WO2024143436A1 - 網膜シートの製造方法 - Google Patents

網膜シートの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024143436A1
WO2024143436A1 PCT/JP2023/046832 JP2023046832W WO2024143436A1 WO 2024143436 A1 WO2024143436 A1 WO 2024143436A1 JP 2023046832 W JP2023046832 W JP 2023046832W WO 2024143436 A1 WO2024143436 A1 WO 2024143436A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
retinal
transplantation
sheet
cells
transplant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/046832
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
道子 万代
智浩 増田
光宏 西田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kobe City Hospital Organization
Vc Cell Therapy
Vcct Inc
Original Assignee
Kobe City Hospital Organization
Vc Cell Therapy
Vcct Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kobe City Hospital Organization, Vc Cell Therapy, Vcct Inc filed Critical Kobe City Hospital Organization
Priority to CN202380089743.8A priority Critical patent/CN120569227A/zh
Priority to EP23912214.6A priority patent/EP4643894A1/en
Priority to AU2023416411A priority patent/AU2023416411A1/en
Priority to JP2024567903A priority patent/JPWO2024143436A1/ja
Publication of WO2024143436A1 publication Critical patent/WO2024143436A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B3/00—Apparatus for testing the eyes; Instruments for examining the eyes
    • A61B3/10—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions
    • A61B3/102—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions for optical coherence tomography [OCT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B3/00—Apparatus for testing the eyes; Instruments for examining the eyes
    • A61B3/10—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions
    • A61B3/12—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions for looking at the eye fundus, e.g. ophthalmoscopes
    • A61B3/1225—Objective types, i.e. instruments for examining the eyes independent of the patients' perceptions or reactions for looking at the eye fundus, e.g. ophthalmoscopes using coherent radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A61L27/3891—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types as distinct cell layers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a transplant sheet from a retinal organoid derived from pluripotent stem cells.
  • a method for evaluating the quality of grafts excised from retinal organoids is known in which quantitative PCR is performed on the organoids, approximately 1-2 mm in size, on a portion (ring) considered to be equivalent to the product (cap), to confirm that the target retinal marker gene is expressed, and that the expression of non-retinal markers and anterior segment marker genes is below a preset standard value, thereby evaluating the quality of the graft (Patent Document 1).
  • retinal organoids themselves are 1-2 mm in size and have individual differences, there is a problem that inspection of all items is inefficient and expensive.
  • excising the cap-ring requires the visual judgment and technique of an expert, and therefore can only be performed by a limited number of technicians.
  • the primary objective of the present invention is to provide a method for efficiently producing retinal sheets with quality suitable for transplantation, without relying on the sophisticated discrimination techniques of an expert.
  • the method further comprises a step of performing bright field microscopy and/or phase contrast microscopy on the pluripotent stem cell-derived retinal organoid, The method according to any one of [1] to [5], wherein the OCT is used to identify a transplant-compatible area in an area in which differentiation into retina and homogeneity can be confirmed by the bright-field microscopy and/or phase-contrast microscopy.
  • markers for extra-graft cells include one or more selected from CRYAB, EMX2, s100A10, Zic1, AQP1, and MSX1, preferably one or more selected from CRYAB, Zic1, and EMX2, and the markers for retinal cells include one or more selected from Crx, Recoverin, and Rxr-gamma.
  • a method for treating a retinal degenerative disease comprising producing a plurality of transplantable retinal sheets from pluripotent stem cell-derived retinal organoids by a method according to any one of [1] to [7], [10], and [11], and transplanting the plurality of transplantable retinal sheets into the retina of a subject in need thereof.
  • a method for treating a retinal degenerative disease comprising producing a composite sheet for retinal transplantation by the method described in [8] and transplanting the composite sheet for retinal transplantation into the retina of a subject in need thereof.
  • FIG. 4 shows the reconstruction of a horizontal X-Y plane image from an OCT tomographic image (three-dimensional image).
  • Figure 7 shows the results of quantitative PCR for 1) planar retinal organoids with a uniform brightness distribution and 2) a thickness of 70 ⁇ m or more (4,5,9,10), and for areas that do not meet either of 1) or 2) (1-3,6-8).
  • expression of marker genes for outer retinal tissues is low, and markers for each group of photoreceptor precursor cells/photoreceptor precursor cells/inner retinal cells, which are components of retinal organoids, can be confirmed as a set, and the area can be determined to be suitable for transplantation.
  • FIG. 8 shows an example of cutting out a retinal sheet for transplantation from a transplant-compatible region of a retinal organoid. A grid is aligned with the transplant-compatible region so as to maximize the effective number of sheets, and the retinal sheet for transplantation is cut out.
  • FIG. 9 shows a state in which a plurality of retinal sheets for transplantation, each about 1 ⁇ 2 mm, are loaded into a 24 G cannula for transplantation.
  • Figure 10 shows a composite sheet in which a retinal sheet for transplantation is laminated on a retinal pigment epithelial sheet using 7-fold diluted hyaluronic acid for intraocular surgery (Viscoat (registered trademark)).
  • the present invention relates to a method for producing a retinal sheet for transplantation from a retinal organoid derived from pluripotent stem cells, comprising the steps of performing optical coherence tomography on the retinal organoid derived from the pluripotent stem cells to identify an area having a thickness of 70 ⁇ m or more and free of foreign body structures characterized by differences in brightness as a transplant-compatible area, and cutting out a small piece from the transplant-compatible area to form a retinal sheet for transplantation.
  • pluripotent stem cells in the present invention refers to embryonic stem cells (hereinafter referred to as "ES cells”) and cells that potentially have the same pluripotency as ES cells.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells are pluripotent stem cells derived from early embryos, and various established ES cell lines can be used. Examples of ES cell lines that can be used include, but are not limited to, clinical human ES cell lines provided by the Human ES Cell Research Center, Institute of Medical Biology, Kyoto University, and human ES cell lines provided by RIKEN BRC (KhES-1, KhES-1_Crx::Venus, KhES-1_Rx::Venus).
  • iPS cells not only iPS cells induced from the patient's own somatic cells, but also various iPS cell lines can be used.
  • iPS cell lines that can be used include, but are not limited to, various iPS cell stock lines provided by the Kyoto University iPS Cell Research Foundation, iPS cell lines derived from healthy individuals provided by RIKEN BRC, KVs09, CLs23, etc.
  • the method for producing retinal organoids from pluripotent stem cells is not particularly limited, and any method may be used, such as a suspension culture method such as the SFEBq method, or a known method such as those described in WO2015/025967A1, WO2019/217630A1, WO2013/077425A1, WO2022/239868A1, WO2020/249935A1, JP2013-128475A, WO2022/138803A1, JP2021-118733A, WO2017/183732A1, WO2020/249935, and WO2022/054925A1.
  • a suspension culture method such as the SFEBq method
  • a known method such as those described in WO2015/025967A1, WO2019/217630A1, WO2013/077425A1, WO2022/239868A1, WO2020/249935A1, JP2013-128475A, WO2022/138803A1, JP2021-118733A, WO2017/183732A1,
  • the retinal organoid preferably has a diameter of about 1 cm or more so that multiple grafts can be excised.
  • a diameter of 1 cm or more means the length of the part corresponding to the diameter when the retinal organoid is shaped like a circle, or the length of the part corresponding to the major axis when the retinal organoid is shaped like an ellipse.
  • optical coherence tomography is performed on the above-mentioned retinal organoids to identify areas suitable for transplantation.
  • OCT optical coherence tomography
  • Optical coherence tomography is a technology that uses the coherence of light to image the fine structure inside the object being measured, and allows for high-speed, high-resolution, non-invasive, real-time observation of the structure of retinal organoids.
  • OCT includes spectral domain OCT, swept-source OCT, full-field OCT, adaptive optics OCT, etc.
  • the area suitable for transplantation must be an area that can be confirmed by OCT to have a certain thickness and to be free of foreign body structures.
  • a confocal imaging system using infrared to near-infrared light, an ultrasound microscope, etc. can also be used as a means of observing the internal structure of retinal organoids at different depths.
  • the term "transplantation-compatible region” refers to a region of a retinal organoid that is suitable for transplantation into the retina.
  • the transplantation-compatible region is a region that has been confirmed by OCT to have a thickness of at least 70 ⁇ m or more, preferably 70 to 175 ⁇ m, or 80 ⁇ m or more, and more preferably 80 to 150 ⁇ m.
  • the thickness of the retinal organoid can be confirmed by an OCT tomographic image (three-dimensional image) or a horizontal plane image reconstructed from an OCT tomographic image.
  • the thickness of the retinal organoid can be easily confirmed by using a heat map created from an OCT tomographic image, and the compatibility range can be easily narrowed down by using a binary image.
  • the transplant-suitable area must be an area that has been confirmed by OCT to be free of foreign body structures.
  • "Foreign body structures" are characterized by high brightness in the brightness distribution of the OCT image that differs from the average brightness distribution in other uniform areas. Because retinal organoids have a layered structure, it is preferable to continuously extract and evaluate multiple horizontal X-Y plane images reconstructed from the OCT image in the Z direction, for example at intervals of approximately 10 ⁇ m or less (see Figure 4), to determine the presence or absence of foreign body structures.
  • the term “about” refers to a value that varies by plus or minus 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, or 1%, respectively, from the reference value.
  • the term “about” refers to a range of plus or minus 10%, 5%, or 1%, respectively, from the reference value.
  • the transplant-compatible areas can be efficiently identified by using bright-field and/or phase-contrast microscopy in addition to various types of OCT to exclude areas that are not suitable for transplantation (transplant-unsuitable areas) or retinal organoids that are not suitable for transplantation.
  • “Bright-field microscopy” is ideal for understanding the overall condition of retinal organoids.
  • organoids differentiate into the retina, they show the formation of characteristic retinal pigment cells (RPE) or spherical 3D organoid-like structures in the periphery, so the presence of these structures can be used to confirm whether they have differentiated properly into the retina.
  • RPE retinal pigment cells
  • thicker areas are observed in a different color (e.g., light brown) from thinner areas, so the overall uniformity and thickness can also be roughly confirmed.
  • bright-field microscopy areas where differentiation into the retina is not observed or areas that are thin and non-uniform can be excluded from the OCT examination.
  • by recording the differentiation state over time using bright-field microscopy and tracking the progress it can be confirmed that differentiation is occurring in a good state.
  • the small pieces cut out are preferably about 1.0 to 10.0 mm long and 0.5 to 2.0 mm short so that they can be attached to a transplant cannula.
  • the short length is about 0.5 to 1.0 mm, and the long length can be freely set.
  • the short length can be extended up to about 2.0 mm.
  • a low-viscosity viscoelastic substance such as 7-fold diluted hyaluronic acid for ophthalmic surgery (such as Viscoat)
  • multiple transplant pieces can be attached.
  • the retinal sheet for transplantation obtained by the method of the present invention is composed of retinal organoids in which the ratio of retinal cells (including retinal progenitor cells) to the total cells is about 90% or more, and more preferably about 95% or more.
  • a retinal sheet for transplantation composed of such retinal organoids can be easily obtained by the method using the above-mentioned OCT, or OCT and bright-field microscopy and/or phase-contrast microscopy, without depending on the skills of an expert.
  • cell non-adhesive substances examples include MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) polymer; celluloses such as methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and sodium carboxymethylcellulose; polyethylene oxide; carboxyvinyl polymer; polyvinylpyrrolidone; polyethylene glycol; polyamides such as polyacrylamide and poly-N-isopropylacrylamide; polysaccharides such as chitin, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, starch, pectin, carrageenan, guar gum, gum arabic, and dextran; albumin and derivatives thereof.
  • the cell non-adhesive substance is an MPC polymer.
  • Region A and region B may be formed on the surface of the culture substrate by any method used for patterning. Region A and region B can be formed on the surface of the culture substrate by techniques such as soft lithography, photolithography, and 3D printing.
  • the pluripotent stem cells collected and dispersed using a cell dispersion solution containing an enzyme e.g., trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, papain
  • an enzyme e.g., trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, papain
  • a chelating agent e.g., ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the cell dispersion solution for example, a commercially available product such as TrypLETM Select (Thermo Fisher Scientific) or TrypLETM Express (Thermo Fisher Scientific) may be used.
  • the medium containing the BMP signal inhibitor or BMP signal agonist is a 1:1 mixture of F-12 medium and IMDM medium to which KnockOutTM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific) (e.g., 0.5% to 30%, 1% to 20%, or 10%), Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific), BSA, and 1-thioglycerol have been added.
  • KnockOutTM Serum Replacement e.g., 0.5% to 30%, 1% to 20%, or 10%
  • Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific
  • BSA 2-thioglycerol
  • the retinal sheet for transplantation of the present invention can be evaluated as having the desired quality if, in quantitative PCR, the expression of the inner photoreceptor precursor cell marker among the above-mentioned retinal cell markers is high, the expression of the inner retinal layer cell marker and the retinal progenitor cell marker is confirmed, and the expression of the outer retinal tissue cell marker is low or below the detection limit.
  • the "relative expression pattern" of these genes can also be an important marker that defines the retina and its characteristics and quality. For example, by plotting each gene on a radar chart, it is possible to confirm the degree to which each group gene is expressed, the relative expression ratio of any two genes, etc. (see Example 1-4, Figure 11 below). In addition, for exclusion markers such as retinal extracellular tissue cell markers, and caution markers such as ciliary body markers, where contamination below a certain level is acceptable, by checking deviations from the pattern on the chart in addition to the values for individual genes, it is possible to determine whether the deviation is due to a single gene by chance, or as part of the overall expression pattern, which is expected to lead to more reliable judgments.
  • exclusion markers such as retinal extracellular tissue cell markers
  • caution markers such as ciliary body markers
  • RNA is extracted from each sample using RNeasy Micro Kits (Qiagen), and cDNA is synthesized using SuperScript® III Reverse Transcriptase Kits (Invitrogen).
  • the synthesized cDNA sample is diluted, and quantitative PCR is performed for each primer using TB Green® Premix DimerEraser(TM) (Takara).
  • Evaluation is performed, for example, by averaging the ⁇ CT of each primer using an internal control (e.g., GAPDH and ARP) to determine the ⁇ CT of the corresponding primer, and then comparing the ⁇ CTs. Evaluation is performed according to certain criteria, such as a ⁇ CT value of 5 or less indicating strong expression, and a ⁇ CT value of 5 to 7 indicating expression.
  • Table 1 shows an example of primers used for quantitative PCR.
  • the present invention also provides a drug for treating retinal degenerative disease, comprising a plurality of retinal sheets for transplantation and a transplantation medium (which also functions as a storage solution for the sheets).
  • a drug for treating retinal degenerative disease comprising a plurality of retinal sheets for transplantation and a transplantation medium (which also functions as a storage solution for the sheets).
  • the drug at least a portion of the plurality of retinal sheets for transplantation are cut from one planar retinal organoid derived from pluripotent stem cells, and each of them has a thickness of 70 ⁇ m or more and is confirmed to be free of foreign body structures by optical coherence tomography (OCT).
  • OCT optical coherence tomography
  • the "transplantation medium” include a diluted viscoelastic substance solution such as 7-fold diluted Viscoat.
  • Each sheet is a small piece that is sized to fit into a cannula, a transplantation device, preferably an 18G to 24G cannula, for example, with a short axis length of 0.5 to 2.0 mm, preferably 0.5 to 1.0, and a long axis length of 1 mm or more, preferably 1 to 3 mm. Therefore, multiple sheets can be fitted into a 24G cannula for transplantation, and transplantation is possible without making a large incision in the retina.
  • the multiple retinal sheets for transplantation contained in the pharmaceutical product of the present invention are also characterized by high expression of one or more photoreceptor precursor cell markers selected from Crx, Recoverin, and Rxr-gamma, and low or below the detection limit expression of one or more extraretinal tissue cell markers selected from CRYAB, EMX2, s100A10, Zic1, AQP1, and MSX1, preferably one or more selected from CRYAB, Zic1, and EMX2.
  • a composite sheet can be used for transplantation in which a retinal sheet for transplantation and a retinal pigment epithelial cell sheet are loosely adhered together using a low-viscosity fluid gel, such as x7 Viscoat (a mixture of sodium chondroitin sulfate and sodium hyaluronate for ophthalmic surgery).
  • a low-viscosity fluid gel such as x7 Viscoat (a mixture of sodium chondroitin sulfate and sodium hyaluronate for ophthalmic surgery).
  • the present invention also provides a method for producing a composite sheet for retinal transplantation as described above, the method including the steps of producing a retinal sheet for transplantation from pluripotent stem cell-derived retinal organoids, and laminating the retinal sheet for transplantation on a retinal pigment epithelial cell sheet via a fluid gel to produce a composite sheet for retinal transplantation.
  • the program may include, as necessary, a step of acquiring information from bright-field and/or phase-contrast microscopy; a step of inputting information from the bright-field and/or phase-contrast microscopy, a step of identifying a region (estimated region) that is estimated to be a transplant-compatible region according to the information from the bright-field and/or phase-contrast microscopy, and a step of issuing a command to perform OCT on the estimated region.
  • Reference Example 1 Preparation of retinal organoids from pluripotent stem cells Planar retinal organoids were prepared by the following method. ⁇ Day 0 A PDMS sheet with a 1 cm diameter hole is placed on a 35 mm dish, and the inside of the hole is filled with 200 ⁇ l of 7 ⁇ l iMatrix-511/500 ⁇ l PBS dilution to coat the dish in a circular shape (1 hour at 37 °C). After removing the coating agent with an aspirator, 5x10 5 iPS cells are suspended in 200 ⁇ l StemFIT (registered trademark) AKO2N medium containing Y27632 at a final concentration of 10 ⁇ M and seeded at the same site.
  • StemFIT registered trademark
  • the thickness information from the OCT cross-sectional images was written out as a heat map (Figure 5). This makes it possible to identify the overall thickness trend using the heat map after confirming the internal structure using the OCT cross-sectional images. Furthermore, by converting the heat map into a binary image, it is possible to identify graft areas with appropriate thickness, such as areas with a thickness of 80 ⁇ m or more, or areas between 75 and 125 ⁇ m.
  • transplant-compatible area of retinal organoids can be identified as an area with a certain thickness (70 ⁇ m or more) and no foreign body structure with different brightness distribution.
  • the thickness and the presence or absence of foreign body structure can be identified by creating continuous XY plane images or heat maps from OCT tomographic images. By narrowing down the area to be evaluated by OCT using bright-field and phase-contrast microscopy, it is possible to identify the transplant-compatible area more efficiently.
  • a region with uniformity suitable for transplantation is estimated using bright field/phase contrast, and 1 x 2 mm graft tissues are continuously cut out from the homogeneous region with a thickness of approximately 70 ⁇ m or more in the OCT tomographic image.
  • thickness evaluation can be efficiently performed by using a heat map.
  • a grid is set on the retinal organoid according to the size of the graft, and the grafts are aligned so that the number of usable sheets is maximized in the transplant-compatible region, and then cut out along the grid ( Figure 8).
  • Multiple 1 x 2 mm grafts can be attached to a 24G transplant cannula, making it possible to transplant them without making a large incision in the retina ( Figure 9).
  • a viscoelastic medium (35,000-60,000 mPa ⁇ s (25°C, shear rate 2 s-1) diluted two-fold) was placed on top of the retinal organoid, and a retinal pigment epithelial cell sheet was then placed on top of it so that the parietal side was in contact with the organoid.
  • the sheets may be cut to an appropriate size beforehand and then layered, or they may be layered and then cut to the desired size. After layering, excess viscoelastic material is removed as much as possible using MQA (registered trademark) or similar.
  • MQA registered trademark
  • the method of the present invention makes it possible to efficiently cut out sheets suitable for transplantation from retinal organoids using an objective evaluation method, without relying on the special techniques of an expert.
  • the present invention will greatly contribute to the practical application of regenerative medicine for retinal degenerative diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)

Abstract

本発明は、多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから移植用シートを製造する方法等に関する。具体的には、本発明は、多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから移植用網膜シートを製造する方法であって、前記多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドに対して光干渉断層撮影（OCT）を実施して、70μm以上の厚さを有し、かつ、輝度の違いで特徴付けられる異物構造が存在しない領域を、移植適合領域として特定する工程、及び前記移植適合領域から小片を切り出し、移植用網膜シートとする工程を含む、前記方法に関する。

Description

網膜シートの製造方法
関連出願：
　本出願は特願２０２２－２１０９９８（２０２２年１２月２８日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
技術分野：
　本発明は、多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから移植用シートを製造する方法に関する。
　遺伝的網膜変性疾患における視細胞変性領域は広範囲にわたることが多いが、その変性領域の場所やサイズはそれぞれの疾患や変性段階によって様々である。視細胞変性疾患に対しては、胎児網膜やES/iPS細胞由来の網膜細胞、網膜オルガノイドから切り出したシートなどの移植により、視機能が回復する可能性が示されている。前記移植方法としては、視細胞を純化して懸濁細胞として移植する方法や網膜オルガノイド組織を移植する方法が報告されているが、細胞移植は効率よく目的細胞を純化するのは未だ困難であり、純化の手間やコスト、生着の不安定さなどの問題がある。
　網膜オルガノイドから切り出した移植片は長径1mm程度であるため、視機能を期待する面積を覆うには複数枚の挿入が必要であるが、現在の製造工程や品質管理法から十分量を用意するのは極めて困難である。一方で、大きな網膜シートが用意できたとしても、変性の進んだ網膜では大きな切開を加えて移植するのは移植時の障害が懸念される。
　網膜オルガノイドから切り出した移植片の品質評価方法として、約1-2mm大のオルガノイドに対し、製品（cap）と同等と考えられる部位（ring）に対し定量PCRを行い目的の網膜マーカー遺伝子が発現していること、及び非網膜系マーカーや前眼部のマーカー遺伝子の発現が予め設定された基準値以下であることを確認し、移植片の品質を評価する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、網膜オルガノイドはそれ自体個体差を持つ1-2mm大のものであるため、全品検品は低効率で、高コストとなるという問題がある。また、Cap-ringの切り出しには、熟練者の視覚判断や技術を必要とするため、限られた技術者しか行えないという問題もある。
ＷＯ２０２０／１８４７２０
　本発明の課題は、主として、熟練者の高度な判別技術に頼ることなく、移植に適した品質を有する網膜シートを効率よく製造する方法を提供することにある。
　発明者らは、平面オルガノイド分化方法を用いて作成された網膜オルガノイドから、光干渉断層撮影を用いて移植シートに適した領域を特定し、所定の品質を有する移植シートを簡便に調製可能なことを見出した。
　本発明は、上記知見に基づくものであり、下記の［１］～［１３］を提供する。
［１］多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから移植用網膜シートを製造する方法であって、前記多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドに対して光干渉断層撮影（OCT）、共焦点画像解析、及び超音波顕微鏡解析から選ばれるいずれか1または2以上（好ましくはOCT）を実施して、70μm以上（好ましくは70～175μm、場合により80μm以上、80～150μm）の厚さを有し、かつ、輝度の違いで特徴付けられる異物構造が存在しない領域を、移植適合領域として特定する工程、及び前記移植適合領域から小片を切り出し、移植用網膜シートとする工程を含む、前記方法。
［２］異物構造が存在しない領域が、OCT断層像から再構築した、水平方向のX-Y平面画像をZ方向に複数枚連続的に取り出して評価することにより特定される、［１］に記載の方法。
［３］70μm以上（好ましくは70～175μm、場合により80μm以上、80～150μm）の厚さを有する領域が、ヒートマップを用いて特定される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］切り出される小片が、18G～24Gカニューレに装着可能な大きさである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］切り出される小片が、長軸方向の長さが1.0～10.0mmであり、短軸方向の長さが0.5～2.0mmである、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記方法が、多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドに対して明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影を実施する工程をさらに含み、
前記明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影により、網膜への分化と均質性が確認できる領域を対象として、前記OCTによる移植適合領域の特定を実施する、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］網膜オルガノイドが、直径1cm以上の平面状網膜オルガノイドである、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の方法で移植用網膜シートを製造する工程と、前記移植用網膜シートを流動性ゲル（例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、及びこれらの誘導体から選ばれる１以上を含むゲル）を介して網膜色素上皮細胞シートに積層して、網膜移植用複合シートを製造する工程を含む、網膜移植用複合シートの製造方法。
［９］網膜変性疾患の治療用医薬品であって、多能性幹細胞由来の1つの平面状網膜オルガノイドから切り出された複数の網膜移植用細胞シートと移植媒体を含み、前記複数の網膜移植用細胞シートが、長軸方向の長さが1.0～10.0mmで、短軸方向の長さが0.5～2.0mmの大きさを有し、光干渉断層撮影（OCT）により、70μm以上（好ましくは70～175μm、場合により80μm以上、80～150μm）の厚さを有し、かつ、異物構造が存在しないことが確認されたものである、前記医薬品。
［１０］切り出された小片に対して定量的PCRを行い、網膜組織外細胞のマーカーの発現が低く、網膜細胞のマーカーの発現が高いことを確認する工程をさらに含む、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。前記確認工程は、例えば、レーダーチャート等を用いた絶対的または相対的な発現量パターン又は発現比の解析により実施できる。
［１１］移植組織外細胞のマーカーがCRYAB、EMX2、s100A10、Zic1、AQP1、及びMSX1から選択される１つ以上、好ましくはCRYAB、Zic1、及びEMX2から選択される１つ以上を含み、網膜細胞のマーカーがCrx、Recoverin、及びRxr-gammaから選択される１つ以上を含む、［１０］に記載の方法。
［１２］網膜変性疾患の治療方法であって、［１］～［７］、［１０］、及び［１１］のいずれかに記載の方法により多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから複数の移植用網膜シートを製造し、必要とする対象の網膜に前記複数の移植用網膜シートを移植することを含む、治療方法。
［１３］網膜変性疾患の治療方法であって、［８］に記載の方法により網膜移植用複合シートを製造し、必要とする対象の網膜に前記網膜移植用複合シートを移植することを含む、治療方法。
　従来の網膜オルガノイドでは長径1mm程度のサイズの移植片の切り出しに高度な判別眼と熟練した技術を要し、かつオルガノイド毎の検品が必要であった。また切り出した移植片がオルガノイドの形状やサイズに依存して不揃いであった。本発明の方法によれば、１つの大きな平面網膜オルガノイドから、客観的評価方法により、移植に適したシートを効率よく切り出すことができる。
図１は、明視野顕微鏡画像を示す。シートの均一性、周辺部位のオルガノイド構造物及び有色細胞である網膜色素細胞の形成（矢印）、網膜への分化を判断できる。 図２は、位相差顕微鏡画像を示す。内部構造の均一性を推定できる。均一領域（A、線で囲まれた部分）では均一な網膜組織構造が免疫染色像（B）で確認できる。 図３は、OCT画像を示す。網膜内の異物構造を有する部位（A）と異物構造を含まない領域（B）が判別できる。異物構造を含まず厚みが一定の部位では分化60日（C）では基底面はCollagen IV陽性であり頭頂側に広い範囲に網膜前駆細胞（Chx10）、その中の頭頂面側に視細胞前駆細胞（CRX）、基底膜側により分化した網膜内層の細胞（PAX6）が分布している。 図４は、OCT断層像（三次元画像）からの水平方向のX-Y平面画像の再構築を示す。X-Y平面画像を用いると、より少ない枚数の連続画像を用いて10μm以下の間隔でのシート内の異物構造の有無を効率よく判定できる。左上領域(a)は複数断面像において輝度がほぼ均一であり異物構造がないのに比べ、右下領域(b)は輝度分布にムラがあり、上面(No.1側)に近づくと右下領域では複数断面図において複数箇所又はマダラ状に空隙が見られ、表面が滑らかでないことが判別できる。 図５は、OCT断層像から生成したヒートマップ（A,B）、ヒートマップにさらに二値化処理を行った図（C,D）を示す。ここでは、70μm以上の厚さを有する部分が白く、70μ未満の厚さを有する部分が黒く示されるように二値化処理している（C,D）。ヒートマップによりオルガノイド（A,C）では厚さ及び厚さにムラのある構造物を判定できる。オルガノイド（A,C）では移植適合領域が右側に限定されるが、オルガノイド（B,D）では全面が移植に適合する厚みを持つと判定される。 図６は、厚さが50μmに満たない薄い網膜オルガノイドの定量的PCRの結果を示す。PCRパネルを用いて視細胞、網膜前駆細胞、網膜内層細胞など網膜オルガノイドを構成する細胞グループを確認することで網膜への分化、網膜外組織混入の判定、網膜細胞内の内層細胞/視細胞の分化60日時点での大まかな構成内容がわかる。このような薄いシートにおいては視細胞マーカーに加え、水晶体や毛様体といった、網膜以外の眼組織マーカーの上昇が見られる。 図７は、１）輝度分布が一定で２）70μm以上の厚みを持つ平面状網膜オルガノイド（4,5,9,10)及び１）、２）のいずれかを満たさない部位(1-3,6-8)の定量的PCRの結果を示す。厚みを持った均一な部分（4,5,9,10)では網膜外組織のマーカー遺伝子発現は低く、網膜オルガノイドの構成要素である視細胞前駆細胞/視細胞前駆細胞/網膜内層細胞のそれぞれの群のマーカーがセットで確認でき、移植に適した部位と判定できる。矢印はここで不適合基準値を示した除外マーカー。 図８は、網膜オルガノイドの移植適合領域からの移植用網膜シートの切り出しの一例を示す。移植適合領域に有効枚数が最大となるようにグリッドを合わせて、移植用網膜シートを切り出す。 図９は、移植用24Gカニューレに、約1x2mmの移植用網膜シートを複数枚充填した状態を示す。 図１０は、移植用網膜シートを、7倍希釈眼内手術用ヒアルロン酸（ビスコート（登録商標））を用いて網膜色素上皮シートに積層した複合シートを示す。移植用網膜シート（A）に網膜色素上皮細胞シートを積層して、作製した複合シート（B）は、24Gカニューレに挿入でき、複合状態を維持したままカニューレから押し出すことが可能である（C,D）。 図１１は、同じ網膜オルガノイドから切り出した組織片の網膜遺伝子発現パターンを示すレーダーチャートである。A：分化40日と60日の発現パターンの比較。分化40日(点線)から60日（実線）にかけて網膜前駆細胞マーカーの発現減少と視細胞マーカーの発現増強が確認できる（矢印）。B：分化50日(点線)と60日（実線）の発現パターンの比較。発現パターンはほぼ類似しており、同じ基準で評価が可能である。C:標準的なデータを集めることにより、良好なシートを示す網膜遺伝子発現パターン範囲（Cのグレー帯）を特定することができる。このチャート上での除外（注意）マーカーは、網膜外組織細胞マーカー（EMX2、CRYAB、Zic1、AQP1）を示し、パターンから外れる部位（丸囲い）を含むシートは不合格プロファイルを持つと判定できる。
１．移植用網膜シートの製造方法
　本発明は、多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから移植用網膜シートを製造する方法であって、前記多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドに対して光干渉断層撮影を実施して、70μm以上の厚さを有し、かつ、輝度の違いで特徴付けられる異物構造が存在しない領域を、移植適合領域として特定する工程、及び、前記移植適合領域から小片を切り出し、移植用網膜シートとする工程を含む方法に関する。
　本発明にかかる「多能性幹細胞」とは、胚性幹細胞（以下、「ES細胞」と言う）、及びES細胞と同様の分化多能性（pluripotency）を潜在的に有する細胞を意味する。ES細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、体細胞を初期化することで分化多能性と自己複製能を持たせた人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells（iPS cells）、以下「iPS細胞」と言う）を挙げることができる。
　ES細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であるが、樹立した各種ES細胞株を利用することができる。ES細胞株としては、例えば、京都大学医生物学研究所附属ヒトES細胞研究センターが提供する臨床用ヒトES細胞株、RIKEN BRCが提供するヒトES細胞株(KhES-1、KhES-1_Crx::Venus、KhES-1_Rx::Venus)を利用することができるが、これらに限定されない。
　iPS細胞としては、患者自身の体細胞から誘導されたiPS細胞のみならず、各種iPS細胞株を利用することができる。iPS細胞株としては、京都大学iPS細胞研究財団が提供する各種iPSストック細胞株、RIKEN BRCが提供する健常者由来iPS細胞株、KVs09、CLs23などを利用することができるが、これらに限定されない。
　多能性幹細胞の生物種は特に限定されず、レシピエントに応じて、適宜選択される。ヒト移植用網膜シートの場合には、霊長類由来の細胞、特にサル又はヒト由来の細胞が好ましく、ヒト由来の多能性幹細胞がより好ましい。
　「網膜オルガノイド」とは、生体外で作製された三次元的な網膜組織を意味する。したがって、「多能性幹細胞由来の網膜オルガノイド」とは、多能性幹細胞を生体外で分化誘導して得られた三次元的な網膜組織を意味する。
　多能性幹細胞から網膜オルガノイドを作製する方法は特に限定されず、例えば、SFEBq法のような浮遊培養による方法や、WO2015/025967A1、WO2019/217630A1、WO2013/077425A1、WO2022/239868A1、WO2020/249935A1、JP2013-128475A、WO2022/138803A1、JP2021-118733A、WO2017/183732A1、WO2020/249935、WO2022/054925A1に記載されるような公知の方法など、いずれの方法を使用してもよい。
　網膜オルガノイドは、複数の移植片を切り出すことが可能なように、直径約1cm以上の大きさを有することが好ましい。ここで、直径1cm以上とは、網膜オルガノイドが円に近い形状の場合の直径、あるいは楕円に近い形状の場合の長径に該当する部分の長さを意味する。
　網膜オルガノイドは、平面状の網膜オルガノイド（平面状網膜オルガノイド）であることが好ましい。平面状網膜オルガノイドは、多能性幹細胞を適当な基材上で平面培養することにより製造することができる。この方法によれば、浮遊培養法では困難な組織の形態やサイズを制御することができる。平面状網膜オルガノイドの製造方法については、「２．網膜オルガノイドの調製」において詳細に説明する。
　本発明では、上記した網膜オルガノイドに対して、光干渉断層撮影（OCT）を実施して、移植適合領域を特定する。「光干渉断層撮影」とは、光の干渉性を利用して測定対象内部の微細構造を画像化する技術であり、高速、高分解能、非侵襲、リアルタイムで網膜オルガノイドの構造を観察することができる。ここでOCTとはSpectral domain OCT、Swept-Source OCT、full-field OCT、adaptive optics OCTなどを含む。移植適合領域は、OCTにより、一定の厚さと異物構造を含まないことが確認できる領域でなければならない。同じ目的で深度を変えて網膜オルガノイドの内部構造を観察する手段として赤外線～近赤外線光による共焦点画像システム、超音波顕微鏡などを用いることもできる。
　本発明において、「移植適合領域」とは、網膜オルガノイドのうち、網膜への移植に適した領域を意味する。前記移植適合領域は、OCTにより、少なくとも70μm以上、好ましくは70～175μm、あるいは80μm以上、より好ましくは80～150μmの厚さを有することが確認された領域である。網膜オルガノイドの厚さは、OCTの断層像（三次元画像）、あるいはOCT断層像から再構築した水平面画像等で確認することができる。とくに、網膜オルガノイドの厚さは、OCT断層像から作製したヒートマップを用いると簡便に確認することができ、さらに二値価画像を用いると適合範囲を容易に絞ることができる。
　移植適合領域は、70μm以上の厚さに加えて、OCTにおいて異物構造を含まないことが確認された領域でなければならない。「異物構造」は、OCT画像の輝度分布において、他の均一部分における平均的な輝度分布とは異なる高輝度によって特徴付けられる。網膜オルガノイドは層状の構造を有するため、OCT画像より再構築された水平方向のX-Y平面画像を、Z方向に複数枚、例えば約10μm以下の間隔で、連続的に取り出して評価を行い（図4参照）、異物構造の有無を判定することが好ましい。
　なお、本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％又は1％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ10％、5％、又は1％の範囲を示す。
　移植適合領域は、各種OCTに加えて、明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影を使用することにより、移植に適合しない領域（移植非適合領域）又は移植に適合しない網膜オルガノイドを除外することで、効率的に特定することができる。
　「明視野顕微鏡撮影」は、網膜オルガノイドの全体の状態を把握するために好適である。オルガノイドは、網膜への分化が見られる場合、周辺部に特徴的な網膜色素細胞（RPE）又は球状の3Dオルガノイド様構造物の形成を示すため、これらの構造物が認められれば、網膜に適切に分化しているかどうかが確認できる。また、厚みのある部位は、薄い部分とは異なる色（例えば、薄茶色）に観察されるため、大まかな全体の均一性や厚さも確認することができる。明視野顕微鏡撮影によって、網膜への分化が認められない領域や、均一性がなく薄い領域はOCTによる検査の対象から除外することができる。また、経時的に分化状態を明視野顕微鏡撮影にて記録し、その経過を追うことによっても良好な状態で分化できていることを確認することができる。
　「位相差顕微鏡撮影」は、光線の位相差をコントラストに変換して観察できる光学顕微鏡である。対象を無染色・非侵襲的に観察することができるため、細胞や組織の観察に有用である。位相差顕微鏡撮影は、明視野顕微鏡では観察できない内部構造も詳細に観察できるため、網膜オルガノイド内の異物構造の有無や、大まかな均一性や厚さも確認することができる。位相差顕微鏡撮影によって、異物構造が認められる領域や、均一性がなく薄い領域はOCTによる検査の対象から除外することができる。
　移植適合領域からの移植用小片の切り出しは、周知の方法により行うことができる。例えば、網膜オルガノイド上に移植用小片の大きさに合わせたグリッドを設定し、移植適合領域から取得可能な移植用小片数（有効枚数）が最も多くなるよう位置合わせを行い、グリッドに沿って小片を切り出す。
　切り出される小片は、移植用カニューレに装着可能なように、長軸方向の長さが1.0～10.0mm、短軸方向の長さが0.5～2.0mm程度の大きさであることが好ましい。例えば、24Gカニューレを用いる場合には、短軸方向の長さは約0.5～約1.0mmであり、長軸方向の長さは自由に設定できる。18Gカニューレを用いる場合には、短軸方向の長さは～約2.0mmまで伸ばすことも可能である。カニューレ内に7倍希釈の眼科手術用ヒアルロン酸（ビスコートなど）などの粘度の低い粘弾性物質を充填することで、移植用小片を複数枚装着することができる。特に24Gカニューレを用いる場合には、網膜に大きな切開を加えることなく約10μl以内の少量の媒体で意図した部位に小片を移植することが可能である。
　本発明の方法で得られる移植用網膜シートは、全細胞に対する網膜細胞（網膜前駆細胞を含む）の割合が約90％以上、より好ましくは約95％以上の網膜オルガノイドから構成される。このような網膜オルガノイドからなる移植用網膜シートが、熟練者の技能によらず、前述したOCT、あるいはOCTと明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影を用いた方法により、簡便に得ることができる。
　本発明の方法は、切り出された小片（移植用網膜シート）に対して、定量的PCRを行い、その遺伝子発現パターンを検査し、所望の品質の網膜移植片であることを確認する工程をさらに含んでいてもよい。こうした定量的PCRによる移植用網膜シートの品質確認については、「３．移植用網膜シートの品質管理」において詳述する。
２．平面状網膜オルガノイドの調製
　多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製方法として、細胞接着性を有する領域Aと、前記領域Aの少なくとも一部に隣接する前記領域Aよりも細胞接着性の低い領域Bとをその表面に有する培養基材上の領域Aにおいて、多能性幹細胞を網膜組織に分化誘導する方法を挙げることができる。以下、このような特定のパターンを有する基材上での培養をパターニング培養と呼ぶ。
　領域Aは、多能性幹細胞を接着培養で維持できる領域である。領域Bは、領域Aに多能性幹細胞を播種した場合に、網膜組織への分化誘導中に（すなわち、網膜組織への分化が確認できるまでの期間）、前記領域Aに隣接する領域Bに細胞が伸展しない程度に、領域Aよりも細胞接着性の低い領域である。細胞接着性の比較は、その面積に対して過剰量（例えば、5×105～10×105cells/cm2）の多能性幹細胞を播種し、37℃、5％CO2下で24時間培養後、細胞が接着する面積の割合を比較することにより行うことができる。前記の細胞接着性は、通常、24時間培養後に培地を除去し、培地又は緩衝液で細胞を洗浄して、未接着の細胞を除去した後に評価する。
　領域Aは、例えば、その面積に対して過剰量（例えば、5×105～10×105cells/cm2）の多能性幹細胞を播種し、37℃、5％CO2下で24時間培養後、その面積の70％以上、80％以上、又は90％以上に細胞が接着する領域でありうる。
　ある実施形態において、領域Bは、細胞非接着性の領域である。細胞非接着性の領域とは、多能性幹細胞を接着培養で維持するのに十分な細胞接着性を有さないことを意味する。細胞非接着性の領域は、例えば、その面積に対して過剰量（例えば、5×105～10×105cells/cm2）の多能性幹細胞を播種し、37℃、5％CO2下で24時間培養後、その面積の30％以下、20％以下、又は10％以下に細胞が接着する領域でありうる。
　培養基材は、その表面に領域Aと領域Bとを形成することができれば、いずれの材質で形成されていてもよい。培養基材は、例えば、金属、ガラス、よびシリコーン等の無機材料、プラスチック等の有機材料でありうる。ある実施形態において、培養基材は、ガラス又はプラスチック、特にポリスチレン樹脂である。
　培養基材は、一般的に細胞培養に使用される形状であればよく、特に限定されない。培養基材は、例えば、シャーレ、プレート、ボトル、チャンバー、マルチウェルプレートなどの培養容器、フィルム、又は多孔質膜でありうる。
　領域Aは、細胞接着性の培養基材の表面が露出した領域であってもよく、培養基材の表面に細胞接着性をもたせるため、又は培養基材の表面の細胞接着性を高めるため、培養基材の表面を細胞接着性の物質でコーティングした領域であってもよい。細胞接着性物質としては、ポリL-リジン及びポリL-オルニチンなどの正電荷ポリマー；ラミニン；I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VII型コラーゲン等のコラーゲン；テネイシン；フィブリリン；フィブロネクチン；ビトロネクチン（Vitronectin）；エラスチン；エンタクチン；コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸等の硫酸化グルコサミノグリカンと、コアタンパク質とから構成されるプロテオグリカン；コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸等のグルコサミノグリカン；Synthemax（登録商標、ビトロネクチン誘導体）、Matrigel（登録商標）などが挙げられる。
　ある実施形態において、領域Aは、ラミニンでコーティングされている。ラミニンは特に限定されず、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン211、ラミニン213、ラミニン222、ラミニン311（ラミニン3A11）、ラミニン332（ラミニン3A32）、ラミニン321（ラミニン3A21）、ラミニン3B32、ラミニン411、ラミニン421、ラミニン423、ラミニン521、ラミニン522、ラミニン523、又はこれらの断片（例えば、E8断片である、ラミニン211-E8、ラミニン311-E8、ラミニン411-E8、ラミニン511-E8）を使用できる。ある実施形態において、ラミニンは、ラミニン511又はその断片（例えば、ラミニン511-E8断片）である。
　領域Bは、領域Aよりも細胞接着性の低い培養基材の表面が露出した領域であってもよく、領域Aよりも細胞接着性の低い領域とするため、培養基材の表面を何らかの物質でコーティングした領域であってもよい。ある実施形態において、領域Bは、細胞非接着性の物質によりコーティングされている。細胞非接着性物質としては、MPC（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマー；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ポリエチレンオキサイド；カルボキシビニルポリマー；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；ポリアクリルアミド、ポリN-イソプロピルアクリルアミド等のポリアミド；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、デキストラン等の多糖類；アルブミン及びこれらの誘導体などが挙げられる。ある実施形態において、細胞非接着性物質は、MPCポリマーである。
　領域Aの形状は、特に限定されない。ある実施形態において、領域Aは円形である。本明細書において、円形とは、当業界で実質的に円形と認識される形状であればよく、真円を含む略円形の意味で用いられる。領域Aの面積は、特に限定されず、例えば、領域Aの面積は、0.5～10 cm2、0.7～10 cm2、1～10 cm2、0.5～5 cm2、0.7～5 cm2、又は1～5 cm2でありうる。
　領域A及び領域Bは、パターニングに用いられるいずれの方法により培養基材表面に形成してもよい。領域A及び領域Bは、例えば、ソフトリソグラフィー、フォトリソグラフィー、3Dプリンティングなどの技術により培養基材表面に形成することができる。
　例えば、領域Aの形状及びサイズの穴を有するシートを3Dプリンターでプリントした鋳型により作成し、培養基材の表面をこのシートで覆い、シートで覆われていない表面を細胞接着性物質によりコーティングし、その後シートを取り除くことにより、培養基材上に領域A及び領域Bを形成することができる。あるいは、領域Aの形状及びサイズのシートを作成し、培養基材の表面に置き、シートで覆われていない表面を細胞非接着性物質によりコーティングした後、シートを取り除き、シートで覆われていた表面を細胞接着性物質でコーティングすることにより、培養基材上に領域A及び領域Bを形成することもできる。シートは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリエチレングリコールハイドロゲル、又はアガロースゲルなどの生体適合性材料により形成することができる。コーティングは、例えば、培養基材を細胞接着性物質又は細胞非接着性物質の溶液と接触させて37℃又は室温で必要な時間（例えば、1時間以上）反応させることにより行うことができる。細胞接着性物質及び細胞非接着性物質の濃度は、当業者が適宜決定しうるが、例えば、ラミニンの場合、0.1～1 μg/cm2、0.1～0.5 μg/cm2、又は約0.25μg/cm2でありうる。
　本明細書において、培養基材は表面に凸部（ピラー（pillar）ともいう）を有し、その凸部上面に領域Aを有してもよい。凸部の形状は、特に限定されず、円柱又は角柱のような形状であってもよい。
　多能性幹細胞は、細胞が領域Aの70％以上を占めるような細胞数で培養基材に播種される。細胞は、領域Aのみに播種しても、領域Aと領域Bとを含む培養基材上全体に播種してもよい。例えば、領域Bが細胞非接着性の領域である場合、培養基材上全体に播種することができる。例えば、多能性幹細胞は、5×105～10×105cells/cm2で播種されうる。典型的には、酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、パパイン）及び/又はキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））を含む細胞分散液を用いて回収及び分散した多能性幹細胞を、所望の培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養基材上に加える。細胞分散液として、例えば、TrypLETM Select （Thermo Fisher Scientific）、TrypLETM Express （Thermo Fisher Scientific）などの市販品を用いてもよい。
　多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、前記培養基材上で接着培養により行う。多能性幹細胞を培養基材へ播種後、未分化維持因子を含む培地で一定期間培養した後、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導を開始してもよい。本開示において、未分化維持因子を含まない培地での培養を開始した時点を、網膜組織への分化誘導を開始した時点とする。
　多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、前述したような公知の方法にしたがって実施できる。ある実施形態において、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、多能性幹細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で培養することを含む。さらなる実施形態において、多能性幹細胞の網膜組織への分化誘導は、以下の工程を含む：
(1) 多能性幹細胞を、BMPシグナル阻害薬を含む培地で培養すること、及び
(2) 工程(1)で得られた細胞を、BMPシグナル作用薬を含む培地で培養すること。
　使用する培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、IMDM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、又はこれらの混合培地が挙げられる。
　上記基礎培地には、血清、血清代替物、増殖因子、未分化維持因子、サイトカイン、インシュリン、脂肪酸、脂質、ビタミン、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸、レチノイド類、グルタミン、タウリン）、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-チオグリセロール、抗生物質、緩衝剤、無機塩類から選択される1種以上の成分を、必要に応じて加えることができる。
　培地は、基礎培地に上記の成分を添加してなる市販の培地、例えば、Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAXTM Supplement (Thermo Fisher Scientific)、DMEM/F-12, GlutaMAXTM supplement（Thermo Fisher Scientific）などを使用してもよい。
　培地は無血清培地であることが好ましく、分化誘導はフィーダーフリーで実施することが好ましく、ゼノフリーで実施することがより好ましい。
　「BMPシグナル阻害薬」は、BMPによるシグナル伝達を阻害する物質であれば特に限定されない。BMPシグナル阻害薬としては、LDN-193189（4-[6-(4-Piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline）、ドルソモルフィン（Dorsomorphin）（6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine）、及びDMH1（4-(6-(4-sopropoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が挙げられる。ある実施形態において、BMPシグナル阻害薬は、LDN-193189である。BMPシグナル阻害薬の濃度は、阻害薬の種類に応じて適宜決定されるが、例えば1～1000 nM、10～500 nM、30～300 nM、もしくは約100 nM又は前記濃度のLDN-193189のBMP阻害活性に相当する濃度である。
　BMPシグナル阻害薬を含む培地での培養期間は、特に限定はされないが、例えば1～10日間、2～9日間、3～7日間、4～6日間、又は約5日間である。
　「BMPシグナル作用薬」は、BMPによるシグナル伝達を活性化する物質であれば特に限定されない。BMPシグナル作用薬としては、BMP2、BMP4、BMP7、BMP12（GDF7）もしくはこれらの断片、又は抗BMP受容体抗体が挙げられる。ある実施形態において、BMPシグナル作用薬は、BMP4である。BMPシグナル作用薬の濃度は、作用薬の種類に応じて適宜決定されるが、例えば0.01～1000 nM、0.1～100 nM、1～10 nM、1～3 nM、もしくは約1.5 nM、又は前記濃度のBMP4の活性に相当する濃度である。
　BMPシグナル作用薬を含む培地での培養は、網膜組織への分化に必要な期間行われる。培養期間は、限定はされないが、例えば1～30日間、2～20日間、3～15日間、4～12日間、又は5～10日間（例えば、5、6、7、8、9、又は10日間）である。BMPシグナル作用薬の濃度は、培養期間中、一定としても変化させてもよい。例えば、2～4日につき40～60％減の割合で、段階的にBMPシグナル作用薬の濃度を低下させてもよい。例えば、BMPシグナル作用薬を含む培地での培養の開始後、2、3、又は4日毎に培地の一部（例えば、半量）をBMPシグナル作用薬を含まない培地に交換することにより、培地中のBMPシグナル作用薬の濃度を段階的に低下させることができる。
　ある実施形態において、BMPシグナル阻害薬又はBMPシグナル作用薬を含む培地は、F-12培地とIMDM培地との1：1混合液に、KnockOutTM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific)（例えば、0.5％～30％、1％～20％、又は10％）、Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific)、BSA、及び1-チオグリセロールを加えた培地である。
　BMPシグナル作用薬を含む培地での培養後、培地をBMPシグナル作用薬を含まないものに交換し、培養を継続してもよい。この培養期間は、限定はされないが、例えば1～100日間、10～90日間、20～80日間、30～70日間、40～60日間、又は約50日間である。
　BMPシグナル作用薬を含む培地での培養後の培養期間の一部また全体において、Wntシグナル阻害薬を含む培地で細胞を培養してもよい。Wntシグナル阻害薬としては、CKI-7（N-(2-Aminoethyl)-5-chloro-8-isoquinolinesulfonamide）、D4476（4-(4-(2,3-Dihydrobenzo[1,4]dioxin-6-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)benzamide）、IWR-1-endo (IWR1e) （4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinylbenzamide）、及びIWP-2（N-(6-methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide）などが挙げられる。Wntシグナル阻害薬の濃度は、阻害薬の種類に応じて適宜決定されるが、例えば、0.1～100 μM、0.3～30 μM、又は1 μM～10 μMである。
　前記した移植用網膜シートの調製には、多能性幹細胞の分化開始から約40～90日、より好ましくは約45～80日、特に好ましくは約50～70日の平面状網膜オルガノイドを使用することが好ましい。この時期の網膜オルガノイドであれば、多能性幹細胞から網膜への十分な分化誘導が期待できるからである。分化60日位の平面状網膜オルガノイドは、主として、頭頂側のより幼弱な網膜前駆細胞（Chx10又はRX陽性）と、基底膜側のより分化した神経節細胞などの網膜内層細胞（BRN3B,Pax6, ISL1）を含む、2層構造として特徴付けられる。
３．網膜細胞シートの品質確認
　本発明の方法で調製した移植用網膜シートが所望の品質を有することは、既報（例えば、WO2020/184720等）にしたがい、定量的PCRを実施し、その遺伝子発現パターンを例えばレーダーチャート表示することにより確認することができる。または、免疫染色、シングルセル解析、フローサイトメトリーを用いた解析やこれらを教師データとして用いた機械学習、深層学習などを応用した解析などを行うことにより、適合部位が視細胞前駆細胞を含む網膜オルガノイドであることを確認できる。
　定量的PCRでは、網膜組織外細胞のマーカーの発現が低く、網膜細胞のマーカーの発現が高いことを確認する。この確認は、特定のマーカーの発現量に基づく評価だけでなく、複数のマーカーの発現パターンやプロファイルによる評価も含む。
　具体的に言えば、移植用網膜シートは、網膜オルガノイドであることの指標として複数の構成細胞群のマーカーを含むこと、および、網膜外組織細胞を含まないことを前記遺伝子発現パターンにより確認する必要がある。ここで、分化40-80日での網膜細胞及びその前駆細胞とは、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞（錐体・桿体前駆細胞を含む）、網膜内層細胞（水平細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞）網膜色素上皮細胞を含み、網膜外組織細胞とは、網膜細胞以外の細胞であり、具体的には水晶体細胞、毛様体細胞、脳神経細胞を含む。例えば分化60日前後の移植組織のシングルセル解析においては網膜前駆細胞と一部早期に分化する網膜内層の細胞や視細胞前駆細胞の集団を確認することができる。
　網膜前駆細胞マーカーとしては、RX、Vsx2、Otx2、Six3、Sxi6が挙げられる。視細胞前駆細胞マーカーとしては、Recoverin、Rxr-gamma、CRX、Nr2e3、Nrl、MSI1、Sox2、Prom1が挙げられる。この中で特に後の錐体細胞比率を予測するマーカーとしては、Rxr-gamma、ARR3、THRBなどが挙げられる。網膜内層細胞マーカーとしては、Calbindin、Onecut1、Onecut2、Prox１、Chx10、POU 4F2、ISL1が挙げられる。網膜色素上皮細胞（RPE）に特異的なマーカーとしては、MITF、TTR、BEST1、RPE65、MERTK、が挙げられる。
　網膜外組織細胞マーカーとしては、CRYAB、EMX2、s100A10が挙げられ、一定以下の混入は許容可能である毛様体マーカーとしては、Zic1、AQP1、MSX1などが挙げられる。
　本発明の移植用網膜シートは、定量的PCRにおいて、上記網膜細胞マーカーの内視細胞前駆細胞マーカーの発現が高く網膜内層細胞マーカー及び網膜前駆細胞マーカーについては発現が確認され、かつ網膜外組織細胞マーカーの発現が低いか、あるいは検出限界以下であれば、移植用網膜シートは所望の品質を有すると評価できる。特に、視細胞前駆細胞マーカーであるCrx、Recoverin、及びRxr-gammaから選ばれる１以上の発現、並びに、網膜外組織細胞マーカーであるCRYAB、Zic1、及びEMX2から選ばれる１以上の発現を指標とすることが好ましい。また、個々の遺伝子発現量のみならず、これらの遺伝子の「相対的な発現量パターン」も、網膜であること及びその特徴や品質を規定する重要なマーカーとなりうる。例えば各遺伝子をレーダーチャートプロットすることにより、それぞれのグループ遺伝子がどの程度発現しているか、任意の2つの遺伝子の相対的な発現比などを確認することが可能となる（後掲実施例1の4、図11参照）。また、網膜外組織細胞マーカーなどの除外マーカーや、一定以下の混入は許容可能である毛様体マーカーなどの注意マーカーについても、単独遺伝子での数値以外に、チャート上のパターンからの逸脱を確認することで、たまたま1遺伝子で逸脱値となったのか、全体の発現パターンの一環としての逸脱値かの判定が可能となり、より信頼性の高い判断が期待できる。
　マーカーの確認は周知の方法により実施できる。例えば、各サンプルよりTotal RNAをRNeasy Micro Kits (Qiagen) で抽出し、cDNA をSuperScript（登録商標）III Reverse Transcriptase Kits (Invitrogen)で合成する。合成したcDNAサンプルを希釈し、各プライマーに対してTB Green（登録商標）Premix DimerEraser(TM)(Takara)を用いて定量的PCRを行う。評価は、例えば、内部Control（例えば、GAPDHとARP）を用いてそれぞれのΔCTを平均化して対応プライマーのΔCTとし、そのΔCT同士を比較する。判定は、例えば、ΔCT値5以下であれば強発現、ΔCT値5～7であれば発現など、一定の基準に従って実施する。表１に、定量的PCRに使用するプライマーの一例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
４．網膜変性疾患治療用医薬品
　本発明は、複数の移植用網膜シートと移植媒体（シートの保存液としても機能する）を含む、網膜変性疾患の治療用医薬品も提供する。前記医薬品において、複数の移植用網膜シートの少なくとも一部は、多能性幹細胞由来の1つの平面状網膜オルガノイドから切り出されたものであり、いずれも、光干渉断層撮影（OCT）により、70μm以上の厚さを有し、かつ、異物構造が存在しないことが確認されたものである。「移植媒体」としては、例えば、7倍希釈ビスコートなど希釈粘弾性物質液が挙げられる。
　各シートは、移植器具であるカニューレ、好ましくは18G～24Gカニューレに装着可能な大きさ、例えば、短軸方向の長さが0.5～2.0mm、好ましくは0.5～1.0であり、長軸方向の長さが1mm以上、好ましくは1～3mmの大きさを有する小片であり、それゆえ、移植用24Gカニューレに複数枚装着でき、網膜に大きな切開を加えることなく移植することが可能である。
　本発明の医薬品に含まれる複数の移植用網膜シートは、視細胞前駆細胞マーカーであCrx、Recoverin、Rxr-gammaから選ばれる１以上の発現が高く、網膜外組織細胞マーカーであるCRYAB、EMX2、s100A10、Zic1、AQP1、及びMSX1から選択される１つ以上、好ましくはCRYAB、Zic1、EMX2から選ばれる１以上の発現が低いか検出限界以下であることによっても特徴づけられる。
　移植用網膜シートを構成する網膜オルガノイドは、全細胞に対する網膜細胞（網膜前駆細胞を含む）の割合が約90％以上、好ましくは約95％以上であり、細胞が層構造を形成している。
　本発明において、「網膜変性疾患」とは、網膜組織を構成する細胞に障害が発生することにより、視機能に異常をきたす疾患であり、杆体細胞又は錐体細胞の変性や障害、欠損を伴う網膜疾患を含む。網膜変性疾患としては、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、杆体錐体ジストロフィー、黄斑円孔、変性近視、外傷性黄斑疾患を挙げることができる。
５．網膜移植用複合シートの製造方法
　網膜オルガノイドはシート形状を生かして、網膜色素上皮細胞と積層して、複合シートを作成することも可能である。生体内において網膜と網膜色素上皮細胞は頭頂面同士で接触しているだけで、強固な接着は必要としない。そのため、粘度の低い流動性ゲル、例えば、x7ビスコート（眼科手術用コンドロイチン硫酸エステルナトリウム・ヒアルロン酸ナトリウム 混合材）などを用いて、移植用網膜シートと網膜色素上皮細胞シートを緩く接着させた複合シートとして、移植に使用することができる。
　本発明は、上記のような網膜移植用複合シートの製造方法であって、多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから移植用網膜シートを製造する工程と、前記移植用網膜シートを流動性ゲルを介して網膜色素上皮細胞シートに積層して、網膜移植用複合シートを製造する工程を含む、製造方法も提供する。
　流動性ゲルとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などの生体内で網膜と網膜色素上皮細胞の間に細胞間マトリックスとして存在する多糖類（その塩、エステルなどの誘導体含む）など、組織適合性の流動性ゲルを使用することができる。これらの流動性ゲルは、シート挿入時の移植媒体、シートの保存液成分としても使用できる。
６．網膜変性疾患の治療方法
　本発明は、１．に記載した方法にしたがい、多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから複数の移植用網膜シートを調製し、必要とする対象の網膜に前記複数の移植用網膜シートを（例えば、24Gカニューレに装着するなどして）移植することを含む、網膜変性疾患の治療方法も提供する。
７．自動化プログラム
　本発明の移植用網膜シートを調製する方法は、その少なくとも一部を自動化することができる。
　例えば、前記プログラムは、網膜オルガノイドのOCT情報を取得する工程；前記OCT情報をコンピューターに入力する工程；前記OCT情報からX-Y平面画像を連続的に生成し、異物構造を含まない領域を特定する工程；OCT情報からヒートマップを生成し、厚さが70μm以上、好ましくは70～175μm、特に好ましくは80～150μmの領域を選択する工程；厚さが70μm以上、かつ異物構造を含まない領域を移植適合領域として特定する工程；移植用網膜シートに合わせたサイズのグリッドを当該移植適合領域上に有効枚数が最大となるように設定し、グリッドに合わせて移植用網膜シートを切り出す指令を切り出し用機器に出力する工程を含む。前記プログラムは、必要に応じて、明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影の情報を取得する工程；前記明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影の情報を入力する工程、前記明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影の情報にしたがって、移植適合領域と推定される領域（推定領域）を特定する工程、前記推定領域に対して、OCTを実施するよう指令を出す工程を含んでいてもよい。
　上記はプログラムの工程の一例であって、本発明の自動化プログラムは、これらの工程の一部を含むものであってもよいし、追加の工程を含むものであってもよい。
　以下、本発明を参考例及び実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの参考例及び実施例に限定されるものではない。
参考例１：多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作成
　以下の方法で平面状網膜オルガノイドを作成した。
・Day0
　直径１cmの穴のあいたPDMSシートを35 mm dishに設置し、穴の内部に7 μl iMatrix-511/500μl PBS 希釈液200μlで満たしてdishを円状にコーティングする（37 ℃で１時間）。コーティング剤をアスピレーターで除去後 5x105 iPS細胞を200μl StemFIT（登録商標）AKO2NにY27632を最終濃度10μMで添加した培地に懸濁し、同部位に播種する。37℃インキュベータで30分静置後、滅菌鑷子を用いてPDMシートを取り外し、上述のStemFIT （登録商標）AKO2N+Y27632培地を300μl追加して5%CO2インキュベーターで培養する。
・Day1
　培地をStemFIT AKO2N培地（Y 27632無し、ペニシリン/ストレプトマイシン添加）500μlに置換する。
・Day2
　1ml gfCDM(10%KSR)で3回wash後 1ml gfCDM(10%KSR)に全量置換する。
［gfCDM培地の組成］
　IMDM (31980-030)　　　　　　　　125ml
　F-12 (31765-092)　　　　　　　　125ml
　CD lipid (11950-031)　　　　　　2.5ml
　BSA (5g/20ml)　　　　　　　　　　5ml
　1-チオグリセロール(207-09232)　　9.75μl
　ペニシリン/ストレプトマイシン　　2.5ml
　KSR　　　　　　　　　　　　　　　25ml
・Day3 とDay6
　100nM LDNの入ったgfCDM培地1mlに置換する。
・Day8
　1mlのgfCDMで洗浄後、1mlのBMP４ (終濃度1.5nM)入り培地に置換する。
・Day11とDay14
　gfCDM培地を半量交換する。
・Day17
　DMEM/F-12+Glutamaxで3回洗浄後下記培地1mlに置換する。
［培地の組成］
　DMEM/F-12+Glutamax (10565-042)　 5ml
　N2 supplement (17502-048)　　　　50μl
　ペニシリン/ストレプトマイシン　　50μl
・Day 20
　以下のcontrol成熟培地 1mlに置換する。
［培地の組成］
　DMEM/F-12+Glutamax　(10565-042)　　　　　　500ml
　N2 supplement (17502-048)　　　　　　　　　5ml
　非働化FBS　　　　　　　　　　　　　　　　　50ml
　50mM タウリン　（in PBS）　　　　　　　　　1.12ml
　Antibiotic-Antimycotic (100x)(15240-062)　 5ml
＊以降2-3日に１回培地交換する。
実施例１：網膜オルガノイドの観察
　分化60日前後の網膜平面オルガノイドにおいて、1)明視野顕微鏡撮影（全体の状態の把握）、2)位相差顕微鏡撮影（均質性の観察）、3)OCT断層増撮影（均一性、厚さ、異物情報）、4)OCT X-Y平面での観察を用いて、網膜オルガノイドの厚さと異物構造を含まない領域を特定した。
１．明視野顕微鏡撮影
　まず、明視野顕微鏡撮影にて全体の状態を把握した。オルガノイドは、網膜への分化が見られる場合、周辺部に特徴的なRPE又は3Dオルガノイド様構造物の形成が全例で見られ、これらの構造物が網膜への分化の傍証となる。また、厚みのある部位は薄茶色に観察され、大まかな全体の均一性を明視野で観察することができる（図1）。
２．位相差顕微鏡撮影
　オルガノイドに対し位相差顕微鏡撮影を実施すると、より内部構造が詳細に観察され、シート内に均一構造を持つ部分が確認できた（図2）。
３．光干渉断層撮影（OCT）
　Screen社の光干渉断層撮影（OCT）を用いて断層像を取得した。輝度の違いから組織内の異物の検出や均一性の確認が可能であり（図3）、輝度分布を調べることにより、異物の混在を同定することが可能と思われた。また、OCT断層像から水平方向のX-Y平面画像、Z方向に10μm以下の間隔で複数枚連続的に取り出し、X-Y水平面の連続的評価を行うことで、さらに効率よく輝度分布の異なる異物構造がないことを判定することができる（図4）。
　OCTの断層像の厚み情報をヒートマップとして書き出した（図5）。これにより、OCT断層像で内部構造を確認後、ヒートマップを利用して全体の厚みの傾向を特定することが可能である。さらにヒートマップを二値化画像に変換することにより、厚み80μm以上、あるいは75-125μmの領域、のように適切な厚みを持った移植片部位を特定することが可能である。
４．定量的PCR
　推定網膜領域を確定後、その領域内から1x2mmのサイズの移植片を切り出し、その遺伝子発現パターンを、PCRパネルを使用して確認した。これにより、網膜外組織混入の判定、網膜細胞内の内層細胞/視細胞の分化60日時点での大まかな構成内容などがわかる。その結果、薄い網膜では毛様体/水晶体マーカーが高いことが確認できた（図6）。一方、厚みを持った均一な部分（4,5,9,10)では網膜外組織のマーカー遺伝子発現は低く、移植に向いた部位であることが確認できた（図7）。
　レーダーチャートにより、同じ網膜遺伝子プロファイルを持つシート間の定量的PCRの結果を比較した。分化40日から60日にかけて、前駆細胞マーカーの発現減少と視細胞マーカーの発現増強が確認でき、これらの各遺伝子群の発現が分化日数により相対的に変化することがわかる（図11A）。分化50日と60日では、網膜遺伝子発現パターンはほぼ同じと評価することが可能である（図11B）。移植後の結果をフィードバックして生着良好出あった移植シートのqPCRデータを集めることにより（図11C）、良好なシートを示す網膜遺伝子発現パターン範囲（図11Cのグレー帯）を特定することができ、このパターンから逸脱する遺伝子発現パターンを示すシートについて不適合判定を下すことができる。
５．移植片の作製
　以上の結果から、網膜オルガノイドの移植適合領域は、一定の厚さ（70μm以上）と輝度分布の異なる異物構造を有さない領域として同定しうることが確認された。厚さと異物構造の有無は、OCT断層像から、連続的X-Y平面画像やヒートマップを作製するなどして、特定することができる。明視野顕微鏡撮影や位相差顕微鏡撮影により、OCTによる評価対象領域を絞り込むことで、より効率的な移植適合領域の特定が可能となる。
　例えば、直径1cm程度の平面オルガノイドシートについて、明視野/位相差で移植に適合する均一性を有する領域を推定し、OCT 断層像で70μm程度以上の厚さを有し、均一性を有する領域から1 x 2 mmの移植組織を連続的に切り出す。上述のとおり、厚さの評価はヒートマップを使用することで効率的に実施できる。移植片の切り出しは、網膜オルガノイド上に移植片の大きさに合わせたグリッドを設定し、移植適合領域上で有効枚数が一番多くなるよう位置合わせを行い、グリッドに沿って移植片を切り出す（図8）。1 x 2 mmの移植片は、移植用24Gカニューレに複数枚装着できるため、網膜に大きな切開を加えることなく移植することが可能である（図9）。
　また、平面状オルガノイドシートに別途用意したシート状網膜色素上皮細胞を頭頂側同士を接する形で重ね合わせることにより、生体内での両者の関係性を模倣した複合シートを移植用に用意できる。網膜と網膜色素上皮細胞は元々頭頂側同士で機能的に接しているが、発生過程において間に結合組織は存在せず、移植時に一時的に両者を複合的に保持できれば、移植後それぞれ規定面側に生着することで、その後の機能的関係を構築できると考えられる。
　そこで、図10のように、網膜オルガノイド上に粘弾性媒体（35000～60000mPa・s （25°C、せん断速度 2s -1）を2倍に希釈したもの）を置き、さらに上から頭頂側がオルガノイドに接するように網膜色素上皮細胞シートを重ねた。シートはあらかじめ適当な大きさに切断して重ねても、重ねてから所定の大きさに切断してもよい。重ね合わせた後、余分な粘弾性物質はMQA（登録商標）などを用いてなるべく除去する。得られた複合シートは、同程度またはそれ以下の粘度を有する移植用媒体とともに24Gカニューレに挿入することが可能であり、また複合シートの状態を維持したままカニューレから押し出すことも可能である。
　本発明の方法によれば、網膜オルガノイドから、熟練者の特別な技術に頼ることなく、客観的評価方法により、移植に適したシートを効率よく切り出すことができる。本発明は、網膜変性疾患に対する再生医療の実用化に大きく貢献する。
　本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

Claims (9)

  1. 　多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドから移植用網膜シートを製造する方法であって、
    前記多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドに対して光干渉断層撮影（OCT）、共焦点画像解析、及び超音波顕微鏡解析から選ばれるいずれか1または2以上を実施して、70μm以上の厚さを有し、かつ、輝度の違いで特徴付けられる異物構造が存在しない領域を、移植適合領域として特定する工程、及び
    前記移植適合領域から小片を切り出し、移植用網膜シートとする工程を含む、前記方法。
  2. 　異物構造が存在しない領域が、OCT断層像から再構築した、水平方向のX-Y平面画像をZ方向に複数枚連続的に取り出して評価することにより特定される、請求項１に記載の方法。
  3. 　70μm以上の厚さを有する領域が、ヒートマップを用いて特定される、請求項１に記載の方法。
  4. 　切り出される小片が、18G～24Gカニューレに装着可能な大きさである、請求項１に記載の方法。
  5. 　切り出される小片が、長軸方向の長さが1.0～10.0mmであり、短軸方向の長さが0.5～2.0mmである、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記方法が、多能性幹細胞由来の網膜オルガノイドに対して明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影を実施する工程をさらに含み、
    前記明視野顕微鏡撮影及び／又は位相差顕微鏡撮影により、網膜への分化と均質性が確認できる領域を対象として、前記OCTによる移植適合領域の特定を実施する、請求項１に記載の方法。
  7. 　網膜オルガノイドが、直径1cm以上の平面状網膜オルガノイドである、請求項１に記載の方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の方法で移植用網膜シートを製造する工程と、前記移植用網膜シートを流動性ゲルを介して網膜色素上皮細胞シートに積層して、網膜移植用複合シートを製造する工程を含む、網膜移植用複合シートの製造方法。
  9. 　網膜変性疾患の治療用医薬品であって、多能性幹細胞由来の1つの平面状網膜オルガノイドから切り出された複数の網膜移植用細胞シートと移植媒体を含み、前記複数の網膜移植用細胞シートが、長軸方向の長さが1.0～10.0mmで、短軸方向の長さが0.5～2.0mmの大きさを有し、光干渉断層撮影（OCT）により、70μm以上の厚さを有し、かつ、異物構造が存在しないことが確認されたものである、前記医薬品。
     

     
PCT/JP2023/046832 2022-12-28 2023-12-27 網膜シートの製造方法 Ceased WO2024143436A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202380089743.8A CN120569227A (zh) 2022-12-28 2023-12-27 视网膜片材的制备方法
EP23912214.6A EP4643894A1 (en) 2022-12-28 2023-12-27 Method for manufacturing retinal sheet
AU2023416411A AU2023416411A1 (en) 2022-12-28 2023-12-27 Method for manufacturing retinal sheet
JP2024567903A JPWO2024143436A1 (ja) 2022-12-28 2023-12-27

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-210998 2022-12-28
JP2022210998 2022-12-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024143436A1 true WO2024143436A1 (ja) 2024-07-04

Family

ID=91717774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/046832 Ceased WO2024143436A1 (ja) 2022-12-28 2023-12-27 網膜シートの製造方法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP4643894A1 (ja)
JP (1) JPWO2024143436A1 (ja)
CN (1) CN120569227A (ja)
AU (1) AU2023416411A1 (ja)
WO (1) WO2024143436A1 (ja)

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013077425A1 (ja) 2011-11-25 2013-05-30 住友化学株式会社 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法
JP2013128475A (ja) 2011-11-25 2013-07-04 Sumitomo Chemical Co Ltd 網膜組織の製造方法
WO2015025967A1 (ja) 2013-08-23 2015-02-26 住友化学株式会社 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法
WO2016063986A1 (ja) * 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造方法
WO2017183732A1 (ja) 2016-04-22 2017-10-26 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造法
WO2019217630A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Stem cell-derived cell cultures, stem cell-derived three-dimensional tissue products, and methods of making and using the same
WO2020138430A1 (ja) * 2018-12-28 2020-07-02 国立研究開発法人理化学研究所 網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬
WO2020184720A1 (ja) 2019-03-13 2020-09-17 大日本住友製薬株式会社 移植用神経網膜の品質を評価する方法及び移植用神経網膜シート
WO2020249935A1 (en) 2019-06-10 2020-12-17 Newcells Biotech Limited Improved retinal organoids and methods of making the same
JP2021118733A (ja) 2015-09-08 2021-08-12 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造方法
WO2022054925A1 (ja) 2020-09-11 2022-03-17 国立研究開発法人理化学研究所 神経網膜を含む細胞凝集体とマトリクスとを含む複合体及びその製造方法
WO2022138803A1 (ja) 2020-12-24 2022-06-30 国立研究開発法人理化学研究所 視細胞を含む層状の網膜組織の促成製造方法
WO2022239868A1 (ja) 2021-05-14 2022-11-17 国立研究開発法人理化学研究所 網膜組織の製造方法
WO2023003025A1 (ja) * 2021-07-21 2023-01-26 国立大学法人京都大学 網膜組織の製造方法

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013077425A1 (ja) 2011-11-25 2013-05-30 住友化学株式会社 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法
JP2013128475A (ja) 2011-11-25 2013-07-04 Sumitomo Chemical Co Ltd 網膜組織の製造方法
WO2015025967A1 (ja) 2013-08-23 2015-02-26 住友化学株式会社 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法
WO2016063986A1 (ja) * 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造方法
JP2021118733A (ja) 2015-09-08 2021-08-12 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造方法
WO2017183732A1 (ja) 2016-04-22 2017-10-26 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造法
WO2019217630A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Stem cell-derived cell cultures, stem cell-derived three-dimensional tissue products, and methods of making and using the same
WO2020138430A1 (ja) * 2018-12-28 2020-07-02 国立研究開発法人理化学研究所 網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬
WO2020184720A1 (ja) 2019-03-13 2020-09-17 大日本住友製薬株式会社 移植用神経網膜の品質を評価する方法及び移植用神経網膜シート
WO2020249935A1 (en) 2019-06-10 2020-12-17 Newcells Biotech Limited Improved retinal organoids and methods of making the same
WO2022054925A1 (ja) 2020-09-11 2022-03-17 国立研究開発法人理化学研究所 神経網膜を含む細胞凝集体とマトリクスとを含む複合体及びその製造方法
WO2022138803A1 (ja) 2020-12-24 2022-06-30 国立研究開発法人理化学研究所 視細胞を含む層状の網膜組織の促成製造方法
WO2022239868A1 (ja) 2021-05-14 2022-11-17 国立研究開発法人理化学研究所 網膜組織の製造方法
WO2023003025A1 (ja) * 2021-07-21 2023-01-26 国立大学法人京都大学 網膜組織の製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIBA RYUTARO: "Toward establishment of regenerative cell therapy for retinitis pigmentosa using iPS cell derived retinal sheet", FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, vol. 155, 1 March 2020 (2020-03-01), pages 93 - 98, XP055868350 *
See also references of EP4643894A1

Also Published As

Publication number Publication date
CN120569227A (zh) 2025-08-29
EP4643894A1 (en) 2025-11-05
JPWO2024143436A1 (ja) 2024-07-04
AU2023416411A1 (en) 2025-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6850456B2 (ja) 網膜色素上皮細胞の純化方法
JP5552478B2 (ja) 膜
CN111164205B (zh) 包含视网膜组织的细胞聚集体及其制造方法
CA2828197C (en) Method of producing retinal pigment epithelial cell sheet
Kang et al. Effects of flow-induced shear stress on limbal epithelial stem cell growth and enrichment
KR20190112090A (ko) 다능성줄기세포의 분화 제어 방법
Tian et al. Polarized, cobblestone, human retinal pigment epithelial cell maturation on a synthetic PEG matrix
WO2023090427A1 (ja) シート状網膜組織の製造方法
CN120569227A (zh) 视网膜片材的制备方法
WO2024185751A1 (ja) 神経網膜前駆細胞を含む組織とその製造方法、該組織を含む網膜疾患治療用組成物
WO2024204596A1 (ja) 網膜組織の製造方法
Kingston Utilising Glaucomatous Extracellular Matrix Substrates and Novel Biomimetic 3D Polymer Scaffolds to Study Trabecular Meshwork (TM) Cells and TM Progenitors
US20250290044A1 (en) Method for producing cell sheet
JP2025524999A (ja) 分離ウェルマイクロプレートを使用する胚様体のヒドロゲルへの自動埋め込みの方法
CN120897992A (zh) 视网膜组织的生产方法
Dimmock Simulation and characterization of the corneal limbal epithelial stem cell niche by using new biotechnologies
WO2024085251A1 (ja) 網膜移植物の品質を評価する方法
Liu et al. Development of a biodegradable smooth-surface microcarrier for retinal pigment epithelial cell expansion and maturation
Savioja Attachment and Differentiation of Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium Cells on Different Coating Materials
HK40008770B (zh) 多能干细胞的分化调控方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23912214

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024567903

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202380089743.8

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: AU2023416411

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023912214

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023912214

Country of ref document: EP

Effective date: 20250728

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023416411

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20231227

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023912214

Country of ref document: EP

Effective date: 20250728

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 202380089743.8

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2023912214

Country of ref document: EP