WO2024140854A1 - 抗pdl1的抗体及其用途 - Google Patents

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    • G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86

Definitions

  • the present disclosure relates to the field of biomedicine, and in particular to an anti-PDL1 antibody or an antigen-binding fragment thereof and uses thereof.
  • Cancer is a major disease that threatens human life and health worldwide, and with the intensification of environmental pollution, the incidence of cancer is increasing year by year.
  • cancer therapies have been developed, including traditional surgical resection, radiotherapy, chemotherapy, and targeted therapies that have emerged in recent years, including small molecule targeted drug therapy, macromolecular targeted drug therapy, immune checkpoint therapy, bispecific antibodies, cell and gene therapy, etc.
  • Radiotherapy and chemotherapy are generally accompanied by strong side effects and immunosuppression in patients, which can easily lead to tumor recurrence.
  • immune checkpoint therapy and bispecific antibody drugs use the patient's own immune system to fight cancer, with relatively few side effects, and the patient's immune function will not be suppressed.
  • PDL1 expression is significantly upregulated in a variety of tumors. It transmits immunosuppressive signals by binding to the PD-1 receptor on the surface of T cells, promotes T cell exhaustion, and reduces the patient's anti-cancer immune function. Using antibodies to block the interaction between PD-1 and PDL1 can reverse the immune exhaustion of T cells and restore anti-cancer function. So far, PD-1 antibodies such as Opdivo and Keytruda, and PDL1 antibodies such as Tecentirq (Atezolizumab) have benefited a lot of patients, but it should be noted that not all patients respond to PD-1/L1 monoclonal antibody therapy, and its overall efficacy is around 30%, and there are still more patients who cannot benefit from it.
  • the present disclosure aims to solve one of the technical problems in the related art at least to some extent.
  • an antibody or antigen-binding fragment comprising:
  • a CDR sequence selected from at least one of the following or an amino acid sequence having at least 80% identity thereto:
  • Heavy chain variable region CDR sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3;
  • Light chain variable region CDR sequence SEQ ID NO: 4, WAS, SEQ ID NO: 5.
  • the antibodies or antigen-binding fragments provided by the present disclosure contain the above-mentioned specific CDR sequences, which can specifically bind to PDL1 highly expressed on the surface of tumor cells with high binding affinity, thereby blocking the interaction between PD-1 and PDL1 on the surface of immune cells and promoting the anti-cancer function of immune cells.
  • the antibody or antigen-binding fragment comprises:
  • the antibody or antigen-binding fragment comprises:
  • the antibody or antigen-binding fragment includes: a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO:6 or SEQ ID NO:8; and/or a light chain variable region as shown in SEQ ID NO:7 or SEQ ID NO:9.
  • the antibody or antigen-binding fragment comprises: a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO:6, and a light chain variable region as shown in SEQ ID NO:7; or a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO:8, and a light chain variable region as shown in SEQ ID NO:9.
  • the light chain constant region and the heavy chain constant region are both from a murine IgG antibody or a mutant thereof or a human IgG antibody or a mutant thereof.
  • the light chain constant region and the heavy chain constant region are both from a murine IgG1 antibody or a mutant thereof or a human IgG1 antibody or a mutant thereof.
  • the N-terminus of the heavy chain constant region is connected to the C-terminus of the heavy chain variable region
  • the N-terminus of the light chain constant region is connected to the C-terminus of the light chain variable region
  • the antibody or antigen-binding fragment has a heavy chain having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO:10 and SEQ ID NO:12, and a light chain having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO:11 and SEQ ID NO:13.
  • the antibody or antigen-binding fragment has a heavy chain with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:10 and a light chain with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:11; the antibody or antigen-binding fragment has a heavy chain with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:12 and a light chain with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:13.
  • the antibody or antigen-binding fragment includes a monoclonal antibody or a polyclonal antibody; the monoclonal antibody includes a full-length antibody, Fv, a single-chain antibody, Fab, a single-domain antibody and at least one of a minimum recognition unit; the antibody or antigen-binding fragment is capable of binding to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:14.
  • a second aspect of the present disclosure provides a bispecific binding molecule, comprising: a first binding region, the first binding region comprising the antibody or antigen-binding fragment described in the first aspect; and a second binding region, the second binding region having CD3 binding activity.
  • the bispecific binding molecule comprises a symmetric bispecific binding molecule or an asymmetric bispecific binding molecule; the bispecific binding molecule is an asymmetric bispecific binding molecule.
  • the second binding region comprises at least one of a full-length antibody, Fv, a single-chain antibody, Fab, a single-domain antibody, and a minimum recognition unit having CD3 binding activity.
  • the second binding region comprises an anti-CD3 single chain antibody.
  • the CD3 ⁇ PDL1 bispecific antibody provided by the present disclosure can bind more strongly to tumor cells and promote T cells to exert anti-cancer function.
  • the anti-CD3 single-chain antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:22.
  • the first binding region further includes at least one of a first heavy chain constant region and a light chain constant region, and at least a portion of at least one of the first heavy chain constant region and the light chain constant region is derived from at least one of a human antibody, a primate antibody, and a murine antibody or a mutant thereof.
  • the first heavy chain constant region and the light chain constant region are both from human IgG antibodies or mutants thereof.
  • the first heavy chain constant region and the light chain constant region are both from human IgG1 antibodies or mutants thereof.
  • the N-terminus of the first heavy chain constant region is connected to the C-terminus of the heavy chain variable region, and the N-terminus of the light chain constant region is connected to the C-terminus of the light chain variable region.
  • the peptide chain 1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:12
  • the peptide chain 2 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:13.
  • the peptide chain 1 and the peptide chain 2 are connected by a disulfide bond.
  • the second binding region further includes a second heavy chain constant region, at least a portion of which is derived from at least one of a human antibody, a primate antibody, and a murine antibody or a mutant thereof.
  • the second heavy chain constant region is derived from a human IgG antibody or a mutant thereof.
  • the second heavy chain constant region is derived from a human IgG1 antibody or a mutant thereof.
  • the N-terminus of the second heavy chain constant region is linked to the C-terminus of the anti-CD3 single-chain antibody.
  • the first heavy chain constant region and the second heavy chain constant region are connected by a knob-into-hole structure.
  • the third aspect of the present disclosure provides an isolated polynucleotide, which encodes the antibody or antigen-binding fragment of the first aspect or encodes the bispecific binding molecule of the second aspect.
  • the recombinant cell is obtained by introducing the expression vector of the fourth aspect into a host cell.
  • Lung cancer liver cancer, ovarian cancer, cervical cancer, skin cancer, bladder cancer, colon cancer, breast cancer, glioma, kidney cancer, stomach cancer, esophageal cancer, oral squamous cell carcinoma and head and neck cancer.
  • the cancer comprises at least one of the following:
  • Lung cancer liver cancer, ovarian cancer, cervical cancer, skin cancer, bladder cancer, colon cancer, breast cancer, glioma, kidney cancer, stomach cancer, esophageal cancer, oral squamous cell carcinoma and head and neck cancer.
  • FIG5 is a graph showing the ELISA results of 19B8 chimeric antibody blocking the binding of PD-1 to PDL1 in one embodiment of the present disclosure
  • FIG11 is a graph showing the result of CD3 ⁇ PDL1 bispecific antibody binding to PDL1 fusion protein in one embodiment of the present disclosure
  • the antibodies disclosed herein include murine antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies, preferably humanized antibodies.
  • mutant or “variant” may refer to any naturally occurring or engineered molecule comprising one or more nucleotide or amino acid mutations.
  • the "knob into hole structure” refers to the formation of a knob (Knob) and a hole (Hole) mutation in the CH3 region of the antibody heavy chain constant region to facilitate the heavy chain biting and form a heterodimer.
  • the present disclosure provides an antibody (anti-PDL1 antibody) or an antigen-binding fragment that can specifically recognize PDL1, and the antibody or its antigen-binding fragment contains a CDR sequence selected from at least one of the following or an amino acid sequence that has at least 80% identity thereto: heavy chain variable region CDR sequence: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3; light chain variable region CDR sequence: SEQ ID NO: 4, WAS, SEQ ID NO: 5.
  • WAS in the CDR sequence refers to the amino acid sequence.
  • the anti-PDL1 antibody or antigen-binding fragment comprises:
  • the anti-PDL1 antibody or antigen-binding fragment comprises: a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8; and/or
  • the light chain variable region as shown in SEQ ID NO:7 or SEQ ID NO:9.
  • the anti-PDL1 antibody or antigen-binding fragment comprises:
  • the computer program BLAST with default parameters is used, especially BLASTP or TBLASTN.
  • the amino acid sequences described in the present disclosure are all shown in the manner of N-terminus to C-terminus. It should be known to those skilled in the art that the CDR sequences analyzed from different databases may be different, but these changes should be included in the scope of protection of the present disclosure.
  • the antibodies of the present disclosure may be full-length (e.g., IgG1 or IgG4 antibodies) or may only contain an antigen binding portion (e.g., Fab, F(ab')2 or scFv fragments), or may be modified to affect function.
  • the present disclosure includes anti-PDL1 antibodies with modified glycosylation patterns. In some applications, it may be useful to modify to remove undesirable glycosylation sites, or antibodies without the presence of fucose moieties on the oligosaccharide chains to, for example, enhance antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) function. In other applications, galactosylation modifications may be performed to alter complement-dependent cytotoxicity (CDC).
  • the fragments of the present disclosure still have PDL1 binding activity, particularly the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:10.
  • the functional fragment will be composed of or contain a partial sequence of the heavy chain variable region or light chain variable region of the antibody from which it is derived, and the partial sequence is sufficient to retain the same binding specificity and sufficient affinity as the antibody from which it is derived, and for PDL1, it is preferably at least equal to 1/100 of the affinity of the antibody from which it is derived, and in a more preferred manner, at least equal to 1/10.
  • Such a functional fragment will contain at least 5 amino acids, preferably 10, 15, 25, 50 and 100 consecutive amino acids of the antibody sequence from which it is derived.
  • nucleic acid molecules Nucleic acid molecules, recombinant vectors, recombinant cells, immunoconjugates
  • nucleic acid molecules expressing these antibodies can be connected to different vectors and then expressed in different cells to obtain the corresponding antibodies.
  • the present disclosure also provides isolated nucleic acids encoding the above-mentioned antibodies or antigen-binding fragments thereof, and recombinant vectors and transformants containing the nucleic acids.
  • the nucleic acid molecules encode the above-mentioned antibodies or antigen-binding fragments thereof, and the nucleic acids are preferably expression cassettes obtained by genetic engineering.
  • the recombinant vector may refer to a cloning vector or an expression vector, and can be obtained by operably linking the nucleic acid to a commercially available vector (such as a plasmid or a viral vector).
  • a commercially available vector such as a plasmid or a viral vector.
  • Commonly used plasmids include pSeTag2, PEE14, pMH3, and the like.
  • the nucleic acid molecule is species optimized and is more easily expressed in mammalian cells.
  • the present disclosure also provides an expression vector, which comprises the above-mentioned isolated nucleic acid molecule.
  • the polynucleotide can be directly or indirectly connected to the control elements on the vector, as long as these control elements can control the translation and expression of the polynucleotide.
  • these control elements can come directly from the vector itself, or they can be exogenous, that is, they are not from the vector itself.
  • the polynucleotide can be operably connected to the control element.
  • operably connected means connecting the exogenous gene to the vector so that the control elements in the vector, such as transcription control sequences and translation control sequences, etc., can play their expected functions of regulating the transcription and translation of the exogenous gene.
  • control elements in the vector such as transcription control sequences and translation control sequences, etc.
  • the polynucleotides used to encode the heavy chain and light chain of the antibody can be inserted into different vectors separately and independently, and it is common to insert them into the same vector.
  • Commonly used vectors can be, for example, plasmids, bacteriophages, etc.
  • the present disclosure also provides a recombinant cell, which contains the expression vector.
  • the expression vector can be introduced into mammalian cells to construct recombinant cells, and then these recombinant cells are used to express the antibodies or antigen-binding fragments provided by the present disclosure. By culturing the recombinant cells, the corresponding antibodies can be obtained.
  • the host cell described in the present disclosure can be a prokaryotic host cell, a eukaryotic host cell or a bacteriophage.
  • the prokaryotic host cell can be Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces or Proteus mirabilis, etc.
  • the eukaryotic host cell can be fungi including Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Trichoderma, insect cells such as armyworms, plant cells such as tobacco, mammalian cells such as BHK cells, CHO cells, COS cells, myeloma cells, etc.
  • the host cell described in the present disclosure is preferably a mammalian cell, more preferably a BHK cell, CHO cell, NSO cell or COS cell.
  • the immunoconjugate provided by the present disclosure contains a therapeutic agent and the above-mentioned antibody or antigen-binding fragment thereof coupled to the therapeutic agent.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof and the therapeutic agent can be coupled in a conventional manner.
  • composition provided by the present disclosure contains an antibody or its antigen-binding fragment as described above, and/or the above-mentioned immunoconjugate, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition includes a combination separated in time and/or space, as long as it can work together to achieve the purpose of the present disclosure.
  • the components contained in the composition can be applied to the subject as a whole, or separately to the subject. When the components contained in the composition are applied separately to the subject, each component can be applied to the subject simultaneously or sequentially.
  • the present disclosure also provides a drug, which includes the above-mentioned antibody or antigen-binding fragment thereof and a pharmaceutically acceptable carrier, and may also include the above-mentioned immunoconjugate, nucleic acid molecule, expression vector, and recombinant cell.
  • these pharmaceutical compositions further include a pharmaceutically acceptable carrier, including any solvent, solid excipient, diluent, binder, disintegrant, or other liquid excipient, dispersant, flavoring agent or suspending agent, surfactant, isotonic agent, thickener, emulsifier, preservative, solid binder, glidant or lubricant, etc., suitable for a specific target dosage form.
  • a pharmaceutically acceptable carrier including any solvent, solid excipient, diluent, binder, disintegrant, or other liquid excipient, dispersant, flavoring agent or suspending agent, surfactant, isotonic agent, thickener, emulsifier, preservative, solid binder, glidant or lubricant, etc.
  • compositions of the present disclosure may also be administered in combination with each other or with one or more other therapeutic compounds, for example, in combination with a chemotherapeutic agent. Therefore, the composition may also contain a chemotherapeutic agent.
  • the antibodies or antigen-binding fragments thereof or immunoconjugates disclosed herein may also be combined with a second therapeutic agent, exemplary agents of which include but are not limited to other agents that inhibit PDL1 activity (including other antibodies or antigen-binding fragments thereof, peptide inhibitors, small molecule antagonists, etc.) and/or agents that interfere with PDL1 upstream or downstream signal transduction.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is administered in an effective amount, i.e., an amount sufficient to achieve the desired therapeutic and/or preventive effect, e.g., an amount that causes the prevention or alleviation of symptoms associated with the disease being treated, e.g., a disease associated with PDL1.
  • an effective amount of the composition administered to the subject will depend on the type and severity of the disease, as well as on the characteristics of the individual, such as general health, age, sex, weight, and tolerance to drugs; it will also depend on the severity and type of the disease, and a person skilled in the art will be able to determine an appropriate dose based on these factors, among others.
  • the kit for detecting PDL1 in a sample provided by the present disclosure contains an antibody or an antigen-binding fragment thereof as described above, a pharmaceutically acceptable carrier, an immunoconjugate, a nucleic acid molecule, an expression vector, and a recombinant cell.
  • the sample can be a tissue of a patient suffering from a disease mediated by PDL1 (particularly a transplant rejection, an autoimmune disease, an infectious disease, or a cancer patient, more preferably a patient suffering from at least one of lung cancer, liver cancer, ovarian cancer, cervical cancer, skin cancer, bladder cancer, colon cancer, breast cancer, glioma, kidney cancer, gastric cancer, esophageal cancer, oral squamous cell carcinoma, and head and neck cancer).
  • the kit can also include reagents conventionally used to detect PDL1, such as a coating solution, etc.
  • the present disclosure also provides the antibody or antigen-binding fragment thereof, a pharmaceutically acceptable carrier, an immunoconjugate, a nucleic acid molecule, an expression vector, and a recombinant cell.
  • a pharmaceutically acceptable carrier e.g., a pharmaceutically acceptable carrier
  • an immunoconjugate e.g., a nucleic acid molecule
  • an expression vector e.g., a cell
  • a recombinant cell e.g., a recombinant cell.
  • the PDL1-mediated disease is transplant rejection, an autoimmune disease, an infectious disease, or a cancer.
  • the cancer is a cancer expressing PDL1.
  • the cancer is at least one of lung cancer, liver cancer, ovarian cancer, cervical cancer, skin cancer, bladder cancer, colon cancer, breast cancer, glioma, kidney cancer, gastric cancer, esophageal cancer, oral squamous cell carcinoma, and head and neck cancer.
  • the infectious disease includes but is not limited to HIV virus infection and/or hepatitis B virus infection.
  • the present disclosure also relates to a method for preventing and/or treating a PDL1-mediated disease (as described above), the method comprising: administering an effective amount of at least one of the antibodies or antigen-binding fragments thereof, immunoconjugates and compositions of the present disclosure to a patient.
  • the administration may be oral, nasal, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous or intraperitoneal.
  • nucleic acids encoding the heavy and/or light chains of the antibodies of the present disclosure are within the scope of the present disclosure. According to the amino acid sequences of the heavy and/or light chains, those skilled in the art can easily obtain the corresponding nucleic acid sequences, as shown in Table 1.
  • PDL1-strep Purified recombinant PDL1 extracellular domain Strep tag fusion protein
  • mice were immunized three times with purified antigen and complete Freund's adjuvant, and the immune response was detected after bleeding from the tail vein.
  • the serum was screened by ELISA and flow cytometry to obtain mice with anti-human PDL1 immunoglobulin.
  • the spleen cells of the mice with the highest anti-PDL1 immunoglobulin were taken out and fused with mouse myeloma cells SP2/0 cells (ATCC No. CRL-1581).
  • the hybridoma cells after fusion were screened for antibodies to obtain mouse monoclonal antibodies.
  • the total number of candidate hybridoma cells was cultured to 10 6 , and the cells were collected by centrifugation at 800 rpm for 10 minutes, and the total RNA was extracted using the Trizol kit (Invitrogen); the total RNA was used as a template for reverse transcription to synthesize a cDNA library (Invitrogen), and the cDNA was used as a template for PCR amplification of the variable region nucleic acid sequence corresponding to the hybridoma cells.
  • the primer sequences used in the PCR amplification reaction are complementary to the first framework region or signal peptide region and constant region of the antibody variable region (Larrick, JW, et al., (1990) Scand. J.
  • amino acid sequence of the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO:6:
  • amino acid sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO:7:
  • PDL1 extracellular domain protein was coated into a 96-well plate, and the strength of the signal after the addition of the antibody was used to determine the binding properties of the antibody and PDL1.
  • Antibody production The heavy chain and light chain nucleotide sequences of the above-mentioned antibodies were transiently transfected into ExpiCHO-S cells (Gibco, Catalog No. A29127) with pcDNA3.4 vectors (synthesized by Nanjing GenScript, mouse 19B8 heavy chain, i.e., 19B8-mIgG1 (amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10) and mouse h19B8 light chain, i.e., 19B8-mK (amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11), respectively to prepare antibodies.
  • ExpiCHO-S cells One day before transfection, the cell density of ExpiCHO-S cells was adjusted to (3-4) ⁇ 10 6 /mL and cultured overnight at 37°C, 8% CO 2 and 95 rpm with shaking. On the day of transfection, the cells grew to 7 ⁇ 10 6 -1 ⁇ 10 7 /mL and the viability was greater than 95%, ready for transfection. The cells were diluted to 6 ⁇ 10 6 /mL using fresh pre-warmed ExpiCHO medium (Gibco, Catalog No.
  • PDL1-Fc fusion protein purchased from Acro was diluted to 5 ⁇ g/mL with PBS buffer, added to a 96-well plate at a volume of 100 ⁇ L/well, and placed at 4°C overnight.
  • the PBS buffer in the 96-well plate was aspirated, and the plate was washed 6 times with PBST (pH7.2 PBS containing 0.1% Tween 20) buffer, and then 200 ⁇ L/well PBS/10% BSA was added, and the plate was incubated at 37°C for 2 hours for blocking.
  • PBST pH7.2 PBS containing 0.1% Tween 20
  • Antibody production The heavy chain and light chain nucleotide sequences of the above antibodies were transiently transfected into ExpiCHO-S cells (Gibco, catalog number A29127) with pcDNA3.4 vectors (synthesized by Nanjing GenScript, mouse 19B8 heavy chain hIgG1LALA, i.e. 19B8-hIgG1LALA (amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 31), mouse h19B8 light chain hK, i.e.
  • the blocking solution was removed, and the plate was washed 6 times with PBST, and then 100 ⁇ l/well of the chimeric antibody 19B8-hIgGLALA to be tested and the control antibody 12A4-hIgG1LALA diluted to an appropriate concentration with PBST/0.05% BSA were added, and incubated at 37°C for 1 hour. Remove the reaction system, wash the plate with PBST 6 times, dilute the HRP (horseradish peroxidase) labeled anti-human IgG-Fab antibody secondary antibody with PBST/0.05% BSA at 100 ⁇ l/well, and incubate at 37°C for 1 hour.
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase-labeled strreptavidin secondary antibody
  • PBST/0.05% BSA PBST/0.05% BSA
  • 80 ⁇ L/well TMB tetramethylbenzidine
  • 80 ⁇ L/well 4M sulfuric acid was added to terminate the reaction, wherein mIgG (purchased from Biolegend) was used as a control.
  • the absorbance value was read at 450 mm using an enzyme reader. The results are shown in FIG5 , indicating that the chimeric antibody 19B8-hIgG1LALA disclosed in the present invention can block the binding of PDL1 to its receptor PD-1.
  • Example 7 Flow cytometry binding experiment of human-mouse chimeric PDL1 antibody
  • Human melanoma A375 cells and human lung adenocarcinoma A549 cells were diluted to 1 ⁇ 10 6 /mL with PBS, added to 1.5mL EP tubes at a volume of 100 ⁇ L/tube, and 10 ⁇ L/tube of rat serum was added thereto, and blocked at 4°C for 30min.
  • Different concentrations of chimeric antibody 19B8-hIgG1LALA or control antibody 12A4-hIgG1LALA were added, and incubated at 4°C for 30min. 1mL PBS was added to the EP tube, centrifuged at 4°C, 3500rpm ⁇ 5min, the supernatant was discarded, and then washed with PBS.
  • the humanized template that best matches its non-CDR region is selected.
  • the CDR region of the mouse antibody is transplanted to the selected humanized template to replace the CDR region of the human template to obtain a humanized antibody.
  • the embedded residues, the residues that directly interact with the CDR region, and the residues that have an important influence on the conformation of VL and VH are back mutated to obtain the humanized antibody.
  • the sequence of the heavy chain variable region of the humanized PDL1 antibody is shown in SEQ ID NO:8, and the sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO:9.
  • Antibody production The heavy chain and light chain nucleotide sequences of the above-mentioned antibodies were transiently transfected into ExpiCHO-S cells (Gibco, Catalog No. A29127) with pcDNA3.4 vectors (synthesized by Nanjing GenScript, humanized 19B8 heavy chain hIgG1LALA, i.e., h19B8-hIgG1LALA (amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12) and humanized h19B8 light chain hK, i.e., h19B8-hK (amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13) to prepare antibodies.
  • ExpiCHO-S cells One day before transfection, the cell density of ExpiCHO-S cells was adjusted to (3-4) ⁇ 10 6 /mL and cultured overnight at 37°C, 8% CO 2 and 95 rpm with shaking. On the day of transfection, the cells grew to 7 ⁇ 10 6 -1 ⁇ 10 7 /mL and the viability was greater than 95%, ready for transfection. The cells were diluted to 6 ⁇ 10 6 /mL using fresh pre-warmed ExpiCHO medium (Gibco, Catalog No.
  • the chromatography column was equilibrated with a pH 7.2 phosphate buffer, the supernatant was passed through the affinity chromatography column and eluted with an elution buffer (100 mM citric acid, pH 2.7), and finally concentrated and replaced with a PBS buffer.
  • the purified antibody was identified by SDS-PAGE to have a purity of more than 95%, and the results showed that the above-mentioned antibody was finally obtained.
  • PDL1-Fc fusion protein purchased from Acro was diluted to 5 ⁇ g/mL with PBS buffer, added to a 96-well plate at a volume of 100 ⁇ L/well, and placed at 4°C overnight.
  • the PBS buffer in the 96-well plate was aspirated, and the plate was washed 6 times with PBST (pH7.2 PBS containing 0.1% Tween20) buffer, and then 200 ⁇ L/well PBS/10% BSA was added, and incubated at 37°C for 2 hours for blocking.
  • PBST pH7.2 PBS containing 0.1% Tween20
  • the blocking solution was removed, and the plate was washed 6 times with PBST, and then 100 ⁇ L/well of the humanized PDL1 antibody h19B8-hIgG1LALA or the control antibody 12A4-hIgG1LALA, Atezulizumab analog (purchased from Bio-Bio), 2 ⁇ g/mL PD-1-Avi tag (purchased from Acro) diluted to an appropriate concentration with PBST/0.05% BSA was added, and incubated at 37°C for 1 hour. The reaction system was removed, and the plate was washed 6 times with PBST.
  • HRP horseradish peroxidase-labeled strreptavidin secondary antibody
  • PBST/0.05% BSA PBST/0.05% BSA
  • 80 ⁇ L/well TMB tetramethylbenzidine
  • 80 ⁇ L/well 4M sulfuric acid was added to terminate the reaction, wherein mIgG (purchased from Biolegend) was used as a control.
  • the absorbance value was read at 450 mm using an ELISA reader.
  • Human melanoma A375 cells and human lung adenocarcinoma A549 cells were diluted to 1 ⁇ 10 6 /mL with PBS and added at a volume of 100 ⁇ L/tube. In a 1.5mL EP tube, add 10 ⁇ L/tube of rat serum and block at 4°C for 30min. Add different concentrations of humanized antibody h19B8-hIgG1LALA (heavy chain and light chain as shown in SEQ ID NO: 12-13) or control antibody 12A4-hIgG1LALA, Atezulizumab analog (purchased from Baiying Bio) and incubate at 4°C for 30min.
  • FIG8 further demonstrates that the chimeric antibody of the present invention can bind to the PDL1 protein on the surface of tumor cells, and its binding is stronger than that of the control antibody 12A4 and the Atezulizumab analog.
  • Example 11 Humanized PDL1 antibody promotes SEB-induced IL-2 secretion in human PBMC
  • Human PBMC cells were diluted to 2 ⁇ 10 6 /mL with complete RPMI-1640 medium, added to a 96-well plate at a volume of 100 ⁇ L/well, and 50 ⁇ L/well of different concentrations of humanized antibody h19B8-hIgG1LALA or Atezulizumab analogs were added thereto, and blocked at 4°C for 30 minutes.
  • PDL1 extracellular domain fusion protein was coated into 96-well plates, and the strength of the signal after the addition of the antibody was used to determine the binding properties of the antibody and PDL1.
  • PDL1-Fc fusion protein was diluted to 1 ⁇ g/ml with PBS buffer, added to a 96-well plate at a volume of 100 ⁇ l/well, and placed at 4°C overnight.
  • the PBS buffer in the 96-well plate was aspirated, and the plate was washed 6 times with PBST (pH7.2 PBS containing 0.1% Tween20) buffer, and then 200 ⁇ l/well PBS/10% BSA was added, and the plate was incubated at 37°C for 2 hours for blocking.
  • PBST pH7.2 PBS containing 0.1% Tween20
  • the blocking solution was removed, and the plate was washed 6 times with PBST, and then 100 ⁇ l/well of the humanized antibody h19B8-hIgG1LALA and the bispecific antibody CD3 ⁇ h19B8 to be tested diluted to an appropriate concentration with PBST/0.05% BSA were added, and incubated at 37°C for 1 hour. Remove the reaction system, wash the plate with PBST 6 times, dilute the HRP (horseradish peroxidase) labeled anti-human IgG-Fab secondary antibody with PBST/0.05% BSA at 100 ⁇ l/well, and incubate at 37°C for 1 hour.
  • HRP horseradish peroxidase
  • FIG. 10 shows several connection methods of the CD3 ⁇ PDL1 bispecific antibody disclosed in the present invention
  • Figure 11 shows that the CD3 ⁇ h19B8 antibody disclosed in the present invention can bind to the PDL1 protein, and the binding ability is slightly weaker than that of the h19B8 monoclonal antibody.
  • CD3 ⁇ h19B8 antibody Schematic diagram shown in FIG. 10
  • CD3 ⁇ 12A4 antibody used in the examples of the present disclosure is shown in Table 2.
  • Example 14 CD3 ⁇ PDL1 antibody promotes PBMC to kill tumor cells
  • This example detects the killing of PBMC by bispecific antibodies.
  • step (3) diluting the bispecific antibody into a series of concentration gradients using complete RPMI-1640 medium, and adding the dilution to the RTCA plate obtained in step (2) at a volume of 20 ⁇ L/well;
  • step (4) The reaction system obtained in step (4) was incubated at 37°C and 5% CO2 for 24 hours using an xCELLigence RTCA MP instrument to detect the cell coefficient.
  • Example 16 CD3 ⁇ PDL1 antibody promotes PBMC to kill tumor cells
  • step (3) diluting the bispecific antibody into a series of concentration gradients using complete RPMI-1640 medium, and adding the dilution to the RTCA plate obtained in step (2) at a volume of 20 ⁇ L/well;
  • PBMC (Sai Li Biotechnology) was diluted to 1.25 ⁇ 10 6 cells/mL with complete RPMI-1640 medium and added to the RTCA plate obtained in step (3) at a volume of 80 ⁇ L/well;
  • step (4) The reaction system obtained in step (4) was incubated at 37°C and 5% CO2 for 24 hours using an xCELLigence RTCA MP instrument to detect the cell coefficient.
  • FIG. 15 The specific experimental results are shown in FIG. 15 , which further demonstrates that the CD3 ⁇ h19B8 bispecific antibody disclosed herein can promote PBMC to kill A375 tumor cells, and its killing ability is comparable to or slightly better than that of the control antibody CD3 ⁇ 12A4.
  • NCG mice were subcutaneously injected with 1 ⁇ 10 6 human melanoma A375 cells per mouse on the right flank;
  • mice On days 8, 11, 14, and 17, the mice were injected with the CD3 ⁇ h19B8(a) antibody via tail vein, 25 ⁇ g per mouse;

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Abstract

本公开涉及生物医药领域，具体涉及一种抗PDL1的抗体或其抗原结合片段及用途。本公开提供的抗PDL1的抗体或其抗原结合片段含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO：4、WAS、SEQ ID NO：5。该抗体与PDL1具有较高的结合亲和力，且本公开还提供一种CD3与PDL1双特异抗体，与肿瘤细胞有更强结合，促进T细胞发挥抗癌功能。

Description

抗PDL1的抗体及其用途
优先权信息
本申请请求2022年12月31日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202211737491.9的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本公开涉及生物医药领域，具体涉及一种抗PDL1的抗体或其抗原结合片段及用途。
背景技术
全球范围内，癌症是威胁人类生命健康的重大疾病，并且随着环境污染的加剧，癌症发病率逐年上升。与此同时，多种癌症疗法被开发，包括传统的手术切除、放疗、化疗，以及今年来兴起的靶向疗法，包括小分子靶向药物疗法、大分子靶向药物疗法、免疫检查点疗法、双特异抗体、细胞与基因疗法等。
近年来，最被寄予厚望的药物是免疫检查点抗体药物和双特异抗体药物。随着CTLA4抗体PD-1/L1抗体、LAG3抗体获批，免疫检查点药物成为近年来的热潮，并在多种肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌等瘤种中取得奇效。双特异抗体药物审批速度也明显加快，截止到目前，包括Eemovab(CD3×EPCAM)、CD3×CD19(Blincyto)、Rybrevant(EGFR×cMet)、Lunsumio(CD3×CD20)、Tecvayli(CD3×BCMA)获批，其中Rybrevant(EGFR×cMet)、Lunsumio(CD3×CD20)、Tecvayli(CD3×BCMA)更是去年和今年获批成药，说明这些创新药物确实能够使得更多患者受益。
放疗、化疗则一般伴随着强烈的副作用，以及患者体内免疫抑制状态，进而极易造成肿瘤复发。与传统的放疗、化疗细胞毒作用不同，免疫检查点疗法和双特异抗体药物借助患者自身的免疫系统抗癌，副作用相对较小，并且患者体内的免疫功能不会受到抑制。
PDL1在多种肿瘤中PDL1表达显著上调，其通过结合T细胞表面的PD-1受体，传递免疫抑制性信号，促进T细胞功能耗竭，降低患者的抗癌免疫功能。利用抗体阻断PD-1与PDL1相互作用，能够逆转T细胞的免疫耗竭，恢复抗癌功能。截止到目前，包括Opdivo、Keytruda等PD-1抗体、以及Tecentirq(Atezolizumab)等PDL1抗体已经使得非常多的患者受益，但是应当指出，并非所有患者都响应PD-1/L1单抗疗法，其总体有效率在30％左右，仍有更多的患者无法从中受益。
由于PD-1受体胞外段或其变体受限于糖基化修饰的多样性，成药性不好，目前虽有PDL1抗体的报道以及相关产品，但均存在与肿瘤细胞表面的PDL1结合能力不太强的问题。
因此，亟需开发一种与PDL1具有更高亲和力的抗PDL1抗体。
发明内容
本公开旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本公开第一方面提供一种抗体或抗原结合片段，包括：
选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：
重链可变区CDR序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；
轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO：4、WAS、SEQ ID NO：5。
本公开提供的抗体或抗原结合片段含有上述特定的CDR序列，其能够与肿瘤细胞表面高表达的PDL1特异性结合，且具有较高的结合亲和力，从而阻断免疫细胞表面的PD-1与PDL1的相互作用，促进免疫细胞抗癌功能。
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体或抗原结合片段包括：
SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列，SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2，SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，WAS所示的轻链可变区CDR2，SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR3。
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体或抗原结合片段包括：
(a)具有SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的轻链可变区；
与(a)相比，序列同一性至少在80％的氨基酸序列；
(b)具有SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:9所示的轻链可变区；
与(b)相比，序列同一性至少在80％的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体或抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的重链可变区；和/或如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
在本公开的一些实施方案中，所述的抗体或抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:6所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区；或如SEQ ID NO:8所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
在本公开的一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
在本公开的一些实施方案中，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG抗体或其突变体或人源IgG抗体或其突变体。
在本公开的一些实施方案中，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG1抗体或其突变体或人源IgG1抗体或其突变体。
在本公开的一些实施方案中，所述重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连，所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的C端相连。
在本公开的一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12任一项所示氨基酸序列的重链和具有EQ ID NO:11、SEQ ID NO:13任一项所示氨基酸序列的轻链。
在本公开的一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链；所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链。
在本公开的一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗；所述单抗包括全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一；所述抗体或抗原结合片段能够结合SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
本公开第二方面提供一种双特异性结合分子，包括：第一结合区，所述第一结合区包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段；和第二结合区，所述第二结合区具有CD3结合活性。
在本公开的一些实施方案中，所述双特异性结合分子包括对称双特异性结合分子或不对称双特异性结合分子；所述双特异性结合分子为非对称双特异性结合分子。
在本公开的一些实施方案中，所述双特异性结合分子第一结合区包含肽链1和肽链2，其中，所述肽链1包括重链可变区SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8，所述肽链2包括轻链可变区SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9。
在本公开的一些实施方案中，所述第二结合区包括具有CD3结合活性的全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。
在本公开的一些实施方案中，所述第二结合区包括抗CD3单链抗体。
本公开提供的CD3×PDL1双特异抗体能够与肿瘤细胞有更强结合，促进T细胞发挥抗癌功能。
在本公开的一些实施方案中，所述抗CD3单链抗体包括抗CD3抗体重链可变区和抗CD3抗体轻链可变区，其中，所述抗CD3抗体重链可变区包括SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR1序列，SEQ ID NO:16所示的重链可变区CDR2，SEQ ID NO:17所示的重链可变区CDR3；所述抗CD3抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:18所示的轻链可变区CDR1，GTN所示的轻链可变区CDR2，SEQ ID NO:19所示的轻链可变区CDR3。
在本公开的一些实施方案中，所述抗CD3单链抗体包括SEQ ID NO:20所示的重链可变区和SEQ ID NO:21所示的轻链可变区。
在本公开的一些实施方案中，所述抗CD3单链抗体进一步包括连接肽，其中，所述连接肽的N端与所述抗CD3抗体重链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述抗CD3抗体轻链可变区的N端相连；或所述连接肽的N端与所述抗CD3抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述抗CD3抗体重链可变区的N端相连。
在本公开的一些实施方案中，所述连接肽具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在本公开的一些实施方案中，所述抗CD3单链抗体具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，所述第一结合区进一步包括第一重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述第一重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
在本公开的一些实施方案中，所述第一重链恒定区和轻链恒定区均来自人源IgG抗体或其突变体。
在本公开的一些实施方案中，所述第一重链恒定区和轻链恒定区均来自人源IgG1抗体或其突变体。
在本公开的一些实施方案中，所述第一重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连，所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的C端相连。
在本公开的一些实施方案中，所述肽链1具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列，所述肽链2具有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。
在本公开的一些实施方案中，所述肽链1和肽链2通过二硫键相连。
在本公开的一些实施方案中，所述第二结合区进一步包括第二重链恒定区，所述第二重链恒定区的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
在本公开的一些实施方案中，所述第二重链恒定区来自于人源IgG抗体或其突变体。
在本公开的一些实施方案中，所述第二重链恒定区来自于人源IgG1抗体或其突变体。
在本公开的一些实施方案中，所述第二重链恒定区的N端与所述抗CD3单链抗体的C端相连。
在本公开的一些实施方案中，所述第一重链恒定区和所述第二重链恒定区通过knob-into-hole结构进行连接。
本公开第三方面提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码第一方面所述的抗体或抗原结合片段或编码第二方面所述的双特异性结合分子。
本公开第四方面提供一种表达载体，该表达载体携带第三方面所述的多核苷酸。
本公开第五方面提供一种重组细胞，携带第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体或能够表达第一方面所述的抗体或抗原结合片段或编码第二方面所述的双特异性结合分子。
在本公开的一些实施方案中，所述重组细胞是通过将第四方面表达载体导入至宿主细胞中而获得的。
在本公开的一些实施方案中，所述重组细胞为真核细胞。
在本公开的一些实施方案中，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
本公开第六方面提供一种组合物，包括第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的双特异性结合分子、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞。
本公开第七方面提供一种制备第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的双特异性结合分子的方法，包括培养第五方面所述的重组细胞。
本公开第八方面提供一种药物，包括第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的双特异性结合分子、第三发明所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物。
本公开第九方面提供一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的双特异性结合分子、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞。
本公开第十方面提供第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的双特异性抗体、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗PDL1介导的相关疾病，包括癌症。
在本公开的一些实施方案中，所述癌症包括选自以下中的至少之一：
肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
本公开第十一方面提供第二方面所述的双特异性结合分子、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗PDL1和CD3介导的相关疾病。
在本公开的一些实施方案中，所述PDL1和CD3介导的相关疾病包括癌症。
在本公开的一些实施方案中，所述癌症包括下列中的至少之一：
肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
本公开第十二方面提供第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的双特异性抗体、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PDL1。
本公开第十三方面提供第二方面所述的双特异性结合分子、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PDL1和/或CD3。
利用本公开提供的CD3抗体与PD-1受体胞外段蛋白组成抗体-融合蛋白，桥联T细胞与PDL1阳性的肿瘤，能够促进T细胞杀伤肿瘤，即使肿瘤细胞低表达PDL1，T细胞仍能够促进肿瘤完全杀伤。
本公开第十四方面提供第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的双特异性抗体、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞、第六方面所述的组合物、第八方面所述的药物在预防或治疗疾病中的用途，所述疾病包括癌症，所述癌症的癌细胞表面PDL1呈阳性。
根据本公开的具体实施方案，所述癌症选自：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少之一。
本公开第十五方面提供一种治疗肿瘤的方法，包括向受试者施用以下中的至少之一：
第一方面所述的抗体或抗原结合片段、第二方面所述的双特异性抗体、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞、第六方面所述的组合物或第八方面所述的药物。
根据本公开的具体实施方案，所述肿瘤的肿瘤细胞表面PDL1呈阳性，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少之一。
本公开的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本公开的实践了解到。
附图说明
本公开的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本公开一个实施方案中的鼠源19B8抗体与人(左A)、食蟹猴PDL1(右B)蛋白结合的ELISA结果图；
图2为本公开一个实施方案中的鼠源19B8抗体阻断PD-1与PDL1结合的ELISA结果图；
图3为本公开一个实施方案中的鼠源19B8抗体与人肺癌A549细胞结合的流式细胞术结果图；
图4为本公开一个实施方案中的19B8嵌合抗体与人(左A)、食蟹猴PDL1(右B)蛋白结合的ELISA结果图；
图5为本公开一个实施方案中的19B8嵌合抗体阻断PD-1与PDL1结合的ELISA结果图；
图6为本公开一个实施方案中的19B8嵌合抗体与人黑色素瘤A375细胞(左A)、人肺癌A549细胞(右B)结合的流式细胞术结果图；
图7为本公开一个实施方案中的人源化19B8抗体阻断PD-1与PDL1结合的ELISA结果图；
图8为本公开一个实施方案中的人源化19B8抗体与人黑色素瘤A375细胞(左A)、人肺癌A549细胞(右B)结合的流式细胞术结果图；
图9为本公开一个实施方案中的人源化19B8抗体促进SEB诱导的人PBMC分泌IL-2结果图；
图10为本公开一个实施方案中的CD3×PDL1双特异抗体模式图；
图11为本公开一个实施方案中的CD3×PDL1双特异抗体结合PDL1融合蛋白的结果图；
图12为本公开一个实施方案中的CD3×PDL1双特异抗体阻断PD-1与PDL1结合的ELISA结果图；
图13为本公开一个实施方案中的CD3×PDL1双特异抗体促进PBMC杀伤人黑色素瘤A375细胞的结果图；
图14为本公开一个实施方案中的CD3×PDL1双特异抗体与人肺腺癌A549细胞结合的流式细胞术结果图；
图15为本公开一个实施方案中的CD3×PDL1双特异抗体促进PBMC杀伤人黑色素瘤A375细胞的结果图；
图16为本公开一个实施方案中的CD3×PDL1抗体促进PBMC重建小鼠抗癌的结果图。
发明详细描述
下面详细描述本公开的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本公开，而不能理解为对本公开的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本公开所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
本公开所述的抗体或抗原结合片段通常由生物合成的方法制备。根据本公开所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便地用各种已知方法制得本公开的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本公开的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本公开的编码核酸序列。其中，所述抗体或抗原片段是采用Kabat编号系统进行编号和定义的。在本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对人B7H6的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源B7H6抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
在本文中，术语“抗原结合片段”也即“抗体片段”，抗体片段通常是指抗原结合性抗体片段，可以包括完整抗体的一部分，一般是抗原结合区或可变区，抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv，双抗体，线性抗体，单链抗体分子等。
本文中，所述“单抗”是指具有单一抗原结合位点的抗体。
本文中，所述“双抗”是指具有两个不同抗原结合位点的抗体。
在本文中，术语“突变体”或“变体”可以指包含对任何天然存在的或工程化的分子进行包含一个或多个核苷酸或氨基酸突变获得的分子。
在本文中，术语“互补决定区”或“CDR”或“CDR序列”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸序列，例如，通常包括：轻链可变区中23-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，和重链可变区中31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近的氨基酸残基(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))；和/或来自“高变环”(例如，轻链可变区中26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变区中26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)附近的氨基酸残基(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
在本文中，术语“功能性片段”尤其是指抗体片段如Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半寿期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇，如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)。
在本文中，术语“嵌合抗体”是指利用重组DNA技术，将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区氨基酸序列替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区而获得的重组抗体。
在本文中，术语“人源化抗体”(humanized antibody)是指利用重组DNA技术，将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区和可变区的非CDR(Fv骨架区(FR))氨基酸序列全部替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列而获得的重组抗体。也即，一个抗体的恒定区被人源化时称为嵌合抗体，而恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列全部人源化后称为人源化抗体。
在本文中，所述“全长抗体”是由两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构，如免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白E(IgE)。同一类免疫球蛋白也可以根据氨基酸组成分为不同的亚类，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。免疫球蛋白轻链根据恒定区的不同分为κ链或者λ链。
在本文中，“knob into hole结构”为在抗体重链恒定区的CH3区形成钮(Knob)扣(hole)突变，便于重链咬合，形成异二聚体。
在本文中，术语“同一性”用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols in Molecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在不实质性影响抗体活性(保留至少95％的活性)的前提下，本领域技术人员可以对本公开的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本公开保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本公开所述变体序列可以与参比序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性(或同源性)。本公开所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本公开述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
抗PDL1抗体或抗原结合片段
根据本公开的具体实施方案，本公开提供一种能特异性识别PDL1的抗体(抗PDL1抗体)或抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO：4、WAS、SEQ ID NO：5。
CDR序列中的“WAS”是指氨基酸序列。
根据本公开一个具体的实施方案，所述抗PDL1抗体或抗原结合片段包括：
SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列，SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2，SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，WAS所示的轻链可变区CDR2，SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR3。
根据本公开一个具体的实施方案，所述抗PDL1抗体或抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的重链可变区；和/或
如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
根据本公开一个具体的实施方案，所述抗PDL1抗体或抗原结合片段包括：
如SEQ ID NO:6所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:8所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
根据本公开的具体实施方案，在不实质性影响抗体活性(保留至少95％的活性)的前提下，本领域技术人员可以对本公开的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本公开保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本公开所述变体的序列可以与参比序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性(或同源性)。本公开所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本公开述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。本领域技术人员应知的是，不同数据库分析出来的CDR序列可能不一样，但是这些变化均应包含在本公开的保护范围之内。
根据本公开的具体实施方案，本公开的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或可仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，或可以被修饰以影响功能。本公开包括具有修饰的糖基化模式的抗PDL1抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。经过一系列修饰后，本公开所述片段依旧具有具有PDL1结合活性，特别是特别是SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。优选地，所述功能性片段将由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于PDL1，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。
根据本公开的具体实施方案，为了进一步提高抗体的生物可接受性，本公开对抗体进行了人源化处理，人源化的方法可以参照常规的抗体工程技术进行，本公开提供的人源化抗体的重链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示，轻链可变区的序列如SEQ ID NO:9所示。
核酸分子、重组载体、重组细胞、免疫缀合物
在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。
因此，本公开还提供了编码上述抗体或其抗原结合片段的分离的核酸以及含有该核酸的重组载体和转化子。所述核酸分子编码上述所述的抗体或其抗原结合片段，所述核酸优选为基因工程手段获得的表达盒。
重组载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将所述核酸与商购的载体(如质粒或病毒载体)可操作地连接而获得，常用的质粒包括pSeTag2、PEE14、pMH3等。
在一些优选的实施方案中，所述核酸分子经过种属优化，更易在哺乳动物细胞中表达。
本公开还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的核酸分子。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。
本公开还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本公开提供的抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。本公开所述宿主细胞可以为原核宿主细胞、真核宿主细胞或噬菌体。所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方式中，本公开所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞。
本公开提供的免疫缀合物含有治疗剂以及与治疗剂偶联的如前所述的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段与治疗剂偶联的方式可以为常规的方式。
本公开提供的组合物含有如前所述的抗体或其抗原结合片段、和/或上述免疫缀合物、以及药学上可接受的载体。在某些实施方式中，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本公开的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
药物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途
本公开还提供了一种药物，所述药物包括上述抗体或者其抗原结合片段和药学可接受的载体，还可以包括上述免疫缀合物、核酸分子、表达载体、重组细胞。
在一些实施例中，这些药物组合物进一步包括药学上可接受的载体，包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、或其他液体赋形剂、分散剂、矫味剂或悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、助流剂或润滑剂，等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
本公开的组合物也可以相互组合、或与一种或多种其它的治疗化合物组合地给药，例如，与化疗剂组合给药。因此，所述组合物还可以含有化疗剂。本公开的抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物还可以与第二治疗剂组合，所述第二治疗剂的示例性试剂包括但不限于抑制PDL1活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰PDL1上游或下游信号转导的试剂。
通常，所述抗体或其抗原结合片段以有效量给药，即足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，引起与被治疗的疾病相关的症状的预防或缓解的量，所述疾病例如与PDL1相关的疾病。给药至受试者的组合物的有效量将取决于疾病的类型和严重度，以及取决于个体的特征，例如一般健康状态、年龄、性别、体重和对药物的耐受性；还将取决于疾病的严重程度和类型，本领域技术人员将能够根据这些因素等确定合适的剂量。
在本公开的一些实施方案中，本公开提供的用于检测样品中PDL1的试剂盒含有如上所述的抗体或其抗原结合片段，药学可接受的载体，免疫缀合物、核酸分子、表达载体、重组细胞。在一些实施方案中，所述样品可以为患有PDL1介导的疾病的患者(特别是移植排斥、自身免疫病、感染性疾病或癌症患者，更优选是患有肺癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少一种的患者)的组织。所述试剂盒还可以包括常规用于检测PDL1的试剂，如包被液等。
本公开还提供了所述的抗体或其抗原结合片段，药学可接受的载体，免疫缀合物、核酸分子、表达载体、重组细胞。在制备用于预防和/或治疗PDL1介导的疾病的药物中的用途。优选地，所述PDL1介导的疾病为移植排斥、自身免疫病、感染性疾病或癌症。更优选地，所述癌症为表达PDL1的癌症。进一步优选地，所述癌症为肺癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少一种。进一步优选地，所述感染性疾病包括但不限于HIV病毒感染和/或乙型肝炎病毒感染。
本公开还涉及一种预防和/或治疗PDL1介导的疾病(如前所述)的方法，该方法包括：将有效量的本公开的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物和组合物中的至少一种给药至患者。其中，给药的方式可以为口服给药、经鼻给药、皮内给药、皮下给药、肌内给药或静脉给药或腹腔内给药。
编码本公开的抗体的重链和/或轻链的核酸在本公开的范围内，根据重链和/或轻链的氨基酸序列，本领域技术人员能够很容易得到相应的核酸序列，如表1所示。
表1




下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1抗体的制备
生成针对人PDL1的鼠源单克隆抗体，用纯化的重组PDL1胞外区Strep tag标签融合蛋白(PDL1-strep)作为抗原，免疫C57BL/6小鼠(9周龄，购自上海莱斯克，体重20g左右)。
免疫小鼠使用纯化抗原和完全弗氏佐剂进行3次免疫，通过尾静脉放血后检测免疫应答。通过ELISA、流式细胞术筛选血清，获取有抗人PDL1免疫球蛋白的小鼠。并对有最高的抗PDL1免疫球蛋白的小鼠取出脾细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(ATCC编号CRL-1581)进行融合。融合后的杂交瘤细胞进行抗体筛选，得到鼠单抗。
将候选杂交瘤细胞总数量培养到106个，800rpm离心10分钟收集细胞，并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA；以总RNA为模板，逆转录合成cDNA文库(Invitrogen)，又以cDNA为模板PCR扩增杂交瘤细胞的所对应的可变区核酸序列。PCR扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区或信号肽区和恒定区互补(Larrick，J.W.，et al.，(1990)Scand.J.Immunol.，32，121-128和Coloma，J.J.et al.，(1991)BioTechniques，11，152-156)。在50μl反应体系中，分别加入cDNA 2μl，10×PCR缓冲液5μl，上 游及下游引物2μl(5μmol)，dNTP 2μl，Taq酶1μl(Takara，Ex Taq)，H2O 38μl；95℃预变性5min，进入温度循环，进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性30S，58℃退火45S，72℃延伸50S，共32个循环，然后72℃延长7min。将扩增产物测序后，得到鼠单抗的重链和轻链可变区序列。
重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：
轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：
实施例2 PDL1抗体ELISA结合实验
ELISA实验被用于检测PDL1抗体的结合特性。PDL1胞外区蛋白包被到96孔板中，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和PDL1的结合特性。
抗体生产：分别将上述抗体的重链和轻链核苷酸序列的pcDNA3.4载体(南京金斯瑞合成，鼠源19B8重链即19B8-mIgG1(氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示)、鼠源h19B8轻链即19B8-mK(氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)瞬时转染ExpiCHO-S细胞(Gibco，货号A29127)来制备抗体。
转染前一天，将ExpiCHO-S细胞调整细胞密度为(3～4)×106/mL，在37℃、8％CO2和95rpm条件下摇动培养过夜。转染当天，细胞生长到7×106～1×107/mL，存活率大于95％时准备转染，使用新鲜预热的ExpiCHO培养基(Gibco，货号A2910002)将细胞稀释到6×106/mL，将上述携带有重链和轻链的pcDNA3.4质粒(轻重链质粒配比1：1)和ExpiFectamine CHO转染试剂(Gibco，货号A29129)转染到ExpiCHO-S细胞中，在37℃、8％CO2和95rpm条件下摇动培养。转染后18-22h，将ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHO Feed混匀后立即加入转染后细胞，混匀，于32℃、5％CO2和95rpm条件下摇动培养。转染后第5天，向细胞中再补加8mL ExpiCHO Feed，混匀后继续培养。每日观察细胞数和细胞活率变化，待细胞活率下降至80％以下或培养10～14天后离心收获细胞。表达的上清用0.45μm滤膜过滤，利用Mabselect prism Aprotein A亲和层析柱(购自苏州纳微)从表达上清中捕获带有Fc结构域的抗体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡层析柱后，上清过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸，pH2.7)洗脱，最后用PBS缓冲液浓缩置换，纯化后的抗体通过SDS-PAGE鉴定纯度在95％以上，结果显示最终获得了上述抗体。
用PBS缓冲液将人PDL1-Fc融合蛋白(购自Acro)或猴PDL1-His tag蛋白(购自Acro)稀释为1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2PBS含0.1％Tween20)缓冲液洗板6次后，加入200μl/孔PBS/10％BSA，37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μl/孔用PBST/0.05％BSA稀释至合适浓度的待测鼠源PDL1抗体19B8，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μl/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠IgG抗体二抗，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μl/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μl/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图1所示，表明本公开的PDL1抗体能够结合人、猴PDL1蛋白。
实施例3：鼠源PDL1抗体阻断活性检测实验
ELISA实验被用于检测抗体对PDL1与其受体PD-1结合的影响，具体实验如下：
用PBS缓冲液将PDL1-Fc融合蛋白(购自Acro)稀释为5μg/mL，以100μL/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2PBS含0.1％Tween 20)缓冲液洗板6次后，加入200μL/孔PBS/10％BSA，于37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释至不同浓度的19B8抗体、稀释至2μg/ml的PD-1-Avi tag(购自Acro)，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的Strreptavidin二抗(购自Southern biotech)，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μL/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸终止反应，其中，以mIgG(购自Biolegend)为对照。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图2所示，表明本公开的鼠源PDL1抗体(19B8)能够阻断PDL1与其受体PD-1的结合。
实施例4：鼠源PDL1抗体流式细胞术结合实验
用PBS将人肺腺癌A549细胞稀释为1×106/mL，以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管山羊血清，于4℃封闭30min。加入不同浓度的19B8抗体(重链氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNO:11所示)，于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、3500rpm×5min离心，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向其中加入1μL/管Alexa-647标记的山羊抗小鼠抗体二抗(Biolegend)，于4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，结果如图3所示，进一步显示本公开的鼠源PDL1抗体能够结合肿瘤细胞表面的PDL1。
实施例5：人鼠嵌合PDL1抗体ELISA结合实验
ELISA实验被用于检测PDL1抗体的结合特性。PDL1胞外区蛋白包被到96孔板中，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和PDL1的结合特性。
抗体生产：分别将上述抗体的重链和轻链核苷酸序列的pcDNA3.4载体(南京金斯瑞合成，鼠源19B8重链hIgG1LALA即19B8-hIgG1LALA(氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示)、鼠源h19B8轻链hK即19B8-hK(氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示)、全人源12A4抗体重链12A4-hIgG1LALA(氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示)、全人源12A4抗体轻链12A4-hK(氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示)瞬时转染ExpiCHO-S细胞(Gibco，货号A29127)来制备抗体。

转染前一天，将ExpiCHO-S细胞调整细胞密度为(3～4)×106/mL，在37℃、8％CO2和95rpm条件下摇动培养过夜。转染当天，细胞生长到7×106～1×107/mL，存活率大于95％时准备转染，使用新鲜预热的ExpiCHO培养基(Gibco，货号A2910002)将细胞稀释到6×106/mL，将上述携带有重链和轻链的pcDNA3.4质粒(轻重链质粒配比1：1)和ExpiFectamine CHO转染试剂(Gibco，货号A29129)转染到ExpiCHO-S细胞中，在37℃、8％CO2和95rpm条件下摇动培养。转染后18-22h，将ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHO Feed混匀后立即加入转染后细胞，混匀，于32℃、5％CO2和95rpm条件下摇动培养。转染后第5天，向细胞中再补加8mL ExpiCHO Feed，混匀后继续培养。每日观察细胞数和细胞活率变化，待细胞活率下降至80％以下或培养10～14天后离心收获细胞。表达的上清用0.45μm滤膜过滤，利用Mabselect prism Aprotein A亲和层析柱(购自苏州纳微)从表达上清中捕获带有Fc结构域的抗体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡层析柱后，上清过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸，pH2.7)洗脱，最后用PBS缓冲液浓缩置换，纯化后的抗体通过SDS-PAGE鉴定纯度在95％以上，结果显示最终获得了上述抗体。
用PBS缓冲液将人PDL1-Fc融合蛋白(购自Acro)或猴PDL1-His tag融合蛋白(购自Acro)稀释为1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2PBS含0.1％Tween20)缓冲液洗板6次后，加入200μl/孔PBS/10％BSA，37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μl/孔用PBST/0.05％BSA稀释至合适浓度的待测嵌合抗体19B8-hIgGLALA、对照抗体12A4-hIgG1LALA，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μl/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗人IgG-Fab抗体二抗，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μl/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μl/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图4，表明本公开的嵌合抗体19B8-hIgG1LALA能够结合人、猴PDL1蛋白。
实施例6：人鼠嵌合PDL1抗体阻断活性检测实验
ELISA实验被用于检测嵌合抗体对PDL1与其受体PD-1结合的影响，具体实验如下：
用PBS缓冲液将PDL1-Fc融合蛋白(购自Acro)稀释为5μg/mL，以100μL/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2PBS含0.1％Tween20)缓冲液洗板6次后，加入200μL/孔PBS/10％BSA，于37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释至不同浓度的19B8-hIgG1LALA抗体或12A4-hIgG1LALA抗体、2μg/ml的PD-1-Avi tag蛋白(购自Acro)，并加入100μL/孔用PBST/0.05％BSA，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的Strreptavidin二抗(购自Southern biotech)，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μL/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸终止反应，其中，以mIgG(购自Biolegend)为对照。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图5显示，表明本公开的嵌合抗体19B8-hIgG1LALA能够阻断PDL1与其受体PD-1的结合。
实施例7：人鼠嵌合PDL1抗体流式细胞术结合实验
用PBS将人黑色素瘤A375细胞、人肺腺癌A549细胞分别稀释为1×106/mL，以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管大鼠血清，于4℃封闭30min。加入不同浓度的嵌合抗体19B8-hIgG1LALA或对照抗体12A4-hIgG1LALA，于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、3500rpm×5min离心，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向其中加入1μL/管Alexa-647标记的大鼠抗人抗体二抗(Biolegend)，于4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，结果如图6所示，进一步显示本公开的嵌合抗体能够结合肿瘤细胞表面PDL1蛋白，并且其结合强于对照抗体12A4。
实施例8：小鼠抗体人源化实验
参照PDL1抗体轻链可变区序列和重链可变区序列，选取与其非CDR区匹配最好的人源化模板。将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人源模板的CDR区，得到人源化的抗体。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，得到人源化之后的抗体，人源化PDL1抗体重链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:9所示。
实施例9：人源化PDL1抗体阻断活性检测实验
ELISA实验被用于检测抗体对PDL1与其受体PD-1结合的影响，具体实验如下：
抗体生产：分别将上述抗体的重链和轻链核苷酸序列的pcDNA3.4载体(南京金斯瑞合成，人源化19B8重链hIgG1LALA即h19B8-hIgG1LALA(氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示)、人源化h19B8轻链hK即h19B8-hK(氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示)瞬时转染ExpiCHO-S细胞(Gibco，货号A29127)来制备抗体。
转染前一天，将ExpiCHO-S细胞调整细胞密度为(3～4)×106/mL，在37℃、8％CO2和95rpm条件下摇动培养过夜。转染当天，细胞生长到7×106～1×107/mL，存活率大于95％时准备转染，使用新鲜预热的ExpiCHO培养基(Gibco，货号A2910002)将细胞稀释到6×106/mL，将上述携带有重链和轻链的pcDNA3.4质粒(轻重链质粒配比1：1)和ExpiFectamine CHO转染试剂(Gibco，货号A29129)转染到ExpiCHO-S细胞中，在37℃、8％CO2和95rpm条件下摇动培养。转染后18-22h，将ExpiFectamine CHO Enhancer和ExpiCHO Feed混匀后立即加入转染后细胞，混匀，于32℃、5％CO2和95rpm条件下摇动培养。转染后第5天，向细胞中再补加8mL ExpiCHO Feed，混匀后继续培养。每日观察细胞数和细胞活率变化，待细胞活率下降至80％以下或培养10～14天后离心收获细胞。表达的上清用0.45μm滤膜过滤，利用Mabselect prism Aprotein A亲和层析柱(购自苏州纳微)从表达上清中捕获带有Fc结构域的抗体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液平衡层析柱后，上清过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸，pH2.7)洗脱，最后用PBS缓冲液浓缩置换，纯化后的抗体通过SDS-PAGE鉴定纯度在95％以上，结果显示最终获得了上述抗体。
用PBS缓冲液将PDL1-Fc融合蛋白(购自Acro)稀释为5μg/mL，以100μL/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2PBS含0.1％Tween20)缓冲液洗板6次后，加入200μL/孔PBS/10％BSA，于37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释至合适浓度的待测人源化PDL1抗体h19B8-hIgG1LALA或对照抗体12A4-hIgG1LALA、Atezulizumab类似物(购自百英生物)、2μg/mL PD-1-Avi tag(购自Acro)，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的Strreptavidin二抗(购自Southern biotech)，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μL/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸终止反应，其中，以mIgG(购自Biolegend)为对照。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图7显示，表明本公开的人源化PDL1抗体h19B8能够阻断PDL1与其受体PD-1的结合，并且阻断能力与12A4、Atezulizumab类似物相当。
实施例10：人源化PDL1抗体流式细胞术结合实验
用PBS将人黑色素瘤A375细胞、人肺腺癌A549细胞分别稀释为1×106/mL，以100μL/管的体积加 于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管大鼠血清，于4℃封闭30min。加入不同浓度的人源化抗体h19B8-hIgG1LALA(重链和轻链如SEQ ID NO:12-13所示)或对照抗体12A4-hIgG1LALA、Atezulizumab类似物(购自百英生物)，于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、3500rpm×5min离心，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向其中加入1μL/管Alexa-647标记的大鼠抗人抗体二抗(Biolegend)，于4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，结果如图8所示，进一步显示本公开的嵌合抗体能够结合肿瘤细胞表面PDL1蛋白，并且其结合强于对照抗体12A4、Atezulizumab类似物。
实施例11：人源化PDL1抗体促进SEB诱导的人PBMC分泌IL-2
用完全RPMI-1640培养基将人PBMC细胞稀释为2×106/mL，以100μL/孔的体积加于96孔板中，向其中加入50μL/孔不同浓度的人源化抗体h19B8-hIgG1LALA或Atezulizumab类似物，于4℃封闭30min。加入不同浓度的人源化抗体h19B8-hIgG1LALA(SEQ ID NO:12-13所示)或对照抗体Atezulizumab类似物(购自百英生物)，加入50μL/孔0.4μg/ml的SEB，于37℃，5％CO2培养箱培养72h。利用人IL-2ELISA检测试剂盒检测培养上清中IL-2含量。结果如图9所示，进一步显示本公开的人源化PDL1抗体能够促进PBMC分泌IL-2(其中图A和图B中PBMC细胞来自于不同的人类个体)，并且促进能力与Atezulizumab类似物相当或略优。
实施例12：CD3×PDL1抗体ELISA结合实验
ELISA实验被用于检测PDL1抗体的结合特性。PDL1胞外区融合蛋白包被到96孔板中，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和PDL1的结合特性。
用PBS缓冲液将PDL1-Fc融合蛋白稀释为1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2PBS含0.1％Tween20)缓冲液洗板6次后，加入200μl/孔PBS/10％BSA，37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μl/孔用PBST/0.05％BSA稀释至合适浓度的待测人源化抗体h19B8-hIgG1LALA、双特异抗体CD3×h19B8，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μl/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗人IgG-Fab抗体二抗，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μl/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μl/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。图10展示了本公开中的CD3×PDL1双特异抗体的几种连接方式，图11表明本公开的CD3×h19B8抗体能够结合PDL1蛋白，结合能力稍弱于h19B8单抗。
本公开的实施例中所用的CD3×h19B8抗体(模式图如图10所示)、CD3×12A4抗体的具体序列信息，如表2所示。
表2
实施例13：CD3×PDL1抗体阻断活性检测实验
ELISA实验被用于检测抗体对PDL1与其受体PD-1结合的影响，具体实验如下：
用PBS缓冲液将PDL1-Fc融合蛋白(购自Acro)稀释为5μg/mL，以100μL/孔的体积加于96孔板 中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2PBS含0.1％Tween20)缓冲液洗板6次后，加入200μL/孔PBS/10％BSA，于37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释至合适浓度的待测人源化抗体h19B8-hIgG1LALA或双特异抗体CD3×h19B8、2μg/mL PD-1-Avi tag(购自Acro)，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的Strreptavidin二抗(购自Southern biotech)，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μL/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图12显示，表明本公开的双特异抗体CD3×h19B8能够阻断PDL1与其受体PD-1的结合，并且阻断能力与对照Atezulizumab相比稍弱。
实施例14:CD3×PDL1抗体促进PBMC杀伤肿瘤细胞
本实施例检测双特异性抗体对PBMC杀伤。
(1)按照50μL/孔的体积向16孔RTCA板中加入完全RPMI-1640培养基，上机校准；
(2)用完全RPMI-1640培养基将人肺腺癌A375细胞稀释为2×105/mL，按照50μL/孔的体积分别单独添加至加入步骤(1)获得的RTCA板中，然后于37℃、，5％CO2条件下使用xCELLigence RTCA MP设备检测细胞系数24h；
(3)用完全RPMI-1640培养基将双特异抗体稀释为一系列浓度梯度，加入步骤(2)获得的RTCA板中，添加体积为20μL/孔；
(4)用完全RPMI-1640培养基将PBMC(赛笠生物)稀释为1.25×106个/mL，加入步骤(3)获得的RTCA板中，添加体积为80μL/孔；
(5)将步骤(4)获得的反应体系于37℃，5％CO2使用xCELLigence RTCA MP设备检测细胞系数24h。
具体的实验结果如图13所示，进一步显示本公开的CD3×h19B8(a)双特异抗体能够促进PBMC杀伤A375肿瘤细胞，并且其促杀伤能力优于(b)和(c)构型。
实施例15：CD3×PDL1抗体流式细胞术结合实验
用PBS将人肺腺癌A549细胞分别稀释为1×106/mL，以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管大鼠血清，于4℃封闭30min。加入不同浓度的双特异抗体CD3×h19B8或对照抗体CD3×12A4，于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、3500rpm×5min离心，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向其中加入1μL/管Alexa-647标记的大鼠抗人抗体二抗(Biolegend)，于4℃避光孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，结果如图14所示，进一步显示本公开的双特异抗体CD3×h19B8能够结合肿瘤细胞表面PDL1蛋白，并且其结合强于对照抗体CD3×12A4。
实施例16:CD3×PDL1抗体促进PBMC杀伤肿瘤细胞
本实施例检测双特异性抗体对PBMC杀伤。
(1)按照50μL/孔的体积向16孔RTCA板中加入完全RPMI-1640培养基，上机校准；
(2)用完全RPMI-1640培养基将人肺腺癌A375细胞稀释为2×105/mL，按照50μL/孔的体积分别单独添加至加入步骤(1)获得的RTCA板中，然后于37℃、，5％CO2条件下使用xCELLigence RTCA MP设备检测细胞系数24h；
(3)用完全RPMI-1640培养基将双特异抗体稀释为一系列浓度梯度，加入步骤(2)获得的RTCA板中，添加体积为20μL/孔；
(4)用完全RPMI-1640培养基将PBMC(赛笠生物)稀释为1.25×106个/mL，加入步骤(3)获得的RTCA板中，添加体积为80μL/孔；
(5)将步骤(4)获得的反应体系于37℃，5％CO2使用xCELLigence RTCA MP设备检测细胞系数24h。
具体的实验结果如图15所示，进一步显示本公开的CD3×h19B8双特异抗体能够促进PBMC杀伤A375肿瘤细胞，并且其促杀伤能力与对照抗体CD3×12A4相当或略优。
实施例17：CD3×PDL1抗体对小鼠抗癌的影响
体内药效实验，用于检测所述双特异抗体CD3×h19B8促进免疫重建小鼠抗癌功能。
(1)在第-4天，将人PBMC尾静脉转输给NCG小鼠(购自集萃药康)，1E7/只；
(2)第0天，NCG小鼠右腹侧皮下荷瘤，每只鼠注射1×106个人黑色素瘤A375细胞；
(2)于第8、11、14、17天，为小鼠尾静脉注射所述CD3×h19B8(a)抗体，每只鼠25μg；
(3)注射上述抗体后每3天测量一次肿瘤体积。
结果如图16所示，可以看出，本公开的CD3×h19B8双特异抗体可以有效抑制肿瘤的生长，具有抗癌功能。
从以上实验结果可以看出，本公开的PDL1抗体具有以下特性：与肿瘤细胞有更强的结合能力；能够与人及猴PDL1结合；能够阻断PDL1与其受体PD-1的结合；能够促进免疫细胞抗癌功能。
本公开提供了一种PDL1抗体(h19B8)，与抗体12A4及Atezolizumab相比，该抗体与肿瘤细胞表面的PDL1结合更强。并且，当重组表达为CD3×PDL1双特异抗体后，本公开的CD3×h19B8抗体与CD3×12A4抗体相比，也具有更加强烈的结合能力，提示该双特异抗体具有更强的肿瘤识别，进而诱导更强的T细胞杀伤。本公开也比较了不同结构的CD3×PDL1抗体的功能活性，获得了具有更强功能活性的双特异抗体。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本公开的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本公开的限制，本领域的普通技术人员在本公开的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (59)

  1. 一种抗体或抗原结合片段，其中，包括：
    选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：
    重链可变区CDR序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3；
    轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO：4、WAS、SEQ ID NO：5。
  2. 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，包括：
    SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1序列，SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2，SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，WAS所示的轻链可变区CDR2，SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR3。
  3. 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，包括下列至少之一：
    (a)具有SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的轻链可变区；
    与(a)相比，序列同一性至少在80％的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，包括下列至少之一：
    (b)具有SEQ ID NO:8所示的重链可变区和SEQ ID NO:9所示的轻链可变区；
    与(b)相比，序列同一性至少在80％的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，包括:
    如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的重链可变区；和/或
    如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
  6. 根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其中，包括:
    如SEQ ID NO:6所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区；或
    如SEQ ID NO:8所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:9所示的轻链可变区。
  7. 根据权利要求1～6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
  8. 根据权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG抗体或其突变体或人源IgG抗体或其突变体。
  9. 根据权利要求1～7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于鼠源IgG1抗体或其突变体或人源IgG1抗体或其突变体。
  10. 根据权利要求1～8中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连，所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的C端相连。
  11. 根据权利要求1～10中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13任一项所示氨基酸序列的轻链。
  12. 根据权利要求1～11中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的轻链；
    所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链。
  13. 根据权利要求1～12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗。
  14. 根据权利要求1～13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述单抗包括全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。
  15. 根据权利要求1～13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段能够结合SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
  16. 一种双特异性结合分子，其中，包括：
    第一结合区，所述第一结合区包含权利要求1～15任一项所述的抗体或抗原结合片段；和
    第二结合区，所述第二结合区具有CD3结合活性。
  17. 根据权利要求16所述的双特异性结合分子，其中，所述双特异性结合分子包括对称双特异性结 合分子或不对称双特异性结合分子。
  18. 根据权利要求16或17所述的双特异性结合分子，其中，所述双特异性结合分子为非对称双特异性结合分子。
  19. 根据权利要求16～18中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第一结合区包含肽链1和肽链2，其中，所述肽链1包括权利要求1～15任一项中所述的重链可变区，所述肽链2包括权利要求1～15任一项中所述的轻链可变区。
  20. 根据权利要求16～19中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第二结合区包括具有CD3结合活性的全长抗体、Fv、单链抗体、Fab、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一。
  21. 根据权利要求16～20中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第二结合区包括抗CD3单链抗体。
  22. 根据权利要求16～21中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述抗CD3单链抗体包括抗CD3抗体重链可变区和抗CD3抗体轻链可变区，其中，所述抗CD3抗体重链可变区包括SEQ ID NO:15所示的重链可变区CDR1序列，SEQ ID NO:16所示的重链可变区CDR2，SEQ ID NO:17所示的重链可变区CDR3；
    所述抗CD3抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:18所示的轻链可变区CDR1，GTN所示的轻链可变区CDR2，SEQ ID NO:19所示的轻链可变区CDR3。
  23. 根据权利要求16～22中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述抗CD3单链抗体包括SEQ ID NO:20所示的重链可变区和SEQ ID NO:21所示的轻链可变区。
  24. 根据权利要求16～23中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述抗CD3单链抗体进一步包括连接肽，其中，所述连接肽的N端与所述抗CD3抗体重链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述抗CD3抗体轻链可变区的N端相连；或所述连接肽的N端与所述抗CD3抗体轻链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述抗CD3抗体重链可变区的N端相连。
  25. 根据权利要求16～24中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述连接肽具有氨基酸序列(GGGGS)n，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
  26. 根据权利要求16～25中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述抗CD3单链抗体具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
  27. 根据权利要求16～26中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第一结合区进一步包括第一重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述第一重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
  28. 根据权利要求16～27中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第一重链恒定区和轻链恒定区均来自人源IgG抗体或其突变体。
  29. 根据权利要求16～28中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第一重链恒定区和轻链恒定区均来自人源IgG1抗体或其突变体。
  30. 根据权利要求16～29中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第一重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连，所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的C端相连。
  31. 根据权利要求16～30中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述肽链1具有SEQ ID NO:12所示氨基酸序列，所述肽链2具有SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。
  32. 根据权利要求16～31中所述的双特异性结合分子，其中，所述肽链1和肽链2通过二硫键相连。
  33. 根据权利要求16～32中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第二结合区进一步包括第二重链恒定区，所述第二重链恒定区的至少一部分来自于人源抗体、灵长目源抗体和鼠源抗体或其突变体中的至少之一。
  34. 根据权利要求16～33中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第二重链恒定区来自于人源IgG抗体或其突变体。
  35. 根据权利要求16～34中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第二重链恒定区来自于人源IgG1抗体或其突变体。
  36. 根据权利要求16～35中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第二重链恒定区的N端与所述抗CD3单链抗体的C端相连。
  37. 根据权利要求16～36中任一项所述的双特异性结合分子，其中，所述第一重链恒定区和所述第二 重链恒定区通过knob-into-hole结构进行连接。
  38. 一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段或编码权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子。
  39. 一种表达载体，其中，携带权利要求38所述的多核苷酸。
  40. 一种重组细胞，其中，携带权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体或能够表达权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段或编码权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子。
  41. 根据权利要求40所述的重组细胞，其中，所述重组细胞是通过将权利要求39所述的表达载体导入至宿主细胞中而获得的。
  42. 根据权利要求41所述的重组细胞，其中，所述重组细胞为真核细胞。
  43. 根据权利要求41所述的重组细胞，其中，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
  44. 一种组合物，其中，包括权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子、权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体、权利要求40～43中任一项所述的重组细胞。
  45. 一种制备权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子的方法，其中，包括培养权利要求40～43中任一项所述的重组细胞。
  46. 一种药物，其中，包括权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子、权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体、权利要求40～43中任一项所述的重组细胞或权利要求44所述的组合物。
  47. 一种试剂盒，其中，所述试剂盒含有权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子、权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体、权利要求40～43中任一项所述的重组细胞。
  48. 权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子、权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体、权利要求40～43中任一项所述的重组细胞或权利要求47所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗PDL1介导的相关疾病。
  49. 根据权利要求48所述的用途，其中，所述PDL1介导的相关疾病包括癌症。
  50. 根据权利要求49所述的用途，其中，所述癌症包括选自以下中的至少之一：
    肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
  51. 权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子、权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体、权利要求40～43中任一项所述的重组细胞或权利要求47所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗PDL1和CD3介导的相关疾病。
  52. 根据权利要求51所述的用途，其中，所述PDL1和CD3介导的相关疾病包括癌症。
  53. 根据权利要求52所述的用途，其中，所述癌症包括下列中的至少之一：
    肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌。
  54. 权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子、权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体、权利要求40～43中任一项所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PDL1。
  55. 权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子、权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体、权利要求40～43中任一项所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PDL1和/或CD3。
  56. 权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子、权利要求38所述的多核苷酸、权利要求39所述的表达载体、权利要求40～43中任一项所述的重组细胞、权利要求44所述的组合物或权利要求46所述的药物在预防或治疗疾病中的用途，所述疾病包括癌症，所述癌症的癌细胞表面PDL1呈阳性。
  57. 根据权利要求56所述的用途，其中，所述癌症选自：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、 膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少之一。
  58. 一种预防或治疗肿瘤的方法，其中，包括向受试者施用以下中的至少之一：
    权利要求1～15中任一项所述的抗体或抗原结合片段；
    权利要求16～37中任一项所述的双特异性结合分子；
    权利要求38所述的多核苷酸；
    权利要求39所述的表达载体；
    权利要求40～43中任一项所述的重组细胞；
    权利要求44所述的组合物；
    权利要求46所述的药物。
  59. 根据权利要求58所述的方法，其中，所述肿瘤的肿瘤细胞表面PDL1呈阳性，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤、肾癌、胃癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少之一。
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