WO2024155111A1 - 염기 에디터의 염기 교정 능력을 측정하는 세포외 시험법 - Google Patents

염기 에디터의 염기 교정 능력을 측정하는 세포외 시험법 Download PDF

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    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing genome base editing in an extracellular, in vitro environment (cell-free, in vitro system). Specifically, target DNA mutation by base editor without using cells and without a separate complicated experimental process. This is a method that can confirm and quantify.
  • Target DNA can be amplified from cells and used, but more usefully, it can be used by imitating the mutant DNA of organisms that require base editing (for example, patients with genetic diseases) through double-stranded DNA synthesis.
  • adenine base editor By measuring DNA editing efficiency without a cell line or model animal carrying a specific mutation, adenine base editor, cytosine base editor, DddA-derived cytosine base editor (DdCBE), TALE-linked deaminase (TALED), zinc finger deaminase (ZFD) It can be used as a primary test method for the base editing ability of various base editors such as finger deaminase)) and CRISPR system.
  • base editing is a fusion protein that connects a base-converting enzyme such as deaminase to Cas9 nickase (nCas9) or Cas9 (dCas9) with dead catalytic ability.
  • a base-converting enzyme such as deaminase to Cas9 nickase (nCas9) or Cas9 (dCas9) with dead catalytic ability.
  • DSB double-strand break
  • Prime editing uses a fusion protein linking reverse transcriptase to nCas9 and a prime editing guide RNA (pegRNA) containing an RNA template to correct various changes, including base mutations and small insertions or deletions (indels), at specific positions in nuclear DNA. Used to induce custom mutations.
  • pegRNA prime editing guide RNA
  • indels small insertions or deletions
  • the purpose of the present invention is to provide a method for testing genome editing in an extracellular, in vitro environment (cell-free, in vitro system).
  • Target DNA mutation by base editor without using cells and without a separate complicated experimental process.
  • the purpose is to provide a method to confirm and quantify.
  • it is intended to provide a method to screen base editors with the ability to correct target DNA mutations in actual cells through such a simple extracellular test method.
  • the extracellular test method is to obtain base-corrected DNA by contacting isolated double-stranded DNA, which is an editing target, with a base-editing protein in an extracellular environment, and to measure base-correction activity by sequencing the obtained base-corrected DNA. It entails doing.
  • the base-editing protein is mixed in one reaction tube (one pot) with target DNA in the form of a polynucleotide (including DNA or mRNA) encoding the base-editing protein or a vector containing the same and synthesized as a base-editing protein, It can be used in a reaction for DNA base correction without a separate protein purification process, or it can be used mixed with target DNA in expressed and purified form.
  • the target DNA may be nuclear DNA, mitochondrial DNA, or chloroplast DNA, and can be extracted from animal or plant cells and amplified or synthesized. In this way, it was confirmed for the first time that even if bases were corrected in the extracellular environment without using cells, the proofreading activity was substantially the same as when base proofreading was done within cells.
  • the target DNA mutation caused by the base editor in the environment and measuring the base correction ability it is possible to measure the base correction activity of the base editor, and the target DNA mutation can be corrected in actual cells with a simple extracellular test method. It became possible to screen base editors.
  • Figure 1 shows the results of base editing of the ND1 gene region of human mitochondria using DdCBE (DddA-derived cytosine base editor) in an extracellular environment according to the present invention.
  • 1397N represents the G1397 DddA tox splitter at the N-terminal side
  • 1397C represents the G1397 DddA tox splitter at the C-terminal side.
  • the boxed portion on the left represents the DNA sequence recognized by the fusion protein containing 1397N (left DdCBE), and the boxed portion on the right represents the DNA sequence recognized by the fusion protein containing 1397C (right DdCBE). It represents.
  • the efficiency of base correction is indicated by the degree of darkness.
  • the fact that the base position of the guanine (G) base is also marked as having been corrected indicates that the cytosine (C) base pairing at that position has been corrected.
  • FIG. 2 shows the results of base editing of the ND1 gene region of human mitochondria using TALED (TALE-linked deaminase) in an extracellular environment according to the present invention.
  • 1397N represents the G1397 DddA tox splitter at the N-terminal side
  • 1397C represents the G1397 DddA tox splitter at the C-terminal side.
  • the boxed part on the left represents the DNA sequence recognized by a fusion protein (left split TALED (sTALED)) containing the TALE protein linked to 1397C and TadA8e
  • the boxed part on the right shows the TALE protein linked to 1397N. It represents the DNA sequence recognized by the fusion protein (right split TALED (sTALED)) containing.
  • the efficiency of base correction is indicated by the degree of darkness.
  • the fact that the base position of the thymine (T) base is also marked as having been corrected indicates that the adenine (A) base that forms the base pair at that position has been corrected.
  • the proofreading of the cytosine (C) base is the result of C-to-T proofreading due to the DddA tox contained in TALED, and the indication that the guanine (G) base position has been base-corrected is the cytosine (base pairing at that position).
  • C) Indicates that the base has been corrected.
  • Figure 3 shows the results of C-to-T correction using DdCBE and A-to-G correction using TALED for the ND1 gene region of human mitochondria in the extracellular environment according to the present invention, and the results of A-to-G correction in HEK293T cells This compares the results of C-to-T correction using the same DdCBE and the results of A-to-G correction using the same TALED.
  • IVTT indicates that base correction was performed using the extracellular test method according to the present invention
  • HEK293T indicates that base correction was performed using HEK293T cells.
  • Figure 4 shows the C-to-T correction efficiency obtained using DdCBE and the A-to-G correction efficiency obtained using TALED targeting the ND1 gene region of human mitochondria in the extracellular environment according to the present invention
  • the A bar graph compares the C-to-T correction efficiency obtained by applying the same DdCBE and the A-to-G correction efficiency obtained by applying the same TALED.
  • FIG. 5 shows the G3460A mutation (a mutation in which the 3460th base of the mitochondria is A rather than G) constituting the ND1 gene of the mitochondria of a patient with Leber's hereditary optic neuropathy (LHON) using TALED in an extracellular environment according to the present invention.
  • LHON Leber's hereditary optic neuropathy
  • m.A3460G means that A-to-G correction is performed for the G3460A mutation.
  • 1397N represents the G1397 DddA tox splitter at the N-terminal side
  • 1397C represents the G1397 DddA tox splitter at the C-terminal side.
  • the boxed portion on the left represents the DNA sequence recognized by the fusion protein (17 C or 18 C) containing TALE, 1397C, and TadA8e
  • the boxed portion on the right represents the fusion protein containing TALE and 1397N.
  • (56 N or 57 N) shows the recognized DNA sequence.
  • the boxed "A” represents the G3460A mutation, and the degree of darkness indicates the efficiency of base correction.
  • the bar graph on the right shows the 3460A ⁇ G calibration efficiency.
  • Figure 6 shows the results of A-to-G base correction for the G3460A mutation constituting the ND1 gene in the mitochondria of a LHON patient using TALED in UDC cells.
  • 1397N represents the G1397 DddA tox splitter at the N-terminal side
  • 1397C represents the G1397 DddA tox splitter at the C-terminal side.
  • the boxed portion on the left represents the DNA sequence recognized by the fusion protein (17 C or 18 C) containing TALE, 1397C, and TadA8e
  • the boxed portion on the right represents the fusion protein containing TALE and 1397N.
  • (56 N or 57 N) shows the recognized DNA sequence.
  • the boxed "A" represents the G3460A mutation, and the degree of darkness indicates the efficiency of base correction.
  • the bar graph on the right shows the 3460A ⁇ G calibration efficiency.
  • Figure 7 is a bar graph showing the extracellular base proofreading efficiency obtained using fusion protein 17 C and fusion protein 57 N shown in Figure 5 as base editors, and the intracellular base proofreading efficiency obtained using the same base editor shown in Figure 6. It is compared.
  • Figure 8 is a bar graph showing the extracellular base proofreading efficiency obtained using fusion protein 18 C and fusion protein 56 N shown in Figure 5 as base editors, and the intracellular base proofreading efficiency obtained using the same base editor shown in Figure 6. It is compared.
  • Figure 9 is a bar graph showing the extracellular base proofreading efficiency obtained using fusion protein 18 C and fusion protein 57 N shown in Figure 5 as base editors, and the intracellular base proofreading efficiency obtained using the same base editor shown in Figure 6. It is compared.
  • Figure 10 is a bar graph comparing the 3460A ⁇ G base correction efficiency obtained using the base editors shown in Figure 5 with the 3460A ⁇ G base correction efficiency obtained using the same base editors shown in Figure 6.
  • genomic targets include, but are not limited to, genes, promoters, open reading frames, or any nucleic acid sequence.
  • base editor As used herein, the terms “base editor,” “base editing system,” and “base editing system” are interchangeable and refer to a substance that has the activity of altering the nucleic acid sequence by selective mutation of the genomic target. , contains a combination of one or more different base editors.
  • base editor may be in the form of a polypeptide (which may be a fusion protein) or a polynucleotide, or a combination thereof, depending on the context, and may include one or more It may be a composition comprising a polypeptide (which may be a fusion protein) or a polynucleotide, or a combination thereof.
  • base correction system or “base correction composition” as used herein may include one base editor or a combination of two or more different base editors, wherein the different base editors may be used simultaneously. It can also be used separately.
  • a base correction protein which is also called a “fusion protein” because it includes at least a DNA binding protein and a base-conversion protein.
  • the “base correction system” or “base editor” used in the extracellular test method according to the present invention may be in the form of one or more fusion proteins, or may be in the form of polynucleotides (DNA or mRNA) encoding the one or more fusion proteins. , it may be a combination of a protein and a polynucleotide (for example, if it includes a base correction protein (fusion protein) and a guide RNA).
  • target refers to a previously identified nucleic acid sequence of any composition and/or length.
  • target sites include, but are not limited to, genes, promoters, open reading frames, or any nucleic acid sequence.
  • the terms “cell free, in vitro,” “extracellular test tube environment,” or “extracellular” refer to a test tube environment that does not use cells (including tissues, organs, and organisms containing cells).
  • the term “extracellular test method” used herein refers to a test method that does not use cells (including tissues, organs, and organisms containing cells).
  • the term “in vitro coupled transcription/translation”, “IVTT” or “in vitro transcription and translation reaction” means that a polynucleotide (DNA or mRNA) encoding a base correction protein in the "extracellular in vitro environment” It refers to a system that exerts base proofreading activity as a functional base proofreading protein after transcription or transcription and translation.
  • step (b) sequencing the DNA obtained from step (a) to measure the base correction activity of the base correction system
  • Information provided according to the above method may be the ability of the base correction system to correct DNA mutations.
  • the term “ability to correct DNA mutations” used herein refers to the ability to correct DNA mutations within actual cells.
  • the information regarding the “ability to correct DNA mutation” may be qualitative information about whether or not it causes the DNA mutation (or off-target mutation) of interest. It may be quantitative information about how much it causes.
  • the quantitative information is, for example, 0.5% or more, 1% or more, 2% or more, 3% or more, 4% or more, 5% or more, 6% or more, 7% or more, 8% or more, 9% or more and 10%. This means that DNA bases are corrected with an efficiency of more than 11%, more than 12%, more than 13%, more than 14%, more than 15%, more than 16%, more than 17%, more than 18%, more than 19%, or more than 20%. You can.
  • Base correction efficiency can be expressed as a percentage of sequencing reads that reflect the results of base correction among the total sequencing read results for DNA on which base correction was performed, and can also be expressed as base correction frequency.
  • the method of providing information regarding the ability of the base correction system according to the present invention to correct DNA mutations may be part of a method of screening base editors that can be used in actual cells.
  • the present invention can provide a method for screening base editors capable of correcting target DNA mutations in cells, including the following steps.
  • step (b) sequencing the DNA molecules obtained from step (a) to measure the base correction activity of the candidate base editors
  • step (d) Based on the information obtained from step (c), selecting a base editor capable of correcting the same DNA mutation within the cell.
  • measurement encompasses not only quantitatively determining the frequency at which a base mutation occurs, but also qualitatively confirming whether a base mutation has occurred. Whether a nucleotide mutation has occurred can typically be confirmed through DNA sequencing techniques widely known in the field of biotechnology.
  • the isolated DNA containing the target DNA mutation when the isolated DNA containing the target DNA mutation is contacted with one or more base correction proteins used in the base correction system in the extracellular environment, the isolated DNA containing the target DNA mutation and the base correction protein are each used as reactants.
  • a polynucleotide encoding a base correction protein is mixed with the isolated DNA containing the target DNA mutation in the form of DNA or mRNA (or a vector containing the same), resulting in in vitro transcription. and/or a base correction protein obtained as a product of the translation process reacts with the target DNA.
  • the step of contacting isolated DNA containing a target DNA mutation with a base correction protein comprises: It may involve mixing the modified DNA with one or more polynucleotides encoding one or more base correction proteins, and the polynucleotides (including DNA or mRNA) are transcribed and translated outside the cell.
  • the base correction protein used in the present invention is in the form of a polynucleotide (including DNA or mRNA) or a vector containing the same and is mixed with the target DNA in one reaction tube to express the base correction protein and correct the DNA base without a separate protein purification process. It can be used in reactions for.
  • an expression plasmid may be used, and the plasmid may include, for example, a T7 promoter or an SP6 promoter, but is not limited thereto.
  • the above method can be performed without separately purifying the synthesized protein after mixing plasmid DNA and target DNA with reactants for in vitro transcription and translation in one reaction tube. Expression of base correction proteins and DNA base correction can be accomplished through a one-pot reaction in one tube.
  • the reaction system for extracellular testing may include factors and enzymes for in vitro transcription and translation reactions, other enzymes required for the reaction system, various substrates, buffers and salts, and may also be used in the DNA proofreading process. Enzymes and reactants associated with necessary DNA replication may be added. Components included in the reaction system include, for example, DNA polymerase, RNA polymerase, NTPs (ribonucleotide triphosphates) for the four bases (adenine, cytosine, guanine and uracil), cap analogs, and ribonucleates.
  • Clease inhibitors protease inhibitors, amino acid mixtures, tRNA, aminoacyl-tRNA synthetase, methionyl-tRNA transformylase, ribosomes containing rRNA, initiation factors, elongation factors, termination factors. It may contain one or more selected from (termination factor), pyrophosphatase, MgCl 2 , antioxidants, buffers, polyamines, etc., and all or part of the above components (especially components required for protein synthesis) are for cell use. It may also be provided in the form of bacterial material (eg, reticulocyte lysate).
  • bacterial material eg, reticulocyte lysate
  • Transcription and translation reactions that can be used in the extracellular test method according to the present invention can be performed under commonly known reaction conditions.
  • the reaction can be performed at a temperature of 20-40oC for 4-20 hours, preferably at 30oC for 6 hours and then at 37oC for 16 hours.
  • enzymes for transcription or translation reactions include enzymes for energy regeneration in reaction systems such as creatine kinase, myokinase, and nucleoside diphosphate kinases, and inorganic pyrophosphatases for transcription or translation. Enzymes that hydrolyze the inorganic pyrophosphate formed during the reaction may be included, but are not limited thereto.
  • Examples of various substrates include, but are not limited to, normal amino acids, nucleotide triphosphate, which is an energy source, creatine phosphate, and formyl folate.
  • Nucleotide triphosphates include ATP, GTP, CTP, and UTP.
  • the buffer solution may be, for example, potassium phosphate buffer solution, but is not limited thereto.
  • Salts include, but are not limited to, potassium glutamate, ammonium chloride, magnesium acetate, calcium chloride, putrescine, spermidine, and dithiothreitol.
  • the step of contacting isolated DNA containing a target DNA mutation with a base correction protein includes a process in which the target DNA mutation is corrected by the base correction protein.
  • the base proofreading reaction is performed by contacting the base proofreading protein with the target DNA and then carrying out a DNA replication process.
  • the base correction protein used in the extracellular test method according to the present invention is provided in the form of a polynucleotide (including DNA or mRNA) or a vector containing the same
  • expression of the base correction protein and DNA base correction are performed in one tube. This can be done through a one-pot reaction. For example, after completing the reaction for in vitro transcription and translation reaction, the tube in which the reaction has been completed can be directly applied to the PCR process.
  • the step of contacting isolated DNA containing the target DNA mutation with a base correction protein includes the target DNA mutation outside the cell. This may involve directly mixing isolated DNA with a base-correcting protein.
  • the step of contacting isolated DNA containing a target DNA mutation with a base correction protein includes a process in which the target DNA mutation is corrected by the base correction protein.
  • the base proofreading reaction is performed by contacting the base proofreading protein with the target DNA and then carrying out a DNA replication process.
  • the base correction protein used in the present invention is expressed separately and/or mixed with the target DNA in purified form.
  • Methods for expressing and purifying base-correction proteins are well known to those skilled in the art of biotechnology.
  • kits for use in the extracellular base proofreading ability test method according to the present invention.
  • the kit may contain factors and enzymes for in vitro transcription and translation reactions, other enzymes required for the reaction system, various substrates, buffers, and salts, and may also contain enzymes and reactants related to DNA replication required for the DNA proofreading process. It can be.
  • Components included in the kit include, for example, DNA polymerase, RNA polymerase, NTPs (ribonucleotide triphosphates) for the four bases (adenine, cytosine, guanine and uracil), cap analogs, and ribonuclease.
  • the extracellular test method according to the present invention is performed by mixing DNA encoding base correction protein(s) used as a base correction system with the kit composition, and then under reaction conditions allowing DNA transcription and translation, and DNA base correction. It may involve reacting.
  • reaction products including base-corrected DNA obtained through a proofreading reaction with a base-correction protein are directly subjected to the base-correction activity measurement step through sequencing without separate purification ( It may be used in step (b)) above.
  • a DNA sequencing method common techniques widely known in the field of biotechnology, such as targeted deep sequencing or Sanger sequencing, can be used.
  • the results of correcting bases in an extracellular environment without using cells and measuring the base correction results were virtually identical to the results of measuring the base correction results after performing base correction within cells. It was confirmed experimentally.
  • the fact that the base correction results are substantially the same means that the presence and/or frequency of base correction according to the base sequence is the same.
  • the base sequence that was confirmed to be corrected when the base was corrected in the extracellular environment was also corrected in the same way when the base was corrected within the actual cell.
  • nucleotide sequences in which base correction was performed at a relatively high frequency in the extracellular environment also underwent base correction at a relatively high frequency when base correction was performed within the actual cell.
  • the IVTT system of the present invention has the advantage of being simpler and time-saving than experiments using cells. Even for the purpose of developing a treatment, mutated cells are generally required, and the methods and conditions for transfecting gene correction materials into cells often vary depending on the cell. On the other hand, using the IVTT system of the present invention, mutated DNA can be produced directly, and the transfection process is omitted, so there is no need to optimize conditions.
  • the target DNA used in the present invention may contain one or more single nucleotide genetic mutations. Confirming the base correction ability of a base correction system to correct inherited single base mutations is particularly difficult because cells must be isolated from plants or animals (e.g., patients with genetic diseases) with the genetic mutation in question. Therefore, the effect of being able to confirm substantially the same proofreading activity as when base proofreading was performed within the cell even by performing only the extracellular test method according to the present invention is particularly useful in developing technology to correct genetic mutations such as those in genetic diseases. can do.
  • Isolated target DNA used in the present invention may be nuclear DNA or organelle DNA.
  • the organelle DNA may be mitochondrial DNA or chloroplast DNA, and may be extracted from animal or plant cells and amplified or synthesized.
  • the isolated target DNA may be nuclear DNA or mitochondrial DNA of a human with a genetic disease. Methods for extracting and amplifying double-stranded DNA from cells or chemically synthesizing it based on its sequence are widely known to those skilled in the biotechnology field.
  • the base proofreading system which can measure base proofreading ability through the extracellular test method according to the present invention, has the activity of proofreading the adenine (A) base to guanine (G), cytosine (C), or thymine (T), Has the activity of correcting a guanine (G) base to adenine (A), cytosine (C), or thymine (T), or correcting a cytosine (C) base to adenine (A), guanine (G), or thymine (T) It may have an activity to correct a thymine (T) base to adenine (A), guanine (G), or cytosine (C), or it may have one or more of these activities.
  • the base correction system that can measure base correction ability through the extracellular test method according to the present invention has the activity of correcting adenine (A) base to guanine (G) or cytosine (C) base. It may have correction activity with thymine (T) or may have both activities.
  • A adenine
  • G guanine
  • C cytosine
  • T thymine
  • One or more base correction proteins included in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention may each independently include one or more base-converting enzymes.
  • the base correction protein included in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention is characterized in that it does not cause double-strand breaks in the target DNA.
  • base-conversion enzyme catalyzes a reaction that converts a substituent of a purine or pyrimidine ring of a DNA base to another group or atom, or removes a DNA base by hydrolyzing the N-glycosidic bond of DNA. refers to an enzyme that catalyzes a reaction and is involved in the process of eventually converting (correcting) a target base to another type of base (via DNA replication and/or repair machinery).
  • a type of base-conversion enzyme that catalyzes the reaction of converting a substituent on a purine or pyrimidine ring of a DNA base to another group or atom includes deaminase, which removes a DNA base by hydrolyzing the N-glycosidic bond of DNA.
  • Types of base-transfer enzymes that catalyze this reaction include DNA glycosylase.
  • one or more base correction proteins that may be included in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention may each independently include cytosine deaminase and/or adenine deaminase as base-transfer enzymes. You can.
  • Cytosine deaminase that can be used in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention refers to any deamination enzyme that has the activity of converting cytosine base to uridine, and is used in algae and bacteria. , may be derived from or modified (e.g., engineered or evolved) from any organism (e.g., eukaryote or prokaryote), including but not limited to fungi, plants, invertebrates, and mammals. there is.
  • APOBEC apolipoprotein B editing complex
  • AID activation-induced deaminase
  • cytosine deaminase derived from or mutated from TadA (tRNA-specific adenosine deaminase), a bacterial adenine deaminase, or its ortholog.
  • a cytosine deaminase derived from or mutated from DddA a bacterial cytosine deaminase, or an ortholog thereof, or a fragment thereof.
  • Cytosine deaminase mutated from the above-mentioned TadA is, for example, 6, 26, 27, 28, 46, 48, 49, 61, 74, 76, 77, 82, 96, 107 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • one or more of amino acid residues 108, 112, 114, 115, 119, 122, 127, 142, 143, 151, 154, and 158 may be mutated to another amino acid.
  • it may be a polypeptide in which the 27th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is mutated to lysine, the 28th amino acid is mutated to alanine, the 61st amino acid is mutated to isoleucine, and the 96th amino acid is mutated to asparagine.
  • composition of cytosine deaminase that can be used in the present invention contents already known before this application, including International Patent Application Publication WO 2022/060185, WO 2023/086953, etc., which are incorporated by reference in their entirety. may be quoted.
  • cytosine deaminase When cytosine deaminase is included in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention, cytosine deaminase may be included in the form of a first fragment and a second fragment, and may be full-length. ) may be included in the form of. When it has the form of a first cleavage body and a second cleavage body, the first cleavage body and the second cleavage body each have a form linked to different DNA binding proteins.
  • the cytosine deaminase used in the present invention may be DddA tox .
  • DddA tox is a part of the bacterial toxin derived from Burkholderia cenocepacia that exerts an enzymatic function and can deaminate cytosine in double-stranded DNA.
  • DddA tox may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 wild-type DddA tox
  • DddA tox Since DddA tox is toxic to cells, it can be divided into two inactivated splits, i.e., a first split and a second split, to avoid toxicity in host cells.
  • a first split and a second split When the cytosine deaminase used in the present invention is used in the form of a first fragment and a second fragment, each of the first fragment and the second fragment has no deamination activity.
  • the first division of the DddA tox cytosine deaminase may include sequences from the N terminus to G33, G44, A54, N68, G82, N98, or G108 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the second division may include a sequence from G34, P45, G55, N69, T83, A99, or A109 to the C terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the first fragment of DddA tox cytosine deaminase includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 from the N terminus to G44 (SEQ ID NO: 3 below), and the second fragment includes the amino acid sequence from P45 to the C terminus. It may include a sequence (SEQ ID NO: 4 below).
  • SEQ ID NO: 3 wild-type DddA tox G1333-N
  • SEQ ID NO: 4 wild-type DddA tox G1333-C
  • the first fragment of DddA tox cytosine deaminase includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 from the N terminus to G108 (SEQ ID NO: 5 below), and the second fragment includes the amino acid sequence from A109 to the C terminus. It may also include a sequence (SEQ ID NO: 6 below).
  • SEQ ID NO: 5 wild-type DddA tox G1397-N
  • SEQ ID NO: 6 wild-type DddA tox G1397-C
  • the first and second fragments of DddA tox are used as cytosine deaminase
  • one or more amino acids located on the surface where the first fragment and the second fragment of cytosine deaminase bind to each other are replaced with another amino acid.
  • the first and second fragments of DddA tox may include the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 (G1333-N) and SEQ ID NO: 4 (G1333-C), respectively.
  • SEQ ID NO: 3 One or more selected from the group consisting of positions 3, 5, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 28, 30 and 31 or positions 13, 16, 17 of SEQ ID NO: 4, One or more amino acids selected from the group consisting of positions 20, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 56, 57, 58, and 60 may be substituted with other amino acids, but are not limited thereto.
  • the first fragment of DddA tox may include the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 (G1397-N) and SEQ ID NO: 6 (G1397-C), in which case 87, 88, and 91 of SEQ ID NO: 5.
  • amino acids selected from the group consisting of positions 92, 95, 100, 101, 102 and 103, or one or more amino acids selected from the group consisting of positions 13, 14, 15 and 16 of SEQ ID NO: 6 with another amino acid It may be substituted, but is not limited to this.
  • the “other amino acids” include alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, tryptophan, valine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, serine, threonine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, lysine, and the above.
  • variants of amino acids means an amino acid selected from amino acids other than those that the wild-type protein has at the original variant position.
  • the two pairs of DddA tox fragments, each linked to a DNA binding protein do not perform their function properly if they do not bind to DNA, resulting in a very efficient and non-targeted C-to-T correction. and can produce precise C-to-T correction.
  • the first split of DddA tox with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may be referred to as “G1397-N” or “G1397N”
  • the first split of DddA tox with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 2 split body which may be referred to as “G1397-C” or “G1397C”.
  • G1333-N may refer to the first fragment of wild-type DddA tox having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid variant thereof
  • G1333-C may refer to the second split of wild-type DddA tox having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid variant thereof.
  • G1397-N may refer to the first fragment of wild-type DddA tox having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7 or an amino acid variant thereof
  • G1397-C may refer to the second split of wild-type DddA tox having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or 8 or an amino acid variant thereof.
  • the cytosine deaminase used in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention may be used in full-length form, and the full-length cytosine deaminase (e.g., DddA tox ) used in this case is toxic.
  • the amino acid sequence has been modified to have no or low toxicity. Positively charged amino acids are specifically concentrated at the C-terminus of DddA tox . Because DNA has a negative charge, it binds to the positively charged amino acids of proteins. By substituting this positively charged amino acid, the binding force of DddA tox to DNA can be weakened, thereby reducing or eliminating intracellular toxicity.
  • This non-toxic full-length cytosine deaminase can be provided by substituting one or more, two or more, three or more, four or more, or five or more amino acids in the wild-type amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with other amino acids.
  • the "other amino acids” include alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, tryptophan, valine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, serine, threonine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, lysine, and the above.
  • it means an amino acid selected from amino acids other than those that the wild-type protein has at the original variant position.
  • the other amino acid may be alanine.
  • full-length cytosine deaminase variants that can be included in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention include substitution of S at position 37 with G and position 59 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It may have one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of substitution of G for S, substitution of A for V at position 109, and substitution of S for G at position 129.
  • full-length cytosine deaminase variants that can be included in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention include substitution of S at position 37 with G and position 59 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It may have all of the substitution of G with S, substitution of A with V at position 109, and substitution of S with G at position 129.
  • Adenine deaminase that can be used in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention refers to an amino group deaminase that has the activity of converting adenine base to hypoxanthine (or inosine as a nucleoside), Any organism (e.g., eukaryote or prokaryote), including but not limited to algae, bacteria, fungi, plants, invertebrates, and mammals, such as E. coli, S. aureus , S. typhi, S. putrefaciens, H. influenzae, or C. crescentus.
  • Any organism e.g., eukaryote or prokaryote
  • Any organism e.g., eukaryote or prokaryote
  • mammals such as E. coli, S. aureus , S. typhi, S. putrefaciens, H. influenzae, or C. crescent
  • Such adenine deaminase may be, for example, APOBEC, AID, or TadA, or variants thereof.
  • the above-mentioned TadA may be, for example, TadA8e (SEQ ID NO: 1) or a truncated form or variant thereof (eg, an improved or evolved variant applicable to deoxynucleotides).
  • the above-mentioned variants of TadA8e are, for example, 23, 28, 30, 36, 46, 48, 49, 51, 76, 82, 82, 84, 106, 108, 110, 111, 146, 147 of SEQ ID NO: 1 , one or more of amino acid residues 152, 154, 155, 156, and 157 may be mutated to another amino acid.
  • contents already known before this application including International Patent Application Publication WO 2022/060185, WO 2023/086953, etc., which are incorporated by reference in their entirety. may be quoted.
  • the adenine deaminase that can be used in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a conservative amino acid substitution thereof.
  • One or more base correction proteins included in the base correction system used in the extracellular test method according to the present invention may each independently include cytosine deaminase (or a fragment thereof) or adenine deaminase, or both. You can.
  • One or more base correction proteins included in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention are each independently zinc finger protein, TALE (transcriptional activator-like effector) protein, and CRISPR-related protein. It may comprise one or more DNA binding proteins selected from the group consisting of clease and CRISPR associated nickase.
  • the base correction protein included in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention is characterized in that it does not cause double-strand breaks in the target DNA.
  • one base editor includes a zinc finger protein, a TALE protein, a CRISPR-related nuclease, or a CRISPR-related nickase, and another The base editor may independently include a zinc finger protein, a TALE protein, a CRISPR associated nuclease, or a CRISPR associated nickase.
  • TALE proteins, CRISPR-associated nucleases and CRISPR-associated nickases the contents of this application include International Patent Application Publication Nos. WO 2022/060185 and WO 2022/017745, which are hereby incorporated by reference in their entirety. Information already known may be cited.
  • Zinc fingers are representative DNA-binding protein structures, forming the main DNA-binding protein motif, and the interaction between the ⁇ -helix of zinc fingers and the major groove of DNA ensures strong recognition of DNA sequences. It is specifically made possible.
  • One or more zinc finger motifs may be used in combination.
  • the DNA binding protein used in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention may be a TALE protein.
  • TALE proteins of the present invention refer to proteins that bind nucleotides in a sequence-specific manner through one or more TALE-repeat modules.
  • the TALE protein includes, but is not limited to, at least one TALE-repeat module, preferably 1 to 30 TALE-repeat modules.
  • TALE-repeat modules may be referred to as a "TALE array”
  • the expression “TALE protein” refers to a construct containing an N-terminal domain and a C-terminal domain (possibly including a half domain) on either side of the TALE array, respectively. do.
  • TALE means “TALE protein” unless otherwise indicated.
  • a single module TALE array or a multi-module TALE array e.g., a first TALE (or left TALE ) array and a dual module TALE array of a second TALE (or right TALE) array
  • a single module TALE array or a multi-module TALE array e.g., a first TALE (or left TALE ) array and a dual module TALE array of a second TALE (or right TALE) array
  • a base correction system that can be used in an extracellular test method according to the present invention includes two fusion proteins each comprising a TALE protein
  • the two fusion proteins each have a first TALE protein and a second TALE protein.
  • the first TALE protein and the second TALE protein each independently, directly or indirectly (e.g., via a linker and/or other protein component) one or more base-transfer enzymes, such as cytosine deaminase and adenine deaminase. Can be linked to at least one of the deaminase enzymes.
  • a first fusion protein (a fusion protein that binds to DNA in the 5' direction upstream of the base correction target site) comprising a first TALE protein (left TALE) includes a first fragment of cytosine deaminase;
  • a second fusion protein (fusion protein that binds downstream in the 3' direction from the base correction target site) containing a second TALE protein (righ TALE) may include a second split body of cytosine deaminase, and the first fusion protein (righ TALE) may include Either or both the fusion protein and the second fusion protein may include adenine deaminase.
  • the first fusion protein comprising a first TALE protein includes a second fragment of cytosine deaminase
  • the second fusion protein comprising a second TALE protein (right TALE) includes cytosine.
  • a first fragment of deaminase may be included, and adenine deaminase may be included in either or both of the first fusion protein and the second fusion protein.
  • a full-length form of cytosine deaminase may be included in either a first fusion protein comprising a first TALE protein and a second fusion protein comprising a second TALE protein, and the first fusion protein and Either or both second fusion proteins may include adenine deaminase.
  • the DNA binding protein used in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention may be a CRISPIR-associated protein called a “Cas protein”.
  • CRISPR system well known as a DNA editing tool, refers to a ribonucleoprotein complex in which the Cas protein and related RNA component(s) work together to recognize a specific base in DNA and perform the function of correcting that site.
  • CRISPR It is also called the “/Cas system”.
  • Cas protein refers to an essential protein component in the CRISPR/Cas system.
  • CRISPR-associated (cas) genes which encode Cas proteins, are often associated with CRISPR repeat-spacer arrays. More than 40 different Cas protein families have been described, and information on known Cas genes and proteins is available in, but is not limited to, GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Cas proteins may be isolated from microorganisms such as bacteria, or may be produced unnaturally, such as through recombinant synthesis or artificial synthesis.
  • the DNA binding protein used in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention may be a CRISPR-related nuclease.
  • CRISPR-associated nuclease refers to any Cas protein or variant thereof that has (endo)nuclease activity when forming a complex with a guide RNA.
  • the isolated DNA containing the target DNA mutation is combined with the base correction protein or a polynucleotide (DNA or mRNA) encoding the same.
  • guide RNA may be added together.
  • guide RNA refers to RNA that is specific to a target DNA, can form a complex with a Cas protein, and brings the Cas protein to the target DNA.
  • the guide RNA may be composed of two RNAs, that is, CRISPR RNA (crRNA) and transactivating crRNA (tracrRNA), or a single-stranded RNA (single-stranded RNA) produced by the fusion of essential parts of crRNA and tracrRNA. chain RNA, sgRNA).
  • the guide RNA may be a dual RNA including crRNA and tracrRNA. Any guide RNA can be used in the extracellular test method according to the present invention, provided that the guide RNA contains essential parts of crRNA and tracrRNA and a part complementary to the target.
  • the DNA binding protein used in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention may be a CRISPR-related nickase.
  • CRISPR-associated nickase refers to any Cas protein or variant thereof that has nickase activity when forming a complex with a guide RNA.
  • the CRISPR-related nickase used in the extracellular test method according to the present invention may be mutated to lose some or all of the endonuclease activity that cuts DNA double strands from existing Cas proteins and have nickase activity.
  • “Nickase” activity refers to the activity of cutting only one strand of a DNA molecule.
  • Such variants may be isolated from microorganisms such as bacteria, or may be created unnaturally, such as through recombinant synthesis or artificial synthesis.
  • a CRISPR-related nickase is used as part of a base correction protein in the extracellular test method according to the present invention
  • the isolated DNA containing the target DNA mutation is contacted with the base correction protein or a polynucleotide (DNA or mRNA) encoding the same.
  • reverse transcriptase or a polynucleotide (DNA or mRNA) encoding reverse transcriptase and guide RNA also called prime editing guide RNA
  • cytosine deaminase When a fusion protein comprising a DNA binding protein includes cytosine deaminase, cytosine deaminase may be added directly or indirectly to the N-terminus or C-terminus of the DNA binding protein (e.g., by a linker and/or other protein). components) can be connected. If adenine deaminase is included in a fusion protein comprising a DNA binding protein, adenine deaminase may be added directly or indirectly to the N-terminus or C-terminus of the TALE protein (e.g., as a linker and/or other protein component). elements) can be connected.
  • the adenine deaminase is directly connected to the N-terminus or C-terminus (preferably the C-terminus) of the cytosine deaminase. or indirectly (e.g., via linkers and/or other protein components).
  • fusion proteins When a base correction system that can be used in an extracellular assay according to the present invention includes two fusion proteins, the fusion proteins contain different protein components (e.g., a DNA binding protein and one or more base-transfer enzymes). ) may have a composition and arrangement. For example, a first fusion protein (a fusion protein that binds to DNA 5' upstream of the base correction target site) contains adenine deaminase, whereas a second fusion protein (a fusion protein that binds to DNA 3' upstream of the base correction target site) contains adenine deaminase. The fusion protein that binds to DNA downstream of) may not contain adenine deaminase, or vice versa.
  • a first fusion protein a fusion protein that binds to DNA 5' upstream of the base correction target site
  • a second fusion protein a fusion protein that binds to DNA 3' upstream of the base correction target site
  • a first fusion protein (a fusion protein that binds to DNA 5' upstream of the base correction target site) includes a TALE protein
  • a second fusion protein (a fusion protein that binds to DNA in the 3' direction downstream of the base correction target site) includes a TALE protein
  • fusion proteins that bind to DNA may contain zinc finger proteins, and vice versa.
  • the first fusion protein (a fusion protein that binds to DNA in the 5' direction upstream of the base correction target site) and the second fusion protein (a fusion protein that binds to DNA in the 3' direction downstream of the base correction target site) fusion proteins that bind to DNA) can take on independent arrangements.
  • adenine deaminase may be located after the C-terminus of cytosine deaminase
  • adenine deaminase may be located before the N-terminus of cytosine deaminase. It could be, or it could be the other way around.
  • the DNA binding protein may be located after the C-terminus of cytosine deaminase, whereas in a second fusion protein, the DNA binding protein may be located before the N-terminus of cytosine deaminase; , it could also be the other way around.
  • One or more fusion proteins included in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention may each independently further include UGI (uracil glycosylase inhibitor).
  • UGI can increase base correction efficiency by inhibiting the activity of UDG (uracil DNA glycosylase), an enzyme that repairs mutant DNA and catalyzes the removal of uracil (U) bases from DNA.
  • UDG uracil DNA glycosylase
  • U uracil DNA glycosylase
  • UGI uracil DNA glycosylase
  • its location may vary, for example directly at the C-terminus of cytosine deaminase or They may be linked indirectly (e.g., through linkers and/or other protein components), but are not limited to this.
  • One or more fusion proteins included in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention may each independently additionally include a nuclear export signal (NES).
  • the NES sequence may be any signal sequence that confers the ability to translocate outside the nucleus, and natural NES or artificially synthesized NES may be used. For example, it may be derived from MVM (mirute virus of mice), but is not limited thereto. If a NES is used in a base correction system that can be used in the extracellular assay according to the invention, its location may vary, for example directly or indirectly at the N-terminus of cytosine deaminase (e.g. , linkers and/or other protein components), but is not limited to this.
  • cytosine deaminase e.g. , linkers and/or other protein components
  • One or more fusion proteins included in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention may each independently additionally include a mitochondrial targeting sequence (MTS).
  • MTS mitochondrial targeting sequence
  • the MTS may be any signal sequence capable of translocating into mitochondria, and may be a natural MTS present at the N-terminus of various mitochondrial proteins, or an artificially synthesized MTS may also be used.
  • MTS mitochondrial targeting sequence
  • its location may vary, for example directly or indirectly at the N-terminus of a DNA binding protein or at the N-terminus of a NES. (e.g., via a linker and/or other protein component), but is not limited to this.
  • fusion protein refers to a polypeptide formed by combining two or more different polypeptides through peptide bonds.
  • the fusion protein included in the base correction system that can be used in the extracellular test method according to the present invention includes a DNA binding protein and a base-transfer enzyme, and may further include UGI and/or NES and/or MTS, These protein components can be connected through linkers or directly connected. Additionally, a tag sequence may be added as needed.
  • the method of designing and constructing the fusion protein (or polynucleotide encoding the fusion protein) may be any method known in the biotechnology field, and the polynucleotide may be inserted into a vector.
  • the present invention may relate to (1) to (44) below, but is not limited thereto.
  • a method of providing information regarding the ability of a base correction system to correct DNA mutations comprising the following steps:
  • step (b) sequencing the DNA obtained from step (a) to measure the base correction activity of the base correction system
  • step (a) mixes isolated DNA containing a target DNA mutation with one or more polynucleotides encoding the one or more base correction proteins, and the polynucleotides are transcribed and translated extracellularly. A method that entails becoming.
  • step (a) (4) The method according to any one of (1) to (3), wherein expressing the base correction protein and correcting the DNA base in step (a) is performed through a one-pot reaction.
  • step (a) involves mixing isolated DNA containing the target DNA mutation and a base correction protein outside the cell.
  • step (a) The method according to any one of (1) to (5), wherein the reaction product of step (a) is used in step (b) without further purification.
  • organelle DNA is mitochondrial DNA or chloroplast DNA.
  • the one or more base correction proteins are each independently a zinc finger protein, a transcriptional activator-like effector (TALE) protein, or a CRISPR-related protein.
  • TALE transcriptional activator-like effector
  • a method comprising at least one DNA binding protein selected from the group consisting of clease and CRISPR associated nickase.
  • step (a) The method of (13), wherein the one or more DNA binding proteins comprise a CRISPR associated nuclease, and in step (a) the guide RNA is further contacted with the isolated DNA containing the target DNA variant.
  • step (a) The method of (13), wherein the one or more DNA binding proteins comprise a CRISPR-associated nickase, and in step (a) the reverse transcriptase or polynucleotide encoding the reverse transcriptase and the guide RNA are isolated comprising the target DNA mutation.
  • step (a) the reverse transcriptase or polynucleotide encoding the reverse transcriptase and the guide RNA are isolated comprising the target DNA mutation.
  • each of the candidate base editors independently includes one or more base correction proteins or one or more polynucleotides encoding the same. the steps to do;
  • step (b) sequencing the DNA molecules obtained from step (a) to measure the base correction activity of the candidate base editors
  • step (d) Based on the information obtained from step (c), selecting a base editor capable of correcting the same DNA mutation within the cell.
  • step (21) The method of (21), wherein step (a) mixes isolated DNA containing a target DNA mutation with one or more polynucleotides encoding the one or more base correction proteins, and the polynucleotides are transcribed and translated extracellularly. A method that entails becoming.
  • step (a) involves mixing isolated DNA containing the target DNA mutation with a base correction protein in an extracellular manner.
  • (31) The method according to any one of (21) to (30), wherein the isolated DNA containing the target DNA mutation is nuclear DNA or mitochondrial DNA of a human with a genetic disease.
  • (32) The method of any one of (21) to (31), wherein the base correction is correcting an adenine (A) base to guanine (G), a cytosine (C) base to a thymine (T) base, or both. How to do it all.
  • the base correction is correcting an adenine (A) base to guanine (G), a cytosine (C) base to a thymine (T) base, or both. How to do it all.
  • the one or more base correction proteins are each independently a zinc finger protein, a transcriptional activator-like effector (TALE) protein, or a CRISPR-related protein.
  • TALE transcriptional activator-like effector
  • a method comprising at least one DNA binding protein selected from the group consisting of clease and CRISPR associated nickase.
  • step (a) The method of (33), wherein the one or more DNA binding proteins comprise a CRISPR associated nuclease, and in step (a) the guide RNA is further contacted with the isolated DNA containing the target DNA variant.
  • step (35) The method of (33), wherein the one or more DNA binding proteins comprise a CRISPR-associated nickase, and in step (a) the reverse transcriptase or polynucleotide encoding the reverse transcriptase and the guide RNA are isolated comprising the target DNA mutation.
  • step (a) the reverse transcriptase or polynucleotide encoding the reverse transcriptase and the guide RNA are isolated comprising the target DNA mutation.
  • a method in which further contact is made with DNA.
  • (36) The method of (36), wherein one or more base-converting enzymes are each independently APOBEC (apolipoprotein B editing complex), AID (activation-induced deaminase), TadA (tRNA-specific adenosine deaminase), or DddA tox , or a variant thereof.
  • APOBEC apolipoprotein B editing complex
  • AID activation-induced deaminase
  • TadA tRNA-specific adenosine deaminase
  • DddA tox or a variant thereof.
  • step (a) The method of any one of (1) to (40), wherein DNA polymerase, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphate mixture, amino acid mixture, tRNA, ribosome containing rRNA, initiation factor, elongation factor, termination factor and a buffer solution is used in step (a).
  • a double-stranded DNA sequence mimicking the human mitochondrial ND1 gene was synthesized as a gBlock DNA fragment from IDT (Integrated DNA Technologies).
  • the sequence of the obtained template DNA is as follows.
  • the template DNA was amplified using a forward primer (TACTATTGCCAGCATTGCTGC) and a reverse primer (CTGTGCATCGTGCACATCT) and then purified using a PCR purification kit (Geneall). Just before the experiment, it was used freshly diluted in distilled water to 10 ng/ ⁇ l.
  • Example 2 In vitro transcription and translation (IVTT) and base proofreading
  • template DNA (1 ng, 5 ng or 10 ng), 0.5 ⁇ g of plasmid containing DNA encoding left DdCBE (or sTALED), and right DdCBE (or sTALED) were quantified at 10 ng/ ⁇ L.
  • a reaction mixture containing 0.5 ⁇ g of plasmid containing DNA encoding and 20 ⁇ L of in vitro coupled transcription/translation (IVTT) kit mixture (including distilled water up to 25 ⁇ L) was mixed in a tube and reacted at 30°C for 6 hours. Then reacted at 37°C for 16 hours.
  • IVTT in vitro coupled transcription/translation
  • the IVTT kit used is TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega) and TNT® Quick Master Mix containing TNT® Rabbit Reticulocyte Lysate, TNT® Reaction Buffer, TNT® RNA Polymerase, Amino Acid Mixture, and RNasin® Ribonuclease Inhibitor. used.
  • the amino acid sequences of left DdCBE and sTALED, and right DdCBE and sTALED are as follows.
  • the proteins used are located between the T7 promoter (TAATACGACTCACTATAG) and the termination sequence.
  • the reaction product obtained in Example 2 was used as a template without purification, and the sequence was analyzed using targeted deep sequencing technique (Sanger sequencing technique can be used for sequencing). At this time, the template was amplified using a DNA polymerase with error tolerance of uracil or hypoxanthine (inosine as a nucleoside).
  • the obtained base correction results are shown in Figures 1 and 2.
  • the base correction results in Figure 1 were obtained by using the left DdCBE and right DdCBE as base editors, and the base correction results in Figure 2 were obtained by using the left sTALED and right sTALED as base editors.
  • HEK293T cells were cultured in TC-Treated Multiple Well Plates (Corning) in DMEM (Welgene) containing 10% fetal bovine serum (Welgene) and 1% antibiotic-antimycotic solution at 37°C in 5% CO 2 . It was maintained and cultured.
  • HEK293T cells were distributed in a 48-well plate at 0.75 After mixing 0.5 ⁇ g, 25 ⁇ l of Opti-MEM was added (mixture 1). Afterwards, 1.5 ⁇ l of lipofectamine 2000 and 25 ⁇ l of Opti-MEM were mixed (mixture 2). Mixture 1 and mixture 2 were mixed at a 1:1 volume ratio and incubated at room temperature for 15 minutes.
  • Example 3 50 ⁇ l of culture was added to each well, and after culturing for 4 days, the cell culture medium was removed.
  • Cell lysis was performed by adding 100 ⁇ l of cell lysis buffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.05% SDS, and 1:20 volume ratio of Proteinase K) per well. Afterwards, it was incubated at 50°C for 1 hour and 80°C for 20 minutes and then stored at 4°C. It was amplified with deep-sequencing primers that can distinguish only mitochondrial DNA and then sequenced. The obtained base correction results were compared with the base correction results obtained through the extracellular test method in Example 3 (FIGS. 3 and 4).
  • a double-stranded DNA sequence with the G3460A mutation was synthesized from IDT (Integrated DNA Technologies) as a gBlock DNA fragment.
  • the sequence of the obtained template DNA is as follows.
  • Template DNA was amplified by PCR using forward primer (CTTCAAGGACGACGGCAACCTAGGCTATATACAACTACGC) and reverse primer (TGAAGTTCACCTTGATGCCGCTAAGGTCGGGGCGGTGATG) and then purified with PCR SV mini kit (Geneall). Just before the experiment, it was used freshly diluted in distilled water to 10 ng/ ⁇ l.
  • TALED containing the T7 promoter (TAATACGACTCACTATAG) was constructed. Specifically, the TAL effector array plasmid and expression plasmid were produced using the Golden-Gate cloning system. Competent DH5 ⁇ (enzynomics) E. coli cells were transformed by heat shock (42°C), and single colonies were cultured in LB medium at 37°C overnight with shaking. Plasmid DNA was purified using the Plasmid SV mini kit (GeneAll) according to the manufacturer's protocol. The purified plasmid DNA, or TALED, was sequenced using sanger sequencing (Macrogen).
  • amino acid sequences of the produced base-correction proteins are as follows.
  • Example 7 In vitro transcription and translation (IVTT) and base correction for m.A3460G correction
  • Example 5 After quantifying the template DNA obtained in Example 5 at 10 ng/ ⁇ L, 10 ng of template DNA, 0.5 ⁇ g of plasmid containing DNA encoding a base-correction protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or 14, and SEQ ID NO: 15 or A reaction mixture containing 0.5 ⁇ g of a plasmid containing DNA encoding a base-correction protein with an amino acid sequence of 16 and 20 ⁇ L of in vitro coupled transcription/translation (IVTT) kit mixture (containing distilled water up to 25 ⁇ L) was mixed in a tube. The reaction was carried out at 30°C for 6 hours and then at 37°C for 16 hours.
  • IVTT in vitro coupled transcription/translation
  • the IVTT kit used is TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega) and TNT® Quick Master Mix containing TNT®Rabbit Reticulocyte Lysate, TNT® Reaction Buffer, TNT® RNA Polymerase, Amino Acid Mixture, and RNasin® Ribonuclease Inhibitor. used.
  • Example 8 Intracellular base correction for m.A3460G correction
  • 250 ng of the plasmid encoding the base-correction protein 17 C or 18 C and 250 ng of the plasmid encoding the base-correction protein 56 N or 57 N were transfected using Lipofectamine LTX reagent (Invitrogen). Then, it was placed in a pre-seeded 96-well plate. The transfected cells were maintained at 37°C in 5% CO 2 while changing the culture medium.
  • Transfected UDC cells were lysed in lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4 (Welgene), 1mM EDTA pH 8.0 (Welgene), 0.005% sodium dodecyl sulfate (Welgene), and Proteinase K (Qiagen) at a 1:20 volume ratio. )) was added at 100 ⁇ l per well, incubated in a PCR machine at 50°C for 1 hour, 80°C for 20 minutes, and stored at 4°C.
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.4 (Welgene), 1mM EDTA pH 8.0 (Welgene), 0.005% sodium dodecyl sulfate (Welgene), and Proteinase K (Qiagen) at a 1:20 volume ratio.
  • RNA lysis was used as a template without purification, and the sequence was analyzed using targeted deep sequencing to analyze the base correction rate of the target region.
  • PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (TAKARA) was used to perform nested primary PCR with deep-sequencing primers that can distinguish only mitochondrial DNA, and secondary PCR was performed using the primary PCR as a template, and index-containing A third PCR was performed using primers to add the final index sequence.
  • the third PCR reaction to which the index sequence was added was purified using the PCR SV mini kit (GeneAll), and paired-end sequencing was performed using the MiniSeq system (Illumina) using the MiniSeq Mid Output Kit (Illumina).
  • the obtained base correction results are shown in Figure 6 and compared with the base correction results obtained through the extracellular test method obtained in Example 7 ( Figures 7 to 10).
  • Figure 10 it was confirmed that all of the base editors whose on-target correction ability for the G3460A mutation was confirmed through extracellular testing demonstrated the same on-target correction ability in intracellular experiments.
  • Figures 7 to 9 it was confirmed that not only on-target proofreading ability but also bystander (non-target) base proofreading efficiency showed similar trends between the extracellular test method and the intracellular test method.

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Abstract

본 발명은 세포외 시험관 환경(cell-free, in vitro system)에서 유전체 에디팅을 시험할 수 있는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 진핵세포를 사용하지 않고 별도의 복잡한 실험 과정 없이 염기 에디터에 의한 타겟 DNA 변이를 확인하고 정량할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명을 사용함으로써, 세포를 사용하지 않고 별도의 복잡한 실험 과정 없이 염기 에디터에 의한 타겟 DNA 변이를 확인하고 정량할 수 있다. 또한, 간편한 세포외 시험법을 통해 실제 세포 내에서 타겟 DNA 변이를 교정할 수 있는 능력을 갖춘 염기 에디터를 스크리닝할 수 있다.

Description

염기 에디터의 염기 교정 능력을 측정하는 세포외 시험법
본 발명은 세포외 시험관 환경(cell-free, in vitro system)에서 유전체 염기 에디팅을 시험할 수 있는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 세포를 사용하지 않고 별도의 복잡한 실험 과정 없이 염기 에디터에 의한 타겟 DNA 변이를 확인하고 정량할 수 있는 방법이다. 타겟 DNA는 세포로부터 증폭하여 사용할 수 있으나, 보다 유용하게는 이중가닥 DNA 합성을 통해 염기 에디팅을 필요로 하는 생물체(예를 들어 유전병 환자)의 돌연변이 DNA를 모방하여 사용할 수 있다. 특정 돌연변이를 지닌 세포주 또는 모델 동물 없이 DNA 에디팅 효율을 측정함으로써 아데닌 염기 에디터, 시토신 염기 에디터, DdCBE(DddA-derived cytosine base editor), TALED(TALE-linked deaminase), 징크 핑거 탈아미노효소(ZFD(zinc finger deaminase)), CRISPR 시스템 등 다양한 염기 에디터들의 염기 교정 능력에 관한 일차적 시험법으로 사용될 수 있다.
게놈 에디팅의 도구로 사용되는 여러 단백질들이 있다. 예를 들어, 염기 에디팅은 Cas9 닉카제(nickase)(nCas9), 촉매능력이 죽은 Cas9(dCas9) 등에 탈아미노효소(deaminase)와 같은 염기-전환 효소(base-converting enzyme)를 연결한 융합단백질을 이용해 이중가닥 절단(double-strand break(DSB))를 일으키지 않고, 예를 들어 A-to-G(아데닌 염기 에디터) 또는 C-to-T(시토신 염기 에디터)와 같은 단일 염기 변이를 유도한다. 프라임 에디팅은 nCas9에 역전사효소를 연결한 융합단백질과 RNA 주형을 포함한 프라임 에디팅 가이드 RNA(pegRNA)를 이용해서 핵 DNA의 특정 위치에 염기 변이와 작은 삽입 또는 결실(인델(indel))을 포함해 다양한 맞춤 변이를 유도하는데 사용된다. 또한, DdCBE 및 TALED 기술은 핵 DNA 뿐 아니라, 세포 소기관 DNA의 시토신 또는 아데닌 염기를 에디팅하여 티민 혹은 구아닌으로 단일염기 변이를 일으킬 수 있다.
게놈 에디팅을 생물체의 내인성(endogenous) 유전자에 적용하여 그 효율을 관찰하는 것은 정상 유전자를 가진 세포주를 사용할 수 있기 때문에 상대적으로 쉬운 반면, 변이를 가진 DNA를 에디팅 타겟으로 하는 실험은 쉽지 않다. 원하는 변이를 갖는 생물체 모델 또는 환자에게서 세포를 분리하고, 일차 세포(primary cell)에 직접 실험하거나 세포주로 제작하여 시험할 수는 있으나 세포의 유지 관리가 힘들며 상대적으로 긴 시간(예를 들어, 3-4개월)이 소요된다. 이에, 본 발명의 목적은 세포외, 시험관 환경(cell-free, in vitro system)에서 유전체 에디팅을 시험할 수 있는 방법으로서, 세포를 사용하지 않고 별도의 복잡한 실험 과정 없이 염기 에디터에 의한 타겟 DNA 변이를 확인하고 정량할 수 있는 방법을 제공하는 데에 있다. 또한, 그러한 간편한 세포외 시험법을 통해 실제 세포 내에서 타겟 DNA 변이를 교정할 수 있는 능력을 갖춘 염기 에디터를 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이기도 하다.
본 발명에 따른 세포외 시험법은 에디팅 타겟이 되는 단리된 이중가닥 DNA를 세포외 환경에서 염기 에디팅 단백질과 접촉시켜 염기가 교정된 DNA를 얻고, 얻어진 염기 교정된 DNA를 시퀀싱하여 염기 교정 활성을 측정하는 것을 수반한다. 여기서, 염기 에디팅 단백질은 염기 에디팅 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA 포함) 또는 이를 포함하는 벡터의 형태로 타겟 DNA와 함께 하나의 반응 튜브(one pot)에 혼합되어 염기 교정 단백질로서 합성되고, 별도의 단백질 정제 과정 없이 DNA 염기 교정을 위한 반응에 사용될 수도 있고, 발현되고 정제된 형태로 타겟 DNA와 함께 혼합되어 사용될 수도 있다. 타겟 DNA는 핵 DNA, 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA일 수 있으며, 동물 또는 식물의 세포로부터 추출되어 증폭하거나 합성하여 사용할 수 있다. 이와 같이 세포를 사용하지 않고 세포외 환경에서 염기를 교정하더라도 세포 내에서 염기 교정이 이루어졌을 때와 실질적으로 동일한 교정 활성을 보인다는 사실이 처음 확인되었는바, 세포를 사용하는 복잡한 실험 과정 없이도 세포외 환경에서 염기 에디터에 의한 타겟 DNA 변이를 확인하고 염기 교정 능력을 측정함으로써 해당 염기 에디터의 염기 교정 활성을 측정할 수 있게 되었고, 간단한 세포외 시험법만으로도 실제 세포 내에서 타겟 DNA 변이를 교정할 수 있는 염기 에디터를 스크리닝할 수 있게 되었다.
도 1은 본 발명에 따라 세포외 환경에서 DdCBE(DddA-derived cytosine base editor)를 이용하여 인간 미토콘드리아의 ND1 유전자 부위를 대상으로 염기 에디팅한 결과이다. 1397N은 N-말단 쪽 G1397 DddAtox 분할체를 나타내고, 1397C는 C-말단 쪽 G1397 DddAtox 분할체를 나타낸다. 왼쪽편의 박스로 표시한 부분은 1397N을 포함하는 융합 단백질(left DdCBE)이 인식하는 DNA 서열을 나타내는 것이고, 오른쪽편의 박스로 표시한 부분은 1397C를 포함하는 융합 단백질(right DdCBE)이 인식하는 DNA 서열을 나타내는 것이다. 진한 정도로서 염기 교정의 효율을 표시하였다. 구아닌(G) 염기 위치에도 염기 교정이 된 것으로 표시된 것은 해당 위치에서 염기쌍을 이루는 시토신(C) 염기가 교정된 것을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 세포외 환경에서 TALED(TALE-linked deaminase)를 이용하여 인간 미토콘드리아의 ND1 유전자 부위를 대상으로 염기 에디팅한 결과이다. 1397N은 N-말단 쪽 G1397 DddAtox 분할체를 나타내고, 1397C는 C-말단 쪽 G1397 DddAtox 분할체를 나타낸다. 왼쪽편의 박스로 표시한 부분은 1397C 및 TadA8e와 연결된 TALE 단백질을 포함하는 융합 단백질(left split TALED(sTALED))이 인식하는 DNA 서열을 나타내는 것이고, 오른쪽편의 박스로 표시한 부분은 1397N과 연결된 TALE 단백질을 포함하는 융합 단백질(right split TALED(sTALED))이 인식하는 DNA 서열을 나타내는 것이다. 진한 정도로서 염기 교정의 효율을 표시하였다. 티민(T) 염기 위치에도 염기 교정이 된 것으로 표시된 것은 해당 위치에서 염기쌍을 이루는 아데닌(A) 염기가 교정된 것을 나타낸다. 시토신(C) 염기가 교정된 것은 TALED에 포함된 DddAtox로 인해 C-to-T 교정이 일어난 결과이고, 구아닌(G) 염기 위치에도 염기 교정이 된 것으로 표시된 것은 해당 위치에서 염기쌍을 이루는 시토신(C) 염기가 교정된 것을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 세포외 환경에서 인간 미토콘드리아의 ND1 유전자 부위를 대상으로 DdCBE를 이용하여 C-to-T 교정한 결과 및 TALED를 이용하여 A-to-G 교정한 결과와, HEK293T 세포에 동일한 DdCBE를 적용하여 C-to-T 교정한 결과 및 동일한 TALED를 적용하여 A-to-G 교정한 결과를 비교한 것이다. IVTT는 본 발명에 따른 세포외 시험법으로 염기 교정이 행해진 것을 나타내는 것이고, HEK293T는 HEK293T 세포를 이용해서 염기 교정이 행해진 것을 나타내는 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 세포외 환경에서 인간 미토콘드리아의 ND1 유전자 부위를 대상으로 DdCBE를 이용하여 얻은 C-to-T 교정 효율 및 TALED를 이용하여 얻은 A-to-G 교정 효율과, HEK293T 세포에 동일한 DdCBE를 적용하여 얻은 C-to-T 교정 효율 및 동일한 TALED를 적용하여 얻은 A-to-G 교정 효율을 막대 그래프로 비교한 것이다.
도 5는 본 발명에 따라 세포외 환경에서 TALED를 이용하여 레베르 유전성 시신경병증(LHON) 환자의 미토콘드리아의 ND1 유전자를 구성하는 G3460A 변이(미토콘드리아의 3460번째 염기가 G가 아닌 A로 되어 있는 변이)를 대상으로 A-to-G 염기 교정한 결과이다. m.A3460G는 G3460A 변이에 대해 A-to-G 교정을 행한다는 의미이다. 1397N은 N-말단 쪽 G1397 DddAtox 분할체를 나타내고, 1397C는 C-말단 쪽 G1397 DddAtox 분할체를 나타낸다. 왼쪽편의 박스로 표시한 부분은 TALE과 1397C 및 TadA8e를 포함하는 융합 단백질(17 C 또는 18 C)이 인식하는 DNA 서열을 나타내는 것이고, 오른쪽편의 박스로 표시한 부분은 TALE 및 1397N을 포함하는 융합 단백질(56 N 또는 57 N)이 인식하는 DNA 서열을 나타낸 것이다. 박스친 "A"가 G3460A 변이를 나타내는 것이고, 진한 정도로서 염기 교정의 효율을 표시하였다. 오른쪽의 막대 그래프는 3460A→G 교정 효율을 보여주는 것이다.
도 6는 UDC cell에서 TALED를 이용하여 LHON 환자의 미토콘드리아의 ND1 유전자를 구성하는 G3460A 변이를 대상으로 A-to-G 염기 교정한 결과이다. 1397N은 N-말단 쪽 G1397 DddAtox 분할체를 나타내고, 1397C는 C-말단 쪽 G1397 DddAtox 분할체를 나타낸다. 왼쪽편의 박스로 표시한 부분은 TALE과 1397C 및 TadA8e를 포함하는 융합 단백질(17 C 또는 18 C)이 인식하는 DNA 서열을 나타내는 것이고, 오른쪽편의 박스로 표시한 부분은 TALE 및 1397N을 포함하는 융합 단백질(56 N 또는 57 N)이 인식하는 DNA 서열을 나타낸 것이다. 박스친 "A"가 G3460A 변이를 나타내는 것이고, 진한 정도로서 염기 교정의 효율을 표시하였다. 오른쪽의 막대 그래프는 3460A→G 교정 효율을 보여주는 것이다.
도 7은 도 5에 나타낸 융합 단백질 17 C와 융합 단백질 57 N을 염기 에디터로 사용하여 얻은 세포외 염기 교정 효율과, 도 6에 나타낸 동일한 염기 에디터를 사용하여 얻은 세포내 염기 교정 효율을 막대 그래프로 비교한 것이다.
도 8은 도 5에 나타낸 융합 단백질 18 C와 융합 단백질 56 N을 염기 에디터로 사용하여 얻은 세포외 염기 교정 효율과, 도 6에 나타낸 동일한 염기 에디터를 사용하여 얻은 세포내 염기 교정 효율을 막대 그래프로 비교한 것이다.
도 9는 도 5에 나타낸 융합 단백질 18 C와 융합 단백질 57 N을 염기 에디터로 사용하여 얻은 세포외 염기 교정 효율과, 도 6에 나타낸 동일한 염기 에디터를 사용하여 얻은 세포내 염기 교정 효율을 막대 그래프로 비교한 것이다.
도 10은 도 5에 나타낸 염기 에디터들을 사용하여 얻은 3460A→G 염기 교정 효율과 도 6에 나타낸 동일한 염기 에디터들을 사용하여 얻은 3460A→G 염기 교정 효율을 막대 그래프로 비교한 것이다.
다른 방식으로 정의되지 않는한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어들은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "교정", "편집" 및 "에디팅"은 상호 호환적으로 사용가능하고, 특이적 게놈 표적의 선택적 변이에 의해서 핵산 서열을 변경시키는 방법을 의미한다. 이러한 특이적 게놈 표적은 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염기 에디터", "염기 에디팅 시스템" 및 "염기 교정 시스템"은 상호 호환적으로 사용가능하고, 게놈 표적의 선택적 변이에 의해서 핵산 서열을 변경시키는 활성을 갖는 물질을 의미하며, 하나 이상의 서로 다른 염기 에디터의 조합을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "염기 에디터", "염기 에디팅 시스템" 또는 "염기 교정 시스템"은 문맥에 따라 폴리펩티드(융합 단백질일 수 있음) 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 형태일 수 있고, 하나 이상의 폴리펩티드(융합 단백질일 수 있음) 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "염기 교정 시스템" 또는 "염기 교정 조성물"은 하나의 염기 에디터 또는 둘 이상의 서로 다른 염기 에디터의 조합을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 서로 다른 염기 에디터는 동시에 사용될 수도 있고 별도로 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 염기 교정 시스템의 표적 DNA 변이를 교정하는 능력은 염기 교정 단백질에 의해 제공되며, 상기 염기 교정 단백질은 적어도 DNA 결합 단백질 및 염기-전환 단백질을 포함하기 때문에 "융합 단백질"이라고도 칭해진다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 "염기 교정 시스템" 또는 "염기 에디터"는 하나 이상의 융합 단백질 형태일 수도 있고, 상기 하나 이상의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA) 형태일 수도 있고, 단백질과 폴리뉴클레오티드의 조합(예를 들어, 염기 교정 단백질(융합 단백질)과 가이드 RNA를 포함하는 경우)일 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적", "타겟", "표적 부위" 또는 "타겟 부위"는 임의 조성 및/또는 길이의 사전에 확인된 핵산 서열을 의미한다. 이러한 표적 부위는 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "cell free, in vitro", "세포외 시험관 환경" 또는 "세포외"는 세포(세포를 포함하는 조직, 기관, 유기체(organism)을 포함)를 사용하지 않는 시험관 환경을 의미하며, 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포외 시험법"은 세포(세포를 포함하는 조직, 기관, 유기체(organism)을 포함)를 사용하지 않는 시험법을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "in vitro coupled transcription/translation", "IVTT" 또는 "시험관내 전사 및 번역 반응"은 상기 "세포외 시험관 환경"에서 염기 교정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA)가 전사 또는 전사 및 번역을 거친 후 기능성 염기 교정 단백질로서 염기 교정 활성을 발휘하게끔 하는 시스템을 의미한다.
본 발명은
(a) 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 세포외 환경에서 염기 교정 시스템에 사용되는 하나 이상의 염기 교정 단백질과 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 얻어진 DNA를 시퀀싱하여, 상기 염기 교정 시스템의 염기 교정 활성을 측정하는 단계, 및
(c) 상기 염기 교정 시스템이 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 단계
를 포함하는 염기 교정 시스템의 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 따라 제공되는 정보는 염기 교정 시스템의 DNA 변이를 교정하는 능력일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "DNA 변이를 교정하는 능력"은 실제 세포 내에서 DNA 변이를 교정하는 능력을 의미한다. 상기 "DNA 변이를 교정하는 능력"에 관한 정보는 관심있는 DNA 변이(또는 오프-타겟 변이)를 일으키는지 일으키지 않는지에 관한 정성적인 정보일 수도 있고, 관심있는 DNA 변이(또는 오프-타겟 변이)를 얼마나 일으키는지에 관한 정량적인 정보일 수도 있다. 상기 정량적인 정보는 예를 들어서, 0.5% 이상, 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 또는 20% 이상의 효율로 DNA 염기를 교정한다는 것일 수 있다.
염기 교정 효율은 염기 교정이 행해진 DNA에 대한 전체 시퀀싱 판독결과 중 염기 교정의 결과가 반영된 시퀀싱 판독물의 백분율 값으로 표현될 수 있으며, 염기 교정 빈도라고 표현될 수도 있다.
본 발명에 따른 염기 교정 시스템의 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 방법은 실제 세포에서 사용할 수 있는 염기 에디터를 스크리닝하는 방법의 일부일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 세포 내에서 타겟 DNA 변이를 교정할 수 있는 염기 에디터를 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
(a) 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 세포외 환경에서 후보 염기 에디터들과 접촉시키는 단계로서, 상기 후보 염기 에디터들은 각각 독립적으로 하나 이상의 염기 교정 단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
(b) (a) 단계로부터 얻어진 DNA 분자들을 시퀀싱하여, 상기 후보 염기 에디터들의 염기 교정 활성을 측정하는 단계;
(c) 상기 후보 염기 에디터들이 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 단계; 및
(d) (c) 단계로부터 얻어진 정보를 기초로, 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정할 수 있는 염기 에디터를 선별하는 단계.
본 명세서에서 사용되는 "측정"이라는 용어는 염기 변이가 일어난 빈도를 정량적으로 결정하는 것뿐 아니라, 염기 변이가 일어났는지 여부를 정성적으로 확인하는 것을 포괄한다. 염기 변이가 일어났는지 여부는 전형적으로는, 생명공학 기술 분야에 널리 알려진 DNA 시퀀싱 기법을 통해 확인할 수 있다.
본 명세서에서 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 세포외 환경에서 염기 교정 시스템에 사용되는 하나 이상의 염기 교정 단백질과 접촉시킨다고 할 때에는, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 염기 교정 단백질을 각각 반응물의 형태로서 반응 튜브에 첨가하는 것뿐 아니라, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA에 염기 교정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 DNA 또는 mRNA (또는 이를 포함하는 벡터)의 형태로 혼합하여, 시험관 내 전사 및/또는 번역 과정의 산물로서 얻어지는 염기 교정 단백질이 타겟 DNA와 반응하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 염기 교정 시스템의 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 염기 교정 단백질과 접촉시키는 단계는, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 하나 이상의 염기 교정 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 혼합하고, 상기 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA 포함)가 세포 외에서 전사되고 번역되는 것을 수반하는 것일 수 있다.
본 발명에 사용되는 염기 교정 단백질은 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA 포함) 또는 이를 포함하는 벡터의 형태로 타겟 DNA와 함께 하나의 반응 튜브에 혼합되어 별도의 단백질 정제 과정 없이 염기 교정 단백질 발현 및 DNA 염기 교정을 위한 반응에 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현용 플라스미드를 사용할 수 있고, 상기 플라스미드는 예를 들어 T7 프로모터 또는 SP6 프로모터를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 위와 같은 방법은 플라스미드 DNA와 타겟 DNA를 시험관내 전사 및 번역을 위한 반응물들과 함께 하나의 반응 튜브에 섞은 후 합성된 단백질을 별도로 정제하는 과정 없이 진행될 수 있다. 염기 교정 단백질의 발현 및 DNA 염기 교정은 하나의 튜브에서 원포트(one-pot) 반응을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법을 위한 반응 시스템은 시험관내 전사 및 번역 반응을 위한 인자 및 효소, 반응 시스템에 요구되는 다른 효소, 여러가지 기질, 완충액 및 염들을 포함할 수 있고, 또한 DNA 교정 과정에 필요한 DNA 복제와 관련된 효소 및 반응물들이 첨가될 수 있다. 상기 반응 시스템에 포함되는 구성성분들에는 예를 들어, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 4가지 염기(아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)에 대한 NTP(리보뉴클레오티드 트리포스페이트)들, 캡 아날로그, 리보뉴클레아제 억제제, 프로테아제 억제제, 아미노산 혼합물, tRNA, 아미노아실-tRNA 합성효소, 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제, rRNA를 포함하는 리보솜, 개시 인자(initiation factor), 신장 인자(elongation factor), 종결 인자(termination factor), 피로인산가수분해효소, MgCl2, 산화방지제, 완충액, 폴리아민 등으로부터 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있으며, 상기 성분들(특히 단백질 합성에 필요한 성분들)의 전부 또는 일부는 세포 용균물(예를 들어, reticulocyte 용균물)의 형태로 제공될 수도 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 전사 및 번역 반응은 통상 알려진 반응 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 20-40ºC의 온도에서 4-20시간 반응시킬 수 있고, 바람직하게는 30ºC에서 6시간 반응시킨 후, 37ºC에서 16시간 반응시킬 수 있다.
전사 또는 번역 반응을 위한 인자와 효소 이외에 추가될 수 있는 효소의 예로는 크레아틴 키나제, 미오키나제 및 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 등과 같은 반응 시스템에서 재생하는 에너지를 위한 효소 및 무기 피로포스파타제와 같이 전사 또는 번역 반응이 수행되는 동안에 형성되는 무기 피로인산을 가수분해하는 효소를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
여러가지 기질의 예로는 정상적인 아미노산, 에너지원인 뉴클레오티드 트리포스페이트, 크레아틴 포스페이트 및 포르밀엽산 등을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 뉴클레오티드 트리포스페이트는 ATP, GTP, CTP 및 UTP를 포함한다.
완충액으로는 예를 들어, 인산칼륨 완충액을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 염으로는 예를 들어, 글루탐산칼륨, 염화암모늄, 아세트산마그네슘, 염화칼슘, 푸트레신, 스퍼미딘 및 디티오트레이톨을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포외 시험법 중 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 염기 교정 단백질과 접촉시키는 단계는 염기 교정 단백질에 의해 타겟 DNA 변이가 교정되는 과정을 포함한다. 상기 염기 교정 반응은, 염기 교정 단백질과 타겟 DNA와의 접촉이 이루어진 후, DNA 복제 과정이 이루어짐으로써 수행된다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 단백질이 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA 포함) 또는 이를 포함하는 벡터의 형태로 제공되는 경우, 상기 염기 교정 단백질의 발현 및 DNA 염기 교정은 하나의 튜브에서 원포트(one-pot) 반응을 통해 이루어질 수 있으며, 예를 들어 시험관내 전사 및 번역 반응을 위한 반응을 완료한 후, 반응이 완료된 튜브를 그대로 PCR 과정에 적용시킬 수 있다.
본 발명에 따른 염기 교정 시스템의 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 염기 교정 단백질과 접촉시키는 단계는, 세포 외에서 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 염기 교정 단백질을 직접 혼합하는 것을 수반할 수 있다. 본 발명에 따른 세포외 시험법 중 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 염기 교정 단백질과 접촉하는 단계는 염기 교정 단백질에 의해 타겟 DNA 변이가 교정되는 과정을 포함한다. 상기 염기 교정 반응은, 염기 교정 단백질과 타겟 DNA와의 접촉이 이루어진 후, DNA 복제 과정이 이루어짐으로써 수행된다.
이 경우, 본 발명에 사용되는 염기 교정 단백질은 별도로 발현되고/거나 정제된 형태로 타겟 DNA와 함께 혼합된다. 염기 교정 단백질을 발현시키고 정제하는 방법은 생물공학 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다.
본 발명의 일 측면은, 본 발명에 따른 세포외 염기 교정 능력 시험법에 사용하기 위한 IVTT 키트(조성물)에 관한 것이다. 상기 키트는 시험관내 전사 및 번역 반응을 위한 인자 및 효소, 반응 시스템에 요구되는 다른 효소, 여러가지 기질, 완충액 및 염들을 포함할 수 있고, 또한 DNA 교정 과정에 필요한 DNA 복제와 관련된 효소 및 반응물들이 첨가될 수 있다. 상기 키트에 포함되는 구성성분들에는 예를 들어, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 4가지 염기(아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)에 대한 NTP(리보뉴클레오티드 트리포스페이트)들, 캡 아날로그, 리보뉴클레아제 억제제, 프로테아제 억제제, 아미노산 혼합물, tRNA, 아미노아실-tRNA 합성효소, 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제, rRNA를 포함하는 리보솜, 개시 인자(initiation factor), 신장 인자(elongation factor), 종결 인자(termination factor), 피로인산가수분해효소, MgCl2, 산화방지제, 완충액, 폴리아민 등으로부터 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있으며, 상기 성분들(특히 단백질 합성에 필요한 성분들)의 전부 또는 일부는 세포 용균물(예를 들어, reticulocyte 용균물)의 형태로 제공될 수도 있다. 본 발명에 따른 세포외 시험법은 염기 교정 시스템으로 사용되는 염기 교정 단백질(들)을 암호화하는 DNA를 상기 키트 조성물과 혼합한 후, DNA 전사 및 번역, 그리고 DNA 염기 교정을 허용케 하는 반응 조건 하에서 반응시키는 것을 수반할 수 있다.
본 발명에서, 염기 교정 단백질에 의한 교정 반응을 통해 얻어진 염기 교정된 DNA를 비롯한 반응 생성물들(상기 단계 (a)를 통해 얻어진 생성물들)은 별도의 정제 없이 곧바로 시퀀싱을 통한 염기 교정 활성 측정 단계(상기 단계 (b))에 사용될 수 있다. DNA의 시퀀싱 방법으로는, targeted deep sequencing 또는 Sanger sequencing 기법 등 생명공학 기술분야에서 널리 알려진 통상의 기법을 사용할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 따라 세포를 사용하지 않고 세포외 환경에서 염기를 교정하고 그 염기 교정 결과를 측정한 결과, 세포 내에서 염기 교정을 수행한 후 그 염기 교정 결과를 측정한 결과와 사실상 동일함이 실험적으로 확인되었다. 여기서, 염기 교정 결과가 사실상 동일하다는 것은, 염기 서열에 따른 염기 교정 여부 및/또는 빈도의 경향성이 동일하다는 것을 의미한다. 구체적으로, 세포외 환경에서 염기를 교정하였을 때 교정된 것으로 확인된 염기 서열은, 실제 세포 내에서 염기 교정을 수행하였을 때에도 동일하게 교정되었음이 확인되었다. 또한, 세포외 환경에서 상대적으로 높은 빈도로 염기 교정이 이루어진 염기 서열은, 실제 세포 내에서 염기 교정을 수행하였을 때에도 상대적으로 높은 빈도로 염기 교정이 이루어짐이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따라 특정 타겟 DNA를 대상으로 세포 외에서 염기 교정을 수행하였을 때 목적하는 서열 부위에서 원하는 서열 교정이 이루어진 것을 확인하였다면, 이는 실제 세포 내에서도 동일한 서열 부위에서 원하는 서열 교정이 이루어질 가능성이 매우 높다는 것을 의미하기 때문에, 다양한 염기 에디터들의 일차적 시험법으로서 매우 유용하게 사용될 수 있다. 종래에는 세포를 이용해서 시험하지 않고서는 염기 에디터의 염기 교정 활성/능력을 결정할 수 없다고 여겨졌기 때문에, 본 발명에서와 같은 세포외 시험법을 통해 염기 에디터의 염기 교정 능력을 결정하는 방법이 시험되거나 기술된 바 없었다.
세포 내에서 유전자 교정효율을 관찰하기 위해서는 먼저 세포를 배양해야 한다. 이때 세포의 종류와 유전자 교정을 일으키는 물질의 조합 수, 즉 스크리닝 갯수에 따라 형질주입을 하기 위한 적절한 세포 수를 확보하기까지 일반적으로 1 내지 3일, 계대 배양까지 필요로 할 경우에는 5 내지 6일 정도의 시간이 소요된다. 반면, IVTT 키트를 사용하여 세포외 조건에서 유전자 교정효율을 관찰하기 위해서는, IVTT 키트 조성물에 타겟 DNA와, 유전자 교정 단백질을 코딩하는 DNA를 섞어서, 예를 들어 30ºC에서 6시간, 37ºC에서 16시간 인큐베이션시키고, PCR을 수행하기만 하면 된다. 상기 인큐베이션은 PCR 기기에서 이루어질 수도 있다. 세포 실험은 3 내지 12일 정도의 시간을 필요로 하는 반면, 본 발명의 IVTT 시스템을 이용한 세포외 실험은 하루만에 가능하다.
이후 라이브러리 제작 과정에도 세포를 이용해서 염기 교정 능력을 측정하는 경우에는 세포를 용해시키는 과정이 필요하며, 이를 주형으로 하여 nested 1차 PCR를 수행한 후, 1차 PCR 산물을 주형으로 하여 2차 PCR을 수행하고, 다시 2차 PCR 산물을 주형으로 해서 인덱스 함유 프라이머를 사용하여 3차 PCR을 수행하여 최종 인덱스 서열을 추가하는 과정을 거치게 된다. 그러나, IVTT시스템을 이용한 세포외 조건에서는 위 PCR 시스템으로 30 ºC 6시간, 37 ºC 16시간 인큐베이션하고, 얻어진 것을 주형으로 하여 2차 PCR 부터 진행하는 것으로 충분하다.
이처럼, 본 발명의 IVTT 시스템은 세포를 이용해서 실험하는 것보다 더 간단하며, 시간을 단축시킬 수 있다는 이점이 있다. 치료제 개발을 목적으로 하는 경우에도, 일반적으로는, 돌연변이된 세포가 필요하고, 세포 내에 유전자 교정물질을 형질주입하기 위한 방법과 조건이 세포에 따라 달라지는 경우가 많다. 반면, 본 발명의 IVTT 시스템을 이용하면 돌연변이된 DNA를 직접 제작할 수 있으며, 형질주입 과정이 생략되므로 조건을 최적화할 필요가 없다는 장점이 있다.
본 발명에 사용되는 타겟 DNA는 하나 이상의 단일 염기 유전 변이를 포함할 수 있다. 유전되는 단일 염기 돌연변이를 교정하기 위한 염기 교정 시스템의 염기 교정 능력을 확인하는 것은, 해당 유전 변이를 갖는 식물 또는 동물(예를 들어, 유전병 환자)로부터 세포를 분리해야 하기 때문에 특히 쉽지 않다. 따라서, 본 발명에 따른 세포외 시험법만을 수행하더라도 세포 내에서 염기 교정이 이루어졌을 때와 실질적으로 동일한 교정 활성을 확인할 수 있다는 효과는 유전병에서와 같은 유전 변이를 교정하는 기술을 개발함에 있어 특히 유용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 단리된 타겟 DNA는 핵 DNA, 또는 세포소기관 DNA일 수 있다. 상기 세포소기관 DNA는 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA일 수 있으며, 동물 또는 식물의 세포로부터 추출되어 증폭된 것이거나 합성된 것일 수 있다. 예를 들어, 단리된 타겟 DNA는 유전병을 가진 인간의 핵 DNA 이거나 미토콘드리아 DNA일 수 있다. 이중가닥 DNA를 세포로부터 추출하여 증폭하는 방법이나, 그 서열을 기초로 화학적으로 합성하는 방법은 생명공학 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법을 통해 염기 교정 능력을 측정할 수 있는 염기 교정 시스템은 아데닌(A) 염기를 구아닌(G), 시토신(C) 또는 티민(T)으로 교정하는 활성을 갖거나, 구아닌(G) 염기를 아데닌(A), 시토신(C) 또는 티민(T)으로 교정하는 활성을 갖거나, 시토신(C) 염기를 아데닌(A), 구아닌(G) 또는 티민(T)으로 교정하는 활성을 갖거나, 티민(T) 염기를 아데닌(A), 구아닌(G) 또는 시토신(C)으로 교정하는 활성을 갖거나, 이들 활성들 중 하나 이상을 가질 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 세포외 시험법을 통해 염기 교정 능력을 측정할 수 있는 염기 교정 시스템은 아데닌(A) 염기를 구아닌(G)으로 교정하는 활성을 갖거나, 시토신(C) 염기를 티민(T)으로 교정하는 활성을 갖거나, 두 가지 활성을 모두 가질 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 하나 이상의 염기 교정 단백질은 각각 독립적으로 하나 이상의 염기-전환 효소를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 염기 교정 단백질은 타겟 DNA의 이중가닥 절단을 일으키지 않는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염기-전환 효소"는 DNA 염기의 퓨린 또는 피리미딘 고리의 치환기를 다른 기 또는 원자로 전환시키는 반응을 촉매하거나, DNA의 N-글리코시드 결합을 가수분해하여 DNA 염기를 제거하는 반응을 촉매하여, 표적 염기가 결국에(DNA 복제 및/또는 수선 기구를 통해) 다른 종류의 염기로 전환(교정)되는 과정에 관여하는 효소를 의미한다. DNA 염기의 퓨린 또는 피리미딘 고리의 치환기를 다른 기 또는 원자로 전환시키는 반응을 촉매하는 유형의 염기-전환 효소에는 탈아미노효소가 포함되고, DNA의 N-글리코시드 결합을 가수분해하여 DNA 염기를 제거하는 반응을 촉매하는 유형의 염기-전환 효소에는 DNA 글리코실라제가 포함된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 포함될 수 있는 하나 이상의 염기 교정 단백질은 각각 독립적으로 시토신 탈아미노효소 및/또는 아데닌 탈아미노효소를 염기-전환 효소로서 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 사용될 수 있는 시토신 탈아미노효소는 시토신 염기를 우리딘으로 전환시키는 활성을 갖는 임의의 아미노기 이탈 효소를 의미하는 것으로서, 조류(algae), 박테리아, 진균류, 식물, 무척추생물 및 포유동물을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는 임의의 생물체(예를 들어, 진핵생물 또는 원핵생물)로부터 유래되거나 변이된(예를 들어, 엔지니어링되거나 진화된) 것일 수 있다. 예를 들어, APOBEC(apolipoprotein B editing complex), AID(activation-induced deaminase), 박테리아 아데닌 탈아미노효소인 TadA(tRNA-specific adenosine deaminase) 또는 이의 오솔로그(ortholog)에서 유래되거나 변이된 시토신 탈아미노효소, 또는 박테리아 시토신 탈아미노효소인 DddA 또는 이의 오솔로그(ortholog)에서 유래되거나 변이된 시토신 탈아미노효소 또는 그의 분할체일 수 있다. 상기 언급된 TadA로부터 변이된 시토신 탈아미노효소는 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 6, 26, 27, 28, 46, 48, 49, 61, 74, 76, 77, 82, 96, 107, 108, 112, 114, 115, 119, 122, 127, 142, 143, 151, 154 및 158번째 아미노산 잔기 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 변이된 것일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 27번째 아미노산이 리신으로 변이되고 28번째 아미노산이 알라닌으로 변이되고 61번째 아미노산이 이소류신으로 변이되고 96번째 아미노산이 아스파라진으로 변이된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 시토신 탈아미노효소의 구성에 관해서는 전체로서 본 출원에 참고로 포함되는 국제특허출원 공개공보 WO 2022/060185, WO 2023/086953 등을 비롯하여 본 출원 이전에 이미 알려져 있는 내용들이 인용될 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 시토신 탈아미노효소가 포함되는 경우, 시토신 탈아미노효소는 제1 분할체 및 제2 분할체의 형태로 포함될 수 있고, 전장(full-length)의 형태로 포함될 수도 있다. 제1 분할체 및 제2 분할체의 형태를 갖는 경우, 상기 제1 분할체 및 제2 분할체는 각각 서로 다른 DNA 결합 단백질에 연결되는 형태를 갖는다.
본 명세서에서, 두 단백질이 "연결"된다고 하는 것은 직접 연결된 것일 수도 있고, 링커나 다른 단백질(들)을 통해서 간접적으로 연결된 것일 수도 있다.
본 발명에 사용되는 시토신 탈아미노효소는 DddAtox일 수 있는데, DddAtox는 Burkholderia cenocepacia에서 유래된 박테리아 독소 중 효소 기능을 발휘하는 부분으로서, 이중나선 DNA의 시토신을 탈아미노화할 수 있다. DddAtox는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
서열번호 2: wild-type DddAtox
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
DddAtox는 세포에 독성을 주기 때문에 숙주세포에서의 독성을 피하기 위해 2개의 비활성화된 분할체(split), 즉 제1 분할체 및 제2 분할체의 형태로 나누어 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 시토신 탈아미노효소가 제1 분할체 및 제2 분할체의 형태로 사용되는 경우, 상기 제1 분할체와 제2 분할체 각각은 탈아미노활성이 없다.
상기 DddAtox 시토신 탈아미노효소의 제1 분할체는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 N 말단에서부터 G33, G44, A54, N68, G82, N98, 또는 G108까지의 서열을 포함할 수 있고, 제2 분할체는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 G34, P45, G55, N69, T83, A99, 또는 A109로부터 C 말단까지의 서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, DddAtox 시토신 탈아미노효소의 제1 분할체는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 N 말단에서부터 G44까지의 서열(하기 서열번호 3)을 포함하고, 제2 분할체는 P45에서부터 C 말단까지의 서열(하기 서열번호 4)을 포함할 수 있다.
서열번호 3: wild-type DddAtox G1333-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGG
서열번호 4: wild-type DddAtox G1333-C
PTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
바람직하게는, DddAtox 시토신 탈아미노효소의 제1 분할체는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 N 말단에서부터 G108까지의 서열(하기 서열번호 5)을 포함하고, 제2 분할체는 A109에서부터 C 말단까지의 서열(하기 서열번호 6)을 포함할 수도 있다.
서열번호 5: wild-type DddAtox G1397-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
서열번호 6: wild-type DddAtox G1397-C
AIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
시토신 탈아미노효소로서 DddAtox의 제1 분할체 및 제2 분할체가 사용되는 경우, 시토신 탈아미노효소의 제1 분할체와 제2 분할체가 서로 결합하는 표면에 위치하는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, DddAtox의 제1 분할체 및 제2 분할체는 각각 서열번호 3(G1333-N) 및 서열번호 4(G1333-C)의 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이 경우 상기 서열번호 3의 3, 5, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 28, 30 및 31번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 또는 상기 서열번호 4의 13, 16, 17, 20, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 56, 57, 58 및 60번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 예로서, DddAtox의 제1 분할체는 서열번호 5(G1397-N) 및 서열번호 6(G1397-C)의 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이 경우 상기 서열번호 5의 87, 88, 91, 92, 95, 100, 101, 102 및 103번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 또는 상기 서열번호 6의 13, 14, 15 및 16번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 "다른 아미노산"은 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스데인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 및 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 이러한 변이체를 사용하게 되면, 각각 DNA 결합 단백질에 연결된 두 개의 DddAtox 분할체 쌍이 DNA에 결합하지 못할 경우 제대로 된 기능을 수행하지 못함으로써, 원치 않는 비표적 C-to-T 교정을 일으키지 않고 매우 효율적이고 정밀한 C-to-T 교정을 일으킬 수 있다. 이러한 변이체의 예로서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 DddAtox의 제1 분할체("G1397-N" 또는 "G1397N"이라 칭해질 수 있음) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 DddAtox의 제2 분할체("G1397-C" 또는 "G1397C"라 칭해질 수 있음)를 들 수 있다.
본 명세서에서, "G1333-N", "G1333N" 또는 "1333N"이라는 용어는, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 wild-type DddAtox의 제1 분할체 또는 그의 아미노산 변이체를 의미할 수 있고, "G1333-C", "G1333C" 또는 "1333C"라는 용어는, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 wild-type DddAtox의 제2 분할체 또는 그의 아미노산 변이체를 의미할 수 있다.
본 명세서에서, "G1397-N", "G1397N" 또는 "1397N"이라는 용어는, 서열번호 5 또는 7의 아미노산 서열을 갖는 wild-type DddAtox의 제1 분할체 또는 그의 아미노산 변이체를 의미할 수 있고, "G1397-C", "G1397C" 또는 "1397C"라는 용어는, 서열번호 6 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 wild-type DddAtox의 제2 분할체 또는 그의 아미노산 변이체를 의미할 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 사용되는 시토신 탈아미노효소는 전장의 형태로 사용될 수도 있고, 이 때 사용되는 전장의 시토신 탈아미노효소(예를 들어, DddAtox)는 독성이 없거나 낮은 독성만을 갖도록 아미노산 서열이 변형된 것이다. DddAtox의 C- 말단에는 양전하를 가지는 아미노산이 특이적으로 몰려있다. DNA는 음전하를 띄기 때문에 단백질의 양전하 성질을 가지는 아미노산과 결합한다. 이 양전하를 가지는 아미노산을 치환하여 DddAtox가 DNA와 결합하는 힘을 약하게 하여 세포내 독성을 낮추거나 제거할 수 있다. 즉, 양전하를 가지는 아미노산을 치환하여 독성을 가지지 않게 되면 대장균을 이용한 클로닝이 가능하여 전장 DddAtox를 확보할 수 있다. 이러한 비독성 전장 시토신 탈아미노효소는 서열번호 2의 야생형 아미노산 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 제공될 수 있다. 상기 "다른 아미노산"은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 및 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 예를 들어, 상기 다른 아미노산은 알라닌일 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 포함될 수 있는 전장 시토신 탈아미노효소 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 37번 위치의 S의 G로의 치환, 59번 위치의 G의 S로의 치환, 109번 위치의 A의 V로의 치환 및 129번 위치의 S의 G로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 포함될 수 있는 전장 시토신 탈아미노효소 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 37번 위치의 S의 G로의 치환, 59번 위치의 G의 S로의 치환, 109번 위치의 A의 V로의 치환 및 129번 위치의 S의 G로의 치환을 모두 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 사용될 수 있는 아데닌 탈아미노효소는 아데닌 염기를 하이포잔틴(또는 뉴클레오시드로서 이노신)으로 전환시키는 활성을 갖는 아미노기 이탈 효소를 의미하는 것으로서, 조류(algae), 박테리아, 진균류, 식물, 무척추생물 및 포유동물을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는 임의의 생물체(예를 들어, 진핵생물 또는 원핵생물), 예를 들어 E. coli, S. aureus, S. typhi, S. putrefaciens, H. influenzae, 또는 C. crescentus로부터 유래되거나 변이된(예를 들어, 엔지니어링되거나 진화된) 것일 수 있다. 그러한 아데닌 탈아미노효소는 예를 들어, APOBEC, AID, 또는 TadA, 또는 그의 변이체일 수 있다. 상기 언급된 TadA는 예를 들어 TadA8e(서열번호 1) 또는 그의 절단형이나 변이체(예를 들어, 데옥시뉴클레오티드에 적용할 수 있도록 개량되거나 진화된 변이체)일 수 있다. 상기 언급된 TadA8e의 변이체는 예를 들어, 서열번호 1의 23, 28, 30, 36, 46, 48, 49, 51, 76, 82, 82, 84, 106, 108, 110, 111, 146, 147, 152, 154, 155, 156 및 157번째 아미노산 잔기 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 변이된 것일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 아데닌 탈아미노효소의 구성에 관해서는 전체로서 본 출원에 참고로 포함되는 국제특허출원 공개공보 WO 2022/060185, WO 2023/086953 등을 비롯하여 본 출원 이전에 이미 알려져 있는 내용들이 인용될 수 있다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 사용될 수 있는 아데닌 탈아미노효소는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 보존적 아미노산 치환체를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 염기 교정 시스템에 포함되는 하나 이상의 염기 교정 단백질은 각각 독립적으로, 시토신 탈아미노효소(또는 그의 분할체) 또는 아데닌 탈아미노효소, 또는 이 둘 모두를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 하나 이상의 염기 교정 단백질은 각각 독립적으로, 징크 핑거 단백질(zinc finger protein), TALE(transcriptional activator-like effector) 단백질, CRISPR 연관 뉴클레아제 및 CRISPR 연관 닉카제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 결합 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 염기 교정 단백질은 타겟 DNA의 이중가닥 절단을 일으키지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 염기 교정 시스템이 하나 이상의 서로 다른 염기 에디터의 조성물의 형태인 경우, 하나의 염기 에디터는 징크 핑거 단백질, TALE 단백질, CRISPR 연관 뉴클레아제 또는 CRISPR 연관 닉카제를 포함하고, 또다른 염기 에디터는 그와 독립적으로, 징크 핑거 단백질, TALE 단백질, CRISPR 연관 뉴클레아제 또는 CRISPR 연관 닉카제를 포함할 수 있다. 징크 핑거 단백질, TALE 단백질, CRISPR 연관 뉴클레아제 및 CRISPR 연관 닉카제의 구성에 관해서는 전체로서 본 출원에 참고로 포함되는 국제특허출원 공개번호 WO 2022/060185 및 WO 2022/017745를 비롯하여 본 출원 이전에 이미 알려져 있는 내용들이 인용될 수 있다.
징크 핑거는 대표적인 DNA 결합 단백질 구조로서, 주요한 DNA-결합 단백질 모티브를 형성하며, 징크 핑거의 알파-나선(α-helix)과 DNA의 주홈(major groove) 사이의 상호 작용이 DNA 서열의 인식을 강하고 특이적으로 가능하게 한다. 1개 이상의 징크 핑거 모티프들이 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 사용되는 DNA 결합 단백질은 TALE 단백질일 수 있다. 본 발명의 TALE 단백질은 하나 이상의 TALE-반복 모듈을 통해 서열-특이적인 방식으로 뉴클레오티드에 결합하는 단백질을 가리킨다. 상기 TALE 단백질은 적어도 하나의 TALE-반복 모듈, 바람직하게는 1 내지 30개의 TALE-반복 모듈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. TALE-반복 모듈들은 "TALE 어레이"라고 부를 수도 있고, "TALE 단백질"이라는 표현은 TALE 어레이의 양측으로 각각 N-말단 도메인과 C-말단 도메인(half domain이 포함될 수 있음)이 포함되는 구성을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "TALE"이라는 표현은 달리 표시되지 않는 한, "TALE 단백질"을 의미한다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 사용되는 DNA 결합 단백질로서 TALE 단백질이 사용되는 경우, 단일 모듈 TALE 어레이 또는 다중 모듈 TALE 어레이(예를 들어, 제1 TALE(또는 left TALE) 어레이 및 제2 TALE(또는 right TALE) 어레이의 듀얼 모듈 TALE 어레이)가 사용될 수도 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템이 각각 TALE 단백질을 포함하는 2개의 융합 단백질을 포함하는 경우, 2개의 융합 단백질은 각각 제1 TALE 단백질 및 제2 TALE 단백질을 갖는다. 제1 TALE 단백질 및 제2 TALE 단백질은 각각 독립적으로, 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 및/또는 다른 단백질 구성요소를 통해) 하나 이상의 염기-전환 효소, 예를 들어 시토신 탈아미노효소 및 아데닌 탈아미노효소 중 적어도 하나와 연결될 수 있다. 예를 들어, 제1 TALE 단백질(left TALE)을 포함하는 제1 융합 단백질(염기 교정 표적 부위보다 5' 방향의 상류에서 DNA에 결합하는 융합 단백질)에 시토신 탈아미노효소의 제1 분할체가 포함되고, 제2 TALE 단백질(righ TALE)을 포함하는 제2 융합 단백질(염기 교정 표적 부위보다 3' 방향의 하류에 결합하는 융합 단백질)에 시토신 탈아민효소의 제2 분할체가 포함될 수 있고, 상기 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두에 아데닌 탈아미노효소가 포함될 수 있다. 다른 방식으로는, 제1 TALE 단백질(left TALE)을 포함하는 제1 융합 단백질에 시토신 탈아미노효소의 제2 분할체가 포함되고, 제2 TALE 단백질(right TALE)을 포함하는 제2 융합 단백질에 시토신 탈아민효소의 제1 분할체가 포함될 수 있고, 상기 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두에 아데닌 탈아미노효소가 포함될 수 있다. 다른 방식으로는, 제1 TALE 단백질을 포함하는 제1 융합 단백질 및 제2 TALE 단백질을 포함하는 제2 융합 단백질 중 어느 하나에 시토신 탈아미노효소의 전장 형태가 포함될 수 있고, 상기 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두에 아데닌 탈아미노효소가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 사용되는 DNA 결합 단백질은 "Cas 단백질"이라고 불리는 CRISPIR-연관 단백질일 수 있다. DNA 교정 도구로서 잘 알려진 "CRISPR 시스템"은 Cas 단백질과 관련 RNA 성분(들)이 함께 작동하여 DNA의 특정 염기를 인식하고 해당 부위를 교정하는 기능을 발휘하는 리보핵단백질 복합체를 의미하며, "CRISPR/Cas 시스템"이라고도 부른다.
"Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미한다. Cas 단백질을 암호화하는 CRISPR-연관(CRISPR-associated, cas) 유전자는 종종 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)과 관련된다. 40개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 기술되어 왔고, 알려진 Cas 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information(NCBI))의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas 단백질은 박테리아와 같은 미생물에서 분리된 것이거나, 재조합적 합성 또는 인공적인 합성 등과 같이 비자연적으로 생성된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 사용되는 DNA 결합 단백질은 CRISPR 연관 뉴클레아제일 수 있다. 이 때, 용어 "CRISPR 연관 뉴클레아제"는 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때 (엔도)뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 Cas 단백질 또는 이의 변이체를 의미한다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 CRISPR 연관 뉴클레아제가 염기 교정 단백질의 일부로서 사용되는 경우, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 해당 염기 교정 단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA)와 접촉시킬 때, 가이드 RNA가 함께 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가이드 RNA"는 표적 DNA에 특이적인 DNA로서, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA로 가져오는 RNA를 말한다. 상기 가이드 RNA는 2개의 RNA, 즉 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 필수적 부분의 융합에 의해 생성된 단일 사슬 RNA(single-chain RNA, sgRNA)일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA(dual RNA)일 수 있다. 만약 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA라도 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 사용되는 DNA 결합 단백질은 CRISPR 연관 닉카제일 수 있다. 이 때, 용어 "CRISPR 연관 닉카제"는 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때 닉카제 활성을 갖는 임의의 Cas 단백질 또는 이의 변이체를 의미한다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용되는 CRISPR 연관 닉카제는, 기존의 Cas 단백질로부터 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성의 일부 또는 전부를 소실시키고 닉카제 활성을 갖도록 변이된 것일 수 있다. "닉카제" 활성은 DNA 분자의 한 가닥만을 절단하는 활성을 의미한다. 그러한 변이체는 박테리아와 같은 미생물에서 분리된 것이거나, 재조합적 합성 또는 인공적인 합성 등과 같이 비자연적으로 생성된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 CRISPR 연관 닉카제가 염기 교정 단백질의 일부로서 사용되는 경우, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 해당 염기 교정 단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA)와 접촉시킬 때, 역전사 효소 또는 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 mRNA)와 가이드 RNA(프라임 에디팅 가이드 RNA라고도 함)가 함께 첨가될 수 있다.
DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 시토신 탈아미노효소가 포함되는 경우, 시토신 탈아미노효소는 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 및/또는 다른 단백질 구성요소를 통해) 연결될 수 있다. DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 아데닌 탈아미노효소가 포함되는 경우, 아데닌 탈아미노효소는 TALE 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 및/또는 다른 단백질 구성요소를 통해) 연결될 수 있다. DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 시토신 탈아미노효소과 아데닌 탈아미노효소가 모두 포함되는 경우, 아데닌 탈아미노효소는 시토신 탈아미노효소의 N-말단 또는 C-말단(바람직하게는 C-말단)에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 및/또는 다른 단백질 구성요소를 통해) 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템이 2개의 융합 단백질을 포함하는 경우, 상기 융합 단백질들은 서로 다른 단백질 구성요소들(예를 들어, DNA 결합 단백질 및 하나 이상의 염기-전환 효소)의 조성 및 배열을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1 융합 단백질(염기 교정 표적 부위보다 5' 방향의 상류에서 DNA에 결합하는 융합 단백질)은 아데닌 탈아미노효소를 포함하는 반면, 제2 융합 단백질(염기 교정 표적 부위보다 3' 방향의 하류에서 DNA에 결합하는 융합 단백질)은 아데닌 탈아미노효소를 포함하지 않을 수 있고, 그 반대일 수도 있다. 예를 들어, 제1 융합 단백질(염기 교정 표적 부위보다 5' 방향의 상류에서 DNA에 결합하는 융합 단백질)은 TALE 단백질을 포함하는 반면, 제2 융합 단백질(염기 교정 표적 부위보다 3' 방향의 하류에서 DNA에 결합하는 융합 단백질)은 징크 핑거 단백질을 포함할 수 있고, 그 반대일 수도 있다.
융합 단백질의 단백질 구성요소들의 배열에 있어서, 제1 융합 단백질(염기 교정 표적 부위보다 5' 방향의 상류에서 DNA에 결합하는 융합 단백질)과 제2 융합 단백질(염기 교정 표적 부위보다 3' 방향의 하류에서 DNA에 결합하는 융합 단백질)은 서로 독립적인 배열을 취할 수 있다. 예를 들어, 제1 융합 단백질에서는 아데닌 탈아미노효소가 시토신 탈아미노효소의 C-말단 이후에 위치하는 반면, 제2 융합 단백질에서는 아데닌 탈아미노효소가 시토신 탈아미노효소의 N-말단 이전에 위치할 수 있고, 그 반대일 수도 있다. 예를 들어, 제1 융합 단백질에서는 DNA 결합 단백질이 시토신 탈아미노효소의 C-말단 이후에 위치하는 반면, 제2 융합 단백질에서는 DNA 결합 단백질이 시토신 탈아미노효소의 N-말단 이전에 위치할 수 있고, 그 반대일 수도 있다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 하나 이상의 융합 단백질은 각각 독립적으로 UGI(uracil glycosylase inhibitor; 우라실 글리코실라제 억제제)를 추가로 포함할 수 있다. UGI는 DNA에서 우라실(U) 염기를 제거하는 작용을 촉매하는 돌연변이 DNA를 복구하는 효소 UDG(uracil DNA glycosylase) 활성을 억제시켜 염기 교정 효율을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 염기 교정 단백질에 UGI가 사용되는 경우, 그 위치는 다양할 수 있으며, 예를 들어 시토신 탈아미노효소의 C-말단에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 및/또는 다른 단백질 구성요소를 통해) 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 하나 이상의 융합 단백질은 각각 독립적으로 NES(nuclear export signal; 핵외 수송 신호)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 NES 서열은 핵외로 전위케 하는 능력을 부여하는 임의의 신호서열일 수 있는바, 천연의 NES 또는 인위적으로 합성된 NES가 사용될 수 있다. 예를 들어, MVM(mirute virus of mice) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 NES가 사용되는 경우, 그 위치는 다양할 수 있으며, 예를 들어 시토신 탈아미노효소의 N-말단에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 및/또는 다른 단백질 구성요소를 통해) 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 하나 이상의 융합 단백질은 각각 독립적으로 MTS(mitochondrial targeting sequence; 미토콘드리아 타겟팅 서열)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 MTS는 미토콘드리아 내로 전위케 하는 능력을 갖춘 임의의 신호서열일 수 있는 바, 다양한 미토콘드리아 단백질들의 N-말단에 존재하는 천연의 MTS일 수 있으며, 또한 인위적으로 합성된 MTS가 사용될 수도 있다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 MTS가 사용되는 경우, 그 위치는 다양할 수 있으며, 예를 들어 DNA 결합 단백질 의 N-말단 또는 NES의 N-말단에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커 및/또는 다른 단백질 구성요소를 통해) 연결될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "융합 단백질"은 둘 이상의 상이한 폴리펩티드가 펩티드 결합을 통해 결합되어 형성된 폴리펩티드를 가리킨다. 본 발명에 따른 세포외 시험법에 사용될 수 있는 염기 교정 시스템에 포함되는 융합 단백질은 DNA 결합 단백질 및 염기-전환 효소를 포함하고, 추가로 UGI 및/또는 NES 및/또는 MTS를 포함할 수 있으며, 이들 단백질 구성요소들은 링커를 통해 연결되거나 직접 연결될 수 있다. 또한, 필요에 따라서 태그 서열이 부가될 수 있다. 융합 단백질 (또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 설계 및 구성하는 방법은 생명공학 분야에 공지된 임의의 방법일 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 삽입될 수 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 내용을 바탕으로, 하기 (1) 내지 (44)에 관한 것일 수 있지만, 여기에 제한되는 것은 아니다.
(1) 하기 단계들을 포함하는 염기 교정 시스템의 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 방법:
(a) 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 세포외 환경에서 염기 교정 시스템에 사용되는 하나 이상의 염기 교정 단백질과 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a)로부터 얻어진 DNA를 시퀀싱하여, 상기 염기 교정 시스템의 염기 교정 활성을 측정하는 단계, 및
(c) 상기 염기 교정 시스템이 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 단계.
(2) (1)에 있어서, 단계 (a)는 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 상기 하나 이상의 염기 교정 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 혼합하고, 상기 폴리뉴클레오티드가 세포 외에서 전사되고 번역되는 것을 수반하는 것인 방법.
(3) (2)에 있어서, 염기 교정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 mRNA인 방법.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 염기 교정 단백질을 발현시키고 DNA 염기를 교정하는 것이 원포트(one-pot) 반응을 통해 수행되는 것인 방법.
(5) (1)에 있어서, 단계 (a)는 세포 외에서 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 염기 교정 단백질을 혼합하는 것을 수반하는 것인 방법.
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 반응 생성물을 별도의 정제 없이 단계 (b)에 사용하는 방법.
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이가 하나 이상의 단일 염기 변이를 포함하는 것인 방법.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 동물 또는 식물의 세포로부터 추출되어 증폭된 것이거나 인공적으로 합성된 것인 방법.
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 핵 DNA 또는 세포소기관 DNA 인 방법.
(10) (9)에 있어서, 세포소기관 DNA가 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA인 방법.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 유전병을 가진 인간의 핵 DNA이거나 미토콘드리아 DNA인 방법.
(12) (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 있어서, 염기 교정이 아데닌(A) 염기를 구아닌(G)으로 교정하거나, 시토신(C) 염기를 티민(T) 염기로 교정하거나, 두 가지 모두를 수행하는 것인 방법.
(13) (1) 내지 (12) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 염기 교정 단백질은 각각 독립적으로, 징크 핑거 단백질(zinc finger protein), TALE(transcriptional activator-like effector) 단백질, CRISPR 연관 뉴클레아제 및 CRISPR 연관 닉카제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 결합 단백질을 포함하는 것인 방법.
(14) (13)에 있어서, 하나 이상의 DNA 결합 단백질이 CRISPR 연관 뉴클레아제를 포함하며, 단계 (a)에서 가이드 RNA가 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 추가로 접촉되는 것인 방법.
(15) (13)에 있어서, 하나 이상의 DNA 결합 단백질이 CRISPR 연관 닉카제를 포함하며, 단계 (a)에서 역전사효소 또는 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 가이드 RNA가 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 추가로 접촉되는 것인 방법.
(16) (1) 내지 (15) 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 염기 단백질이 각각 독립적으로 염기-전환 효소를 포함하는 것인 방법.
(17) (16)에 있어서, 하나 이상의 염기-전환 효소가 각각 독립적으로 APOBEC(apolipoprotein B editing complex), AID(activation-induced deaminase), TadA(tRNA-specific adenosine deaminase) 또는 DddAtox, 또는 그의 변이체 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
(18) (17)에 있어서, DddAtox 또는 그의 변이체가 2개의 분할체의 형태로 사용되는 것인 방법.
(19) (17)에 있어서, DddAtox 또는 그의 변이체가 전장 단백질의 형태로 사용되는 것인 방법.
(20) (1) 내지 (19) 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 염기 교정 단백질이 각각 독립적으로 UGI(uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 것인 방법.
(21) 하기 단계들을 포함하는 세포 내에서 타겟 DNA 변이를 교정할 수 있는 염기 에디터를 스크리닝하는 방법:
(a) 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 세포외 환경에서 후보 염기 에디터들과 접촉시키는 단계로서, 상기 후보 염기 에디터들은 각각 독립적으로 하나 이상의 염기 교정 단백질 또는 그를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
(b) (a) 단계로부터 얻어진 DNA 분자들을 시퀀싱하여, 상기 후보 염기 에디터들의 염기 교정 활성을 측정하는 단계;
(c) 상기 후보 염기 에디터들이 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 단계; 및
(d) (c) 단계로부터 얻어진 정보를 기초로, 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정할 수 있는 염기 에디터를 선별하는 단계.
(22) (21)에 있어서, 단계 (a)는 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 상기 하나 이상의 염기 교정 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 혼합하고, 상기 폴리뉴클레오티드가 세포 외에서 전사되고 번역되는 것을 수반하는 것인 방법.
(23) (22)에 있어서, 염기 교정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 mRNA인 방법.
(24) (21) 내지 (23) 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 염기 교정 단백질을 발현시키고 DNA 염기를 교정하는 것이 원포트(one-pot) 반응을 통해 수행되는 것인 방법.
(25) (21)에 있어서, 단계 (a)는 세포 외에서 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 염기 교정 단백질을 혼합하는 것을 수반하는 것인 방법.
(26) (21) 내지 (25) 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 반응 생성물을 별도의 정제 없이 단계 (b)에 사용하는 방법.
(27) (21) 내지 (26) 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이가 하나 이상의 단일 염기 변이를 포함하는 것인 방법.
(28) (21) 내지 (27) 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 동물 또는 식물의 세포로부터 추출되어 증폭된 것이거나 인공적으로 합성된 것인 방법.
(29) (21) 내지 (28) 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 핵 DNA 또는 세포소기관 DNA 인 방법.
(30) (29)에 있어서, 세포소기관 DNA가 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA인 방법.
(31) (21) 내지 (30) 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 유전병을 가진 인간의 핵 DNA이거나 미토콘드리아 DNA인 방법.
(32) (21) 내지 (31) 중 어느 한 항에 있어서, 염기 교정이 아데닌(A) 염기를 구아닌(G)으로 교정하거나, 시토신(C) 염기를 티민(T) 염기로 교정하거나, 두 가지 모두를 수행하는 것인 방법.
(33) (21) 내지 (32) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 염기 교정 단백질은 각각 독립적으로, 징크 핑거 단백질(zinc finger protein), TALE(transcriptional activator-like effector) 단백질, CRISPR 연관 뉴클레아제 및 CRISPR 연관 닉카제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 결합 단백질을 포함하는 것인 방법.
(34) (33)에 있어서, 하나 이상의 DNA 결합 단백질이 CRISPR 연관 뉴클레아제를 포함하며, 단계 (a)에서 가이드 RNA가 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 추가로 접촉되는 것인 방법.
(35) (33)에 있어서, 하나 이상의 DNA 결합 단백질이 CRISPR 연관 닉카제를 포함하며, 단계 (a)에서 역전사효소 또는 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 가이드 RNA가 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 추가로 접촉되는 것인 방법.
(36) (21) 내지 (35) 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 염기 단백질이 각각 독립적으로 염기-전환 효소를 포함하는 것인 방법.
(37) (36)에 있어서, 하나 이상의 염기-전환 효소가 각각 독립적으로 APOBEC(apolipoprotein B editing complex), AID(activation-induced deaminase), TadA(tRNA-specific adenosine deaminase) 또는 DddAtox, 또는 그의 변이체 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
(38) (37)에 있어서, DddAtox 또는 그의 변이체가 2개의 분할체의 형태로 사용되는 것인 방법.
(39) (37)에 있어서, DddAtox 또는 그의 변이체가 전장 단백질의 형태로 사용되는 것인 방법.
(40) (21) 내지 (39) 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 염기 교정 단백질이 각각 독립적으로 UGI(uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 것인 방법.
(41) (1) 내지 (40) 중 어느 한 항에 있어서, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 혼합물, 아미노산 혼합물, tRNA, rRNA를 포함하는 리보솜, 개시 인자, 신장 인자, 종결 인자 및 완충액을 포함하는 조성물이 단계 (a)에서 사용되는 것인 방법.
(42) (21) 내지 (41) 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별된 염기 에디터.
(43) (21) 내지 (41) 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별된 염기 에디터로서, 단계 (a)에서 사용된 하나 이상의 염기 교정 단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 염기 에디터.
(44) DNA 중합효소, RNA 중합효소, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 혼합물, 아미노산 혼합물, tRNA, rRNA를 포함하는 리보솜, 개시 인자, 신장 인자, 종결 인자 및 완충액을 포함하는, (1) 내지 (41) 중 어느 한 항에 따른 방법인 키트.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 주형 DNA 증폭
DNA 교정을 위한 타겟 DNA로서 인간 미토콘드리아 ND1 유전자를 모방한 이중가닥 DNA 서열을 gBlock DNA 단편으로서 IDT(Integrated DNA Technologies)로부터 합성하였다. 얻어진 주형 DNA의 서열은 다음과 같다.
TACTATTGCCAGCATTGCTGCCCTCAACCTAGGCCTCCTATTTATTCTAGCCACCTCTAGCCTAGCCGTTTACTCAATCCTCTGATCAGGGTGAGCATCAAACTCAAACTACGCCCTGATCGGCGCACTGCGAGCAGTAGCCCAAACAATCTCAAGATGGTGCACGATGCACAG (밑줄친 서열은 오염을 방지하기 위한 임의의 PCR 증폭 서열임)
포워드 프라이머(TACTATTGCCAGCATTGCTGC) 및 리버스 프라이머(CTGTGCATCGTGCACCATCT)를 이용하여 주형 DNA를 증폭한 후 PCR 정제 키트(Geneall)로 정제하였다. 실험하기 직전 신선하게 10 ng/μl로 증류수에 묽혀서 사용하였다.
실시예 2: 시험관내 전사 및 번역(IVTT) 및 염기 교정
실시예 1에서 얻어진 주형 DNA를 10 ng/μL로 정량한 후, 주형 DNA(1ng, 5ng 또는 10 ng), left DdCBE(또는 sTALED)을 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 0.5 μg 및 right DdCBE(또는 sTALED)를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 0.5 μg 및 in vitro coupled transcription/translation(IVTT) kit mixture 20 μL을 포함하는 반응 혼합물(25 μL까지 증류수 포함)을 튜브에 섞은 후 30°C에서 6시간 반응시킨 후 37°C에서 16시간 반응시켰다. 사용된 IVTT kit는 TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems(Promega)이며 TNT® Rabbit Reticulocyte Lysate에 TNT® Reaction Buffer, TNT® RNA Polymerase, Amino Acid Mixture, RNasin® Ribonuclease Inhibitor 들이 포함된 TNT® Quick Master Mix 를 사용하였다.
상기 left DdCBE 및 sTALED, 및 right DdCBE 및 sTALED의 아미노산 서열은 다음과 같다. 사용된 단백질들은 T7 프로모터(TAATACGACTCACTATAG)와 종결서열 사이에 위치해 있다.
Left DdCBE:
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML (서열번호 9)
Right DdCBE:
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML(서열번호 10)
Left sTALED
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLLVGSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN(서열번호 11)
Right sTALED:
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG(서열번호 12)
실시예 3: 염기 교정 확인을 위한 시퀀싱 및 염기 교정 효율 측정
실시예 2에서 얻어진 반응물을 정제 없이 주형으로 사용하여, targeted deep sequencing 기법으로 서열을 분석하였다(시퀀싱은 Sanger sequencing 기법을 사용할 수 있다). 이 때, 우라실 또는 하이포잔틴(뉴클레오시드로서 이노신) 오류 내성을 갖는 DNA 중합효소를 사용하여 주형을 증폭하였다. 얻어진 염기 교정 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 도 1의 염기 교정 결과는 상기 left DdCBE 및 right DdCBE를 염기 에디터로 사용하여 얻은 것이고, 도 2의 염기 교정 결과는 상기 left sTALED 및 right sTALED를 염기 에디터로 사용하여 얻은 것이다.
실시예 4: 세포 내 염기 교정
HEK293T 세포를 TC-Treated Multiple Well Plates(Corning)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)(Welgene)과 1% antibiotic-antimycotic 용액을 포함하는 DMEM(Welgene) 배양액으로 5% CO2에서 37℃로 유지하여 배양하였다. HEK293T 세포를 48-웰 플레이트에 0.75 x 105 cell/well 로 분주하고, left DdCBE(또는 sTALED)을 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 0.5 μg 및 right DdCBE(또는 sTALED)를 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 0.5 μg을 혼합한 후, Opti-MEM 25 μl을 넣었다(혼합물 1). 그 후, lipofectamine 2000 1.5 μl와 Opti-MEM 25 μl을 섞었다(혼합물 2). 혼합물 1과 혼합물 2를 1:1 부피비로 혼합한 후 15분간 상온에서 배양하였다. 배양물을 하나의 웰 당 50 μl씩 넣고, 4일간 배양한 후, 세포 배양 배지를 제거하였다. 세포 용해(cell lysis) 완충액(50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.05% SDS 및 1:20 부피비의 Proteinase K)을 웰 당 100 μl 넣어 세포 용해를 진행하였다. 그 후, 50°C에서 1시간, 80°C 20분 배양 후 4°C에 보관하였다. 미토콘드리아 DNA만 구분할 수 있는 Deep-sequencing primer로 증폭한 후 시퀀싱하였다. 얻어진 염기 교정 결과를, 실시예 3에서 세포외 시험법을 통해 얻어진 염기 교정 결과와 비교하였다(도 3 및 4).
도 3에서 확인되는 바와 같이, 세포외 시험법을 통해 DdCBE에 의해서 C-to-T 교정된 염기 서열들은 모두 세포 실험을 통해서도 교정되었고, 또한 TALED에 의해서 A-to-G 교정된 염기 서열들 역시 모두 세포 실험을 통해서도 동일하게 교정되었음이 확인되었다. 또한, 예를 들어, 세포외 시험법을 통해 ACTCAATCCTCTGATC 서열 중 밑줄친 염기 서열에서 C-to-T 염기 교정이 비교적 높은 빈도로 일어나고, ACTCAATCCTCTGATC 서열 중 밑줄친 염기 서열에서 A-to-G 염기 교정(상기 밑줄친 염기가 T인 경우, 그와 쌍을 이룬 A 염기가 교정된 경우에 해당함)이 비교적 높은 빈도로 일어났는데, 이러한 염기 교정의 경향성은 세포 실험을 통해서도 동일하게 확인되었다.
실시예 5: m.A3460G 교정을 위한 주형 DNA 증폭
대표적인 미토콘드리아 유전질환인 LHON의 원인인 ND1 유전자의 G3460A 돌연변이를 교정하는 염기 에디터를 선별하기 위해 G3460A 돌연변이를 가지는 이중가닥 DNA 서열을 gBlock DNA 단편으로서 IDT(Integrated DNA Technologies)로부터 합성하였다. 얻어진 주형 DNA의 서열은 다음과 같다.
CTTCAAGGACGACGGCAACCTAGGCTATATACAACTACGCAAAGGCCCCAACGTTGTAGGCCCCTACGGGCTACTACAACCCTTCGCTGACACCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCCCCGACCTTAGCGGCATCAAGGTGAACTTCA (밑줄친 서열은 오염을 방지하기 위한 임의의 PCR 증폭 서열임; 굵은 글씨체로 표시한 A가 G3460A 변이를 나타냄)
포워드 프라이머(CTTCAAGGACGACGGCAACCTAGGCTATATACAACTACGC) 및 리버스 프라이머(TGAAGTTCACCTTGATGCCGCTAAGGTCGGGGCGGTGATG)를 이용하여 주형 DNA를 PCR로 증폭한 후 PCR SV mini kit(Geneall)로 정제하였다. 실험하기 직전 신선하게 10 ng/μl로 증류수에 묽혀서 사용하였다.
실시예 6: m.A3460G 교정을 위한 염기 에디터 제작
T7 프로모터(TAATACGACTCACTATAG)를 포함하는 TALED를 제작하였다. 구체적으로 TAL 이펙터 어레이 플라스미드와 발현 플라스미드를 골든-게이트 클로닝 시스템으로 제작하였다. 컴피턴트(competent) DH5α(enzynomics) 대장균 세포에 열 충격(42℃) 방법으로 형질전환하여 단일 콜로니를 LB 배지에 37℃에서 밤새 진탕 인큐베이션으로 배양하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Plasmid SV mini kit(GeneAll)로 플라스미드 DNA를 정제하였다. 정제된 플라스미드 DNA, 즉 TALED들은 sanger sequencing(Macrogen)으로 염기서열을 확인하였다.
제작한 염기 교정 단백질들의 아미노산 서열은 다음과 같다.
17 C:
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLLVGSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN(서열번호 13)
Figure PCTKR2024000873-appb-img-000001
56 N:
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG(서열번호 15)
57 N:
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG(서열번호 16)
실시예 7: m.A3460G 교정을 위한 시험관내 전사 및 번역(IVTT) 및 염기 교정
실시예 5에서 얻어진 주형 DNA를 10 ng/μL로 정량한 후, 주형 DNA 10 ng, 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 염기 교정 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 0.5 μg 및 서열번호 15 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 염기 교정 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 플라스미드 0.5 μg 및 in vitro coupled transcription/translation(IVTT) kit mixture 20 μL을 포함하는 반응 혼합물(25 μL까지 증류수 포함)을 튜브에 섞은 후 30°C에서 6시간 반응시킨 후 37°C에서 16시간 반응시켰다. 사용된 IVTT kit는 TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Promega)이며 TNT®Rabbit Reticulocyte Lysate에 TNT® Reaction Buffer, TNT® RNA Polymerase, Amino Acid Mixture, RNasin® Ribonuclease Inhibitor 들이 포함된 TNT® Quick Master Mix 를 사용하였다.
얻어진 염기 교정 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 8: m.A3460G 교정을 위한 세포 내 염기 교정
미토콘드리아 ND1 유전자의 G3460A 점 돌연변이를 가지는 LHON 환자의 소변으로부터 세포를 단리하여 primary cell을 확보하였으며, 이를 passage 2에서 소분하여 동결보존 하였다. 환자유래 소변세포(UDC: Urine derived cell)는 0.1% 젤라틴(Welgene)으로 코팅한 12-웰 Clear TC-Treated Multiple Well Plates(Corning)에 Renal Epithelial cell Growth Medium Bullet kit(REGM, Lonza) 배양액으로 5% CO2에서 37℃로 유지하여 배양하였다. UDC 세포를 96-웰 Clear TC-Treated Multiple Well Plates(Corning)에 1 웰당 0.6 x 104 세포수가 되도록 시딩(seeding)해 주었다. 20-24시간 후, 염기 교정 단백질 17 C 또는 18 C를 인코딩하고 있는 플라스미드 250 ng과 염기 교정 단백질 56 N 또는 57 N을 인코딩하고 있는 플라스미드 250 ng을 Lipofectamine LTX reagent(Invitrogen)을 이용하여 형질주입한 뒤 미리 시딩해놓은 96-웰 플레이트에 넣어 주었다. 형질주입된 세포들을 배양액을 교체해주면서 5% CO2에서 37℃로 유지 배양하였다.
형질주입된 UDC 세포들을 세포 용해 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.4(Welgene), 1mM EDTA pH 8.0(Welgene), 0.005 % 나트륨 도데실 술페이트(Welgene), 및 1:20 부피비의 Proteinase K(Qiagen))을 웰 당 100 μl 넣어준 뒤, 50°C에서 1시간, 80°C 20분 PCR 기계로 인큐베이션하고 4°C에 보관하였다.
세포 용해(cell lysis)한 것을 정제 없이 주형으로 하여, 표적 부위의 염기교정 비율 분석을 위해 표적 딥 시퀀싱(targeted deep sequencing) 기법으로 서열을 분석하였다. 딥 시퀀싱 라이브러리를 제작하기 위해 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase(TAKARA)를 사용하여 미토콘드리아 DNA만 구분할 수 있는 Deep-sequencing primer로 nested 1차 PCR 및 1차 PCR를 주형으로 하여 2차 PCR를 진행하였고, 인덱스 함유 프라이머를 사용하여 3차 PCR를 수행하여 최종 인덱스 서열을 추가하였다. 인덱스 서열이 추가된 3차 PCR 반응물을 PCR SV mini kit(GeneAll)를 사용하여 정제하였으며, MiniSeq Mid Output Kit(Illumina)를 사용하여 MiniSeq system(Illumina)를 이용하여 paired-end sequencing 하였다.
얻어진 염기 교정 결과를 도 6에 나타내었고, 실시예 7에서 얻어진 세포외 시험법을 통해 얻어진 염기 교정 결과와 비교하였다(도 7 내지 10). 도 10에서 확인되는 바와 같이, 세포외 시험법을 통해 G3460A 변이에 대한 교정(on-target 교정) 능력이 확인된 염기 에디터들은 모두 세포내 실험에서도 동일한 on-target 교정 능력을 발휘함이 확인되었다. 또한, 도 7 내지 9에서 확인되는 바와 같이, on-target 교정 능력뿐 아니라, bystander(비-타겟) 염기 교정 효율도 세포외 시험법과 세포내 실험 사이에서 유사한 경향성을 나타냄이 확인되었다.

Claims (23)

  1. (a) 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 세포외 환경에서 염기 교정 시스템에 사용되는 하나 이상의 염기 교정 단백질과 접촉시키는 단계;
    (b) 단계 (a)로부터 얻어진 DNA를 시퀀싱하여, 상기 염기 교정 시스템의 염기 교정 활성을 측정하는 단계, 및
    (c) 상기 염기 교정 시스템이 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 단계
    를 포함하는 염기 교정 시스템의 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)는 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 상기 하나 이상의 염기 교정 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 혼합하고, 상기 폴리뉴클레오티드가 세포 외에서 전사되고 번역되는 것을 수반하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 염기 교정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 mRNA인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 염기 교정 단백질을 발현시키고 DNA 염기를 교정하는 것이 원포트(one-pot) 반응을 통해 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 (a)는 세포 외에서 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 염기 교정 단백질을 혼합하는 것을 수반하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 반응 생성물을 별도의 정제 없이 단계 (b)에 사용하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이가 하나 이상의 단일 염기 변이를 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 동물 또는 식물의 세포로부터 추출되어 증폭된 것이거나 인공적으로 합성된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 핵 DNA 또는 세포소기관 DNA 인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 세포소기관 DNA가 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA가 유전병을 가진 인간의 핵 DNA이거나 미토콘드리아 DNA인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 염기 교정이 아데닌(A) 염기를 구아닌(G)으로 교정하거나, 시토신(C) 염기를 티민(T) 염기로 교정하거나, 두 가지 모두를 수행하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 염기 교정 단백질은 각각 독립적으로, 징크 핑거 단백질(zinc finger protein), TALE(transcriptional activator-like effector) 단백질, CRISPR 연관 뉴클레아제 및 CRISPR 연관 닉카제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 결합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 DNA 결합 단백질이 CRISPR 연관 뉴클레아제를 포함하며, 단계 (a)에서 가이드 RNA가 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 추가로 접촉되는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 하나 이상의 DNA 결합 단백질이 CRISPR 연관 닉카제를 포함하며, 단계 (a)에서 역전사효소 또는 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 가이드 RNA가 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA와 추가로 접촉되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 염기 단백질이 각각 독립적으로 염기-전환 효소를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 하나 이상의 염기-전환 효소가 각각 독립적으로 APOBEC(apolipoprotein B editing complex), AID(activation-induced deaminase), TadA(tRNA-specific adenosine deaminase) 또는 DddAtox, 또는 그의 변이체 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, DddAtox 또는 그의 변이체가 2개의 분할체의 형태로 사용되는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, DddAtox 또는 그의 변이체가 전장 단백질의 형태로 사용되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 염기 교정 단백질이 각각 독립적으로 UGI(uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 것인 방법.
  21. (a) 타겟 DNA 변이를 포함하는 단리된 DNA를 세포외 환경에서 후보 염기 에디터들과 접촉시키는 단계로서, 상기 후보 염기 에디터들은 각각 독립적으로 하나 이상의 염기 교정 단백질 또는 그를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 단계;
    (b) (a) 단계로부터 얻어진 DNA 분자들을 시퀀싱하여, 상기 후보 염기 에디터들의 염기 교정 활성을 측정하는 단계;
    (c) 상기 후보 염기 에디터들이 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정하는 능력에 관한 정보를 제공하는 단계; 및
    (d) (c) 단계로부터 얻어진 정보를 기초로, 세포 내에서 동일한 DNA 변이를 교정할 수 있는 염기 에디터를 선별하는 단계
    를 포함하는 세포 내에서 타겟 DNA 변이를 교정할 수 있는 염기 에디터를 스크리닝하는 방법.
  22. 제21항에 따른 방법에 의해 선별된 염기 에디터.
  23. DNA 중합효소, RNA 중합효소, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 혼합물, 아미노산 혼합물, tRNA, rRNA를 포함하는 리보솜, 개시 인자, 신장 인자, 종결 인자 및 완충액을 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 키트.
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