AAVrh.1中的至少一种。
有益效果：
当前AAV病毒递送载体的研究还缺乏通用的、有效的针对病毒衣壳蛋白的血清学检测方法。本发明开发的抗AAV衣壳蛋白的单克隆抗体能够特异性地与多个血清型AAV反应，并且均能识别病毒的VP1、VP2和VP3蛋白。提供的单克隆抗体为AAV病毒递送载体的功能验证及其检测试剂盒的开发提供了便利。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为免疫之后的兔血清效价检测结果图；
图2为5G4-1单克隆抗体与不同血清型的AAV的ELISA反应结果；
图3为24F7-1单克隆抗体与不同血清型的AAV的ELISA反应结果；
图4为5G4-1单克隆抗体与不同血清型的AAV的EC50结果；
图5为24F7-1单克隆抗体与不同血清型的AAV的EC50结果；
图6为5G4-1单克隆抗体与不同血清型的AAV的WB结果；
图7为24F7-1单克隆抗体与不同血清型的AAV的WB结果。
具体实施方式
本发明涉及一种抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。
术语“腺相关病毒”(AAV)，是当前常用的基因操作工具，其属于细 小病毒科，为无包膜的单链线状DNA病毒。基因组全长约4.7kb，Cap基因编码VP1、VP2和VP3三种病毒衣壳蛋白。AAV的血清型众多，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVDJ和AAVrh10等。AAVrh.1是一种分离自恒河猴中的AAV病毒，与其他AAV病毒一样对人体的多种组织和器官具有易感性。
术语“病毒样颗粒”或“VLP”指不含病毒基因组核酸的，仅由病毒结构蛋白组装形成的非感染性颗粒。VLP的形态一般与成熟病毒颗粒相同，具有很强的免疫原性。哺乳动物表达系统、杆状病毒表达系统等多种表达系统可以表达VLP。本发明使用的VLP由293T细胞中表达的AAV病毒的VP1、VP2和VP3蛋白自动组装形成。
术语"抗体"意在指由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子(其中两条重链(H)和两条轻链(L)通过二硫键相互连接(即"完整的抗体分子"))，以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(由结构域CH1、CH2和CH3组成)组成。每条轻链由轻链可变区(“LCVR或“VL”)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插有更保守的区称为框架区(FR)。CDR的氨基酸序列可以使用本领域公认的编号方案，例如Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact容易地确定。在一个具体实施方案中，本发明已经根据Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下列顺序从氨基末端至羟基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的一些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可与人种系序列相同或可经天然或人工修饰。
术语“单克隆抗体”指均一的仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型的包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的普通多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征，不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体优选通过重组DNA方法产生，或通过本发明其他地方描述的筛选方法 获得。
术语“突变”是指单克隆抗体或其功能片段包含一个或多个(数个)位置的一个或多个(数个)氨基酸残基的变更，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代是指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失是指除去占据某位置的氨基酸；而插入是指在占据某位置的氨基酸邻接处且在之后添加1-3个氨基酸。
术语“分离的多核苷酸”指非自然界中天然存在状态的多核苷酸，包括通过生物学技术从自然界(包括生物体内)分离出的多核苷酸，也包括人工合成的多核苷酸。分离的多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、mRNA或合成的其他RNA，或者它们的组合。需要指出的是，本领域技术人员可以根据本文所提供的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，基于密码子简并性，设计出提供的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列，但都编码相同的氨基酸序列。这些经改动的核苷酸序列也包括在本发明的范围内。
当涉及多核苷酸时，术语“载体”指用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子(例如核酸、质粒或病毒等)。术语“表达载体”或“表达盒”指适于在宿主细胞内表达目的基因(待表达核苷酸序列)的载体，通常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同，只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
术语“抗体功能片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。例如，能够结合AAV病毒衣壳蛋白或其部分的抗体片段，包括但不限于sdAb(单域抗体)、Fab(例如，抗体经木瓜蛋白酶消化而得到)、F(ab’)2(例如，通过胃 蛋白酶消化得到)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术得到)。
术语“氨基酸替换”，指在预先确定的(初始)氨基酸序列中，用不同的氨基酸残基代替现有的氨基酸残基。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等，Molecular Biology ofthe Gene(基因的分子生物学)，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第四版，1987))。这样的例示性取代优选依照以下所示的取代来进行：
表1示例性保守氨基酸取代
关于肽或多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。
除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。除非另外特别说明，否则词语“一个(a)”或“一个(an)”意指“至少一个”。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。短语“至少一个”的含义等同于短语“一个或多个”的含义。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则术语诸如“要素”或“组分”包括包含一个单元的元素或组分以及包含多于一个单元的元素和组分。
除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1 rh.1型AAV病毒样颗粒免疫动物
采用100μg重组rh.1型AAV病毒样颗粒(AAVrh.1VLP，衣壳蛋白VP1、VP2和VP3蛋白序列如SEQ ID NO:1、2和3所示)免疫新西兰白兔。随后，每隔一周重复免疫，从而对实验兔进行加强免疫，共3次。2只兔血清效价在3次免疫之后均达到105以上(图1)。编号为R05999的实验兔在最后一次免疫后7天采集无菌血进行后续抗体发现工作。
rh.1血清型AAV衣壳蛋白VP1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

rh.1血清型AAV衣壳蛋白VP2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
rh.1血清型AAV衣壳蛋白VP3氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

实施例2 B细胞的获得以及单克隆抗体的筛选
1)抗原阳性B细胞的分离
无菌采集抗凝兔血15mL进行PBMC分离，然后采用抗原对抗原阳性细胞进行富集。富集后的细胞按照10个细胞每孔的密度铺到提前铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中。将板在37℃下在5％CO2中孵育。第7天收集培养过夜的上清液，开始使用下文所述的间接ELISA方法检测针对AAV病毒样颗粒的抗体的存在情况。
2)间接ELISA
间接ELISA用于评估上清液中抗体对VLP的结合能力。用PBS将AAVrh.1VLP稀释到1μg/mL后100μL每孔包被96孔酶标板于4℃下包被过夜。用PBST(0.05％吐温)洗涤后，以150μL/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭1小时。随后弃去封闭液，向每个板加入100μL的B细胞培养上清液，然后在37℃孵育1小时。弃去上清并用PBST洗涤三次后，以100μL/孔的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗(GenScript,A01856)于37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤5次，然后加入TMB显色液并在室温下避光反应13分钟。最后加入50μL的1M HCl终止液(国药，10011018)终止显色。使用酶标仪在450nm下读板。选择吸光度值大于1.0的阳性孔的细胞进行后续实验。
实施例3单克隆抗体的可变区测序
使用TRIzol(Life Technology，15596-026)提取OD值大于1.0的孔内总细胞的RNA，并利用通用引物(Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，Takara)将其逆转录为cDNA。随后通过RACE PCR扩增兔免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，并将扩增的片段通过同源重组至pCDNA3.4载体中，使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获取了克隆5G4-1和24F7-1的独特V-区域蛋白氨基酸序列及质粒。
5G4-1重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
5G4-1轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：
24F7-1重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：
24F7-1轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：
表2抗体的CDR区序列
实施例4基于重组表达的单克隆抗体的生产
将分别包含抗体重链和轻链的质粒共转染至ExpiCHO-STM Cells(Gibco，A29133)细胞，于37℃摇瓶中培养6天后，收取上清用于抗体纯化。抗体纯化步骤：将蛋白A柱用含有0.05M Tris和1.5M NaCl(pH8.0)的缓冲液平衡。随后将收获的细胞培养物上清液，使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时，使用1×上述缓冲液洗涤柱后，使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG，收集洗脱液并用九分之一体积的无菌1M Tris-HCl(pH9.0)中和。在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去残余的洗脱缓冲液，使用1.43的消光系数Ec(0.1％)通过OD280nm对抗体进行定量。
实施例5单克隆抗体对多种血清型AAV病毒VLP的交叉反应性
间接ELISA用于评估纯化抗体对于AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVDJ和AAVrh.1的VLP的结合能力。向96孔酶标板各孔中加入100μL PBS稀释的1μg/mL的VLP在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗板后，各孔加入150μL的含1％BSA的PBST在37℃封闭1小时。随后弃去封闭液，向每个板加入100μL浓度为1μg/mL重组表 达抗体，然后在37℃孵育1小时。PBST洗涤三次后，每孔加入100μL的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗(GenScript,A01856)37℃孵育0.5小时。PBST洗涤五次后，加入TMB显色液并在室温下避光孵育13分钟。最后加入50μL的1M HCl终止液(国药，10011018)终止显色。使用酶标仪在450nm下读板，结果如图2和图3所示。选择选择吸光度值大于0.3的抗原抗体组合进行后续EC50实验。
实施例6单克隆抗体对多种血清型AAV病毒VLP结合的EC50测试
间接ELISA用于评估纯化抗体对多种血清型AAV病毒VLP的结合能力。将1μg/mL的各个血清型AAV的VLP分别包被96孔酶标板，并在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗板后，每孔加入250μL含1％BSA的PBST于37℃封闭2小时。随后弃去封闭液，向首孔加入1μg/mL的纯化抗体100μL，并按照3倍梯度稀释，共计11个测试浓度梯度外加一个仅加入PBST的对照孔。然后在37℃下孵育1小时。PBST洗涤三次后，每孔加入100μL的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗(GenScript,A01856)37℃孵育0.5小时。PBST洗涤四次后，加入TMB显色液(GenScript)并在室温避光孵育15分钟。最后加入50μL的1M HCl终止液(国药，10011018)终止显色。使用酶标仪在450nm下读板，各单克隆抗体的EC50检测曲线如图4和图5，EC50值如表3所示：
表3抗体对多种血清型AAV病毒VLP结合的EC50值

实施例7 WB检测单克隆抗体对多种血清型AAV病毒VLP的交叉反应性
WB用于评估单克隆抗体对不同血清型AAV病毒VP1、VP2和VP3三个衣壳蛋白的反应性。将AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVDJ和AAVrh.1的VLP稀释到0.015mg/mL，每份样品与还原性2×loading Buffer进行1：1混合后沸水浴5min。分别取10μL处理后的样品加入10％预制胶(GenScript，M42012C)样品孔中进行SDS-PAGE电泳并转印到NC膜上。以PBST稀释的5％脱脂乳37℃封闭2h后，换液为脱脂乳稀释的0.1μg/mL的单克隆抗体孵育1h。PBST洗涤5次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗(GenScript,A01856)37℃孵育1小时。PBST洗涤5次后，加入化学发光液置于ChemiDoc MP化学发光成像系统(Bio-Rad)中拍照。各个单克隆抗体对不同血清型AAV病毒的WB反应结果如图6、图7所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (15)

  1. 抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，所述抗体或其功能片段包含重链CDR和轻链CDR，所述重链CDR和轻链CDR选自由SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列的CDR和其各自包含至多三个氨基酸突变的变体所组成的组，且所述组的组合方式由a和/或d所限定：
  2. 根据权利要求1所述的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，所述重链CDR和轻链CDR选自如下序列：
    a.重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8，9，10，11，12和13所示；或
    b.重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:14，15，16，17，18和19所示。
  3. 根据权利要求1或2所述的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区选自由SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的可变区和其各自包含至少80％一致性的氨基酸序列的变体所组成的组，且所述组的组合方式由A和/或B所限定：

  4. 根据权利要求3所述的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列：
    A.所述重链可变区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或
    B.所述重链可变区包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求1、2、4任一项所述的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，其是兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或者人抗体。
  6. 根据权利要求1、2、4任一项所述的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段，其具有可检测的标记。
  7. 编码权利要求1～6中任一项所述的抗多种血清型AAV衣壳蛋白的单克隆抗体或其功能片段的分离的多核苷酸。
  8. 根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含编码所述单克隆抗体或其功能片段的重链可变区的核苷酸序列，和编码所述单克隆抗体或其功能片段的轻链可变区的核苷酸序列。
  9. 包含根据权利要求7或8所述的多核苷酸的表达载体。
  10. 包含根据权利要求9所述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
  11. 一种制备抗多种血清型AAV单克隆抗体或其功能片段的方法，包括：
    在合适的培养条件下培养权利要求10所述的宿主细胞；以及
    从培养基中或从所培养的细胞中回收如此产生的抗体或其抗原结合片 段。
  12. 一种检测多种血清型AAV的试剂盒，所述试剂盒中包含权利要求1～6中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段。
  13. 用于分离多种血清型AAV的层析介质，其特征在于，所述层析介质包括基体支持物和固定于所述基体支持物上的权利要求1～6中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段。
  14. 层析分离装置，其特征在于，含有权利要求13所述的层析介质。
  15. 权利要求1～6中任一项所述抗体或其抗原结合片段在检测和/或纯化多种血清型AAV中的应用；
    所述多种血清型AAV包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVDJ和AAVrh.1中的至少一种；或者所述多种血清型AAV包括AAV1、AAV2、AAV6、AAVDJ和AAVrh.1中的至少一种。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN120399047A (zh) * 2025-07-01 2025-08-01 北京溯本源和生物科技有限公司 一种用于特异性检测aav6的单克隆抗体1e12及应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026254A2 (de) * 1998-10-29 2000-05-11 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts An das aav-kapsid bindender, den zelltropismus verändernder antikörper und verfahren zum gerichteten gentransfer
US6093534A (en) * 1995-03-17 2000-07-25 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Monoclonal antibody specifically recognizing adeno-associated virus cap protein
US20160030560A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-04 The Research Foundation For The State University Of New York Methods of treating neurodegenerative conditions
WO2016176212A1 (en) * 2015-04-27 2016-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Engineered human anti-aav antibodies and uses thereof
CN113583112A (zh) * 2021-07-30 2021-11-02 信念医药科技(苏州)有限公司 Aav特异性抗体及其应用
US20210388064A1 (en) * 2020-06-15 2021-12-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus antibodies and fragments thereof
WO2022166949A1 (zh) * 2021-02-07 2022-08-11 南京金斯瑞生物科技有限公司 抗aav2单克隆抗体及其制备方法和应用
CN116199773A (zh) * 2022-12-22 2023-06-02 北京因诺惟康医药科技有限公司 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用
CN116239679A (zh) * 2022-12-22 2023-06-09 北京因诺惟康医药科技有限公司 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6093534A (en) * 1995-03-17 2000-07-25 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Monoclonal antibody specifically recognizing adeno-associated virus cap protein
WO2000026254A2 (de) * 1998-10-29 2000-05-11 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts An das aav-kapsid bindender, den zelltropismus verändernder antikörper und verfahren zum gerichteten gentransfer
US20160030560A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-04 The Research Foundation For The State University Of New York Methods of treating neurodegenerative conditions
WO2016176212A1 (en) * 2015-04-27 2016-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Engineered human anti-aav antibodies and uses thereof
US20210388064A1 (en) * 2020-06-15 2021-12-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus antibodies and fragments thereof
WO2022166949A1 (zh) * 2021-02-07 2022-08-11 南京金斯瑞生物科技有限公司 抗aav2单克隆抗体及其制备方法和应用
CN113583112A (zh) * 2021-07-30 2021-11-02 信念医药科技(苏州)有限公司 Aav特异性抗体及其应用
CN116199773A (zh) * 2022-12-22 2023-06-02 北京因诺惟康医药科技有限公司 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用
CN116239679A (zh) * 2022-12-22 2023-06-09 北京因诺惟康医药科技有限公司 一种可结合多种aav血清型的纳米抗体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KABAT, E. A. ET AL.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1991
See also references of EP4644414A1
WATSON ET AL.: "Molecular Biology of the Gene", 1987, THE BENJAMIN/CUMMINGS PUB. CO., pages: 224

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN120399047A (zh) * 2025-07-01 2025-08-01 北京溯本源和生物科技有限公司 一种用于特异性检测aav6的单克隆抗体1e12及应用
CN120399047B (zh) * 2025-07-01 2025-09-09 北京溯本源和生物科技有限公司 一种用于特异性检测aav6的单克隆抗体1e12及应用

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