WO2024181580A1 - 脂質ナノ粒子、医薬組成物、および脂質ナノ粒子の製造方法 - Google Patents

脂質ナノ粒子、医薬組成物、および脂質ナノ粒子の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024181580A1
WO2024181580A1 PCT/JP2024/008154 JP2024008154W WO2024181580A1 WO 2024181580 A1 WO2024181580 A1 WO 2024181580A1 JP 2024008154 W JP2024008154 W JP 2024008154W WO 2024181580 A1 WO2024181580 A1 WO 2024181580A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mol
lipid
polymer
antibody
igg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2024/008154
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
祥正 川口
史朗 二木
勇祐 平井
久昭 広瀬
千聖 笠原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Priority to JP2025504021A priority Critical patent/JPWO2024181580A1/ja
Priority to CN202480016036.0A priority patent/CN120826236A/zh
Priority to EP24764057.6A priority patent/EP4674431A1/en
Publication of WO2024181580A1 publication Critical patent/WO2024181580A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/80—Immunoglobulins specific features remaining in the (producing) cell, i.e. intracellular antibodies or intrabodies

Definitions

  • the present disclosure relates to lipid nanoparticles.
  • the present disclosure relates to lipid nanoparticles that can encapsulate proteins such as antibodies and deliver them into cells, including the cytosol, a pharmaceutical composition, and a method for producing lipid nanoparticles.
  • antibody drugs have antigen-specific binding ability, they are not only used as research reagents but are also put to practical use as molecular targeted drugs, making them biopharmaceuticals that play an important role in modern medicine.
  • antibodies are highly hydrophilic polymers (approximately 150 kDa), and due to the constraints of biological membrane permeability, their targets are limited to extracellular factors. In other words, if an innovative method for introducing antibodies into cells could be developed, the range of application of antibodies could be expanded from extracellular antigens to intracellular antigens, and new disease applications of antibody drugs could be expected.
  • LNP Lipid Nanoparticle
  • Comirnaty registered trademark
  • Spikevax registered trademark
  • LNPs are lipid nanoparticle formulations that efficiently encapsulate negatively charged molecules such as nucleic acids and enhance their delivery to the cytosol, and are also expected to be applied to antibody drugs.
  • Non-Patent Document 1 describes that a liposome-based formulation, DOSP:MM27 (imidazole-based helper lipid MM27+aminoglycoside lipid dioleylsuccinylparomomycin (DOSP)), was able to deliver anti-cytokeratin 8 (K8) antibody intracellularly.
  • Non-Patent Document 2 describes that antibodies against ⁇ -tubulin and ⁇ -actin could be delivered intracellularly using lipospermine DOGS (dioctadecylglycylspermine) dissolved in ethanol.
  • DOGS dioctadecylglycylspermine
  • Patent Document 1 describes a method for concentrating a protein having a surface charge by forming a complex between the protein and a polyamino acid in a buffer solution.
  • Patent Document 2 describes lipids that form lipid nanoparticles for use in drug delivery systems, which are said to improve escape from endosomes after endocytosis.
  • the present disclosure aims to deliver useful proteins into cells, particularly to deliver antibodies against functional proteins within cells, such as cancer cells.
  • the inventors discovered that when encapsulating a protein, which is a polymer with a multivalent charge, in lipids, the coexistence of an acidic polymer such as an acidic polyamino acid produces lipid nanoparticles with smaller particle sizes, and thus completed the present disclosure.
  • a lipid nanoparticle comprising a composition comprising a protein selected from an antibody and an antibody fragment, a polymer, and a lipid, wherein the protein and the polymer have opposite charges at a predetermined pH.
  • the lipid nanoparticle according to (1) in which the protein is encapsulated in the lipid nanoparticle.
  • the polymer is an anionic or cationic polymer.
  • the cationic polymer is at least one selected from the group consisting of polylysine, polyarginine, polyhistidine, and water-soluble salts thereof.
  • the molecular weight of the cationic or anionic polyamino acid is 0.5 kDa to 1000 kDa.
  • a pharmaceutical composition comprising a composition comprising a protein selected from an antibody and an antibody fragment, a polymer, and a lipid, wherein the protein and the polymer have opposite charges at a predetermined pH.
  • (12-1) A method for delivering an antibody, which is a pharmacologic active ingredient, comprising administering the pharmaceutical composition according to (12) above.
  • (12-2) Use of the pharmaceutical composition according to (12) above.
  • (13) a droplet formation step of mixing the protein selected from the antibody and the antibody fragment with the polymer to form droplets;
  • a method for producing lipid nanoparticles comprising: an encapsulation step of mixing the droplets with the lipid to encapsulate the droplets in the lipid.
  • 13-1) The method for producing lipid nanoparticles described in (13), wherein at least one step selected from the droplet formation step and the encapsulation step is a step using a flow channel of a microfluidic device.
  • a lipid nanoparticle comprising a composition comprising a protein, a polymer, and a lipid, wherein the polymer has an opposite charge to the protein at a certain pH.
  • a protein selected from an antibody or an antibody fragment can be delivered into a cell, including the cytoplasm or nucleus.
  • IgG was most efficiently delivered to the cytosol with 1:200 IgG_polyE-LNP.
  • FIG. 1 shows that IgG_polyE-LNP was able to deliver hIgG-AF488 to the cytosol in HeLa, HT1080, MDA-MB-231, and SW480 cells.
  • IgG_polyE-LNP prepared with t-BuOH lipid solution and IgG_polyE-LNP prepared with 90% t-BuOH lipid solution were similarly capable of delivering antibody to the cytosol.
  • FIG. 1 shows that the peak top of the lipid nanoparticle particle size is approximately 100 nm.
  • FIG. 1 shows the results of particle size measurement of IgG_polyE-LNP determined by nanoparticle tracking analysis (NTA method).
  • FIG. 13 shows images of each cell immunostained in Example 13.
  • FIG. 13 shows images of each cell immunostained in Example 13.
  • FIG. 13 shows the particle size of hIgG_polyE-LNP in Example 13.
  • FIG. 13 shows the encapsulation rate of each antibody in hIgG_polyE-LNP in Example 13.
  • FIG. 13 shows the values of hIgG_polyE-LNP in Example 14.
  • FIG. 13 is a diagram of each cell immunostained in Example 14.
  • FIG. 15 shows the formation of droplets in Example 15.
  • FIG. 13 is a diagram of each cell immunostained in Example 16.
  • the composition used in this disclosure is a composition comprising a protein, a polymer, and a lipid, characterized in that the polymer has an opposite charge to the protein at a certain pH.
  • it is a composition comprising a protein, a polymer, and a lipid, characterized in that the protein and the polymer have an opposite charge at a certain pH.
  • the numerical range of 1 to 50 includes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, and 50.
  • the protein used in the present disclosure is a protein selected from an antibody and an antibody fragment.
  • An antibody is composed of immunoglobulin (Ig), a protein molecule that specifically binds to an antigen, and includes types such as IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE.
  • An antibody fragment is a partial fragment of an antibody. The isoelectric point of an antibody or an antibody fragment is generally about pH 7.5 to 9.5.
  • the use of the pharmaceutical composition of the present disclosure enables the protein to be more stably transported and stored when applied to humans as a pharmaceutical preparation or diagnostic agent, and further, the protein can be easily administered to humans when in use, making the composition highly useful.
  • the protein may have a sugar chain.
  • high purity means pharmaceutical-grade purity, i.e., a level that can be used as a human medicine, while for other proteins, high purity means reagent-grade purity, for example, a threshold value of 0.1% by mass or less in terms of the total amount of impurities.
  • Antigens to which the antibodies or antibody fragments used in the present disclosure specifically bind include, but are not limited to, polypeptides and peptides present in cells, including the cytoplasm and nucleus, genes including RNA (ribonucleic acid) including mRNA, rRNA, or tRNA, and DNA (deoxyribonucleic acid), lipids including phospholipids such as cardiolipin, or sugar chains bound to the above polypeptides, peptides, genes, or lipids.
  • RNA ribonucleic acid
  • lipids including phospholipids such as cardiolipin, or sugar chains bound to the above polypeptides, peptides, genes, or lipids.
  • antibodies may be produced by the hybridoma method (Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)) or recombinant method (U.S. Patent No. 4,816,567). They may also be isolated from phage antibody libraries (Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)). They may also be isolated from single B cell clones (N. Biotechnol. 28(5):253-457 (2011)).
  • an antibody delivered into the cytoplasm by receptor-dependent endocytosis and endosomal escape by cholic acid, or liposome-mediated endocytosis and endosomal escape by photosensitive benzoporphyrin is translocated into the nucleus by a nuclear localization signal inserted into the sequence (Mol. Pharmaceutics 2016, 13, 1915-1926 and Mol. Pharmaceutics 2015, 12, 9, 3272-3281).
  • a nuclear localization signal inserted into the sequence
  • the polymer used in the present invention is a polymer with a charge that cancels the charge of the protein to be delivered into the cell under the conditions of use.
  • the conditions of use are determined either at the time of manufacture, in blood, or in the cell.
  • An acidic or basic polymer anionic polymer, cationic polymer
  • Polymers that are considered to have a charge include polymers with carboxyl groups or amino groups. Examples of such polymers include polyamino acids, polyesters, glycosaminoglycans, and polyamides.
  • the polymers used in the present disclosure are selected to have opposite charges under the measurement conditions of the protein to be delivered into the cell.
  • a combination is selected in which the polymer and protein have opposite charges at a specified pH. It is possible to confirm whether the polymer and protein have opposite charges at a specified pH by measuring the pI values of the polymer and protein. It is possible to determine the pI values of the polymer and protein using known methods such as measuring the zeta potential of a polymer solution in water or measuring using isoelectric focusing of a protein.
  • known methods such as measuring the zeta potential of a polymer solution in water or measuring using isoelectric focusing of a protein.
  • the polyamino acids used in the present disclosure are selected to have an opposite charge under the measurement conditions of the protein to be delivered into the cell.
  • the isoelectric point of the polymer In order for the polymer to associate with the protein, the isoelectric point of the polymer must be different from the isoelectric point of the protein described above, and must be higher or lower than the isoelectric point of the protein.
  • the isoelectric point of antibodies and antibody fragments which are examples of proteins, is pH 7.5 to 9.5 as described above, it is preferable that the isoelectric point of the polymer is outside this range, for example, pH 7.0 or lower or 10.0 or higher.
  • polymer examples include cationic or anionic polyamino acids or salts thereof.
  • anionic polyamino acids include sodium salts of polyglutamic acid and polyaspartic acid
  • examples of the cationic polyamino acids include water-soluble salts (e.g., hydrochlorides) of polyarginine, polyhistidine, polylysine, polyornithine, polycitrulline, and the like.
  • polyamino acids include sodium poly-L-glutamic acid and sodium poly-L-aspartic acid as anionic polyamino acids, and poly-L-arginine hydrochloride, poly-L-lysine hydrochloride, poly-L-arginine hydrobromide, and poly-L-lysine hydrobromide as cationic polyamino acids.
  • the polyamino acids are homopolymers or copolymers, or mixtures thereof. It is preferable that the polyamino acids have a CH2 group between the main chain and the carboxyl group or amino group of the side chain.
  • the degree of polymerization can be appropriately selected from the range of 20 to 3000.
  • the degree of polymerization can be appropriately selected from the ranges of 60 to 3000, 60 to 2500, 60 to 2000, 60 to 1500, 60 to 1000, 60 to 500, 60 to 400, 60 to 300, and 60 to 200.
  • the degree of polymerization can be appropriately selected from the ranges of 80 to 3000, 80 to 2500, 80 to 2000, 80 to 1500, 80 to 1000, 80 to 500, 80 to 400, 80 to 300, and 80 to 200.
  • the polymerization degree can be appropriately selected from the ranges of 100 to 3000, 100 to 2500, 100 to 2000, 100 to 1500, 100 to 1000, 100 to 500, 100 to 400, 100 to 300, and 100 to 200.
  • the polyglutamic acid may have a degree of polymerization having a molecular weight of 3000 (degree of polymerization 20) to 60,000 (degree of polymerization 408), and in another non-limiting embodiment, the polyglutamic acid may have a degree of polymerization of 3000 (degree of polymerization 20) to 50,000 (degree of polymerization 340), 3000 (degree of polymerization 20) to 40,000 (degree of polymerization 272), 3000 (degree of polymerization 20) to 20,000 (degree of polymerization 136), 3000 (degree of polymerization 20) to 15,000 (degree of polymerization 102), 3000 (degree of polymerization 20) to 10,000 (degree of polymerization 68), 4000 (degree of polymerization 27) to 50,000 (degree of polymerization 340), 4000 (degree of polymerization 2 7) to 40,000 (degree of polymerization 272), 4,000 (degree of polymerization 27) to 30,000 (degree of polymerization
  • an antibody or antibody fragment thereof including human immunoglobulin is usually basic and positively charged at plasma pH 7.4, so an anionic polymer can be used.
  • polyamino acids such as polyglutamic acid and polyaspartic acid can be preferably used.
  • glycosaminoglycans such as hyaluronic acid and heparin can be preferably used as anionic polymers.
  • acidic antibodies and antibody fragments that have been approved as therapeutic antibodies (Journal of Chromatography B, Volumes 1065-1066, 2017, Pages 119-128).
  • a cationic polymer can be used in the composition of the present disclosure that includes such an antibody or its antibody fragment that is negatively charged at plasma pH 7.4, a cationic polymer can be used.
  • polyamino acids such as polyarginine, polylysine, and polyornithine are preferable.
  • the pKa, pI, size, shape, etc. of the protein to be delivered can be taken into consideration, and the pKa, pI, molecular weight, shape, etc. of the polymer to be selected can also be taken into consideration.
  • the size of the lipid nanoparticles can be reduced.
  • a protein including an antibody or an antibody fragment, etc. is stably associated with a polymer having an opposite charge through electrostatic bonding to form droplets.
  • the form of association between a protein including an antibody or an antibody fragment, etc., and a polymer can be, for example, a form in which the protein is electrostatically bonded to a polymer having an opposite charge, or a form in which the protein is electrostatically bonded to a polymer having an opposite charge and stably encapsulated within the polymer.
  • PPCs Protein-polyelectrolyte complexes
  • the formation of the droplets of the present disclosure can be appropriately confirmed by observation under a microscope using differential interference contrast.
  • the diameter of the formed droplets can be measured using an ocular micrometer under a transmission electron microscope to obtain an approximate value, a particle size distribution meter using a dynamic light scattering method, a nanoparticle tracking analyzer using the characteristics of both scattered light and Brownian motion, and the like.
  • the particle size of the droplets of the present disclosure is determined by nanoparticle tracking analysis. By adjusting the production conditions, droplets of the present disclosure can also be produced in the range of 100 nm to 10 ⁇ m, 200 nm to 2 ⁇ m, or 300 nm to 1 ⁇ m.
  • the ratio (mass ratio) of polymer to protein can be set appropriately. For example, it can be in the range of 1:100 to 1:10, or even in the range of 1:10 to 1:1.
  • the temperature during mixing can also be set appropriately, for example, in the range of 15 to 40°C, or even in the range of 20°C to 30°C.
  • the pH during mixing may be any pH at which the protein and polymer can electrostatically interact with each other, and is preferably, for example, a pH between the isoelectric point of the protein and the isoelectric point of the polymer.
  • the droplets formed are separated using a process such as centrifugation, filtration, or deep bed filtration (for example, Patent No. 5361738, etc.), and the droplets reconstituted as an aqueous solution with an appropriate protein concentration can be provided to the next encapsulation process.
  • lipid mixture As the lipid used in the present disclosure, at least one type of lipid capable of forming micelles in water is used as a mixture (hereinafter also referred to as lipid mixture). So-called amphipathic lipids having both hydrophilic and hydrophobic portions can be used. Such lipids can be known, and examples of such lipids include phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, and the like, which are phospholipids known to be components of biological membranes.
  • PEG lipids such as DMG-PEG5k, and the like, which are used as surfactants, such as the amphoteric lipid 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate (CHAPS), the anionic lipid sodium cholic acid salt, and the nonionic lipid octylglycoside, can also be used as appropriate.
  • CHAPS amphoteric lipid 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
  • anionic lipid sodium cholic acid salt e.glycoside
  • neutral phospholipids such as 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) and PEG lipids such as 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy-polyethylene glycol-2000 (DSPEmPEG2000) may be used.
  • DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • PEG lipids such as 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy-polyethylene glycol-2000 (DSPEmPEG2000) may be used.
  • DSPEmPEG2000 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxy-polyethylene glycol-2000
  • the cationic lipid comprises 20 mol% to 60 mol%, 20 mol% to 55 mol%, 20 mol% to 50 mol%, 20 mol% to 45 mol%, 20 mol% to 40 mol%, 25 mol% to 55 mol%, 25 mol% to 50 mol%, 25 mol% to 45 mol%, 25 mol% to 40 mol%, 30 mol% to 55 mol%, 30 mol% to 50 mol%, 30 mol% to 45 mol% of the lipid mixture (excluding PEG lipids) present in the lipid nanoparticles of the present disclosure.
  • the phospholipids in the lipid mixture (excluding PEG lipids) present in the lipid nanoparticles may comprise 2 mol% to 20 mol%, 2 mol% to 15 mol%, 2 mol% to 12 mol%, 2 mol% to 10 mol%, 2 mol% to 8 mol%, 4 mol% to 15 mol%, 4 mol% to 12 mol%, or 4 mol% to 10 mol%, 4 mol% to 8 mol% (or any percentage or range thereof) of the lipid mixture (excluding PEG lipids) present in the lipid nanoparticles of the present disclosure.
  • the phospholipids in the lipid mixture comprise 8 mol% to 15 mol%, 8 mol% to 12 mol%, 8 mol% to 10 mol%, or 5 mol%, 6 mol%, 7 mol%, 8 mol%, 9 mol%, 10 mol%, 11 mol%, or 12 mol% (or any percentage or range thereof) of the lipid mixture (excluding PEG lipids) present in the particle.
  • the cholesterol or cholesterol derivatives in the lipid mixture are present in the lipid nanoparticles of the present disclosure in an amount of 20 mol% to 60 mol%, 20 mol% to 55 mol%, 20 mol% to 50 mol%, 20 mol% to 45 mol%, 20 mol% to 40 mol%, 25 mol% to 55 mol%, 25 mol% to 50 mol%, 25 mol% to 45 mol%, 25 mol% to 40 mol%, 30 mol% or more of the lipid mixture (excluding PEG lipids) present in the lipid nanoparticles of the present disclosure.
  • the PEG lipid comprises 0.5 mol% to 5 mol%, 0.5 mol% to 8 mol%, 0.5 mol% to 10 mol%, 1.0 mol% to 5 mol%, 1.0 mol% to 8 mol%, 1.0 mol% to 10 mol%, 1.5 mol% to 5 mol%, 1.5 mol% to 8 mol%, 1.5 mol% to 10 mol%, 2.0 mol% to 5 mol%, 2.0 mol% to 8 mol%, 2.0 mol% to 10 mol%, 0.5 mol%, 1.0 mol%, 1.5 mol%, 5 mol%, 8 mol%, 10 mol% (or any percentage or range thereof) of the lipid mixture (excluding the PEG lipid) present in the lipid nanoparticles of the present disclosure.
  • the percentage of PEG lipid present in the lipid nanoparticles of the present disclosure is the target amount during manufacturing, and the actual content of PEG lipid present in the formulation may vary, for example
  • the composition containing cationic lipids can be 20 mol% to 60 mol% cationic lipids, 20 mol% to 60 mol% cholesterol, and 2 mol% to 20 mol% phospholipids with 0.5 mol% to 10 mol% PEG lipids.
  • the composition containing cationic lipids is 40 mol% to 55 mol% cationic lipids, 40 mol% to 55 mol% cholesterol, and 8 mol% to 15 mol% phospholipids with 1.0 mol% to 5 mol% PEG lipids.
  • intracellular environment-responsive lipids are also preferably used as cationic lipids in order to increase the efficiency of escape from endosomes after delivery to cells.
  • Intracellular environment-responsive lipids are lipids that decompose or change their structure in response to environmental factors such as reducing conditions and pH in the cell.
  • intracellular environment-responsive lipids having one or more properties selected from ionizable property, reducing environment responsive property, and self-degrading property can be appropriately used.
  • Lipids with ionizable properties have no charge outside the cell, but after being taken up into the cell via endocytosis, they become positively charged under acidic conditions in the endosome and can fuse with the negatively charged endosomal membrane.
  • Non-limiting examples of lipids with ionizable properties include a combination of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) and cholesterol hemisuccinic acid (CHEMS), and a combination of 1,2-dioleoyl-3-dimethylammoniumpropane (DODAP) and phosphatidylserine (PS), which are appropriately used.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • CHEMS cholesterol hemisuccinic acid
  • DODAP 1,2-dioleoyl-3-dimethylammoniumpropane
  • PS phosphatidylserine
  • lipids with ionizable properties is 1,2-dilinoleyl-MC3-N,N-dimethyl-3-aminopropane (DLin-MC3-DMA), which has a tertiary amine in the hydrophilic portion of the amphipathic lipid.
  • DLin-MC3-DMA 1,2-dilinoleyl-MC3-N,N-dimethyl-3-aminopropane
  • Lipids that are responsive to reducing conditions have no charge outside the cell, but after being taken up into the cell via endocytosis, they become positively charged under acidic conditions in the endosome and can fuse with the negatively charged endosomal membrane.
  • Non-limiting examples of lipids with such ionizable properties include a combination of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) and cholesterol hemisuccinic acid (CHEMS), and a combination of 1,2-dioleoyl-3-dimethylammoniumpropane (DODAP) and phosphatidylserine (PS), which are appropriately used.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • CHEMS cholesterol hemisuccinic acid
  • DODAP 1,2-dioleoyl-3-dimethylammoniumpropane
  • PS phosphatidylserine
  • lipids with such ionizable properties is 1,2-dilinoleyl-MC3-N,N-dimethyl-3-aminopropane (DLin-MC3-DMA), which has a tertiary amine in the hydrophilic portion of the amphipathic lipid.
  • DLin-MC3-DMA 1,2-dilinoleyl-MC3-N,N-dimethyl-3-aminopropane
  • lipids listed in WO2019-188867 for example, the lipids listed in the following formula (1), can be used.
  • R1a and R1b each independently represent an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • Xa and Xb each independently represent a non-cyclic alkyl tertiary amino group having 1 to 6 carbon atoms and one tertiary amino group, or a cyclic alkylene tertiary amino group having 2 to 5 carbon atoms and one or two tertiary amino groups
  • R2a and R2b each independently represent an alkylene group or an oxydialkylene group having 8 or less carbon atoms
  • Ya and Yb each independently represent an ester bond, an amide bond, a carbamate bond, an ether bond, or a urea bond
  • Za and Zb each independently represent a divalent group derived from an aromatic compound having 3 to 16 carbon atoms, at least one aromatic ring, and optionally having a heteroatom
  • R3a and R3b each independently represent a residue derived from a reaction product of a fat-soluble vitamin having a hydroxy
  • examples of such lipids include O-Ph-P3C1, O-Ph-P4C1, O-Ph-P4C2, O-BnP4C2, E-Ph-P4C2, L-Ph-P4C2, HD-Ph-P4C2, O-Ph-amide-P4C2, and O-Ph-C3M. These lipids respond to pH, redox activity, and the like, and can increase the efficiency of endosomal escape.
  • lipid one or more lipids selected from the compounds described in the Examples below, that is, bis[[4-[2-[[4-(oleoyloxy)phenyl]acetoxy]ethyl]piperidino]ethyl]disulfane (SS-OP) as a lipid having ionizable properties, reducing condition responsive properties, and autolytic properties, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a neutral phospholipid, DMG-PEG5k as a PEG lipid, and ⁇ -sitosterol as cholesterol, can be suitably used.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • the antibody content (protein loading rate) in the lipid nanoparticles of the present disclosure can be appropriately adjusted from within the ranges of 5-95 mol%, 10-90 mol%, or 30-80 mol%.
  • the lipid mixture of the present disclosure can be prepared by dispersing the cationic lipids of the present disclosure and other components (lipids, etc.) in an appropriate solvent or dispersion medium, for example, an aqueous solvent or an alcoholic solvent, and performing an operation to induce organization as necessary.
  • amphiphilic substances are used in producing the lipid nanoparticles of the present disclosure.
  • the amphiphilic substance is selected in consideration of the stability and uniformity of the lipid nanoparticles.
  • amphiphilic substances used in the present disclosure include lipids such as phosphoglycerides, phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), dioleyloxypropyltriethylammonium (DOTMA), dioleoylphosphatidylcholine, cholesterol, cholesterol esters, diacylglycerol, diacylglycerol succinate, diphosphatidylglycerol (DPPG), hexanedecanol, and polyethylene glycol (PEG).
  • lipids such as phosphoglycerides, phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleylphosphatidyl
  • Aliphatic alcohols such as palmitic acid or oleic acid; fatty acids; fatty acid monoglycerides; fatty acid diglycerides; fatty acid amides; sorbitan trioleate (Span® 85); glycocholate; sorbitan monolaurate (Span® 20); polysorbate 20 (Tween® 20); polysorbate 60 (Tween® 60); polysorbate 65 (Tween® 65); polysorbate 80 (Tween® 65); (Tween® 85); polysorbate 85 (Tween® 85); polyoxyethylene monostearate; surfactin; poloxomer; sorbitan fatty acid esters such as sorbitan trioleate; lecithin; lysolecithin; phosphatidylserine; phosphatidylinositol; sphingomyelin; phosphatidylethanolamine (cephalin); cardiolipin; phosphatidic acid
  • the lipid nanoparticles can be produced by the production method described below.
  • the lipid nanoparticles have a structure in which droplets formed by the association of a protein containing an antibody or an antibody fragment with a polymer are encapsulated in lipid.
  • the protein containing an antibody or an antibody fragment is stably associated with a polymer having an opposite charge through electrostatic bonding to form droplets.
  • the form of association between the protein containing an antibody or an antibody fragment and the polymer is not limited to a specific theory, but examples of the form in which the protein is electrostatically bonded to a polymer having an opposite charge and the protein is electrostatically bonded to a polymer having an opposite charge and stably encapsulated in the polymer can be assumed.
  • the particle size of the lipid nanoparticles can be measured using a particle size distribution meter using a dynamic light scattering method or a nanoparticle tracking analyzer that utilizes the characteristics of both scattered light and Brownian motion.
  • the particle size of the lipid nanoparticles in the present disclosure is determined by nanoparticle tracking analysis and is produced in the range of 10 to 600 nm.
  • the lipid nanoparticles can also be produced in the range of 50 to 500 nm or 70 to 400 nm.
  • the average particle size distribution determined by nanoparticle tracking analysis is 300 nm or less.
  • the peak top is produced at 150 nm or less, and can be produced at 120 nm or less, or even 100 nm or less by adjusting the production conditions. It is said that a particle size of less than 100 nm is easily endocytosed. Furthermore, in tumor cells, etc., it is said that a particle size of less than 100 nm is retained around the cancer tissue through the Enhanced Permeability and Retention effect, increasing selectivity.
  • the antibody content (protein loading rate) in the lipid nanoparticles of the present disclosure can be appropriately adjusted within the following ranges: 0.1-10.0 mol%, 0.2-10.0 mol%, 0.3-10.0 mol%, 0.4-10.0 mol%, 0.5-10.0 mol%, 0.1-5.0 mol%, 0.2-5.0 mol%, 0.3-5.0 mol%, 0.4-5.0 mol%, 0.5-5.0 mol%, 0.1-2.0 mol%, 0.2-2.0 mol%, 0.3-2.0 mol%, 0.4-2.0 mol%, 0.5-2.0 mol%.
  • compositions In order to formulate the lipid nanoparticles of the present disclosure into pharmaceutical compositions, the lipid nanoparticles can be combined with various pharma- ceutically acceptable additives and bases or carriers for dispersing the active agent(s).
  • additives include pH adjusters such as arginine, sodium hydroxide, glycine, hydrochloric acid, citric acid, and mixtures thereof.
  • additives include local anesthetics (e.g., benzyl alcohol), isotonicity agents (e.g., sodium chloride, mannitol, sorbitol), adsorption inhibitors (e.g., Tween 80), solubility enhancers (e.g., cyclodextrin and its derivatives), stabilizers (e.g., serum albumin), and reducing agents (e.g., glutathione).
  • the pharmaceutical compositions comprising the lipid nanoparticles of the present disclosure can be dispersed in a base or vehicle, which may include a hydrophilic compound capable of dispersing the active agent and any desired additives.
  • the base may be selected from a wide range of suitable carriers, including, but not limited to, copolymers of polycarboxylic acids or their salts, copolymers of carboxylic anhydrides (e.g., maleic anhydride) and other monomers (e.g., methyl (meth)acrylate, acrylic acid, etc.), hydrophilic vinyl polymers such as polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, cellulose derivatives such as hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, etc., and natural polymers such as chitosan, collagen, sodium alginate, gelatin, hyaluronic acid, and non-toxic metal salts thereof.
  • suitable carriers including, but not limited to, copolymers of polycarboxylic acids or their salts, copolymers of carboxylic anhydrides (e.g., maleic anhydride) and other monomers (e.g., methyl (meth)acrylate, acrylic acid, etc.), hydrophil
  • biodegradable polymers such as polylactic acid, poly(lactic acid-glycolic acid) copolymers, polyhydroxybutyric acid, poly(hydroxybutyric acid-glycolic acid) copolymers, and mixtures thereof, are selected as the base or carrier.
  • synthetic fatty acid esters such as polyglycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, etc. may also be used as carriers.
  • Hydrophilic polymers and other carriers can be used alone or in combination and can impart enhanced structural integrity to the carrier by partial crystallization, ionic bonding, crosslinking, etc.
  • Carriers can be provided in a variety of forms including fluid or viscous solutions, gels, pastes, powders, microspheres, and films for direct application to the nasal mucosa. Use of selected carriers in this context can result in enhanced absorption of the biologically active agent.
  • compositions of the present disclosure may contain pharma- ceutically acceptable carriers necessary to approximate physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, tonicity adjusting agents, and wetting agents, e.g., sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate, and mixtures thereof.
  • pharma- ceutically acceptable carriers necessary to approximate physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, tonicity adjusting agents, and wetting agents, e.g., sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate, and mixtures thereof.
  • conventional non-toxic pharma-ceutically acceptable carriers may be used, including, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, sucrose, magnesium carbonate, and the like.
  • Lipid nanoparticles can be produced based on known methods with reference to J. Chem. Phys. 150, 064903 (2019) and the like. Specifically, first, a protein containing an antibody or an antibody fragment and a polymer are mixed in an appropriate ratio to form droplets (droplet formation step).
  • the form of association between a protein containing an antibody or an antibody fragment and a polymer is not limited to a specific theory, but examples of the form in which the protein is electrostatically bound to a polymer having an opposite charge, or the protein is electrostatically bound to a polymer having an opposite charge and stably encapsulated within the polymer, can be assumed.
  • Mixing can be performed by mixing with a liquid mixer or pipetting, stirring with a stirrer or stirring blade in a mixing container, mixing with a high-speed impinging jet mixer or a multi-inlet vortex mixer, or contacting on a flow path of a microfluidic device (i.e., a microflow path).
  • the ratio (mass ratio) of polymer to protein can be appropriately set, but can be, for example, within the range of 100:1 to 10:1, or even within the range of 10:1 to 1:1.
  • the temperature during mixing can also be appropriately set, for example, within the range of 15 to 40°C, or 20 to 30°C.
  • the pH during mixing may be any pH that allows electrostatic interaction between the protein and the polymer, and is preferably, for example, a pH between the isoelectric point of the protein and the isoelectric point of the polymer.
  • the droplets formed are separated using a process such as centrifugation, filtration, or depth filtration (e.g., Patent 5361738, etc.), and the droplets reconstituted as an aqueous solution with an appropriate protein concentration can be provided to the subsequent encapsulation process.
  • the droplets are mixed with lipids to encapsulate the droplets in the lipids (encapsulation process), producing lipid nanoparticles.
  • This mixing can be performed by using a liquid mixer or pipetting, stirring in a mixing vessel with a stirrer or impeller, or using a high-speed confined impinging jets mixer or a multi-inlet vortex mixer.
  • Other industrial production methods such as contacting the droplets on a flow channel of a microfluidic device, alcohol dilution (precipitation), hydration, and emulsification, have also been established.
  • the ratio (mass ratio) of lipid to droplets can be set appropriately, and can be, for example, within the range of 1:100 to 10:1, or even within the range of 1:10 to 1:1.
  • the temperature during mixing can also be set appropriately, and can be, for example, within the range of 15 to 40°C, or even within the range of 20°C to 30°C.
  • the pH during mixing can be, for example, within the range of 5 to 9, and further within the range of h 6 to 8.
  • solvents that can be used to dissolve lipids include alcohols such as ethanol, butanol, and tert-butanol, as well as ethylene glycol, glycerin, and polyethylene glycol. However, the solvent should be selected after comprehensively considering the particle formation properties, delivery properties to cells, and toxicity.
  • effect The nanoparticles thus produced are evaluated in vitro and in vivo.
  • the nanoparticles of the present disclosure have been observed to be localized intracellularly, including in the cytosol and nucleus.
  • IgG used was normal human IgG, whole molecule, purified product (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) In this specification, it is referred to as IgG or hIgG.
  • the polyglutamic acids used had the following sizes (mol wt 3,000-15,000, Sigma).
  • the particle diameter, PdI (particle size distribution, and zeta potential ( ⁇ -potential) were evaluated using a Zetasizer Nano ZS (Malvern). The collected samples were diluted 100-fold with PBS and measurements were performed.
  • the encapsulation rate was calculated by centrifuging the prepared LNP at 4 ° C. and 20,000 g for 30 minutes using a tabletop ultracentrifuge, measuring the protein concentration of the supernatant. That is, IgG_polyE-LNP was adjusted with PBS (-) so that the antibody concentration was 2 ⁇ M (final sample volume 100 ⁇ L). This was centrifuged at 4 ° C., 20,000 ⁇ g, for 1 hour to precipitate the LNP fraction. 50 ⁇ L of the supernatant was collected, the antibody concentration was measured using Nanodrop, and the encapsulation rate was calculated back from the following formula.
  • C IgG refers to the IgG concentration calculated from the supernatant obtained by centrifuging 2 ⁇ M IgG
  • C LNP refers to the IgG concentration calculated from the supernatant obtained by centrifuging IgG_polyE-LNP.
  • Encapsulation rate of IgG (%) (C IgG ⁇ C LNP )/C IgG ⁇ 100
  • HeLa cells HeLa cells obtained from ATCC were cultured in ⁇ -MEM containing 10% bovine serum (BS).
  • BS bovine serum
  • Dialysis The dialysis membrane used was a 2-14k MWCO dialysis membrane (Spectrum Laboratories Inc.) After filling the dialysis membrane, dialysis was performed by stirring with a Corning Stirrer.
  • hIgG-AF488 For the Alexa Fluor 488 modification, 345 ⁇ L of PBS( ⁇ ) was added to 100 ⁇ L of 10 mg/mL hIgG (normal human IgG, Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation), and 50 ⁇ L of 1 M NaHCO 3 was added thereto to make the solution basic. The mixture was mixed with 1000 ⁇ g/mL Alexa488-SDP ester (Thermo Fisher Scientific) and mixed by inversion for 1 hour at 25°C in the dark. The antibody fraction was then separated using a PD10 column and purified with Alexa Fluor 488-labeled hIgG (hIgG-AF488). was purified.
  • Anti-GFP antibodies were prepared using the Expi293TM Expression System (Thermo Fisher Scientific). Expi293FTM cells were prepared to a concentration of 3,000,000 cells/mL, and 25 mL was added to a 125 mL Erlenmeyer flask. 25 ⁇ g of a plasmid encoding Anti-GFP-IgG (Addgene, Anti-GFP [N86/38.1R]) was mixed with ExpiFectamineTM293 (Thermo Fisher Scientific) and transfected according to the recommended protocol.
  • Expi293TM Expression System Thermo Fisher Scientific
  • the fraction containing IgG was collected and dialyzed against PBS (pH 7.4) to obtain anti-GFP antibody (anti-GFP-IgG).
  • the recovered anti-GFP antibody (anti-GFP-IgG) was stored at 4° C.
  • an antibody in a citric acid solution pH 7.5
  • the solution was replaced with a citric acid solution (pH 5) using a Micro Biospin (registered trademark) Column 30 (BIORAD).
  • Example 1 (Production of LNPs) The lipid was dissolved in chloroform to prepare 20 mM SS-OP, 10 mM DOPE, 20 mM ⁇ -sitosterol, and 10 mM DMG-PEG5k.
  • the composition of SS-OP/DOPE/ ⁇ -sitosterol/DMG-PEG5k (molar ratio 45/10/45/1.5) was mixed in a flask at room temperature, and 1 mL of t-BuOH (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation) was added and dissolved, and the chloroform was evaporated in a rotary evaporator to obtain a lipid solution.
  • this lipid solution was freeze-dried for 18 to 24 hours, and then dissolved in t-BuOH to prepare a 10 mM lipid solution.
  • a lipid solution dissolved in t-BuOH and a polyglutamic acid solution (0.75 mg/mL polyglutamic acid solution (polyE, mol wt 3,000-15,000) dissolved in 10 mM citric acid solution (pH 5) were separately incubated at 40° C. for 30 minutes.
  • hIgG:polyE 5:1 (mass ratio) to form hIgG-polyE droplets
  • the lipid solution incubated at 40°C for 30 minutes was mixed with the droplet solution by pipetting 15 times to give a 1:4 (volume ratio).
  • the mixture was dialyzed against 1,000 times or more volume of PBS (-) (pH 7.4) using a 12-14k MWCO dialysis membrane (Spectrum Laboratories Inc.) to prepare lipid nanoparticles encapsulating hIgG (hIgG_polyE-LNPs).
  • Example 2 (Production of LNPs) hIgG_polyE-LNP was produced in the same manner as in Example 1, except that a 90% tBuOH aqueous solution was used instead of tBuOH. (effect)
  • Example 3 (Localization in HeLa cells) (Production of LNPs)
  • IgG_polyE-LNP(a) to (e) with antibody:lipid ratios of (a) to (e) were prepared in the same manner as in Example 1, except that hIgG-AF488 was used instead of IgG.
  • hIgG-AF488:polyE (a) 1:100 (b) 1:200 (c) 1:300 (d) 1:400 (e) 1:500
  • the adjusted hIgG-AF488_polyE-LNP was added to serum medium of HeLa cells so that the IgG concentration was 1 ⁇ M, suspended, and incubated for 18 hours under conditions of 37°C and 5% CO2 , and the intracellular localization of hIgG-AF488 was observed.
  • Figure 1 A the time course of (b) 1:200 IgG_polyE-LNP was observed, it was found that hIgG was delivered to the cytosol 6 hours after addition.
  • Example 4 (Production of various LNPs) (Anti-GFP antibody_polyE-LNP)
  • Anti-GFP antibody_polyE-LNP was produced in the same manner as in Example 1, except that anti-GFP antibody was used instead of hIgG.
  • Example 5 (a) hIgG-AF488, (b) hIgG-AF488_PolyE, or (c) hIgG-AF488_PolyE-LNP was added to serum-containing medium at 1 ⁇ M to HeLa cells, and the cells were incubated at 37° C. and 5% CO2 for 18 hours to observe the intracellular localization of IgG (FIG. 2A).
  • Example 6 In order to demonstrate the usefulness of adding polyE, LNPs (IgG-LNPs) (Reference Example 1) were prepared by mixing polyE-free hIgG with lipids, and a comparative test was carried out with hIgG_polyE-LNP (Example 1). To observe intracellular localization, hIgG-AF488 was used as the hIgG.
  • HIgG-LNP and hIgG_polyE-LNP were added to HeLa cells in serum medium at an IgG concentration of 1 ⁇ M, suspended, and incubated at 37°C and 5% CO2 for 18 hours.
  • IgG concentration 1 ⁇ M
  • Example 7 LgBiT and HiBiT associate to reconstitute nanoluciferase, which emits light when luciferin is added.
  • the amount of cytosolic transfer of hIgG_polyE-LNP (Production Example 1) and hIgG-LNP (Production Example 2) was compared.
  • hIgG_polyE-LNPs or IgG-LNPs encapsulating hIgG-HiBiT which had a HiBiT sequence genetically engineered to the C-terminus of an anti-GFP antibody (anti-GFP-IgG) (Addgene; Anti-GFP [N86/38.1R], Plasmid #114492), were suspended in serum medium at an IgG concentration of 0.5 ⁇ M and administered to HeLa cells (HeLa-LgBiT) constitutively expressing LgBiT for 18 hours. After incubation, the cells were washed three times with PBS (pH 7.4) and harvested by trypsinization.
  • anti-GFP-IgG anti-GFP antibody
  • HRas is a member of the Ras protein family and is a protein that is localized in the cell membrane. GFP was localized in the cell membrane by using HeLa cells expressing HRas-GFP, which is a fusion of HRas with GFP.
  • Anti-GFP-IgG (Addgene; Anti-GFP [N86/38.1R], Plasmid #114492) (anti-GFP antibody-AF594) labeled with Alexa Fluor 594 was prepared, converted into LNP, and suspended in serum medium to an IgG concentration of 1 ⁇ M in HRas-GFP-expressing HeLa cells for 18 hours, and the intracellular localization of IgG was observed. Co-localization of the fluorescent signals of GFP and anti-GFP-IgG-AF594 was confirmed near the cell membrane where HRas-GFP was present (Figure 5A).
  • Non-fluorescently labeled anti-GFP antibodies were converted into LNPs, suspended in serum medium to an IgG concentration of 1 ⁇ M in HRas-GFP-expressing HeLa cells, and incubated for 18 hours. The cells were then fixed with paraformaldehyde and immunostained using an Alexa fluor 568-labeled secondary antibody (ThermoFisher Scientific) to observe the intracellular localization of IgG. As with the fluorescently labeled antibodies, it was confirmed that the fluorescent signal of HRas-GFP and the fluorescent signal of the secondary antibody Alexa fluor 568 were colocalized (Figure 5B). These results demonstrated that both fluorescently labeled and non-fluorescently labeled antibodies can be delivered to the cytosol by IgG_polyE-LNPs.
  • Example 9 In order to introduce an antibody that recognizes an endogenous protein, an antibody against nuclear pore complexes (NPC), anti-NPC-IgG (Mab414, Cat#: 902902, BioLegend), was introduced.
  • NPC nuclear pore complexes
  • hIgG-AF488_polyE-LNP or hIgG-AF488_polyE sample was suspended in serum medium to an IgG concentration of 1 ⁇ M in HeLa cells, and administered for 18 hours. Thereafter, immunostaining was performed to observe the intracellular localization of IgG.
  • Example 10 We carried out the delivery of IgG, which not only recognizes intracellular proteins but also exerts cellular functions by inhibiting the activity of the recognized proteins.
  • Akt suppresses the activity of proteins that induce apoptosis in cancer cells. It has been reported that IgG (anti-pAKT1-IgG) (Cat#: 700392, Invitrogen), which recognizes phosphorylated Akt (pAkt), an active form of Akt, and inhibits its function, can induce apoptosis in cells by introducing it into HeLa cells. Therefore, we examined whether anti-pAkt1-IgG could be delivered to the cytosol by LNP and induce apoptosis.
  • IgG_polyE-LNP encapsulating hIgG and anti-pAkt1-IgG as control IgG was suspended in serum medium to a hIgG concentration of 1 ⁇ M in HeLa cells, and administered for 24 hours. After that, Caspase-Glo (registered trademark) 3/7 Assay reagent (Promega) was added and incubated at room temperature for 1 hour, and the amount of luminescence was quantified. It was confirmed that apoptosis was significantly induced in the group delivered with anti-pAkt1 antibody (anti-pAkt1-IgG) compared to hIgG ( Figure 7A).
  • IgG_polyE-LNP The versatility of IgG_polyE-LNP was examined using HT1080 cells, MDA-MB-231 cells, and SW480 cells in addition to HeLa cells.
  • IgG_polyE-LNP encapsulating hIgG-AF488 was suspended in serum medium to an IgG concentration of 1 ⁇ M, administered to the cells, incubated for 24 hours, and observed under a confocal microscope.
  • hIgGAlexa488 was efficiently delivered to the cytosol ( Figure 8).
  • MDA-MB-231 cells and SW480 cells diffusion into the cytosol was confirmed, although the efficiency was not high ( Figure 8). Therefore, it was found that hIgG_polyE-LNP can be delivered to the cytosol in cancer cells other than HeLa cells.
  • polyE poly-L-glutamic acid
  • the lipid solution and droplet solution which had been prepared to 4 mM with 90% t-BuOH and incubated at 40 ° C. for 30 minutes, were mixed by pipetting 15 times to make the ratio 1: 4 (volume ratio). Thereafter, the mixture was dialyzed against 1,000 times or more volume of PBS (-) using a 12-14k MWCO dialysis membrane (Spectrum Laboratories Inc.) to prepare lipid nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) encapsulating IgG. These were added to HeLa cells, and 18 hours later, the cells were fixed and permeabilized, immunostained with Alexa488-labeled anti-human IgG antibody, and the cells were observed using a confocal microscope.
  • hIgG_polyE-LNP prepared with 90% t-BuOH lipid solution was also capable of delivering antibodies to the cytosol in the same way as hIgG_polyE-LNP prepared with t-BuOH lipid solution (FIG. 9).
  • Lipid Nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) was investigated using a microfluidic device.
  • Human IgG (10 mg/mL) and polyE (0.75 mg/mL) were dissolved in 10 mM MES buffer (pH 5) at a ratio of 5:1 (w/w), droplets were formed, and the droplets were loaded into a 1 mL syringe (Terumo).
  • a 8 mM or 16 mM lipid solution prepared with t-BuOH to give a 1.5 mol% PEG5k mixture of SS-OP:DOPE: ⁇ -sitosterol 45:10:45 was filled into another 1 mL syringe (Terumo). These were set in a syringe pump (kd scientific) and mixed at each flow rate, and the mixture was dialyzed overnight against PBS. The conditions for each sample are shown in the table below.
  • Lipid Nanoparticles hIgG_polyE-LNP
  • the Lipid Nanoparticles hIgG_polyE-LNP
  • the Lipid Nanoparticles prepared under conditions of a lipid concentration of 8 mM and a flow rate of 100 ⁇ L/min had the highest delivery efficiency.
  • the particle size of the prepared Lipid Nanoparticle (hIgG_polyE-LNP) was measured (FIG. 13), and the antibody encapsulation rate (FIG. 14) was calculated.
  • the particle size of the Lipid Nanoparticle (hIgG_polyE-LNP) prepared under the condition of a flow rate of 500 ⁇ L/min showed a small tendency for the encapsulation rate to be low.
  • lipid nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) exhibiting desired properties by changing the mixing conditions of the microfluidic device.
  • Lipid Nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) prepared by adding serum-containing medium to the dialysate to make 200 ⁇ L (fill-up) at 37° C. for 18 hours, and the cells were washed with PBS, fixed with 4% formaldehyde, and permeabilized with 0.1% Triton X-100.
  • Immunostaining with anti-Human IgG-Alexa488 suggested that the intracellular delivery efficiency of Lipid Nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) prepared using droplets with 2.6k polyglutamic acid was lower than that of droplets with 3-15k and 39k polyglutamic acid (FIGS. 15 and 16).
  • Lipid Nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) exhibiting desired properties by examining the degree of polymerization of the polymer.
  • Hyaluronic acid Example 15
  • the efficiency of delivery into the cytoplasm of lipid nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) prepared using droplets containing hyaluronic acid with a molecular weight of about 1,000,000 (approximate degree of polymerization of about 2500) and an antibody was confirmed.
  • the mixture in which the droplets were formed was adjusted to 40 ⁇ L (fill-up) with 10 mM citrate buffer (pH 5) and then suspended, and 10 ⁇ L of 8 mM lipid solution was added, followed by dialysis overnight against PBS to produce Lipid Nanoparticles (hIgG_polyE-LNP).
  • HeLa cells were treated with Lipid Nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) prepared by adding serum-containing medium to the dialysate to make 200 ⁇ L (fill-up) at 37° C. for 18 hours, and the cells were washed with PBS, fixed with 4% formaldehyde, and permeabilized with 0.1% Triton X-100.
  • Immunostaining with anti-Human IgG-Alexa488 confirmed that IgG contained in the Lipid Nanoparticles (hIgG_polyE-LNP) was delivered to the cytosol (FIG. 18).
  • a nuclear molecule-specific antibody (IgG-NLS) is prepared by expressing a gene in which a nuclear localization signal sequence (PAAKRVKLD) is added to the C-terminus of an antibody capable of binding to a target molecule present in the nucleus.
  • PAKRVKLD nuclear localization signal sequence
  • HeLa cells were treated with lipid nanoparticles (IgG-NLS_polyE-LNP) prepared by adding serum-containing medium to the dialysis solution to make 200 ⁇ L (fill-up) at 37°C for 18 hours, after which the cells were washed with PBS, fixed with 4% formaldehyde, and permeabilized with 0.1% Triton X-100.
  • Immunostaining was performed using anti-Human IgG-Alexa488, and the localization of IgG-NLS was observed using a confocal microscope.
  • lipid nanoparticles By using charged proteins and polymers with the opposite charge to create lipid nanoparticles, it is possible to produce smaller lipid nanoparticles that are taken up by cells and delivered to the interior of the cell, including the cytosol and nucleus. By using this drug delivery system, it is now possible to introduce antibodies into cells, which was previously difficult, expanding the range of treatment methods.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本開示は、抗体および抗体フラグメントから選択されるタンパク質と、ポリマーと、脂質と、からなる組成物であって、所定のｐＨにおいてポリマーとタンパク質とが反対の電荷を持つことを特徴とする組成物からなる脂質ナノ粒子である。脂質ナノ粒子は、タンパク質が封入されていることが好ましい。また、脂質ナノ粒子の粒径を測定したときに粒径分布のピークトップが８０ｎｍから１２０ｎｍであることが好ましい。

Description

脂質ナノ粒子、医薬組成物、および脂質ナノ粒子の製造方法
　本開示は、脂質ナノ粒子に関する。特に、抗体などのタンパク質を脂質ナノ粒子に封入させサイトゾル（細胞質基質）を含む細胞内へ送達することができる脂質ナノ粒子、医薬組成物、および脂質ナノ粒子の製造方法に関する。
　抗体医薬は、抗原特異的な結合能を有するため、研究用試薬としてのみでなく、分子標的薬として実用化され、現代の医療において重要な役割を担うバイオ医薬品である。しかしながら、抗体は親水性に富む高分子（約１５０ｋＤａ）であり、生体膜透過性の制約から、その標的は細胞外因子に制限される。つまり、抗体の画期的な細胞内への導入方法を開発できれば、抗体の適用範囲を細胞外抗原から細胞内抗原へ拡大することができ、抗体医薬の新たな疾患応用が期待できる。
　新型コロナウイルスワクチン（Ｃｏｍｉｒｎａｔｙ（登録商標）、Ｓｐｉｋｅｖａｘ（登録商標））に代表されるＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＬＮＰ）技術は、ｍＲＮＡなどの核酸分子を標的細胞内に送達でき、バイオ医薬品の適用範囲を拡げた。ＬＮＰは核酸などの負電荷分子を効率的に内封化およびサイトゾルへの送達を増強する脂質ナノ粒子製剤であり、抗体医薬への応用も期待される。
　非特許文献１には、リポソームベースの製剤であるＤＯＳＰ：ＭＭ２７（イミダゾールベースのヘルパー脂質　ＭＭ２７＋アミノグリコシド脂質ジオレイルスクシニルパロモマイシン（ＤＯＳＰ））が抗サイトケラチン８（Ｋ８）抗体を細胞内送達できたことが記載されている。
　非特許文献２には、エタノールに溶解させたリポスペルミンＤＯＧＳ（ジオクタデシルグリシルスペルミン）を用いて、α－ｔｕｂｕｌｉｎとβ－ａｃｔｉｎの抗体を細胞内送達できたことが記載されている。
　特許文献１には、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアミノ酸とが複合体を形成することにより、このタンパク質を濃縮する方法について記載されている。
　特許文献２には、薬物送達システムに用いられる脂質ナノ粒子を形成する脂質について記載されている。この脂質を用いると、エンドサイトーシス後にエンドソームから脱出性が良好になるとされる。
国際公開第２０１５／０６４５９１号 国際公開第２０１９／１８８８６７号 Ｃｈａｔｉｎ　Ｂ，　Ｍｅｖｅｌ　Ｍ，　Ｄｅｖａｌｌｉｅｒｅ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｂａｓｅｄ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．　２０１５；４：ｅ２４４ Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ．　２００４　Ｊｕｎ；９（６）：９６４－９．　ｄｏｉ：　１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００４．０３．００７．Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ａｎｉｏｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
　本開示は、有用タンパク質の細胞内への送達、特に、癌細胞などにおいて、細胞内の機能性タンパク質に対する抗体を細胞内へ送達することを目的とする。
　発明者らは、多価電荷を持つ高分子であるタンパク質を脂質に封入するにあたり、酸性ポリアミノ酸のような酸性ポリマーを共存させることで、より小さな粒径の脂質ナノ粒子が生成することを見出して本開示を完成させた。
（１）抗体および抗体フラグメントから選択されるタンパク質と、ポリマーと、脂質と、を含む組成物であって、所定のｐＨにおいて前記タンパク質と前記ポリマーとが反対の電荷を持つことを特徴とする組成物からなる脂質ナノ粒子。
（２）前記脂質ナノ粒子は、前記タンパク質が封入されている、（１）記載の脂質ナノ粒子。
（３）前記脂質ナノ粒子の粒径を測定したときに粒径分布のピークトップが８０から１２０ｎｍである、（１）または（２）記載の脂質ナノ粒子。
（４）前記抗体または抗体フラグメントが、ポリペプチド、ペプチド、遺伝子、または脂質もしくは前記ポリペプチド、前記ペプチド、前記遺伝子、または前記脂質に結合した糖鎖に特異的に結合する、（１）から（３）のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
（５）前記ポリマーが、アニオン性またはカチオン性のポリマーである、（１）から（４）のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
（６）前記カチオン性ポリマーが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである、（５）記載の脂質ナノ粒子。
（７）前記アニオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも１つのポリアミノ酸またはヒアルロン酸、プルランからなる群より選択される少なくとも１つのグリコサミノグリカンである、（５）記載の脂質ナノ粒子。
（８）前記カチオン性または前記アニオン性ポリアミノ酸の分子量が、０．５ｋＤａ～１０００ｋＤａである、（５）記載の脂質ナノ粒子。
（９）前記脂質がカチオン性脂質である、前記（１）から（８）のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
（１０）前記カチオン性脂質が、イオン化可能特性、還元条件応答特性、自己分解性特性から選択される一以上の特性を有する細胞内環境応答性脂質である、（９）記載の脂質ナノ粒子。
（１１）さらに中性リン脂質、ＰＥＧ脂質、およびコレステロールからなる群より選択される一以上の脂質を含む（１）から（１０）のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。。
（１２）抗体および抗体フラグメントから選択されるタンパク質と、ポリマーと、脂質と、を含む組成物であって、所定のｐＨにおいて前記タンパク質と前記ポリマーとが反対の電荷を持つことを特徴とする組成物を含む医薬組成物。
（１２－１）前記（１２）記載の医薬組成物を投与することを含む薬学的有効成分である抗体の送達方法。
（１２－２）前記（１２）記載の医薬組成物の使用。
（１３）前記抗体および抗体フラグメントから選択されるタンパク質と、前記ポリマーとを混合して液滴を形成させる液滴形成工程と、
　前記液滴と前記脂質とを混合して前記脂質に前記液滴を内封させる内封工程と、を備えることを特徴とする脂質ナノ粒子の製造方法。
（１３－１）前記液滴形成工程および前記内封工程から選択される少なくとも一つの工程がマイクロ流体デバイスの流路を用いる工程である、（１３）記載の脂質ナノ粒子の製造方法。
（１４）タンパク質、ポリマー、脂質からなる組成物であって、ポリマーはあるｐＨにおいてタンパク質と反対の電荷を持つことを特徴とする組成物からなる脂質ナノ粒子。
　本開示によれば、抗体および抗体フラグメントから選択されるタンパク質を細胞質や核を含む細胞内に送達できる。
Ａ）１：２００のＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰが最も効率よくＩｇＧがサイトゾルへ送達されたことを示す図である。Ｂ）１：２００のＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰについて経時的な変化を観察したところ、添加後６時間でＩｇＧがサイトゾルに送達されていたことを示す図である。 Ａ）ＨｅＬａ細胞にｈＩｇＧ―ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰを１μＭとなるように血清培地に添加したときのＩｇＧの細胞内局在を示す図である。Ｂ）サイトゾルのＩｇＧ－ＡＦ４８８のシグナルとａｎｔｉ－ｈＩｇＧｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙのシグナルが共局在したことから、サイトゾルに存在するＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８のシグナルは、ＩｇＧ分子が送達されたことによるものであることを示す図である。 Ａ）ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８の細胞内局在を観察すると、ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰでは、サイトゾルで観察される蛍光シグナルが、ＩｇＧ－ＬＮＰと比較して明らかに高いことを示す図である。Ｂ）それぞれのＬＮＰ　によって細胞内に移行した抗体量をフローサイトメトリーにて定量すると、ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ―ＬＮＰの方がＩｇＧ－ＬＮＰと比較して２倍程度細胞内取り込み量が増加したことを示す図である。 ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰを添加した細胞では、ＩｇＧ－ＬＮＰと比較して５倍以上の発光を示す図である。 Ａ）ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰによってａｎｔｉ－ＧＦＰ－ＩｇＧ－ＡＦ５９４サイトゾルに送達したところ、細胞内で発現したＨＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）とＧＦＰとの融合タンパク質のＧＦＰとＡＦ５９４の蛍光が共局在したことから、蛍光標識抗体を抗原認識能を保ったままサイトゾルに送達できたことを示す図である。Ｂ）ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰによってａｎｔｉ－ＧＦＰ－ＩｇＧをサイトゾルに送達し、細胞を固定化、膜透過処理して、Ａｌｅｘａ５９４標識されたａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙで染色したところ、細胞内で発現したＨＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）とＧＦＰとの融合タンパク質のＧＦＰの蛍光とＡｌｅｘａ５９４の蛍光が共局在したことから、蛍光標識されていない抗体が抗原認識能を保ったままサイトゾルに送達されたことを示す図である。 Ａ）ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰによってａｎｔｉ－ＮＰＣ－ＩｇＧをサイトゾルに送達し、Ａｌｅｘａ５９４標識されたａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙで免疫染色したところ、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色された核周辺にＡＦ５９４の蛍光が集積し、核膜孔複合体を認識したことを示す図である。Ｂ）ラインプロットによって、ＡＦ５９４の蛍光シグナルが核を標識するＨｏｅｃｈｓｔの蛍光シグナルの辺縁に集積していることを確認した図である。Ｃ）ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰによっておよそ２０％の細胞においてサイトゾル送達されたことを示した図である。 Ａ）ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰによってａｎｔｉ－ｐＡｋｔ１－ＩｇＧを送達したＨｅＬａ細胞では、コントロール抗体であるｈＩｇＧを送達したＨｅＬａ細胞と比較して、Ｃａｓｐａｓｅ活性が向上しており、有意にアポトーシスを誘導できることを示す図である。Ｂ）ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰによってａｎｔｉ－ｐＡｋｔ１－ＩｇＧを送達したＨｅＬａ細胞では、コントロール抗体であるｈＩｇＧを送達したＨｅＬａ細胞と比較して、有意な細胞増殖阻害効果を発揮したことを示す図である。 ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰによってｈＩｇＧ－ＡＦ４８８をＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＳＷ４８０細胞においてサイトゾルに送達できたことを示す図である。 ｔ－ＢｕＯＨ脂質溶液で調製したＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰも９０％　ｔ－ＢｕＯＨ脂質溶液で調製したＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰも同様に抗体をサイトゾルに送達可能であったことを示す図である。 脂質ナノ粒子の粒径のピークトップが約１００ｎｍであることを示す図である。 ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ法）により決定されたＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰの粒子径測定の結果を示す図である。 実施例１３において免疫染色された各細胞の図である。 実施例１３において免疫染色された各細胞の図である。 実施例１３においてｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰの各粒子径を示す図である。 実施例１３においてｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰの各抗体内封率を示す図である。 実施例１４においてｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰの各値を示す図である。 実施例１４において免疫染色された各細胞の図である。 実施例１５において液滴の形成を示す図である。 実施例１６において免疫染色された各細胞の図である。
　本開示に用いられる組成物は、タンパク質、ポリマー、脂質からなる組成物あって、ポリマーはあるｐＨにおいてタンパク質と反対の電荷を持つことを特徴とする組成物である。換言すれば、タンパク質、ポリマー、脂質からなる組成物であって、所定のｐＨにおいてタンパク質とポリマーとが反対の電荷を持つことを特徴とする組成物である。なお、本開示に用いられる組成物を規定するときに使用され得る数値範囲は、その範囲内のすべての数値について略記されたものである。たとえば、１～５０の数値範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０が含まれる。
（タンパク質）
　本開示に使用されるタンパク質は、抗体及び抗体フラグメントから選択されるタンパク質である。抗体は、抗原に特異的に結合する分子であるタンパク質である免疫グロブリン（Ｉｇ）で構成され、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの種類がある。抗体フラグメントは、抗体の一部の断片である。抗体や抗体フラグメントの等電点は、一般にｐＨ７．５～９．５程度である。
　タンパク質が抗体または抗体フラグメントであると、これらのタンパク質を製剤または診断剤としてヒトに適用する際に、本開示の医薬組成物を用いれば、より安定に運搬、保存が可能であり、しかも用時にヒトに投与することが容易であり有用性が高い。タンパク質は糖鎖を有していてもよい。
　高純度であるとは医療用タンパク質であれば、医薬品レベル、ヒトの医薬品として使用可能なレベルであり、その他のタンパク質では試薬級の高純度、例えば不純物の総量で０．１質量％以下という閾値が挙げられる。
　本開示で使用される抗体又は抗体フラグメントが特異的に結合する抗原は、細胞質や核を含む細胞内に存在するポリペプチド及びペプチド、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はｔＲＮＡ等を含むＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）等を含む遺伝子、カルジオリピン等のリン脂質を含む脂質、若しくは上記のポリペプチド、ペプチド、遺伝子、又は脂質に結合した糖鎖等が非限定な一形態として好適に挙げられる。具体的な抗体の作製方法は当業者によく知られており、例えばモノクローナル抗体の場合、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５））、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。また、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１））。また、単一のB細胞クローンから単離してもよい（Ｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（５）：２５３－４５７（２０１１）)。
　免疫原性を低下するためのキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体の作製方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｖｏｌｕｍｅ　２７，１（２０２０）、生体内で所望の性質や動態を付与するための抗体の改変方法、抗体フラグメントの作製方法、及びＰａｙｌｏａｄ等の毒性物質を抗体に連結する方法（Ｃｅｌｌ，１８５，１５，２７８９－２８０５（２０２２）は公知であり、この公知の方法で改変された抗体及び抗体フラグメントも本開示で適宜使用され得る。
　受容体依存性のエンドサイトーシスおよびコール酸によるエンドソーム脱出、または、リポソーム介在性エンドサイトーシスおよび光感受性ベンゾポルフィリンによるエンドソーム脱出によって細胞質内に送達された抗体がその配列中に挿入された核移行シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｉｇｎａｌ）により核内に移行されることが示されている（Ｍｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　２０１６，　１３，　１９１５－１９２６およびＭｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　２０１５，　１２，　９，　３２７２-３２８１）。本開示において、こうした核移行シグナルを抗体に付与することで、細胞質内に送達された本開示に係る抗体を核内に移行させることが可能となる。
（ポリマー）
　発明に用いられるポリマーは、細胞内に送達すべきタンパク質と使用の条件においてタンパク質の電荷を打ち消す電荷のポリマーが用いられる。使用の条件とは、製造時、血液中、細胞内の条件のいずれかにおいて決定される。送達すべきタンパク質の等電点電気泳動の結果などを参考に、酸性または塩基性のポリマー（アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー）を用いることができる。電荷を持つと考えられるポリマーとしては、カルボキシル基やアミノ基を持つポリマーが考えられる。そのようなポリマーとしては、ポリアミノ酸やポリエステル、グリコサミノグリカン、ポリアミドなどを挙げることができる。本開示に使用されるポリマーは、細胞内に送達すべきタンパク質の測定条件において、反対の電荷を持つものが選択される。たとえば所定のｐＨにおいてポリマーとタンパク質が反対の電荷をもつ組合せが選択される。所定のｐＨにおいてポリマーとタンパク質が反対の電荷をもつかどうかは、ポリマーとタンパク質のｐＩ値を測定することで確認することが可能である。水中のポリマー溶液のゼータ電位の測定やタンパク質の等電点電気泳動を用いた測定等、公知の方法を用いてポリマーやタンパク質のｐＩ値を決定することが可能である。
　本開示に使用されるタンパク質については、特許文献１や特開２０２２－１２２８７１号を参照することができる。
　本開示に使用されるポリアミノ酸は、細胞内に送達すべきタンパク質の測定条件において、反対の電荷を持つものが選択される。ポリマーがタンパク質と会合するには、ポリマーの等電点は、上述したタンパク質の等電点と異なるものであり、タンパク質の等電点よりも高いものか、低いものである必要がある。例えば、タンパク質の例である抗体や抗体フラグメントの等電点は上述したようにｐＨ７．５～９．５であるため、ポリマーの等電点はこの範囲以外、例えばｐＨ７．０以下や１０．０以上であることが好ましい。
　具体的には、ポリマーとして、カチオン性あるいはアニオン性ポリアミノ酸またはその塩を挙げることができる。アニオン性ポリアミノ酸として、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸のナトリウム塩等、カチオン性ポリアミノ酸として、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリシトルリン等の水溶性塩（たとえば塩酸塩）等が挙げられる。本開示において、より好ましい形態のポリアミノ酸の形態は、アニオン性ポリアミノ酸として、ポリ－Ｌ－グルタミン酸ナトリウム塩、ポリ－Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム塩、カチオン性ポリアミノ酸として、ポリ－Ｌ－アルギニン塩酸塩、ポリ－Ｌ－リジン塩酸塩、ポリ－Ｌ－アルギニン臭化水素酸塩、ポリ－Ｌ－リジン臭化水素酸塩が例示できる。ポリアミノ酸はホモ重合体もしくは共重合体、またはその混合物である。ポリアミノ酸は主鎖と側鎖のカルボキシル基またはアミノ基との間にＣＨ２基が存在するのが好ましい。重合度は２０～３０００の範囲から適宜選択することが可能である。例えば、２０～３０００、２０～２５００、２０～２０００、２０～１５００、２０～１０００、２０～５００、２０～４００、２０～３００、２０～２００の重合度の範囲から適宜選択することが可能である。別の非限定の一形態では、４０～３０００、４０～２５００、４０～２０００、４０～１５００、４０～１０００、４０～５００、４０～４００、４０～３００、４０～２００の重合度の範囲から適宜選択することが可能である。別の非限定の一形態では、６０～３０００、６０～２５００、６０～２０００、６０～１５００、６０～１０００、６０～５００、６０～４００、６０～３００、６０～２００の重合度の範囲から適宜選択することが可能である。別の非限定の一形態では、８０～３０００、８０～２５００、８０～２０００、８０～１５００、８０～１０００、８０～５００、８０～４００、８０～３００、８０～２００の重合度の範囲から適宜選択することが可能である。別の非限定の一形態では、１００～３０００、１００～２５００、１００～２０００、１００～１５００、１００～１０００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００の重合度の範囲から適宜選択することが可能である。例えばポリグルタミン酸の場合、３０００（重合度２０）～６００００（重合度４０８）の分子量を有する重合度を含むポリグルタミン酸が、別の非限定の一形態では、３０００（重合度２０）～５００００（重合度３４０）、３０００（重合度２０）～４００００（重合度２７２）、３０００（重合度２０）～２００００（重合度１３６）、３０００（重合度２０）～１５０００（重合度１０２）、３０００（重合度２０）～１００００（重合度６８）、４０００（重合度２７）～５００００（重合度３４０）、４０００（重合度２７）～４００００（重合度２７２）、４０００（重合度２７）～３００００（重合度１３６）、４０００（重合度２７）～２００００（重合度１３６）、４０００（重合度２７）～１５０００（重合度１０２）、４０００（重合度２７）～１００００（重合度６８）、５０００（重合度３４）～５００００（重合度３４０）、５０００（重合度３４）～４００００（重合度２７２）、５０００（重合度３４）～３００００、５０００（重合度３４）～２００００（重合度１３６）、５０００（重合度３４）～１５０００（重合度１０２）、５０００（重合度３４）～１００００（重合度６８）、６０００（重合度４０）～５００００（重合度３４０）、６０００（重合度４０）～４００００（重合度２７２）、６０００（重合度４０）～３００００、６０００（重合度４０）～２００００（重合度１３６）、６０００（重合度４０）～１５０００（重合度１０２）、６０００（重合度４０）～１００００（重合度６８）、７０００（重合度４８）～５００００（重合度３４０）、７０００（重合度４８）～４００００（重合度２７２）、７０００（重合度４８）～２００００（重合度１３６）、７０００（重合度４８）～１５０００（重合度１０２）、７０００（重合度４８）～１００００（重合度６８）、８０００（重合度５４）～５００００（重合度３４０）、８０００（重合度５４）～４００００（重合度２７２）、８０００（重合度５４）～２００００（重合度１３６）、８０００（重合度５４）～１５０００（重合度１０２）、８０００（重合度５４）～１００００（重合度６８）、から選択されるいずれか一以上の分子量を有する重合度を含むポリグルタミン酸が好適に使用され得る。
　たとえば、ヒト免疫グロブリンを含む抗体やその抗体フラグメントは、通常塩基性であり、血漿のｐＨ７．４では正に帯電していることから、アニオン性のポリマーを用いることができる。そのようなポリマーとしては、ポリアミノ酸としては、ポリグルタミン酸やポリアスパラギン酸が好適に使用できる。また、アニオン性ポリマーとして、ヒアルロン酸やヘパリン等のグリコサミノグリカンも好適に使用できる。また、酸性である抗体および抗体フラグメントも、治療用抗体として薬事承認されている例がある（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｂ，Ｖｏｌｕｍｅｓ　１０６５－１０６６，２０１７，Ｐａｇｅｓ　１１９－１２８）。血漿のｐＨ７．４では負に帯電しているこのような抗体やその抗体フラグメントを含む本開示の組成物には、カチオン性のポリマーを使用することが可能である。そのようなポリマーとしては、ポリアミノ酸としては、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリオルニチンが好ましい。
　ポリマーの選択にあたっては、送達するタンパク質のｐＫａ、ｐＩや大きさ、形状なども考慮の上、選択するポリマーのｐＫａ、ｐＩや分子量、形状などを勘案して選択することができる。
　適切なポリマーを選択すると、脂質ナノ粒子の粒径を小さくすることができる。
　本開示に使用されるポリアミノ酸については、特許文献１を参照することができる。
（液滴）
　本開示においては、抗体または抗体フラグメント等を含むタンパク質が、反対電荷を有するポリマーと静電結合を伴って安定的に会合し液滴を形成している。特定の理論に拘束されるものではないが、抗体または抗体フラグメント等を含むタンパク質とポリマーとの会合の形態は、タンパク質が反対電荷を有するポリマーと静電的に結合している形態や、タンパク質が反対電荷を有するポリマーと静電的に結合しポリマー内に安定的に包接される形態が一例として想定され得る。タンパク質の高密度形態の一つとして知られている、タンパク質と高分子電解質の複合体（ＰＰＣ；Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）（Ｍａｓｈｉｒｏ　Ｍｉｍｕｒａ　ｅｔ．　ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１５０，０６４９０３（２０１９））も本開示の液滴の非限定の一形態として挙げられ、本開示の液滴の形成は、微分干渉コントラスト（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　Ｃｏｎｔｒａｓｔ）を利用した顕微鏡下での観察により適宜確認することが可能である。また、形成した液滴の直径は、透過型電子顕微鏡での検鏡下での接眼マイクロメーターを用いて概数値を求めるほか、動的光散乱法を用いた粒度分布計や散乱光とブラウン運動の両方の特性を利用したナノ粒子トラッキング解析計等を用いて測定することができる。本開示の液滴の粒子径は、ナノ粒子トラッキング解析により決定される。製造条件の調整により本開示の液滴は、１００ｎｍ～１０μｍ、２００ｎｍ～２μｍまたは３００ｎｍ～１μｍの範囲でも製造される。
　ポリマーとタンパク質の比率（質量比）は、適宜設定することができる。例えば、１：１００～１：１０の範囲内、さらには１：１０～１：１の範囲内とすることができる。混合時の温度も適宜設定することができ、例えば１５～４０℃、更にはまたは２０℃から３０℃の範囲内とすることができる。混合の際のｐHは、タンパク質とポリマーが静電相互作用しうるｐＨであればよく、例えばタンパク質の等電点とポリマーの等電点の間のｐＨであることが好ましい。形成された液滴は、遠心分離、ろ過、または深層濾過等の工程を用いて分離され（例えば、特許第５３６１７３８号等）、適切なタンパク質の濃度の水溶液として再構成された液滴を次の内封工程に供与することが可能となる。
（脂質）
　本開示に用いられる脂質としては、水中でミセルを形成することが可能な少なくとも一種類以上の脂質が混合物（以下、脂質混合物ともいう）として用いられる。親水性と疎水性部分の両方を合わせ持ついわゆる両親媒性脂質を用いることができる。そのような脂質としては公知のものが使用できるが、そのような脂質としては、生体膜の構成成分としても知られているリン脂質であるホルファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホルファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン等を挙げることができる。さらに、ＤＭＧ―ＰＥＧ５ｋ等のＰＥＧ脂質等、界面活性剤として利用されている、両極性脂質の３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、アニオン性脂質のコール酸ナトリウム塩、非イオン性脂質のオクチルグリコシド等も適宜利用され得る。さらに、たとえば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）等の中性リン脂質や、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－メトキシ－ポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＰＥｍＰＥＧ２０００）等のＰＥＧ脂質を用いても良い。これらの脂質は、ポリエチレングリコール、タンパク質、ペプチド、糖が連結された複合体であっても良い。
　本開示の非限定の実施形態では、カチオン性脂質は、本開示の脂質ナノ粒子中に存在する（ＰＥＧ脂質を除いた）脂質混合物の２０ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、又は３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、又は５０ｍｏｌ％（又はその任意の割合若しくはその範囲）を含み得る。
　本開示の脂質ナノ粒子が脂質混合物としてリン脂質を含む本開示の非限定の実施形態では、脂質ナノ粒子中に存在する（ＰＥＧ脂質を除いた）脂質混合物中のリン脂質は、本開示の脂質ナノ粒子中に存在する（ＰＥＧ脂質を除いた）脂質混合物の２ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％～１２ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％～８ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％～１２ｍｏｌ％、又は４ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％～８ｍｏｌ％（又はその任意の割合若しくはその範囲）を含み得る。別の非限定の本開示の実施形態では、（ＰＥＧ脂質を除いた）脂質混合物中のリン脂質は、粒子中に存在する（ＰＥＧ脂質を除いた）脂質混合物中の８ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％～１２ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、又は５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、又は１２ｍｏｌ％（又はその任意の割合若しくはその範囲）を含む。
　脂質ナノ粒子が脂質混合物としてコレステロール又はコレステロール誘導体を含む本開示の他の非限定の実施形態では、（ＰＥＧ脂質を除いた）脂質混合物中のコレステロール又はコレステロール誘導体は、本開示の脂質ナノ粒子中に存在する（ＰＥＧ脂質を除いた）脂質混合物の２０ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、又は３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、４６ｍｏｌ％、４７ｍｏｌ％、４８ｍｏｌ％、４９ｍｏｌ％、又は５０ｍｏｌ％（又はその任意の割合若しくはその範囲）を含み得る。
　他の非限定の本開示の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、本開示の脂質ナノ粒子中に存在する（ＰＥＧ脂質を除いた）脂質混合物に対して０．５ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％～８ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、１．０ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％、１．０ｍｏｌ％～８ｍｏｌ％、１．０ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％～８ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、２．０ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％、２．０ｍｏｌ％～８ｍｏｌ％、２．０ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、０．５ｍｏｌ％、１．０ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％（又はその任意の割合若しくはその範囲）を含む。本開示の脂質ナノ粒子中に存在するＰＥＧ脂質の割合は、製造の際の標的量であり、製剤中に存在するＰＥＧ脂質の実際の含有量は、例えば、±０．５ｍｏｌ％変化し得る。
　カチオン性脂質を含有する組成は、２０ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％のカチオン性脂質、２０ｍｏｌ％～６０ｍｏｌ％のコレステロール、及び２ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％のリン脂質に対して０．５ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質であり得る。別の非限定の本開示の実施形態では、カチオン性脂質を含有する組成は、４０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、４０ｍｏｌ％～５５ｍｏｌ％のコレステロール、及び８ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％のリン脂質に対して１．０ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質である。
　本開示においては、カチオン性脂質として、細胞送達後にエンドソームからの脱出効率を上げるために、細胞内環境応答性脂質も好適に使用される。細胞内環境応答性脂質は、細胞内の還元条件やｐHなどの環境因子に応答して分解する、またはその構造が変化する脂質である。細胞内環境応答性脂質としては、イオン化可能特性（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ）、還元条件応答特性（ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ）、自己分解性特性（ｓｅｌｆ―ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ）から選択される一以上の特性を有する細胞内環境応答性脂質が適宜使用され得る。
　イオン化可能特性を有する脂質は、細胞外では電荷を有しない一方で、エンドサイトーシスを介して細胞内に取り込まれた後にエンドソーム内の酸性条件下において正に帯電して負電荷を有するエンドソーム膜と融合することが可能である。そのようなイオン化可能特性を有する脂質の非限定の例としては、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とコレステロールヘミコハク酸（ＣＨＥＭＳ）との組合せや、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）とフォスファチジルセリン（ＰＳ）との組合せ等が適宜使用される。また、両親媒性脂質の親水性部分に三級アミンを有する、１，２－ジリノレイル－ＭＣ３－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）もそのようなイオン化可能特性を有する脂質の非限定の例として挙げられる。
　還元条件応答特性を有する脂質は、細胞外では電荷を有しない一方で、エンドサイトーシスを介して細胞内に取り込まれた後にエンドソーム内の酸性条件下において正に帯電して負電荷を有するエンドソーム膜と融合することが可能である。そのようなイオン化可能特性を有する脂質の非限定の例としては、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とコレステロールヘミコハク酸（ＣＨＥＭＳ）との組合せや、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）とフォスファチジルセリン（ＰＳ）との組合せ等が適宜使用される。また、両親媒性脂質の親水性部分に三級アミンを有する、１，２－ジリノレイル－ＭＣ３－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）もそのようなイオン化可能特性を有する脂質の非限定の例として挙げられる。
　イオン化可能特性および還元条件応答特性に加えて自己分解性特性を有する脂質の非限定の一形態として、ＷＯ２０１９－１８８８６７に挙げられている脂質、例えば、以下の式（１）で挙げられた脂質を用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
（式（１）中、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはそれぞれ独立して、炭素数１～６のアルキレン基を表し、
Ｘａ及びＸｂはそれぞれ独立して、炭素数が１～６であり、かつ３級アミノ基の数が１の非環状のアルキル３級アミノ基、又は炭素数が２～５であり、かつ３級アミノ基の数が１～２の環状のアルキレン３級アミノ基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはそれぞれ独立して、炭素数８以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはそれぞれ独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又はウレア結合を表し、
Ｚａ及びＺｂはそれぞれ独立して、炭素数が３～１６であり、少なくとも１つの芳香環を有し、かつヘテロ原子を有していてもよい芳香族化合物から誘導される２価の基を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂはそれぞれ独立して、水酸基を有する脂溶性ビタミンとコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は水酸基を有するステロール誘導体とコハク酸無水物又はグルタル酸無水物との反応物由来の残基、又は炭素数１２～２２の脂肪族炭化水素基を表す。）
　より具体的には、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ３Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ１、Ｏ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－ＢｎＰ４Ｃ２、Ｅ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｌ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、ＨＤ－Ｐｈ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－ａｍｉｄｅ－Ｐ４Ｃ２、Ｏ－Ｐｈ－Ｃ３Ｍを挙げることができる。これらの脂質は、ｐＨや酸化還元活性などにより応答し、エンドソーム脱出効率を上げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
　脂質としては、後述する実施例に記載されている化合物、すなわち、イオン化可能特性、還元条件応答特性、及び自己分解性特性を有する脂質としてビス［［４－［２－［［４－（オレオイルオキシ）フェニル］アセトキシ］エチル］ピペリジノ］エチル］ジスルファン（ＳＳ－ＯＰ）、中性リン脂質として１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ－ＰＥＧ５ｋ、コレステロールとしてβ―シトステロールから選択される一つ以上の脂質などが好適に使用され得る。
　本開示の脂質ナノ粒子における抗体の含有量（タンパク質負荷率）は、５～９５ｍｏｌ％、は１０～９０ｍｏｌ％、３０～８０ｍｏｌ％の範囲の中から適宜調製可能である。本開示の脂質混合物は、本開示のカチオン性脂質及びその他の構成成分（脂質等）を適当な溶媒または分散媒、例えば、水性溶媒やアルコール性溶媒中に分散させ、必要に応じて組織化を誘導する操作を行うことにより調製することができる。
（他の添加剤）
　本開示の脂質ナノ粒子を製造するにあたり、１つまたは２つ以上の両親媒性の物質を用いられる。両親媒性物質は、脂質ナノ粒子の安定性や、均一性などを考慮して選択される。本開示に用いられる両親媒性の例としては、ホスホグリセリド；ホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；ジオレイルオキシプロピルトリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；ジオレオイルホスファチジルコリン；コレステロール；コレステロールエステル；ジアシルグリセロール；ジアシルグリセロールスクシネート；ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）；ヘキサンデカノール；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの脂肪族アルコール；ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル；パルミチン酸またはオレイン酸などの表面活性脂肪酸；脂肪酸；脂肪酸モノグリセリド；脂肪酸ジグリセリド；脂肪酸アミド；ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８５）グリココレート；ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ（登録商標）２０）；ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）；ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）；ポリソルベート６５（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５）；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）；ポリソルベート８５（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５）；ポリオキシエチレンモノステアレート；サーファクチン；ポロキソマー（ｐｏｌｏｘｏｍｅｒ）；ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステル；レシチン；リゾレシチン；ホスファチジルセリン；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリン；ホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）；カルジオリピン；ホスファチジン酸；セレブロシド；ジセチルホスフェート；ジパルミトイルホスファチジルグリセロール；ステアリルアミン；ドデシルアミン；ヘキサデシルアミン；アセチルパルミテート；グリセロールリシノレエート；ヘキサデシルステアレート；イソプロピルミリステート；チロキサポール；ポリ（エチレングリコール）５０００－ホスファチジルエタノールアミン；ポリ（エチレングリコール）４００－モノステアレート；リン脂質；高い界面活性物質活性を有する合成および／または天然洗剤；デオキシコレート；シクロデキストリン；カオトロピック塩；イオンペア剤；および、これらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の添加剤として、脂質ナノ粒子の膜の安定性のために寄与する物質を加えることができる。そのような物質としては、コレステロール、フィトステロール、スティグマステロール、β－シトステロールを挙げることができる。
（脂質ナノ粒子）
　脂質ナノ粒子は、後述する製造方法にて製造することができる。脂質ナノ粒子は、抗体または抗体フラグメント等を含むタンパク質とポリマーとが会合して形成された液滴が、脂質内に内封された構造を有している。また、抗体または抗体フラグメント等を含むタンパク質が反対電荷を有するポリマーと静電結合を伴って安定的に会合し液滴を形成している。抗体または抗体フラグメント等を含むタンパク質とポリマーとの会合の形態は、特定の理論に拘束されるものではないが、タンパク質が反対電荷を有するポリマーと静電的に結合している形態や、タンパク質が反対電荷を有するポリマーと静電的に結合しポリマー内に安定的に包接される形態が一例として想定され得る。脂質ナノ粒子の粒径は、動的光散乱法を用いた粒度分布計や散乱光とブラウン運動の両方の特性を利用したナノ粒子トラッキング解析計等を用いて測定することができる。本開示における脂質ナノ粒子の粒子径は、ナノ粒子トラッキング解析により決定され、１０～６００ｎｍの範囲で製造される。製造条件の調整により５０～５００ｎｍ、７０～４００ｎｍでの範囲でも製造され得る。ナノ粒子トラッキング解析で決定される、平均粒径分布は３００ｎｍ以下である。そのピークトップは１５０ｎｍ以下で製造され、製造条件の調整により１２０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下でも製造され得る。粒径が１００ｎｍを下回るとエンドサイトーシスされやすいと言われている。さらに、腫瘍細胞などでは、１００ｎｍを下回るとＥｎｈａｎｃｅｄ　Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ効果を通じてがん組織周辺に滞留し選択性が上がると言われている。
　本開示の脂質ナノ粒子における抗体の含有量（タンパク質負荷率）は、０．１～１０．０ｍｏｌ％、０．２～１０．０ｍｏｌ％、０．３～１０．０ｍｏｌ％、０．４～１０．０ｍｏｌ％、０．５～１０．０ｍｏｌ％、０．１～５．０ｍｏｌ％、０．２～５．０ｍｏｌ％、０．３～５．０ｍｏｌ％、０．４～５．０ｍｏｌ％、０．５～５．０ｍｏｌ％、０．１～２．０ｍｏｌ％、０．２～２．０ｍｏｌ％、０．３～２．０ｍｏｌ％、０．４～２．０ｍｏｌ％、０．５～２．０ｍｏｌ％、の範囲の中から適宜調製可能である。
（医薬組成物）
　本開示の脂質ナノ粒子を医薬組成物として製剤化するために、脂質ナノ粒子を、様々な薬学的に許容される添加剤、並びに活性剤（複数可）の分散のための基剤又は担体と組み合わせることが可能である。添加剤の例としては、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸、及びこれらの混合物などのｐＨ調整剤が挙げられる。他の添加剤としては、局所麻酔剤（例えば、ベンジルアルコール）、等張剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ　８０）、溶解度増強剤（例えば、シクロデキストリン及びその誘導体）、安定剤（例えば、血清アルブミン）、及び還元剤（例えば、グルタチオン）が挙げられる。本開示の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、活性剤及び任意の所望の添加剤を分散させる能力を有する親水性化合物を含み得る、基剤又はビヒクル中に分散され得る。基剤は、ポリカルボン酸又はその塩のコポリマー、カルボン酸無水物（例えば、無水マレイン酸）と他のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸など）とのコポリマー、親水性ビニルポリマー、例えば、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等、並びに天然ポリマー、例えば、キトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、及びこれらの非毒性金属塩等を含むが、これらに限定されない広範な好適な担体から選択され得る。多くの場合、生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸－グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸－グリコール酸）コポリマー、及びこれらの混合物は、基剤又は担体として選択される。基剤又は担体に代えて、若しくは基剤又は担体に加えて、ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル等の合成脂肪酸エステルを担体として用いることもできる。親水性ポリマー及び他の担体は、単独で又は組み合わせて使用することができ、部分的な結晶化、イオン結合、架橋等によって、増強された構造的一体性を担体に付与することができる。担体は、流体又は粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、微小球、及び鼻粘膜に直接適用するためのフィルムを含む様々な形態で提供され得る。この文脈における選択された担体の使用は、生物学的活性剤の吸収促進をもたらし得る。
　本開示の医薬組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、張度調整剤、及び湿潤剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、及びこれらの混合物等の、生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される物質を担体として含有することも可能である。固体組成物の場合、例えば、医薬基準のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む従来の非毒性の薬学的に許容される担体が利用可能である。
（製造方法）
　脂質ナノ粒子は、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１５０，０６４９０３（２０１９）などを参考にして公知の方法をもとに製造できる。
　具体的には、まず抗体または抗体フラグメント等を含むタンパク質とポリマーとを適切な比率で混合して液滴を形成させる（液滴形成工程）。抗体または抗体フラグメント等を含むタンパク質とポリマーとの会合の形態は、特定の理論に拘束されるものではないが、タンパク質が反対電荷を有するポリマーと静電的に結合している形態や、タンパク質が反対電荷を有するポリマーと静電的に結合しポリマー内に静電的に結合し安定的に包接される形態等が、一例として想定され得る。混合は、液体混合機やピペッティングで混合する、混合容器中においてスターラーまたは攪拌翼で撹拌する、高速型衝突噴流（ｃｏｎｆｉｎｅｄ　ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ　ｊｅｔｓ）ミキサーやマルチインレットボルテックスミキサーを用いて混合する、マイクロ流体デバイスの流路（すなわち、マイクロ流路）上で接触させるなどの操作で行うことができる。ポリマーとタンパク質の比率（質量比）は、適宜設定することができるが、例えば、１００：１～１０：１の範囲内、さらには１０：１～１：１の範囲内とすることができる。混合時の温度も適宜設定することができ、例えば１５～４０℃、または２０℃から３０℃の範囲内とすることができる。混合の際のｐHは、タンパク質とポリマーが静電相互作用しうるｐＨであればよく、例えばタンパク質の等電点とポリマーの等電点の間のｐＨであることが好ましい。形成された液滴は、遠心分離、ろ過、または深層濾過等の工程を用いて分離され（例えば、特許５３６１７３８等）、適切なタンパク質の濃度の水溶液として再構成された液滴を次の内封工程に供与することが可能となる。
　次に、この液滴と脂質を混合して脂質内に液滴を内封させることで（内封工程）、脂質ナノ粒子が製造される。この混合も、液体混合機やピペッティングで混合する、混合容器中においてスターラーまたは攪拌翼で撹拌する、高速型衝突噴流（ｃｏｎｆｉｎｅｄ　ｉｍｐｉｎｇｉｎｇ　ｊｅｔｓ）ミキサーやマルチインレットボルテックスミキサーを用いて混合する、などの操作で行うことができる。また、マイクロ流体デバイスの流路上で接触させるなどの操作や、アルコール希釈(沈殿) 法、水和法、乳化法等のほかの工業生産の手法も確立されている。脂質と液滴の比率（質量比）は、適宜設定することができるが、例えば、１：１００～１０：１の範囲内、さらには１：１０～１：１の範囲内とすることができる。混合時の温度も適宜設定することができ、例えば１５～４０℃、更には２０℃から３０℃の範囲内とすることができる。混合の際のｐHは、例えば５～９の範囲内、更にhが６～８の範囲内とすることができる。なお、脂質ナノ粒子を製造するときに脂質を溶解する溶媒としては、エタノール、ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノールなどアルコール、エチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコールなどを用いることができるが、粒子の形成性、細胞への送達性や毒性などを総合的に考慮して選択されるべきである。
（効果）
　生成したナノ粒子は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏでの評価がなされる。本明細書では、本開示のナノ粒子とすることで、サイトゾルや核等を含む細胞内への局在が観察された。
　以下、実施例及び比較例に基づいて本開示をより具体的に説明するが、本開示は以下の実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パ－セント）である。
［材料および方法］
（試薬）
　ｐＨ応答性脂質であるｓｓ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ　ａｎｄ　ｐＨ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ　ｍａｔｅｒｉａｌ（ｓｓＰａｌｍ）Ｏ－Ｐｈｅ（ＳＳ－ＯＰ　、　ＮＯＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＯＰＥ、ＮＯＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、β－ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｒａｃ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｍｅｔｈｙｌｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　ｃｈａｉｎ，　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　５０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ５ｋ、ＮＯＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は１０ｍＭの濃度でクロロホルム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に溶解し使用するまで－３０度の冷凍庫にて保存した。
　ＩｇＧは、正常ヒトＩｇＧ，全分子，精製品（富士フイルム和光純薬製）を用いた。本明細書においては、ＩｇＧ、またはｈＩｇＧと表記する。
　ポリグルタミン酸は、以下のサイズのものを用いた（ｍｏｌ　ｗｔ３，０００－１５，０００，ｓｉｇｍａ）。
（粒径の測定）
　粒径は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を使って粒子直径、ＰｄＩ（粒径分布、ゼータ電位（ζ－電位）を評価した。回収したサンプルをＰＢＳに１００倍希釈して測定を実施した。
（内包率）
　内包率は、調製したＬＮＰを卓上超遠心機によって、４℃、２００００ｇにて３０分間遠心分離して、上清のタンパク質濃度を測定することで、タンパク質の内封率を算出した。すなわち、ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰをＰＢＳ（－）で抗体濃度が２μＭとなるように調整した（最終サンプル量１００μＬ）。これを４℃、２０，０００×ｇ、１時間遠心分離することでＬＮＰ画分を沈殿させた。上清５０μＬを回収し、Ｎａｎｏｄｒｏｐにて抗体濃度を測定し、内封率を以下の式から逆算した。ただし、ＣＩｇＧは２μＭ　ＩｇＧを遠心した上清から算出したＩｇＧ濃度、ＣＬＮＰはＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰを遠心した上清から算出したＩｇＧ濃度を指す。
ＩｇＧの内封率（％）＝（ＣＩｇＧ－ＣＬＮＰ）／ＣＩｇＧ×１００
（ＨｅＬａ細胞）
　ＡＴＣＣから入手したＨｅＬａ細胞を１０％牛血清（ＢＳ）含有α－ＭＥＭにて培養した。
（透析）
　透析膜には、２－１４ｋ　ＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を用いた。透析膜に充填した後に、Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｓｔｉｒｒｅｒにて攪拌して透析を実施した。
（ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８）
　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８修飾のため、１０ｍｇ／ｍＬ　ｈＩｇＧ（正常ヒトＩｇＧ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）１００μＬにＰＢＳ（－）３４５μＬを加え、そこに１Ｍ　ＮａＨＣＯ３　５０μＬを添加し溶液を塩基性にした後、１０ｍｇ／ｍＬ　Ａｌｅｘａ４８８－ＳＤＰ　ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、遮光下、２５℃で１時間転倒混和した。その後ＰＤ１０カラムにて抗体画分を分取し、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ｈＩｇＧ（ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８）を精製した。
（抗ＧＦＰ抗体）
　抗ＧＦＰ抗体の調製はＥｘｐｉ２９３ＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて行った。Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を３，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように準備し、１２５ｍＬ用三角フラスコに２５ｍＬ加えた。Ａｎｔｉ－ＧＦＰ－ＩｇＧをコードするプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ，　Ａｎｔｉ－ＧＦＰ［Ｎ８６／３８．１Ｒ］）を２５μｇ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、その推奨プロトコルに従いトランスフェクションした。トランスフェクション後の２０時間後に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　１を１５０μＬおよびＥｎｈａｎｃｅｒ　２を１．５ｍＬ加え五日間インキュベートした。培養液を５０ｍＬチューブに移し、３，２００×ｇ、４℃、２０分間遠心分離し、上清を回収した。抗体が含まれる上清を０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌した。さらにこの溶液をＨｉＴｒａｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｃｙｔｉｖａ）に吸着させ、精製用緩衝液（０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ＨＣｌ　ｐＨ＝２．７）によってカラムから溶出させた。ＩｇＧを含むフラクションを回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて透析を行ない、抗ＧＦＰ抗体（ａｎｔｉ－ＧＦＰ－ＩｇＧ）を得た。回収した抗ＧＦＰ抗体（ａｎｔｉ－ＧＦＰ－ＩｇＧ）は４℃条件で保存した。クエン酸溶液（ｐＨ５）の抗体を用いる場合は、マイクロバイオスピン（登録商標）　カラム３０（ＢＩＯＲＡＤ）を用いてクエン酸溶液（ｐＨ５）に置換した。
（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ）
　１０ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ５）に溶解したポリ－Ｌ－グルタミン酸（ｐｏｌｙＥ、ｍｏｌ　ｗｔ　３，０００－１５，０００）溶液を４０℃の条件で３０分間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（－）もしくはクエン酸溶液（ｐＨ５）に溶解されたＩｇＧ（抗体全て）と上記のｐｏｌｙＥをＩｇＧ：ｐｏｌｙＥ＝５：１（質量比）となるようにピペッティング１０回で混合した。その後、１２－１４ｋ　ＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）に充填して、１，０００倍以上の体積量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浮かしてスターラーで攪拌して透析を実施した。
（実施例１）
（ＬＮＰの製造）
　脂質をクロロホルムで溶解し、２０ｍＭ　ＳＳ－ＯＰ、１０ｍＭ　ＤＯＰＥ、２０ｍＭ　β－ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ、１０ｍＭ　ＤＭＧ－ＰＥＧ５ｋを調製した。ＳＳ－ＯＰ／ＤＯＰＥ／β－ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ／ＤＭＧ－ＰＥＧ５ｋ（モル比　４５／１０／４５／１．５）の組成物をフラスコ内で室温にて混合し、１ｍＬのｔ－ＢｕＯＨ（富士フィルム和光純薬　Ｆｕｊｉｆｉｌｍ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えて溶解させた後、ロータリーエバポレーターにてクロロホルムを蒸発させ脂質溶液を得た。さらに、この脂質溶液を１８から２４時間凍結乾燥させ、その後ｔ－ＢｕＯＨで溶解させることで１０ｍＭ脂質溶液を作製した。ｔ－ＢｕＯＨに溶解した脂質溶液と１０ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ５）に溶解したポリグルタミン酸溶液（０．７５ｍｇ／ｍＬポリグルタミン酸溶液（ｐｏｌｙＥ、ｍｏｌ　ｗｔ　３，０００－１５，０００）溶液を、別々に４０度の条件で３０分間インキュベートした。
　ｈＩｇＧとｐｏｌｙＥをｈＩｇＧ：ｐｏｌｙＥ＝５：１（質量比）となるようにピペッティング１０回で混合しｈＩｇＧ－ｐｏｌｙＥ液滴を形成した後、４０℃で３０分インキュベートした脂質溶液と液滴溶液を１：４（体積比）となるようにピペッティング１５回で混合した。その後、１，０００倍以上の体積量のＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）に対して１２－１４ｋ　ＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）で透析し、ｈＩｇＧを内包するＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）を調製した。
（比較例１）
（ＬＮＰの製造）
　ｐｏｌｙＥを含まずにｈＩｇＧのみを用いた以外は、製造例１と同様に行いＬＮＰ化したサンプル（ｈＩｇＧ－ＬＮＰ）を製造した。
（評価）
　実施例１で調製したｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ―ＬＮＰと、比較例１で調整したｈＩｇＧ－ＬＮＰをＺｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使って粒子直径、ＰｄＩ、ζ－電位を評価した。結果を、図１０ａ，図１０ｂおよび表１に示す。調製したＬＮＰを卓上超遠心機によって、４℃、２００００ｇにて３０分間遠心分離して、上清の抗体濃度を測定することで、抗体の内封率を算出した。結果を表１に示す。
（評価）
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
また、ＮＴＡ法での粒子径の測定に当たっては、ＰＢＳにて１００倍に希釈した上記ＬＮＰをＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＮＳ３００を用いて測定した。その結果、粒子径は１２３±２ｎｍであった。
（実施例２）
（ＬＮＰの製造）
　実施例１において、ｔＢｕＯＨの代わりに９０％ｔＢｕＯＨ水溶液を用いた以外は実施例１と同様な操作を行い、ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰを製造した。
（効果）
（実施例３）（ＨｅＬａ細胞への局在化）
（ＬＮＰの製造）
　抗体と脂質の混合比によりｈＩｇＧのサイトゾルへの送達活性が変化するかどうか検討するために、ＩｇＧの代わりにｈＩｇＧ－ＡＦ４８８を用いた以外は（実施例１）と同様な操作を行い、抗体：脂質比が（ａ）～（ｅ）の混合比のＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ（ａ）～（ｅ）を調整した。
　　　　　　　　　ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８：ｐｏｌｙＥ
　　　　　（ａ）　　　１：１００
　　　　　（ｂ）　　　１：２００
　　　　　（ｃ）　　　１：３００
　　　　　（ｄ）　　　１：４００
　　　　　（ｅ）　　　１：５００
　調整したｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰをＨｅＬａ細胞の血清培地に、ＩｇＧ濃度が１μＭとなるように添加して懸濁させ、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で１８時間インキュベーションし、ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８の細胞内局在を観察した。（ｂ）１：２００のＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰが最も効率よくｈＩｇＧをサイトゾルへ送達した（図１　Ａ））。また、（ｂ）１：２００のＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰについて経時的な変化を観察したところ、添加後６時間でｈＩｇＧがサイトゾルに送達されていたことが分かった。
（実施例４）
（各種ＬＮＰの製造）
（抗ＧＦＰ抗体＿ｐｏｌｙＥ―ＬＮＰ）
　実施例１で、ｈＩｇＧの代わりに抗ＧＦＰ抗体を用いた以外は同様の操作を行い、抗ＧＦＰ抗体＿ｐｏｌｙＥ―ＬＮＰを製造した。
（実施例５）
　ＨｅＬａ細胞に（ａ）ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８、（ｂ）ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ＰｏｌｙＥ、（ｃ）ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ＰｏｌｙＥ－ＬＮＰを１μＭとなるように血清培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１８時間インキュベーションし、ＩｇＧの細胞内局在を観察した（図２Ａ）。
　（ａ）ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８、（ｂ）ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥを添加した細胞では、点状のｈＩｇＧ－ＡＦ４８８由来のシグナルが観察されるだけで、サイトゾルに移行していないことが確認された。一方で、（ｃ）ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰサンプルを添加した細胞でＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰは、サイトゾル全体にシグナルが拡散している様子が確認された。
　観察されるシグナルが、ＩｇＧの送達によるものであることを確認するために、処理後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、Ａｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ　５９４標識された抗ｈＩｇＧ抗体（ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ－ＩｇＧ　ｌａｂｅｌｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｌｅｘａ　Ｆｕｌｏｒ　５９４）を用いて免疫染色を行い、ｈＩｇＧの細胞局在を観察した（図２Ｂ）。サイトゾルのＩｇＧ－ＡＦ４８８のシグナルとａｎｔｉ－ｈＩｇＧｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ａｎｔｉｂｏｄｙのシグナルが共局在したことから、サイトゾルに存在するＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８のシグナルは、ＩｇＧ分子が送達されたことによるものであると判明した。
（実施例６）
　ｐｏｌｙＥを添加することの有用性を示すために、ｐｏｌｙＥを含まないｈＩｇＧと脂質を混合し得られるＬＮＰ（ＩｇＧ－ＬＮＰ）（参考例１）を調製し、ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ（実施例１）との比較試験を実施した。細胞内局在を観察するために、ｈＩｇＧは、ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８を用いた。
　ＨｅＬａ細胞にｈＩｇＧ－ＬＮＰおよびｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰをＩｇＧ濃度にして１μＭとなるように血清培地に添加して懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２において１８時間インキュベーションを行った。ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８の細胞内局在を観察すると、ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰでは、サイトゾルで観察される蛍光シグナルが、ＩｇＧ－ＬＮＰと比較して明らかに高いことが確認された（図３Ａ）。それぞれのＬＮＰによって細胞内に移行した抗体量をフローサイトメトリーにて定量すると、ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ―ＬＮＰの方がｈＩｇＧ－ＬＮＰと比較して２倍程度細胞内取り込み量が増加した（図３Ｂ）。
（実施例７）
　ＬｇＢｉＴとＨｉＢｉＴは会合することでナノルシフェラーゼｎａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを再構成し、ルシフェリンＬｕｃｉｆｅｒｉｎを添加すると発光を呈する。この技術を利用してｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ（製造例１）とｈＩｇＧ－ＬＮＰ（製造例２）のサイトゾル移行量を比較した。
　ＬｇＢｉＴを恒常発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＬｇＢｉＴ）に対して、抗ＧＦＰ抗体（ａｎｔｉ－ＧＦＰ－ＩｇＧ）（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ａｎｔｉ－ＧＦＰ［Ｎ８６／３８．１Ｒ］、Ｐｌａｓｍｉｄ　＃１１４４９２）のＣ末端に遺伝子工学的にＨｉＢｉＴ配列を付与したｈＩｇＧ－ＨｉＢｉＴを内封するｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰまたはＩｇＧ－ＬＮＰをＩｇＧ濃度にして０．５μＭとなるように血清培地に懸濁し、１８時間投与した。インキュベート後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、トリプシン処理により細胞を回収後、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）　Ｌｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合して発光量を測定したところ、ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰを添加した細胞では、ＩｇＧ－ＬＮＰと比較して５倍以上の発光を示した（図４）。
（実施例８）
　次に、サイトゾルに存在するタンパク質を標的とするＩｇＧをＬＮＰにより送達することで、その分子を認識できるかどうか検討した。
　ＨＲａｓはＲａｓタンパク質ファミリーの一種で、細胞膜に局在するタンパク質であり、これにＧＦＰを融合したＨＲａｓ－ＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞を用いることでＧＦＰを細胞膜に局在させた。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４で標識したａｎｔｉ－ＧＦＰ－ＩｇＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ；　Ａｎｔｉ－ＧＦＰ［Ｎ８６／３８．１Ｒ］、Ｐｌａｓｍｉｄ　＃１１４４９２）（抗ＧＦＰ抗体－ＡＦ５９４）を作製し、ＬＮＰ化し、ＨＲａｓ－ＧＦＰ発現ＨｅＬａ細胞にＩｇＧ濃度にして１μＭとなるように血清培地に懸濁後、１８時間投与を行い、ＩｇＧの細胞内局在を観察した。ＨＲａｓ－ＧＦＰが存在する細胞膜付近においてＧＦＰとａｎｔｉ－ＧＦＰ－ＩｇＧ－ＡＦ５９４の蛍光シグナルの共局在が確認された（図５Ａ）。
　蛍光標識を施していない抗ＧＦＰ抗体のサイトゾルへの送達についても検討した。未蛍光標識抗ＧＦＰ抗体をＬＮＰ化し、ＨＲａｓ－ＧＦＰ発現ＨｅＬａ細胞にＩｇＧ濃度にして１μＭとなるように血清培地に懸濁し、１８時間インキュベーションした。その後、パラホルムアルデヒドで固定、およびＡｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ　５６８標識二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて免疫染色を行い、ＩｇＧの細胞内局在を観察した。蛍光標識抗体同様にＨＲａｓ－ＧＦＰの蛍光シグナルと２次抗体のＡｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ　５６８の蛍光シグナルが共局在していることが確認された（図５Ｂ）。以上の結果から、蛍光標識抗体および蛍光標識されていない抗体ともにＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰによってサイトゾル送達可能であることが判明した。
（実施例９）
　次に、内在性タンパク質を認識する抗体を導入するため、核膜孔複合体（ｎｕｃｌｅａｒｐｏｒｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ＮＰＣ）に対する抗体ａｎｔｉ－ＮＰＣ－ＩｇＧ（Ｍａｂ４１４、Ｃａｔ＃：　９０２９０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）導入した。ＨｅＬａ細胞にｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰまたはｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥサンプルをＩｇＧ濃度にして１μＭとなるように血清培地に懸濁し、１８時間投与を行った。その後、免疫染色を行い、ＩｇＧの細胞内局在を観察した。ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥを添加した細胞では、点状のシグナルが確認されるのみであったが、ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ添加において、核周囲にＩｇＧのシグナルがリング状に確認された（ｙｅｌｌｏｗ　ａｒｒｏｗ　ｈｅａｄｓ）（図６Ａ）。また、核を横切るようにラインプロットを作製したところ、ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥ　ｄｒｏｐｌｅｔ添加では、核シグナル（シアン色）から離れた位置に抗体シグナル（マゼンタ色）が確認されるのに対し、ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ処理では核シグナルの両端と抗体シグナルが隣接ように検出された（図６Ｂ）。さらに、各サンプルで４００個程度の細胞を観察し、核周囲に抗体由来のシグナルがリング状に観察される細胞をカウントし、その割合を算出したところ、ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ処理によって約２０％の細胞に抗ＮＰＣ抗体を核膜孔に送達でき蛍光イメージングできることが確認された（図６Ｃ）。
（実施例１０）
　細胞内のタンパク質を認識する活性のみでなく、認識したタンパク質の活性を阻害することで細胞機能を発揮するＩｇＧの送達を実施した。Ａｋｔはがん細胞においてアポトーシスを誘導するタンパク質の活性を抑制している。Ａｋｔの活性体であるリン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）を認識し、その機能を阻害するＩｇＧ（ａｎｔｉ－ｐＡＫＴ１－ＩｇＧ）（Ｃａｔ＃：７００３９２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＨｅＬａ細胞に導入することで、細胞のアポトーシスを誘発できることが報告されている。そこで、ａｎｔｉ－ｐＡｋｔ１－ＩｇＧをＬＮＰによりサイトゾルへ送達し、アポトーシスを誘導できるか検討した。
ＨｅＬａ細胞にコントロールＩｇＧとしてｈＩｇＧおよびａｎｔｉ－ｐＡｋｔ１－ＩｇＧを内封するＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰをｈＩｇＧ濃度にして１μＭとなるように血清培地にそれぞれ懸濁し、２４時間投与を行った。その後、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）　３／７　Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え１時間室温でインキュベート後、発光量を定量したところ、ｈＩｇＧと比較して、抗ｐＡｋｔ１抗体（ａｎｔｉ－ｐＡｋｔ１－ＩｇＧ）を送達した群では、有意にアポトーシスを誘導されたことが確認された（図７Ａ）。また、細胞生存率をＷＳＴ－８　ａｓｓａｙにより同様の実験条件で検討を行ったところ、抗ｐＡｋｔ１抗体（ａｎｔｉ－ｐＡｋｔ１－ＩｇＧ）を送達するＬＮＰ添加を行った群において有意な細胞増殖阻害効果を得た（図７Ｂ）。以上の結果から、ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰはタンパク質の活性を阻害可能なＩｇＧをサイトゾルにまで導入でき、細胞機能を制御できることが判明した。
（実施例１１）
　ＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰの汎用性についてＨｅＬａ細胞以外にＨＴ１０８０細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＳＷ４８０細胞を用いて検討した。ｈＩｇＧ－ＡＦ４８８を内封したＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰをＩｇＧ濃度にして１μＭとなるように血清培地にそれぞれ懸濁し、上記細胞に投与して２４時間インキュベートして共焦点顕微鏡にて観察したところ、ＨＴ１０８０細胞では効率良くサイトゾルにｈＩｇＧＡｌｅｘａ４８８が送達されていた（図８）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞およびＳＷ４８０細胞では効率は高くないながらも、サイトゾルへの拡散が確認された（図８）。よって、ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰはＨｅＬａ細胞以外のがん細胞においてもサイトゾル送達可能であることが判明した。
（実施例１２）
　脂質溶液における溶媒を検討するために凍結乾燥後の脂質を９０％ｔ－ＢｕＯＨに溶解した。脂質溶液と１０ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ５）に溶解した０．７５ｍｇ／ｍＬ　ｐｏｌｙ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ（ｐｏｌｙＥ、ｍｏｌ　ｗｔ　３，０００－１５，０００）溶液を別々に４０度の条件で３０分間インキュベートした。その後、３μＬのｈＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）を８μＬのｐｏｌｙＥに添加して［ＩｇＧ：ｐｏｌｙＥ＝５：１（質量比）］、２９．８μＬのクエン酸溶液を添加して、ピペッティング１０回で混合し、ｈＩｇＧ－ｐｏｌｙＥ液滴を形成した。９０％　ｔ－ＢｕＯＨで４ｍＭに調製し４０℃で３０分インキュベートした脂質溶液と液滴溶液を１：４（体積比）となるようにピペッティング１５回で混合した。その後、１，０００倍以上の体積量のＰＢＳ（－）に対して１２－１４ｋ　ＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）で透析し、ＩｇＧを内包するＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）を調製した。これらをＨｅＬａ細胞に添加して１８時間後に固定化・膜透過処理して、Ａｌｅｘａ４８８標識されたａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ抗体にて免疫染色を実施して、共焦点顕微鏡によって細胞を観察したところ、９０％　ｔ－ＢｕＯＨ脂質溶液によって調製したｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰもｔ－ＢｕＯＨ脂質溶液で調製したｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰと同様にサイトゾルに抗体を送達可能であることが判明した（図９）。
（マイクロ流体デバイス：実施例１３）
　マイクロ流体デバイスを用いてＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）の調製を検討した。
　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）とｐｏｌｙＥ（０．７５　ｍｇ／ｍＬ）を５：１（ｗ／ｗ）になるように１０ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）に溶解し、液滴を形成させ、１ｍＬシリンジ（テルモ）に充填した。
　ＳＳ－ＯＰ：ＤＯＰＥ：β－ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ＝４５：１０：４５の混合液に１．５ｍｏｌ％ＰＥＧ５ｋとなるようにｔ－ＢｕＯＨで調製した８ｍＭもしくは１６ｍＭの脂質溶液を別の１ｍＬシリンジ（テルモ）に充填した。これらをシリンジポンプ（ｋｄ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にセットして各流速で混合した後、同混合液をＰＢＳにて終夜透析した。各サンプルの条件を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　ＨｅＬａ細胞に対して、これらのＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）を含む血清含有培地にて１８時間処理して、免疫染色にて細胞を観察した。その結果を図１１，図１２に示す。いずれの条件でも細胞質内への送達が確認されたが、脂質濃度が８ｍMで流速が１００μL／ｍｉｎの条件で作製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）が最も送達効率が高かった。また、脂質と液滴の流速比が１：４で調製したＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）が最も送達効率が高かった。
　作製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）の粒子径を測定し（図１３）、抗体内封率（図１４）を算定したところ、脂質濃度が８ｍMで流速１００μL／ｍｉｎの条件で作製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）、または脂質と液滴の流速比１：４の条件で作製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）の内封率が高く、粒子径も大きくなる傾向が観察された。一方、流速が５００μL／ｍｉｎの条件で作製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）の粒子径は小さく内封率は低い傾向を示した。
　上記のようにマイクロ流体デバイスの混合条件を変えることで所望の特性を示すＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）を作製可能であることが示された。
（ＰｏｌｙＥのサイズ：実施例１４）
　分子量の異なるＰｏｌｙＥと抗体を含む液滴を用いて調製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）の細胞質内への送達効率を確認した。１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４μＬを０．３７５ｍｇ/ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬの３－１５ｋ、３９ｋ、２．６ｋの分子量を有する各ポリグルタミン酸溶液８μＬと混合した後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）で４０μＬに調製（Ｆｉｌｌ－ｕｐ）した後に懸濁し、さらに８ｍＭの脂質溶液１０μＬを添加し、ＰＢＳで終夜透析してＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）を作製した。
　透析液に血清含有培地を添加し２００μＬに調製（Ｆｉｌｌ－ｕｐ）したＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）でＨｅＬａ細胞を３７℃で１８時間処理した後、ＰＢＳを用いて洗浄された細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で膜透過処理を施した。ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８によって免疫染色をおこなったところ、２．６ｋのポリグルタミン酸との液滴を用いて調製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）の細胞内送達効率は３－１５ｋ、３９ｋのポリグルタミン酸との液滴を用いて調製されたそれよりもサイトゾルへの送達効率が低いことが示唆された（図１５，図１６）。
　上記のようにポリマーの重合度を検討することで所望の特性を示すＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）を作製可能であることが示された。
（ヒアルロン酸：実施例１５）
　ＰｏｌｙＥ以外のアニオン性ポリマー、具体的には分子量約１，０００，０００（重合度概算で約２５００）のヒアルロン酸と抗体を含む液滴を用いて調製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）の細胞質内への送達効率を確認した。１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ３μＬを０．０９３７５ｍｇ／ｍＬ、０．１８７５ｍｇ／ｍＬ、０．３７５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬの各ヒアルロン酸溶液８μＬと混合したところ、ヒアルロン酸：ＩｇＧ（ｗ／ｗ）を１：４０～１：５となるように調製された混合液中で、液滴の形成が検鏡下で確認された（図１７）。
　液滴が形成された混合液を１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）で４０μＬに調製（Ｆｉｌｌ－ｕｐ）した後に懸濁し、さらに８ｍＭの脂質溶液１０μＬを添加し、ＰＢＳで終夜透析してＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）を作製した。
　透析液に血清含有培地を添加し２００μＬに調製（Ｆｉｌｌ－ｕｐ）したＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）でＨｅＬａ細胞を３７℃で１８時間処理した後、ＰＢＳを用いて洗浄された細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で膜透過処理を施した。ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８によって免疫染色をおこなったところ、Ｌｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）に含まれるＩｇＧがサイトゾルに送達されていることが確認された（図１８）。
　上記のようにＰｏｌｙＥ以外のアニオン性ポリマーを使用することで、検鏡下アニオン性ポリマーと抗体を含む液滴の形成が確認可能であることが示された。さらにこのように形成された液滴を用いて調製されたＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ｈＩｇＧ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）に含まれる抗体が効率よく細胞内に送達されることも示された。
（実施例１６）
　核内に存在する標的分子に結合し得る抗体のＣ末端に核移行シグナル配列（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ）を付加した遺伝子を発現させて核内分子特異的抗体（ＩｇＧ－ＮＬＳ)を調製する。１０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ－ＮＬＳを３μＬおよび各濃度の (０．３７５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、又は３．０ｍｇ／ｍＬ濃度のポリグルタミン酸溶液８μＬを混合した後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）で４０μＬに調製（Ｆｉｌｌ－ｕｐ）した後に懸濁し、さらに８ｍＭの脂質溶液１０μＬを添加し、ＰＢＳで終夜透析してＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＩｇＧ－ＮＬＳ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）を作製する。
　透析液に血清含有培地を添加し２００μＬに調製（Ｆｉｌｌ－ｕｐ）したＬｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ（ＩｇＧ－ＮＬＳ＿ｐｏｌｙＥ－ＬＮＰ）でＨｅＬａ細胞を３７℃で１８時間処理した後、ＰＢＳを用いて洗浄された細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で膜透過処理を施す。ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８を用いて免疫染色して、ＩｇＧ－ＮＬＳの局在を共焦点顕微鏡によって観察する。
　電荷を持つタンパク質と反対の電荷のポリマーを用いて脂質ナノ粒子とすることで、より小さな脂質ナノ粒子を製造することができ、細胞に取り込まれサイトゾルや核を含む細胞内に送達される。この薬物送達システムを利用することで、これまで困難であった抗体を細胞内に導入することができるようになり、治療方法の幅を広げることができる。

Claims (11)

  1. 　抗体および抗体フラグメントから選択されるタンパク質と、ポリマーと、脂質と、を含む組成物であって、所定のｐＨにおいて前記タンパク質と前記ポリマーとが反対の電荷を持つことを特徴とする組成物からなる脂質ナノ粒子。
  2. 　前記脂質ナノ粒子は、前記タンパク質が封入されている、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
  3. 　前記脂質ナノ粒子の粒径を測定したときに粒径分布のピークトップが８０ｎｍから１２０ｎｍである、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
  4. 　前記ポリマーが、アニオン性またはカチオン性のポリマーである、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
  5. 　前記カチオン性ポリマーが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンおよびこれらの水溶性塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項４記載の脂質ナノ粒子。
  6. 　前記アニオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも１つのポリアミノ酸、またはヒアルロン酸、プルランからなる群より選択される少なくとも１つのグリコサミノグリカンである、請求項４記載の脂質ナノ粒子。
  7. 　前記カチオン性または前記アニオン性ポリマーの分子量が、０．５ｋＤａ～１０００ｋＤａである請求項４記載の脂質ナノ粒子。
  8. 　前記脂質がカチオン性脂質である、請求項１記載の脂質ナノ粒子。
  9. 　さらに中性リン脂質、ＰＥＧ脂質、およびコレステロールからなる群より選択される一以上の脂質を含む請求項１から８のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
  10. 　抗体および抗体フラグメントから選択されるタンパク質と、ポリマーと、脂質と、を含む組成物であって、所定のｐＨにおいて前記タンパク質と前記ポリマーとが反対の電荷を持つことを特徴とする組成物からなる医薬組成物。
  11. 　前記抗体および抗体フラグメントから選択されるタンパク質と、前記ポリマーとを混合して液滴を形成させる液滴形成工程と、
    　前記液滴と前記脂質とを混合して前記脂質に前記液滴を内封させる内封工程と、を備えることを特徴とする脂質ナノ粒子の製造方法。
     
PCT/JP2024/008154 2023-03-02 2024-03-04 脂質ナノ粒子、医薬組成物、および脂質ナノ粒子の製造方法 Ceased WO2024181580A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2025504021A JPWO2024181580A1 (ja) 2023-03-02 2024-03-04
CN202480016036.0A CN120826236A (zh) 2023-03-02 2024-03-04 脂质纳米粒子、医药组合物以及脂质纳米粒子的制造方法
EP24764057.6A EP4674431A1 (en) 2023-03-02 2024-03-04 Lipid nanoparticles, pharmaceutical composition, and production method for lipid nanoparticles

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023-031510 2023-03-02
JP2023031510 2023-03-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024181580A1 true WO2024181580A1 (ja) 2024-09-06

Family

ID=92589996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/008154 Ceased WO2024181580A1 (ja) 2023-03-02 2024-03-04 脂質ナノ粒子、医薬組成物、および脂質ナノ粒子の製造方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4674431A1 (ja)
JP (1) JPWO2024181580A1 (ja)
CN (1) CN120826236A (ja)
WO (1) WO2024181580A1 (ja)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JP2010536786A (ja) * 2007-08-17 2010-12-02 アムジエン・インコーポレーテツド ポリカチオンを用いた抗体およびｆｃ融合分子の製剤
JP5361738B2 (ja) 2007-01-22 2013-12-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多価電解質沈殿物及びタンパク質の精製
WO2015064591A1 (ja) 2013-10-28 2015-05-07 テルモ株式会社 タンパク質水性懸濁剤
WO2019188867A1 (ja) 2018-03-27 2019-10-03 日油株式会社 細胞内動態を改善した新規カチオン性脂質
JP2021519748A (ja) * 2018-01-29 2021-08-12 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ タンパク質治療薬をカプセル製剤化および徐放性製剤化を可能にするポリマーナノ粒子組成物
JP2022122871A (ja) 2013-05-03 2022-08-23 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 特定の薬力学的有効期間および免疫寛容の誘発のための抗原を有する免疫抑制剤の送達

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JP5361738B2 (ja) 2007-01-22 2013-12-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多価電解質沈殿物及びタンパク質の精製
JP2010536786A (ja) * 2007-08-17 2010-12-02 アムジエン・インコーポレーテツド ポリカチオンを用いた抗体およびｆｃ融合分子の製剤
JP2022122871A (ja) 2013-05-03 2022-08-23 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 特定の薬力学的有効期間および免疫寛容の誘発のための抗原を有する免疫抑制剤の送達
WO2015064591A1 (ja) 2013-10-28 2015-05-07 テルモ株式会社 タンパク質水性懸濁剤
JP2021519748A (ja) * 2018-01-29 2021-08-12 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ タンパク質治療薬をカプセル製剤化および徐放性製剤化を可能にするポリマーナノ粒子組成物
WO2019188867A1 (ja) 2018-03-27 2019-10-03 日油株式会社 細胞内動態を改善した新規カチオン性脂質

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Intracytoplasmic delivery of anionic proteins", MOL THER., vol. 9, no. 6, June 2004 (2004-06-01), pages 964 - 9
CELL, vol. 185, no. 15, 2022, pages 2789 - 2805
CHATIN BMEVEL MDEVALLIERE J ET AL.: "Liposome-based formulation for intracellular delivery of functional proteins", MOL THER NUCLEIC ACIDS.
CLACKSON E, NATURE, vol. 352, 1991, pages 624 - 628
HIRAI YUSUKE, HIROSE HISAAKI, IMANISHI MIKI, ASAI TOMOHIRO, FUTAKI SHIROH: "Cytosolic protein delivery using pH-responsive, charge-reversible lipid nanoparticles", SCIENTIFIC REPORTS, NATURE PUBLISHING GROUP, US, vol. 11, no. 1, US , XP093205049, ISSN: 2045-2322, DOI: 10.1038/s41598-021-99180-5 *
HIRAI YUSUKE, KAWAGUCHI YOSHIMASA, KASAHARA CHISATO, HIROSE HISAAKI, FUTAKI SHIROH: "Liquid Droplet-Mediated Formulation of Lipid Nanoparticles Encapsulating Immunoglobulin G for Cytosolic Delivery", MOLECULAR PHARMACEUTICS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 21, no. 4, 1 April 2024 (2024-04-01), US , pages 1653 - 1661, XP093205060, ISSN: 1543-8384, DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.3c00868 *
JOURNAL OF BIOMEDICAL SCIENCE, vol. 27
JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B, vol. 1065, no. 1066, 2017, pages 119 - 128
KOHLERMILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
LU TIEMEI, LIESE SUSANNE, SCHOENMAKERS LUDO, WEBER CHRISTOPH A., SUZUKI HIROAKI, HUCK WILHELM T. S., SPRUIJT EVAN: "Endocytosis of Coacervates into Liposomes", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 144, no. 30, 3 August 2022 (2022-08-03), pages 13451 - 13455, XP093205052, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/jacs.2c04096 *
MARKS ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 222, 1991, pages 581 - 597
MASHIRO MIMURA, J. CHEM. PHYS., vol. 150, pages 064903
MOL. PHARMACEUTICS, vol. 12, no. 9, 2015, pages 3272 - 3281
MOL. PHARMACEUTICS, vol. 13, 2016, pages 1915 - 1926
N. BIOTECHNOL., vol. 28, no. 5, 2011, pages 253 - 457
See also references of EP4674431A1
TSUMURA KEISUKE; HSU WEILIN; MIMURA MASAHIRO; HORIUCHI AIKO; SHIRAKI KENTARO: "Lowering the viscosity of a high-concentration antibody solution by protein–polyelectrolyte complex", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 133, no. 1, 8 October 2021 (2021-10-08), NL , pages 17 - 24, XP086925102, ISSN: 1389-1723, DOI: 10.1016/j.jbiosc.2021.09.011 *
YUSUKE HIRAI, HISAAKI HIROSE, MIKI IMANISHI; TOMOHIRO ASAI, SHIROH FUTAKI: "29V09-pm03 Intracellular delivery of negatively charged protein using lipid-based carrier", ABSTRACTS OF THE 141ST ANNUAL MEETING OF THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, MARCH 26-29, 2021, ONLINE, PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, JP, 26 March 2021 (2021-03-26) - 29 March 2021 (2021-03-29), JP, pages 29V09 - pm03S, XP009559593 *
ZHANG YANWEN, CHEN YUFENG, YANG XIAOHAI, HE XIAOXIAO, LI MEI, LIU SONGYANG, WANG KEMIN, LIU JIANBO, MANN STEPHEN: "Giant Coacervate Vesicles As an Integrated Approach to Cytomimetic Modeling", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 143, no. 7, 24 February 2021 (2021-02-24), pages 2866 - 2874, XP093205055, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/jacs.0c12494 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2024181580A1 (ja) 2024-09-06
EP4674431A1 (en) 2026-01-07
CN120826236A (zh) 2025-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rome et al. Development of the vault particle as a platform technology
CN116496193B (zh) 一种氨基酸脂质形成的纳米递送系统及其应用
JPWO2007037444A1 (ja) 目的物質を核内又は細胞内に送達するためのベクター
JP2017502997A (ja) ハイブリドソーム、それを含む組成物、それらの製造方法、およびその使用
JP2023543623A (ja) 融合関連小膜貫通タンパク質が配合されたプロテオリピド小胞
CN103037840A (zh) 具有核内转运性的脂质膜结构体
CN1863558A (zh) 具有向核内转移能力的聚精氨酸修饰的脂质体
Kalra et al. Virosomes: as a drug delivery carrier
US20100166840A1 (en) Liposome having lipid membrane containing bacterial cell component
Zhang et al. Macropinocytosis is the major pathway responsible for DNA transfection in CHO cells by a charge-reversal amphiphile
Jing et al. Delivery of siRNA complexed with palmitoylated α-peptide/β-peptoid cell-penetrating peptidomimetics: membrane interaction and structural characterization of a lipid-based nanocarrier system
US20090305409A1 (en) Liposome Capable of Effective Delivery of Given Substance Into Nucleus
US20150140066A1 (en) Carrier for intracellular delivery of functional protein
KR101916941B1 (ko) 플라스미드 디엔에이 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그의 제조방법
EP4442256A1 (en) Lipid nanoparticle compositions
Binici et al. A comparative study of cationic lipid-enriched LNPs for mRNA vaccine delivery
ES2640060T3 (es) Proceso para producir una partícula fina revestida
JP2006028030A (ja) リポソーム封入物質がエンドソームから脱出可能なリポソーム
JP5067733B2 (ja) 目的物質をミトコンドリア内に送達可能な脂質膜構造体
KR20220117133A (ko) 양이온성 분자 수송체 및 SARS-CoV-2 mRNA의 이온 복합체를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 예방 백신 조성물
WO2024181580A1 (ja) 脂質ナノ粒子、医薬組成物、および脂質ナノ粒子の製造方法
US9937127B2 (en) Method of producing fine particles surface-modified with water-soluble substance
US20090010999A1 (en) Complex Particles and Coated Complex Particles
Sun et al. Enhanced in vivo gene expression mediated by listeriolysin O incorporated anionic LPDII: Its utility in cytotoxic T lymphocyte-inducing DNA vaccine
Wang et al. Spleen Targeting Nucleic Acid Delivery Vector Based on Metal–Organic Frameworks

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24764057

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2025504021

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2025504021

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202480016036.0

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024764057

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 202480016036.0

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024764057

Country of ref document: EP

Effective date: 20251002

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024764057

Country of ref document: EP

Effective date: 20251002

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2024764057

Country of ref document: EP

Effective date: 20251002

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2024764057

Country of ref document: EP