WO2024140939A2 - 含有治疗性抗体的药物制剂及其用途 - Google Patents

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李红俊
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Definitions

  • MASP-2 When MBL binds to pathogens, MASP-2 is activated, cleaving complement components C4 and C2 into C4a, C4b, C2a, and C2b, generating C3 convertase C4bC2b, followed by C3 being converted to C3b by C4bC2b, and finally forming a membrane attack complex (MAC) after C5 is converted to C5b by C3b.
  • MAC membrane attack complex
  • the activation of C3 ultimately leads to the formation of MAC, which then initiates a series of cascade activation processes of the downstream complement system, stimulating the innate immune response.
  • C4b can activate the generation of C4d.
  • the deposition of C4d may be a sign of complement activation.
  • the present invention provides a stable liquid drug formulation, characterized in that the drug is a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human MASP-2, and the formulation further comprises a buffer, a surfactant, and an excipient.
  • the buffer in the stable liquid pharmaceutical preparation comprises histidine and/or acetate buffer system;
  • the surfactant comprises polysorbate;
  • the excipient comprises sucrose, trehalose and/or proline; and
  • the pH value of the stable liquid pharmaceutical preparation is 4.7-6.1.
  • a stable liquid pharmaceutical formulation comprising: (a) a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human MASP-2; (b) a buffer comprising a histidine and/or acetate buffer system; (c) a surfactant comprising a polysorbate; and (d) an excipient comprising sucrose, trehalose and/or proline; wherein the pH of the formulation is 4.7-6.1.
  • the antibody concentration is 10 mg/ml ⁇ 1 mg/ml to 200 mg/ml ⁇ 20 mg/ml. In some embodiments, the antibody concentration is 20 mg/ml ⁇ 2 mg/ml. In some embodiments, the antibody concentration is 60 mg/ml ⁇ 6 mg/ml. In some embodiments, the antibody concentration is 100 mg/ml ⁇ 10 mg/ml. In some embodiments, the antibody concentration is 150 mg/ml ⁇ 15 mg/ml. In some embodiments, the antibody concentration is about 20 mg/ml to about 100 mg/ml.
  • the buffer comprises acetic acid and its concentration is 5 mM ⁇ 1 mM to 20 mM ⁇ 4 mM. In some cases, the acetate buffer concentration is 10 mM ⁇ 1 mM. In some embodiments, the acetate buffer comprises acetic acid and sodium acetate trihydrate.
  • liquid antibody formulation of the present invention comprises:
  • the pH is 5.3 ⁇ 0.5.
  • liquid antibody formulation of the present invention comprises:
  • the viscosity of the liquid preparation at 4-40°C is about 5.0 centipoise-7.0 centipoise. In one embodiment, the viscosity of the liquid preparation at 4-40°C is about 6.8 centipoise. In one embodiment, the viscosity of the liquid preparation at 25°C is about 6.8 centipoise.
  • the preparation can be tested for appearance, visible foreign matter, protein content, monomer purity, and/or electrical
  • the stability of the preparation after storage can be indicated by changes in the load variants.
  • the stability of the liquid preparation of the present invention can be detected in a forced experiment of high temperature stress, such as after storage at 40°C ⁇ 2°C for at least 1 week, 2 weeks or preferably 1 month, or in an accelerated experiment, such as after storage at 25°C ⁇ 2°C for at least 1 month or 2 months, or in a long-term experiment, such as after storage at 5°C ⁇ 3°C for at least 6 months or 12 months.
  • the stability is, for example, manifested as a purity of antibody monomers in a dissolved state exceeding 95%, preferably 98%, and more preferably 99%.
  • the preparation has a purity of greater than 90% antibody monomer, preferably greater than 92%, 94%, 96%, 98%, as measured by a reducing or non-reducing CE-SDS method (e.g., non-reducing CE-SDS);
  • the drug formulation comprises: (a) 20 mg/ml ⁇ 2 mg/ml antibody, (b) 0.175 mg/ml L-histidine, (c) 1.86 mg/ml L-histidine monohydrochloride monohydrate, (d) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (e) 8.6% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the pharmaceutical formulation comprises: (a) 150 mg/ml ⁇ 15 mg/ml antibody, (b) a buffer comprising 10 mM ⁇ 1 mM histidine buffer system, (c) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (d) 7.0% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the drug formulation comprises: (a) 150 mg/ml ⁇ 15 mg/ml antibody, (b) 0.175 mg/ml L-histidine, (c) 1.86 mg/ml L-histidine monohydrochloride monohydrate, (d) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (e) 7.0% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the polysorbate may be polysorbate 80 or polysorbate 20, with polysorbate 80 being preferred.
  • the invention provides anti-MASP-2 antibodies or antibody fragments (preferably antigen-binding fragments) that bind to MASP-2 or a fragment thereof (preferably a human MASP-2 protein).
  • the present invention provides novel monoclonal anti-MASP-2 antibodies and fragments thereof.
  • a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of DYYIN (SEQ ID NO: 1),
  • a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of WIFPGSX1SX2YX3X4X5X6FX7X8 (SEQ ID NO: 2 ) , and
  • a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of GDRSGPFX 9 Y (SEQ ID NO: 3);
  • a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of KSSQSLLYSNGKTYLN (SEQ ID NO: 4),
  • a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of LVSKLDS (SEQ ID NO:5), and
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and/or
  • a heavy chain CDR2 comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 and SEQ ID NO:10, and/or
  • a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, and/or
  • a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, and/or
  • the invention provides an isolated antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:
  • a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
  • a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7
  • a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11
  • a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:8, and a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof further comprises:
  • a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13; or
  • a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:14.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:7, and a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:11, a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:13; or.
  • a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; or
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:18 or a sequence having at least 80% identity thereto;
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24, or a sequence that has at least 80% identity thereto; or
  • a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30, or a sequence having at least 80% identity.
  • the antibody or its antigen-binding fragment comprises a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 26 and/or a light chain variable region comprising an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 30.
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:20, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30;
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:22, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:28;
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30;
  • the heavy chain constant region comprises one or more amino acid substitutions at amino acid residues 252, 254 or 256 relative to a wild-type human IgG constant region, and optionally, the amino acid substitution at amino acid residue 252 is substituted by tyrosine, the amino acid substitution at amino acid residue 254 is substituted by threonine, and the amino acid substitution at amino acid residue 256 is substituted by glutamic acid.
  • the heavy chain constant region comprises a sequence having at least 80% identity with a wild-type human IgG constant region amino acid sequence, and has amino acid residue 252 substituted by tyrosine, amino acid residue 254 substituted by threonine, and amino acid residue 256 substituted by glutamic acid relative to a wild-type human IgG constant region.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to MASP-2 and does not cross-react with C1s, C1r, MASP1, or MASP3.
  • the present invention further provides a method for treating or preventing a condition or disease associated with abnormal (e.g., elevated) serum C4 levels, comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein, or an antibody pharmaceutical preparation of the present invention, or a pharmaceutical composition, kit or unit dosage form of the present invention, thereby treating the condition or disease.
  • a condition or disease associated with abnormal (e.g., elevated) serum C4 levels comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein, or an antibody pharmaceutical preparation of the present invention, or a pharmaceutical composition, kit or unit dosage form of the present invention, thereby treating the condition or disease.
  • the method further comprises administering a second therapeutic agent.
  • the nervous system disease or injury includes multiple sclerosis, myasthenia gravis, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Guillain-Barre syndrome, reperfusion following stroke, degenerative disc, brain trauma, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Miller-Fisher syndrome, brain trauma and/or hemorrhage, demyelination and meningitis.
  • the therapeutic methods of the present invention comprise administering to an individual any formulation, pharmaceutical composition or unit dosage form comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human MASP-2 as described herein.
  • the individual to whom the pharmaceutical formulation is administered can be, for example, any human or non-human animal in need of such treatment.
  • the invention provides a nucleic acid encoding any of the above anti-MASP-2 antibodies or fragments thereof.
  • a vector comprising the nucleic acid is provided.
  • the vector is an expression vector.
  • a host cell comprising the vector is provided.
  • the host cell is eukaryotic.
  • the host cell is selected from a yeast cell, a mammalian cell, or other cells suitable for the preparation of antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the host cell is prokaryotic.
  • Figures 21-23 relate to the experimental results of the F12-F20 formulations used to screen the optimal pH value of the formulation after being placed at high temperature 40°C for 14 days.
  • Figure 21 shows the results of the HMW% detection by SEC for the nine formulations.
  • Figure 22 shows the results of the LMW% detection by NR CE-SDS for the nine formulations.
  • Figure 23 shows the results of the percentage of the main peak, acidic peak and basic peak detected by CEX for the nine formulations.
  • the vector provided by the present invention contains a nucleic acid sequence encoding an antibody or an antigen-binding fragment thereof provided herein, at least one promoter (e.g., SV40, CMV, EF-1 ⁇ ) operably linked to the nucleic acid sequence, and at least one selection marker.
  • a promoter e.g., SV40, CMV, EF-1 ⁇
  • the amount of antibody or antigen-binding fragment thereof contained in the pharmaceutical formulation of the present invention can vary depending on the specific characteristics desired for the formulation and the specific circumstances and purposes for which the formulation is intended to be used.
  • the pharmaceutical formulation may contain about 0.1 mg/mL to about 500 mg/mL of antibody; about 0.5 mg/mL to about 400 mg/mL of antibody; about 1 mg/mL to about 200 mg/mL of antibody; about 2 mg/mL to about 100 mg/mL; about 1 mg/mL to about 5 mg/mL of antibody; about 10 mg/mL to about 30 mg/mL of antibody; about 75 mg/mL to about 125 mg/mL; about 5 mg/mL to about 50 mg/mL; or about 2 mg/mL to about 150 mg/mL of antibody.
  • the formulation of the present invention may be a liquid formulation comprising about 0.5 mg/mL; about 1 mg/mL; about 2 mg/mL; about 3 mg/mL; about 4 mg/mL; about 5 mg/mL; about 6 mg/mL; about 7 mg/mL; about 8 mg/mL; about 9 mg/mL; about 10 mg/mL; about 11 mg/mL; about 12 mg/mL; about 13 mg/mL; about 14 mg/mL; about 15 mg/mL; about 16 mg/mL; about 17 mg/mL; about 18 mg/mL.
  • the present invention includes antigen binding molecules that are bioequivalent to any of the exemplary antibodies described herein.
  • two antibodies are pharmaceutical equivalents or pharmaceutical substitutes that do not show significant differences in absorption rate and absorption extent when administered at the same dose (single dose or multiple doses) under similar experimental conditions, they are considered to be bioequivalent.
  • some antibodies are equivalent in terms of their absorption extent but not equivalent in terms of their absorption rate, they are considered to be equivalents or pharmaceutical substitutes, and they can still be considered to be bioequivalent, because the differences in such absorption rates are established and reflected in the label, and are not necessary for reaching effective in vivo drug concentrations when, for example, used for a long time, and are medically insignificant for the specific drug under study.
  • two antibodies are bioequivalent if there are no clinically meaningful differences in safety, purity, and potency.
  • two antibodies are bioequivalent if a patient can switch between the reference product and the biologic product one or more times without an increased risk of expected side effects, including clinically significant changes in immunogenicity or diminished effectiveness, compared to continued therapy without such switching.
  • Bioequivalence can be demonstrated by in vivo and in vitro methods.
  • Bioequivalence measurements include, for example, (a) in vivo tests in humans or other mammals, in which the concentration of the antibody or its metabolites in blood, plasma, serum or other biological fluids is measured over time; (b) in vitro tests that correlate with and reasonably predict the in vivo bioavailability data in humans; (c) in vivo tests in humans or other mammals, in which the appropriate acute pharmacological effects of the antibody (or its target) are measured over time; and (d) well-controlled clinical trials that establish the safety, efficacy or bioavailability or bioequivalence of the antigen binding protein.
  • the pharmaceutical formulations of the present invention comprise one or more excipients.
  • excipient means any non-therapeutic agent added to a formulation to provide the desired consistency, viscosity and/or stabilizing effect.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention has a viscosity of less than 30cP, which is conducive to delivering the composition from a pre-filled syringe or an automatic syringe.
  • the stable liquid preparation of the present invention has a viscosity of about 1.0cP-30cP.
  • the viscosity of the pharmaceutical preparation at 25°C is less than 28cP, less than 25cP, less than 23cP, less than 20cP, less than 18cP, less than 15cP, less than 13cP, less than 10cP, less than 7cP or less than 5cP, for example, about 1.0cP-10cP.
  • the viscosity of the liquid preparation at 25°C is about 1.0cP-20cP. In some embodiments, when measured using DLS, the viscosity of the pharmaceutical preparation at 25°C at an antibody concentration of up to 150mg/ml is less than 15cP. In one embodiment, the viscosity of the liquid preparation at 25°C is about 1.0cP-10cP. In one embodiment, the viscosity of the liquid formulation at 25°C is about 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 or 10.0 cP. In some embodiments, the viscosity of the pharmaceutical formulation at 25°C at an antibody concentration of up to 150 mg/ml is less than 7 cP when measured using DLS.
  • the viscosity of the liquid formulation at 4-40°C is about 5.0 cP-7.0 cP. In one embodiment, the viscosity of the liquid formulation at 4-40°C is about 6.8 cP. In one embodiment, the viscosity of the liquid formulation at 25°C is about 6.8 cP.
  • the formulation contains about 6.0% ⁇ 0.5% excipients (e.g., sucrose). In some embodiments, the formulation contains about 6.5% ⁇ 0.5% excipients (e.g., sucrose). In some embodiments, the formulation contains about 7.0% ⁇ 0.5% excipients (e.g., sucrose). In some embodiments, the formulation contains about 8.6% ⁇ 0.5% excipients (e.g., sucrose).
  • Each of the above percentages corresponds to a weight/volume percentage (w/v). In some cases, the formulation contains 5.5% ⁇ 0.5% to 9% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose. In some cases, the formulation contains 5.5% ⁇ 0.5% to 9% ⁇ 0.5% (w/v) trehalose. In some cases, the formulation contains 200mM to 300mM proline.
  • a formulation of the invention may include about 0.01%; about 0.02%; about 0.03%; about 0.04%; about 0.05%; about 0.06%; about 0.07%; about 0.08%; about 0.09%; about 0.10%; about 0.11%; about 0.12%; about 0.13%; about 0.14%; about 0.15%; about 0.16%; about 0.17%; about 0.18%; about 0.19%; about 0.20%; about 0.21%; about 0.22%; about 0.23%; about 0.24%; about 0.25%; about 0.26%; about 0.27%; about 0.28%; about 0.29%; or about 0.30% of a surfactant (e.g., polysorbate 80).
  • a surfactant e.g., polysorbate 80
  • the formulation contains about 0.1% surfactant (e.g., polysorbate 80). Each of the above percentages corresponds to a weight/volume percentage (w/v). In some cases, the formulation contains 0.025% ⁇ 0.01% to 0.1% ⁇ 0.01% w/v polysorbate 80. In some cases, the formulation contains 0.05% ⁇ 0.01% w/v polysorbate 80.
  • the pharmaceutical formulations of the present invention may also include a buffer or buffer system for maintaining a stable pH and for helping to stabilize the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human MASP-2.
  • the buffer or buffer system includes at least one buffer whose buffer range fully or partially covers the range of pH 4.7 to 6.1.
  • the buffer includes a histidine buffer and/or an acetate buffer.
  • the buffer e.g., histidine
  • the buffer is present at a concentration of about 1 mM to about 40 mM, about 1 mM to about 30 mM, about 1 mM to about 20 mM; about 3 mM to about 18 mM, about 5 mM to about 15 mM; or about 8 mM to about 12 mM.
  • the histidine buffer includes L-histidine and a monohydrated L-histidine hydrochloride. In some cases, the histidine buffer includes a concentration of 0.175mg/mL of L-histidine and a concentration of 1.86mg/mL of monohydrated L-histidine hydrochloride.
  • the preparation contains an acetate buffer.
  • the buffer e.g., acetic acid
  • the buffer is present at a concentration of about 1mM to about 40mM, about 1mM to about 30mM, about 1mM to about 20mM; about 3mM to about 18mM, about 5mM to about 15mM; or about 8mM to about 12mM.
  • the buffer (e.g., acetic acid) is present at a concentration of about 1mM; about 2mM; about 3mM; about 4mM; about 5mM; about 6mM; about 7mM; about 8mM; about 9mM; about 10mM; about 11mM; about 12mM; about 13mM; about 14mM; about 15mM; about 16mM; about 17mM; about 18mM; about 19mM; or about 20mM.
  • the preparation contains an acetate buffer at a concentration of 5mM ⁇ 1mM to 20mM ⁇ 4mM.
  • the formulation contains an acetate buffer at a concentration of 10 mM ⁇ 2 mM.
  • the acetate buffer comprises acetic acid and sodium acetate trihydrate.
  • the histidine buffer comprises a histidine salt at a concentration of 10 mM.
  • Buffer exchange can be accomplished, for example, by ultrafiltration/diafiltration (UF/DF) using, for example, semipermeable tangential flow filtration membranes.
  • UF/DF ultrafiltration/diafiltration
  • the use of such techniques may induce the Gibbs-Donnan effect (Bolton et al., 2011, Biotechnol. Prog. 27(1):140-152).
  • UF/DF ultrafiltration/diafiltration
  • the use of such techniques may induce the Gibbs-Donnan effect (Bolton et al., 2011, Biotechnol. Prog. 27(1):140-152).
  • the accumulation of positive charge on the product side of the membrane is electrically balanced by the preferential migration of positive ions to the opposite side of the membrane.
  • the present invention includes formulations in which, due to the Gibbs-Donnan effect, the concentration of, for example, histidine/acetate is varied within the amounts or ranges described herein.
  • Size exclusion describes the property of highly concentrated samples in which a large portion of the total volume of the solution is occupied by solutes, especially macromolecules (such as proteins), so that solvent is excluded from this space. Subsequently, this reduces the total volume of solvent available to dissolve other solutes, which may cause uneven distribution of ultrafiltration membranes. Therefore, the present invention includes formulations in which, due to the size exclusion effect, the concentration of, for example, histidine can be varied within the amounts or ranges described herein.
  • the composition of the formulation may vary. These variations may include the concentration of the active ingredient, the concentration of the excipients, and/or the pH of the formulation.
  • the present invention includes formulations comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human MASP-2 that is stable and retains potency over excipient concentration variations of up to at least 10%.
  • formulations of monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind to human MASP-2 are included herein, wherein the stability and potency of the formulation are not affected by ⁇ 10% or ⁇ 20% variations in the concentration of the antibody, excipients, buffers, and/or surfactants.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention exhibits a high level of stability.
  • the term "stable" about a pharmaceutical preparation means that the antibody in the pharmaceutical preparation retains an acceptable degree of structure and/or function and/or biological activity after storing a defined amount of time. Even if the antibody contained in the preparation cannot maintain 100% of its structure and/or function and/or biological activity after storing a defined amount of time, the preparation can still be stable. In some cases, the maintenance of the structure and/or function and/or biological activity of about 90%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98% or about 99% of the antibody after storing a defined amount of time can be considered as "stable".
  • the stable liquid formulations of the present invention have an average particle size of 2-10 ⁇ m, as measured by microfluidics imaging system (MFI).
  • MFI microfluidics imaging system
  • the stable liquid formulations of the present invention have an osmolarity between 250 and 350 mOsm/kg H2O .
  • stability can be measured by measuring the protein content (concentration) of the antibody in the preparation after storing a defined amount of time at a given temperature.
  • acceptable stability means that the protein content of the antibody detected in the preparation after storing a defined amount of time at a given temperature changes no more than 10%.
  • the protein content of the antibody detected in the preparation after storing a defined amount of time at a given temperature changes no more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less.
  • the defined amount of time before measuring stability can be at least 3 days, at least 5 days, at least 1 week, at least 10 days, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 5 weeks, at least 6 weeks, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 24 months, at least 36 months or longer.
  • the temperature at which the pharmaceutical formulation can be stored when evaluating stability can be any temperature from about -80°C to about 45°C, for example, stored at about -80°C, about -30°C, about -20°C, about 0°C, about 4°C-8°C, about 5°C, about 25°C, about 35°C, about 37°C, about 40°C, or about 45°C.
  • the protein content of the antibody detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less, the pharmaceutical formulation can be considered stable.
  • the pharmaceutical formulation can also be considered stable.
  • a pharmaceutical formulation may also be considered stable if the amount of antibody protein detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after 9 months storage at 4°C.
  • a pharmaceutical formulation may also be considered stable if the amount of antibody protein detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after 12 months storage at 4°C.
  • a pharmaceutical formulation may also be considered stable if the amount of antibody protein detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after 24 months storage at 4°C.
  • a pharmaceutical formulation may also be considered stable if the amount of antibody protein detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after 36 months storage at 4°C.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the protein content of the antibody detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after storage at 25°C for 2 weeks.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the protein content of the antibody detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after storage at 25°C for 1 month.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the protein content of the antibody detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after storage at 25°C for 4 weeks.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the protein content of the antibody detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after storage at 25°C for 6 weeks.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the protein content of the antibody detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after storage at 40°C for 2 weeks.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the protein content of the antibody detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after storage at 40°C for 4 weeks.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the protein content of the antibody detected in the formulation does not change by more than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less after storage at 40°C for 6 weeks.
  • stability can be measured by measuring the monomer purity percentage of the antibody in the formulation after storing a defined amount of time at a given temperature.
  • the monomer purity of the antibody can be measured by size exclusion chromatography (e.g., size exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC)).
  • size exclusion chromatography e.g., size exclusion high performance liquid chromatography (SEC-HPLC)
  • acceptable stability the phrase means that at least 90% monomer purity of the antibody can be detected in the formulation after storing a defined amount of time at a given temperature. In certain embodiments, at least about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% monomer purity of the antibody can be detected in the formulation after storing a defined amount of time at a given temperature.
  • the defined amount of time before stability is measured can be at least 3 days, at least 5 days, at least 1 week, at least 10 days, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 5 weeks, at least 6 weeks, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 24 months, at least 36 months, or longer.
  • the temperature at which the pharmaceutical formulation can be stored when stability is assessed can be any temperature from about -80°C to about 45°C, such as storage at about -80°C, about -30°C, about -20°C, about 0°C, about 4°C-8°C, about 5°C, about 25°C, about 35°C, about 37°C, about 40°C, or about 45°C.
  • the monomer purity of the antibody is greater than about 90%, 95%, 96%, or 97% as detected by SEC-HPLC after storage at 4°C for 3 months, the pharmaceutical formulation can be considered stable.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the monomer purity of the antibody detected by SEC-HPLC is greater than about 90%, 95%, 96%, or 97% after storage at 4°C for 6 months.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the monomer purity of the antibody detected by SEC-HPLC is greater than about 90%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, or 99.5% after storage at 4°C for 9 months.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the monomer purity of the antibody detected by SEC-HPLC is greater than about 90%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, or 99.5% after storage at 4°C for 12 months.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the monomer purity of the antibody is greater than about 90%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, or 99.5% as measured by SEC-HPLC after storage at 4°C for 24 months.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable. If the monomer purity of the antibody detected by SEC-HPLC after storage at 25°C for 1 month is greater than about 90%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99% or 99.5%, the pharmaceutical formulation may also be considered stable. If the monomer purity of the antibody detected by SEC-HPLC after storage at 25°C for 4 weeks is greater than about 90%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99% or 99.5%, the pharmaceutical formulation may also be considered stable.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the monomer purity of the antibody detected by SEC-HPLC is greater than about 90%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, or 99.5% after storage at 25°C for 6 weeks.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the monomer purity of the antibody detected by SEC-HPLC is greater than about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, or 98% after storage at 40°C for 2 weeks.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the monomer purity of the antibody detected by SEC-HPLC is greater than about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, or 98% after storage at 40°C for 4 weeks.
  • the pharmaceutical formulation may also be considered stable if the monomer purity of the antibody is greater than about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% or 98% as detected by SEC-HPLC after storage at 40°C for 6 weeks.
  • other methods are used to assess the stability of the formulations of the invention, such as absorbance at about 405 nm or about 350 nm to determine the turbidity of the solution, differential scanning calorimetry (DSC) to determine thermal stability, and controlled agitation to determine mechanical stability.
  • DSC differential scanning calorimetry
  • the stability of the preparation after storage can be indicated by detecting the appearance of the preparation, visible foreign matter.
  • the stability of the liquid preparation of the present invention is visually inspected, wherein the liquid preparation of the present invention remains clear to slightly opalescent in appearance, is a colorless to light yellow liquid, and is free of foreign matter.
  • visual inspection under a clarity detector shows that no visible foreign matter is present in the preparation.
  • the defined amount of time before stability is measured can be at least 3 days, at least 5 days, at least 1 week, at least 10 days, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 5 weeks, at least 6 weeks or more.
  • the stability of the liquid formulation of the present invention is checked by measuring the transition temperature T onset at which the protein undergoes conformational change or aggregation during temperature increase so that the particle size changes.
  • the liquid formulation of the present invention has a T onset higher than about 60°C, higher than about 63°C, higher than about 65°C, higher than about 68°C or higher than about 70°C.
  • liquid antibody formulation of the present invention comprises:
  • the pH is 5.3 ⁇ 0.5.
  • the drug formulation comprises: (a) 20 mg/ml ⁇ 2 mg/ml antibody, (b) 0.175 mg/ml L-histidine, (c) 1.86 mg/ml L-histidine monohydrochloride monohydrate, (d) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (e) 8.6% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the pharmaceutical formulation comprises: (a) 60 mg/ml ⁇ 6 mg/ml antibody, (b) a buffer comprising 5 mM ⁇ 1 mM to 20 mM ⁇ 4 mM histidine or acetate, (c) 0.025% ⁇ 0.01% to 0.1% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (d) 6.5% ⁇ 0.5% to 8.6% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose or trehalose, at a pH of 5.3 ⁇ 0.5.
  • the pharmaceutical formulation comprises: (a) 60 mg/ml ⁇ 6 mg/ml antibody, (b) 0.175 mg/ml L-histidine, (c) 1.86 mg/ml L-histidine monohydrochloride monohydrate, (d) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (e) 8.6% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the pharmaceutical formulation comprises: (a) 100 mg/ml ⁇ 10 mg/ml antibody, (b) a buffer comprising 5 mM ⁇ 1 mM to 20 mM ⁇ 4 mM histidine or acetate, (c) 0.025% ⁇ 0.01% to 0.1% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (d) 6.5% ⁇ 0.5% to 8.6% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose or trehalose, at a pH of 5.3 ⁇ 0.5.
  • the pharmaceutical formulation comprises: (a) 100 mg/ml ⁇ 10 mg/ml antibody, (b) a buffer comprising 10 mM ⁇ 1 mM histidine buffer system, (c) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (d) 7.0% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the drug formulation comprises: (a) 100 mg/ml ⁇ 10 mg/ml antibody, (b) 0.175 mg/ml L-histidine, (c) 1.86 mg/ml L-histidine monohydrochloride monohydrate, (d) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (e) 7.0% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the pharmaceutical formulation comprises: (a) 150 mg/ml ⁇ 15 mg/ml antibody, (b) a buffer comprising 5 mM ⁇ 1 mM to 20 mM ⁇ 4 mM histidine or acetate, (c) 0.025% ⁇ 0.01% to 0.1% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (d) 6.5% ⁇ 0.5% to 8.6% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose or trehalose, at a pH of 5.3 ⁇ 0.5.
  • the pharmaceutical formulation comprises: (a) 150 mg/ml ⁇ 15 mg/ml antibody, (b) a buffer comprising 10 mM ⁇ 1 mM histidine buffer system, (c) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (d) 7.0% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the drug formulation comprises: (a) 150 mg/ml ⁇ 15 mg/ml antibody, (b) 0.175 mg/ml L-histidine, (c) 1.86 mg/ml L-histidine monohydrochloride monohydrate, (d) 0.05% ⁇ 0.01% (w/v) polysorbate, and (e) 7.0% ⁇ 0.5% (w/v) sucrose, with a pH of 5.3 ⁇ 0.1.
  • the polysorbate may be polysorbate 80 or polysorbate 20, with polysorbate 80 being preferred.
  • the pharmaceutical formulation does not comprise other buffer systems/buffers.
  • the pharmaceutical formulation does not include additional surfactants.
  • the pharmaceutical formulation contains no other excipients.
  • the pharmaceutical formulation comprising the anti-MASP-2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can maintain good stability of the antibody in a liquid state at higher concentrations (e.g., about 100 mg/mL, about 150 mg/mL) and lower concentrations (e.g., about 20 mg/mL, about 50 mg/mL), meet the requirements of the production process and the needs of clinical application, and can support the development of the antibody into intravenous injection and subcutaneous injection.
  • concentrations e.g., about 100 mg/mL, about 150 mg/mL
  • lower concentrations e.g., about 20 mg/mL, about 50 mg/mL
  • the pharmaceutical preparations of the present invention may be contained in any container suitable for storing medicines and other therapeutic compositions.
  • the pharmaceutical preparations may be contained in sealed and sterilized plastic or glass containers of defined volume such as vials, vials, ampoules, syringes, cartridges, bottles, or IV bags.
  • vials including, for example, clear and opaque (e.g., amber) glass or plastic vials may be used to contain the preparations of the present invention.
  • any type of syringe may be used to contain and/or administer the pharmaceutical preparations of the present invention.
  • the pharmaceutical preparations are contained in pre-filled syringes.
  • the pharmaceutical preparations are contained in pre-filled staked needle syringes.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention may be contained in a "normal tungsten" syringe or a "low tungsten” syringe.
  • the method of making a glass syringe generally involves the use of a hot tungsten rod to pierce the glass, thereby creating a hole from which liquid can be drawn and discharged from the syringe. This process results in trace amounts of tungsten deposited on the inner surface of the syringe. Subsequent washing and other processing steps may be used to reduce the amount of tungsten in the syringe.
  • normal tungsten means that the syringe contains more than 500 parts per billion (ppb) of tungsten.
  • low tungsten means that the syringe contains less than 500 ppb of tungsten.
  • a low tungsten syringe may contain less than about 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 390, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ppb or less of tungsten.
  • the pharmaceutical preparation can be administered to the patient by a non-parenteral route such as injection (e.g., subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, etc.) or transdermal, transmucosal, nasal, pulmonary and/or oral administration.
  • a non-parenteral route such as injection (e.g., subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, etc.) or transdermal, transmucosal, nasal, pulmonary and/or oral administration.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention is delivered subcutaneously using a reusable pen-type and/or auto-injector delivery device.
  • the pharmaceutical preparation is contained in a syringe that is particularly suitable for use with an auto-injector.
  • microinfusion set means a subcutaneous delivery device designed to slowly administer a larger volume (e.g., up to about 2.5 mL, about 3.0 mL, or more) of a therapeutic formulation over an extended period of time (e.g., about 10, 15, 20, 25, 30, or more).
  • the pharmaceutical preparation is administered via I.V. drip, such that the preparation is diluted in an IV bag containing a physiologically acceptable solution.
  • the pharmaceutical composition is a compounded sterile preparation in an intravenous infusion bag, such that a single dose of the drug is diluted to 100 mL, 250 mL (or other similar amounts suitable for intravenous drip delivery) of a physiological buffer (e.g., 0.9% saline).
  • the pharmaceutical formulations of the invention may also be contained in unit dosage forms.
  • unit dosage form refers to physically discrete units suitable for use as unit dosages for patients to be treated, each unit containing a predetermined amount of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect in combination with the required pharmaceutical carriers, diluents or excipients.
  • the unit dosage form is contained in a container as discussed herein.
  • dosage levels of the active ingredients in the formulations of the invention may be varied so as to obtain an amount of active ingredient that is effective to achieve the desired therapeutic response for a particular patient, composition, and mode of administration, and that has no adverse effects on the patient.
  • the dosage level selected will depend on various pharmacokinetic factors, including the activity of the particular composition of the invention employed, the route of administration, the time of administration, the rate of excretion of the particular compound employed, the duration of the treatment, other drugs, compounds and/or species used in combination with the particular composition employed, the age, sex, weight, condition, general health and previous medical history of the patient being treated; and similar factors well known in the medical arts.
  • the term "diluent" as used herein refers to a solution suitable for altering or achieving an exemplary or appropriate concentration or concentrations as described herein.
  • the unit dosage form contains an amount of active ingredient (e.g., a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human MASP-2) that is intended for a single use.
  • the amount of active ingredient in the unit dosage form is from about 0.1 mg to about 5000 mg, from about 100 mg to about 1000 mg, and from about 100 mg to about 500 mg, from about 100 mg to about 400 mg, from about 100 mg to about 200 mg, from about 200 mg to about 400 mg, from about 250 mg to about 350 mg, from about 125 mg to about 175 mg, from about 275 mg to about 325 mg, from about 1 mg to about 250 mg, from about 1 mg to about 100 mg, from about 1 mg to about 50 mg, from about 1 mg to about 25 mg, from about 1 mg to about 10 mg, from about 1 mg to about 5 mg, or ranges or intervals thereof.
  • the intermediate range of the above-described amount of mg to about 100mg or 2mg to 20mg is also intended to be a part of the present invention.
  • it is intended to include a combination of any one of the above-described values (or the value contained in the above-described range) as the value range of the upper limit and/or lower limit.
  • the preparation is often supplied in a liquid form in a unit dosage form.
  • the unit dosage form contains 2 to 2.5mg or 10 to 11mg, 20 to 25mg, 80 to 90mg, 100 to 125mg, 160 to 180mg, 200 to 225 or 320 to 360mg, 200 to 400mg.
  • the unit dosage form according to the present invention is suitable for subcutaneous administration to a patient (e.g., a unit dosage form containing an antibody having a concentration of about 100mg/ml or about 150mg/ml).
  • the invention provides a unit dosage form comprising about 20 mg, about 80 mg, about 160 mg, about 200 mg, about 320 mg or about 400 mg of an antibody in a stable formulation, wherein the formulation comprises 200 mg or 400 mg of the antibody unit dosage form.
  • the invention also includes methods of preparing unit dosage forms.
  • a method for preparing a pharmaceutical unit dosage form comprises combining the formulation of any of the preceding embodiments in a suitable container, such as those discussed herein.
  • the drug formulation is contained in a container (e.g., a vial or a prefilled syringe) that may contain less than 5% headspace gas of an oxidizing gas (e.g., oxygen) by volume.
  • a container e.g., a vial or a prefilled syringe
  • the concentration of the oxidizing gas (e.g., oxygen) in the headspace of the container may be less than 4.5%, less than 4%, less than 3.5%, less than 3%, less than 2.5%, less than 2%, or less than 1.5%.
  • the concentration of the oxidizing gas (e.g., oxygen) in the headspace is less than about 1%.
  • the concentration of the oxidizing gas (e.g., oxygen) in the headspace does not exceed about 0.5%.
  • the concentration of the oxidizing gas (e.g., oxygen) in the headspace does not exceed about 0.1%.
  • the concentration of the oxidizing gas (e.g., oxygen) in the headspace of the drug container is less than 0.9%, less than 0.8%, less than 0.7%, less than 0.6%, less than 0.5%, less than 0.4%, less than 0.3%, less than 0.2%, or less than 0.1%.
  • the concentration of oxygen in the headspace gas is about 0.01% to about 1.5%.
  • the oxygen concentration in the headspace gas is about 0.75% to about 1.25%.
  • the oxygen concentration in the headspace gas is about 0.05% to about 0.15%.
  • the oxidizing gas (e.g., oxygen) in the headspace is replaced or substantially replaced by an inert gas such as nitrogen, argon, helium, xenon, neon, krypton, or radon.
  • an inert gas such as nitrogen, argon, helium, xenon, neon, krypton, or radon.
  • the non-oxidizing gas is nitrogen.
  • the non-oxidizing gas is argon.
  • the pharmaceutical formulations of the invention are particularly useful for treating, preventing and/or ameliorating any disease or condition associated with cells expressing human MASP-2.
  • Exemplary, non-limiting diseases and conditions that can be treated by administering the pharmaceutical formulations of the invention include diseases or conditions that would benefit from inhibition of MASP-2-dependent complement activation.
  • the disease or condition that would benefit from inhibition of MASP-2-dependent complement activation comprises an autoimmune disease, a vascular disorder, ischemia-reperfusion injury, atherosclerosis, inflammation, a pulmonary disorder, an extracorporeal reperfusion procedure, a musculoskeletal disorder, a renal disorder, a skin disorder, an organ or tissue transplant procedure, a nervous system disease or injury, a blood disorder, a genitourinary disorder, non-obese diabetes or complications associated with type 1 or type 2 diabetes, cancer, an endocrine disorder, an ophthalmic disorder, or COVID-19.
  • an autoimmune disease comprises an autoimmune disease, a vascular disorder, ischemia-reperfusion injury, atherosclerosis, inflammation, a pulmonary disorder, an extracorporeal reperfusion procedure, a musculoskeletal disorder, a renal disorder, a skin disorder, an organ or tissue transplant procedure, a nervous system disease or injury, a blood disorder, a genitourinary disorder, non-obe
  • the autoimmune disease includes thrombotic microangiopathy (TMA), atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS), thrombotic microangiopathy associated with hematopoietic transplantation (TA-TMA), lupus nephritis, systemic erythromycin, Systemic lupus erythematosus (SLE) and IgA nephropathy.
  • TMA thrombotic microangiopathy
  • aHUS atypical hemolytic uremic syndrome
  • TA-TMA thrombotic microangiopathy associated with hematopoietic transplantation
  • lupus nephritis lupus nephritis
  • systemic erythromycin systemic erythromycin
  • SLE Systemic lupus erythematosus
  • IgA nephropathy IgA nephropathy
  • the vascular disorders include cardiovascular disorders, cerebrovascular disorders, peripheral (e.g., musculoskeletal) vascular disorders, renal vascular disorders, mesenteric/intestinal vascular disorders, revascularization of grafts and/or regrafts, vasculitis, Henlein-Schonlein purpura nephritis, vasculitis associated with systemic lupus erythematosus, vasculitis associated with rheumatoid arthritis, immune complex vasculitis, Takayasu arteritis, dilated cardiomyopathy, diabetic angiopathy, Kawasaki disease (arteritis), venous gas embolism (VGE), and restenosis following stenting, rotational aneurysm resection, and percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA).
  • peripheral e.g., musculoskeletal
  • renal vascular disorders vascular disorders
  • mesenteric/intestinal vascular disorders revascularization of graf
  • the ischemia-reperfusion injury includes ischemia-reperfusion injury associated with aortic aneurysm repair, cardiopulmonary bypass, vascular reanastomosis associated with organ transplantation and/or limb/digit replantation, stroke, myocardial infarction, and hemodynamic resuscitation after shock and/or surgery.
  • the inflammation comprises inflammatory gastrointestinal diseases, which include pancreatitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, irritable bowel syndrome, and diverticulitis.
  • the pulmonary disorders include acute respiratory distress syndrome, transfusion-related acute lung injury, ischemia/reperfusion acute lung injury, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, Wegener's granulomatosis, anti-glomerular basement membrane disease (Goodpasture's disease); meconium aspiration syndrome, bronchiolitis obliterans syndrome, idiopathic pulmonary fibrosis, acute lung injury secondary to burns, non-cardiogenic pulmonary edema, transfusion-related dyspnea, emphysema, cystic fibrosis, SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2 (Covid-19) related diseases.
  • the extracorporeal circulation reperfusion process includes hemodialysis, plasmapheresis, leukocyte removal, extracorporeal membrane oxygenation (ECMO), heparin-induced exfracorporeal membrane oxygenation LDL precipitation (HELP) and cardiopulmonary bypass (CPB).
  • ECMO extracorporeal membrane oxygenation
  • HELP heparin-induced exfracorporeal membrane oxygenation LDL precipitation
  • CPB cardiopulmonary bypass
  • the musculoskeletal disorders include osteoarthritis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, gout, neuropathic arthropathy, psoriatic arthritis, spondyloarthropathies, crystalline arthropathy, and systemic lupus erythematosus (SLE).
  • the renal disorder includes mesangial proliferative glomerulonephritis, membranous glomerulonephritis, membranous proliferative glomerulonephritis (mesangial capillary glomerulonephritis), acute post-infectious glomerulonephritis (post-streptococcal glomerulonephritis), cryoglobulinemic glomerulonephritis, lupus nephritis, Henlein-Schonlein purpura nephritis, and IgA nephropathy.
  • the skin disorders include psoriasis, autoimmune bullous skin diseases, eosinophilic spongiosis, bullous pemphigoid, epidermolysis bullosa acquisita, herpes gestationis, thermal burns, and chemical burns.
  • the organ or tissue transplantation process includes organ allotransplantation, organ xenotransplantation, organ and tissue transplantation.
  • the nervous system disease or injury includes multiple sclerosis, myasthenia gravis, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Guillain-Barre syndrome, reperfusion following stroke, degenerative disc, brain trauma, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Miller-Fisher syndrome, brain trauma and/or hemorrhage, demyelination and meningitis.
  • the blood disease includes sepsis, severe sepsis, septic shock, sepsis-induced Acute respiratory distress syndrome, systemic inflammatory response syndrome, hemorrhagic shock, hemolytic anemia, autoimmune thrombotic thrombocytopenic purpura and hemolytic uremic syndrome.
  • the urogenital disorders include painful bladder, sensory bladder, chronic nonbacterial cystitis, interstitial cystitis, infertility, placental dysfunction, and miscarriage and pre-eclampsia.
  • the endocrine diseases include Hashimoto's thyroiditis, stress, anxiety, and hormonal diseases involving the regulated release of prolactin, growth hormone or other insulin-like growth factors and adrenocorticotropic hormone from the pituitary gland.
  • the ophthalmic disease comprises age-related macular degeneration.
  • the subject is determined to have elevated serum levels of C4, or to have C4d deposition or C4d positive staining in the relevant sample.
  • the condition or disease is IgA nephropathy. It is reported that C4d positive staining is an independent risk factor for ESRD in IgAN. C4d can be detected by any suitable method known in the art, for example, by using ELISA, or immunofluorescence microscopy.
  • the therapeutically effective amount of the antibodies or antigen-binding fragments provided herein will depend on various factors known in the art, such as body weight, age, past medical history, current medications, the health status of the subject and potential cross-reactions, allergies, sensitivity and adverse side effects, as well as the route of administration and the extent of disease development.
  • a person of ordinary skill in the art may proportionally reduce or increase the dosage according to these and other circumstances or requirements.
  • a therapeutically effective dose of an anti-MASP-2 antibody or antigen-binding fragment provided herein is from about 0.01 mg/kg to about 100 mg/kg (e.g., about 0.01 mg/kg, about 0.5 mg/kg, about 1 mg/kg, about 2 mg/kg, about 3 mg/kg, about 5 mg/kg, about 10 mg/kg, about 15 mg/kg, about 20 mg/kg, about 25 mg/kg, about 30 mg/kg, about 35 mg/kg, about 40 mg/kg, about 45 mg/kg, about 50 mg/kg, about 55 mg/kg, about 60 mg/kg, about 65 mg/kg, about 70 mg/kg, about 75 mg/kg, about 80 mg/kg, about 85 mg/kg, about 90 mg/kg, about 95 mg/kg, or about 100 mg/kg).
  • the dosage of the antibody or antigen binding fragment is about 50 mg/kg or less, in some embodiments, the dosage is 10 mg/kg or less, 5 mg/kg or less, 3 mg/kg or less, 1 mg/kg or less, or 0.1 mg/kg or less.
  • the dosage can be changed during the treatment process. For example, in some embodiments, the initial dosage can be higher than the subsequent dosage. In some embodiments, the dosage can change during the treatment process according to the response of the subject.
  • Dosage regimens may be adjusted to provide the optimum desired response (eg, therapeutic response). For example, a single dose may be administered, or several divided doses may be administered over a period of time.
  • anti-MASP-2 antibodies and antigen-binding fragments disclosed herein can be administered by any route known in the art, for example, parenteral (e.g., subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, including intravenous infusion, intramuscular or intradermal injection) or non-parenteral (e.g., oral, intranasal, intraocular, sublingual, rectal or topical) routes.
  • parenteral e.g., subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, including intravenous infusion, intramuscular or intradermal injection
  • non-parenteral e.g., oral, intranasal, intraocular, sublingual, rectal or topical routes.
  • the additional therapeutic agent administered in conjunction with an antibody or antigen-binding fragment disclosed herein is administered according to the schedule listed in the product information sheet for the additional therapeutic agent, or according to the Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002)) or regimens well known in the art.
  • the treatment methods of the present invention comprise administering to a subject any formulation comprising a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human MASP-2 as disclosed herein.
  • the subject to whom the pharmaceutical formulation is administered can be, for example, any human or non-human animal in need of such treatment.
  • the subject can be a subject diagnosed with or considered to be at risk of suffering from any of the aforementioned diseases or disorders.
  • the present invention further comprises the use of any of the pharmaceutical formulations disclosed herein in the manufacture of a medicament for treating any disease or disorder associated with cells expressing human MASP-2, including any of the exemplary diseases, disorders, and conditions mentioned above.
  • the invention provides a kit comprising a pharmaceutical preparation (e.g., a container having a preparation or unit dosage form) and packaging or labeling (e.g., a drug insert) as discussed herein, and instructions for use of the pharmaceutical preparation to treat a disease or condition as discussed above.
  • a pharmaceutical preparation e.g., a container having a preparation or unit dosage form
  • packaging or labeling e.g., a drug insert
  • instructions for use of the pharmaceutical preparation to treat a disease or condition as discussed above e.g., a container having a preparation or unit dosage form
  • the instructions provide the use of a unit dosage form as discussed herein for treating a disease or condition.
  • NT in the table of the present invention means not detected unless otherwise specified; ND means not detected unless otherwise specified.
  • Example 1 Generation of human, mouse, and cynomolgus monkey MASP-2 antigens
  • the above MASP-2 expression constructs were transfected into ExpiCHO-s cells using the ExpiFectamine CHO transfection kit.
  • ExpiCHO-s cells were cultured in serum-free ExpiCHO expression medium. 14 days after transfection, the supernatant was collected. After centrifugation and filtration, the supernatant was loaded onto an anti-FLAG or anti-HIS column and then purified using the GE AKTA purification system. After washing, the MASP-2 protein was eluted with citric acid (pH 3.5) for animal immunization.
  • mice or rats were immunized with DNA expressing the chimeric MASP-2 antigen described above via the Helios gene gun system (Bio-Rad). Immunized animals were boosted with recombinant MASP-2 protein every two weeks. Four days after the last boost immunization, the animals were sacrificed for hybridoma fusion. Spleen cells were isolated and fused with SP2-0 cells via an electrofusion method. The resulting hybridoma cells were cultured in DMEM medium containing hypoxanthine-aminopterin-thymidine.
  • the hybridoma supernatant was collected for antigen binding screening.
  • the full-length human MASP-2 protein was coated in an ELISA plate at a concentration of 0.5 ⁇ g/ml, 100 ⁇ l per well. After blocking with PBS containing 1% BSA + 1% normal goat serum + 0.05% Tween20, the hybridoma supernatant was added to the plate for 1 hour. The specific binding of the hybridoma antibody to human MASP-2 was detected with an anti-mouse antibody linked to horseradish peroxidase (HRP). The positive clones that bound to ELISA were selected for further activity screening.
  • HRP horseradish peroxidase
  • ELISA plates were coated with 10 ⁇ g/ml mannan, 100 ⁇ l per well, overnight at 4°C. After washing three times with PBS + 0.1% Tween20, the plates were blocked with blocking buffer (10 mM Tris-HCl + 0.1% human serum albumin + 140 mM NaCl) for 1 hour. 50 ⁇ l of hybridoma supernatant was mixed with 50 ⁇ l of 1% human serum (Quidel, A113) diluted with detection buffer (0.1% human serum albumin + 20 mM Tris-HCl + 2 mM CaCl 2 + 140 mM NaCl + 1 mM MgCl 2 + 0.05% Tween20), and then incubated on ice for 45 minutes.
  • blocking buffer 10 mM Tris-HCl + 0.1% human serum albumin + 140 mM NaCl
  • Positive antibodies were then subcloned and rescreened by ELISA binding and C4 activation assays.
  • ELISA plates were coated with 10 ⁇ g/ml mannan, 100 ⁇ l per well, overnight at 4°C. After washing three times with PBS + 0.1% Tween20, the plates were blocked with blocking buffer (10 mM Tris-HCl + 0.1% human serum albumin + 140 mM NaCl) for 1 hour. Antibodies were serially diluted with detection buffer (0.1% human serum albumin + 20 mM Tris-HCl + 2 mM CaCl 2 + 140 mM NaCl + 1 mM MgCl 2 + 0.05% Tween20) containing 1% human serum (Quidel, A113) and incubated on ice for 45 minutes.
  • the blocking buffer was discarded from the mannan-coated plates and the antibody-serum mixture was added. The plates were incubated at 37°C for 1.5 hours. The activated complement components should be deposited on the bottom of the plate, while the inactivated components should still be soluble in the buffer. After washing three times with wash buffer, activation of complement components was monitored using HRP-linked complement antibodies, including anti-C3c antibody (Quidel-A205), anti-C4c antibody (Quidel-A211), and anti-MAC (SC5b-9) antibody (Quidel-A239). The detection antibodies were linked to HRP in-house. MASP-2 antibodies purified from hybridoma cells blocked activation of complement C3 (see Figure 1), complement C4 (see Figure 2), and MAC (see Figure 3) in a dose-dependent manner.
  • V-type gene cloning The sequences of mouse anti-human MASP-2 light and heavy chain variable regions were obtained by polymerase chain reaction (PCR) amplification. Total RNA of positive hybridoma cells was isolated using MiniBest Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa), and cDNA was synthesized using 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa) with Oligo (dT) primers. The variable regions of mouse IgG gene were amplified by PCR, using primers of different isotypes for the heavy chain variable region and kappa chain primers for the light chain variable region. The PCR products were subcloned into a TA cloning vector. For each variable gene construct, more than 10 single clones were used for DNA sequencing by Synbio Technologies (Suzhou, China). The amino acid sequences of VH and V ⁇ were obtained from the DNA sequencing results.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Co-transfection of heavy and light chains was performed using Invitrogen's ExpiFectamine TM CHO reagent according to the manufacturer's protocol.
  • ExpiCHO-S cells were transfected with equal amounts of heavy and light chain vector DNA at a final concentration of 0.8 ⁇ g/ml at 5-6x10 6 cells/ml in ExpiCHO expression medium using ExpiFectamine TM CHO reagent.
  • Plasmid DNA or ExpiFectamine TM CHO reagent was diluted with cold OptiPRO TM medium and then mixed by rotating the tube and/or inverting.
  • ExpiFectamine TM CHO/plasmid DNA mixture was incubated at room temperature for 1-5 minutes and then slowly transferred to a shake flask containing cells.
  • Transfected cells were cultured on an orbital shaker (shaking speed of 125 rpm) at 37°C, in a humidified atmosphere of 5% CO 2.
  • ExpiCHO TM Feed was added 18 to 22 hours after transfection and conditioned medium was harvested on day 10. The supernatant was centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes and then filtered through a 0.22 ⁇ m filter capsule to remove cell debris. The filtered supernatant was loaded into a pre-equilibrated Protein-A affinity column.
  • the Protein-A resin was washed with equilibration buffer (PBS) and then the antibody was eluted with 25 mM citrate (pH 3.5).
  • the purified antibody solution was adjusted to pH 6.0-7.0 with 1 M Tris-base (pH 9.0). Endotoxin was controlled below 1 EU/mg. Finally, the purified antibody was identified by SDS-PAGE.
  • variable region domains of mouse antibody 129C10 was used to determine the germline sequences with the highest homology to the respective mouse frameworks. Humanized variants with CDR grafting and back mutations were designed using computer modeling.
  • the human germline framework sequences VH/1-2 were used for the heavy chain, and VK/2-30 for the light chain, respectively, for CDR grafting.
  • Heavy chain (HC) variants 1, 2, 3 and 4 were obtained by directly grafting three CDRs to the germline sequence (SEQ ID NO: 37), in addition, R71V, A93T mutations (SEQ ID NO: 20) for HC variant 1, R71V, A93T, V67A, M69L mutations (SEQ ID NO: 22) for HC variant 2, R71V, A93T, A65G, K64Q, E61Q mutations (SEQ ID NO: 24) for HC variant 3 and R71V, A93T, V67A, M69L, A65G, K64Q, E61Q mutations (SEQ ID NO: 26) for HC variant 4, respectively. It should be noted that HC variants 3 and 4 have three mutations (A65G, K64Q, E61Q) introduced into HC CDR2 to further improve the humanization of the antibodies.
  • VH/1-2 (129C10-HC germline, SEQ ID NO:37).
  • VH/1-2 variant 1 (Hu129C10_Ha, SEQ ID NO:20).
  • VH/1-2 variant 2 (Hu129C10_Hb, SEQ ID NO:22).
  • VH/1-2 variant 4 (Hu129C10_Hd, SEQ ID NO:26).
  • Light chain (LC) variants 1 and 2 were obtained by directly grafting three CDRs onto the germline sequence (SEQ ID NO:38), with an F36L back mutation for LC variant 1 (SEQ ID NO:28) and F36L, T69A back mutations for LC variant 2 (SEQ ID NO:30), respectively.
  • VK/2-30 (129C10-LC-germline, SEQ ID NO: 38)
  • VK/2-30 variant 1 (Hu129C10_La, SEQ ID NO:28).
  • VK/2-30 variant 2 (Hu129C10_Lb, SEQ ID NO:30).
  • the cDNA of the variable region of the above heavy and light chains was synthesized and then fused with the sequences of the constant region of human IgG4 and human kappa.
  • the resulting antibody gene sequence was cloned into an expression vector.
  • Large-scale DNA was prepared using Qiagen's Plasmid Maxiprep system, and cell transfection was performed using Invitrogen's ExpiFectamine TM CHO reagent according to the manufacturer's protocol. The supernatant was harvested when the cell viability exceeded 60% and filtered through a 0.22 micron filter capsule to remove cell debris. The filtered supernatant was then loaded onto a pre-equilibrated Protein-A affinity column.
  • the protein A resin was washed with equilibration buffer (PBS), and the antibody was then eluted with 25mM citrate (pH3.5).
  • the purified antibody solution was adjusted to pH6.0-7.0 with 1M Tris-base (pH9.0). Endotoxin was controlled below 1EU/mg. Finally, the purified antibody was identified by SDS-PAGE.
  • the purified antibody was serially diluted starting from 100 ⁇ g/ml to obtain a gradient concentration.
  • the complement C3 activation assay was used to evaluate the blocking activity of the MASP-2 antibody as described in Example 3. 100 ⁇ l of 10 ⁇ g/ml mannan per well was coated on an ELISA plate overnight at 4°C. The antibody was incubated with 1% human serum (Quidel, A113) on ice for 45 minutes. After washing and blocking the plate, the antibody-serum mixture was added and incubated at 37°C for 90 minutes. After washing, the deposited activated C3 was detected with an HRP-linked anti-C3c antibody (Quidel-A205).
  • Figure 4 shows the blocking activity of the chimeric and humanized antibodies on complement C3 activation.
  • 129C10HaLa Due to the humanized The 129C10 variant 129C10HaLa showed the best affinity and C3 blocking activity, and 129C10HaLa was selected as the lead antibody for further in vitro and in vivo studies and was named 129C10-hu.
  • Example 7 Comparison of the blocking activity of complement C4 and MAC between the lead antibody 129C10-hu and the benchmark antibody OMS721-analog
  • the blocking activity of the lead MASP-2 antibodies 129C10-hu and OMS721-analog on complement C4 and MAC activation in 2% human serum was compared using the detection method described in Example 3. 100 ⁇ l of 10 ⁇ g/ml mannan per well was coated on ELISA plates overnight at 4°C. The antibodies were incubated with 2% human serum (Quidel, A113) on ice for 45 minutes. After washing and blocking the plates, the antibody-serum mixture was added and incubated at 37°C for 90 minutes. After washing, deposited activated C4 was detected with an HRP-linked anti-C4c antibody (Quidel-A211).
  • an HRP-linked anti-MAC (SC5b-9) antibody (Quidel-A239) was used for detection.
  • 129C10-hu was approximately 10 times more potent than OMS721-analog in blocking the activation of complement C4 (IC50: 0.11 ⁇ g/mL vs. 1.70 ⁇ g/mL) and MAC (IC50: 0.27 ⁇ g/mL vs. 1.97 ⁇ g/mL).
  • Antibodies were serially diluted with assay buffer (0.1% human serum albumin + 20 mM Tris-HCl + 2 mM CaCl 2 + 140 mM NaCl + 1 mM MgCl 2 + 0.05% Tween20) containing 50% human serum (Quidel, A113), and then incubated on ice for 45 minutes. The blocking buffer was removed from the mannan-coated plate and the antibody-serum mixture was added. The plates were incubated at 37°C for 30 minutes. After washing three times, activated C3 was detected with an HRP-linked anti-C3c antibody (Quidel-A205).
  • 129C10-hu and OMS721-analog had similar inhibitory efficacy on C3 activation in 1% serum (IC50: 0.08 ⁇ g/mL vs. 0.10 ⁇ g/mL).
  • 129C10-hu showed a 3-fold higher potency than OMS721-analog at a high concentration of 10% serum (IC50: 0.20 ⁇ g/mL vs. 0.69 ⁇ g/mL) (see FIG8 ).
  • 129C10-hu still had the activity of blocking C3 activation with an IC50 of 0.05 ⁇ g/mL, while OMS721-analog lost its activity (see FIG9 ).
  • 129C10-hu also showed a 2-fold higher potency than OMS721-analog in blocking C4 activation in 10% human serum (IC50: 0.69 ⁇ g/mL vs. 1.59 ⁇ g/mL) (see FIG. 10 ).
  • the antibodies to be tested were diluted to a concentration of 100 nM using ForteBio kinetic buffer (PBS pH 7.4, 0.1% BSA + 0.002% Tween-20).
  • the human MASP-2 protein was diluted with kinetic buffer to obtain a gradient of 100 nM, 50 nM and 25 nM. 0 nM was used as a reference control.
  • the antibodies were immobilized on the Protein A biosensor. The baseline was measured for 60 seconds, and then the association of the antibody with MASP-2 was measured for 180 seconds to obtain the K on factor data. The K off factor data was obtained after dissociation in kinetic buffer for 180 seconds.
  • the biosensor was regenerated in 10 mM glycine, pH 2.0 buffer. All kinetic data were collected at 30°C.
  • Human C1s/C1r and MASP-1/3 were purchased from R&D, Cusbio, etc. Recombinant human complement components C1s/C1r, MASP-1 or MASP-3 (1 mg/ml) were coated overnight at 4°C; washed three times with washing buffer; added blocking buffer (200 ⁇ L/well) for 1 h at 4°C; washed three times; added serially diluted Ab for 1 h at RT; washed three times; added mouse anti-human IgG4 HRP (1:20000) for 1 h at RT; washed three times; detected with tetramethylbenzidine (TMB) at OD450nm for 40 minutes.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • 129C10-Hu and The EC50 of OMS721-analog binding to C1s, C1r, MASP1, MASP2 or MASP3 is shown in Figures 12A to 12E, respectively.
  • the results show that 129C10-Hu only binds to human MASP2, but not to human C1s, C1r, MASP1 or MASP3.
  • Rat/mouse MASP-2 was ordered from Cusbio. Human/cynomolgus monkey MASP-2 was generated in-house. ELISA assays were performed according to the following procedure. MASP-2 of different species (1 ⁇ g/ml) was coated overnight at 4°C; washed three times with wash buffer; added blocking buffer (200 ⁇ L/well) for 2 hours at RT; washed three times; added serially diluted 129C10-hu or OMS721-analog as a control for 1 hour at RT; washed three times; added mouse anti-human IgG4 Fc HRP (1:20000) for 1 hour at RT; washed three times; detected with TMB at OD450nm for 2 minutes.
  • the EC50s of binding of 129C10-Hu and OMS721-analog to MASP-2 of different species are shown in Figures 13A and 13B, respectively.
  • Example 11 Cross-reactivity of 129C10-hu with cynomolgus monkey MASP-2, as determined by using C4 activation in cynomolgus monkey serum
  • the assay was performed the same as described in Example 3 except that cynomolgus monkey serum was used. 100 ⁇ l per well of 10 ⁇ g/ml mannan was coated on an ELISA plate at 4°C overnight. The antibody was incubated with 1% cynomolgus monkey serum on ice for 45 minutes. After washing and blocking the plate, the antibody-serum mixture was added and then incubated at 37°C for 90 minutes. After washing, the deposited activated C4 was detected with an HRP-linked anti-C4c antibody (Quidel-A211).
  • 129C10 blocked C4 activation in cynomolgus monkeys with an IC 50 of 0.4973 ⁇ g/ml, indicating that 129C10 can bind to cynomolgus monkey MASP-2 and block its activity.
  • Example 12 Selectivity of 129C10 in Blocking Activation of the MB-Lectin Complement Pathway
  • MBL MB-Lectin
  • MAC membrane attack complex
  • the Wieslab complement system screening kit (IBL America, Cat# COMPL 300RUO) was used to determine the selectivity of the lead antibody 129C10-hu.
  • the plates were pre-coated with mannan as an initiator of the MBL pathway, IgM as an initiator of the classical pathway, and LPS as an initiator of the alternative pathway.
  • 129C10-hu was serially diluted in assay buffer containing human serum (Quidel, A113) and then incubated on ice for 45 minutes. The antibody-serum mixture was added to the plate and incubated at 37°C for 60 minutes. After washing, the deposited MAC was detected with an AP-linked anti-C5b-9 antibody. EDTA was used as a positive control to block complement activation.
  • 129C10-hu only blocked complement activation initiated from the MBL pathway, but not the other two complement pathways, indicating that the 129C10-hu antibody selectively blocked complement activation from the MBL pathway.
  • Example 13 Prolonging the half-life of 129C10-hu by introducing a YTE mutation at the Fc site.
  • Dall'Acqua WF et al. reported that the introduction of triple mutation M252Y/S254T/T256E (YTE) in the Fc part of IgG can enhance its binding affinity to FcRn and prolong its half-life in vivo (Dall'Acqua WF, et.al. 2006. JBC).
  • Motavizumab-YTE is the first YTE-mutated IgG in humans, which showed good tolerability and prolonged half-life in Phase I clinical trials (Robbie, GJ, et.al. 2013. AAC).
  • FcRn protein was immobilized on a Ni-NTA biosensor. The kinetics of association and dissociation were recorded and analyzed. As shown in FIG. 16A , FIG. 16B and Table 5, the YTE mutation increased the binding affinity of 129C10-hu to human FcRn by 3-fold.
  • Example 14 Pharmacokinetic (PK)/pharmacodynamic (PD) study of MASP-2 antibodies 129C10-hu and 129C10-hu-YTE in cynomolgus monkeys
  • Two cynomolgus monkeys per group were intravenously injected with 10 mg/kg 129C10-hu, 129C10-hu-YTE, or OMS721-analog.
  • Serum samples were collected at 0, 0.5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504, 672, and 840 hours after infusion.
  • Antibody concentrations in serum and the potency of lectin pathway activation were tested.
  • Serum concentrations were determined using a developed ELISA method with a detection range of 0.625-40 ng/mL.
  • Microplates were pre-coated with human IgG-specific anti-IgG antibodies [R10z8e6]. After blocking, standard (STD), quality control (QC) samples, matrix blank samples, and test samples were added. After washing, biotinylated mouse anti-human IgG4 was added to the microplate wells, followed by HRP-labeled streptavidin. TMB was added to the microplate wells. The OD values of the QC and test samples were converted to concentrations by comparison with the standard curve analyzed simultaneously, and regression was performed according to a four-parameter logistic model.
  • the half-life of 129C10-hu in crab-eating monkeys is 164.77 hours, which is longer than OMS721-analog (130.152 hours).
  • the YTE mutation increases the half-life of 129C10-hu to 274.404 hours.
  • the activation efficacy of the lectin pathway was suppressed to the basal level 0.5 hours after the antibody was administered. The inhibitory effect lasted for 2 weeks in the OMS721-analog group, 3 weeks in the 129C10-hu group, and about 4 weeks in the 129C10-hu-YTE group.
  • male and female cynomolgus monkeys were assigned to five groups of 2 males and 2 females each and received either subcutaneous injections of 0 (vehicle control), 15, 20, and 295.8 mg/kg 129C10-hu or intravenous injections of 15 mg/kg 129C10-hu at 3 mL/kg for 4 weeks (up to five times).
  • the vehicle control article used drug formulation buffer.
  • Complement 4c (C4c) in serum was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Briefly, mannan (Sigma) was diluted to 10 ⁇ g/ml with coating buffer. 100 ⁇ l of mannan working solution was added to each well of a 96-well plate. The plate was incubated overnight at 4°C. The plate was washed three times, and then 200 ⁇ l of blocking buffer was added and incubated at room temperature for 1 hour. Monkey serum was diluted to 2% with C4 activation buffer.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • serum C4c showed a dose-dependent decrease at ⁇ 15 mg/kg, which began to appear at 2 hours after dosing in animals administered subcutaneously and at 0.083 hours after dosing in animals administered via I.V.
  • the effect persisted throughout the dosing period at the three dose levels administered via S.C. or I.V., with a maximum effect at 24-96 hours after the first dose, and the maximum mean decrease compared to baseline values was noted at a dose of 295.8 mg/kg administered via S.C., up to 88.4% in males and 92.8% in females.
  • 129C10-hu had a significant dose-dependent decrease in serum C4c in monkeys after five weekly doses at doses of 15, 60, or 295.8 mg/kg administered via S.C. or I.V., indicating that serum C4c may be a potential pharmacodynamic marker.
  • the protein, i.e., antibody molecule, selected in the preparation research of the present invention was examined using 129C10-hu-YTE as an example.
  • Sample preparation method Use dialysis to replace the DS buffer into the target formulation, or directly add high-concentration excipients and surfactants into high-concentration DS, and then dilute DS to the target concentration.
  • the dialysis method can be divided into the following two types according to the consumables used: (1) If the formulation of the target formulation is different from the buffer in the DS, use dialysis to replace the DS buffer with the target formulation (surfactants cannot be added by dialysis). Load the sample into After sealing, the dialysis bag is placed in a buffer solution with a volume of approximately 100 to 200 times the sample volume. Dialysis is performed three times, with durations of 4 hours, 4 hours and overnight, respectively, and the stirring speed is 200 rpm.
  • Slide-A-Lyzer dialysis cards can also be used for dialysis. Use a syringe with a needle to load 3-12 ml of sample into the dialysis card, immerse it in 100 to 200 times the target buffer, and dialyze the dialysis card three times at room temperature with stirring at 300 rpm, for 4 hours, 4 hours and overnight, respectively.
  • pH The sample pH is measured by installing Measure sample pH with a Seven Compact pH meter using a Micro-Pro-ISM electrode. Calibrate the pH meter before use.
  • Protein concentration was determined by absorbance at 280 nm using a Nano Drop 2000 spectrophotometer. The extinction coefficient (E1%) used throughout the study was 1.422 L/g/cm. Each sample was measured twice at a loading volume of 2.0 ⁇ L, and the average concentration was reported.
  • DLS Dynamic Light Scattering
  • kD value by DLS Dilute the samples with corresponding buffer to concentrations of 1, 2, 4, 8, 12, 16, and 20 mg/mL, and analyze their kD values by DLS, with acquisition time of 5 s, 20 acquisitions per measurement, and temperature of 25°C.
  • Tonset measures the transition temperature when the protein undergoes conformational changes or aggregation during the heating process, causing the particle size to change. Dilute the sample to 4 mg/mL with the corresponding buffer, take 100 ⁇ L and add it to a 96-well plate, centrifuge at 3000 rpm for 5 min, add 10 ⁇ L of silicone oil to cover the sample, and centrifuge at 3000 rpm for 5 min. The instrument performs linear heating at 1°C/min in the range of 25-80°C, and a single sample is measured 8 times, with each acquisition time of 3s. Collect the particle size and temperature data, draw a curve, and use the linear intersection function provided by the official software of the instrument to calculate the Tonset of the sample.
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • Cation exchange chromatography (CEX): The charge heterogeneity of the protein was determined by CEX-HPLC.
  • the liquid phase system was Agilent 1260 Infinity II and the chromatographic column was Thermo Propac WCX-10 BioLC column (4 ⁇ 250 mm, 10 ⁇ m). After the sample was mixed evenly, it was centrifuged and the supernatant was transferred, and then diluted to 2.0 mg/mL with mobile phase A.
  • the chromatographic conditions are shown in Table 10 below.
  • Non-reducing capillary electrophoresis Protein fragmentation was determined by the NR-CE-SDS method. The standard or test sample was diluted to 4 mg/mL with phosphate-citrate buffer, and then 25 ⁇ L was vortexed with 75 ⁇ L SDS sample buffer and 5 ⁇ L NEM (100 mM N-ethylmaleimide) for denaturation. After centrifugation, the denatured sample was incubated at 70 ⁇ 2 ° C for 10 ⁇ 2 min, cooled at room temperature, and then centrifuged again. Separation was performed on the PA800 plus using an SDS separation gel kit and uncoated fused silica capillaries. The high-speed separation mode was used, and the effective separation length of the capillary was 10 cm.
  • Protein solution turbidity test (OD405): The sample turbidity was tested using the Envision multifunctional microplate reader. The buffer solution was used as the blank control, and the difference between the sample and the blank control was the OD value of the sample at 405 nm.
  • Microfluidics Imaging The number of subvisible particles in the sample is determined by Protein Simple’s MFI 5200. The sample does not need to be diluted and 1 mL is directly injected using a pipette. The number of particles in the range of ⁇ 2 ⁇ m, ⁇ 10 ⁇ m, and ⁇ 25 ⁇ m per mL of sample is reported.
  • Whole-column imaging capillary isoelectric focusing (icIEF): The sample is mixed with an appropriate mixture containing pl markers and amphoteric electrolytes and then enters the FC-coated capillary of the iCE3 system through an autosampler. After the high voltage separation step, the different charge isomers of the protein migrate to their respective isoelectric point positions, and then the positions determined after separation are captured by the UV detector (UV absorption spectrum collected at UV280nm by a CCD camera with full column detection). Using the iCE system software, the isoelectric point of the sample peak is calibrated by the focusing position of the sample peak and the corresponding pl marker, and subsequent data analysis is performed in the Empower software. The chromatographic conditions are shown in Table 11 below.
  • Binding activity This method uses the anti-MASP-2 antibody C4 activation inhibition assay.
  • the coating is mannan
  • the detection antibody is Complement C4c Antibody (HRP)
  • the substrate of the enzyme reaction is TMB.
  • the mannan coating is adsorbed on the ELISA solid phase carrier adsorption plate, and after washing and blocking, the test sample and human serum complement mixture are added to bind to it.
  • the higher the sample concentration the stronger the effect of inhibiting the cleavage of C4 by MASP-2 in the serum, the lower the C4b content, and the less C4c is obtained by shearing.
  • the detection antibody is added, and then the unbound detection antibody is removed by incubation and washing.
  • the substrate is added for color development, and finally the reaction stop solution is added.
  • the absorbance value is read on the microplate reader, and the detection wavelength is 450nm/650nm.
  • the log value of the anti-MASP-2 antibody protein concentration is used as the horizontal axis, and the OD 450nm-650nm value is used as the vertical axis for four-parameter fitting to obtain the IC 50 value of the sample and the standard.
  • the final results are reported as relative activity, i.e., the IC50 value of the standard divided by the IC50 value of the sample.
  • the sample prescription information, stability test placement conditions and test methods are shown in Table 12.
  • the UFDF sample was prepared by dialysis replacement into the target prescription buffer, then diluted to 30 mg/mL with the corresponding excipient stock solution, and finally filtered with a 0.22 ⁇ m PVDF membrane.
  • sucrose F4 sucrose F4
  • the sample prescription information, stability test placement conditions and test methods are shown in Table 14.
  • the UFDF sample was diluted to 50 mg/mL with the corresponding excipient stock solution and finally prepared by filtration with a 0.22 ⁇ m PVDF membrane. 1 mL of the sample was taken into a 2R vial for a 40°C test, 2 mL of the sample was taken into a 6R vial for a stirring test, and 2 mL of the sample was taken into a 2R vial for a shaking test.
  • the sample prescription information and test method are shown in Table 23.
  • the UFDF sample was prepared by dialysis replacement into the target prescription buffer, then diluted to 30 mg/mL with the corresponding excipient stock solution, and finally filtered with a 0.22 ⁇ m PVDF membrane. After the sample preparation was completed, its appearance, concentration, osmotic pressure, viscosity, k D , and T onset were measured.
  • the concentration of insoluble particles ⁇ 25 ⁇ m was less than 10/mL for all formulations; and less than 100/mL for insoluble particles ⁇ 10 ⁇ m for all formulations.
  • the concentration of insoluble particles ⁇ 2 ⁇ m and ⁇ 10 ⁇ m in F19 (Cit6.0) showed a significant increase trend, and no significant differences were observed among the other formulations.
  • the SEC HMW% content of proteins in the histidine formulation was generally small, and the SEC HMW% content of proteins in the acetic acid formulation and the citric acid formulation increased with increasing pH, and the SEC HMW% of F14 (Ace5.5) increased to a greater extent.
  • the stability of the acetic acid and histidine systems is better.
  • the pH 4.5 and pH 5.0 in the acetic acid system, and the pH 5.0 and pH 5.5 in the histidine system have good stability for proteins.
  • the acetate buffer system has good buffering capacity and robustness at pH 5.0 and the histidine system has good buffering capacity and robustness at pH 5.5, there is a good operating space when adjusting the pH in the process, and there is better risk control for extreme situations that deviate from the target value.
  • the use of histidine is less irritating and has higher patient tolerance. Therefore, F13 (Ace5.0) acetate buffer pH 5.0 and F16 (His5.5) histidine buffer pH 5.5 are preferred buffer systems.
  • the sample prescription information and test method are shown in Table 33.
  • the sample was replaced by dialysis into the target prescription buffer, then diluted to 20 mg/mL with the corresponding excipient stock solution, and finally filtered with a 0.22 ⁇ m PVDF membrane. After the sample preparation was completed, its appearance, concentration, osmotic pressure, viscosity, kD, and Tonset were measured.
  • the basic properties (appearance, concentration, pH, biological activity) of prescription F21 did not change significantly after stirring, freezing and thawing, illumination, shaking, and incubation at 5°C, 25°C, 40°C, -20°C, and -30°C.
  • the particle size and PD% results there was no significant difference under stability conditions except 40°C; because 40°C is a more severe stress condition for protein preparations, it is normal for the results to change significantly, and the specific judgment should be based on the results of SEC, NR-CE, and CEX.
  • ND means not detected
  • the results of the low-concentration formula confirmation experiment showed that the final formula F21 can maintain long-term stability at 5°C, 25°C, -20°C, and -30°C, has good tolerance to freezing, thawing, and shaking, does not change under light and stirring conditions, and will change to a certain extent under 40°C, so the sample should be prevented from being placed at high temperature for a long time.
  • the development of low-concentration preparations has undergone surfactant screening, excipient screening, pH screening, and final formula confirmation research, and the final low-concentration preparation formula was selected as 20mg/mL protein, 10mM histidine salt, 8.6% (w/v) sucrose, 0.05% (w/v) polysorbate 80, and pH 5.3.
  • the sample prescription information, stability test placement conditions and test methods are shown in Table 36.
  • the UFDF sample was concentrated by ultrafiltration and diluted to 150 mg/mL with the corresponding excipient stock solution, and finally filtered with a 0.22 ⁇ m PVDF membrane.
  • the prepared samples were taken for k D , T onset and viscosity determination.
  • the kD values of acetate buffers at pH 4.5, 5.0, and 5.5 and histidine buffers at pH 5.0, 5.5, and 6.0 are all positive.
  • 10 mM acetate buffer at pH 5.0 the kD of the formulation with 5.8% sucrose and 230 mM proline as excipients is positive, while it is negative when the excipient is 125 mM arginine.
  • a positive kD indicates that the interaction between protein molecules in the system is a strong net repulsive force, which is beneficial to the long-term colloidal stability of the protein.
  • the kD is negative, it indicates that the interaction between protein molecules is a net attractive force, which is not conducive to the long-term colloidal stability of the protein.
  • Tonset can predict the thermal stability of proteins. Except for the F29 (ARG) arginine formulation, the Tonset values of all samples were greater than 60°C, indicating that in these formulations, the proteins had good thermal stability.
  • the concentrations of 125 mM arginine and 5.8% sucrose are lower than the target values and need to be further adjusted in subsequent experiments.
  • the kD of 10mM Acetate (pH 4.5, pH 5.0, pH 5.5) and 10mM Histidien (pH5.0, pH5.5 and pH6.0) are positive, and the Tonset values are all greater than 60°C, which all meet the test requirements.
  • the kD and Tonset of arginine are inferior to those of sucrose and proline.
  • the buffer system using histidine is less irritating to injection, and the pH should not be too low. Therefore, on the whole, 10mM Acetate, pH 5.0, 10mM Histidine, pH 5.0, and 10mM Histidine, pH 5.5 are preferred, and sucrose or proline are used for the next step of research.
  • sample prescription information, stability test placement conditions and test methods are shown in Table 38.
  • Fed-batch UFDF samples were first ultrafiltrated and concentrated to an appropriate concentration, then diluted to 150 mg/mL with the corresponding excipient stock solution, and finally filtered through a 0.22 ⁇ m PVDF membrane. 1 mL of sample was taken into a 2R vial for 25°C, 40°C and light tests, 2 mL of sample was taken into a 6R vial for stirring tests, and 2 mL of sample was taken into a 2R vial for shaking tests.
  • the osmotic pressure of all formulations was within the preset target (250-350 mOsm/kg H2O).
  • the formulations with sucrose as an excipient (F31, F32, F33, F37) had higher viscosity than the proline formulations (F34, F35, F36), and the histidine formulation had higher viscosity than the acetic acid formulation.
  • the pH of F34 (Ace50Pro), F35 (His50Pro), and F36 (Fed-Batch) was slightly higher than the target value and needed to be adjusted in subsequent experiments.
  • acetate buffer at pH 5.0 and histidine buffer at pH 5.0 and pH 5.5 were selected, and sucrose, proline, and 0.05% polysorbate 80 were used for the experiment.
  • the conditions of light, shaking, and pressure at 25°C and 40°C were investigated.
  • the differences in the stability of the stock solutions produced by the perfusion and batch fed culture processes were compared. The results showed that at 40°C, 25°C and light, the purity change of histidine buffer was less than that of acetate buffer, and the stock solution produced by the batch fed process was more stable at 40°C than that produced by the perfusion process.
  • the sample prescription information, stability test conditions and test methods are shown in Table 44.
  • the UFDF sample was diluted to 100 mg/mL with the corresponding excipient stock solution and finally filtered through a 0.22 ⁇ m PVDF membrane. 2 mL of the sample was taken to 6R West Place 2 mL of sample in a 2R vial for a stirring test and 2 mL of sample in a 2R vial for a shaking test.
  • Sample prescription information, stability test placement conditions and test methods are shown in Table 46.
  • the UFDF sample was diluted with the mother solution to the target concentration of protein, sucrose and polysorbate 80, and then filtered with a 0.22 ⁇ m PVDF membrane. 2mL of the sample was taken into a 2R vial for -40°C, -20°C, 5°C, 25°C, 40°C stability, -20°C/-40°C freeze-thaw, shaking and light tests, 2mL of the sample was taken into a 6R vial for stirring test, and 2mL of the sample was taken into a 5mL PC bottle for -80°C freeze-thaw test.
  • the selected prescriptions were subjected to freeze-thaw, stirring, shaking, light, forced degradation (40°C), acceleration (25°C), and long-term (5/-20/-40°C) conditions at different temperatures.
  • the results showed that the purity of the samples did not change significantly under freeze-thaw, stirring, shaking, and long-term conditions.
  • the purity decreased under 25°C and light conditions.
  • the purity of the samples decreased significantly, but it did not affect the binding activity, and the PS80 concentration in the prescription did not decrease.
  • the high-concentration final formulation can maintain long-term stability at -40°C, -20°C, 5°C and 25°C, and has good tolerance to freezing, thawing and shaking. It will change under light and stirring conditions, and the change is greater under 40°C, so the sample should be protected from long-term light, high temperature and vigorous stirring.

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Abstract

本发明提供了包含以高浓度和低浓度存在的特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体的稳定的药物制剂，以及包含所述制剂的试剂盒、药物组合物、单位剂型，和使用所述制剂和试剂盒、药物组合物、单位剂型用于抑制MASP‐2依赖性补体活化、治疗相关疾病的治疗方法，以及制备相应药剂的用途。本发明还提供了新的特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体。

Description

含有治疗性抗体的药物制剂及其用途 技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及治疗性抗体制剂的领域。更具体来说，本发明涉及包含特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体的药物制剂，及其用途。
背景技术
MASP-2(MBL相关的丝氨酸蛋白酶2)参与补体系统，它与MASP-1和两个C1q相关的丝氨酸蛋白酶C1r和C1s显示出显著的同源性。一旦凝集素识别并与病原体结合，MASP-2的酶原形式就会在CCP2和SP结构域之间裂解(在保守的R444和I445之间裂解)，变成由两条多肽链(重链/A链和轻链/B链)组成的活性形式，通过二硫键(C434-C552)连接(A.B.W.Boldt et al.,Human Immunology,72(9):753-760(2011))。当MBL与病原体结合时，MASP-2被激活，将补体成分C4和C2裂解为C4a、C4b、C2a和C2b，生成C3转化酶C4bC2b，随后C3被C4bC2b转化为C3b，最后在C5被C3b转化为C5b后形成膜攻击复合物(MAC)。C3的激活最终导致MAC的形成，然后启动下游补体系统的一系列级联激活过程，刺激先天免疫反应。事实上C4b可以激活C4d的生成。C4d的沉积可能是补体激活的一个标志。有研究表明，C4d阳性染色是IgAN患者发生ESRD的独立风险因素(见，Clin J Am Soc Nephrol 9:897-904,2014)，在IgAN患者中，有C4d染色的肾脏比没有C4d染色的肾脏生存时间明显短。在狼疮性肾炎和膜性肾小球肾炎患者的肾脏中也检测到C4d染色。MASP-2已被确定为治疗自身免疫性疾病的一个非常有希望的靶点。
除了在免疫防御中的重要作用外，补体系统在许多临床情况下也会造成组织损伤。目前，仍然需要治疗上有效的补体抑制剂，如新的MASP-2抗体，特别是那些具有有利的高结合亲和力和特异性的抗体，以防止不良反应。
治疗性抗体需要配制为适用于向患者给药的制剂，并且所述制剂还能够维持其在储存和后续使用期间的稳定性。例如，如果所述制剂溶液配置不当，其中的治疗性抗体可能更容易发生降解、聚集和/或非所需甚至有害的化学修饰。液体制剂中的抗体的稳定性不仅视制剂中所使用的赋形剂的种类而定，并且还视赋形剂相对于彼此的量和比例而定。此外，当制备液体抗体制剂时，除稳定性之外，还必须考虑其它因素，例如给定制剂可容纳的抗体浓度和制剂的视觉质量或外观，等等。因此，当配制治疗性抗体制剂时，必须格外谨慎以获得保持稳定、含有足够浓度的抗体且具有使得制剂能够方便地施用至患者的其它特性的制剂。
对于抗MASP-2抗体，例如，Omeros公司的单抗Narsoplimab(OMS721)进入了III期临床，其在中国专利申请号CN201780051640.7中公开了MASP-2抗体制剂，含185mg/mL的蛋白，20mM L-组氨酸，200mM L-精氨酸HCl，0.01％(w/v)的聚山梨酯80，pH5.5-6.5。然而，上述制剂处方不能使本发明抗MASP-2单抗达到符合要求的稳定性，因此对于本发明提供的新型抗MASP-2单克隆抗体，仍有开发稳定的针对本发明抗MASP-2抗体的稳定的液体制剂需要。
发明简述
MASP-2是重要和有利的治疗靶标。本发明提供了本发明抗MASP-2抗体制剂处方，可以使得本发明抗MASP-2单抗在较高浓度和低浓度情况下的液体状态时维持较好的稳定性，满足生产工艺和临床给药的需求，可以支持将本发明抗MASP-2单抗开发为静脉注射液和皮下注射液。本发明还提供了针对MASP-2的抗体。
一、本发明的抗体制剂
一方面，本发明提供了一种稳定液体药物制剂，其特征在于，所述药物是特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段，并且所述制剂还包含缓冲液、表面活性剂、和辅料。
在本发明的一些实施方案中，所述稳定液体药物制剂中所述的缓冲液包含组氨酸和/或醋酸缓冲体系；所述表面活性剂包含聚山梨酯；所述辅料包含蔗糖、海藻糖和/或脯氨酸；所述稳定液体药物制剂的pH值为4.7-6.1。
因此，在本发明的一些实施方案中，提供了一种稳定液体药物制剂，其包含：(a)特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段；(b)包含组氨酸和/或醋酸缓冲体系的缓冲液；(c)包含聚山梨酯的表面活性剂；和(d)包含蔗糖、海藻糖和/或脯氨酸的辅料；其中所述制剂的pH为4.7-6.1。
在一些实施方案中，抗体浓度为10mg/ml±1mg/ml至200mg/ml±20mg/ml。在一些实施方案中，抗体浓度为20mg/ml±2mg/ml。在一些实施方案中，抗体浓度为60mg/ml±6mg/ml。在一些实施方案中，抗体浓度为100mg/ml±10mg/ml。在一些实施方案中，抗体浓度为150mg/ml±15mg/ml。在一些实施方案中，抗体浓度为约20mg/ml至约100mg/ml。
在一些实施方案中，所述缓冲液包含组氨酸，并且其浓度为5mM±1mM至20mM±4mM。在一些情况下，组氨酸缓冲液浓度为10mM±2mM。在一些实施方案中，组氨酸缓冲液包含L-组氨酸和一水合L-组氨酸盐酸盐。在一些情况下，所述缓冲液包含0.175mg/ml的L-组氨酸和1.86mg/ml的一水合L-组氨酸盐酸盐。
在一些实施方案中，所述缓冲液包含醋酸，并且其浓度为5mM±1mM至20mM±4mM。在一些情况下，醋酸缓冲液浓度为10mM±1mM。在一些实施方案中，醋酸缓冲液包含醋酸和三水合醋酸钠。
在一些实施方案中，聚山梨酯浓度为0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)。在一些情况下，聚山梨酯浓度为0.05％±0.01％(w/v)。在一些实施方案中，聚山梨酯为聚山梨酯20。在一些实施方案中，聚山梨酯为聚山梨酯80。
在一些实施方案中，所述辅料是蔗糖。在一些实施方案中，蔗糖浓度为5.5％±0.5％至9％±0.5％(w/v)。在某些实施方案中，蔗糖浓度为5.8％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)。在一些实施方案中，蔗糖浓度为5.8％±0.5％(w/v)。在一些实施方案中，蔗糖浓度为6.0％±0.5％(w/v)。在一些实施方案中，蔗糖浓度为6.5％±0.5％(w/v)。在一些实施方案中，蔗糖浓度为7.0％±0.5％(w/v)。在一些实施方案中，蔗糖浓度为8.6％±0.5％(w/v)。
在一些实施方案中，所述辅料是海藻糖。在一些实施方案中，海藻糖浓度为5.5％±0.5％至9％±0.5％(w/v)。在某些实施方案中，海藻糖浓度为7.0％±0.5％至9.0％±0.5％(w/v)。在一些实施方案中，海藻糖浓度为7.0％±0.5％(w/v)。在一些实施方案中，海藻糖浓度为8.0％±0.5％(w/v)。在一些实施方案中，海藻糖浓度为9.0％±0.5％(w/v)。
在一些实施方案中，所述辅料是脯氨酸。在一些实施方案中，脯氨酸浓度为200mM至300mM。在某些实施方案中，脯氨酸浓度为200mM至250mM。在一些实施方案中，脯氨酸浓度为230mM。
在一些实施方案中，用于本发明的制剂中的缓冲液可以将本发明的制剂的pH控制在大约4.7-6.1的范围，优选大约5.0-6.0，更优选约5.0-5.5，最优选为5.3±0.1。在一些具体的实施方案中，本发明的抗体制剂具有约4.7、5.0、5.2、5.3、5.4、5.5、6.0、6.1、6.2、6.5的pH值。
在本发明优选的实施方案中，本发明的液体制剂中的表面活性剂是聚山梨酯，诸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、或聚山梨酯-40；普洛尼克等。在一个优选实施方案中，本发明的液体制剂中包含聚山梨酯-80作为表面活性剂。在另一个优选实施方案中，本发明的液体制剂中包含聚山梨酯-20作为表面活性剂。
在一个实施方案中，所述液体制剂是胃肠外给药制剂，优选为注射剂，更优选为皮下注射剂或静脉内注射剂。在一个实施方案中，所述液体制剂为静脉输注剂。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)20mg/ml±2mg/ml至200mg/ml±20mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，或200mM至300mM脯氨酸，
pH为4.7至6.0。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)20mg/ml±2mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
pH为5.3±0.5。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)60mg/ml±6mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
pH为5.3±0.5。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)100mg/ml±10mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
pH为5.3±0.5。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)150mg/ml±15mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
pH为5.3±0.5。
本发明的液体制剂可以长期稳定储存，例如至少24个月或更长时间。在一个实施方案中，本发明的液体制剂可以在约-80℃至约45℃，例如-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约5℃、约25℃、约35℃、约38℃、约40℃、约42℃或约45℃的条件下，储存至少10天、至少20天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，至少36个月，或更长时间，且是稳定的。
在一些实施方案中，本发明的液体制剂具有2-10μm的平均粒径，如通过微流成像系统(MFI)所测定的。
在一些实施方案中，本发明的液体制剂具有250～350mOsm/kg H2O之间的质量渗透压摩尔浓度。
在一些实施方案中，本发明的液体制剂具有约1.0厘泊-30厘泊的粘度，例如约1.0厘泊-10厘泊的粘度。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0厘泊-20厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0厘泊-10厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在4-40℃的粘度为约5.0厘泊-7.0厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在4-40℃的粘度为约6.8厘泊。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约6.8厘泊。
在一个实施方案中，本发明的液体制剂可以稳定储存至少24个月。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在-80℃至45℃之间的任何温度下是稳定的。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在约2℃-8℃保持稳定至少3个月，优选至少12个月，更优选至少24个月，最优选至少36个月。在一个实施方案中，本发明的液体制剂在室温或例如约25℃保持稳定至少2个月，优选至少3个月，更优选至少6个月，最优选至少12个月。在再一实施方案中，本发明的液体制剂在约40℃保持稳定至少2周、优选至少1个月、更优选至少6周、最优选至少8周。所述稳定例如表现为例如溶解状态下的抗体单体纯度超过95％，优选98％，更优选99％。
在一个实施方案中，可以通过检测制剂的外观、可见异物、蛋白含量、单体纯度、和/或电 荷变异体的变化，来指示储存后制剂的稳定性。在一个实施方案中，可以在高温胁迫的强制实验中，例如在40℃±2℃储存至少1周、2周或优选地1个月后，或在加速实验中，例如在25℃±2℃储存至少1个月或2个月后，或在长期实验中，例如在5℃±3℃储存至少6个月或12个月后，检测本发明液体制剂的稳定性。所述稳定例如表现为溶解状态下的抗体单体纯度超过95％，优选98％，更优选99％。
在一个实施方案中，在储存后，通过目视检查本发明液体制剂的稳定性，其中本发明液体制剂在外观上保持为澄清至微乳光，为无色至淡黄色液体，且无异物。在一个实施方案中，在澄明度检测仪下目视检查，制剂中无可见异物存在。在一个实施方案中，检测制剂在约405nm或约350nm处的吸光度以测定溶液混浊度。在一个实施方案中，通过测定蛋白在升温过程中发生构型变化或聚集而使得粒径发生变化时的转变温度Tonset，检查本发明液体制剂的稳定性，优选Tonset高于60℃、63℃、65℃、68℃或70℃。在一个实施方案中，在储存后，通过测定蛋白含量变化，检查本发明液体制剂的稳定性，相对于储存第0天的初始值，蛋白含量变化率不超过10％，优选不超过5％。在一个实施方案中，在储存后，通过测定本发明液体制剂中抗体的单体纯度变化，检查本发明液体制剂的稳定性，其中通过体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)，相对于储存第0天的初始值，单体纯度的变化值不超过10％，例如不超过5％、4％、3％、例如变化值不超过1-2％，优选不超过1％。在另一个实施方案中，在储存后，通过非还原型和/或还原型十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)法，单体纯度的变化值下降不超过10％，例如不超过5％、4％、3％。在一个实施方案中，在储存后，通过全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(icIEF)或阳离子交换高效液相色谱法(CEX-HPLC)检测本发明液体制剂的稳定性，其中相对于储存第0天的初始值，抗体的电荷变异体(主成分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过50％，例如不超过40％、30％、20％、10％、5％。
在一些实施方案中，制剂在储存后，例如在2-8℃储存至少24个月后，或在室温储存至少3个月后，或在40℃±2℃储存1个月后，是稳定的，优选地具有如下特征之一或多项：
(i)通过SEC-HPLC法测量，制剂具有大于90％的抗体单体纯度，优选大于95％、96％、97％、98％、99％的纯度；
(ii)通过还原型或非还原型CE-SDS法(例如，非还原型CE-SDS)测量，制剂具有大于90％的抗体单体纯度，优选大于92％、94％、96％、98％的纯度；
(iii)通过iCIEF或CEX法测量，相对于储存第0天的初始值，制剂中抗体蛋白的各组分(主成分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过50％，例如不超过40％、30％、20％、10％、5％。
在一些实施方案中，制剂在振摇后(例如，振摇14天后)，搅拌后(例如，搅拌6小时后)，光照后(例如，光照3天后)，和/或冻融后(例如，经5轮冻融后)，是稳定的，优选地具有如下特征之一或多项：
(i)通过SEC-HPLC法测量，制剂具有大于90％的抗体单体纯度，优选大于95％、96％、97％、98％、99％的纯度；
(ii)通过还原型或非还原型CE-SDS法(例如，非还原型CE-SDS)测量，制剂具有大于90％的抗体单体纯度，优选大于92％、94％、96％、98％的纯度；
(iii)通过iCIEF或CEX法测量，相对于储存第0天的初始值，制剂中抗体蛋白的各组分(主成分、酸性组分和碱性组分)的变化值总和不超过50％，例如不超过40％、30％、20％、10％、5％。
在本发明的优选实施方案中，本发明的制剂具有高的抗体浓度，同时其具有适合给药尤其皮下给药的低粘度，具有高的物理和化学稳定性，存放时不易产生聚集体和颗粒并且较不易发生电荷异质性变化。这些优点对于生产完全、有效、高一致性的临床药品是十分有益的。
在一个方面，本发明提供了一种递送装置，其包含本发明的液体抗体制剂。在一个实施方案中，本发明的递送装置以包含本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的预填充注射器形式提供，例如用于静脉内、皮下、皮内或者肌内注射、静脉内输注。
在又一方面，本发明提供向受试者，例如哺乳动物，例如人，施用抗体的方法，包括给予所述受试者本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂的步骤，所述递送是例如通过使用预填充注射器的递送装置实施的。
在又一方面，本发明提供本发明的液体抗体制剂或固体抗体制剂用于制备在受试者中治疗、预防或延缓与……相关的病症的递送装置(如，预填充注射器)或药物的用途，所述病症例如……。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)20mg/ml±2mg/ml抗体，(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)20mg/ml±2mg/ml抗体，(b)包含10mM±2mM组氨酸的缓冲液，(c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)20mg/ml±2mg/ml抗体，(b)0.175mg/ml L-组氨酸，(c)1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，(d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(e)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)60mg/ml±6mg/ml抗体，(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)60mg/ml±6mg/ml抗体，(b)包含10mM±2mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，(c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)60mg/ml±6mg/ml抗体，(b)0.175mg/ml L-组氨酸，(c)1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，(d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(e)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)100mg/ml±10mg/ml抗体，(b)包含5mM±1 mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)100mg/ml±10mg/ml抗体，(b)包含10mM±1mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，(c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)100mg/ml±10mg/ml抗体，(b)0.175mg/ml L-组氨酸，(c)1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，(d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(e)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)150mg/ml±15mg/ml抗体，(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)150mg/ml±15mg/ml抗体，(b)包含10mM±1mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，(c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)150mg/ml±15mg/ml抗体，(b)0.175mg/ml L-组氨酸，(c)1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，(d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(e)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在这些实施例中的任一者中，聚山梨酯可为聚山梨酯80或聚山梨酯20，优选聚山梨酯80。
在一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其中所述组合物包含如上文或本文所论述的药物制剂，且所述组合物容纳于容器中。在一些实施方案中，容器为小瓶。在一些情况下，小瓶为2ml、5ml、10ml或20ml的1型透明玻璃小瓶。在一些实施方案中，容器为注射器。在一些情况下，注射器为低钨玻璃。在一些实施方案中，容器为预填充注射器。在一些实施方案中，组合物容纳于自动注射器中。
在一个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其包含(i)含有包含如上文或本文所论述的药物制剂的组合物的容器，和使用所述组合物的说明书。在一些实施方案中，容器为玻璃小瓶。在一些实施方案中，容器为预填充注射器。在一些实施方案中，容器为自动注射器。
在一个方面中，本发明提供了包含如上文或本文所论述的药物制剂的单位剂型，其中抗体以0.1mg至500mg的量存在。在一些情况下，抗体以200-400mg的量存在。在一些实施方案中，单位剂型为玻璃小瓶，例如西林瓶。在一些实施方案中，单位剂型为预填充注射器。在一些实施方案中，单位剂型为自动注射器。
在上文或本文所论述的药物组合物、试剂盒或单位剂型中的任一者中，含有药物制剂的容器可包含顶隙，所述顶隙包含气体，其中所述气体包含小于5体积％的氧气。在一些情况下，气体包含小于1体积％的氧气。在一些情况下，气体包含不超过0.1体积％的氧气。
在一个方面中，本发明提供含有药物组合物的容器，其中所述组合物包含如上文或本文中所论述的药物制剂。在一些情况下，容器为注射器。在一些情况下，容器为预填充注射器。在 一些情况下，容器为自动注射器。在一些情况下，容器为玻璃小瓶。
在各种实施例中，上文或本文所论述的实施例的特征或组分中的任一者可组合，且此类组合涵盖于本发明案的范围内。上文或本文所论述的任何具体值可与上文或本文所论述的另一相关值组合以叙述范围，其中所述值表示所述范围的上端和下端，且此类范围和属于此类范围内的所有值涵盖于本发明案的范围内。上文或本文所论述的值中的每一者可表示为具有1％、5％、10％或20％的变化。举例来说，10mM浓度可表示为10mM±0.1mM(1％变化)、10mM±0.5mM(5％变化)、10mM±1mM(10％变化)或10mM±2mM(20％变化)。
二、本发明的抗MASP-2抗体
在一个方面中，本发明提供结合MASP-2或其片段(优选人MASP-2蛋白)的抗MASP-2抗体或抗体片段(优选抗原结合片段)。
在一些实施方案中，本发明提供了新型单克隆抗MASP-2抗体及其片段。
在一个方面，本发明提供了特异性结合MASP-2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段表现出以下一个或多个特征：a)与小鼠或大鼠没有交叉反应；b)与OMS721相比，在猴体内具有更长的血清半衰期；c)与C1s、C1r、MASP1或MASP3没有交叉反应；d)能够选择性地阻断MBL途径的补体激活；e)能够与人MASP-2特异性结合，其KD值不超过27.8nM(或不超过25nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM、0.01nM、0.009nM、0.008nM、0.007nM、0.006nM、0.005nM、0.004nM、0.003nM、0.002nM，或0.001nM)，如由Bio-Layer Interferometry所测量的；f)能够阻断补体C3的激活，在1％的人血清中通过ELISA测定其IC50不超过0.08μg/mL(或不超过0.07μg/mL、0.06μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL、0.02μg/mL或0.01μg/mL)，或在10％的人血清中通过ELISA测定其IC50不超过0.20μg/mL(或不超过0.15μg/mL、0.10μg/mL、0.09μg/mL、0.08μg/mL、0.07μg/mL、0.06μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL、0.02μg/mL、或0.01μg/mL)；g)能够在50％人血清中阻断补体C3的激活；h)能够阻断补体C4的激活，在2％的人血清中通过ELISA测定其IC50不超过0.11μg/mL(或不超过0.10μg/mL、0.09μg/mL、0.08μg/mL、0.07μg/mL、0.06μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL、0.02μg/mL，或0.01μg/mL)，或在10％的人血清中通过ELISA测定其IC50不超过0.69μg/mL(或不超过0.65μg/mL、0.6μg/mL、0.55μg/mL、0.5μg/mL、0.45μg/mL、0.4μg/mL、0.35μg/mL、0.3μg/mL、0.25μg/mL、或0.2μg/mL、0.15μg/mL、0.1μg/mL、0.09μg/mL、0.08μg/mL、0.07μg/mL、0.06μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL、0.02μg/mL、或0.01μg/mL)；i)能够阻断MAC的形成，在2％的人血清中通过ELISA测定其IC50不超过0.27μg/mL(或不超过0.25μg/mL，或0.2μg/mL，0.15μg/mL、0.1μg/mL、0.09μg/mL、0.08μg/mL、0.07μg/mL、0.06μg/mL、0.05μg/mL、0.04μg/mL、0.03μg/mL、0.02μg/mL、或0.01μg/mL)。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
包含DYYIN(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的重链CDR1，
包含WIFPGSX1SX2YX3X4X5X6FX7X8(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的重链CDR2，和
包含GDRSGPFX9Y(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的重链CDR3；和/或
包含KSSQSLLYSNGKTYLN(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列的轻链CDR1，
包含LVSKLDS(SEQ ID NO:5)氨基酸序列的轻链CDR2，和
包含VQX10THFPFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的轻链CDR3。
其中X1是E、D或G，X2是A或P，X3是H或Y，X4是S或N，X5是E或Q，X6是K或N，X7是K或Q，X8是A或G，X9是A或P，和X10是V或G。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，和/或
包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2，和/或
包含选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR3；和/或
包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或
包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或
包含选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2，以及包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；或
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR2，以及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR3；或
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2，以及包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；或
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2，以及包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段进一步包含：
包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2，和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR3；或
包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2，以及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR3。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链CDR2，以及包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2，以及包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR3；或。
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR2， 以及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2，以及包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR3；或
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2，以及包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2，以及包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR3；或
包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2，以及包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2，以及包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR3。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列的重链可变区；
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列的重链可变区；或
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列的重链可变区。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，或具有至少80％同一性的序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或具有至少80％同一性的序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，或具有至少80％同一性的序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或具有至少80％同一性的序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26具有至少80％序列同一性的氨基酸序列和/或轻链可变区包含与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段包含：
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区；或
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含一个或多个氨基酸残基突变，但仍保留对MASP-2的特定结合亲和力。在某些实施方案中，至少有一个突变是保守取代，或所有的突变都是保守取代。在某些实施方案中，至少一个突变是发生在CDR序列中的一个或多个位置，和/或在重链可变区或轻链可变区的非CDR序列中的一个或多个位置。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区，可选地包含IgG的重链恒定区，和/或轻链恒定区。在某些实施方案中，恒定区包括小鼠恒定区、兔恒定区或人恒定区，任选地恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在某些实施方案中，重链恒定区包含相对于野生型人IgG恒定区在氨基酸残基252、254或256处的一个或多个氨基酸取代，任选地，氨基酸残基252处的氨基酸取代是被酪氨酸取代，氨基酸残基254处的氨基酸取代是被苏氨酸取代，氨基酸残基256处的氨基酸取代是被谷氨酸取代。在某些实施方案中，重链恒定区包含与野生型人IgG恒定区氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，并且相对于野生型人IgG恒定区具有氨基酸残基252处被酪氨酸取代，氨基酸残基254处被苏氨酸取代，和氨基酸残基256处被谷氨酸取代。
在某些实施方案中，所述抗MASP-2抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体、融合蛋白、二聚或多聚抗体、或修饰的抗体(例如糖基化修饰的抗体)。
在某些实施方案中，所述抗MASP-2抗体或其抗原结合片段是双体抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')。二硫键稳定的双体抗体(ds diabody)，单链抗体分子(scFv)，scFv二聚体(二价双体抗体)， 多特异性抗体，骆驼单域抗体，纳米抗体，域抗体，或二价域抗体。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性地与MASP-2结合，与C1s、C1r、MASP1或MASP3没有交叉反应。
在本发明的优选的实施方案中，所述抗MASP-2抗体或其抗原结合片段具有如下表所示的序列：
表1 小鼠抗MASP-2抗体和人源化129C10抗体的CDR序列
表2 本发明的抗体序列



在某些实施方案中，本发明提供的抗体及其抗原结合片段是人源化的。人源化抗体或抗原结合片段在降低针对人的免疫原性方面具有优势。人源化抗体在其可变区是嵌合的，以非人的CDR序列嫁接到人FR序列(或基本上是人的FR序列)。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可以通过在人免疫球蛋白基因中用非人(如鼠)CDR基因替换相应的人CDR基因来实现(例如，参见Jones et al.(1986)Nature 321:522-525；Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science 239:1534-1536)。在一些实施方案中，本文提供的人源化抗体或抗原结合片段基本全部由人序列组成，除了CDR序列是非人的。在某些实施方案中，可变区FR和恒定区(如果有)完全或基本上完全来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以来自不同的人免疫球蛋白基因，例如，FR序列来自一个人的抗体，恒定区来自另一个人的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体或抗原结合片段包括人重/轻链FR1-4。
在某些实施方案中，本发明提供的人源化抗体及其抗原结合片段包含人胚系框架序列VH/1-2的一个或多个重链FR序列，和/或人胚系框架序列VK/2-30的一个或多个轻链FR序列，有或没有回复突变。可以根据需要在人胚系框架序列中引入回复突变。在某些实施方案中，本发明的人源化抗体129C10可以包含一个或多个选自下组的突变：在重链框架序列VH/1-2中的R71V,A93T,V67A和M69L(基于Kabat编号)，和/或重链CDR2中的A65G,K64Q,E61Q(基于Kabat编号)。人源化抗体129C10可以包含一个或多个选自下组的回复突变：轻链框架序列VK/2-30中的F36L和T69A(基于Kabat编号)。
在某些实施方案中，本文提供的抗体及其抗原结合片段的人源化重链和轻链在人体内基本 上没有免疫原性，并保持与MASP-2的母体抗体基本相同或甚至更高的亲和力。
在一些实施方案中，本文所述的抗MASP-2抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol 5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol 20：450-459(2008)。
在一些实施方案中，本文所述的抗MASP-2抗体是嵌合抗体。
三、本发明抗体或其制剂的治疗方法和用途
本发明还提供了治疗方法，包括将治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合片段，或本发明的抗体药物制剂，或本发明的药物组合物、试剂盒或单位剂型施用于需要的受试者，从而治疗或预防MASP-2依赖性补体激活相关疾病或病症。
本发明提供了在需要的受试者中通过抑制MASP-2而抑制MASP-2依赖性补体激活的方法，或治疗或预防与MASP-2依赖性补体激活相关的病症或疾病的方法，这些方法包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或抗原结合片段，或本发明的抗体药物制剂，或本发明的药物组合物、试剂盒或单位剂型。
在另一个方面，本发明提供了治疗受试者中受益于抑制MASP-2依赖性补体激活的病症的方法，包括将治疗有效量的本文提供的抗体或抗原结合片段，或本发明的抗体药物制剂，或本发明的药物组合物、试剂盒或单位剂型施用于需要的受试者。
在另一个方面，本发明进一步提供了降低受试者血清C4水平的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段，或本发明的抗体药物制剂，或本发明的药物组合物、试剂盒或单位剂型，从而降低受试者的血清C4的水平。
在另一个方面，本发明进一步提供了一种治疗受试者的病症的方法，其中所述病症将受益于受试者血清C4水平的降低，包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段，或本发明的抗体药物制剂，或本发明的药物组合物、试剂盒或单位剂型，从而治疗该病症。
在另一个方面，本发明进一步提供了治疗或预防与血清C4水平异常(例如升高)相关的病症或疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的抗体或其抗原结合片段，或本发明的抗体药物制剂，或本发明的药物组合物、试剂盒或单位剂型，从而治疗所述病症或疾病。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括施用第二种治疗剂。
在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，给药是通过口服、鼻饲、静脉注射、皮下注射、舌下注射或肌肉注射。
在一个方面，本发明进一步提供了本发明提供的抗体或其抗原结合片段，或本发明的抗体药物制剂，或本发明的药物组合物、试剂盒或单位剂型在制造药剂中的用途，其中所述药剂用于以下中的一者或多者：
(1)用于抑制MASP-2依赖性补体激活；
(2)用于治疗或预防MASP-2依赖性补体激活相关疾病或病症；
(3)用于治疗受试者中受益于抑制MASP-2依赖性补体激活的病症；
(4)用于降低受试者血清C4水平；
(5)用于治疗受试者中受益于受试者血清C4水平的降低的病症；
(6)用于治疗或预防与血清C4水平异常(例如升高)相关的病症或疾病。
在一些实施方案中，前述任何疾病或病症包括自身免疫性疾病、血管病症、缺血再灌注损伤、动脉硬化、炎症、肺部病症、体外再灌注过程、肌肉骨骼病症、肾脏病症、皮肤病症、器官或组织移植过程、神经系统疾病或损伤、血液疾病、泌尿生殖系统疾病、非肥胖型糖尿病或与1型或2型糖尿病相关并发症、癌症、内分泌疾病、眼科疾病或COVID-19(新冠肺炎)。
在一些具体的实施方案中，所述自身免疫性疾病包括血栓性微血管病(TMA)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、造血移植相关的血栓性微血管病(TA-TMA)、狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)和IgA肾病。
在一些具体的实施方案中，所述血管病症血管病症包括心血管病症、脑血管病症、外周(如肌肉骨骼)血管病症、肾血管病症、肠系膜/肠道血管病症、移植物和/或再移植物的血管再生、血管炎、亨-舍二氏紫癜性肾炎、系统性红斑狼疮相关的血管炎、与类风湿性关节炎相关的血管炎、免疫复合物血管炎、大动脉炎、扩张型心肌病、糖尿病血管病、川崎病(动脉炎)、静脉气体栓塞(VGE)，以及支架置入术、旋转动脉瘤切除术和经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄。
在一些具体的实施方案中，所述缺血再灌注损伤包括与主动脉瘤修复、心肺转流、与器官移植和/或肢体/手指再植有关的血管再吻合、卒中、心肌梗死和休克和/或外科手术后的血液动力学复苏有关的缺血再灌注损伤。
在一些具体的实施方案中，所述炎症包括炎症性胃肠道疾病，其包括胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征和憩室炎。
在一些具体的实施方案中，所述肺部病症包括急性呼吸窘迫综合征、输血相关性急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、慢性阻塞性肺病、哮喘、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基底膜病(Goodpasture病)；胎粪吸入综合征、闭塞性细支气管炎综合征、特发性肺纤维化、继发于烧伤的急性肺损伤、非心源性肺水肿、输血相关呼吸困难、肺气肿、囊性纤维化、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2(Covid-19)相关疾病。
在一些具体的实施方案中，所述体外循环再灌注过程包括血液透析、血浆去除术、白细胞去除术、体外膜氧合(ECMO)、肝素诱导体外膜氧合低密度脂蛋白沉淀(heparin-induced exfracorporeal membrane oxygenation LDL precipitation,HELP)和心肺转流术(CPB)。
在一些具体的实施方案中，所述肌肉骨骼病症包括骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风、神经性关节病、银屑病性关节炎、脊椎关节病、结晶性关节病和系统性红斑狼疮(SLE)。
在一些具体的实施方案中，所述肾脏病症包括系膜增生型肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎(系膜毛细血管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、亨-舍二氏紫癜性肾炎和IgA肾病。
在一些具体的实施方案中，所述皮肤病症包括银屑病、自身免疫性大疱性皮肤病、嗜酸性海绵形成、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解、妊娠疱疹、热烧伤和化学烧伤。
在一些具体的实施方案中，所述器官或组织移植过程包括器官异体移植、器官异种移植器官和组织移植。
在一些具体的实施方案中，所述神经系统疾病或损伤包括多发性硬化症、重症肌无力、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、格林巴利综合征、卒中后再灌注(reperfusion following stroke)、退变性椎间盘、脑外伤、帕金森氏病、阿尔茨海默病、Miller-Fisher综合征、脑外伤和/或出血、脱髓鞘和脑膜炎。
在一些具体的实施方案中，所述血液病包括败血症、严重败血症、败血症休克、败血症引起的急性呼吸窘迫综合症、全身炎症反应综合症、失血性休克、溶血性贫血、自身免疫性血栓性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征。
在一些具体的实施方案中，所述泌尿生殖系统病症包括疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎、间质性膀胱炎、不孕症、胎盘功能障碍和流产和先兆子痫。
在一些具体的实施方案中，所述内分泌疾病包括桥本氏甲状腺炎、压力、焦虑和激素性疾病，涉及垂体的催乳素、生长素或其他胰岛素样生长因子和促肾上腺皮质激素的调节性释放。
在一些具体的实施方案中，所述眼科疾病包括年龄相关性黄斑变性。
本发明的治疗方法包含向个体施用包含如本发明的特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段的任何制剂、药物组合物或单位剂型。施用药物制剂的个体可为例如需要此类治疗的任何人类或非人类动物。
四、其它
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗MASP-2抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。
在一个实施方案中，本发明提供制备抗MASP-2抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包含在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗MASP-2抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。
在一方面中，本发明涉及检测样品中MASP-2蛋白的方法，所述方法包括(a)将样品与本发明所述的任何抗MASP-2抗体制剂或本发明的抗体接触；和(b)检测抗MASP-2抗体或其片段和MASP-2蛋白间的复合物的形成。在一个实施方案中，抗MASP-2抗体是被可检测地标记的。
本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有制剂或抗MASP-2抗体或其片段、方法和用途。
附图说明
图1显示MASP-2抗体阻断补体C3的激活。
图2显示MASP-2抗体阻断补体C4的激活。
图3显示MASP-2抗体阻断MAC的形成。
图4显示嵌合型和人源化MASP-2抗体阻断补体C3的激活。
图5显示MASP-2抗体129C10-hu和OMS721-analog在2％的人血清中阻断补体C4的激活。
图6显示MASP-2抗体129C10-hu和OMS721-analog在2％的人血清中阻断MAC的形成。
图7显示MASP-2抗体在1％人血清中阻断C3激活。
图8显示MASP-2抗体在10％人血清中阻断C3激活。
图9显示MASP-2抗体在50％的人血清中阻断C3的激活。
图10显示MASP-2抗体在10％的人血清中阻断C4的激活。
图11显示了MASP-2抗体129C10-hu与hMASP-2的亲和力动力学。
图12A-12E显示通过ELISA检测MASP-2抗体129C10-Hu与人C1s(12A)、C1r(12B)、MASP1(12C)、MASP3(12D)和MASP2(12E)的结合。
图13A-13B显示通过ELISA检测MASP-2抗体129C10-hu(13A)和OMS721-analog(13B)与人、食蟹猴、大鼠和小鼠MASP2的结合。
图14显示MASP-2抗体129C10-hu与食蟹猴MASP-2的交叉反应性。
图15显示MASP-2抗体129C10-hu中和三种补体激活途径的选择性。
图16A-16B显示MASP-2抗体129C10-hu-WT(16A)和129C10-hu-YTE(16B)与人FcRn的结合动力学曲线。
图17显示了MASP-2抗体129C10-hu-WT和129C10-hu-YTE在食蟹猴血清中的药代动力学(PK)结果。
图18A-18C显示了MASP-2抗体129C10-hu-WT和129C10-hu-YTE在食蟹猴血清中的PK和药效学(PD)结果。
图19显示了129C10-hu在第一次用药后对猴血清C4c的降低作用。
图20显示了129C10-hu在第四个剂量后对猴血清C4c的降低作用。
图21-图23涉及用于筛选制剂最适pH值的F12-F20处方于高温40℃条件下放置14天后的相关实验结果。图21所示为九个处方通过SEC检测HMW％的结果。图22所示为九个处方通过NR CE-SDS检测LMW％的结果。图23所示为九个处方通过CEX检测主峰、酸性峰和碱性峰的百分比的结果。
图24-图29涉及用于筛选最适辅料的F1-F5处方的相关实验结果。图24-图26分别为五个处方于高温40℃条件下放置14天后的SEC、NR CE-SDS和CEX结果。图27所示为各处方在振摇14天条件下的CEX结果。图28-29所示分别为各处方在搅拌6小时条件下的CEX、NR CE-SDS结果。
图30-图32涉及用于筛选最适表面活性剂的F6-F11处方的相关实验结果。图30所示为六个处方于高温40℃条件下放置14天后的SEC结果。图31-32所示分别为各处方在100rpm搅拌6小时条件下通过NR CE-SDS和CEX检测稳定性结果。
图33-图44涉及用于筛选最适处方的F31-F37处方的相关实验结果。图33-35分别为七个处方于高温40℃条件下放置4-6周后的SEC、NR CE-SDS和CEX结果。图36-38分别为七个处方于25℃条件下放置4-6周后的SEC、NR CE-SDS和CEX结果。图39-41分别为七个处方于光照3天条件下的SEC、NR CE-SDS和CEX结果。图42-44分别为七个处方于200rpm振摇条件下处理10天的SEC、NR CE-SDS和CEX结果。
发明详述
定义
除非另外规定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如本文所使用，当关于特定叙述数值或值范围使用时，本文所用的术语“约”将与其联用的数值浮动±10％。举例而言，如本文所使用，表述“约100”包括90和110和其间的所有值(例如90.5、95、101、105、109.95……等)。对于比例而言，术语“约”用于限定所给出的比例的每个数字。例如，比例约1:1是指比例为0.9～1.1:0.9～1.1。。
尽管类似或等效于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但现描述示例性方法和材料。本说明书中所提及的所有专利、申请和非专利出版物均以全文引用的方式并入本文中。
本文所用的术语“患者”是指可受益于本发明的难溶性抗肿瘤活性剂的哺乳动物和非哺乳动物个体。哺乳动物是指哺乳类的任何成员，其包括但不限于：人；非人灵长类动物，如黑猩猩及其它猿类和猴类物种；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊和猪；家畜，如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，如大鼠、小鼠和豚鼠；等等。非哺乳动物的例子包括但不限于鸟等。术语“患者”并不限定特定的年龄或性别。在一些实施方案中，所述“患者”是人。
如无特别说明，本文中“施用”和“给药”可互换使用。
如本文所用，术语“按体积计的重量百分比”或“％w/v”表示单一组分相对于含有该组分的混合物的总体积的百分比重量(以克计)。例如，总体积8ml中的500mg组分为6.25％w/v，总体积5ml中的500mg组分为10％w/v。
本文所用的术语"抗体"包括任何与特定抗原结合的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体、或双特异性抗体。天然的完整抗体包含两条重链(H)和两条轻链(L)。哺乳动物的重链分为α、δ、ε、γ和μ，每个重链由一个可变区(VH)和第一、第二和第三恒定区(分别为CH1,CH2,CH3)组成。哺乳动物的轻链分为λ和κ，而每条轻链由一个可变区(VL代表λ轻链，或VK代表κ轻链)和一个恒定区(CL代表λ轻链或CK代表κ轻链)组成。抗体呈"Y"形，Y的茎部由两条重链的第二和第三恒定区组成，通过二硫键结合在一起。Y的每个臂包括一个重链的可变区和第一恒定区与一个轻链的可变区和恒定区结合。轻 链和重链的可变区负责抗原结合。两条链的可变区通常包含三个高度可变的环，称为互补性决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以按照Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani的惯例来定义或识别(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4),927(1997)；Chothia,C.et al.,J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196,901(1987)；Chothia,C.et al.,Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.et al.,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。三个CDR散布在四个被称为框架区(FR)的侧翼之间，后者比CDR更高度保守，形成一个支架来支持高变异环。重链和轻链的恒定区域不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体分为不同的类别。抗体的五个主要类别或同型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的特点是分别包含α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别又分为几个亚类，如IgG1(γ1重链)，IgG2(γ2重链)，IgG3(γ3重链)，IgG4(γ4重链)，IgA1(α1重链)，或IgA2(α2重链)。
本文所用的术语"二价"是指具有两个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；术语"单价"是指仅具有一个单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；而术语"多价"是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是二价的。
在本文中，"双特异性"抗体指的是一种人工抗体，它有来自两个不同的单克隆抗体的片段，能够与两个不同的表位结合。这两个表位可以出现在同一个抗原上，或者它们可以出现在两个不同的抗原上。
本文所用的术语"抗原结合片段"是指由抗体的包含1、2或3个CDR的一部分形成的抗体片段，或任何其他能够与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的抗体片段。抗原结合片段的例子包括但不限于双体抗体diabody、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双体抗体(ds Diabody)。单链抗体分子(scFv)，scFv二聚体(二价双体抗体)，双特异性抗体，多特异性抗体，骆驼单域抗体，纳米抗体，域抗体和二价域抗体。抗原结合片段能够与母体抗体所结合的相同抗原结合。
"Fab"对于抗体而言，是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)通过二硫键与一条重链的可变区和第一恒定区结合而成的抗体部分。
"Fab'"是指包括部分铰链区的Fab片段。
"F(ab')2"是指Fab'的二聚体。"Fv"对于一个抗体来说指的是抗体的具有完整的抗原结合部位的最小片段。一个Fv片段由单个轻链的可变区和单个重链的可变区结合组成。
"dsFv"是指一个二硫键稳定的Fv片段，其单一轻链的可变区和单一重链的可变区之间的连接是二硫键。在一些实施方案中，"(dsFv)2"或"(dsFv-dsFv')"包括三个肽链：两个VH部分通过肽接头(例如长的柔性接头)连接并分别通过二硫桥与两个VL部分结合。在一些实施方案中，dsFv-dsFv'是双特异性的，其中每个二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
"单链Fv抗体"或"scFv"是指由一个轻链可变区和一个重链可变区直接或经由肽接头序列相互连接的工程抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA,85:5879(1988))。
"Fc"对于抗体来说是指由第一重链的第二和第三恒定区通过二硫键与第二重链的第二和第三恒定区结合而成的抗体部分。抗体的Fc部分负责各种效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，但不具有抗原结合功能。
"单链Fv-Fc抗体"或"scFv-Fc"是指由连接到抗体Fc区的scFv组成的工程化抗体。
“骆驼单域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”是指包含两个VH结构域而没有轻链的抗体(Riechmann L.and Muyldermans S.,J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S.Patent No.6,005,079)。重链抗体最初源自骆驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)。虽然没有轻链，但骆驼化的抗体有可靠的抗原结合区(Hamers-Casterman C.et al.,Nature.Jun 3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.et al.“Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation,”Immunogenetics.Apr；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.et al.Immunology.May；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)代表了由适应性免疫反应产生的最小的已知抗原结合单元(Koch-Nolte F.et al.,FASEB J.Nov；21(13):3490-8.Epub 2007 Jun 15(2007))。
“纳米抗体”是指由一个重链抗体的VHH结构域和两个恒定结构域(CH2和CH3)组成的抗体片段。
“双体抗体”或"dAb"包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含一个VH结构域与同一多肽链上的VL结构域相连(VH-VL或VL-VH)(例如，见Holliger P.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.Jul 15；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。通过使用太短的连接子，使同一链上的两个结构域之间配对，结构域被迫与另一链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。这些抗原结合位点可以针对相同或不同的抗原(或表位)。在某些实施方案中，“双特异性ds双体抗体”是针对两种不同抗原(或表位)的双体抗体。在某些实施方案中，"scFv二聚体"是一种二价双体抗体或二价ScFv(BsFv)，其包含VH-VL(由肽接头连接)与另一个VH-VL分子二聚化，从而一个部分的VH与另一个部分的VL配合并形成两个结合位点，其可针对相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)。在其他实施方案中，"scFv二聚体"是一种双特异性双体抗体，包括与VL1-VH2(由肽接头连接)相缔合的VH1-VL2(由肽接头连接)，这样VH1和VL1配合，VH2和VL2配合，每个配合配对具有不同抗原特异性。
“域抗体”是指只包含重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多的VH结构域与肽接头共价连接，形成一个二价或多价结构域抗体。一个二价域抗体的两个VH域可以针对相同或不同的抗原。
本文所用的术语"嵌合"是指一种抗体或抗原结合片段，其重链和/或轻链的一部分来自一个物种，重链和/或轻链的其余部分来自另一个物种。在一个说明性的例子中，一个嵌合抗体可以包含来自人的恒定区，和来自非人动物的可变区，如来自小鼠或大鼠。在一些实施方案中，非人动物是哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
本文所用的术语"人源化"是指该抗体或抗原结合片段包含来自非人动物的CDR，来自人的FR区域，以及在适用时，来自人的恒定区。
如本文所用，术语"MASP-2"是指与甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶2，它是补体系统MBL途径中的一个重要成员。人、小鼠和食蟹猴MASP-2的氨基酸和核酸序列可以在公共数据库诸如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。如本文所用，术语MASP-2包括包含突变的蛋白质，例如，全长野生型MASP-2的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。在某些实施方案中，人MASP-2蛋白包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在某些实施方案中，小鼠MASP-2蛋白包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在某些实施方案中，食蟹猴MASP-2蛋白包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在某些实施方案中，合成了包括小鼠MASP-2CUB1-EGF-CUB2结构域(残基20-297)和人MASP-2CCP1-CCP2-SP结构域(残基298-686)的嵌合MASP-2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：42。
本文所用的术语"特异性结合"或"特异地结合"是指两个分子之间的非随机性结合反应，诸如在抗体和抗原之间。在某些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段与人MASP-2特异性地结合，其结合亲和力(KD)为≤10-6M(例如≤5x10-8M,≤2x10-8M,≤10-8M,≤5x10-9M,≤2x10-9M,≤10-9M,≤5x10-10M,≤2x10-10M,≤10-10M,≤5x10-11M,≤2x10-11M,≤10-11M,≤5x10-12M,≤4x10-12M,≤3x10-12M,≤2x10-12M,or≤10-12M。此处使用的KD是指解离速率与缔合速率的比值(koff/kon)，可通过使用本领域已知的任何常规方法确定，包括但不限于表面等离子体共振法、微尺度热泳法、HPLC-MS法、生物层干涉法和流式细胞仪(如FACS)法。在某些实施方案中，KD值可以通过使用ForteBio方法适当地确定。
本文所用的"阻断结合"或"竞争同一表位"的能力是指抗体或抗原结合片段对两个分子(例如，MASP-2蛋白和抗MASP-2抗体)之间的结合作用的抑制达到任何可检测的程度。在某些实施方案中，阻断两个分子之间结合的抗体或抗原结合片段对两个分子之间的结合作用的抑制程度为至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，或至少90％。在某些实施方案中，这种抑制可以大于60％，大于70％，大于75％，大于80％，大于85％，或大于90％。
本文所用的术语"表位"是指抗体所结合的抗原上的特定原子或氨基酸组。如果两个抗体表现出对抗原的竞争性结合，则它们可能结合相同或紧密相关的抗原表位。例如，如果一个抗体或抗原结合片段阻止参考抗体与抗原(如人/猴MASP-2)的结合至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，或至少90％，那么该抗体或抗原结合片段可被认为与参考抗体结合相同/紧密相关的表位。
本领域的技术人员将认识到，无需进行不必要的实验就可能确定一种人单克隆抗体是否与本发明的抗体结合同一表位，只要通过弄清前者是否阻止后者与MASP-2抗原多肽的结合。如果测试抗体与本发明的抗体竞争，如同表现为本发明的抗体与MASP-2抗原多肽的结合减少，那么这两种抗体结合到相同或紧密相关的表位。或者，如果测试抗体与MASP-2抗原多肽的结合被本发明的抗体所抑制，那么这两种抗体与相同或紧密相关的表位结合。
本文中所用的术语“OMS721”是指Omeros公司的单抗Narsoplimab(OMS721)，其完整结构记载于美国专利US9011860B2中，在中国专利申请号CN201780051640.7中公开了OMS721抗体制剂，所述专利通过引用以其全文并入本文。OMS721具有人IgG4的恒定区。OMS721的重链序 列如SEQ ID NO:32所示，轻链序列如SEQ ID NO:33所示。
OMS721的重链(hIgG4kappa)(SEQ ID NO:32)：
OMS721的轻链(hIgG4kappa)(SEQ ID NO:33)：
关于氨基酸序列的"保守取代"是指将一个氨基酸残基用具有类似理化性质的侧链的不同氨基酸残基来替代。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(如Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间，在具有中性亲水侧链的残基(如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间，具有酸性侧链的残基(如Asp、Glu)，具有碱性侧链的氨基酸(如His、Lys和Arg)，或具有芳香族侧链的残基(如Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如本领域所知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，因此可以保留蛋白质的生物活性。
本文所用的术语"同源物"和"同源的"是可以互换的，指的是在最适比对时，与另一序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的核酸序列(或它的互补链)或氨基酸序列。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的"序列同一性百分比(％)"是指在比对序列并在必要时引入空位以达到相同氨基酸(或核酸)的最大数量后，候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守取代可以被也可以不被视为相同的残基。为了确定氨基酸(或核酸)序列同一性的百分比，可以使用公开的工具，例如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站上找到，另见Altschul S.F.et al,J.Mol.Biol.,215:403–410(1990)；Stephen F.et al,Nucleic Acids Res.,25:3389–3402(1997))，ClustalW2(可在欧洲生物信息学研究所的网站上找到，另见Higgins D.G.et al,Methods in Enzymology,266:383-402(1996)；Larkin M.A.et al,Bioinformatics(Oxford,England),23(21):2947-8(2007))，以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现比对。本领域的技术人员可以使用该工具提供的默认参数，也可以根据比对的情况定制参数，例如，通过选择合适的算法。
本文所用的"治疗"或"处理"病症包括预防或缓解一种病症，减缓一种病症的发病或发展速度，减少一种疾病的风险，预防或推迟与一种病症相关的症状的发展，减少或结束与一种疾病相关的症状，产生一种病症的完全或部分消退，治愈一种病症，或其一些组合。
一种“分离的”物质已经被人力从其自然状态中改变了。如果一种“分离的”成分或物质出现在自然界中，那么它已经被改变或从其原来的环境中移除，或者两种情况都是。例如，自然存在于活体动物中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但如果同一多核苷酸或多肽已经与自然状态下的共存物质充分分开，从而以基本纯净的状态存在，则是“分离的”。分离的“核酸”或“多核苷酸”可互换使用，指的是分离的核酸分子的序列。在某些实施方案中，"分离的抗体或其抗原结合片段"是指抗体或抗原结合片段的纯度至少为60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％。92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，如通过电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱方法(如离子交换色谱或反相HPLC)所确定的。
本文所用的术语"载体"是指一种载体，编码蛋白质的多核苷酸可以可操作地插入其中，以实现该蛋白质的表达。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的遗传元件在宿主细胞内得到表达。载体的实例包括质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒。用作载体的动物病毒类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可以包含各种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。此外，载体还可以包含一个复制起点。载体还可以包含帮助其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包衣。载体可以是表达载体或克隆载体。本发明提供的载体(例如表达载体)含有本文提供的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作连接的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)以及至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体，质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE,pVITRO,pVIVO,pMAL,pMONO,pSELECT,pUNO,pDUO,Psg5L,pBABE,pWPXL,pBI,p15TV-L,pPro18,pTD,pRS10,pLexA,pACT2.2,pCMV-SCRIPT.RTM、pCDM8、pCDNA1.1/amp,pcDNA3.1,pRc/RSV,PCR 2.1,pEF-1,pFB,pSG5,pXT1,pCDEF3,pSVSPORT,pEF-Bos等等。
本文所用的"宿主细胞"是指引入了外源性多核苷酸和/或载体的细胞。
补体系统与许多急性和慢性疾病或病症的发病机制有关，包括：心肌梗塞、卒中、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、再灌注损伤、败血症休克、热烧伤后的毛细血管渗漏、心肺旁路术后炎症、移植排斥、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力症和阿尔茨海默病。在几乎所有这些疾病或病症中，补体不是病因，但是是参与发病机制的几个因素之一。补体激活可能是一个主要的病理机制，代表了许多这些疾病状态中临床控制的有效点。MASP-2参与MBL途径，即三大补体激活途径之一，也可能参与许多疾病或状态的发病机制。在一些实施方案中，与MASP-2依赖性补体激活有关的疾病或病症是自身免疫性疾病、血管病症、缺血再灌注损伤、动脉硬化、 炎症、肺部病症、体外再灌注手术、肌肉骨骼病症、肾脏病症、皮肤病症、器官或组织移植手术、神经系统疾病或损伤、血液疾病、泌尿生殖系统病症、非肥胖型糖尿病或与1型或2型糖尿病相关的并发症、癌症、内分泌疾病或眼科病症。
本文所用的术语"甘露聚糖结合凝集素"("MBL")等同于甘露聚糖结合蛋白("MBP")。术语"膜攻击复合物"("MAC"，也被称为C5b-9)是指由五种终末补体成分(C5-C9)组成的复合物，它插入并破坏细胞膜。
本文所用的术语"自身免疫性疾病"是指一种病理生理状态，其中免疫反应是针对人体自身组织的，并对其造成损害(自身免疫性)。自身免疫性疾病的实例，包括但不限于血栓性微血管病(TMA)、非典型溶血性尿毒症(aHUS)、造血移植相关的血栓性微血管病(TA-TMA)、狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)和IgA肾病。
本文所用的术语“肿瘤”是指是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物。
术语"药学上可接受的"表示指定的载体、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与构成制剂的其他成分在化学上和/或物理上相容，并与接受者在生理上相容。
药物制剂
如本文所使用，术语“药物制剂”意指至少一种活性成分(例如特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段)与至少一种非活性成分的组合，所述非活性成分在与活性成分和/或一种或多种额外非活性成分组合时适用于治疗性施用至人类或非人类动物。除非另外具体说明，否则如本文所使用的术语“制剂”意指“药物制剂”。本发明提供包含至少一种治疗性抗体的药物制剂。根据本发明的某些实施方案，治疗性抗体为特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段。更具体地，本发明包括药物制剂，其包含：(i)特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段；(ii)包含组氨酸和/或醋酸缓冲体系的缓冲液；(iii)包含聚山梨酯的表面活性剂；和(iv)包含蔗糖、海藻糖和/或脯氨酸的辅料。如果额外组分不会显著地干扰制剂的稳定性，则所述组分可包括于本发明的制剂中。下文详细描述本发明内所包括的具体示例性组分和制剂。
在某些实施例中，本发明的药物制剂为液体制剂。如本文所使用，表述“液体制剂”意指在约2℃至约40℃下主要以液体状态存在的至少两种组分的混合物。液体制剂可视其特定成分而具有低粘度、中等粘度或高粘度。
如本文所用，术语“缓冲液”是指弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的混合物。例如，如本文所用，“醋酸缓冲液”是指包含醋酸钠以及其共轭酸醋酸的混合物。由于在弱酸与其共轭碱之间建立了化学平衡，当向溶液中加入少量酸或碱时，含有缓冲液的溶液抵抗pH值的突然变化。
如本文所用，术语“质量渗透压摩尔浓度”是指溶解的溶质颗粒在水溶液中的渗透压的量度。溶质颗粒包括两种离子以及非离子化分子。渗透压表示为溶解在1kg溶剂(即水)中的渗透活性颗粒的浓度(即渗透压摩尔)。本文以毫渗透压摩尔/千克水(mOsm/kg)为单位表示质量渗透 压摩尔浓度。
本文中术语“辅料”意指添加至制剂中以提供期望稠度、粘度和/或稳定作用的任何非治疗剂，本发明优选的辅料包括但不限于海藻糖、蔗糖、和脯氨酸。
“粒径(Diameter)”和“平均粒径(Mean Diameter)”是指微粒制剂对应的强度体积径，可以采用动态光散射仪例如激光粒度仪测得。
本发明的抗体
本发明的药物制剂内所含有的抗体或其抗原结合片段的量可视制剂所期望的具体特性以及意图使用制剂的特定情况和目的而变化。在某些实施例中，药物制剂可含有约0.1mg/mL至约500mg/mL的抗体；约0.5mg/mL至约400mg/mL的抗体；约1mg/mL至约200mg/mL的抗体；约2mg/mL至约100mg/mL；约1mg/mL至约5mg/mL的抗体；约10mg/mL至约30mg/mL的抗体；约75mg/mL至约125mg/mL；约5mg/mL至约50mg/mL；或约2mg/mL至约150mg/mL的抗体。举例来说，本发明的制剂可为液体制剂，其包含约0.5mg/mL；约1mg/mL；约2mg/mL；约3mg/mL；约4mg/mL；约5mg/mL；约6mg/mL；约7mg/mL；约8mg/mL；约9mg/mL；约10mg/mL；约11mg/mL；约12mg/mL；约13mg/mL；约14mg/mL；约15mg/mL；约16mg/mL；约17mg/mL；约18mg/mL；约19mg/mL；约20mg/mL；约21mg/mL；约22mg/mL；约23mg/mL；约24mg/mL；约25mg/mL；约26mg/mL；约27mg/mL；约28mg/mL；约29mg/mL；约30mg/mL；约35mg/mL；约40mg/mL；约45mg/mL；约50mg/mL；约55mg/mL；约60mg/mL；约65mg/mL；约70mg/mL；约75mg/mL；约80mg/mL；约85mg/mL；约90mg/mL；约95mg/mL；约96mg/mL；约97mg/mL；约98mg/mL；约99mg/mL；约100mg/mL；约101mg/mL；约102mg/mL；约103mg/mL；约104mg/mL；约105mg/mL；约110mg/mL；约115mg/mL；约120mg/mL；约125mg/mL；约130mg/mL；约135mg/mL；约140mg/mL；约145mg/mL；约150mg/mL；约155mg/mL；约160mg/mL；约165mg/mL；约170mg/mL；约175mg/mL；约180mg/mL；约185mg/mL；约190mg/mL；约195mg/mL；或约200mg/mL的特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，药物制剂为液体制剂，其可含有1±0.1mg/mL至200±20mg/mL的抗体；2±0.2mg/mL至100±10mg/mL的抗体；1±0.5mg/mL至30±5mg/mL的抗体；10±1mg/mL至30±3mg/mL的抗体；1±0.1mg/mL至3±0.3mg/mL的抗体；15±1.5mg/mL至25±2.5mg/mL的抗体；90±5mg/mL至110±5mg/mL的抗体；或150±7.5mg/mL至170±7.5mg/mL的抗体。在一些实施方案中，药物制剂含有20±2mg/mL的抗体。在一些实施方案中，药物制剂含有60±6mg/mL的抗体。在一些实施方案中，药物制剂含有100±10mg/ml的抗体。在一些实施方案中，药物制剂含有150±15mg/ml的抗体。
生物等效物11
本发明涵盖具有与本文所公开的示例性分子的氨基酸序列不同的氨基酸序列但保留人MASP-2特异性结合能力的抗体或其抗原结合片段。当相比于亲本序列时，此类变异分子可包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但仍展现与本文所论述的抗体的生物活性基本上等 效的生物活性。
本发明包括与本文所阐述的示例性抗体中的任一者生物等效的抗原结合分子。举例来说，如果两种抗体为当在类似实验条件下以相同剂量(单次剂量或多次剂量)施用时，吸收速率和吸收程度未显示显著差异的医药等效物或医药替代物，则将其视为生物等效的。如果一些抗体在其吸收程度方面等效但在其吸收速率方面并不等效，则将其视为等效物或医药替代物，且仍可将其视为生物等效的，这是因为此类吸收速率方面的差异为既定的且反映在标签中，对于在例如长期使用时达到有效体内药物浓度并非必需的，且对于所研究的特定药品在医疗上无关紧要。
在一个实施例中，如果两种抗体的安全性、纯度和效力不存在临床上有意义的差异，则所述两种抗体是生物等效的。
在一个实施例中，如果患者可以在参考产品与生物学产品之间转换一或多次且相比于不具有所述转换的持续疗法，预期副作用风险没有增加，则两种抗体为生物等效的，所述副作用包括临床上显著的免疫原性变化或经减弱的有效性。
生物等效性可通过体内和体外方法证明。生物等效性测量包括例如(a)人类或其它哺乳动物中的体内测试，其中测量血液、血浆、血清或其它生物流体中的抗体或其代谢物随时间变化的浓度；(b)与人类体内生物可用性资料相关且合理地预测人类体内生物可用性资料的体外测试；(c)人类或其它哺乳动物中的体内测试，其中测量抗体(或其目标)随时间变化的适当急性药理学作用；和(d)建立抗原结合蛋白的安全性、功效或生物可用性或生物等效性的良好受控的临床试验。
制剂辅料和pH
本发明的药物制剂包含一种或多种辅料。如本文所使用，术语“辅料”意指添加至制剂中以提供期望稠度、粘度和/或稳定作用的任何非治疗剂。
在某些实施例中，本发明的药物配药物制剂具有小于30cP的粘度，这有利于从预填充注射器或自动注射器递送组合物。在一些实施方案中，本发明的稳定的液体制剂具有约1.0cP-30cP的粘度。在一些情况下，当使用动态光散射仪(DLS)测量时，药物制剂在25℃下的粘度为小于28cP、小于25cP、小于23cP、小于20cP、小于18cP、小于15cP、小于13cP、小于10cP、小于7cP或小于5cP，例如约1.0cP-10cP。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0cP-20cP。在一些实施方案中，当使用DLS测量时，药物制剂在25℃下在至多150mg/ml的抗体浓度下的粘度为小于15cP。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0cP-10cP。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0cP。在一些实施方案中，当使用DLS测量时，药物制剂在25℃下在至多150mg/ml的抗体浓度下的粘度为小于7cP。在一个实施方案中，所述液体制剂在4-40℃的粘度为约5.0cP-7.0cP。在一个实施方案中，所述液体制剂在4-40℃的粘度为约6.8cP。在一个实施方案中，所述液体制剂在25℃的粘度为约6.8cP。
本发明的药物制剂内所含有的辅料的量视使用制剂的具体情况和预期目的而变化。在某些 实施例中，制剂可含有约0.1％至约20％辅料；约0.5％至约20％辅料；约1％至约20％辅料；约2％至约15％辅料；约5％至约15％辅料；约7.5％至约12.5％辅料；或约9％至约11％辅料。举例而言，本发明的药物制剂可包含约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5.0％、约5.5％、约6.0％、约6.5％、约7.0％、约7.5％、约8.0％、约8.5％、约9.0％、约9.5％、约10.0％、约10.5％、约11.0％、约11.5％、约12.0％、约12.5％、约13.0％、约13.5％、约14.0％、约14.5％、约15％或约20％辅料(例如蔗糖)。在一些实施方案中，制剂含有约5.8％±0.5％辅料(例如蔗糖)。在一些实施方案中，制剂含有约6.0％±0.5％辅料(例如蔗糖)。在一些实施方案中，制剂含有约6.5％±0.5％辅料(例如蔗糖)。在一些实施方案中，制剂含有约7.0％±0.5％辅料(例如蔗糖)。在一些实施方案中，制剂含有约8.6％±0.5％辅料(例如蔗糖)。上述百分比中的每一者对应于重量/体积百分比(w/v)。在一些情况下，制剂含有5.5％±0.5％至9％±0.5％(w/v)蔗糖。在一些情况下，制剂含有5.5％±0.5％至9％±0.5％(w/v)海藻糖。在一些情况下，制剂含有200mM至300mM脯氨酸。
制剂中的表面活性剂
本发明的药物制剂还可包含一种或多种表面活性剂，其类型和量应在如回转式振荡的粗糙处置或搅动条件下特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段稳定。如本文所使用，术语“表面活性剂”意指降低物质所溶解的流体的表面张力和/或降低油与水之间的界面张力的物质。表面活性剂可以是离子或非离子的。可包括于本发明的制剂中的示例性非离子表面活性剂包括例如烷基聚(环氧乙烷)、烷基多葡糖苷(例如辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、如鲸蜡醇和油醇的脂肪醇、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA。可包括于本发明的制剂中的具体非离子表面活性剂包括例如聚山梨酯，如聚山梨酯20、聚山梨酯28、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81和聚山梨酯85；泊洛沙姆(poloxamer)，如泊洛沙姆188(也称为Pluronic F68)、泊洛沙姆407；聚乙烯-聚丙二醇；或聚乙二醇(PEG)。聚山梨酯20也称为TWEEN 20、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在一些实施方案中，表面活性剂为聚山梨酯80或聚山梨酯20，优选聚山梨酯80。
本发明的药物制剂内所含有的表面活性剂的量可视制剂所期望的具体特性以及意图使用制剂的特定情况和目的而变化。在某些实施例中，制剂可含有约0.01％至约1％表面活性剂；约0.01％至约0.5％表面活性剂；约0.05％至约0.15％；约0.08％至约0.12％；或约0.09％至约0.11％表面活性剂。举例来说，本发明的制剂可包含约0.01％；约0.02％；约0.03％；约0.04％；约0.05％；约0.06％；约0.07％；约0.08％；约0.09％；约0.10％；约0.11％；约0.12％；约0.13％；约0.14％；约0.15％；约0.16％；约0.17％；约0.18％；约0.19％；约0.20％；约0.21％；约0.22％；约0.23％；约0.24％；约0.25％；约0.26％；约0.27％；约0.28％；约0.29％；或约0.30％表面活性剂(例如聚山梨酯80)。在一些实施方案中，制剂含有约0.1％表面活性剂(例如聚山梨酯80)。上述百分比中的每一者对应于重量/体积百分比(w/v)。在一些情况下，制剂含有0.025％±0.01％至0.1％±0.01％w/v聚山梨酯80。在一些情况下，制剂含有0.05％±0.01％w/v聚山梨酯80。
制剂的缓冲体系和pH
本发明的药物制剂还可包含用于维持稳定pH且用于帮助稳定特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段的缓冲液或缓冲液系统。在一些实施方案中，缓冲液或缓冲液系统包含缓冲范围完全或部分覆盖pH 4.7至6.1的范围的至少一种缓冲液。在某些实施例中，缓冲液包含组氨酸缓冲液和/或醋酸缓冲液。在某些实施例中，缓冲液(例如组氨酸)以约1mM至约40mM、约1mM至约30mM、约1mM至约20mM；约3mM至约18mM、约5mM至约15mM；或约8mM至约12mM的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲液(例如组氨酸)以约1mM；约2mM；约3mM；约4mM；约5mM；约6mM；约7mM；约8mM；约9mM；约10mM；约11mM；约12mM；约13mM；约14mM；约15mM；约16mM；约17mM；约18mM；约19mM；或约20mM的浓度存在。在一些情况下，制剂含有浓度为5mM±1mM至20mM±4mM的组氨酸缓冲液。在一些情况下，制剂含有浓度为10mM±2mM的组氨酸缓冲液。在一些实施方案中，组氨酸缓冲液包含L-组氨酸和一水合L-组氨酸盐酸盐。在一些情况下，组氨酸缓冲液包含浓度为0.175mg/mL的L-组氨酸和浓度为1.86mg/mL的一水合L-组氨酸盐酸盐。
在一些实施方案中，制剂含有醋酸缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液(例如醋酸)以约1mM至约40mM、约1mM至约30mM、约1mM至约20mM；约3mM至约18mM、约5mM至约15mM；或约8mM至约12mM的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲液(例如醋酸)以约1mM；约2mM；约3mM；约4mM；约5mM；约6mM；约7mM；约8mM；约9mM；约10mM；约11mM；约12mM；约13mM；约14mM；约15mM；约16mM；约17mM；约18mM；约19mM；或约20mM的浓度存在。在一些情况下，制剂含有浓度为5mM±1mM至20mM±4mM的醋酸缓冲液。在一些情况下，制剂含有浓度为10mM±2mM的醋酸缓冲液。在一些实施方案中，醋酸缓冲液包含醋酸和三水合醋酸钠。在一些情况下，组氨酸缓冲液包含浓度为10mM的组氨酸盐。
在抗体纯化过程中，可能期望或有必要将一种缓冲液交换为另一种，以达成合适的赋形剂浓度、抗体浓度、pH等。可以例如通过使用例如半透切向流过滤膜的超过滤/透滤作用(UF/DF)来完成缓冲液交换。然而，使用此类技术有可能引起吉布斯-唐南效应(Gibbs-Donnan effect)(Bolton等人,2011,《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》27(1):140-152)。在蛋白质浓缩过程中，膜的产品侧上正电荷的积累通过正离子优先向膜的对侧移动而在电学上得到配衡。此现象的潜在后果是，由于在UF/DF步骤期间带正电荷的透滤缓冲赋形剂对带正电荷的抗体蛋白的静电排斥，因此某些组分(例如组氨酸)的最终浓度可能低于这些组分的预期目标浓度。因此，本发明包括以下制剂，其中由于吉布斯-唐南效应，例如组氨酸/醋酸的浓度在本文所叙述的量或范围内变化。
体积排阻描述了高浓度样品的特性，其中溶液总体积中的很大一部分被溶质占据，尤其是大分子(如蛋白质)，使溶剂排除在此空间之外。随后，此减少了可用于溶解其它溶质的溶剂的总体积，其可能会导致超过滤膜分配不均。因此，本发明包括制剂，其中由于体积排阻效应，例如组氨酸的浓度可在本文所叙述的量或范围内变化。
在制造本发明制剂期间，制剂的组成可能发生变化。这些变化可包括活性成分的浓度、赋形剂的浓度和/或制剂的pH。本发明包括包含特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段的制剂，所述特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段是稳定的且在赋形剂浓度变化高达至少10％的情况下保留效力。举例来说，本文包括特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段制剂，其中所述制剂的稳定性和效力不受抗体、辅料、缓冲液和/或表面活性剂的浓度的±10％或±20％变化影响。
药物制剂的稳定性
本发明的药物制剂展现高水准的稳定性。如本文所使用的关于药物制剂的术语“稳定”意指药物制剂内的抗体在储存限定时间量之后保留可接受程度的结构和/或功能和/或生物活性。即使制剂中所含有的抗体在储存限定时间量之后无法维持100％的其结构和/或功能和/或生物活性，所述制剂仍可为稳定的。在某些情况下，约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体在储存限定时间量之后的结构和/或功能和/或生物活性的维持可视为“稳定的”。
在一些实施方案中，本发明的稳定的液体制剂具有2-10μm的平均粒径，如通过微流成像系统(MFI)所测定的。
在一些实施方案中，本发明的稳定的液体制剂具有250～350mOsm/kg H2O之间的质量渗透压摩尔浓度。
在一些实施方案中，稳定性可尤其通过测定在给定温度下储存限定时间量之后制剂中抗体的蛋白含量(浓度)来测量。当本文使用“可接受的稳定度”时，所述短语意指可在给定温度下储存限定时间量之后在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％。在某些实施例中，可在给定温度下储存限定时间量之后在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。测量稳定性之前的限定时间量可为至少3天、至少5天、至少1周、至少10天、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少24个月、至少36个月或更长时间。当评定稳定性时药物制剂可储存的温度可为约-80℃至约45℃的任何温度，例如储存在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约40℃或约45℃下。举例来说，如果在4℃下储存3个月后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂可视为稳定的。如果在4℃下储存6个月后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在4℃下储存9个月后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在4℃下储存12个月后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在4℃下储存24个月后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在4℃下储存36个月 后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存2周后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存1个月后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存4周后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存6周后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在40℃下储存2周后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在40℃下储存4周后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。如果在40℃下储存6周后，在制剂中检测到抗体的蛋白含量变化不超过10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，则药物制剂也可视为稳定的。
在一些实施方案中，稳定性可尤其通过测定在给定温度下储存限定时间量之后制剂中抗体的单体纯度百分比来测量。抗体的单体纯度尤其可以通过尺寸排阻色谱法(例如尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC))来测定。当本文使用“可接受的稳定度”时，所述短语意指可在给定温度下储存限定时间量之后在制剂中检测到抗体的单体纯度至少90％。在某些实施例中，可在给定温度下储存限定时间量之后在制剂中检测到抗体的单体纯度至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。测量稳定性之前的限定时间量可为至少3天、至少5天、至少1周、至少10天、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少24个月、至少36个月或更长时间。当评定稳定性时药物制剂可储存的温度可为约-80℃至约45℃的任何温度，例如储存在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约40℃或约45℃下。举例来说，如果在4℃下储存3个月后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％或97％，则药物制剂可视为稳定的。如果在4℃下储存6个月后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％或97％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在4℃下储存9个月后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在4℃下储存12个月后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在4℃下储存24个月后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在4℃下储存36个月后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％， 则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存2周后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存1个月后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存4周后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存6周后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、95％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在40℃下储存2周后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在40℃下储存4周后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％，则药物制剂也可视为稳定的。如果在40℃下储存6周后，通过SEC-HPLC检测到抗体的单体纯度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％，则药物制剂也可视为稳定的。
在其他的实施方案中，使用其它方法以评定本发明的制剂的稳定性，如用以测定溶液混浊度的在约405nm或约350nm处的吸光度、用以测定热稳定性的差示扫描热量测定(DSC)和用以测定机械稳定性的受控搅动。举例来说，如果在约4℃至约25℃下储存6周或更长时间后，本发明的制剂的OD405相对于t＝0时制剂的OD405的变化小于约0.05(例如0.04、0.03、0.02、0.01或更小)，则制剂可视为稳定的。
在一些实施方案中，可以通过检测制剂的外观、可见异物，来指示储存后制剂的稳定性。在一个具体的实施方案中，在储存后，通过目视检查本发明液体制剂的稳定性，其中本发明液体制剂在外观上保持为澄清至微乳光，为无色至淡黄色液体，且无异物。在一个实施方案中，在澄明度检测仪下目视检查，制剂中无可见异物存在。
在其他的实施方案中，通过测量抗体与其目标的结合亲和力评定稳定性。举例来说，如果在例如-80℃、-30℃、-20℃、5℃、25℃、37℃、40℃或45℃等温度下储存限定时间量(例如7天至12个月、24个月或36个月)后，本发明的制剂内所含有的特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段以抗体在所述储存之前的结合亲和力的至少80％、85％、90％、95％或更多亲和力结合至人MASP-2，则制剂可视为稳定的。结合亲和力可通过如ELISA或等离子共振的任何方法来测定。生物活性可通过MASP-2活性分析来测定，例如通过使表达MASP-2的细胞与包含特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段的制剂接触。抗体与此类细胞的结合可如经由FACS分析来直接测量。
在一些实施方案中，稳定性可以通过测定在限定条件下储存限定时间量之后在制剂内形成聚集物(高分子量(HMW))的抗体的百分比来测量，其中稳定性与所形成的聚集物百分比成反比。经聚集的抗体的百分比可尤其通过尺寸排阻色谱法(例如尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC))来测定。当本文使用“可接受的稳定度”时，所述短语意指至多6％的抗体呈在给定温度下储存限定时间量之后在制剂中检测到的聚集形式。在某些实施例中，可接受的稳定度意指可 在给定温度下储存限定时间量之后在制剂中的聚集物中检测到至多约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体。测量稳定性之前的限定时间量可为至少3天、至少5天、至少1周、至少10天、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周或更长时间。当评定稳定性时药物制剂可储存的温度可为约-80℃至约45℃的任何温度，例如储存在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约40℃或约45℃下。举例来说，如果在40℃下储存6周后，检测到小于约10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1.75％、1.5％、1.25％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.1％呈聚集形式的抗体，则药物制剂可视为稳定的。如果在25℃度下储存6周后，检测到小于约10％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1.75％、1.5％、1.25％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.1％呈聚集形式的抗体，则药物制剂也可视为稳定的。
在一些实施方案中，稳定性可尤其通过测定在离子交换期间在比抗体的主要洗脱份(“主要电荷形式”)更具酸性的洗脱份(“酸性形式”)中迁移的抗体的百分比来测量，其中稳定性与呈酸性形式的抗体的分数成反比。“酸化”抗体的百分比可通过离子交换色谱法(例如阳离子交换高效液相色谱法(CEX-HPLC))或全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(icIEF)来测定。当本文使用“可接受的稳定度”时，所述短语意指至多52％的抗体呈在限定温度下储存限定时间量之后在制剂中检测到的较具酸性形式。在某些实施例中，可接受的稳定度意指可在给定温度下储存限定时间量之后在制剂中检测到至多约52％、50％、45％、40％、35％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％呈酸性形式的抗体。测量稳定性之前的限定时间量可为至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少30个月、至少36个月或更长时间。当评定稳定性时药物制剂可储存的温度可为约-80℃至约45℃的任何温度，例如储存在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃、约40℃或约45℃下。举例来说，如果在-80℃、-30℃或-20℃下储存36个月后，小于约29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体呈较具酸性形式，则药物制剂可视为稳定的。如果在4℃下储存12个月、24个月甚至36个月后，小于约28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体呈较具酸性形式，则药物制剂也可视为稳定的。如果在25℃下储存4周或6周后，小于约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体呈较具酸性形式，则药物制剂也可视为稳定的。如果在37℃下储存4周或6周后，小于约37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、 4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的抗体呈较具酸性形式，则药物制剂也可视为稳定的。如果在40℃下储存4周或6周后，可检测到小于约52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％呈较具酸性形式的抗体，则药物制剂也可视为稳定的。
在一个实施方案中，通过测定蛋白在升温过程中发生构型变化或聚集而使得粒径发生变化时的转变温度Tonset，检查本发明液体制剂的稳定性，例如，本发明的液体制剂具有高于约60℃、高于约63℃、高于约65℃、高于约68℃或高于约70℃的Tonset。
提及“指定时间段之后”药物制剂的稳定性意指在指定时间段结束时或指定时间段快结束时进行稳定性参数测量，且意指对于其后所测量的参数，药物制剂不一定维持相同稳定度。举例来说，提及6周之后的特定稳定性意指在研究开始之后6周时或约6周时进行稳定性测量。用于评定制剂中的抗体的稳定性的额外方法展示于下文所呈现的实例中。
在本发明的一些优选的实施方案中，制剂在振摇后(例如，振摇14天后)，按照如上文所述的评估方式是稳定的。
在本发明的一些优选的实施方案中，制剂在搅拌后(例如，搅拌6小时后)，按照如上文所述的评估方式是稳定的。
在本发明的一些优选的实施方案中，制剂在光照后(例如，光照3天后)，按照如上文所述的评估方式是稳定的。
在本发明的一些优选的实施方案中，制剂在冻融后(例如，经5轮冻融后)，按照如上文所述的评估方式是稳定的。
示例性制剂
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)20mg/ml±2mg/ml至200mg/ml±20mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，或200mM至300mM脯氨酸，
pH为4.7至6.0。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)20mg/ml±2mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
pH为5.3±0.5。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)60mg/ml±6mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
pH为5.3±0.5。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)100mg/ml±10mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
pH为5.3±0.5。
在一个实施方案中，本发明的液体抗体制剂包含：
(a)150mg/ml±15mg/ml抗体，
(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和
(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)20mg/ml±2mg/ml抗体，(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)20mg/ml±2mg/ml抗体，(b)包含10mM±2mM组氨酸的缓冲液，(c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)20mg/ml±2mg/ml抗体，(b)0.175mg/ml L-组氨酸，(c)1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，(d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(e)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)60mg/ml±6mg/ml抗体，(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)60mg/ml±6mg/ml抗体，(b)包含10mM±2mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，(c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)60mg/ml±6mg/ml抗体，(b)0.175mg/ml L-组氨酸，(c)1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，(d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(e)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)100mg/ml±10mg/ml抗体，(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)100mg/ml±10mg/ml抗体，(b)包含10mM±1mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，(c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)100mg/ml±10mg/ml抗体，(b)0.175mg/ml L-组氨酸，(c)1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，(d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(e)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)150mg/ml±15mg/ml抗体，(b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，(c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，pH为5.3±0.5。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)150mg/ml±15mg/ml抗体，(b)包含10mM±1mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，(c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(d)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在一些实施方案中，药物制剂包含：(a)150mg/ml±15mg/ml抗体，(b)0.175mg/ml L-组氨酸，(c)1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，(d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨酯，和(e)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，pH为5.3±0.1。
在这些实施例中的任一者中，聚山梨酯可为聚山梨酯80或聚山梨酯20，优选聚山梨酯80。
在一些实施方案中，所述药物制剂不包含其他缓冲体系/缓冲液。
在一些实施方案中，所述药物制剂不包含其他表面活性剂。
在一些实施方案中，所述药物制剂不包含其他辅料。
本发明的包含抗MASP-2抗体或其抗原结合片段的药物制剂处方，可以使所述抗体在较高浓度(例如，约100mg/mL，约150mg/mL)和低浓度(例如，约20mg/mL，约50mg/mL)情况下的液体状态时维持较好的稳定性，符合生产工艺的要求和临床应用的需要，可以支持将所述抗体开发为静脉注射液和皮下注射液。
本发明所涵盖的药物制剂的额外非限制性实例在本文其它地方阐述，包括下文所呈现的工作实例。
容器和施用方法
本发明的药物制剂可含于适用于储存药品和其它治疗性组合物的任何容器内。举例来说，药物制剂可含于如小瓶、西林瓶、安瓿、注射器、药筒、瓶或IV袋的具有限定体积的经密封且经灭菌的塑料或玻璃容器内。可使用包括例如澄清且不透明(例如琥珀色)玻璃或塑料小瓶的不同类型的小瓶以含有本发明的制剂。同样，可使用任何类型的注射器以含有和/或施用本发明的药物制剂。在一些实施方案中，药物制剂含于预填充注射器中。在一些实施方案中，药物制剂含于预填充立桩针注射器中。
本发明的药物制剂可含于“正常钨”注射器或“低钨”注射器内。如本领域的普通技术人员将了解，制造玻璃注射器的方法一般涉及使用用以刺穿玻璃，由此产生可自其中抽吸液体且自注射器排出的洞的热钨棒。此过程导致痕量钨沉积于注射器的内表面上。后续洗涤和其它处理步骤可用于减少注射器中的钨的量。如本文所使用，术语“正常钨”意指注射器含有大于500十亿分率(ppb)的钨。术语“低钨”意指注射器含有小于500ppb的钨。举例来说，根据本发明，低钨注射器可含有小于约490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10ppb或更少的钨。
药物制剂可以通过如注射(例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)或经皮、经粘膜、经鼻、经肺和/或经口施用的非经肠途径施用至患者。在一些实施方案中，本发明的药物制剂利用可重复使用的笔式和/或自动注射器式递送装置进行皮下递送。在一些情况下，药物制剂含于特别适于与自动注射器一起使用的注射器中。
本文还考虑使用微输注器来递送本发明的药物制剂。如本文所使用，术语“微输注器”意指皮下递送装置，其经设计以在延长的时间段内(例如，约10、15、20、25、30或更长时间)缓慢地施用较大体积(例如，至多约2.5mL、约3.0mL或更多)的治疗性制剂。
在某些实施例中，药物制剂经由I.V.滴注施用，使得制剂在含有生理学可接受的溶液的IV袋中稀释。在一个实施方案中，药物组合物是处于静脉输液袋中的复合无菌制剂，使得单剂量的药品稀释至100mL、250mL(或其它适合于静脉内滴注递送的类似量)的生理缓冲液(例如0.9％的盐水)。
本发明的药物制剂还可含于单位剂型中。如本文所使用，术语“单位剂型”是指适用作待治疗的患者的单位剂量的物理离散单位，各单位含有经计算以与所需医药载剂、稀释剂或赋形剂结合产生所期望治疗效果的预定量的活性化合物。在各种实施例中，单位剂型含于如本文所论述的容器内。本发明的制剂中的活性成分(例如特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段)的实际剂量水准可变化以便获得可有效达成特定患者、组合物和施用模式所期望的治疗反应且对患者不具有副作用的量的活性成分。所选剂量水准将视各种药物动力学因素而定，所述因素包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物种、所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和先前病史；和医学领域中熟知的类似因素。如本文所使用的术语“稀释剂”是指适合于改变或达成如本文所描述的示例性或适当浓度或浓度的溶液。
在各种实施例中，单位剂型含有意图单次使用的量的活性成分(例如特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段)。在各种实施例中，单位剂型中的活性成分的量为约0.1mg至约5000mg、约100mg至约1000mg，和约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约200mg、约200mg至约400mg、约250mg至约350mg、约125mg至约175mg、约275mg至约325mg、约1mg至约250mg、约1mg至约100mg、约1mg至约50mg、约1mg至约25mg、约1mg至约10mg、约1mg至约5mg或其范围或区间。例如约2 mg至约100mg或2mg至20mg的上文所叙述量的中间范围也意图成为本发明的一部分。举例来说，意图包括使用上文所叙述值(或含于上文所叙述范围内的值)中的任一个的组合作为上限值和/或下限值的值范围。在特定实施例中，制剂常常以呈单位剂型的液体形式供应。在一些实施方案中，单位剂型含有2至2.5mg或10至11mg、20至25mg、80至90mg、100至125mg、160至180mg、200至225或320至360mg、200至400mg。在一些实施方案中，根据本发明的单位剂型适合于皮下施用至患者(例如，含有浓度为约100mg/ml或约150mg/ml的抗体的单位剂型)。
在一个实施方案中，本发明提供了在稳定制剂中包含约20mg、约80mg、约160mg、约200mg、约320mg或约400mg的抗体的单位剂型，其中所述制剂包含200mg或400mg的抗体单位剂型。
本发明还包括制备单位剂型的方法。在示例性实施例中，用于制备医药单位剂型的方法包括在合适容器(例如本文所论述的那些容器)中合并前述实施例中的任一个的制剂。
在各种实施例中，药物制剂含于容器(例如，小瓶或预填充注射器)中，所述容器可含有小于5体积％的氧化气体(例如氧气)的顶隙气体。在各个实施例中，容器的顶隙中的氧化气体(例如氧气)的浓度可小于4.5％、小于4％、小于3.5％、小于3％、小于2.5％、小于2％或小于1.5％。在一个实施例中，顶隙中的氧化气体(例如氧气)的浓度小于约1％。在一个实施例中，顶隙中的氧化气体(例如氧气)的浓度不超过约0.5％。在一个实施例中，顶隙中的氧化气体(例如氧气)的浓度不超过约0.1％。在各种实施例中，药品容器的顶隙中的氧化气体(例如氧气)的浓度小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％或小于0.1％。在一些情况下，顶隙气体中的氧气浓度为约0.01％至约1.5％。在一些情况下，顶隙气体中的氧气浓度为约0.75％至约1.25％。在一些情况下，顶隙气体中的氧气浓度为约0.05％至约0.15％。在各种实施例中，顶隙中的氧化气体(例如氧气)被惰性气体如氮气、氩气、氦气、氙气、氖气、氪气或氡气替代或基本上被替代。在一个实施例中，非氧化气体为氮气。在一个实施例中，非氧化气体为氩气。
药物制剂的治疗性用途
本发明的药物制剂尤其适用于治疗、预防和/或改善与表达人MASP-2的细胞相关的任何疾病或病症。可以通过施用本发明的药物制剂来治疗的示例性、非限制性疾病和病症包括将受益于抑制MASP-2依赖性补体激活的疾病或病症。
在一些实施方案中，所述将受益于抑制MASP-2依赖性补体激活的疾病或病症包括自身免疫性疾病、血管病症、缺血再灌注损伤、动脉硬化、炎症、肺部病症、体外再灌注过程、肌肉骨骼病症、肾脏病症、皮肤病症、器官或组织移植过程、神经系统疾病或损伤、血液疾病、泌尿生殖系统疾病、非肥胖型糖尿病或与1型或2型糖尿病相关并发症、癌症、内分泌疾病、眼科疾病或COVID-19(新冠肺炎)。
在一些具体的实施方案中，所述自身免疫性疾病包括血栓性微血管病(TMA)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、造血移植相关的血栓性微血管病(TA-TMA)、狼疮肾炎、系统性红 斑狼疮(SLE)和IgA肾病。
在一些具体的实施方案中，所述血管病症血管病症包括心血管病症、脑血管病症、外周(如肌肉骨骼)血管病症、肾血管病症、肠系膜/肠道血管病症、移植物和/或再移植物的血管再生、血管炎、亨-舍二氏紫癜性肾炎、系统性红斑狼疮相关的血管炎、与类风湿性关节炎相关的血管炎、免疫复合物血管炎、大动脉炎、扩张型心肌病、糖尿病血管病、川崎病(动脉炎)、静脉气体栓塞(VGE)，以及支架置入术、旋转动脉瘤切除术和经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄。
在一些具体的实施方案中，所述缺血再灌注损伤包括与主动脉瘤修复、心肺转流、与器官移植和/或肢体/手指再植有关的血管再吻合、卒中、心肌梗死和休克和/或外科手术后的血液动力学复苏有关的缺血再灌注损伤。
在一些具体的实施方案中，所述炎症包括炎症性胃肠道疾病，其包括胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征和憩室炎。
在一些具体的实施方案中，所述肺部病症包括急性呼吸窘迫综合征、输血相关性急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、慢性阻塞性肺病、哮喘、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基底膜病(Goodpasture病)；胎粪吸入综合征、闭塞性细支气管炎综合征、特发性肺纤维化、继发于烧伤的急性肺损伤、非心源性肺水肿、输血相关呼吸困难、肺气肿、囊性纤维化、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2(Covid-19)相关疾病。
在一些具体的实施方案中，所述体外循环再灌注过程包括血液透析、血浆去除术、白细胞去除术、体外膜氧合(ECMO)、肝素诱导体外膜氧合低密度脂蛋白沉淀(heparin-induced exfracorporeal membrane oxygenation LDL precipitation,HELP)和心肺转流术(CPB)。
在一些具体的实施方案中，所述肌肉骨骼病症包括骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风、神经性关节病、银屑病性关节炎、脊椎关节病、结晶性关节病和系统性红斑狼疮(SLE)。
在一些具体的实施方案中，所述肾脏病症包括系膜增生型肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎(系膜毛细血管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、亨-舍二氏紫癜性肾炎和IgA肾病。
在一些具体的实施方案中，所述皮肤病症包括银屑病、自身免疫性大疱性皮肤病、嗜酸性海绵形成、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解、妊娠疱疹、热烧伤和化学烧伤。
在一些具体的实施方案中，所述器官或组织移植过程包括器官异体移植、器官异种移植器官和组织移植。
在一些具体的实施方案中，所述神经系统疾病或损伤包括多发性硬化症、重症肌无力、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、格林巴利综合征、卒中后再灌注(reperfusion following stroke)、退变性椎间盘、脑外伤、帕金森氏病、阿尔茨海默病、Miller-Fisher综合征、脑外伤和/或出血、脱髓鞘和脑膜炎。
在一些具体的实施方案中，所述血液病包括败血症、严重败血症、败血症休克、败血症引 起的急性呼吸窘迫综合症、全身炎症反应综合症、失血性休克、溶血性贫血、自身免疫性血栓性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征。
在一些具体的实施方案中，所述泌尿生殖系统病症包括疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎、间质性膀胱炎、不孕症、胎盘功能障碍和流产和先兆子痫。
在一些具体的实施方案中，所述内分泌疾病包括桥本氏甲状腺炎、压力、焦虑和激素性疾病，涉及垂体的催乳素、生长素或其他胰岛素样生长因子和促肾上腺皮质激素的调节性释放。
在一些具体的实施方案中，所述眼科疾病包括年龄相关性黄斑变性。
在本文提供的方法的一些实施方案中，受试者被确定为具有升高的C4血清水平，或在有关样品中具有C4d沉积或C4d阳性染色。在一些实施方案中，该条件或疾病是IgA肾病。据报道，C4d阳性染色是IgAN发生ESRD的一个独立风险因素。C4d可以用本领域已知的任何合适的方法进行检测，例如，通过使用ELISA，或免疫荧光显微镜。
本文提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效量将取决于本领域已知的各种因素，例如体重、年龄、过去的病史、目前的药物、受试者的健康状况和潜在的交叉反应、过敏、敏感和不良副作用，以及给药途径和疾病发展程度。本领域的普通技术人员(如医生或兽医)可根据这些和其他情况或要求按比例减少或增加剂量。
在某些实施方案中，本文提供的抗MASP-2抗体或抗原结合片段的治疗有效剂量为约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如。约0.01毫克/千克，约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、或约100mg/kg)。在其中某些实施方案中，抗体或抗原结合片段的给药剂量为约50mg/kg或更少，在其中某些实施方案中，剂量为10mg/kg或更少，5mg/kg或更少，3mg/kg或更少，1mg/kg或更少，或0.1mg/kg或更少。在某些实施方案中，给药剂量可在治疗过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始给药剂量可高于后续给药剂量。在某些实施方案中，给药剂量可根据受试者的反应在治疗过程中变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的预期反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一剂量，或在一段时间内施用几个分割的剂量。
本文公开的抗MASP-2抗体和抗原结合片段可通过本领域已知的任何途径给药，例如肠外(如皮下、腹膜内、静脉内，包括静脉输液、肌肉内或皮内注射)或非肠外(如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
在一些实施方案中，本文所披露的抗MASP-2抗体或抗原结合片段可单独或与一种或多种额外的治疗手段或药剂联合施用。例如，本文所披露的抗体或抗原结合片段可与另一种治疗剂，如抗自体免疫药物结合使用。
在某些实施方案中，本文所披露的与一种或多种附加治疗剂联合施用的抗MASP-2抗体或抗原结合片段可与一种或多种附加治疗剂同时施用，在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段和附加治疗剂可作为同一药物组合物的一部分施用。然而，抗MASP-2抗体或抗原结合片段与 另一种治疗剂"结合"使用，不一定要与该治疗剂同时或在同一组合物中使用。在另一药剂之前或之后施用的抗MASP-2抗体或抗原结合片段被认为是与该药剂"联合"施用，因为该短语在此使用，即使该抗体或抗原结合片段和第二药剂是通过不同途径施用。在可能的情况下，与本文公开的抗体或抗原结合片段联合施用的额外治疗剂是根据额外治疗剂的产品信息表中列出的时间表，或根据Physicians'Desk Reference 2003(Physicians'Desk Reference,57th Ed；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；57th edition(November 2002))或本领域中众所周知的方案施用。
本发明的治疗方法包含向个体施用包含如本文所公开的特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段的任何制剂。施用药物制剂的个体可为例如需要此类治疗的任何人类或非人类动物。举例来说，个体可为诊断患有前述疾病或病症中的任一者或视为处于罹患前述疾病或病症中的任一者的风险下的个体。本发明进一步包括本文所公开的药物制剂中的任一种在制造用于治疗与表达人MASP-2的细胞相关的任何疾病或病症的药剂中的用途，所述任何疾病或病症包括上文所提及的示例性疾病、病症和病况中的任一者。
在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所论述的药物制剂(例如具有制剂或单位剂型的容器)和包装或标签(例如药品说明书)以及药物制剂使用说明书的试剂盒以治疗如上文所论述的疾病或病症。在一些情况下，说明书提供如本文所论述的单位剂型用于治疗疾病或病症的用途。
具体实施方式
以下实施例的目的是便于向本领域技术人员提供如何制造和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和描述，且并不意在限制本发明所要求保护的范围。已努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但还应考虑一些实验误差和偏差。除非另有指示，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度以摄氏度计，且压力为大气压或接近大气压。
注：本发明表格中的NT若无特别说明，表示未检测；ND若无特别说明，表示未检出。
实施例1:人、小鼠、食蟹猴MASP-2抗原的产生
1.表达用抗原的构建
为了将抗体的表位限制在人MASP-2的补体结合和激活结构域上，我们设计了一种用于动物免疫的嵌合抗原。合成了表达小鼠MASP-2CUB1-EGF-CUB2结构域(SEQ ID NO:40的残基20-297)和人MASP-2CCP1-CCP2-SP结构域(SEQ ID NO:39的残基298-686)的编码序列。此外，在N端添加IL-2分泌信号肽序列(SEQ ID NO:41)，在C端加入FLAG标签序列。上述元件被组合成一个开放阅读框(ORF)，制成一个嵌合抗原表达构建体(SEQ ID NO:42)。其他表达全长人MASP-2(SEQ ID NO:39)、小鼠MASP-2(SEQ ID NO:40)和食蟹猴MASP-2(SEQ ID NO:43)的构建体，在C端加入HIS标签，通过合成制成。另外，通过PCR方法制作了另一个表达全长的人MASP-2(SEQ ID NO:39)并在C端带有FLAG标记的构建体。 人MASP-2蛋白(SEQ ID NO:39)
小鼠MASP-2蛋白(SEQ ID NO:40)
IL-2分泌信号肽序列(SEQ ID NO:41)
嵌合MASP-2蛋白(SEQ ID NO:42)
食蟹猴MASP-2蛋白(SEQ ID NO:43)
2.MASP-2抗原的表达和纯化
用ExpiFectamine CHO转染试剂盒将上述的MASP-2表达构建体分别转染到ExpiCHO-s细胞。ExpiCHO-s细胞在无血清的ExpiCHO表达培养基中培养。转染后14天，收集上清液。离心和过滤后，上清液被加载到抗FLAG或抗HIS柱上，然后用GE AKTA纯化系统进行纯化。清洗后，MASP-2蛋白用柠檬酸(pH3.5)洗脱，用于动物免疫。
实施例2：MASP-2抗体的产生
1.免疫接种和杂交瘤融合
经由Helios基因枪系统(Bio-Rad)用表达上述嵌合MASP-2抗原的DNA对不同品系的小鼠或大鼠进行免疫。每两周用重组MASP-2蛋白对免疫的动物进行加强。在最后一次加强免疫的4天后，处死动物进行杂交瘤融合。分离脾脏细胞并经由电融合方法与SP2-0细胞融合。得到的杂交瘤细胞在含有次黄嘌呤-氨蝶呤-胸苷的DMEM培养基中培养。
2.杂交瘤筛选
培养10天后，收集杂交瘤上清液进行抗原结合筛选。全长的人MASP-2蛋白以0.5μg/ml的浓度包被在ELISA板中，每孔100μl。用含有1％BSA+1％正常山羊血清+0.05％Tween20的PBS封闭后，将杂交瘤上清液加入板中1小时。用辣根过氧化物酶(HRP)连接的抗鼠抗体检测杂交瘤抗体与人MASP-2的特异性结合。挑选出ELISA结合的阳性克隆，进行进一步的活性筛选。
3.活性筛选
ELISA板用10μg/ml甘露聚糖包被，每孔100μl，4℃过夜。用PBS+0.1％Tween20洗涤3次后，用封闭缓冲液(10mM Tris-HCl+0.1％人血清白蛋白+140mM NaCl)封闭平板1小时。将50μl杂交瘤上清液与50μl用检测缓冲液(0.1％人血清白蛋白+20mM Tris-HCl+2mM CaCl2+140mM NaCl+1mM MgCl2+0.05％Tween20)稀释的1％人血清(Quidel，A113)混合，然后在冰上孵育45分钟。将封闭缓冲液从甘露聚糖包被平板上弃去，并加入上清液-血清混合物。将平板在37℃下孵育1.5小时。用洗涤缓冲液洗涤3次后，通过测量C4b的沉积来监测C4的激活。沉积的C4b通过HRP连接的抗C4c抗体(Quidel-A211)检测。如果MASP-2的活性被抗体所抑制，则沉积在平 板底部的C4b就会减少。通过使用这种方法，选择具有MASP-2抑制活性的杂交瘤抗体。
然后对阳性抗体进行亚克隆，并通过ELISA结合和C4激活试验进行重新筛选。
实施例3：抗人MASP-2抗体的抑制活性的表征。
1.杂交瘤抗体的纯化
亚克隆后，将具有中和活性的阳性杂交瘤克隆在10cm皿中扩增。离心过滤后，将含抗体的上清液装入蛋白A柱，用GE AKTA纯化系统进行纯化。清洗后，用柠檬酸(pH3.5)洗脱抗体。
2.纯化抗体的活性评估
MASP-2是凝集素途径的一个关键成分，它可以裂解补体因子C4和C2，生成C3转化酶C4bC2a。C3的激活最终导致了膜攻击复合物(MAC)的形成。为了测试抑制MASP-2的抗体是否能减少凝集素途径的激活，在纯化的MASP-2抗体存在的情况下，对C4、C3和MAC的激活进行了评估。
ELISA板用10μg/ml甘露聚糖包被，每孔100μl，4℃过夜。用PBS+0.1％Tween20洗涤3次后，用封闭缓冲液(10mM Tris-HCl+0.1％人血清白蛋白+140mM NaCl)封闭平板1小时。用含有1％人血清(Quidel，A113)的检测缓冲液(0.1％人血清白蛋白+20mM Tris-HCl+2mM CaCl2+140mM NaCl+1mM MgCl2+0.05％Tween20)连续稀释抗体并在冰上孵育45分钟。将封闭缓冲液从甘露聚糖包被平板上弃去，加入抗体-血清混合物。将平板在37℃下孵育1.5小时。激活的补体成分应沉积在板的底面，而未激活的成分仍可溶于缓冲液。用洗涤缓冲液洗涤3次后，用HRP连接的补体抗体，包括抗C3c抗体(Quidel-A205)、抗C4c抗体(Quidel-A211)和抗MAC(SC5b-9)抗体(Quidel-A239)监测补体成分的激活。检测抗体是在内部用HRP连接的。从杂交瘤细胞中纯化的MASP-2抗体以剂量依赖的方式阻止了补体C3(见图1)、补体C4(见图2)和MAC(见图3)的激活。
实施例4:V型基因的克隆和嵌合抗体的生成
1.杂交瘤抗体的V型基因克隆和测序
挑选出具有理想特征的主导抗体进行V型基因克隆。通过聚合酶链反应(PCR)扩增技术获得鼠抗人MASP-2轻链和重链可变区的序列。用MiniBest Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa)分离出阳性杂交瘤细胞的总RNA，用1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)与Oligo(dT)引物合成cDNA。通过PCR扩增小鼠IgG基因的可变区域，重链可变区域使用不同同型的引物，轻链可变区域使用Kappa链引物。PCR产物被亚克隆到一个TA克隆载体中。对于每个可变基因构建体，将10个以上的单克隆用于由Synbio Technologies(中国苏州)进行DNA测序。VH和Vκ的氨基酸序列由DNA测序结果得出。
2.嵌合抗体的构建
三个不同序列的抗体，包括129C10、160D10和125D5，被选为产生嵌合抗体的先导抗体，其SEQ列于表1和表2。经过测序分析和确认，合成了重链和轻链可变区的cDNA，并与人IgG4和 人kappa的恒定区序列相融合。为了提高抗体的分泌，在重链和轻链的N端分别加入了信号肽序列。得到的嵌合抗体基因被克隆到表达载体中。通过使用Qiagen公司的Plasmid Maxi-prep System制备大规模的DNA。
3.嵌合抗体的表达和纯化
根据制造商的协议，使用Invitrogen公司的ExpiFectamineTMCHO试剂进行重链和轻链的共转染。使用ExpiFectamineTMCHO试剂将ExpiCHO-S细胞在ExpiCHO表达培养基中以5-6x106细胞/ml的浓度转染等量的最终浓度为0.8μg/ml的重链载体和轻链载体DNA。将质粒DNA或ExpiFectamineTMCHO试剂用冷的OptiPROTM培养基稀释，然后通过旋转试管和/或倒置混合。将ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA混合物在室温下孵育1-5分钟，然后慢慢转移到装有细胞的摇瓶中。转染的细胞在37℃，5％CO2的湿润气氛下，在轨道摇床(125rpm的摇动速度)上培养。转染后18至22小时，加入ExpiCHOTMFeed，并在第10天收获条件培养基。将上清液以4,000rpm的速度离心20分钟，然后通过0.22μm的过滤囊过滤以去除细胞碎片。过滤后的上清液被装入预平衡的Protein-A亲和柱。用平衡缓冲液(PBS)清洗Protein-A树脂，然后用25mM柠檬酸盐(pH3.5)来洗脱抗体。用1M Tris-base(pH9.0)将纯化的抗体溶液调节到pH6.0-7.0。内毒素被控制在1EU/mg以下。最后，纯化的抗体通过SDS-PAGE进行鉴定。
实施例5:人源化抗体的产生和特性化
1.人源化抗体的产生、表达和纯化
小鼠抗体129C10的可变区结构域的序列被用来确定与各自小鼠框架具有最高同源性的胚系序列。使用计算机建模设计带有CDR嫁接和回复突变的人源化变体。
129C10
人胚系框架序列VH/1-2用于重链，VK/2-30用于轻链，分别用于CDR嫁接。
重链(HC)变体1、2、3和4是通过将三个CDR直接嫁接到胚系序列(SEQ ID NO:37)，此外，分别对于HC变体1有R71V、A93T突变(SEQ ID NO:20)，对于HC变体2有R71V，A93T，V67A，M69L突变(SEQ ID NO:22)，对于HC变体3有R71V，A93T，A65G，K64Q，E61Q突变(SEQ ID NO:24)和对于HC变体4有R71V，A93T，V67A，M69L，A65G，K64Q，E61Q突变(SEQ ID NO:26)而得到的。应该注意的是，HC变体3和4有3个突变(A65G，K64Q，E61Q)被引入HC CDR2中，以进一步提高抗体的人源化。
129C10HC的胚系序列：
VH/1-2(129C10-HC胚系，SEQ ID NO:37)。
VH/1-2变体1(Hu129C10_Ha，SEQ ID NO:20)。
VH/1-2变体2(Hu129C10_Hb，SEQ ID NO:22)。
VH/1-2变体3(Hu129C10_Hc，SEQ ID NO:24)。
VH/1-2变体4(Hu129C10_Hd，SEQ ID NO:26)。
轻链(LC)变体1和2是通过将三个CDR直接嫁接到胚系序列(SEQ ID NO:38)，另外，分别对于LC变体1有F36L回复突变(SEQ ID NO:28)和对于LC变体2有F36L、T69A回复突变(SEQ ID NO:30)而得到的。
129C10LC的胚系序列
VK/2-30(129C10-LC-胚系,SEQ ID NO:38)
VK/2-30变体1(Hu129C10_La，SEQ ID NO:28)。
VK/2-30变体2(Hu129C10_Lb，SEQ ID NO:30)。
合成了上述重链和轻链的可变区的cDNA，然后与人IgG4和人kappa的恒定区的序列相融合。得到的抗体基因序列被克隆到一个表达载体中。使用Qiagen公司的Plasmid Maxiprep系统制备大规模的DNA，并根据制造商的协议使用Invitrogen公司的ExpiFectamineTMCHO试剂进行细胞转染。当细胞活力超过60％时收获上清液，并通过0.22微米的过滤囊过滤以去除细胞碎片。过滤后的上清液随后被加载到一个预平衡的Protein-A亲和柱上。用平衡缓冲液(PBS)清洗蛋白A树脂，然后用25mM柠檬酸盐(pH3.5)洗脱抗体。用1M Tris-base(pH9.0)将纯化的抗体溶液调节到pH6.0-7.0。内毒素被控制在1EU/mg以下。最后，纯化的抗体通过SDS-PAGE进行鉴定。
还构建了基准抗体OMS721-analog和129C10-hu-YTE(Hu129C10_HaLa-hIgG4并具有氨基酸取代M252Y/S254T/T256E[YTE]，见表2-3)，表达和纯化过程与上述相同。
实施例6：嵌合型和人源化MASP-2抗体的阻断活性
将纯化的抗体从100μg/ml开始连续稀释，得到一个梯度浓度。补体C3激活试验用于评估MASP-2抗体的阻断活性，如实施例3所述。将每孔100μl的10μg/ml甘露聚糖包被在ELISA板上，在4℃下过夜。将抗体与1％人血清(Quidel，A113)在冰上孵育45分钟。洗涤和封闭板后，加入抗体-血清混合物并在37℃下孵育90分钟。清洗后，用HRP连接的抗C3c抗体(Quidel-A205)检测沉积的活化C3。图4显示了嵌合抗体和人源化抗体对补体C3激活的阻断活性。由于人源化的 129C10变体129C10HaLa显示出最好的亲和力和C3阻断活性，129C10HaLa被选为进一步的体外和体内研究的主导抗体，并被命名为129C10-hu。
实施例7:先导抗体129C10-hu与基准抗体OMS721-analog之间阻断补体C4和MAC的活性比较
1.阻断补体C4和MAC激活的活性比较
使用实施例3中描述的检测方法，对先导MASP-2抗体129C10-hu和OMS721-analog在2％人血清中对补体C4和MAC激活的阻断活性进行了比较。将每孔100μl的10μg/ml甘露聚糖包被在ELISA板上，在4℃下过夜。将抗体与2％人血清(Quidel，A113)在冰上孵育45分钟。洗涤和封闭板后，加入抗体-血清混合物，在37℃下孵育90分钟。清洗后，用HRP连接的抗C4c抗体(Quidel-A211)检测沉积的活化C4。对于MAC的激活，用HRP连接的抗MAC(SC5b-9)抗体(Quidel-A239)检测。如图5和图6所示，结果表明，相比于OMS721-analog，129C10-hu在阻断补体C4(IC50：0.11μg/mL vs.1.70μg/mL)和MAC(IC50：0.27μg/mL vs.1.97μg/mL)的激活方面更强效约10倍。
2.不同浓度血清中的活性比较
不同浓度(1％、10％和50％)的人血清被用于补体C3激活试验。对于1％和10％的人血清，检测方法与实施例3中所述相同。对于50％的人血清，以1μg/ml的浓度包被甘露聚糖，每孔100μl，4℃过夜。用PBS+0.1％Tween20洗涤3次后，用封闭缓冲液(10mM Tris-HCl+0.1％人血清白蛋白+140mM NaCl)封闭平板1小时。用含有50％人血清(Quidel，A113)的测定缓冲液(0.1％人血清白蛋白+20mM Tris-HCl+2mM CaCl2+140mM NaCl+1mM MgCl2+0.05％Tween20)连续稀释抗体，然后在冰上孵育45分钟。将封闭缓冲液从甘露聚糖包被的平板上移走，加入抗体-血清混合物。平板在37℃下孵育30分钟。清洗3次后，用HRP连接的抗C3c抗体(Quidel-A205)检测活化的C3。如图7所示，129C10-hu和OMS721-analog对1％血清中的C3激活有类似的抑制功效(IC50：0.08μg/mL vs.0.10μg/mL)。有趣的是129C10-hu在10％血清的高浓度下表现出比OMS721-analog高3倍的效力(IC50：0.20μg/mL vs.0.69μg/mL)(见图8)。更重要的是，在50％的血清浓度下，129C10-hu仍然具有阻断C3激活的活性，IC50为0.05μg/mL，而OMS721-analog则失去活性(见图9)。对于阻断C4的激活，129C10-hu在10％的人血清中也显示出比OMS721-analog高2倍的效力(IC50：0.69μg/mL vs.1.59μg/mL)(见图10)。
实施例8:通过生物层干涉仪(ForteBio)检测MASP-2抗体与人MASP-2的结合亲和力
用ForteBio动力学缓冲液(PBS pH 7.4，0.1％BSA+0.002％Tween-20)将待测抗体稀释到100nM的浓度。用动力学缓冲液稀释人MASP-2蛋白，得到100nM、50nM和25nM三个浓度的梯度。0nM被用来作为参考对照。抗体被固定在Protein A生物传感器上。检测基线60秒，然后检测抗体与MASP-2的缔合180秒，得到Kon因子数据。随后在动力学缓冲液中解离180秒，得到Koff因子数据。生物传感器的再生是在10mM甘氨酸，pH2.0的缓冲液中。所有的动力学数据都是在30℃下收集的。数据是通过使用ForteBio Octet RED96获取，并通过Octet Data Analysis软件进行分析。如表3所示，所有测试的MASP-2杂交瘤抗体与人MASP-2有很高的结合亲和力，KD值 从10-10M到10-8M。人源化后，主导抗体129C10-hu(129C10-HaLa)与hMASP-2保持最高的结合亲和力，KD值<10-12M(达到ForteBio的检测极限)(表4)，Kon值为3.53E+4，Koff值为<1.0E-7(见图11)。
表3 MASP-2杂交瘤抗体的结合亲和力
表4 MASP-2人源化或嵌合抗体的结合亲和力
实施例9:通过ELISA检测129C10-hu的结合特异性
人C1s/C1r、MASP-1/3均购自R&D、Cusbio等。将重组人补体成分C1s/C1r、MASP-1或MASP-3(1mg/ml)在4℃下包被过夜；用洗涤缓冲液洗涤三次；在4℃下加入封闭缓冲液(200μL/孔)1h；洗涤三次；在RT下加入连续稀释的Ab 1h；洗涤三次；加入小鼠抗人IgG4HRP(1:20000)，在RT下1小时；洗涤三次；用四甲基联苯胺(TMB)在OD450nm下检测40分钟。129C10-Hu和 OMS721-analog与C1s、C1r、MASP1、MASP2或MASP3结合的EC50分别显示在图12A-12E。结果显示，129C10-Hu只与人MASP2结合，而不与人C1s、C1r、MASP1或MASP3结合。
实施例10:通过ELISA对129C10-hu进行交叉反应
大鼠/小鼠MASP-2是向Cusbio公司订购的。人/食蟹猴MASP-2是在内部生成的。ELISA测定按以下程序进行。将不同物种的MASP2(1μg/ml)在4℃下包被过夜；用洗涤缓冲液洗涤三次；在RT下加入封闭缓冲液(200μL/孔)2小时；洗涤三次；在RT下加入连续稀释的129C10-hu或作为对照的OMS721-analog 1小时；洗涤三次；在RT下加入小鼠抗人IgG4Fc HRP(1：20000)1小时；洗涤三次；用TMB在OD450nm下检测2分钟。129C10-Hu和OMS721-analog与不同物种的MASP-2的结合EC50分别见图13A和图13B。
实施例11:129C10-hu与食蟹猴MASP-2的交叉反应性，通过使用食蟹猴血清中的C4激活测定
除了使用食蟹猴的血清外，测定方法与实施例3中描述的相同。每孔100μl，10μg/ml甘露聚糖包被在ELISA板上，4℃过夜。将抗体与1％食蟹猴的血清在冰上孵育45分钟。洗涤和封闭板后，加入抗体-血清混合物，然后在37℃下孵育90分钟。清洗后，用HRP连接的抗C4c抗体(Quidel-A211)检测沉积的活化C4。如图14所示，129C10阻断了食蟹猴的C4激活，其IC50为0.4973μg/ml，表明129C10可以与食蟹猴MASP-2结合，阻断其活性。
实施例12:129C10在阻断MB-Lectin补体途径的激活方面的选择性
有3条途径可以启动补体激活：经典途径、MB-Lectin(MBL)途径和替代途径。这些途径的启动依赖于不同的分子，而它们汇聚在一起产生同一套效应分子，如膜攻击复合物(MAC)。这三种途径都是先天免疫的重要组成部分，在防御不同的感染中发挥不同的作用(Noris M,et.Al.2013.JM.)。接下来，测试了129C10-hu阻断MBL途径的选择性。
Wieslab补体系统筛选试剂盒(IBL America,Cat#COMPL 300RUO)被用来确定主导抗体129C10-hu的选择性。板上预包被有甘露聚糖作为MBL途径的启动剂，IgM作为经典途径的启动剂，LPS作为替代途径的启动剂。用含有人类血清(Quidel，A113)的测定缓冲液连续稀释129C10-hu，然后在冰上孵育45分钟。将抗体-血清混合物加入平板中，在37℃下孵育60分钟。清洗后，用AP连接的抗C5b-9抗体检测沉积的MAC。EDTA被用来作为阻断补体激活的阳性对照。如图15a-15C所示的结果，129C10-hu只阻断了从MBL途径启动的补体激活，而不是其他两条补体途径，这表明129C10-hu抗体选择性地阻断了MBL途径的补体激活。
实施例13：通过在Fc处引入YTE突变来延长129C10-hu的半衰期。
Dall'Acqua WF等人报告说，在IgG的Fc部分引入三重突变M252Y/S254T/T256E(YTE)可以增强其与FcRn的结合亲和力并延长其在体内的半衰期(Dall'Acqua WF,et.al.2006.JBC)。Motavizumab-YTE是人类第一个YTE突变的IgG，在I期临床试验中显示出良好的耐受性和延长的半衰期(Robbie,G.J.,et.al.2013.AAC)。
我们将这种M252Y/S254T/T256E(YTE)突变引入129C10-hu，生成129C10-hu-YTE。用生物层干涉仪(ForteBio)评估了它与FcRn的结合亲和力。129C10-hu或129C10-hu-YTE用ForteBio动力学缓冲液(PBS pH 7.4,0.1％BSA+0.002％Tween-20)稀释到500nM、167nM、56nM、19nM和0nM的系列浓度。带His标签的人FcRn(FCGRT&B2M)蛋白用动力学缓冲液稀释到100nM的浓度梯度。FcRn蛋白被固定在Ni-NTA生物传感器上。记录和分析了缔合和解离的动力学过程。如图16A、图16B和表5所示，YTE突变使129C10-hu与人FcRn的结合亲和力增加了3倍。
表5 129C10-hu和129C10-hu-YTE与人FcRn的结合亲和力
实施例14：MASP-2抗体129C10-hu和129C10-hu-YTE在食蟹猴中的药代动力学(PK)/药效动力学(PD)研究
每组2只食蟹猴静脉注射10mg/kg 129C10-hu、129C10-hu-YTE或OMS721-analog。在输液后0、0.5、2、8、24、48、72、96、168、336、504、672、840小时收集血清样品。测试了血清中的抗体浓度和凝集素途径激活的效力。
血清浓度用开发的ELISA方法测定，检测范围为0.625-40ng/mL。微孔板上预包被有人IgG特异性抗IgG抗体[R10z8e6]。封闭后，加入标准(STD)、质控(QC)样品、基质空白样品和测试样品。洗涤后，将生物素小鼠抗人IgG4加入微孔板孔中，随后加入用HRP标记的链霉亲和素。在微孔板孔中加入TMB。通过与同时分析的标准曲线进行比较，将质控和测试样品的OD值转换为浓度，根据四参数的逻辑模型进行回归。
对于凝集素途径的激活效力测试，将10μg/ml甘露聚糖包被在ELISA板上。用C4激活缓冲液将食蟹猴血清样品稀释到2％。洗涤和封闭平板后，加入稀释的血清并在37℃下孵育90分钟。清洗后，用HRP连接的抗C4c抗体(Quidel-A211)检测沉积的活化C4。
如图17和表6所示的PK结果，129C10-hu在食蟹猴中的半衰期164.77小时比OMS721-analog(130.152小时)长。YTE突变使129C10-hu的半衰期增加到274.404小时。如图18所示的PD结果，抗体给药0.5小时后，凝集素途径的激活效力被抑制到基础水平。抑制效果在OMS721-模拟组持续2周，在129C10-hu组持续3周，在129C10-hu-YTE组持续约4周。
表6 食蟹猴PK试验的数据汇总

在另一项单独的研究中，雄性和雌性食蟹猴被分配到五组，每组2雄性和2雌性，通过皮下注射0(溶媒对照)、15、20和295.8mg/kg 129C10-hu，或通过静脉注射15mg/kg 129C10-hu，注射量为3mL/kg，持续4周(多达五次)。溶媒对照文章使用药物配方缓冲液。
在用药前并分别在第一剂(见图19)和第四剂(见图20)后约0.083、2、6、24、48、96和168小时采集血样。血清中的补体4c(C4c)用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行分析。简而言之，甘露聚糖(Sigma)用包被缓冲液稀释到10μg/ml。在96孔板的每个孔中加入100μl的甘露聚糖工作溶液。将平板在4℃下孵育过夜。洗涤平板三次，然后加入200μl封闭缓冲液，在室温下孵育1h。用C4激活缓冲液将猴血清稀释至2％。在96孔板中加入100μl稀释后的血清，在37℃下孵育70分钟。用洗涤缓冲液清洗平板三次。加入100μl HRP连接的抗C4c抗体(用封闭缓冲液稀释为1:5000)，在室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液清洗平板三次。在96孔板的每个孔中加入100μl TMB底物溶液，在室温下孵育5-10分钟。向每孔板中加入50μl终止液。在450纳米处读取平板。在450纳米处的光密度(OD450)值表示为单个值，并计算每个动物每个时间点的平均值。
在第一次和第四次用药后，血清C4c在≥15mg/kg时出现剂量依赖性降低，在皮下用药的动物中给药后2小时开始出现，在经由I.V.用药的动物中给药后0.083小时开始出现,通过S.C或I.V.给药的3个剂量水平在整个用药期间，效果持续存在，在第一剂量后24-96小时具有最大效果，注意到通过S.C.给药的剂量为295.8mg/kg时，与基线值相比，最大平均降幅在雄性动物中高达88.4％，在雌性动物中高达92.8％。总之，在每周一次以剂量为15、60或295.8mg/kg通过S.C.或I.V.给药5个剂量后，129C10-hu对猴血清C4c有明显的剂量依赖性降低作用，表明血清C4c可能是一个潜在的药效学标志物。
实施例15：抗体制剂研究的材料与方法
本发明制剂研究中选用的蛋白即抗体分子以129C10-hu-YTE为示例进行考察。
本发明所用的仪器设备参见如下表7，耗材参见如下表8，试剂参见如下表9。
表7 仪器设备

表8 耗材
表9 试剂

本发明中涉及的方法步骤如下：
1.通用缓冲液制备方法：所有缓冲液的制备均使用特定的酸性和碱性离子对。准确称取酸性，碱性离子对的辅料，加入约为目标缓冲液体积的60％的Milli-Q水，混合均匀后，测定溶液的pH。如果pH值偏离目标值，需使用相应的离子对调节pH。然后将溶液用Milli-Q水稀释至目标重量或目标体积。最后测定溶液的电导率，渗透压和pH以进行验证。
2.样品制备方法：用透析法将DS缓冲液置换到目标制剂处方中，或者直接将高浓度辅料、表面活性剂加入高浓度DS中，然后将DS稀释至目标浓度。透析方法根据使用的耗材可以分为以下两种：(1)如果目标制剂的处方与DS中的缓冲液不同，则使用透析方法将DS缓冲液置换为目标制剂处方(表面活性剂不可通过透析方法加入)。将样品装入透析袋，密封后，放入体积大约是样品量100到200倍的缓冲液中。透析进行3次，持续时间分别为4小时，4小时和过夜，搅拌速度为200rpm。然后移取适量的表面活性剂和其他辅料储备液加入样品溶液中，并将样品溶液稀释至目标浓度。(2)还可使用Slide-A-Lyzer透析卡进行透析。使用带针注射器将3-12ml样品装入透析卡内，浸入100到200倍的目标缓冲液中，在室温下，以300转/分搅拌将透析卡持续透析三次，时间分别为4小时，4小时和过夜。
3.外观：通过YB-2澄明度检测仪检查黑色和白色背景的外观。报告澄清度，颜色和可见颗粒。
4.pH：样品pH通过安装有Micro-Pro-ISM电极的Seven Compact pH计测量样品pH。在使用前校准pH计。
5.蛋白浓度：通过Nano Drop 2000分光光度计在280nm处的吸光度测定蛋白质浓度。在整个研究中使用的消光系数(E1％)为1.422L/g/cm。每个样品在2.0μL的加载体积下测量两次，报告平均浓度。
6.动态光散射仪(DLS)：通过DLS使用以下测量条件测定蛋白质大小分布：采集时间：5s，每次测量采集：20次，温度：25℃。
6.1.利用DLS测定kD值：将样品用相应的缓冲液稀释至浓度为1、2、4、8、12、16、20mg/mL，利用DLS对其kD值进行分析，采集时间：5s，每次测量采集：20次，温度：25℃。
6.2.利用DLS测定粘度：将待测样品与直径为100nm的标准粒子混合，标准粒子的终浓度为1％，利用DLS测得标准粒子的表观粒径，采集时间：5s，每次测量采集：20次，温度：25℃，并采集的数据经DYNAMICS软件进行分析计算出体系的粘度。
6.3.利用DLS测定Tonset值：Tonset测定的是蛋白在升温过程中发生构型变化或聚集而使得粒径发生变化时的转变温度。将样品用相应缓冲液稀释至4mg/mL，取100μL加入96孔板，3000rpm离心5min，加入10μL硅油覆盖在样品上，3000rpm离心5min。仪器在25～80℃范围内按照1℃/min进行线性升温，同时单个样品测定8次，每次采集3s。收集粒径和温度数据，绘制曲线，用仪器官方软件提供的线性相交功能可计算得到样品的Tonset。
7.体积排阻色谱(SEC)：蛋白聚集情况使用Waters H Class超高效液相色谱仪和Waters BEH Protein SEC柱(150×4.6mm，1.7μm)通过SEC方法测定。流动相为50mM磷酸钠缓冲液，300mM NaCl，pH 6.8±0.1。流速为0.4mL/min。将样品稀释至2mg/mL，检测体积10μL，检测波长为280nm。
8.阳离子交换色谱(CEX)：蛋白的电荷异质性通过CEX-HPLC方法进行测定。液相系统为Agilent 1260 Infinity II，色谱柱为Thermo Propac WCX-10 BioLC column(4×250mm,10μm)。样品混合均匀后，离心并转移上清液，然后用流动相A稀释至2.0mg/mL。色谱条件如下表10所示。
表10 阳离子色谱运行条件
9.非还原毛细管电泳(NR-CE-SDS)：蛋白碎片情况通过NR-CE-SDS方法进行测定。将标准品或供试样品用磷酸-柠檬酸缓冲液稀释至4mg/mL，然后取25μL与75μL SDS样品缓冲液和5μL NEM(100mM N-乙基马来酰亚胺)涡旋混合进行变性处理。变性的样品经离心后，在70±2℃下孵育10±2min，在室温下冷却，然后再次离心。使用SDS分离凝胶试剂盒和未涂层的熔融石英毛细管在PA800 plus上进行分离。使用高速分离模式，毛细管的有效分离长度10cm。
10.蛋白溶液浊度测试(OD405)：通过Envision多功能微孔板检测仪对样品浊度进行检测。以缓冲液为空白对照，测得样品与空白对照的差值为样品405nm的OD值。
11.微流成像系统(MFI)：样品中的亚可见微粒数量是通过Protein Simple的MFI 5200进行测定。样品无需稀释，直接用移液枪取1mL进样。报告每毫升样品中粒径分别在≥2μm，≥10μm和≥25μm范围内的颗粒数。
12.全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(icIEF)：样品通过和适当的包含有pl标记物和两性电解质混合物混匀后通过自动进样器进入到iCE3系统的FC-coated毛细管中。经过高电压分离步骤后，蛋白的不同电荷异构体迁移到各自的等电点位置，然后该分离后确定位置经UV检测器捕获(通过全柱检测的CCD相机在UV280nm处采集的UV吸收图谱)。使用iCE系统软件,通过样品出峰和相应的pl标记物的聚焦位置校准样品出峰的等电点，后续数据分析在Empower软件中执行。色谱条件如下表11所示。
表11 色谱运行条件
13.结合活性：本方法使用抗MASP-2抗体C4活化抑制测定法，实验中包被物为甘露聚糖，检测抗体为Complement C4c Antibody(HRP)，酶反应的底物为TMB。将甘露聚糖包被吸附在ELISA固相载体吸附板上，洗涤封闭后加入供试品和人血清补体混合物与之结合，其中样品浓度越高其抑制血清中MASP-2裂解C4的效应越强，C4b含量就越低，则剪切得到的C4c越少。待孵育后洗涤，加入检测抗体，再进行孵育后洗涤除去未结合的检测抗体，加入底物显色，最后加入反应终止液，在酶标仪上读取吸光值，其检测波长为450nm/650nm。以抗MASP-2抗体蛋白浓度的log值为横坐标，OD450nm-650nm值为纵坐标进行四参数拟合，获得样品与标准品的IC50值。最终结果以标准品IC50值除以样品IC50值的相对活性进行汇报。
实施例16：辅料筛选实验
1.实验设计
样品处方信息，稳定性实验放置条件和检测方法如表格12所示。UFDF样品通过透析置换为目标处方的缓冲液中，然后用相应的辅料储备液稀释至30mg/mL，最后用0.22μm PVDF膜过滤制备得到。
表12 辅料筛选实验设计方案
2.实验
2.1.高温40℃实验结果
在40℃下放置14天后，5个处方的粒径、浓度、pH没有明显差异；纯度方面，所有处方的纯度均发生下降，其中F2(NaCl)和F3(Sor)的SEC主峰最多，F3(Sor)的CEX主峰下降最多，具体降解趋势如图24，图25，图26所示。
2.2.振摇实验结果
辅料筛选中各处方在振摇条件下的CEX结果如图27所示，振摇1天，3天，5天后，5个处方的外观、浓度、OD405和纯度都没有发生明显变化。
2.3.搅拌实验结果
5个处方的样品外观均由乳光变为浑浊，但F4(Suc)在搅拌2小时后依然保持乳光状态，而其他处方在搅拌2小时后已变浑浊。除F1(Arg)外，其余处方的OD405均增加。所有处方的浓度和pH无明显变化。搅拌2小时，6小时后，5个处方的SEC纯度都没有发生明显变化。辅料筛选中各处方在搅拌条件下的CEX、NR CE-SDS结果如图28、图29所示。
2.4.冻融实验结果
经5轮冻融后，5个处方的样品浓度，粒径，OD405和pH均没有明显变化。不溶性微粒方面，F2(NaCl)不溶性微粒浓度呈明显增加趋势。辅料筛选中各处方在冻融条件下的MFI结果如表格13所示。
表13 MFI结果_冻融

总结
对于F2(NaCl)和F3(Sor)来说，40℃条件下SEC、CEX主峰下降程度较其他处方更大，明显劣于其他处方，因此排除上述两种作为辅料。总体来看，精氨酸、蔗糖和海藻糖之间无明显差异，均可满足试验要求，综合成本和辅料在生物制剂上应用的广泛性考虑，因此选择蔗糖F4(Suc)进入下一步实验。
实施例17：表面活性剂筛选实验
1.实验设计
样品处方信息，稳定性实验放置条件和检测方法如表格14所示。UFDF样品用相应的辅料储备液稀释至50mg/mL，最后用0.22μm PVDF膜过滤制备得到。分别取1mL样品至2R西林瓶以进行40℃试验，取2mL样品至6R西林瓶中以进行搅拌试验，2mL样品至2R西林瓶中进行振摇试验。
表14 表面活性剂筛选实验方案设计
2.实验
2.1.高温40℃实验结果
(1)外观、粒径、Conc.，pH和OD405
如表格15所示，6个处方在经40℃处理后外观、粒径、Conc.，pH和OD405均无变化。
表15 表面活性剂筛选实验的外观，粒径，浓度和OD405_高温实验结果
SOC＝轻微乳光
(2)SEC
如表16和图30所示，经40℃处理后所有样品的SEC主峰略微下降，但6组处方之间无明显区别。
表16 表面活性剂筛选实验SEC结果_高温实验
(3)NR CE-SDS
如表格17所示，经40℃处理后所有处方的NR CE-SDS MP％均发生下降，但变化幅度不大，均在可接受范围。
表17 表面活性剂筛选实验NR CE-SDS结果_高温实验

(4)CEX
如表格18所示，经40℃处理后，所有处方的主峰MP％均发生了中等程度的下降，但均在可接受范围，各处方的CEX无显著差异。
表18 CEX结果_高温实验
2.2.搅拌实验结果
表面活性剂筛选中各处方在100rpm搅拌条件下的稳定性结果如表格19、图31、图32所示。经100rpm搅拌6小时后，F6(T2)，F7(T5)，F9(W2)和F10(W5)的外观由乳光变为浑浊，所有处方的OD405均升高，浓度和pH无明显变化。搅拌2小时，6小时后，6个处方的纯度都没有发生明显变化。
表19 外观、浓度、OD405、PH、粒径结果_搅拌实验

SOC＝轻微乳光、Turbid＝浑浊
2.3.振摇实验结果
(1)外观、浓度、OD405
如表格20所示，经200rpm振摇5天后，各处方的外观、浓度和OD405无明显变化。
表20 外观、浓度、OD405结果_振摇实验
SOC＝轻微乳光
(2)NR CE-SDS
如表格21所示，经振摇处理后，所有处方的NR CE-SDS主峰变化无明显区别。
表21 NR CE-SDS结果_振摇实验
(3)CEX
如表格22所示，经振摇处理后，所有处方的CEX主峰无明显变化。
表22 CEX结果_振摇实验

3.总结
40℃条件下，各个处方的外观、OD405和DLS等结果均无明显变化，所有处方的SEC有略微降低，NR CE-SDS和CEX主峰有中等程度定的降低，处方之间的差异较小。
搅拌条件下，各处方的浓度无明显变化，但F6(T2)，F7(T5)，F8(W2)和F10(W5)的外观由乳光变为浑浊，F7(T5)，F9(W2)和F10(W5)的OD405上升，所有处方的DLS粒径和PDI均有增加，纯度无明显变化。
振摇条件下，各个处方的外观和DLS等结果均无明显变化，所有处方的纯度无明显变化，处方之间没有差异。
在表面活性剂筛选中，聚山梨酯80和聚山梨酯20之间无明显差别，所有处方均对于振摇应力有一定的抗性，均满足实验要求。综合成本考虑，选择聚山梨酯80作为表面活性剂进行接下来的试验。
实施例18：pH筛选实验
1.实验设计
样品处方信息和检测方法如表23所示。UFDF样品通过透析置换为目标处方的缓冲液中，然后用相应的辅料储备液稀释至30mg/mL，最后用0.22μm PVDF膜过滤制备得到。样品制备完成后对其外观，浓度，渗透压，粘度，kD，Tonset进行测定。
表23 pH筛选实验设计方案

2.实验
2.1.冻融实验
(1)浓度，pH，粒径和OD405结果
如表格24所示，经5次冻融后，F18(Cit5.5)，F19(Cit6.0)和F20(Cit6.5)的OD405呈增加趋势，其余处方的OD405没有明显变化。9个处方的样品浓度和pH均没有明显变化。F18(Cit5.5)，F19(Cit6.0)和F20(Cit6.5)的样品粒径较大，冻融后样品粒径无明显变化。
表24 外观，浓度，pH和OD405结果_冻融
(2)MFI结果
如表格25所示，T0时，在≥25μm的不溶性微粒浓度方面，所有处方均小于10个/mL；在≥10μm的不溶性微粒方面，所有处方均小于100个/mL。经过冻融后，F19(Cit6.0)中≥2μm和≥10μm的不溶性微粒有明显增加趋势，其余处方之间没有观察到明显的差异。
表25 MFI结果_冻融

2.2.振摇实验
(1)外观、浓度，pH和OD405结果
如表26所示，T0时，所有样品均呈有乳光，且均未发现可见异物，蛋白浓度和pH值均符合要求。经200rpm振摇5天后，F18(Cit5.5)外观变为浑浊，F18(Cit5.5)，F19(Cit6.0)和F20(Cit6.5)的OD405呈增加趋势，其余处方的外观和OD405没有明显变化。9个处方的样品浓度和pH均没有明显变化。
表26 外观，浓度，pH和OD405结果_振摇
SOC＝轻微乳光
Turbid＝浑浊
(2)NR CE-SDS和CEX结果
如表27和表28所示，所有处方的NR CE-SDS和CEX主峰无变化。
表27 NR CE-SDS结果_振摇
表28 CEX结果_振摇
2.3.高温40℃实验
(1)浓度，pH，粒径和OD405结果
如表格29所示，在40℃下放置14天后，9个处方的浓度、pH和粒径没有明显差异。但F18(Cit5.5)的OD405有一定程度的上升。
表29 浓度，pH和OD405结果_高温

(2)SEC结果
如表格30和图21所示，组氨酸处方中蛋白的SEC HMW％含量总体较小，醋酸处方和柠檬酸处方中蛋白的SEC HMW％含量随着pH增加而增加，F14(Ace5.5)的SEC HMW％增加程度较大。
表30 SEC结果_高温
(3)NR CE-SDS结果
如表格31和图22所示，高温40℃下，所有处方的LMW％随着时间都有所增加，但所有处 方结果均在可接受范围内。
表31 NR CE-SDS结果_高温
(4)CEX结果
如表格32和图23所示，所有处方结果均在可接受范围内，其中F17(His6.0)主峰变化程度最大，其余处方的变化无显著性差异。
表32 CEX结果_高温
3.总结
pH筛选实验在T0时，F18(Cit5.5)，F19(Cit6.0)和F20(Cit6.5)的粒径较大，表明其结构更为松散；振摇实验中F18(Cit5.5)的外观由乳光变为浑浊，劣于其他处方；冻融实验中F19(Cit6.0) 和F20(Cit6.5)的不溶性微粒数量变化较大；在40℃条件下，F18(Cit5.5)的OD405上升，F14(Ace5.5)的SEC高聚体增加较多，F16(His5.5)和F17(His6.0)的CEX主峰下降较多和NR CE-SDS低聚体增加较多。
总体来看，醋酸和组氨酸体系的稳定性更优，总体而言，在醋酸体系中的pH 4.5和pH 5.0，组氨酸体系中的pH 5.0和pH5.5对蛋白具有较好的稳定性。考虑到醋酸缓冲液体系在pH 5.0，组氨酸体系在pH 5.5时的缓冲能力和稳健性较好，在工艺中pH调节时具有较好的操作空间，对偏离目标值的极端情况具有较好的风险控制。此外对于皮下注射的制剂而言，选用组氨酸的刺激更小，患者的耐受度更高。因此优选F13(Ace5.0)醋酸缓冲液pH 5.0和F16(His5.5)组氨酸缓冲液pH 5.5为优选缓冲体系。
实施例19：低浓度处方确认试验
1.实验设计
样品处方信息和检测方法如表33所示。样品通过透析置换为目标处方的缓冲液中，然后用相应的辅料储备液稀释至20mg/mL，最后用0.22μm PVDF膜过滤制备得到。样品制备完成后对其外观，浓度，渗透压，粘度，kD，Tonset进行测定。
表33 处方设计方案
2.实验结果
2.1外观，浓度，pH，粒径和OD405结果
如表格34所示，处方F21在经历搅拌、冻融、光照、振摇以及5℃、25℃、40℃、-20℃、-30℃条件的孵育之后，基本属性(外观、浓度、pH、生物学活性)均没有发生明显变化。对于粒径和PD％结果，除40℃外的稳定性条件下均无明显差异；因为40℃对于蛋白制剂属于较为剧烈的应力条件，因此结果变化较为明显属于正常现象，具体应根据SEC,NR-CE,CEX的结果进行判断。
表34 外观，浓度，pH和OD405结果

SOC＝轻微乳光、Multimodal＝多峰、NT＝未检测
2.2 SEC，CEX，NR CE-SDS结果
如表格35所示，处方F21在经历搅拌、冻融、光照、振摇以及5℃、25℃、-20℃、-30℃条件的孵育之后，SEC，CEX，NR CE的结果均无明显变化。40℃条件下，SEC、CEX和NR CE主峰均发生了一定程度的下降，但并不影响生物学活性；在40℃下倒置4周的样品和正置相比，各检测项无明显差异，说明包材与蛋白制剂相容性良好。
表15 SEC，CEX，NR CE-SDS结果

ND表示未检出
3.总结
低浓度处方确认实验的结果表明，最终处方F21在5℃、25℃、-20℃、-30℃条件下均能保持长时间的稳定，对冻融和振摇的耐受性较好，在光照和搅拌条件下不会发生变化，在40℃条件下会有一定的变化，因此该样品应该注意防止长时间高温放置。低浓度制剂开发经过了表面活性剂筛选，辅料筛选，pH筛选和最终处方确认研究，得到最终低浓度制剂处方选定为20mg/mL蛋白，10mM组氨酸盐，8.6％(w/v)蔗糖，0.05％(w/v)聚山梨酯80，pH为5.3。
实施例20：高浓度实验
1.实验设计
样品处方信息，稳定性实验放置条件和检测方法如表格36所示。UFDF样品经超滤浓缩后用相应的辅料储备液稀释至150mg/mL，最后用0.22μm PVDF膜过滤制备得到。取制备的样品分别进行kD，Tonset和粘度测定。
表36 高浓度实验设计方案

2.实验结果
表37 kD值，Tonset和渗透压结果
(1)kD值结果
pH为4.5，5.0，5.5的醋酸缓冲液和pH为5.0，5.5，6.0的组氨酸缓冲液kD均为正值。在pH为5.0的10mM醋酸缓冲液中,辅料为5.8％蔗糖和230mM脯氨酸的处方的kD为正值，辅料为125mM精氨酸时为负值。kD为正，说明体系中蛋白分子之间的作用力为强净排斥力，有利于蛋白的长期胶体稳定性，当kD为负值时，说明蛋白分子之间的作用力为净吸引力，不利于蛋白的长期胶体稳定性。
(2)Tonset结果
Tonset能预测蛋白的热稳定性。除F29(ARG)精氨酸处方外，各样品的Tonset值均大于60℃，表示在这些处方中，蛋白有较好的热稳定性。
(3)渗透压
根据渗透压结果可知，125mM精氨酸和5.8％的蔗糖浓度较目标值低,需要在后续实验中进一步调整。
3.总结
通过在不同缓冲液和辅料中的一般性质研究，10mM Acetate(pH 4.5，pH 5.0，pH 5.5)和10mM Histidien(pH5.0，pH5.5和pH6.0)的kD为正值，Tonset值均大于60℃，均满足试验要求。对于3种辅料而言，精氨酸的kD和Tonset均劣于蔗糖和脯氨酸。对皮下注射剂来说，选用组氨酸的缓冲体系对注射刺激性更小，且pH不宜过低，因此综合来看，优选10mM Acetate,pH 5.0，10mM Histidine,pH 5.0，10mM Histidine,pH 5.5，搭配蔗糖或者脯氨酸进入下一步研究。
实施例21：6处方研究和工艺比较实验
1.实验设计
样品处方信息，稳定性实验放置条件和检测方法如表格38所示。Fed-batch的UFDF样品先行超滤浓缩至合适浓度，然后用相应的辅料储备液稀释至150mg/mL，最后用0.22μm PVDF膜过滤制备得到。分别取1mL样品至2R西林瓶以进行25℃、40℃和光照试验，取2mL样品至6R西林瓶中以进行搅拌试验，2mL样品至2R西林瓶中进行振摇试验。
表38 最佳6处方实验设计方案

2.实验
2.1.高温40℃实验
(1)外观，粒径，浓度，OD405和pH
如表格39所示，所有处方的渗透压均在预设目标内(250～350 mOsm/kg H2O)，以蔗糖作为辅料的处方(F31，F32，F33，F37)相较于脯氨酸处方(F34，F35，F36)的粘度更高，组氨酸处方与醋酸处方相比粘度更高。F34(Ace50Pro)，F35(His50Pro)和F36(Fed-Batch)的pH比目标值略高，需要在后续实验中进行调整。7个处方在经40℃处理4周后外观、粒径浓度和pH均无变化，但F31(Ace50Suc)，F32(His50Suc)，F33(His55Suc)，F34(Ace50Pro)和F36(His55Pro)的OD405略有上升。
表39 外观，粒径，浓度，OD405和pH结果_高温40℃实验
SYC:微黄澄清，无可见异物
CC:无色澄清，无可见异物
(2)SEC
如表格40和图33所示，经40℃处理4/6周后，所有处方的SEC HMW％均有所上升，MP％ 下降，F31(Ace50Suc)和F32(His50Suc)主峰下降更多，F33(His55Suc)和F36(His55Pro)下降较少。同样处方的F31(Ace50Suc)和F37(Fed-Batch)相比，Fed-batch来源的原液要比Perfusion在40℃条件下SEC主峰下降更少。
表40 SEC结果_高温实验
(3)NR CE-SDS
如表格38和图34所示，经40℃处理4/6周后所有处方的NR CE-SDS LMW％均有一定程度增加，MP％下降，其中F34(Ace50Pro)变化最大。同样处方的F31(Ace50Suc)和F37(Fed-Batch)相比，Fed-batch来源的DS要比Perfusion在40℃条件下NR CE-SDS主峰下降更少。
表41 NR CE-SDS结果_高温实验
(4)CEX
如表格42和图35所示，经40℃处理4周后所有处方的酸性峰均增加，MP％下降。相同处方的F31(Ace50Suc)比F37(Fed-Batch)的CEX主峰下降略多。
表42 CEX结果_高温实验
(5)活性
如表格43所示，在40℃放置4周后，各处方的活性没有显著差异。
表43 活性结果_高温实验
2.2. 25℃实验
经25℃处理4周后所有处方外观、Conc.、pH和OD405均无变化。所有样品的纯度(SEC，NR CE-SDS，CEX)均发生中等程度的下降，其中F31(Ace50Suc)的SEC变化最多，F34(Ace50Pro)的NR CE-SDS变化最大。总体而言组氨酸缓冲体系优于醋酸缓冲体系，具体降解趋势如图36，图37和图38所示。
2.3.光照
经光照处理3天后所有处方外观、DLS，Conc.、pH和OD405均无变化。各组处方的纯度均发生下降，具体趋势如图39，图40和图41所示。F35(His50Pro)的SEC HMW％和NR CE-SDS LMW％增加最少。F33(His55Suc)和F36(His55Pro)的CEX变化最小。
2.4.振摇
经200rpm振摇处理10天后所有处方外观、DLS，Conc.、pH和OD405均无变化。纯度方面CEX无明显变化，经200rpm振摇10天后，所有处方的SEC和NR CE-SDS均发生变化，其中F32(His50Suc)的LMW％增加最少，其余处方无明显差异，具体趋势如图42、图43和图44所示。经过200rpm振摇10天后，各处方的不溶性微粒数量无明显差异。
3.总结
25℃ 4周条件下，各个处方的外观、DLS、OD405等结果均无明显变化，但F31(Ace50Suc)的SEC较其他处方变化更多，F34(Ace50Pro)的NR CE-SDS较其他处方变化更多。
40℃ 4周条件下，外观、Conc、pH、DLS均无变化，但F31(Ace50Suc)，F32(His50Suc)，F33(His55Suc)，F34(Ace50Pro)和F36(His55Pro)的OD405略有上升，所有处方的SEC、CEX和NR CE-SDS的主峰有一定程度下降。F31(Ace50Suc)和F32(His50Suc)SEC变化程度大于其余处方，而F34(Ace50Pro)的NR CE-SDS变化略微大于其余处方。相同处方的不同工艺的灌流工艺F31(Ace50Suc)与批次补料的F37(Fed-Batch)相比，批次补料工艺的F37(Fed-Batch)在40℃条件下，所有纯度变化均小于灌流工艺的F31(Ace50Suc)。
光照3天的条件下，各个处方的浓度，外观，pH和DLS等结果均无明显变化。SEC，NR CE-SDS和CEX主峰均有下降，其中F35(His50Pro)的SEC和NR CE-SDS主峰下降程度小于其余处方，F33(His55Suc)和F36(His55Pro)CEX主峰下降程度小于其余处方。
振摇条件下，各个处方的浓度，外观，pH，DLS、OD405、CEX主峰等结果均无明显变化。SEC和NR CE-SDS主峰略有下降，可能是由于振摇实验是在25℃条件下进行所导致的。其中F35(His50Pro)的SEC变化最小，F32(His50Suc)的NR CE-SDS变化最小。
本研究中选用了pH 5.0的醋酸缓冲液以及pH 5.0和pH 5.5组氨酸缓冲液，搭配蔗糖和脯氨酸，0.05％的聚山梨酯80进行试验，考察了光照，振摇，25℃，40℃的压力条件。此外，还比较了灌流和批次补料培养工艺生产的原液稳定性的差异。结果显示，在40℃，25℃和光照下，组氨酸缓冲液纯度变化小于醋酸缓冲液，且批次补料的工艺较灌流工艺生产的原液在40℃下更稳定，考虑到组氨酸对皮下注射更友好，蔗糖在生物制剂中使用得更为广泛，因此选择10mM Histidine,pH选择5.0和5.5中间值5.3搭配蔗糖进行最终处方确认实验。
实施例22：高浓度蛋白中表面活性剂浓度筛选实验
1.实验设计
样品处方信息，稳定性实验放置条件和检测方法如表格44所示。UFDF样品用相应的辅料储备液稀释至100mg/mL，最后用0.22μm PVDF膜过滤制备得到。分别取2mL样品至6R西 林瓶中以进行搅拌试验，2mL样品至2R西林瓶中进行振摇试验。
表44 第二次表面活性剂浓度筛选实验设计方案
2.结果
在本试验中，考察了0.025％，0.05％和0.1％等3个浓度的聚山梨酯80，并对样品进行了振摇和搅拌等压力测试，结果显示各聚山梨酯80浓度下，样品的外观、不溶性微粒，粒径、纯度(SEC)等结果无明显区别，均满足试验要求，选择0.05％的中间浓度进入最终处方确认试验。
表45 第二次表面活性剂浓度筛选实验结果

NT＝未检测
实施例23：处方确认实验
1.实验设计
样品处方信息，稳定性实验放置条件和检测方法如表格46所示。将UFDF样品用母液稀释至目标浓度的蛋白、蔗糖和聚山梨酯80，然后用0.22μm PVDF膜过滤，分别取2mL样品至2R西林瓶以进行-40℃、-20℃、5℃、25℃、40℃稳定性、-20℃/-40℃冻融、振摇和光照试验，取2mL样品至6R西林瓶中以进行搅拌试验，2mL样品至5mL PC瓶中进行-80℃冻融试验。
表46 制剂处方确认研究方案
2.结果
在处方确认实验中，对选定的处方进行了不同温度下的冻融、搅拌、振摇、光照、强制降解(40℃)，加速(25℃)，长期(5/-20/-40℃)等条件的考察，结果显示冻融、搅拌、振摇、长期条件下，样品的纯度均无明显变化，25℃和光照条件下，纯度有所下降，40℃条件下6周后，样品的纯度发生显著下降，但不影响结合活性，且处方中的PS80浓度没有发生下降。
最终处方确认实验的结果如表格47、48、49和表格50所示。
在5℃，-20℃和-40℃长期稳定性考察实验中，样品外观、DLS、SEC、CEX和NR-CE-SDS等结果均无明显变化。
25℃条件下，6周时各个处方无明显变化，3个月和6个月后CEX主峰略有下降。聚山梨酯80的含量无明显下降。
40℃条件下放置6周，样品SEC、CEX和NR-CE-SDS主峰均发生显著下降，但聚山梨酯80的含量并无明显下降。
光照7天的条件下，样品的外观和DLS等结果均无明显变化。纯度有轻微下降，但不影响结合活性。
冻融条件下，样品的外观、DLS、SEC、CEX、NR-CE-SDS等结果均无明显变化。且不溶性微粒的浓度没有明显增加。不同温度的冷冻条件对样品的冻融稳定性无明显影响。
在200rpm搅拌2小时后，样品的外观由轻微乳光变为浑浊，因此未对不溶性微粒进行检测，其余结果无明显变化。
在25℃下以200rpm转速振摇两周后，样品的外观、DLS、OD405、MFI，SEC，NR-CE-SDS和CEX主峰等结果均无明显变化。
在40℃下倒置4周的样品和正置相比，各检测项无明显差异，说明包材与蛋白制剂相容
表47 最终处方确认高温40℃实验结果
表48 最终处方确认加速(25℃)稳定性实验结果

表49 最终处方确认长期(5℃/-20℃/-40℃)稳定性实验结果
表50 最终处方确认搅拌、冻融、光照、振摇实验结果

SOC＝轻微乳光、Turbid＝浑浊、NT＝未检测
3.总结
高浓度最终处方在-40℃，-20℃，5℃和25℃条件下均能保持长时间的稳定，对冻融和振摇的耐受性较好。在光照和搅拌条件下会发生变化，在40℃条件下变化较大，因此该样品应该注意防止长时间光照，高温和剧烈搅拌。
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案限制。实际上，除所描述的那些以外，根据前述描述和附图，本文提供的多种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改意图属于所附权利要求的范围之内。

Claims (68)

  1. 一种稳定液体药物制剂，其包含：
    (a)特异性结合至人MASP-2的单克隆抗体或其抗原结合片段；
    (b)包含组氨酸和/或醋酸缓冲体系的缓冲液；
    (c)包含聚山梨酯的表面活性剂；和
    (d)包含蔗糖、海藻糖和/或脯氨酸的辅料；
    其中所述制剂的pH为4.7-6.1，优选5.0-6.0，更优选5.0-5.5，最优选5.3。
  2. 根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述制剂具有以下特性中的一项或多项：
    (i)平均粒径为2-10μm；
    (ii)质量渗透压摩尔浓度为250～350mOsm/kg H2O之间；
    (iii)粘度为约1.0厘泊-30厘泊，例如约1.0厘泊-10厘泊；
    (iv)在40℃或25℃下放置6周或振摇14天后，外观保持或基本保持轻微乳光或澄清状态，平均粒径不变或基本不变，且溶解状态下的抗体单体纯度超过95％，优选98％，更优选99％；
    (v)在4℃下放置1年-3年后，外观保持或基本保持轻微乳光或澄清状态，平均粒径不变或基本不变，且溶解状态下的抗体单体纯度超过95％，优选98％，更优选99％；
    (vi)光照3天后，外观保持或基本保持轻微乳光或澄清状态，平均粒径不变或基本不变，且溶解状态下的抗体单体纯度超过95％，优选98％，更优选99％；
    (vii)搅拌6小时后，外观保持或基本保持轻微乳光或澄清状态，平均粒径不变或基本不变，且溶解状态下的抗体单体纯度超过95％，优选98％，更优选99％；和
    (viii)经5轮冻融后，外观保持或基本保持轻微乳光或澄清状态，平均粒径不变或基本不变，且溶解状态下的抗体单体纯度超过95％，优选98％，更优选99％。
  3. 根据权利要求1或2所述的药物制剂，其中所述抗体浓度为10mg/ml±1mg/ml至200mg/ml±20mg/mL。
  4. 根据权利要求3所述的药物制剂，其中所述抗体浓度为20mg/ml±2mg/mL。
  5. 根据权利要求3所述的药物制剂，其中所述抗体浓度为60mg/ml±6mg/ml。
  6. 根据权利要求3所述的药物制剂，其中所述抗体浓度为100mg/ml±10mg/ml。
  7. 根据权利要求3所述的药物制剂，其中所述抗体浓度为150mg/ml±15mg/ml。
  8. 根据权利要求3所述的药物制剂，其中所述抗体浓度为约20mg/ml至约100mg/ml。
  9. 根据权利要求1至8中任一项所述的药物制剂，其中所述缓冲液包含组氨酸，并且组氨酸浓度为5mM±1mM至20mM±4mM。
  10. 根据权利要求9所述的药物制剂，其中所述缓冲液浓度为10mM±2mM。
  11. 根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述缓冲液包含L-组氨酸和一水合L-组氨酸盐酸盐。
  12. 根据权利要求11所述的药物制剂，其中所述缓冲液包含约0.175mg/ml的L-组氨酸和约1.86mg/ml的一水合L-组氨酸盐酸盐。
  13. 根据权利要求1至12中任一项所述的药物制剂，其中所述聚山梨醇酯浓度为0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)。
  14. 根据权利要求13所述的药物制剂，其中所述聚山梨醇酯浓度为0.05％±0.01％(w/v)。
  15. 根据权利要求1至14中任一项所述的药物制剂，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，优选为聚山梨醇酯80。
  16. 根据权利要求1至15中任一项所述的药物制剂，其中所述辅料包含蔗糖。
  17. 根据权利要求16所述的药物制剂，其中所述蔗糖浓度为5.5％±0.5％至9％±0.5％(w/v)。
  18. 根据权利要求17所述的药物制剂，其中所述蔗糖浓度为5.8％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)。
  19. 根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述蔗糖浓度为5.8％±0.5％(w/v)。
  20. 根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述蔗糖浓度为6.0％±0.5％(w/v)。
  21. 根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述蔗糖浓度为6.5％±0.5％(w/v)。
  22. 根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述蔗糖浓度为7.0％±0.5％(w/v)。
  23. 根据权利要求18所述的药物制剂，其中所述蔗糖浓度为8.6％±0.5％(w/v)。
  24. 根据权利要求1所述的药物制剂，其包含：
    (a)20mg/ml±2mg/ml抗体，
    (b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
    (c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯80，和
    (d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
    pH为5.3±0.5。
  25. 根据权利要求24所述的药物制剂，其包含：
    (a)20mg/ml±2mg/ml抗体，
    (b)包含10mM±2mM组氨酸的缓冲液，
    (c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (d)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，
    pH为5.3±0.1。
  26. 根据权利要求25所述的药物制剂，其包含：
    (a)20mg/ml±2mg/ml抗体，
    (b)约0.175mg/ml L-组氨酸，
    (c)约1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，
    (d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (e)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，
    pH为5.3±0.1。
  27. 根据权利要求1所述的药物制剂，其包含：
    (a)60mg/ml±6mg/ml抗体，
    (b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
    (c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
    pH为5.3±0.5。
  28. 根据权利要求27所述的药物制剂，其包含：
    (a)60mg/ml±6mg/ml抗体，
    (b)包含10mM±2mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，
    (c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (d)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，
    pH为5.3±0.1。
  29. 根据权利要求28所述的药物制剂，其包含：
    (a)60mg/ml±6mg/ml抗体，
    (b)约0.175mg/ml L-组氨酸，
    (c)约1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，
    (d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (e)8.6％±0.5％(w/v)蔗糖，
    pH为5.3±0.1。
  30. 根据权利要求1所述的药物制剂，其包含：
    (a)100mg/ml±10mg/ml抗体，
    (b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
    (c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
    pH为5.3±0.5。
  31. 根据权利要求30所述的药物制剂，其包含：
    (a)100mg/ml±10mg/ml抗体，
    (b)包含10mM±1mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，
    (c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (d)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，
    pH为5.3±0.1。
  32. 根据权利要求31所述的药物制剂，其包含：
    (a)100mg/ml±10mg/ml抗体，
    (b)约0.175mg/ml L-组氨酸，
    (c)约1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，
    (d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (e)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，
    pH为5.3±0.1。
  33. 根据权利要求1所述的药物制剂，其包含：
    (a)150mg/ml±15mg/ml抗体，
    (b)包含5mM±1mM至20mM±4mM组氨酸或醋酸的缓冲液，
    (c)0.025％±0.01％至0.1％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (d)6.5％±0.5％至8.6％±0.5％(w/v)蔗糖或海藻糖，
    pH为5.3±0.5。
  34. 根据权利要求33所述的药物制剂，其包含：
    (a)150mg/ml±15mg/ml抗体，
    (b)包含10mM±1mM组氨酸缓冲体系的缓冲液，
    (c)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (d)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，
    pH为5.3±0.1。
  35. 根据权利要求34所述的药物制剂，其包含：
    (a)150mg/ml±15mg/ml抗体，
    (b)约0.175mg/ml L-组氨酸，
    (c)约1.86mg/ml L-组氨酸一盐酸盐一水合物，
    (d)0.05％±0.01％(w/v)聚山梨醇酯，和
    (e)7.0％±0.5％(w/v)蔗糖，
    pH为5.3±0.1。
  36. 根据权利要求21至35中任一项所述的药物制剂，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，优选聚山梨醇酯80。
  37. 根据权利要求1至36中任一项所述的药物制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：HCDR1的氨基酸序列如DYYIN(SEQ ID NO:1)所示，HCDR2的氨基酸序列如WIFPGSX1SX2YX3X4X5X6FX7X8(SEQ ID NO:2)所示，并且HCDR3的氨基酸序列如GDRSGPFX9Y(SEQ ID NO:3)所示；
    和/或
    所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：LCDR1的氨基酸序列如KSSQSLLYSNGKTYLN(SEQ ID NO:4)所示，LCDR2的氨基酸序列如LVSKLDS(SEQ ID NO:5)所示，并且LCDR3的氨基酸序列如VQX10THFPFT(SEQ ID NO:6)所示，
    其中X1是E、D或G，X2是A或P，X3是H或Y，X4是S或N，X5是E或Q，X6是K或N，X7是K或Q，X8是A或G，X9是A或P，并且X10是V或G。
  38. 根据权利要求37所述的药物制剂，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示，并且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示；和/或LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。
  39. 根据权利要求1至36中任一项所述的药物制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其中所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中：
    HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，并且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；或
    HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，并且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；或
    HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，并且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；或
    HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，并且HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
  40. 根据权利要求39所述的药物制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包含轻链可变区，其中轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：
    LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或
    LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
  41. 根据权利要求37-40任一项所述的药物制剂，其中：
    HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或
    HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或
    HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或
    HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，并且LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
  42. 根据权利要求37-41任一项所述的药物制剂，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:15、17、18、20、22、24和26中任一者的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列。
  43. 根据权利要求42所述的药物制剂，其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:16、19、28和30中任一者的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列。
  44. 根据权利要求37-41任一项所述的药物制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
    包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:16所示 的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
    包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的重链可变区，和包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变区。
  45. 根据权利要求37-44任一项所述的药物制剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白恒定区，任选地包含IgG的重链恒定区，和/或轻链恒定区。
  46. 根据权利要求45所述的药物制剂，其中所述恒定区包含小鼠恒定区、兔恒定区或人恒定区，任选地，所述恒定区包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
  47. 根据权利要求45所述的药物制剂，其中所述重链恒定区包含相对于野生型人IgG恒定区在氨基酸残基252、254或256处的一个或多个氨基酸取代，任选地，氨基酸残基252处的氨基酸取代是被酪氨酸取代，氨基酸残基254处的氨基酸取代是被苏氨酸取代，氨基酸残基256处的氨基酸取代是被谷氨酸取代。
  48. 根据权利要求47所述的药物制剂，其中所述重链恒定区包含与野生型人IgG恒定区氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，并且相对于野生型人IgG恒定区具有氨基酸残基252处被酪氨酸取代，氨基酸残基254处被苏氨酸取代，和氨基酸残基256处被谷氨酸取代。
  49. 一种药物组合物，其中所述组合物包含根据权利要求1至48中任一项的药物制剂，且 所述组合物容纳于容器中。
  50. 根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述容器为小瓶，例如西林瓶。
  51. 根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述容器为注射器。
  52. 根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述容器为预填充注射器。
  53. 根据权利要求49所述的药物组合物，其容纳于自动注射器中。
  54. 根据权利要求49至53中任一项所述的药物组合物，其中所述容器包含包括气体的顶隙，其中所述气体包含小于5体积％的氧气，优选包含小于1体积％的氧气，更优选包含不超过0.1体积％的氧气。
  55. 一种试剂盒，其包含：
    (i)含有包含根据权利要求1至48中任一项所述的药物制剂的组合物的容器，和使用所述组合物的说明书；或
    (ii)含有包含根据权利要求49至54中任一项所述的药物组合物的容器，和使用所述组合物的说明书。
  56. 一种包含根据权利要求1至48中任一项所述的药物制剂的单位剂型，其中所述抗体以0.1mg至500mg的量存在。
  57. 根据权利要求56所述的单位剂型，其中所述抗体以200mg的量存在或所述抗体以400mg的量存在。
  58. 根据权利要求56或57所述的单位剂型，其为玻璃小瓶，例如西林瓶。
  59. 根据权利要求56或57所述的单位剂型，其为预填充注射器。
  60. 根据权利要求56或57所述的单位剂型，其为自动注射器。
  61. 根据权利要求56或57所述的单位剂型，其中所述玻璃小瓶包含包括气体的顶隙，其中所述气体包含小于5体积％的氧气，优选包含小于1体积％的氧气，更优选包含不超过0.1体积％的氧气。
  62. 一种抑制MASP-2依赖性补体激活的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至48中任一项所述的药物制剂，或权利要求59-54中任一项所述的药物组合物，或权利要求55所述的试剂盒，或权利要求56-61所述的单位剂型。
  63. 一种降低受试者血清C4水平的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至48中任一项所述的药物制剂，或权利要求59-54中任一项所述的药物组合物，或权利要求55所述的试剂盒，或权利要求56-61所述的单位剂型。
  64. 一种治疗受试者中疾病或病症的方法，所述疾病或病症(1)将受益于受试者血清C4水平的降低；(2)与血清C4水平异常(例如升高)相关；(3)将受益于抑制MASP-2依赖性补体 激活；和/或(4)与MASP-2依赖性补体激活相关，
    所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至48中任一项所述的药物制剂，或权利要求59-54中任一项所述的药物组合物，或权利要求55所述的试剂盒，或权利要求56-61所述的单位剂型。
  65. 权利要求1至48中任一项所述的药物制剂，或权利要求59-54中任一项所述的药物组合物，或权利要求55所述的试剂盒，或权利要求56-61所述的单位剂型在制备药剂中的用途，所述药剂用于用于以下中的一者或多者：
    (1)用于抑制MASP-2依赖性补体激活；
    (2)用于治疗或预防MASP-2依赖性补体激活相关疾病或病症；
    (3)用于治疗受试者中受益于抑制MASP-2依赖性补体激活的病症；
    (4)用于降低受试者血清C4水平；
    (5)用于治疗受试者中受益于受试者血清C4水平的降低的病症；
    (6)用于治疗或预防与血清C4水平异常(例如升高)相关的病症或疾病。
  66. 权利要求65的用途，其中所述疾病或病症为自身免疫性疾病、血管病症、缺血再灌注损伤、动脉硬化、炎症、肺部病症、体外再灌注过程、肌肉骨骼病症、肾脏病症、皮肤病症、器官或组织移植过程、神经系统疾病或损伤、血液疾病、泌尿生殖系统疾病、非肥胖型糖尿病或与1型或2型糖尿病相关并发症、癌症、内分泌疾病、眼科疾病或COVID-19。
  67. 权利要求66的用途，其中：
    所述自身免疫性疾病包括血栓性微血管病(TMA)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、造血移植相关的血栓性微血管病(TA-TMA)、狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)和IgA肾病；
    所述血管病症包括心血管病症、脑血管病症、外周(如肌肉骨骼)血管病症、肾血管病症、肠系膜/肠道血管病症、移植物和/或再移植物的血管再生、血管炎、亨-舍二氏紫癜性肾炎、系统性红斑狼疮相关的血管炎、与类风湿性关节炎相关的血管炎、免疫复合物血管炎、大动脉炎、扩张型心肌病、糖尿病血管病、川崎病(动脉炎)、静脉气体栓塞(VGE)，以及支架置入术、旋转动脉瘤切除术和经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后的再狭窄，
    所述缺血再灌注损伤包括与主动脉瘤修复、心肺转流、与器官移植和/或肢体/手指再植有关的血管再吻合、卒中、心肌梗死和休克和/或外科手术后的血液动力学复苏有关的缺血再灌注损伤；
    所述炎症包括炎症性胃肠道疾病，其包括胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、肠易激综合征和憩室炎；
    所述肺部病症包括急性呼吸窘迫综合征、输血相关性急性肺损伤、缺血/再灌注急性肺损伤、 慢性阻塞性肺病、哮喘、韦格纳肉芽肿病、抗肾小球基底膜病(Goodpasture病)；胎粪吸入综合征、闭塞性细支气管炎综合征、特发性肺纤维化、继发于烧伤的急性肺损伤、非心源性肺水肿、输血相关呼吸困难、肺气肿、囊性纤维化、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2(Covid-19)相关疾病；
    所述体外循环再灌注过程包括血液透析、血浆去除术、白细胞去除术、体外膜氧合(ECMO)、肝素诱导体外膜氧合低密度脂蛋白沉淀(heparin-induced exfracorporeal membrane oxygenation LDL precipitation,HELP)和心肺转流术(CPB)；
    所述肌肉骨骼病症包括骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、痛风、神经性关节病、银屑病性关节炎、脊椎关节病、结晶性关节病和系统性红斑狼疮(SLE)；
    所述肾脏病症包括系膜增生型肾小球肾炎、膜性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎(系膜毛细血管性肾小球肾炎)、急性感染后肾小球肾炎(链球菌感染后肾小球肾炎)、冷球蛋白血症性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、亨-舍二氏紫癜性肾炎和IgA肾病；
    所述皮肤病症包括银屑病、自身免疫性大疱性皮肤病、嗜酸性海绵形成、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解、妊娠疱疹、热烧伤和化学烧伤；
    所述器官或组织移植过程包括器官异体移植、器官异种移植器官和组织移植；
    所述神经系统疾病或损伤包括多发性硬化症、重症肌无力、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、格林巴利综合征、卒中后再灌注(reperfusion following stroke)、退变性椎间盘、脑外伤、帕金森氏病、阿尔茨海默病、Miller-Fisher综合征、脑外伤和/或出血、脱髓鞘和脑膜炎；
    所述血液病包括败血症、严重败血症、败血症休克、败血症引起的急性呼吸窘迫综合症、全身炎症反应综合症、失血性休克、溶血性贫血、自身免疫性血栓性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征；
    所述泌尿生殖系统病症包括疼痛性膀胱病、感觉性膀胱病、慢性非细菌性膀胱炎、间质性膀胱炎、不孕症、胎盘功能障碍和流产和先兆子痫；
    所述内分泌疾病包括桥本氏甲状腺炎、压力、焦虑和激素性疾病，涉及垂体的催乳素、生长素或其他胰岛素样生长因子和促肾上腺皮质激素的调节性释放；
    所述眼科疾病包括年龄相关性黄斑变性。
  68. 权利要求65的用途，其中所述药剂用于皮下给药、胃肠外给药和/或静脉给药。
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