WO2024155160A1 - Gfral을 표적으로 하는 안티센스 올리고머 및 이의 용도 - Google Patents

Gfral을 표적으로 하는 안티센스 올리고머 및 이의 용도 Download PDF

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    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy

Definitions

  • the present invention relates to a GFRAL-specific antisense oligomer targeting the GFRAL (GDNF family receptor alpha like) gene and its use. More specifically, to the GFRAL-specific antisense oligomer containing a specific base sequence and the increase of GDF15 containing the same. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases related to the activation of GFRAL.
  • GFRAL GDNF family receptor alpha like
  • Cachexia is a complex metabolic abnormality that is characterized by muscle loss, is often accompanied by a decrease in fat tissue, and is an irreversible disease state that cannot be recovered even with appropriate calorie supplementation.
  • Cachexia is accompanied by loss of appetite, weight loss, loss of fat tissue and muscle, and depression, leading to low quality of life and reduced survival rate.
  • Cachexia is commonly caused by chronic diseases (chronic respiratory disease, heart failure, renal failure, chronic infections, etc.) and cancer.
  • chronic diseases chronic respiratory disease, heart failure, renal failure, chronic infections, etc.
  • cachexia which occurs in cancer patients, can occur in all types of cancer, including lung cancer, pancreatic cancer, and gastroesophageal cancer (Baracos et al., Nat Rev Dis Primers, Jan 18;4:17105, 2018). Cachexia occurs in more than 50% of cancer patients, and cachexia is a direct cause of death in 20% of cancer patients.
  • the diagnostic criteria for cachexia in cancer patients are defined as a weight loss of more than 5% over 6 months, a weight loss of more than 2% in patients with a BMI of less than 20 kg/m2, or a weight loss of more than 2% accompanied by sarcopenia (Feaonetal et al., Lancet Oncol, May;12(5):489-95, 2011).
  • GDF15 (Growth differentiating factor-15) is increased in the blood of patients with chronic diseases accompanied by cachexia (chronic respiratory disease, heart failure, renal failure, chronic infection, etc.) and cancer patients, and is involved in the development of cachexia.
  • GDF15 has a low serum concentration (0.2 - 1.2 ng/dl), but in patients with chronic diseases and cancer, it increases by ⁇ 10 or more than 1000 times, causing cachexia such as appetite suppression, nausea, vomiting, and fat and muscle loss. Therefore, serum GDF15 has diagnostic utility because it increases with the severity of cachexia-causing disease (Breit et al., Annu Rev Physiol. 2021 Feb 10;83:127-151).
  • GDF15 which increases in cancer, is directly related to the development of cancer cachexia
  • neutralizing antibodies that inhibit GDF15 activity show an effect of improving cachexia by alleviating weight gain and loss of muscle and fat tissue in a mouse model of cancer cachexia (Lerner et al. , Journal of cachexia, sarcopenia and muscle 2016; 7: 467-482)
  • the receptor for GDF15 is GFRAL (GDNF family receptor alpha like), which is specifically expressed in the AP (Area postrema) and NTS (Nucleus tractus solitaris) regions of the hindbrain, and GFRAL receptor activation by GDF15 causes cancer cachexia (Mullican et al., Nature 2017, Hsu et. al., Nature 2017). After binding to GFRAL, GDF15 causes activation of GFRAL neurons through Ret signaling, leading to appetite suppression and weight loss (Goldman A et al., Nature 2017).
  • GFRAL GDNF family receptor alpha like
  • GDF15 dimer binds to domain 2 of GFRAL and activates cell signaling through the CLD1, 2, and 3 binding surfaces of Ret.
  • Ret is known to phosphorylate and activate downstream signals PI3K/AKT, PLC/PKC, and MEK/ERK (Mullican et al., Trends Endocrinol Metab. 2018 Aug;29(8):560-570).
  • the present inventors completed the present invention by identifying the role and effect of antisense oligonucleotides on GFRAL in the hindbrain.
  • the purpose of the present invention is to provide an oligomer that inhibits the expression of the human GFRAL (GDNF family receptor alpha like) gene.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and method for preventing or treating diseases related to the activation of GFRAL due to an increase in GDF15 containing the above oligomer.
  • Another object of the present invention is to use the above oligomer for the prevention or treatment of diseases associated with the activation of GFRAL due to an increase in GDF15 and to manufacture a drug for the prevention or treatment of diseases associated with the activation of GFRAL due to an increase in GDF15. It provides for the use of oligomers.
  • the present invention is a Watson-Crick base pairing with at least 13 consecutive nucleobases in the entire pre-mRNA of the human GFRAL (GDNF family receptor alpha like) gene represented by SEQ ID NO: 1.
  • Hybridization via A:T or G:C or wobble pairing G:U, I:A, I:C or I:U is possible and provides oligomers with a length of 13 to 35 nt.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases associated with activation of GFRAL due to an increase in GDF15 containing the above oligomer.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating diseases associated with activation of GFRAL due to an increase in GDF15 using the above oligomer.
  • the present invention also provides the use of the oligomer for the prevention or treatment of diseases associated with the activation of GFRAL due to an increase in GDF15, and the use of the oligomer for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of a disease associated with the activation of GFRAL due to an increase in GDF15. Provides use.
  • Figure 1 is a graph showing the results of a test confirming the possibility of suppressing the level of GFRAL mRNA expression when antisense oligonucleotide candidates according to the present invention were transfected into HEK293 GFRAL and RET cDNA overexpressing cells for 24 hours at a concentration of 200 nM.
  • Figure 2a is a graph showing the results of a test confirming the possibility of suppressing the level of GFRAL mRNA expression when 16 antisense oligonucleotide candidates according to the present invention were transfected into HEK293 GFRAL and RET cDNA overexpressing cells for 24 hours at a concentration of 100 nM.
  • Figure 2b shows the results of a test confirming the possibility of suppressing the level of GFRAL protein expression when HEK293 GFRAL and RET cDNA overexpressing cells were transfected for 48 hours.
  • Figure 3a is a graph showing the results of a test confirming the possibility of suppressing the level of GFRAL mRNA expression when eight antisense oligonucleotide candidates according to the present invention were transfected into HEK293 GFRAL and RET cDNA overexpressing cells for 24 hours at a concentration of 50 nM.
  • Figure 3b is a graph showing the results of a cytotoxicity confirmation test when eight types of antisense oligonucleotide candidates were transfected into HEK293 GFRAL and RET cDNA overexpressing cells for 48 hours at a concentration of 50 nM.
  • Figure 4a shows the results of a test to confirm the possibility of suppressing GFRAL protein expression when antisense oligonucleotide candidates according to the present invention were transfected into HEK293 GFRAL and RET cDNA overexpressing cells for 48 hours at a concentration of 50 nM.
  • Figure 4b is a graph quantifying the amount of GFRAL protein expression in Figure 4a.
  • Figure 5a is a schematic diagram for testing the in vivo toxicity of antisense oligonucleotide candidates according to the present invention.
  • Figure 5b shows the survival rate until 7 days after administration of the toxicity negative control, the toxicity positive control, and four antisense oligonucleotide candidates to experimental animals.
  • Figure 6 shows the results of staining GFRAL protein expression using a purified antibody 1 week after in vivo administration of the antisense oligonucleotide candidate according to the present invention.
  • the arrows in the pictures for each administration group indicate GFRAL positive neurons.
  • the fluorescence intensity of the area postrema (AP) was measured and the number of GFRAL positive neurons within the AP was confirmed and displayed in a graph.
  • Figure 7a shows the results of ASO distribution in the brain using the A427 probe staining technique 2 weeks after in vivo administration of the antisense oligonucleotide candidates according to the present invention.
  • Figure 7b is a graph quantifying ASO distribution within the brain.
  • Figure 8a shows the results of staining GFRAL gene expression 2 weeks after in vivo administration of the antisense oligonucleotide candidates according to the present invention.
  • Figure 8b shows the results of measuring the fluorescence intensity of Area postrema (AP) and confirming the number of GFRAL positive neurons in Area postrema (AP) and Nucleus tractus solitaris (NTS).
  • AP Area postrema
  • NTS Nucleus tractus solitaris
  • Figure 9a is a schematic diagram showing an animal experiment schedule for verifying the cancer cachexia treatment effect of the antisense oligonucleotide according to the present invention, and includes an experimental plan for creating a cancer cachexia animal model and administering the antisense oligonucleotide.
  • Figure 9b is a graph measuring the concentration of GDF15 in serum isolated from the experimental animals.
  • Figure 10a shows the results of measuring the weight of muscle tissue 1 week after antisense oligonucleotide administration in the animal model of the above experiment.
  • Figure 10b is a graph showing the results of confirming the protein expression of Atrogin-1 and MuRF1 in the above tissues by western blot and quantifying the results.
  • GFRAL GDNF family receptor alpha like
  • GDNF family receptor alpha type growth differentiation factor 15 receptor
  • GFRAL protein and similar terms refer to primates (unless otherwise stated).
  • polypeptides (“polypeptide” and “protein”) from vertebrate sources, including mammals such as humans, cynomolgus monkeys (cyno), dogs, and rodents (e.g., mice and rats). (used interchangeably herein) or any native GFRAL, and, in certain embodiments, a related GFRAL polypeptide, including SNP variants thereof.
  • GFRAL is also known in the art as “C6orf144”, “Chromosome 6 Open reading Frame 144”, “BA360D14.1”, “IVFI9356”, and “UNQ9356”.
  • Anti-sense oligonucleotide (ASO) technology is a technology that regulates the transfer of information from genes to proteins by changing the metabolism of mRNA through a single strand of RNA or DNA.
  • ASO Anti-sense oligonucleotide
  • ASO binding is sequence-specific to the target gene, it does not affect the expression of genes other than the target gene. Therefore, ASO technology is not only a useful tool in analyzing the in vivo role of a specific protein, but also has the potential to be used as a gene therapy for specific diseases (FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995).
  • Antisense DNA combines with the target mRNA to form an RNA/DNA double helix, and this RNA/DNA double helix structure is a type of RNase H (RNase H; ribonucleolytic enzyme that exists in vivo), and an RNA/DNA hybrid double helix is formed. Decomposition is caused by attack by an enzyme that specifically decomposes the formed mRNA. Antisense RNA forms an RNA/RNA double helix and is attacked by RNase L, causing degradation of the target mRNA. RNase L is a ribonucleolytic enzyme that preferentially decomposes single-stranded RNA around the double-stranded RNA strand (Pharmacol. Toxicol.32, 329-376, 1992).
  • the present invention relates to at least 13 consecutive nucleic acid bases in the entire pre-mRNA of the human GFRAL (GDNF family receptor alpha like) gene represented by SEQ ID NO: 1 and Watson-Crick base pairing A: It relates to oligomers capable of hybridization via T or G:C or wobble pairing G:U, I:A, I:C or I:U and having a length of 13 to 35 nt.
  • human GFRAL GDNF family receptor alpha like
  • the antisense oligomer (antisense oligonucleotide) according to the present invention can suppress the expression of the gene encoding human GFRAL, specifically mRNA (pre-mRNA or mature mRNA).
  • the antisense oligomer (antisense oligonucleotide) according to the present invention contains a sequence complementary to the mRNA encoding human GFRAL.
  • Antisense activity means any detectable or measurable activity that contributes to hybridization of an antisense compound to its target nucleic acid.
  • antisense activity is a reduction in the amount or expression of a target nucleic acid or a protein encoded by such target nucleic acid.
  • Antisense activity according to the invention acts on a target nucleic acid encoding GFRAL, reducing the amount or expression of the encoded GFRAL protein.
  • Targeting means specifically hybridizing to a target nucleic acid to induce a desired effect.
  • Target nucleic acid “Target nucleic acid,” “target RNA,” and “target RNA transcript” all refer to a nucleic acid that can be targeted by an antisense oligomer.
  • the present invention includes oligomers capable of hybridizing to target nucleic acids through hydrogen bonding.
  • “Inhibition” means reduction of target nucleic acid levels or target protein levels in the presence of an antisense compound complementary to the target nucleic acid compared to target nucleic acid levels or target protein levels in the absence of an antisense oligomer.
  • an “antisense oligomer” includes a single-stranded oligonucleotide having a nucleotide sequence that allows hybridization to a corresponding region or segment of a target nucleic acid.
  • the oligomer is capable of hybridizing with at least 13 consecutive nucleobases in the entire pre-mRNA (whole pre-mRNA) of the human GFRAL gene and can be characterized as having a length of 13 to 35 nt. .
  • the entire pre-mRNA of the human GFRAL gene may be represented by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1 is GenBank Homo sapiens chromosome 6, GRCh38.p14 Primary Assembly NC_000006.12 REGION: 55327469.. It is 55402493.
  • the oligomer according to the present invention contains at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17 or at least 18 consecutive nucleic acid sequences. Hybridization with nucleic acid bases is possible.
  • the conditions used to achieve a particular level of stringency vary depending on the nature of the nucleic acid being hybridized. For example, the length of the nucleic acid region to be hybridized, the degree of homology, the nucleotide sequence composition (e.g., GC/AT composition ratio), and the nucleic acid type (e.g., RNA, DNA) are considered in selecting hybridization conditions. A further consideration is whether the nucleic acid is immobilized, for example on a filter.
  • very stringent conditions examples include: 2X SSC/0.1% SDS at room temperature (hybridization conditions); 0.2X SSC/0.1% SDS at room temperature (low stringency conditions); 0.2X SSC/0.1% SDS at 42°C (moderate stringency conditions); 0.1X SSC at 68°C (high stringency conditions).
  • the washing process can be performed using one of these conditions, for example, high stringency conditions, or each of the above conditions, in the order described above, for 10 to 15 minutes each, all or all of the conditions described above. It can be performed partially repeatedly. However, as described above, optimal conditions vary depending on the particular hybridization reaction involved and can be determined through experimentation. Generally, high stringency conditions are used for hybridization of probes of interest.
  • At least one of the base pairs forming the hybridization may include a wobble pair G:U, I:A, I:C, or I:U.
  • the oligomer is capable of hybridizing with at least 13 consecutive nucleic acid bases included in any one nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 18, and has a length of 13 to 35 nt. It can be characterized as having.
  • the oligomer is an antisense oligomer containing 15 to 25 linked nucleosides, at least 9, at least 10 nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 18,
  • it is capable of hybridizing with at least 19 or 20 consecutive nucleobases selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 18, and may include an oligomer with a length of 13 to 35 nt.
  • the oligomer is capable of hybridizing with at least 13 consecutive nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, and SEQ ID NO: 18. It is possible and may be characterized as having a length of 13 to 35 nt.
  • the oligomer contains at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 consecutive nucleic acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 11. It is capable of hybridizing with a clay base and may contain an oligomer with a length of 13 to 35 nt.
  • the oligomer may have a length of 13 to 35 nt, or 16 to 25 nt, but is not limited thereto. Specifically, the oligomer may have a length of 16nt, 17nt, 18nt, 19nt, 20nt, 21nt, 22nt, 23nt, 24nt or 25nt.
  • At least one of the base pairs forming the hybridization may include a wobble pair G:U, I:A, I:C, or I:U.
  • the oligomer hybridizes with at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, or at least 18 consecutive nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11. It may be characterized as having a length of 13 to 35 nt, and at least one of the base pairs forming the hybridization may include a wobble pair G:U, I:A, I:C, or I:U. You can.
  • Consecutive nucleobases means nucleobases immediately adjacent to each other. “Internucleoside linkage” refers to the chemical bond between nucleosides. “Linked nucleosides” means adjacent nucleosides joined together.
  • Nucleic acid refers to a molecule composed of monomeric nucleotides. Nucleic acids include ribonucleic acid (RNA), deoxyribonucleic acid (DNA), single-stranded nucleic acid, double-stranded nucleic acid, small molecule interfering ribonucleic acid (siRNA), and microRNAs (miRNA). Nucleic acids can also contain combinations of these elements within a single molecule.
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • siRNA small molecule interfering ribonucleic acid
  • miRNA microRNAs
  • Nucleobase means a heterocyclic moiety capable of pairing with a base of another nucleic acid.
  • Nucleobase sequence means a sequence of consecutive nucleobases independent of any sugars, linkages, or nucleobase modifications.
  • Nucleoside means a nucleoside linked to a sugar
  • nucleotide means a nucleoside having a phosphate group covalently linked to the sugar portion of the nucleoside.
  • “Oligomer” means a polymer of linked monomeric subunits capable of hybridizing to regions of a nucleic acid molecule.
  • Oligonucleotide means a polymer of linked nucleosides, each of which, independently of the other, may be modified or unmodified.
  • Single-stranded oligonucleotide means an oligonucleotide that does not hybridize to a complementary strand.
  • At least one of the base pairs forming the hybridization may include a wobble pair G:U, I:A, I:C, or I:U.
  • the antisense oligomer according to the present invention may include, for example, a sequence having 90% or more sequence homology to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 34.
  • the antisense oligomer according to the present invention has, for example, a sequence having 90% or more sequence homology to one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 24 to SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 34. It can be included.
  • the antisense oligomer according to the present invention may include one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 24 to SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 34.
  • the antisense oligomer according to the present invention may include, for example, a sequence having 90% or more sequence homology to the sequence of SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 27.
  • the antisense oligomer according to the present invention may include, for example, the sequence of SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 27.
  • homology means percent identity between polynucleotide moieties. “Identity” refers to the degree to which sequences are functionally or structurally identical based on the polynucleotide sequence through a comparison window. Sequence homology can be confirmed by comparing sequences using standard software, for example, a program called BLASTN or BLASTX developed based on BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993). there is.
  • the antisense oligomer according to the invention may comprise 20 linked nucleosides.
  • the complementary sequence is meant to encompass some base deletions and incomplete complementarity corresponding to the extent of suppressing expression of the mRNA encoding GFRAL.
  • the antisense oligonucleotide selects one or more target sites in the nucleic acid sequence of the gene encoding GFRAL, selects an oligonucleotide sufficiently complementary to the target, and hybridizes sufficiently specifically with the target site. By doing so, the desired effect on regulating the expression of GFRAL can be obtained.
  • hybridization refers to hydrogen bonding, which may be Watson-Crick, Hoogsteen, or reverse Hoogsteen hydrogen bonding between complementary nucleoside or nucleotide bases. do.
  • adenine and thymine are complementary nucleic acid bases that pair up by forming hydrogen bonds.
  • hybridizable or “complementary” or “substantially complementary” means that a nucleic acid (e.g., RNA, DNA) can be produced under appropriate in vitro and/or in vivo conditions of temperature and solution ionic strength. Binding non-covalently to another nucleic acid in a sequence-specific, antiparallel manner (i.e., the nucleic acid binds specifically to the complementary nucleic acid), i.e.
  • a base sequence of nucleotides that can form, “anneal,” or “hybridize” the pairing of adenine (A) with uracil (U) and the pairing of guanine (G) with cytosine (C). means including.
  • the hybridization occurs between the antisense oligonucleotide disclosed herein and the nucleic acid sequence of the gene encoding GFRAL.
  • the most common mechanism of hybridization involves hydrogen bonding between complementary nucleic acid bases in a nucleic acid molecule.
  • Hybridization can occur under a variety of conditions. Stringent conditions are sequence dependent and determined by the nature and composition of the nucleic acid molecule being hybridized. Methods for determining whether a sequence can specifically hybridize with a target nucleic acid are known in the art.
  • the term “complementary” refers to the property of allowing precise pairing between two nucleotides. For example, when the base sequences of two different nucleic acids or oligonucleotides are written in the 5' to 3' direction, when the base sequences of a certain portion of one nucleic acid or oligonucleotide are aligned in the opposite direction.
  • nucleic acids or oligonucleotides are said to be complementary.
  • “specifically hybridizable” and “complementary” refer to a sufficient degree of complementarity or precise pairing between an oligonucleotide and a DNA or RNA target that allows stable specific binding to occur. It can be interpreted as a term used to represent. It is known in the art that the sequence of an antisense oligonucleotide does not need to be 100% complementary to the sequence of the target nucleic acid to which it specifically hybridizes.
  • the antisense oligonucleotide may specifically hybridize with the target DNA or RNA, thereby inhibiting the normal function of the target DNA or RNA, under conditions where specific binding is desirable, that is, under physiological conditions in the case of in vivo analysis or treatment. , in the case of in vitro analysis, it is interpreted that there is a sufficient degree of complementarity to prevent non-specific binding of the antisense oligonucleotide to the non-target sequence under the conditions under which the analysis is performed.
  • antisense oligonucleotide can specifically hybridize with the target nucleic acid, non-complementary nucleic acid bases between the antisense oligonucleotide and the target nucleic acid can be tolerated.
  • antisense oligonucleotides can hybridize to one or more nucleic acid portions such that intervening or adjacent portions do not participate in hybridization (e.g., loop structures, mismatches, or hairpin structures).
  • each nucleic acid base of an antisense oligonucleotide is capable of precise base pairing with the corresponding nucleic acid base of the target nucleic acid.
  • the location of the non-complementary nucleic acid base may be located at the 5' end or 3' end of the antisense oligonucleotide.
  • non-complementary nucleic acid bases or nucleic acid bases may be located inside the antisense oligonucleotide.
  • two or more non-complementary nucleic acid bases may be contiguous (i.e., joined) or not.
  • the non-complementary nucleic acid base may be located in the wing portion of a gapmer antisense oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention may include those complementary to the nucleic acid sequence portion of the gene encoding GFRAL.
  • portion refers to a predetermined number of nucleic acid bases adjacent to (i.e., bound to) a region or portion of a target nucleic acid. The portion also refers to a certain number of contiguous nucleic acid bases of an antisense oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide may be complementary to at least 8 nucleic acid base portions, may be complementary to at least 12 nucleic acid base portions, and may be complementary to at least 15 nucleic acid base portions of the target portion.
  • nucleotide refers to a monomeric molecule constituting a nucleic acid consisting of a combination of a nucleobase, a sugar moiety, and a phosphate group, and the nucleotide is a nucleotide. It can be interpreted as a concept that includes all unmodified or modified nucleobases, sugar moieties and/or phosphate groups, such as analogs, modified nucleotides, non-natural nucleotides, non-standard nucleotides, etc.
  • nucleoside is glycosylamine, which is considered to be the part of a nucleotide excluding the phosphate group, and refers to a monomeric molecule composed of a nucleobase and a sugar moiety, and the nucleoside is a nucleotide. Likewise, it can be interpreted as a concept that includes both nucleosides in which the nucleobase "G/or sugar moiety is modified or unmodified.
  • oligonucleotide refers to a oligonucleotide or polymer of ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA) or their analogs, and the oligonucleotide is generally Oligonucleotides consisting of covalent bonds between nucleobases, sugars, and nucleosides (skeletons) that exist in vivo, as well as modifications consisting of nucleotide analogs, modified nucleotides, non-natural nucleotides, and non-standard nucleotides that act similarly. or substituted oligonucleotides.
  • modified or substituted oligonucleotides have properties such as improved cellular uptake, improved nucleic acid target affinity, and increased stability in the presence of nucleases compared to unmodified or unsubstituted oligonucleotides.
  • anti-sense oligonucleotide As used herein, “anti-sense oligonucleotide (ASO)” is interpreted to include an oligonucleotide capable of hybridizing with a target nucleic acid sequence by hydrogen bonding.
  • Antisense oligonucleotides are oligonucleotides, oligonucleotide analogs, oligonucleotide mimetics, siRNA, single-stranded siRNA (ss siRNA), small hairpin RNA (shRNA), and micro RNA that hybridize with the target nucleic acid sequence and regulate its expression.
  • oligonucleotide includes, but is not limited to, mimetics, ribozymes, external guide sequence oligonucleotides, and other oligonucleotides, and the antisense oligonucleotide is interpreted as including single-stranded and double-stranded oligonucleotides. do.
  • the antisense oligonucleotide when written in the 5' to 3' direction, it has a nucleic acid base sequence that includes the reverse complement of the target portion of the target nucleic acid sequence to be targeted.
  • the antisense oligonucleotide can bind complementary to the nucleic acid sequence of the gene encoding GFRAL.
  • the gene encoding the GFRAL is a nucleic acid that is the target of the antisense oligonucleotide and may be selected from mRNA and pre-mRNA including introns, exons, and untranslated regions.
  • the oligomer may be characterized as comprising a modified internucleoside linker, a modified nucleobase, or a chemical modification of the modified nucleoside.
  • the modified nucleobase may be 5'-methyl-cytosine.
  • the internucleoside linkage may be a phosphorothioate, boranophosphate, or methyl phosphonate linkage.
  • the internucleoside linkage according to the present invention may be a sooossssssssssooos linkage.
  • s may be a phosphorothioate internucleoside linkage, and
  • o may be a phosphodiester internucleoside linkage.
  • the nucleosides may include the following modified sugars:
  • the nucleoside linkage may be a phosphorothioate, boranophosphate, or methyl phosphonate linkage; and 2'-O-methyl(2'-O-Me), 2'-O-methoxyethyl (2'MOE), 2'-O-methoxyethyl-5'methyl at the 2' carbon position of the sugar structure.
  • 2'-O-aminoethyl, 5'-methyl, 2'-O-propyl, 2'-methylthioethyl, or 2'-Fluoro. may include.
  • the nucleoside may be characterized as comprising a modification selected from the group consisting of:
  • the modification includes modification of the sugar moiety, for example, modification at the 2' carbon position of the sugar structure in the nucleotide, specifically, 2'-O-methyl (2'-O-Me), 2'-O-methoxyethyl ( 2'MOE), 2'-O-methoxyethyl-5'methyl, 2'-O-aminoethyl, 5'-methyl, 2'-O-propyl, 2'-methylthioethyl , or modified to 2'-Fluoro; Modification of the nucleotide linkage to phosphorothioate, boranophosphate, or methyl phosphonate; Modification to peptide nucleic acid (PNA), locked nucleic acid (LNA), or unlocked nucleic acid (UNA) form; and a phosphate group.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA locked nucle
  • 2'-O-methoxyethyl refers to the O-methoxy-ethyl modification at the 2' position of the furosyl ring.
  • 2'-O-methoxyethyl nucleotide means a nucleotide comprising a 2'-O-methoxyethyl modified sugar moiety.
  • Modified sugar refers to a substitution or change from a natural sugar.
  • 5-methylcytosine means cytosine modified with a methyl group attached to the 5′ position.
  • 5-Methylcytosine is a modified nucleobase.
  • Modified internucleoside linkage means a substitution or any change from a naturally occurring internucleoside linkage.
  • Modified nucleobase means any nucleobase other than adenine, cytosine, guanine, thymidine, or uracil. “Modified nucleobase” refers to the purine bases adenine (A) and guanine (G) and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C), and uracil (U).
  • Modified nucleotide means, independently, a nucleotide that has a modified sugar moiety, a modified internucleoside linkage, or a modified nucleobase.
  • Modified nucleoside means, independently, a nucleoside having a modified sugar moiety or a modified nucleoside.
  • Modified oligonucleotide means an oligomer comprising at least one modified nucleotide.
  • Antisense oligomers according to the present invention are modified with 2'-O-methoxyethyl (2'MOE), 2'-O-methoxyethyl-5'methyl, 5'-methyl or phosphorothioate linkages. may include.
  • the modified nucleoside is modified with a non-bicyclic modified sugar moiety and/or a bicyclic or tricyclic sugar moiety, and/or a sugar substitute or sugar mimetic, etc. It may be a modified nucleoside containing a modified sugar moiety.
  • the modified nucleoside is, for example, 2'-O-alkyl such as 2'-O-methyl, 2' such as 2'-O-methoxy.
  • -O-alkoxy such as 2'-O-alkoxyalkyl, 2'-amino, 2'-allyl, such as 2'-O-methoxyethyl
  • the sugar moiety may have one or more substituents selected from the group consisting of '-vinyl and 5'-methoxy introduced, but is not limited thereto.
  • Antisense oligomers according to the invention may optionally comprise one or more modified nucleosides with substituted or modified sugar moieties. Modification of the sugar moiety imparts nuclease stability, binding affinity or other advantageous biological properties to the oligomer.
  • the (pento)furanosyl sugar ring of the natural nucleoside may be modified by addition of a substituent (particularly at the 2'position); The cross-linking of two orthostatic ring atoms to form a bicyclic nucleic acid (BNA); and substitution of atoms or groups such as -S-, -N(R)-, or -C(R1)(R2) on the ring oxygen at the 4'-position, but is not limited thereto. .
  • BNA bicyclic modified sugars
  • the modified nucleoside has F at the 2'position; O-, S-, or N-alkyl; O-, S- or N-alkenyl; O-, S- or N-alkynyl; O-alkyl-O-alkyl; O-alkyl-O-alkyl-N(dialkyl); or O-alkyl-carboxylamide, wherein alkyl, alkenyl and alkynyl are substituted or unsubstituted C 1 to C 10 alkyl or C 2 to C 10 alkenyl and alkynyl.
  • O[(CH 2 )nO]m CH 3 , O(CH 2 )nOCH 3 , O(CH 2 )nNH 2 , O(CH 2 )nCH 3 , O(CH 2 )nONH 2 , O(CH 2 )n0 (CH 2 )nN[(CH 2 )mCH 3 ] 2 , O(CH 2 )nC( O)-NHCH 3 and O(CH 2 )n0N[(CH 2 )mCH 3 ] 2 are particularly preferred (where , n and m are from 0 to about 10).
  • the modification is 2'-methoxyethoxy (2'-O-CH 2 CH 2 OCH 3 , also known as 2'-O-(2-methoxyethyl) or 2'-MOE) (Martin et al., HeIv. Acta, 1995, 78, 486-504), i.e., an alkoxyalkoxy group, and the modification is 2'-dimethylaminooxyethoxy (i.e., also known as 2'-DMAOE).
  • the bicyclic or tricyclic sugar moiety is, for example, locked nucleic acid (LNA), constrained ethyl bicyclic nucleic acid (cEt), 2'-O,4'- It may be selected from the group consisting of C-ethylene-bridged nucleic acid (2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid (ENA)) and tricyclo-DNA, but is not limited thereto.
  • LNA locked nucleic acid
  • cEt constrained ethyl bicyclic nucleic acid
  • EDA C-ethylene-bridged nucleic acid
  • tricyclo-DNA tricyclo-DNA
  • the modified nucleoside may include a sugar substitute having a 6-membered ring or an acyclic moiety.
  • the sugar substitutes include, for example, morpholino rings such as phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO), cyclohexenyl rings, cyclohexyl rings and, for example, hexitol, anitol. , mannitol, and fluorohexitol may be selected from the group consisting of tetrahydropyranyl rings, but are not limited thereto.
  • PMO phosphorodiamidate morpholino oligomer
  • cyclohexenyl rings cyclohexyl rings
  • mannitol, and fluorohexitol may be selected from the group consisting of tetrahydropyranyl rings, but are not limited thereto.
  • a variety of other bicyclic and tricyclic sugar substitution ring systems are known in the art that can be used to modify
  • sugar substitute may be, for example, an acyclic moiety such as unlocked nucleic acid (UNA) or peptide nucleic acid (PNA), but is not limited thereto.
  • UNA unlocked nucleic acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • PNA Peptide nucleic acid
  • PNA Peptide nucleic acid
  • PNA is a type of nucleic acid analogue in which the nucleobases are linked by peptide bonds rather than phosphate bonds. The phosphodiester bonds are replaced by peptide bonds, and adenine, thymine, guanine, It has a nucleobase like cytosine, so it can specifically cause a hybridization reaction with nucleic acids.
  • PNA is not found in nature, but is artificially synthesized through chemical methods, and can form a double strand through a hybridization reaction with nucleic acids of complementary base sequences.
  • PNA is not only chemically stable because it is electrically neutral, but is also biologically stable because it is not degraded by nucleases or proteases.
  • PNA is most widely used with an N-aminoethylglycine backbone, but as known in the art, PNA with a modified backbone can also be used (P.E. Nielsen and M. Egholm "An Introduction to PNA” in P.E. Nielsen (Ed .) “Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications” 2nd Ed. (Horizon Bioscience, 2004).
  • Unlocked nucleic acid is a modified nucleoside that does not have the C2'-C3' bond of ribose. Due to its open chain structure, the steric configuration is not restricted and the flexibility of the oligonucleotide can be adjusted. You can. It is known that when UNA is included in the oligomer, the Tm value can be lowered by about 5°C to 10°C and off-targets can be reduced.
  • the modified nucleosides are pseudouridine, 2'-thiouridine, N6'-methyladenosine, 5'-methylcytidine, 5'- Fluoro-2-deoxyuridine, N-ethylpiperidine 7'-EAA triazol modified adenine, N-ethylpiperidine 6 '-triazole modified adenine (N-ethylpiperidine 6'-triazol modified adenine), 6'-phenylpyrrolocytosine, 2',4'-difluorotoluylibonucleoside (2' It may be characterized as a modified nucleoside containing one or more modified nucleobases selected from the group consisting of 4'-difluorotoluylribonuleoside) and 5'-nitroindole. It is not limited.
  • Unmodified or natural nucleic acid bases refer to the purine bases adenine (A) and guanine (G), and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C) and uracil (U).
  • the modified nucleosides may also include nucleobase modifications or substitutions.
  • Nucleobase modifications or substitutions are structurally distinct forms, but can be functionally interchanged with naturally occurring or synthetic unmodified nucleobases. Naturally occurring and modified nucleobases can participate in hydrogen bonding. These nucleobase modifications confer nuclease stability, binding affinity, or other advantageous biological properties to the antisense oligomer. For example, certain nucleobase substitutions, such as 5-methylcytosine substitution, are known to increase nucleic acid duplex stability by 0.6-1.2°C and may be particularly useful in enhancing the binding affinity of antisense oligomers for target nucleic acids.
  • the modified nucleobases include 5'-hydroxymethyl cytosine, xanthine, hypoxanthine, 2'-aminoadenine, 6'-methyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2'-methyl of adenine and guanine.
  • Propyl and other alkyl derivatives 2'-thiouracil, 2'-thiothymine and 2'-thiocytosine, 5'-halouracil and cytosine, 5'-propynyl (-C ⁇ C-CH3) uracil and cytosine and pyri.
  • alkynyl derivatives of midine bases 6'-azouracil, cytosine and thymine, 5'-uracil (pseudouracil), 4'-thiouracil, 8'-halo, 8'-amino, 8'-thiol, 8' -thioalkyl, 8'-hydroxy and other 8'-substituted adenines and guanines, 5'-halo (especially 5'-bromo), 5'-trifluoromethyl and other 5'-substituted uracils and Cytosine, 7'-methylguanine and 7'-methyladenine, 2'-F-adenine, 2'-amino-adenine, 8'-azaguanine and 8'-azaadenine, 7'-deazaguanine and 7'- deazaadenine and 3'-deazaguanine and 3-deazaadenine, phenoxazine cytidine (lH-pyrimi
  • modified nucleobases are described in U.S. Pat. No. 3,687,808, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613], and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu , B. ed., CRC Press, 1993.
  • the modified internucleoside linkage group is phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphotriester, phosphoramidate,
  • One or more modified nucleosides selected from the group consisting of mesyl phosphoramidate, methylphosphonate, methoxypropyl-phosphonate and boranophosphate It can be characterized as an interconnector.
  • phosphate groups typically form the internucleoside backbone of oligonucleotides, and the naturally occurring linkage and backbone of RNA and DNA is a 3' to 5' phosphodiester linkage.
  • Antisense oligomers may include bonds between naturally occurring nucleosides, as well as bonds between one or more modified nucleosides, which may enhance cellular uptake, enhance affinity for target nucleic acids, increase stability in the presence of nucleases, etc. Due to their properties, they are often selected over antisense oligomers containing naturally occurring internucleoside linkages.
  • oligonucleotide containing a modified backbone or unnatural internucleoside linkage is an oligonucleotide containing a modified backbone or unnatural internucleoside linkage.
  • oligonucleotides having a modified backbone include nucleotides that contain a phosphorus atom in the backbone and nucleotides that do not contain a phosphorus atom in the backbone.
  • modified oligonucleotides that do not contain a phosphorus atom in the internucleoside backbone are also interpreted as oligonucleotides.
  • Representative linkages between phosphoric acid containing nucleosides include phosphorothioate, chiral phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoryester, aminoalkylphosphoryester, 3'-alkylene phosphonate, 5'-alkyl Methyl and other alkyl phosphonates, including lene phosphonates and chiral phosphonates, phosphinates, their normal 3'-5' linkage, and 3'-amino phosphorames with 2'-5' linkage analogs.
  • Phosphoramidates including date and aminoalkylphosphoramidates, mesyl phosphoramidate, thionophosphoramidate, thionoalkylphosphonate, thionoalkylphosphotriester, serenophosphate and boranophosphate. And it may be a compound having opposite polarity in which one or more inter-nucleotide bonds are 3'-3', 5'-5' or 2'-2' bonds, but is not limited thereto.
  • the modified oligonucleotide includes a gap segment composed of linked deoxynucleosides, a 5' wing segment composed of linked nucleosides, and a 3' wing segment composed of linked nucleosides, and the gap segment is located between the 5'wing segment and the 3'wing segment, and the nucleoside of each wing segment may include, but is not limited to, a modified sugar moiety or sugar substitute.
  • the modified oligonucleotide includes a gap segment consisting of 8 to 10 linked deoxynucleosides; a 5' wing segment consisting of 3 to 5 linked nucleosides; and a 3' wing segment consisting of 3 to 5 linked nucleosides, where each nucleoside of each wing segment may be characterized as comprising a modified sugar moiety, but is not limited thereto.
  • an internal region with a number of nucleotides that support RNaseH cleavage is located between the nucleosides of the internal region and an external region with a number of chemically different nucleosides.
  • the gap segment supports cleavage of the target nucleic acid, while the wing segment is a modified nucleoside to improve stability, affinity, and exonuclease resistance. It may contain a modified oligonucleotide containing.
  • the gap segment may also include modified oligonucleotides.
  • the modified oligonucleotide is one selected from one or more modified nucleosides comprising one or more modified internucleoside linkages, one or more modified nucleosides comprising a modified sugar moiety, and one or more modified nucleosides comprising a modified nucleobase. It may include the above modifications, and each modification is as described above.
  • the antisense oligomer preferably includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 34, and may be characterized as including the chemical modification of Table 2, but is limited thereto. That is not the case.
  • the oligomer can most preferably be characterized as comprising the structure of the following formula (I) or formula (II):
  • A is 2'MOE-A
  • C is 2'MOE-5'-methyl-C
  • G is 2'MOE-G
  • T is 2'MOE-T
  • 5 is DNA-A
  • 6 is DNA-5.
  • 7 means DNA-G
  • 8 means DNA-T
  • * means PS (phosphorothioate)
  • 2'MOE means 2'-O-methoxyethyl.
  • formulations are employed to facilitate use of the oligomer, for example, to minimize degradation, facilitate delivery and/or absorption, or provide other beneficial properties for the oligonucleotide in the formulation. Therefore, various formulations that can deliver oligonucleotides to a subject or cellular environment have been developed.
  • the antisense oligomer for reducing the expression of GFRAL is suitably formulated so that when administered to a subject in the environment facing the target cell or systemically, a sufficient portion of the oligomer enters the cell to reduce the expression of GFRAL.
  • the antisense oligomer may be formulated in the form of a buffer solution, for example, phosphate buffered saline solution, liposome, micelle structure, or capsid. It can also be formulated in water or an aqueous solution (e.g., pH adjusted water) or a basic buffered aqueous solution (e.g., PBS).
  • a formulation of an oligomer having a cationic lipid can be used to facilitate introduction of the oligomer into cells.
  • cationic lipids such as lipofection, cationic glycerol derivatives, and polycationic molecules (e.g., polylysine) can be used, and suitable lipids include oligofectamine, lipofectamine (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.), or FuGene 6 (Roche), all of which may be used according to the manufacturer's protocol.
  • These formulations may include lipid nanoparticles.
  • the formulation may include excipients.
  • Excipients may include liposomes, lipids, lipid complexes, microspheres, microparticles, nanospheres, or nanoparticles, or may be otherwise formulated for administration to a cell, tissue, organ, or body of a subject in need thereof ( See, for example, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Pharmaceutical Press, 2013). Excipients provide the composition with improved stability, improved absorption, improved solubility and/or therapeutic enhancement of the active ingredient.
  • the excipient may be a buffering agent (e.g., sodium citrate, sodium phosphate, tris base, or sodium hydroxide) or a vehicle (e.g., buffered solution, petrolatum, dimethyl sulfoxide, or mineral oil).
  • a buffering agent e.g., sodium citrate, sodium phosphate, tris base, or sodium hydroxide
  • vehicle e.g., buffered solution, petrolatum, dimethyl sulfoxide, or mineral oil.
  • the oligomer can be lyophilized to extend its shelf life and then brought into solution before use.
  • excipients in compositions comprising oligomers according to the invention may include lyophilization protectants (e.g., mannitol, lactose, polyethylene glycol, or polyvinyl pyrrolidone), or decay temperature modifiers (e.g., dextran, ficoll). or gelatin) may be used.
  • compositions suitable for injectable use may include sterile aqueous solutions (if water soluble) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions.
  • suitable carriers include saline, bacteriostatic water, Cremophor EL.TM. (BASF) or phosphate buffered saline (PBS).
  • the carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof.
  • isotonic agents such as sugars, polyalcohols (e.g. mannitol, sorbitol) and sodium chloride.
  • Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the required amount of oligonucleotide in a solvent of choice with one or a combination of ingredients enumerated above, as required, followed by filtered sterilization.
  • the pharmaceutical composition may contain a dose of at least about 0.1% of a therapeutic agent (e.g., an antisense oligonucleotide to reduce expression of WFDC2) or more, but the percentage of active ingredient may be approximately 0.1% by weight or volume of the total composition. Preferably it is 1% to about 80%. Factors such as solubility, bioavailability, biological half-life, route of administration, product shelf life, as well as other pharmacological considerations will be considered in the preparation of the dosage form.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing the above oligomer for preventing or treating diseases associated with activation of GFRAL due to an increase in GDF15.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating diseases associated with activation of GFRAL due to an increase in GDF15, comprising administering the oligomer to a subject.
  • the present invention relates to the use of the above oligomer for the prevention or treatment of diseases associated with activation of GFRAL due to increase in GDF15.
  • the present invention relates to the use of the above oligomer for the manufacture of a drug for the prevention or treatment of diseases associated with activation of GFRAL due to an increase in GDF15.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the progression of a disease related to the activation of GFRAL due to an increase in GDF15 by administration of the composition of the present invention
  • treatment refers to any action that inhibits or delays the progression of a disease related to the activation of GFRAL due to an increase in GDF15 by administering the composition of the present invention. It refers to the inhibition of the development of diseases associated with the activation of GFRAL and the alleviation or elimination of symptoms.
  • the disease associated with the activation of GFRAL due to the increase in GDF15 may be characterized as obesity, diabetes, anorexia, or cachexia, but is not limited thereto.
  • the disease may be cancer cachexia.
  • Cachexia is a weakened metabolism that is associated with a number of conditions, including cancer, AIDS, chronic heart failure (also known as congestive heart failure), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic kidney disease, tuberculosis, sepsis, and other forms of systemic inflammation. It's a syndrome.
  • cachexia is a wasting disorder associated with involuntary weight loss and may be associated with systemic inflammation and/or acute inflammatory responses.
  • loss of fat mass is often the main clinical feature of cachexia.
  • Sarcopenia a loss of muscle mass, can cause functional impairment, including loss of strength, increased tendency to fall, and loss of autonomy. Respiratory function may also be impaired, resulting in reduced lung capacity.
  • sarcopenia is usually a geriatric disease, its development may be associated with muscle disuse and malnutrition, and may coincide with cachexia.
  • Cachexia can progress through stages named precachexia, cachexia, and refractory cachexia.
  • a number of malignant cancers express GDF15 at increased levels in serum.
  • chemoresistance is correlated with high GDF15 expression.
  • GDF15 a member of the TGF- ⁇ superfamily, is a mediator of cachexia caused by various diseases. Since GFRAL is a high-affinity receptor for GDF15, the antisense oligomer according to the present invention can be used for the prevention or treatment of GDF15-induced cancer cachexia.
  • cancer and “tumor” are used interchangeably and typically refer to or mean a physiological condition in mammals characterized by uncontrolled cell growth/proliferation.
  • the pharmaceutical composition may be characterized as containing a therapeutically effective amount of an antisense oligomer.
  • the “pharmaceutically (pharmaceutically) acceptable carrier” is a substance that can be added to the active ingredient to help formulate or stabilize the preparation and does not cause significant detrimental toxic effects to the patient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are those commonly used in preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, poly Includes, but is not limited to, vinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • lubricants wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • administration refers to introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a patient by any appropriate method.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, such as by infusion or intravenously.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and is usually A skilled doctor can easily determine and prescribe an effective dosage for desired treatment or prevention.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to prevent or treat obesity, diabetes, anorexia, or cachexia.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be used in combination with conventional therapeutic agents.
  • GFRAL mRNA target sequences SEQ ID NO: 3 to 18
  • pre-mRNA sequence pre-mRNA sequence
  • GFRAL mature-RNA sequence SEQ ID NO: 1 to 2
  • antisense 16 sequences SEQ ID NOs: 19 to 34
  • antisense oligonucleotides were developed by applying chemical modification to the 16 types of complementary sequences in Table 1 (Table 2).
  • the antisense oligonucleotide structure is conventionally known to be stable and effective, with a “gap” portion consisting of 10 nt DNA nucleotides inside and a 2'-MOE (2'-MOE) at the 5'-end and 3'-end, respectively.
  • a “gapmer” containing a “wing” region consisting of 4-6 nt 2’MOE nucleotides each with a methoxyethyl modified backbone was used.
  • a phosphorothioate bond (PS bond) was used instead of the usual phosphodiester bond (PO bond) as a bond connecting two DNA nucleosides or a DNA nucleoside and a 2'MOE nucleoside, and 2'MOE PS bonds were used only for bonds located at both ends of the sequence of the wing portion composed of nucleotides, and PO bonds were used for the remaining portions.
  • PO bond phosphodiester bond
  • antisense oligonucleotide candidates targeting GFRAL mRNA were derived and manufactured by Chemgenes (USA).
  • the antisense oligonucleotides were transfected into HEK293 cells overexpressing GFRAL and RET cDNA at a concentration of 200 nM using lipofectamine (Invitrogen, USA) reagent, and then 24 hours later, RNA extraction kit (Bioneer, Korea) and RNA was purified by treatment with DNA degrading enzyme (NEB, USA), and reverse transcription reaction was performed using RT-Premix (Applied Biosystems, USA). Next, qRT-PCR was performed to measure the level of GFRAL gene expression. The following primer and probe sequences were used for qRT-PCR:
  • GFRAL predesigned qPCR Assay (Hs.PT.58.21179605, IDT, USA)
  • HEK293 cell line expressing GFRAL and RET cDNA 100 nM ASO was administered to 16 types of antisense oligonucleotides using lipofectamine (Invitrogen, USA) reagent, and it was repeatedly observed whether knockdown of the GFRAL gene was possible.
  • ASO was transfected for 24 hours, then cells were lysed using lysis and RT kits, and reverse transcription reaction was performed.
  • qRT-PCR was performed using a Taqman probe and qRT-PCR premix (Applied Biosystems, USA) to measure the level of GFRAL gene expression.
  • Figure 2a it was confirmed that eight types of antisense oligonucleotides exhibited a knockdown effect at a concentration of 100 nM.
  • a third screening was performed on the eight antisense oligonucleotides selected in Experimental Examples 1 and 2 by administering 50 nM of ASO using the same method as in Experimental Examples 1 and 2.
  • all eight types of antisense oligonucleotides showed very excellent knockdown efficiency at a concentration of 50 nM.
  • cytotoxicity was measured using Quantimax wst-8 cell viability assay kit (Abcam, UK), and western blot assay was performed under the same conditions to confirm GFRAL gene protein expression.
  • Figure 3b it was confirmed that none of the eight antisense oligonucleotide candidates decreased cell viability.
  • 2 ⁇ l (20 ⁇ g) of the antisense oligonucleotide of the example was administered to the left hemisphere of the brain by intracerebroventricular (ICV) injection to C57BL/6J wild-type mice aged 0 to 2 days after birth, and the survival rate was measured after 7 days (FIG. 5a).
  • ICV intracerebroventricular
  • 8.5 ⁇ l (500 ⁇ g) of antisense oligonucleotides (A114, A427) was administered to 8-week-old male C57BL/6N wild-type mice by intracerebroventricular (ICV) injection, and after 1 week, saline solution (sodium chloride, perfusion agent; JW Pharmaceutical corporation, Korea) ) and 4% paraformaldehyde (FUJIFILM, Japan) were sequentially perfused through the aorta to fix the brain tissue. Brain tissue was extracted and fixed a second time in the same fixative solution for 24 hours. After washing twice with phosphate buffer solution containing 30% sucrose at 4°C, it was frozen and sectioned at 30 ⁇ m in a cryostat.
  • phosphate buffer solution containing 30% sucrose at 4°C
  • 8.5 ⁇ l (500 ⁇ g) of antisense oligonucleotides (A114, A427, A428) was administered to 8-week-old male C57BL/6N wild-type mice by intracerebroventricular (ICV) injection, and after 2 weeks, saline (sodium chloride, perfusion agent) and 4% Brain tissue was first fixed by sequentially perfusing paraformaldehyde through the aorta. The brain was removed and fixed a second time in the same fixative solution for 24 hours. After washing twice with phosphate buffer solution containing 30% sucrose at 4°C, it was frozen and sectioned at 10 ⁇ m in a cryostat. After staining the ASO probe with RNAscopeTM Plus smRNA-RNA HD Reagent kit (ACD bio, USA), the biodistribution of the ASO probe was observed using Fluorescence in situ hybridization (FISH) technique.
  • FISH Fluorescence in situ hybridization
  • A427 was confirmed to be distributed in the hindbrain including the AP (Area postrema) and NTS (Nucleus tractus solitaris).
  • 8.5 ⁇ l (500 ⁇ g) of antisense oligonucleotides (A114, A427, A428, A429, A430) was administered to 8-week-old male C57BL/6N wild-type mice by intracerebroventricular (ICV) injection, and after 2 weeks, saline solution (sodium chloride, perfusion agent) was administered. ) and 4% paraformaldehyde were sequentially perfused through the aorta to fix the brain tissue. Brain tissue was extracted and fixed a second time in the same fixative solution for 24 hours. After washing twice with phosphate buffer solution containing 30% sucrose at 4°C, it was frozen and sectioned at 10 ⁇ m in a cryostat. After staining GFRAL RNA with RNAscopeTM Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Kit (ACD bio, USA), changes in the expression level of GFRAL RNA were confirmed using fluorescence in situ hybridization (FISH) technique.
  • FISH fluorescence in situ hybrid
  • Colon cancer cells (MC38) were injected into 8-week-old male C57BL/6J wild-type mice using intraperitoneal injection (IP injection), and after 2 weeks, 500 ⁇ g of antisense oligonucleotides (A427, A430) were injected into the ventricle. It was administered through my injection.
  • concentration of GDF15 in serum which has diagnostic utility for cancer cachexia, was measured using a Quantikine ELISA kit (R&D Systems, USA) (FIG. 9a).
  • antisense oligonucleotide candidates that regulate GFRAL expression were discovered, and it was confirmed that these candidates effectively inhibited GFRAL expression in vivo and showed an improvement effect in a cancer cachexia animal model. Therefore, the antisense oligonucleotide of the present invention is expected to have very high applicability as a treatment for obesity or cancer cachexia through inhibition of GFRAL expression.

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Abstract

본 발명은 GFRAL(GDNF family receptor alpha like) 유전자를 표적으로 하는 GFRAL 특이적 안티센스 올리고머 및 이를 포함하는 비만, 당뇨, 식욕부진 또는 악액질 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머가 생체 내 GFRAL 발현을 효과적으로 억제하며, 암 악액질 동물모델에서 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, GFRAL 발현 억제를 통해 비만 또는 악액질 치료제로서 적용가능성이 매우 높을 것으로 기대된다.

Description

GFRAL을 표적으로 하는 안티센스 올리고머 및 이의 용도
본 발명은 GFRAL(GDNF family receptor alpha like) 유전자를 표적으로 하는 GFRAL 특이적 안티센스 올리고머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 염기서열을 포함하는 GFRAL 특이적 안티센스 올리고머 및 이를 포함하는 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
악액질(cachexia)은 복합적인 대사 이상으로 근육 소실이 특징이며, 지방 조직의 감소를 흔히 동반하고 적절한 칼로리 보충에 의해서도 회복되지 않는 비가역적인 질병상태를 의미한다. 악액질은 식욕 부진, 체중 감소, 지방 조직 및 근육 소실, 우울증을 동반하여 삶의 질이 낮으며 생존율 저하의 원인이 된다. 악액질은 만성질환(만성호흡기질환, 심부전, 신부전, 만성감염 등) 및 암에 의해서 흔히 발생된다. 암을 비롯한 만성질환에서 발생되는 악액질의 치료에 있어서, 원인 교정 이외에는 식욕 촉진 약물 투여, 운동, 염증 억제 약물 투여 등으로 회복되지 않는다(Baracos et al., Nat Rev Dis Primers, Jan 18;4:17105, 2018). 따라서 악액질은 진행을 억제하고 회복하는 치료제가 없는 미충족 의료 수요로 남아있다.
특히 암환자에서 나타나는 악액질은 폐암, 췌장암 및 위 식도암을 비롯하여 모든 유형의 암에서 발생할 수 있다(Baracos et al., Nat Rev Dis Primers, Jan 18;4:17105, 2018). 악액질은 암 환자의 50% 이상에서 발생되며, 암 환자의 20%는 악액질이 직접적인 사망의 원인이 된다. 암환자에서 악액질의 진단 기준은 6개월 동안 5% 이상의 체중감소 또는 BMI가 20kg/m2 미만인 환자에서 2% 이상의 체중감소, 근감소증을 동반한 2% 이상의 체중감소로 정의된다(Feaonetal et al., Lancet Oncol, May;12(5):489-95, 2011).
GDF15(Growth differentiating factor-15)은 악액질을 동반하는 만성질환(만성호흡기질환, 심부전, 신부전, 만성감염 등) 및 암 환자의 혈액내에서 증가되어 악액질의 발생에 관여한다. 정상인에서 GDF15은 낮은 혈청농도(0.2 - 1.2 ng/dl)를 나타내지만 만성질환 및 암 환자에서는 ~10 혹은 1000배 이상 증가되어 식욕억제, 구역, 구토, 지방 및 근육 소실 등 악액질 소견을 유발한다. 따라서, 혈청 GDF15은 악액질 유발 질병의 중증도에 의해서 증가하기 때문에 진단적 유용성을 가지고 있다(Breit et al., Annu Rev Physiol. 2021 Feb 10;83:127-151). 암에서 증가하는 GDF15은 암 악액질의 발생과 직접적인 관련성이 있으므로 GDF15 활성을 억제하는 중화항체는 암 악액질 마우스 모델에서 체중 증가와 근육, 지방 조직의 손실을 완화하여 악액질 개선 효과를 보인다(Lerner et al., Journal of cachexia, sarcopenia and muscle 2016; 7: 467-482)
GDF15의 수용체는 후뇌(Hindbrain)의 AP(Area postrema, 최종야), NTS(Nucleus tractus solitaris, 고립로핵) 영역에서 특이적으로 발현되는 GFRAL(GDNF family receptor alpha like)이며 GDF15에 의한 GFRAL 수용체 활성화는 암 악액질을 유발한다(Mullican et al., Nature 2017, Hsu et. al., Nature 2017). GDF15은 GFRAL과 결합 후 Ret 신호전달을 통하여 GFRAL 뉴런의 활성화를 초래하여 식욕의 억제와 체중의 감소를 초래한다(Goldman A et al., Nature 2017).
암 악액질의 증상을 개선 및 억제하기 위하여 GDF15/GFRAL/Ret 복합체의 신호전달 과정에 관한 연구가 주목 받고 있다. GDF15 dimer는 GFRAL의 domain 2에 결합하여 Ret의 CLD1, 2, 3 결합면을 통하여 세포 신호를 활성화한다. Ret은 인산화하여 하위신호인 PI3K/AKT, PLC/PKC, MEK/ERK 신호를 활성화하는 것으로 알려져 있다(Mullican et al., Trends Endocrinol Metab. 2018 Aug;29(8):560-570).
암환자의 악액질 발생 원인을 교정하는 효과적인 치료법은 아직 개발이 미미한 실정이며, 이에 따라 효과적인 치료법에 대한 개발이 절실한 상황이다. 이에 따라, 본 발명자들은 후뇌에서 GFRAL에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 역할 및 효과를 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 인간 GFRAL(GDNF family receptor alpha like) 유전자의 발현을 억제하는 올리고머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 올리고머를 포함하는 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 올리고머의 용도 및 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 올리고머의 사용을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 인간 GFRAL(GDNF family receptor alpha like) 유전자의 전체 pre-mRNA에서 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 올리고머를 포함하는 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 올리고머를 이용한 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 올리고머의 용도 및 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 올리고머의 사용을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들을 200nM 농도로 24시간 동안 HEK293 GFRAL 및 RET cDNA 과발현 세포에 형질감염 시켰을 때 GFRAL mRNA 발현양 억제 가능성 확인 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 본 발명에 따른 16종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들을 100nM 농도로 24시간 동안 HEK293 GFRAL 및 RET cDNA 과발현 세포에 형질감염 시켰을 때 GFRAL mRNA 발현양 억제 가능성 확인 시험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2b는 48시간 동안 HEK293 GFRAL 및 RET cDNA 과발현 세포에 형질감염 시켰을 때 GFRAL 단백질 발현양 억제 가능성 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명에 따른 8종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들을 50nM 농도로 24시간 동안 HEK293 GFRAL 및 RET cDNA 과발현 세포에 형질감염 시켰을 때 GFRAL mRNA 발현양 억제 가능성 확인 시험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3b는 8종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들을 50nM 농도로 48시간 동안 HEK293 GFRAL 및 RET cDNA 과발현 세포에 형질감염 시켰을 때 세포독성 확인 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들을 50nM 농도로 48시간 동안 HEK293 GFRAL 및 RET cDNA 과발현 세포에 형질 감염시켰을 때 GFRAL 단백질 발현양 억제 가능성 확인 시험 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 도 4a의 GFRAL 단백질 발현양을 정량화 한 그래프이다.
도 5a는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들의 생체 내 독성 확인 시험을 위한 개요도이다. 도 5b는 독성 음성 대조군과 독성 양성 대조군, 4종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들을 실험 동물에 투여 후 7일 경과시까지의 생존율을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보의 생체 내 투약 1주 후 GFRAL 단백질 발현을 정제된 항체를 사용하여 염색한 결과이다. 각 투여 그룹별 그림의 화살표는 GFRAL positive neuron을 의미한다. Area postrema(AP)의 형광 강도 측정과 AP 내의 GFRAL positive neuron의 수를 확인하여 그래프로 나타냈다.
도 7a는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들의 생체 내 투약 2주 후 A427 probe 염색 기법을 이용하여 뇌 내의 ASO 분포 결과를 나타낸 것이다. 도 7b는 뇌 내의 ASO 분포를 정량화 한 그래프이다.
도 8a는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들의 생체 내 투약 2주 후 GFRAL 유전자 발현을 염색한 결과이다. 도 8b는 Area postrema(AP)의 형광 강도 측정과 AP(Area postrema), NTS(Nucleus tractus solitaris)내의 GFRAL positive neuron의 수를 확인한 결과이다.
도 9a는 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 암 악액질 치료 효과를 검증하기 위한 동물실험 스케쥴을 나타내는 개요도로, 암 악액질 동물 모델 제작 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 실험 계획을 포함하고 있다. 도 9b는 상기 실험 동물에서 분리한 혈청내 GDF15의 농도를 측정한 그래프이다.
도 10a는 상기 실험의 동물 모델에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드 투여 1주 경과 후 수행된 근육 조직의 무게를 측정한 결과이다. 도 10b는 상기의 조직에서 Atrogin-1과 MuRF1의 단백질 발현을 western blot으로 확인한 결과와 그 결과를 정량화 한 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서, 용어 "GFRAL", “GDNF family receptor alpha like”, "GDNF 패밀리 수용체 알파형", "성장 분화 인자 15 수용체" 또는 "GFRAL 단백질" 및 유사 용어는, 별도로 언급되지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간, 시노몰거스 원숭이(시노)), 개 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 척추동물 공급원으로부터의 폴리펩타이드("폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 혼용된다) 또는 임의의 천연(native) GFRAL을 말하고, 특정 실시양태에서는, 관련된 GFRAL 폴리펩타이드를 포함하고, 그의 SNP 변이체를 포함한다. GFRAL은 또한 "C6orf144", "Chromosome 6 Open reading Frame 144", "BA360D14.1", "IVFI9356", 및 "UNQ9356"으로서 당업계에 알려져 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드(anti-sense oligonucleotide, ASO) 기술은 단일가닥의 RNA 또는 DNA 가닥을 통해 mRNA의 중간대사(metabolism)를 변경함으로써 유전자로부터 단백질로의 정보전달을 조절하는 기술이다. 즉, 충분히 상보적, 특이적으로 혼성화하는 염기서열을 선택하여 목표 단백질의 바람직한 발현억제가 이루어지도록 하는 것이다. ASO의 결합은 목표 유전자에 서열 특이적으로 결합하므로 목표 유전자 이외의 다른 유전자 발현에 영향을 주지 않는다. 따라서 ASO 기술은 특정 단백질의 생체 내 역할의 분석에서 유용한 도구일 뿐만 아니라, 특정 질병에 대한 유전자치료법으로 활용 가능성을 가진다(FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995).
안티센스 DNA는 목표 mRNA와 결합하여 RNA/DNA 이중나선을 형성하며, 이 RNA/DNA 이중나선구조는 생체 내에 존재하는 RNase H(RNase H; 리보핵산분해효소의 한 종류로서 RNA/DNA 혼성 이중나선이 형성되어 있는 mRNA를 특이적으로 분해하는 효소)의 공격을 받아 분해가 유발된다. 안티센스 RNA는 RNA/RNA 이중나선을 형성하며, RNase L의 공격을 받아 목표 mRNA의 분해가 유발된다. RNase L은 이중나선 RNA 가닥 주변의 단일가닥 RNA를 우선적으로 분해하는 리보핵산분해효소이다(Pharmacol. Toxicol.32, 329-376,1992).
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 인간 GFRAL(GDNF family receptor alpha like) 유전자의 전체 pre-mRNA에서 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머에 관한 것이다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머(안티센스 올리고뉴클레오타이드)는 인간 GFRAL을 코딩하는 유전자, 구체적으로 mRNA(pre-mRNA 또는 mature mRNA)의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머(안티센스 올리고뉴클레오타이드)는 인간 GFRAL을 코딩하는 mRNA와 상보적인 서열을 포함한다.
"안티센스 활성"은 그의 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 혼성화에 기여하는 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 활성을 의미한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 활성은 표적 핵산 또는 이러한 표적 핵산에 의해 암호화된 단백질의 양 또는 발현에 있어서의 감소이다. 본 발명에 따른 안티센스 활성은 GFRAL을 코딩하는 표적 핵산에 작용하여, 암호화된 GFRAL 단백질의 양 또는 발현을 감소시킨다.
"표적화", "표적하는" 또는 "표적된"은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하여 바람직한 효과를 유도하는 것을 의미한다.
"표적 핵산", "표적 RNA" 및 "표적 RNA 전사체"는 모두 안티센스 올리고머에 의해 표적될 수 있는 핵산을 의미한다.
본 발명은 수소 결합을 통해 표적 핵산에 대한 혼성화를 수행할 수 있는 올리고머를 포함한다.
"억제"는 안티센스 올리고머 부재 시에 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준과 비교하여 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물의 존재 시에 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준의 감소를 의미한다.
"안티센스 올리고머"는 표적 핵산의 대응하는 부위 또는 분절에 혼성화를 가능케 하는 뉴클레이염기 서열을 갖는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머는 인간 GFRAL 유전자의 전체 pre-mRNA(whole pre-mRNA)에서 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 인간 GFRAL 유전자의 전체 pre-mRNA는 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 서열번호 1은 GenBank Homo sapiens chromosome 6, GRCh38.p14 Primary Assembly NC_000006.12 REGION: 55327469..55402493이다.
본 발명에 따른 올리고머는 상기 핵산서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하다.
혼성화에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 혼성화 되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 혼성화 되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 혼성화 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.
매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(혼성화 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 혼성화 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 혼성화에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.
상기 혼성화를 이루는 염기쌍 중에 최소한 하나가 유동 염기쌍(wobble pair) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 3 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산서열에 포함된 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며, 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 올리고머는 15 내지 25개의 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머로, 서열번호 3 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 핵산서열 중 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머인 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 3 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 19개 이상, 20개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 8 내지 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 하나의 핵산서열 중 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 8 내지 서열번호 11로 구성된 군에서 선택되는 핵산서열 중 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머는 13 내지 35 nt의 길이를 갖거나, 16 내지 25 nt의 길이를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 올리고머는 16nt, 17nt, 18nt, 19nt, 20nt, 21nt, 22nt, 23nt, 24nt 또는 25nt의 길이를 가질 수 있다.
상기 혼성화를 이루는 염기쌍 중에 최소한 하나가 유동 염기쌍(wobble pair) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 8 또는 서열번호 11의 핵산서열 중 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개 또는 적어도 18개의 연속된 뉴클레이염기와 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 혼성화를 이루는 염기쌍 중에 최소한 하나가 유동 염기쌍(wobble pair) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 포함할 수 있다.
"연속된 뉴클레이염기"는 서로에 바로 인접한 뉴클레이염기를 의미한다. "뉴클레오시드간 연결"은 뉴클레오시드들 사이의 화학적 결합을 지칭한다. "연결된 뉴클레오시드"는 함께 결합된 인접한 뉴클레오시드를 의미한다.
"핵산"은 단량체 뉴클레오티드로 이루어진 분자를 지칭한다. 핵산에는 리보핵산(RNA), 데옥시리보핵산(DNA), 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 소분자 간섭 리보핵산(siRNA), 및 마이크로RNAs(miRNA)가 포함된다. 핵산은 또한 단일 분자 내에 이들 요소들의 조합을 포함할 수 있다.
"뉴클레이염기"는 다른 핵산의 염기와 짝짓기를 할 수 있는 헤테로사이클릭 모이어티를 의미한다.
"뉴클레이염기 서열"은 임의의 당, 연결, 또는 뉴클레이염기 변형과 무관한 연속된 뉴클레이염기의 순서를 의미한다.
"뉴클레오시드"는 당에 연결된 뉴클레이염기를 의미하고, "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연결된 인산기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
"올리고머"는 핵산 분자의 영역에 혼성화할 수 있는 연결된 단량체 소단위의 중합체를 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"는 각각이, 서로 독립적으로, 변형되거나 비변형될 수 있는, 연결된 뉴클레오시드의 중합체를 의미한다.
"단일-가닥 올리고뉴클레오티드"는 상보적 가닥에 혼성화되지 않는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
상기 혼성화를 이루는 염기쌍 중에 최소한 하나가 유동 염기쌍(wobble pair) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 예를 들어, 서열번호 19 내지 서열번호 34로 구성된 군에서 선택되는 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 19 내지 서열번호 34로 구성된 군에서 선택되는 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 예를 들어, 서열번호 24 내지 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33 및 서열번호 34로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 24 내지 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33 및 서열번호 34로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 서열번호 24 내지 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 33 및 서열번호 34로 구성된 군에서 선택되는 서열 중 하나의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 예를 들어, 서열번호 24 또는 서열번호 27의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 24 또는 서열번호 27의 서열과 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 예를 들어, 서열번호 24 또는 서열번호 27의 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "상동성"은 폴리뉴클레오티드 모이티 사이의 동일성 퍼센트를 의미한다. "동일성"은 비교창(comparison window)을 통해 폴리뉴클레오티드 서열에 기반하여 서열이 기능적 또는 구조적으로 동일한 정도를 의미한다. 서열 상동성은 표준 소프트웨어를 사용, 예를 들면 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 20개의 연결된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 상보적인 서열은 GFRAL을 코딩하는 mRNA에 대하여 발현을 억제할 수 있을 정도에 대응하는 일부 염기 결손 및 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이다.
본 발명의 일 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 GFRAL을 암호화하는 유전자의 핵산 염기서열에서 하나 이상의 표적 부위를 선택하고, 상기 표적과 충분히 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 선택하여, 표적 부위와 충분히 특이적으로 혼성화됨으로서, GFRAL의 발현 조절에 대한 소기의 효과를 얻을 수 있다.
본 명세서에서, "혼성화(hybridization)"는 상보적 뉴클레오시드나 뉴클레오타이드 염기 간 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴(Hoogsteen) 수소결합일 수 있는 수소결합을 의미한다. 예를 들면, 아데닌과 티민은 수소결합을 형성하여 쌍을 이루는 상보적인 핵산 염기다.
본 명세서에서 “혼성화 가능한" 또는 "상보적" 또는 "실질적으로 상보적"의 의미는, 온도 및 용액 이온 세기의 적절한 인 비트로 및/또는 인 비보 조건하에 핵산(예를 들면, RNA, DNA)이 다른 핵산에 서열-특이적, 역평행(antiparallel) 방식(즉, 핵산이 상보적 핵산에 특이적으로 결합)으로 비-공유적으로 결합하는, 즉 아데닌(A)과 티민(T)의 페어링, 아데닌(A)과 우라실(U)의 페어링, 및 구아닌(G)과 시토신(C)의 페어링을 형성하거나, "어닐링(anneal)"하거나, 또는 "혼성화(hybridization)" 할 수 있는 뉴클레오타이드의 염기서열을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 혼성화는 본 명세서에 개시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 GFRAL을 암호화하는 유전자의 핵산 염기서열 사이에서 일어난다. 혼성화의 가장 통상적인 메커니즘은 핵산 분자의 상보적인 핵산 염기 간 수소결합을 수반한다.
혼성화는 다양한 조건에서 발생할 수 있다. 가혹한 조건(stringent condition)은 서열에 의존하고, 혼성화되는 핵산 분자의 성질과 조성에 따라 결정된다. 서열이 표적 핵산과 특이적으로 혼성화할 수 있는지 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서, "상보적(complementary)"이라는 용어는 두 뉴클레오타이드 간 정교하게 쌍을 이룰 수 있는 특성을 말한다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드의 두 가지 서로 다른 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드의 염기서열이 5'에서 3' 방향으로 기재되어 있는 경우, 하나의 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드의 일정 부분의 염기서열을 반대방향으로 정렬했을 때, 나머지 하나의 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드의 일정 부분과 비-공유적으로 결합하는, 즉, 아데닌(A)과 티민(T)의 페어링, 아데닌(A)과 우라실(U)의 페어링, 및 구아닌(G)과 시토신(C)의 페어링을 형성하는 경우, 두 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 상보적이라고 한다.
따라서, "특이적으로 혼성화할 수 있는(specifically hybridizable)"과 "상보적(complementary)"은 올리고뉴클레오타이드와 DNA 또는 RNA 표적 사이에서 안정한 특이 결합이 발생할 수 있게 하는 상보성 또는 정교한 쌍 형성의 충분한 정도를 나타내는 데 이용되는 용어로 해석될 수 있다. 당업계에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열은 특이적으로 혼성화되는 표적 핵산의 서열과 100% 상보적일 필요는 없는 것으로 알려져 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 DNA 또는 RNA와의 결합이 특이적으로 혼성화되어 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 저해할 수 있으며, 특이적 결합이 바람직한 조건에서, 즉, 인 비보 분석 또는 치료의 경우 생리적 조건 하에, 인 비트로 분석의 경우 분석 수행 조건 하에, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 비-표적 서열과의 비특이 결합을 방지하는 데 충분한 정도의 상보성이 있는 것으로 해석된다.
즉, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산과 특이적으로 혼성화할 수 있으면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 표적 핵산 사이의 비상보적인 핵산 염기는 용인될 수 있다. 나아가, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 개재 또는 인접 부분이 혼성화에 관여하지 않도록 하나 이상의 핵산 부분과 혼성화될 수 있다(예를 들어, 루프 구조, 미스매치 또는 헤어핀 구조).
본 명세서에서, "완전히 상보적(fully complementary)"은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 각 핵산 염기가 표적 핵산의 대응 핵산 염기와 정교한 염기 쌍을 이룰 수 있음을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 비상보적인 핵산 염기의 위치는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치할 수 있다. 또는, 비상보적 핵산 염기나 핵산 염기들은 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 내부에 위치할 수 있다. 2 이상의 비상보적 핵산 염기가 존재하는 경우, 이들은 인접(즉, 결합)하거나 인접하지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 비상보적 핵산 염기는 갭머(gapmer) 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 윙(wing) 부분에 위치할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 GFRAL을 암호화하는 유전자의 핵산 염기서열 부분에 상보적인 것들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "부분(portion)"은 표적 핵산의 영역이나 부분 내에 인접(즉, 결합)하는 소정의 핵산 염기 수를 의미한다. 상기 부분은 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 인접하는 핵산 염기의 일정 수를 의미하기도 한다. 일 실시예에 따르면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 부분의 적어도 8개의 핵산 염기 부분과 상보적일 수 있고, 적어도 12개의 핵산 염기 부분과 상보적일 수 있으며, 적어도 15개의 핵산 염기 부분과 상보적일 수 있다. 표적 부분의 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상이나 이들 값들 중에서 두 개의 값으로 정의되는 범위의 핵산 염기 부분에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드도 상기 범위에 포함되는 것으로 해석된다.
본 명세서에서, "뉴클레오타이드(nucleotide)"는 핵염기(nucleobase), 당 모이어티(sugar moiety) 및 인산 그룹(phosphate group)의 결합으로 이루어진 핵산을 구성하는 단위체 분자를 의미하는 것으로, 상기 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체, 변형된 뉴클레오타이드, 비-천연 뉴클레오타이드, 비-표준 뉴클레오타이드 등과 같이 핵염기, 당 모이어티 및/또는 인산 그룹의 비변형 또는 변형을 모두 포함하는 개념으로 해석될 수 있다.
본 명세서에서, "뉴클레오시드(nucleoside)"는 뉴클레오타이드에서 인산 그룹을 제외한 부분으로 간주되는 글리코실아민(glycosylamine)으로, 핵염기 및 당 모이어티로 구성된 단위체 분자를 의미하며, 상기 뉴클레오시드는 뉴클레오타이드와 마찬가지로 핵염기 "G/또는 당 모이어티가 변형되거나, 변형되지 않은 뉴클레오시드를 모두 포함하는 개념으로 해석될 수 있다.
본 명세서에서, "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)"는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 이들 유사체의 저중합체나 중합체를 의미하는 것으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 생체 내에 존재하는 핵염기, 당 및 뉴클레오시드(골격)간 공유 결합으로 구성되는 올리고뉴클레오타이드뿐만 아니라, 이와 유사하게 작용하는 뉴클레오타이드 유사체, 변형된 뉴클레오타이드, 비-천연 뉴클레오타이드, 비-표준 뉴클레오타이드로 이루어진 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레아제 존재 하에, 변형 또는 치환되지 않은 올리고뉴클레오타이드보다 세포 흡수 증진, 핵산 표적 친화성 증진 및 안정성 증가 등의 특성을 갖는다.
본 명세서에서, "안티센스 올리고뉴클레오타이드(anti-sense oligonucleotide, ASO)"는 수소결합에 의해 표적 핵산 서열과 혼성화(hybridization)할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 해석된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열과 혼성화하여 그의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 유사체, 올리고뉴클레오타이드 모사체, siRNA, 단일가닥 siRNA(ss siRNA), 작은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA), 마이크로 RNA 모방체, 리보자임(ribozyme), 외부 가이드 서열(external guide sequence) 올리고뉴클레오타이드 및 기타 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단일가닥 및 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 개념으로 해석된다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5'에서 3' 방향으로 기재되어 있는 경우, 표적화되는 표적 핵산 서열의 표적 부분의 역 상보를 포함하는 핵산 염기서열을 갖는다. 바람직하게는, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 GFRAL을 암호화하는 유전자의 핵산 염기서열에 상보적으로 결합할 수 있다. 상기 GFRAL을 암호화하는 유전자는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적이 되는 핵산으로서, mRNA 및 인트론, 엑손 및 비번역 영역을 포함하는 프리(pre)-mRNA로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머는 변형된 뉴클레오시드 간 연결기, 변형된 핵염기(nucleobase) 또는 변형된 뉴클레오시드의 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 변형된 핵염기는 5’-methyl-cytosine인 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 연결일 수 있다.
본 발명에 따른 뉴클레오시드간 연결은 sooosssssssssssooos의 연결일 수 있다. s는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이고, o는 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결일 수 있다.
상기 뉴클레오시드가 다음의 변형된 당을 포함할 수 있다:
당 구조의 2' 탄소 위치에서 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5'메틸, 2'-O-아미노에틸, 5'-메틸, 2'-O-프로필(propyl), 2'-메틸티오에틸(methylthioethyl), 또는 2'-플로로(2'-Fluoro)로 치환의 변형.
상기 뉴클레오시드는 예를 들어, 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 연결; 및 당 구조의 2' 탄소 위치에서 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5'메틸, 2'-O-아미노에틸, 5'-메틸, 2'-O-프로필(propyl), 2'-메틸티오에틸(methylthioethyl), 또는 2'-플로로(2'-Fluoro)로 치환의 변형을 포함할 수 있다.
상기 뉴클레오시드는 예를 들어, 다음으로 구성된 군에서 선택된 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형은 당 모이어티의 변형 예를 들어, 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 변형 구체적으로, 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5'메틸, 2'-O-아미노에틸, 5'-메틸, 2'-O-프로필(propyl), 2'-메틸티오에틸(methylthioethyl), 또는 2'-플로로(2'-Fluoro)로 변형; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; 및 인산기(phosphate group) 포함할 수 있다.
"2'-O-메톡시에틸"(또한, 2'-MOE 및 2'-O(CH2)2-OCH3)은 퓨로실 고리의 2' 위치에서의 O-메톡시-에틸 변형을 의미한다.
"2'-O-메톡시에틸 뉴클레오티드"는 2'-O-메톡시에틸 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다.
"변형된 당"은 천연 당으로부터의 치환 또는 변화를 지칭한다.
"5-메틸시토신"은 5' 위치에 부착된 메틸기로 변형된 시토신을 의미한다. 5-메틸시토신은 변형된 뉴클레이염기다.
"변형된 뉴클레오시드간 연결"은 자연 발생적인 뉴클레오시드간 결합으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 의미한다.
"변형된 뉴클레이염기"는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 또는 우라실이 아닌 임의의 뉴클레이염기를 의미한다. "변형된 뉴클레이염기"는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G)과, 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 의미한다.
"변형된 뉴클레오티드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 연결, 또는 변형된 뉴클레이염기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. "변형된 뉴클레오시드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티 또는 변형된 뉴클레이염기를 갖는 뉴클레오시드를 의미한다.
"변형된 올리고뉴클레오티드"는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고머를 의미한다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 2'-O-메톡시에틸(2'MOE), 2'-O-메톡시에틸-5'메틸, 5'-메틸 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로의 변형을 포함할 수 있다.
당 모이어티(sugar moiety)의 변형
본 발명의 일 실시예에서, 상기 변형된 뉴클레오시드는 비-바이시클릭 변형 당 모이어티 및/또는, 바이시클릭 또는 트리시클릭 당 모이어티, 및/또는 당 대용물 또는 당 모사체 등으로 변형된 당 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오시드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오시드는 예를 들어, 2'-O-메틸(methyl)과 같은 2'-O-알킬(alkyl), 2'-O-메톡시(methoxy)와 같은2'-O-알콕시(alkoxy), 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸(methoxyethyl)과 같은 2'-O-알콕시알킬(alkoxyalkyl), 2'-아미노(amino), 2'-알릴(allyl), 2'-플루오로(fluoro), 2'-아라비노(arabino)-플루오로(fluoro), 예를 들어, 2'-OCH2C(=O)-NHCH3(NMA)와 같은 2'-O-N-치환 아세트아미드, 2'-O-벤질(benzyl) 및 2'-O-메틸(methyl)-4-피리딘(pyridine), 4'-O-메틸(methyl), 5'-메틸(methyl), 5'-비닐(vinyl) 및 5'-메톡시(methoxy)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 치환체가 도입된 당 모이어티일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 선택적으로 치환 또는 변형된 당 모이어티를 갖는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 당 모이어티의 변형은 상기 올리고머에 뉴클레아제 안정성, 결합 친화성이나 기타 유리한 생물학적 특성을 부여한다. 상기 천연 뉴클레오시드의 (펜토)후라노실((pento)furanosyl) 당 고리는 치환기의 부가(특히, 2' 위치); 바이시클릭 핵산(BNA)을 형성하는 두 개의 다른 자리 고리 원자의 가교; 및 4'-위치의 고리 산소에 -S-, -N(R)- 또는 -C(R1)(R2) 등의 원자나 기의 치환을 포함하는 다양한 방법으로 변형될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 변형된 당 모이어티는 치환 당, 특히, 2'-F, 2'-OCH2(2'-OMe) 또는 2'-O(CH2)2-OCH3(2'-O-메톡시에틸 또는 2'-MOE) 치환기를 갖는 2'-치환 당; 및 4'-(CH2)n-O-2'(n=1 또는 n=2) 가교를 갖는 바이시클릭 변형 당(BNA)을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 이러한 변형된 당의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 변형된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드에서 염기 부분은 표적 핵산과 혼성화하도록 유지될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에서 F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-알킬-O-알킬; O-알킬-O-알킬-N(디알킬); 또는 O-알킬-카르복실아미드 중 하나를 포함한다(여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐이다). O[(CH2)nO]m CH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, O(CH2)n0(CH2)nN[(CH2)mCH3]2, O(CH2)nC(=O)-NHCH3 및 O(CH2)n0N[(CH2)mCH3]2가 특히 바람직하다(여기서, n과 m은 0 내지 약 10이다).
바람직하게는, 상기 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려져 있는 2'-O-CH2CH2OCH3)(Martin et al., HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), 즉, 알콕시알콕시기를 포함할 수 있으며, 상기 변형은 2'-다이메틸아미노옥시에톡시(즉, 2'-DMAOE로도 알려져 있는 (CH2)2ON(CH3)2 기), 및 2'-다이메틸아미노에톡시에톡시[즉, 2'-O-다이메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려져 있는 2'-O(CH2)2O(CH2)2-N(CH3)2 기]를 포함할 수 있다.
상기 바이시클릭 또는 트리시클릭 당 모이어티는 예를 들어, 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA), 컨스트레인 에틸 바이시클릭 핵산(constrained ethyl bicyclic nucleic acid, cEt), 2'-O,4'-C-에틸렌-브릿지 핵산(2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid, ENA) 및 트리시클로(tricyclo)-DNA로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 상기 변형된 뉴클레오시드는 6원 고리 또는 무고리 모이어티를 갖는 당 대용물을 포함할 수 있다. 상기 당 대용물은 예를 들어, 포스포로디아미데이트 모르포리노 올리고머(phodphorodiamidate morpholino oligomer, PMO)와 같은 모르폴리노 고리, 사이클로헥세닐 고리, 사이클로헥실 고리 및 예를 들어, 헥시톨, 아니톨, 만니톨, 플루오르 헥시톨과 같은 테트라하이드로피라닐 고리로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 안티센스 올리고머로 도입되는 뉴클레오시드를 변형하는 데 이용될 수 있는 기타 다양한 이환 및 삼환 당 치환 고리계는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 고리계는 다양한 치환과정을 통해 활성이 증진될 수 있다.
또한, 상기 당 대용물은 예를 들어, 비잠금 핵산(unlocked nucleic acid, UNA) 또는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)과 같은 무고리 모이어티일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
펩타이드 핵산(Peptide nucleic acid, PNA)은 핵염기가 인산 결합이 아닌 펩타이드 결합으로 연결된 핵산 유사체의 일종으로, 포스포다이에스터 결합이 펩타이드 결합(peptide bond)으로 대체되어 있으며, 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신과 같은 핵염기를 가지고 있어, 특이적으로 핵산과 혼성화 반응을 일으킬 수 있다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고, 인공적으로 화학적인 방법으로 합성되며, 상보적인 염기서열의 핵산과 혼성화 반응을 통해 이중가닥을 형성할 수 있다. 또한, PNA는 전기적으로 중성이기 때문에 화학적으로 안정할 뿐만 아니라, 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다는 특징을 가지고 있다. PNA는 N-아미노에틸글리신 골격이 가장 널리 사용되지만, 당업계에 공지된 바에 따라, 변형된 골격을 갖는 PNA도 사용될 수 있다 (P.E. Nielsen and M. Egholm "An Introduction to PNA" in P.E. Nielsen (Ed.) "Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications" 2nd Ed. Page 9 (Horizon Bioscience, 2004)).
비잠금 핵산(unlocked nucleic acid, UNA)은 리보스(ribose)의 C2'-C3' 결합을 갖지 않는 변형된 뉴클레오시드로서, 개방 사슬 구조로 인하여 입체적 배치가 구속되지 않고, 올리고뉴클레오타이드의 유연성을 조정할 수 있다. 올리고머 내에 UNA가 포함되는 경우, Tm 값을 5℃ 내지 10℃ 정도 저하시킬 수 있으며, 오프타깃을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
핵염기(nucleobase)의 변형
본 발명에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오시드는 슈도유리딘(psudouridine), 2'-티오유리딘(thiouridine), N6'-메틸아데노신(methyladenosine), 5'-메틸시티딘(methylcytidine), 5'-플루오로(fluoro)-2-디옥시유리딘(deoxyuridine), N-에틸피페리딘 7'-EAA 트리아졸 변형 아데닌(N-ethylpiperidine 7'-EAA triazol modified adenine), N-에틸피페리딘 6'-트리아졸 변형 아데닌(N-ethylpiperidine 6'-triazol modified adenine), 6'-페닐피롤로시토신(6'-phenylpyrrolocytosine), 2',4'-디플루오로톨루일리보뉴클레오시드(2',4'-difluorotoluylribonuleoside) 및 5'-니트로인돌(5'-nitroindole)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 변형된 핵염기(nucleobase)를 포함하는 변형된 뉴클레오시드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
변형되지 않은 또는 자연 핵산 염기는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 의미한다.
상기 변형된 뉴클레오시드는 핵염기 변형 또는 치환도 포함할 수 있다. 핵염기 변형 또는 치환은 구조적으로 구별되는 형태이지만, 자연 발생적이나 합성 변형되지 않은 핵염기와 기능적으로 서로 교환될 수 있다. 자연 발생 핵염기와 변형된 핵염기는 수소 결합에 참여할 수 있다. 이러한 핵염기 변형은 상기 안티센스 올리고머에 뉴클레아제 안정성, 결합 친화성 또는 기타 유리한 생물학적 특성을 부여한다. 예를 들어, 5-메틸시토신 치환과 같은 특정한 핵염기 치환은 0.6-1.2℃까지 핵산 듀플렉스 안정성을 높이는 것으로 알려져 있어 표적 핵산에 대한 안티센스 올리고머의 결합 친화성을 증진하는 데 특히 유용할 수 있다.
예를 들어, 상기 변형된 핵염기는 5'-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2'-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6'-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2'-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2'-티오우라실, 2'-티오티민 및 2'-티오시토신, 5'-할로우라실 및 시토신, 5'-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 타 알키닐 유도체, 6'-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5'-우라실(유사 우라실), 4'-티오우라실, 8'-할로, 8'-아미노, 8'-티올, 8'-티오알킬, 8'-히드록시 및 기타 8'-치환된 아데닌 및 구아닌, 5'-할로(특히, 5'-브로모), 5'-트라이플루오로메틸 및 기타 5'-치환된 우라실 및 시토신, 7'-메틸구아닌 및 7'-메틸아데닌, 2'-F-아데닌, 2'-아미노-아데닌, 8'-아자구아닌 및 8'-아자아데닌, 7'-데아자구아닌 및 7'-데아자아데닌 및 3'-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌, 페녹사진 사이티딘(lH-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 사이티딘(IH-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온) 등 삼환 피리미딘, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 카바졸 사이티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 사이티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)과 같은 치환 페녹사진 사이티딘 등의 G-클램프를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 변형된 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990,Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613], 및 문헌[Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993]에 개시되어 있는 핵염기를 포함한다.
변형된 뉴클레오시드 간 연결기
본 발명에 있어서, 상기 안티센스 올리고머에서, 변형된 뉴클레오시드 간 연결기는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로다이티오에이트(phosphorodithioate), 포스포트리에스테르(phosphotriester), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메실 포스포르아미데이트(mesyl phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate), 메톡시프로필-포스포네이트(methoxypropyl-phosphonate) 및 보라노포스페이트(boranophosphate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 간 연결기인 것을 특징으로 할 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 뉴클레오시드는 핵염기와 당 모이어티의 조합이다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오시드의 당 모이어티와 공유 결합하는 인산기를 더 포함한다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오타이드에 있어서, 인산기는 결합 당의 2', 3' 또는 5' 히드록시기와 결합할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 형성에 있어, 인산기는 서로 인접하는 뉴클레오시드와 공유 결합하여 선형 중합체 화합물을 형성한다. 차례로, 선형 중합체 구조의 각 말단도 결합하여 원형 구조를 형성하지만, 개방형 선형 구조가 일반적으로 바람직하다. 올리고뉴클레오타이드 구조에서, 인산기는 통상적으로 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오시드 간 골격을 형성하며, RNA와 DNA의 자연 발생적인 결합과 골격은 3' 내지 5' 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합이다. 일 구체예에 따른 안티센스 올리고머는 자연 발생적 뉴클레오시드 간의 결합 이외에 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 간 결합을 포함할 수 있는데, 이는 세포 흡수 증진, 표적 핵산 친화성 증진, 뉴클레아제 존재 하 안정성 증가 등의 특성으로 인하여 자연 발생적 뉴클레오시드 간 결합을 포함하는 안티센스 올리고머보다 자주 선택된다.
본 발명에서 이용될 수 있는 바람직한 안티센스 올리고머의 일 구체예로는 변형된 골격이나 비자연적 뉴클레오시드 간 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드다. 상기 정의한 바와 같이, 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 골격에 인 원자를 함유하는 뉴클레오타이드와 골격에 인 원자를 포함하지 않는 뉴클레오타이드를 포함한다. 아울러, 당업계에서 원용되는 바와 같이, 본 명세서에서는 뉴클레오시드 간 골격에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드도 올리고뉴클레오타이드인 것으로 해석된다.
일 실시예에 따른 안티센스 올리고머에서 뉴클레오시드 간 변형된 결합은 인산을 보유하는 뉴클레오시드 사이의 결합뿐만 아니라 인산을 포함하지 않는 뉴클레오시드 사이의 결합을 포함할 수 있다. 대표적인 인산 함유 뉴클레오시드 사이의 결합은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 이들의 정상적인 3'-5' 결합, 2'-5' 결합 유사체를 갖는 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 메실 포스포르아미데이트, 티오노포스포아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포르트라이에스터, 세레노포스페이트 및 보라노포스페이드를 포함하는 포스포아미데이트 및 하나 이상의 뉴클레오타이드간 결합이 3'-3', 5'-5' 또는 2'-2' 결합인 반대의 극성을 갖는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 연결된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 세그먼트, 연결된 뉴클레오시드로 구성된 5'윙 세그먼트 및 연결된 뉴클레오시드로 구성된 3'윙 세그먼트를 포함하며, 상기 갭 세그먼트는 5'윙 세그먼트 및 3'윙 세그먼트 사이에 위치하고, 각각의 윙 세그먼트의 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티 또는 당 대용물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 8개 내지 10개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 세그먼트; 3개 내지 5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 윙 세그먼트; 및 3개 내지 5개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 각 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
갭머에서, RNaseH 절단을 지원하는 다수의 뉴클레오타이드를 가지는 내부 영역은 내부 영역의 뉴클레오시드와 화학적으로 상이한 다수의 뉴클레오시드를 가지는 외부 영역 사이에 위치한다. 갭머 모티프를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우, 갭(gap) 세그먼트는 표적 핵산의 분할을 지원하는 반면, 윙(wing) 세그먼트는 안정성, 친화성 및 엑소뉴클레아제 내성을 향상시키기 위한 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
필요에 따라서는, 상기 갭 세그먼트 역시 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기, 변형된 당 모이어티를 포함하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 핵염기를 포함하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있으며, 각각의 변형에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 안티센스 올리고머는 바람직하게는, 서열번호 19 내지 서열번호 34로 표시되는 염기서열을 포함하며, 표 2의 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고머는 가장 바람직하게는, 하기 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 구조를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
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여기서, A는 2'MOE-A, C는 2'MOE-5'-methyl-C, G는 2'MOE-G, T는 2'MOE-T, 5는 DNA-A, 6은 DNA-5'-methyl-C, 7은 DNA-G, 8은 DNA-T, *는 PS(phosphorothioate), 2’MOE는 2’-O-methoxyethyl을 의미한다.
본 발명에 있어서, 올리고머의 사용을 용이하게 하기 위해, 예를 들어, 분해를 최소화하거나, 전달 및/또는 흡수를 용이하게 하거나, 또는 제형에서 올리고뉴클레오타이드에 대해 또 다른 유익한 성질을 제공하는 제형을 이용하여 올리고뉴클레오타이드를 대상체 또는 세포 환경으로 전달할 수 있는 다양한 제형이 개발되었다.
본 발명에 있어서, GFRAL의 발현을 감소시키기 위한 안티센스 올리고머는 표적 세포의 직면한 환경으로 또는 전신으로 대상에게 투여될 때, 올리고머의 충분한 부분이 세포에 들어가서 GFRAL의 발현을 감소시키도록 적합하게 제형화될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 상기 안티센스 올리고머는 완충제 용액, 예를 들어, 인산염 완충 식염수 용액, 리포좀, 미셀 구조체 또는 캡시드의 형태로 제형화될 수 있다. 또한, 물 또는 수성 용액(예를 들어, pH가 조정된 물) 또는 염기성 완충된 수성 용액(예를 들어, PBS) 내에서 제형화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 양이온성 지질을 갖는 올리고머의 제형을 이용하여 올리고머가 세포에 도입되는 것을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예를 들어, 리포펙션, 양이온성 글리세롤 유도체, 및 다가 양이온성 분자(예를 들어, 폴리리신)를 이용할 수 있으며, 적합한 지질에는 올리고펙타민, 리포펙타민(Life Technologies), NC388(Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.), 또는 퓨진(FuGene) 6 (Roche))이 포함될 수 있으며, 이는 모두 제조자의 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. 이러한 제형에는 지질 나노입자를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제형은 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 리포좀, 지질, 지질 복합체, 미세구, 미세입자, 나노구, 또는 나노입자를 포함하거나, 또는 그를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직, 기관 또는 신체에 투여하기 위해 달리 제형화될 수 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Pharmaceutical Press, 2013 참고). 부형제는 조성물에게 활성성분의 개선된 안정성, 개선된 흡수, 개선된 가용성 및/또는 치료적 증강을 부여한다. 또한, 부형제는 완충제(예를 들어, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 트리스염기, 또는 수산화나트륨) 또는 비히클(예를 들어, 완충된 용액, 바셀린, 디메틸 술폭시드, 또는 광유)일 수 있다.
일 실시예에서, 올리고머는 그의 보관 수명을 연장시키기 위해 동결건조된 다음, 사용하기 전에 용액으로 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 올리고머를 포함하는 조성물 중의 부형제는 동결건조보호제(예를 들어, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 폴리비닐 피롤리돈), 또는 붕괴 온도 조정제(예를 들어, 덱스트란, 피콜 또는 젤라틴)가 사용될 수 있다.
주사 용도에 적합한 약학적 조성물은 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 멸균 수성 용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 또는 피하 투여의 경우, 적합한 담체에는 생리식염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) EL.TM. (BASF) 또는 인산염 완충된 식염수 (PBS)가 포함될 수 있다. 또한, 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 여러 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜(예를 들어, 만니톨, 소르비톨) 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 멸균성 주사 용액은 선택된 용매 중에 필요한 양의 올리고뉴클레오타이드를 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 그들의 조합물과 함께 도입시킨 후에, 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 적어도 약 0.1%의 치료제(예를 들어, WFDC2의 발현을 감소시키기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드) 또는 그 이상의 용량을 함유할 수 있지만, 활성 성분의 백분율은 총 조성물의 중량 또는 부피의 약 1% 내지 약 80%인 것이 바람직하다. 이는 가용성, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 제형의 제조에 고려될 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 올리고머를 포함하는 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 올리고머를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 올리고머의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 올리고머의 사용에 관한 것이다.
본 명세서에서, 용어 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, “치료”는 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 발전의 억제, 증상의 경감 또는 제거를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환은 비만, 당뇨, 식욕부진 또는 악액질(cachexia)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로는, 상기 질환은 암 악액질(cancer cachexia)일 수 있다.
악액질은 암, AIDS, 만성 심부전(또한, 울혈성 심부전으로도 알려짐), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 만성 신장 질환, 결핵, 패혈증 및 기타 형태의 전신성 염증을 포함하는 다수의 질환에 관련된 약화 대사 증후군이다. 특히, 악액질은 비자발적 체중 소실에 관련된 소모성 장애이고, 전신성 염증 및/또는 급성 염증 반응과 연관될 수도 있다. 근육 질량의 소실뿐 아니라, 지방 질량의 소실은 종종 악액질의 주요한 임상적 특징이다. 근육 질량의 감소에 의한 근육감소증은 힘의 소실, 넘어지는 경향의 증가 및 자율성의 소실을 포함하는 기능적인 손상을 야기할 수 있다. 호흡 기능 역시 손상될 수 있어서 감소된 폐활량을 나타낼 수 있다. 근육감소증은 대개 노인성 질환이지만, 근육감소증의 발달은 근육의 불용 및 영양부족과 연관될 수도 있고, 악액질과 동시에 일어날 수 있다. 악액질은 전악액질, 악액질 및 불응성 악액질로 명명된 단계를 거쳐 진행될 수 있다.
다수의 악성 암(특히, 침습성 뇌암, 흑색종, 폐암, 위장 종양, 결장암, 췌장암, 전립선암 및 유방암의 경우 혈청에서 증가된 레벨로 GDF15가 발현된다. 마찬가지로, 화학내성은 높은 GDF15 발현과 상관관계가 있을 수 있고, 높은 GDF15 발현 레벨과 암의 예후 사이에 상관관계가 역시 보고된 바 있다. TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원인 GDF15을 매개로 다양한 질환에 의해 유발되는 악액질의 매개자임이 보고된 바 있다. GFRAL은 GDF15에 대한 고친화성 수용체인 바, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머는 GDF15-유발 암 악액질의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, “암”과 “종양”은 동일한 의미로 사용되며, 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 치료 유효량의 안티센스 올리고머를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 “약제학적으로(제약상) 허용되는 담체”는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물은 경구투여 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 주입(infusion), 정맥내 투여(intravenous injection), 근육내 투여(intramuscular injection), 피하 투여(subcutaneous injection), 복강내 투여(intraperitoneal injection), 직장내 투여(Intrarectal administration), 국소 투여(topical administration), 비내 투여(intranasal injection) 등으로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 비만, 당뇨, 식욕부진 또는 악액질의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 사용하는 용도로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 안티센스 올리고머 및 이를 포함하는 약학 조성물은 기존의 항암제 등의 치료제와 동시에 투여되거나, 순차적 또는 역순으로 투여될 수 있음을 의미하는 것으로, 통상의 기술자의 범위 내 적절한 유효량의 조합으로 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: GFRAL 표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 개발
표적 특이성 및 안정성을 고려하여, GFRAL 유전자(pre-mRNA 서열) 및 GFRAL mature-RNA 서열(서열번호 1 내지 2)로부터 GFRAL mRNA 타겟 서열 16종(서열번호 3 내지 18)을 개발하였으며, 이에 대해 안티센스 서열 16종(서열번호 19 내지 34)을 개발하였다(표 1).
또한, 표 1의 상보결합서열 16종에 대해 화학적 변형을 적용한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 16종을 개발하였다(표 2). 안티센스 올리고뉴클레오타이드 구조로는 종래에 안정적이면서도 효과적인 것으로 알려진, 내부의 10nt의 DNA nucleotide들로 구성된 “갭(gap)” 부분 및 5’-말단 및 3’-말단에 각각 2’-MOE(2'-Methoxyethyl) 변형 골격을 갖는 각 4-6nt의 2’MOE nucleotide들로 구성되는 “윙(wing)” 부분을 포함하는 “갭머(gapmer)”를 사용하였다. 상기 갭머 중 두 DNA nucleoside들을 연결하는 부분이나 DNA nucleoside와 2’MOE nucleoside를 연결하는 결합으로 통상의 포스포디에스터 결합(PO bond) 대신 포스포로티오에이트 결합(PS bond)이 사용되었고, 2’MOE nucleotide들로 구성된 윙 부분의 서열 마지막 양끝에 위치한 결합들에 대해서만 PS 결합이 사용되었으며, 나머지 부분은 PO 결합이 사용되었다. 한편, 모든 시토신(C)은 메틸화 시토신으로 치환되었고, RNA 부분에 포함되는 우라실(U)은 모두 티민(T)으로 대체되었으며, 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 더 높이고 호스트 면역반응을 줄이기 위함이다.
예를 들어, A427의 경우 G*GTATA*8*8*8*8*7*5*8*5*7*5*AGAAC*C(A=2'MOE-A, C=2'MOE-5'-methyl-C, G=2'MOE-G, T=2'MOE-T, 5=DNA-A, 6=DNA-5'-methyl-C, 7=DNA-G, 8=DNA-T, *=PS)의 서열 및 화학적 변형을 가지고 있다.
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실험예 1: 1차 스크리닝
상기 표 1에 기재된 바와 같이 GFRAL mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보물질들을 도출한 후, 이를 Chemgenes사(USA)에 의뢰하여 제조하였다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 GFRAL 및 RET cDNA가 과발현된 HEK293 세포에 리포펙타민(Invitrogen, USA) 시약을 이용하여 200nM 농도로 처리하여 형질감염시킨 후 24시간 경과 후, RNA 추출 kit(Bioneer, Korea) 및 DNA 분해 효소(NEB, USA)를 처리하여 RNA를 정제하고, RT-프리믹스(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 역전사 반응을 수행하였다. 그 다음 qRT-PCR을 수행하여 GFRAL 유전자 발현 수준을 측정하였다. qRT-PCR에는 다음의 프라이머 및 프로브 서열이 사용되었다:
GFRAL: predesigned qPCR Assay (Hs.PT.58.21179605, IDT, USA)
GAPDH:
forward: 5’-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3’ (서열번호 35)
reverse: 5’-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3’ (서열번호 36)
probe: 5’-AGATCATCAGCAATGCCTCCTGCA-3’ (서열번호 37)
그 결과 도 1에서 확인되는 바와 같이, 1차 스크리닝을 통하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 GFRAL 유전자 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
실험예 2: 2차 스크리닝
GFRAL 및 RET cDNA를 발현시킨 HEK293 세포주에서, 16종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대상으로 리포펙타민(Invitrogen, USA) 시약을 이용하여 100nM의 ASO를 투여하여 GFRAL 유전자의 넉다운이 가능한지 반복 관찰하였다. 먼저 24시간 동안 ASO를 형질감염 시킨 후 세포를 lysis 및 RT kit로 용해시키고 역전사 반응을 수행하였다. 그 다음 Taqman probe와 qRT-PCR 프리믹스(Applied Biosystems, USA)를 이용한 qRT-PCR을 수행하여, GFRAL 유전자 발현 수준을 측정하였다. 그 결과 도 2a에서 확인되는 바와 같이, 100nM의 농도에서 8종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 넉다운 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 48시간 동안 ASO를 형질감염 시킨 후 western blot assay를 실시하여 GFRAL 유전자 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과 도 2b에서 확인되는 바와 같이, 8종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보에서 단백질 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 도 1 및 도 2의 결과를 토대로 A426, A427, A428, A429, A430, A433, A436, A437 총 8종을 후보로 선정하였다.
실험예 3: 3차 스크리닝
실험예 1, 2에서 선정된 8종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 대상으로 실험예 1, 2와 동일한 방법을 사용하여 50nM의 ASO를 투여하여 3차 스크리닝을 진행하였다. 그 결과 도 3a에서 확인되는 바와 같이, 8종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 모두 50nM의 농도에서 매우 우수한 넉다운 효율을 나타냈다. 48시간 동안 ASO를 형질감염 시킨 후 Quantimax wst-8 cell viability assay kit(Abcam, UK)를 이용하여 세포독성을 측정하였고, 동일 조건으로 western blot assay를 실시하여 GFRAL 유전자 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과 도 3b에서 확인되는 바와 같이, 8종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보 모두 세포 생존율이 감소하지 않는 것을 확인하였다.
또한 도 4a, 도 4b에서 확인되는 바와 같이, A427, A428, A429, A430에서 반복적으로 단백질 발현 억제를 확인하였다. 이에, 도 1, 도 2, 도 3 및 도 4의 결과를 종합하여, A427, A428, A429, A430을 최종 후보물질로 선정하였다.
실험예 4: 생체 내 독성 시험
실험예 1, 2 및 3의 세포 실험결과를 바탕으로 4종의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들의 안정성을 검증하기 위해 3회에 거쳐서 동물 독성 실험을 수행하였다.
생후 0~2일의 C57BL/6J 야생형 생쥐에 실시예의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 두뇌 좌반구에 2μl(20μg)을 뇌실 내(ICV) 주사로 투여하고, 7일 경과 후 생존율을 측정하였다(도 5a).
그 결과, 도 5b에서 확인되는 바와 같이, 음성 대조군으로 사용된 PBS, A114는 12두 중 폐사한 실험동물이 없었고, 독성 양성 대조군으로 사용한 A386이 투여된 개체는 6시간 이내에 12두 중 11두가 폐사하여 상당한 독성이 있음을 확인하였다. 실험군인 A427이 투여된 개체는 7두 중 1두가 폐사했고, A428, A429, A430이 투여된 개체는 모두 전원 생존하여 생체 내 투여 시 상대적으로 안전한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보물질임이 확인되었다.
실험예 5: 생체 내 GFRAL 단백질 발현 조절 분석
안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들의 약리효과를 검증하기 위해 다음의 동물실험을 수행하였다.
8주령의 웅성 C57BL/6N 야생형 생쥐에 안티센스 올리고뉴클레오타이드(A114, A427) 8.5μl(500μg)를 뇌실 내(ICV) 주사로 투여하고 1주 경과 후에 생리식염수(염화나트륨, 관류제; JW Pharmaceutical corporation, Korea)와 4% 파라포름알데히드(FUJIFILM, Japan)를 차례대로 대동맥을 통해 관류하여 뇌 조직을 1차 고정하였다. 뇌 조직을 적출하여 24시간동안 동일 고정액에서 2차 고정하였다. 4℃에서 30% 수크로스를 함유한 인산 완충용액으로 2번 세척한 후 냉동시키고 저온유지장치에서 30㎛로 절편을 제작하였다. 5% 당나귀 혈청(Jackson immunoresearch, USA)이 포함된 0.1% PBST(triton-x100)를 이용하여 1시간 동안 블로킹한 후, 정제한 1차 항체로 24시간 반응시켰다. 2차 항체로 2시간 반응 후 면역조직화학(IHC) 형광 염색기법을 사용하여 GFRAL 유전자 단백질의 발현양 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 확인되는 바와 같이, A427 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투약한 경우 GFRAL 유전자 단백질의 형광 신호 세기가 감소하고, 전체 신경 세포(neuron) 중 GFRAL 유전자 발현 신경 세포(neuron)의 비율이 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 6: 생체 내 ASO 분포 분석
안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들의 약리효과를 검증하기 위해 다음의 동물실험을 수행하였다.
8주령의 웅성 C57BL/6N 야생형 생쥐에 안티센스 올리고뉴클레오타이드(A114, A427, A428) 8.5μl(500μg)를 뇌실 내(ICV) 주사로 투여하고 2주 경과 후에 생리식염수(염화나트륨, 관류제)와 4% 파라포름알데히드를 차례대로 대동맥을 통해 관류하여 뇌 조직을 1차 고정하였다. 뇌를 적출하여 24시간동안 동일 고정액에서 2차 고정하였다. 4℃에서 30% 수크로스를 함유한 인산 완충용액으로 2번 세척한 후 냉동시키고 저온유지장치에서 10㎛로 절편을 제작하였다. RNAscope™ Plus smRNA-RNA HD Reagent kit(ACD bio, USA)로 ASO probe를 염색한 후, Fluorescence in situ hybridization(FISH) 기법을 사용하여 ASO probe의 생체내 분포를 관찰하였다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에서 확인되는 바와 같이, A427은 AP(Area postrema)와 NTS(Nucleus tractus solitaris)를 포함하는 후뇌(Hindbrain)에 분포되는 것을 확인하였다.
실험예 7: 생체 내 GFRAL RNA 발현 조절 분석
안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보들의 약리효과를 검증하기 위해 다음의 동물실험을 수행하였다.
8주령의 웅성 C57BL/6N 야생형 생쥐에 안티센스 올리고뉴클레오타이드(A114, A427, A428, A429, A430) 8.5μl(500μg)를 뇌실 내(ICV) 주사로 투여하고 2주 경과 후에 생리식염수(염화나트륨, 관류제)와4% 파라포름알데히드를 차례대로 대동맥을 통해 관류하여 뇌 조직을 1차 고정하였다. 뇌 조직을 적출하여 24시간동안 동일 고정액에서 2차 고정하였다. 4℃에서 30% 수크로스를 함유한 인산 완충용액으로 2번 세척한 후 냉동시키고 저온유지장치에서 10㎛로 절편을 제작하였다. RNAscope™ Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Kit(ACD bio, USA)로 GFRAL RNA를 염색한 후, Fluorescence in situ hybridization(FISH) 기법을 사용하여 GFRAL RNA의 발현양 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 8a 및 도 8b에서 확인되는 바와 같이, A427, A428, A429, A430 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투약한 경우 GFRAL RNA의 형광 신호 세기가 감소하고, 전체 신경 세포(neuron) 중 GFRAL 유전자 발현 신경 세포(neuron)의 비율이 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 8: 암 악액질 모델에서 ASO의 효능확인
8주령의 웅성 C57BL/6J 야생형 생쥐에 Colon cancer cell(MC38)을 복강내 주사(intraperitoneal injection, IP injection) 기법을 이용하여 체내 주입하고, 2주 경과 후 안티센스 올리고뉴클레오타이드(A427, A430) 500μg을 뇌실 내 주사를 통해 투여하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 투여 1주 후, Quantikine ELISA kit(R&D Systems, USA)를 이용하여 암 악액질의 진단적 유용성을 가진 혈청내 GDF15의 농도를 측정하였다(도 9a).
도 9b에서 확인되는 바와 같이, MC38이 투여된 그룹에서 GDF15의 혈청내 농도가 1000배 이상 증가하였으며, 이는 암 악액질 모델이 잘 생성되었음을 시사한다.
도 10a에서 확인되는 바와 같이, 상기의 암 악액질 동물 모델에서 A427을 투여한 그룹이 음성 대조군(PBS) 보다 근육조직(gastrocnemius)의 무게가 증가되는 것을 관찰하였다. 또한, 근육조직(gastrocnemius)에서 western bolt assay를 통하여, 근육위축증의 주요한 분자 마커인 Atrogin-1와 MuRF1 단백질 발현을 측정하였다. Atrogin-1의 단백질 발현 ASO에 의해 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 10b).
본 발명에서는 GFRAL 발현을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 후보물질들을 발굴하였으며, 상기 후보물질들이 생체 내 GFRAL 발현을 효과적으로 억제하며, 암 악액질 동물모델에서 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 GFRAL 발현 억제를 통해 비만 또는 암 악액질 치료제로서 적용가능성이 매우 높을 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (15)

  1. 서열번호 1로 표시되는 인간 GFRAL(GDNF family receptor alpha like) 유전자의 전체 pre-mRNA에서 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 3 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산서열에 포함된 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 8 내지 서열번호 11, 서열번호 14, 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산서열에 포함된 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
  4. 제1항에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 8 내지 서열번호 11로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 핵산서열에 포함된 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
  5. 제1항에 있어서, 상기 올리고머는 서열번호 8 또는 서열번호 11의 핵산서열에 포함된 적어도 13개의 연속된 뉴클레이염기와 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick pairing) A:T 또는 G:C 또는 유동 염기쌍(wobble pairing) G:U, I:A, I:C 또는 I:U를 통한 혼성화가 가능하며 13 내지 35 nt의 길이를 갖는 올리고머.
  6. 제1항에 있어서, 상기 올리고머는 변형된 뉴클레오시드 간 연결기, 변형된 핵염기(nucleobase) 또는 변형된 뉴클레오시드의 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  7. 제6항에 있어서, 상기 변형된 핵염기는 5’-methyl-cytosine인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  8. 제6항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-메틸(methyl), 2'-O-메톡시(methoxy), 2'-O-메톡시에틸(methoxyethyl), 2'-아미노(amino), 2'-알릴(allyl), 2'-플루오로(fluoro), 2'-아라비노(arabino)-플루오로(fluoro), 2'-OCH2C(=O)-NHCH3(NMA), 2'-O-벤질(benzyl), 2'-O-메틸(methyl)-4-피리딘(pyridine), 4'-O-메틸(methyl), 5'-메틸(methyl), 5'-비닐(vinyl) 및 5'-메톡시(methoxy)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 치환체가 도입된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드; 또는 LNA(locked nucleic acid) 또는 cEt(constrained ethyl) 중 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오시드인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  9. 제6항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오시드 간 연결기는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로다이티오에이트(phosphorodithioate), 포스포트리에스테르(phosphotriester), 포스포르아미데이트(phosphoramidate), 메실 포스포르아미데이트(mesyl phosphoramidate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate), 메톡시프로필-포스포네이트(methoxypropyl-phosphonate) 및 보라노포스페이트(boranophosphate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 간 연결기인 것을 특징으로 하는 올리고머.
  10. 제6항에 있어서, 상기 올리고머는 연결된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 세그먼트, 연결된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 세그먼트 및 연결된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
    상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트 및 3' 윙 세그먼트 사이에 위치하고, 각각의 윙 세그먼트의 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티 또는 당 대용물을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  11. 제10항에 있어서, 상기 올리고머는 8개 내지 10개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 갭 세그먼트; 3개 내지 7개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 5' 윙 세그먼트; 및 3개 내지 7개의 연결된 뉴클레오시드로 이루어진 3' 윙 세그먼트를 포함하고, 각 윙 세그먼트의 각각의 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티 또는 당 대용물을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머.
  12. 제1항에 있어서, 상기 올리고머는 하기 화학식 (I) 또는 화학식 (II)의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고머:
    G*GTATA*8*8*8*8*7*5*8*5*7*5*AGAAC*C 화학식 (I);
    C*ACAA*5*5*5*7*6*6*5*5*6*5*TCTG*G 화학식 (II),
    여기서, A는 2'MOE-A, C는 2'MOE-5'-methyl-C, G는 2'MOE-G, T는 2'MOE-T, 5는 DNA-A, 6은 DNA-5'-methyl-C, 7은 DNA-G, 8은 DNA-T, *는 PS(phosphorothioate), 2’MOE는 2’-O-methoxyethyl을 의미함.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 올리고머를 포함하는 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환은 비만, 당뇨, 식욕부진 또는 악액질(cachexia)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 GDF15의 증가에 따른 GFRAL의 활성화와 관련된 질환은 암 악액질(cancer cachexia)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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