WO2024204596A1 - 網膜組織の製造方法 - Google Patents

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篤 桑原
泰之 喜多
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    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing retinal tissue.
  • Non-Patent Document 1 demonstrating the possibility of transplantation therapy for photoreceptor degenerative diseases such as retinitis pigmentosa.
  • Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 a method for obtaining multi-layered retinal tissue from pluripotent stem cells
  • Patent Document 3 and Patent Document 2 a method for obtaining multi-layered retinal tissue by forming uniform pluripotent stem cell aggregates in a serum-free medium containing a substance that inhibits the Wnt signaling pathway, and then floating-culture the obtained aggregates in the presence of a basement membrane preparation and then floating-culture in a serum medium
  • Non-Patent Document 3 and Patent Document 2 a method for obtaining retinal tissue by floating-culture of pluripotent stem cell aggregates in a medium containing a substance that acts on the BMP signaling pathway
  • These retinal tissues are produced as sphere-shaped cell aggregates.
  • Non-Patent Document 5 it has been reported that Wnt2b has an effect on the formation of retinal epithelial structures in chickens (Non-Patent Document 5), but a similar effect has not been reported in organisms other than chickens.
  • the present invention aims to provide a method for regenerating the neuroepithelial structure of retinal tissue from retinal cells and a method for producing retinal tissue by applying this method.
  • a neuroepithelial structure when a neuroepithelial structure is reconstituted using dispersed retinal cells as starting cells to produce retinal tissue, a neuroepithelial structure can be reconstituted by adding a substance acting on the Wnt signaling pathway to the dispersed retinal cells.
  • a ROCK inhibitor a substance acting on the SHH signaling pathway, and/or a fibroblast growth factor can be further added, (2) in order to reconstitute a good neuroepithelial structure, particularly in a sheet form, by culturing on a culture plate coated with an extracellular matrix that serves as a scaffold for cell adhesion, and (3) by improving the purity of retinal progenitor cells as starting cells, impure cells such as retinal pigment epithelial cells (RPE) can be removed.
  • RPE retinal pigment epithelial cells
  • retinal tissues need to be prepared, and retinal cells as a raw material for reconstituting a neuroepithelial structure need to be scaled up, but the number of cells that can be obtained from one spherical retinal tissue is limited, and the production of multiple spherical retinal tissues and the preparation of retinal cells from them are complicated.
  • the inventors came up with the idea of using retinal cells obtained from a retinal sheet as starting cells, and discovered that these cells are suitable for regenerating neuroepithelial structures, which led to the completion of the present invention.
  • a method for producing retinal tissue having an epithelial structure comprising the steps of: (1) Seeding pluripotent stem cells into region A on a culture substrate having, on its surface, a region A having cell adhesiveness and a region B adjacent to at least a portion of region A and having lower cell adhesiveness than region A; (2) culturing the pluripotent stem cells seeded in step (1) in a medium containing a ROCK inhibitor; (3) culturing the cells obtained after step (2) in a medium containing a substance acting on the BMP signaling pathway to obtain retinal tissue; (4) dispersing the retinal tissue obtained in step (3) to obtain a dispersed retinal cell population; and (5) subjecting the dispersed retinal cell population obtained in step (4) to suspension or adhesion culture in a medium containing a substance acting on the Wnt signaling pathway.
  • the medium containing the substance acting on the Wnt signaling pathway further contains one or more substances selected from the group consisting of a ROCK inhibitor, a substance acting on the SHH signaling pathway, and a substance acting on the FGF signaling pathway.
  • the ROCK inhibitor in the medium containing the substance acting on the Wnt signaling pathway is one or more substances selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil (HA1077), and H-1152.
  • step of increasing the proportion of retinal progenitor cells further comprises a step of contacting the dispersed retinal cell population with a substance that binds to one or more antigens selected from the group consisting of SSEA1, CD66b, CD69 and CD84, to obtain a cell population in which the expression level of the antigen is below a reference value.
  • a substance that binds to one or more antigens selected from the group consisting of SSEA1, CD66b, CD69 and CD84, to obtain a cell population in which the expression level of the antigen is below a reference value.
  • [36] The method according to any one of [1] to [35], wherein the epithelial structure is a multi-layered structure.
  • a method for producing retinal tissue (a composite of neural retina and RPE cells (composite sheet)), comprising producing a sheet-like retinal tissue by the method according to any one of [21] to [36], and bonding the sheet-like retinal tissue to a sheet-like or dispersed retinal pigment epithelial cell in the presence of an adhesion factor.
  • a method for producing retinal tissue comprising joining a sheet-like retinal tissue produced by the method according to any one of [21] to [36] with sheet-like or dispersed retinal pigment epithelial cells in the presence of an adhesion factor.
  • the adhesion factor is an extracellular matrix or a hydrogel.
  • the adhesion factor is one or more substances selected from gelatin, fibrin, fibronectin, hyaluronic acid, laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
  • the retinal tissue described in [43] comprises a retinal cell layer having the above-mentioned multilayer structure and a sheet-like retinal pigment epithelial cell joined to the above-mentioned retinal cell layer, wherein the tangential directions of the surfaces of the above-mentioned retinal cell layer and the sheet-like retinal pigment epithelial cell are roughly parallel, the apical surface of the above-mentioned retinal cell layer faces the apical surface of the above-mentioned sheet-like retinal pigment epithelial cell, and the above-mentioned retinal cell layer and the sheet-like retinal pigment epithelial cell are joined to each other by an adhesion factor present between them.
  • a pharmaceutical composition comprising the retinal tissue according to any one of [42] to [47].
  • a method for treating a disease caused by a disorder of a retinal cell or retinal tissue or damage to the retinal tissue comprising transplanting the retinal tissue according to any one of [42] to [47] into a subject in need of transplantation.
  • the retinal tissue according to any one of [42] to [47] for use in treating a disorder of a retinal cell or retinal tissue, or a disease caused by damage to the retinal tissue.
  • the present invention makes it possible to provide a method for regenerating the layered structure of retinal tissue from retinal cells, a method for producing retinal tissue using the method, and retinal tissue.
  • this is a bright field micrograph showing the state of re-formation of aggregates one day after dispersing KhES-1-derived aggregates into single cells and seeding them.
  • 1231A3-derived aggregates were dispersed into single cells, and this is a bright field micrograph showing the state of re-formation of the aggregates one day after seeding.
  • this is a bright field micrograph showing the morphology of aggregates that were re-formed one day after dispersing KhES-1-derived aggregates into single cells and seeding them.
  • FIG. 13 is a fluorescence micrograph showing the morphology of aggregates that were reformed 7 days after dispersing KhES-1-derived aggregates into single cells and seeding them in Reference Example 1-2.
  • FIG. 13 is a fluorescence micrograph showing the morphology of aggregates re-formed 14 days after dispersing KhES-1-derived aggregates into single cells and seeding them in Reference Example 1-2.
  • 1 is a graph showing the results of measuring the area of aggregates re-formed by single cells derived from KhES-1 in Reference Example 1-2 using Image J.
  • (A) shows the area of the aggregates on days 1, 7, and 14 after seeding
  • (B) shows the ratio (area ratio) of the area of the aggregates on days 7 and 14 to the area of the aggregates on day 1 after seeding.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and immunostained (DAPI, Rx::Venus, Chx10) sections of the aggregates 15 days after seeding were observed using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and immunostained ( ⁇ -catenin) sections of the aggregates 15 days after seeding were observed using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and immunostained (Collagen IV, Zo-1) sections of the aggregates 15 days after seeding were observed using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and immunostained (DAPI, Chx10, Ki67, Pax6) sections of the aggregates 28 days after seeding were observed using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and sections of the aggregates 28 days after seeding were observed for Rx::Venus fluorescence using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and immunostained (Collagen IV, Zo-1) sections of the aggregates 28 days after seeding were observed using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and the photographs show the results of observing immunostained (DAPI, Rx::Venus, Collagen IV, Zo-1) sections of the aggregates 28 days after seeding using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and immunostained (DAPI, Chx10, Ki67, Pax6) sections of the aggregates 28 days after seeding were observed using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and immunostained (CRX, RxRg, NRL, Recoverin) sections of the aggregates 28 days after seeding were observed using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates were dispersed into single cells, and immunostained (DAPI, Islet-1, Brn3, Calretinin) sections of the aggregates 28 days after seeding were observed using a confocal laser scanning fluorescence microscope.
  • KhES-1-derived aggregates on the 18th, 25th, 40th, 61st, and 75th days of differentiation were dispersed into single cells, and these are bright field and fluorescence microscopy photographs showing the state of the aggregates that were re-formed on the 3rd, 15th, and 21st days after seeding.
  • KhES-1-derived aggregates (BMP4+/BMP4-) on the 40th day of differentiation were dispersed into single cells, and these are bright field microscope and fluorescence microscope (Rx::Venus) photographs showing the state of the re-formed aggregates on days 3, 15, and 21 after seeding.
  • Reference Example 1-6 these are fluorescence micrographs showing the morphology of aggregates formed 1 day and 7 days after seeding dispersed retinal cells cryopreserved in various cryopreservation solutions. This is a graph showing the viability (A) of dispersed retinal cells cryopreserved in various cryopreservation solutions in Reference Examples 1-6 after waking them up, and the area (B) of aggregates re-formed using the awake retinal cells.
  • Reference Example 1-7 a photograph showing the results of observing, using a confocal laser scanning fluorescence microscope, a section immunostained for the basement membrane expressed in the retinal tissue formed by suspension culture.
  • 1 shows immunohistochemical staining images showing the results of investigating Laminin isoforms expressed in mouse fetal neural retinal tissue in Reference Example 1-7.
  • 13 shows confocal laser scanning fluorescence microscope photographs confirming the re-formation of sheet-like retinal tissue in adhesion culture from a single cell suspension of retinal cells under conditions 1 to 3 in Reference Example 1-8.
  • 13 shows confocal laser scanning fluorescence microscope photographs confirming the re-formation of sheet-like retinal tissue in adhesion culture from a single cell suspension of retinal cells under conditions 1 to 3 in Reference Example 1-8.
  • 1 shows bright field and fluorescent micrographs showing the results of confirming the effects of various factors on the re-formation of sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-9.
  • 13 is a set of confocal laser scanning fluorescence microscope photographs showing the results of confirming the effects of various factors on the re-formation of sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-9.
  • 1 shows bright field micrographs, fluorescence micrographs, and confocal laser scanning fluorescence micrographs showing the results of investigating the concentration and addition period of CHIR99021 in the re-formation of sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-10.
  • 13 is a set of confocal laser scanning fluorescence microscope photographs showing the results of investigating the concentration and addition period of CHIR99021 in the re-formation of sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-10.
  • 13 is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph showing the results of confirming the effect of CHIR99021 in re-forming sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-12.
  • 13 is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph showing the results of confirming the effect of CHIR99021 in re-forming sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-12.
  • 13 is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph showing the results of confirming the effect of CHIR99021 in re-forming sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-12.
  • 13 is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph showing the results of confirming the effect of CHIR99021 in re-forming sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-12.
  • 13 is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph showing the results of confirming the effect of CHIR99021 in re-forming sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-12.
  • 13 is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph showing the results of confirming the effect of CHIR99021 in re-forming sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-12.
  • 13 is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph showing the results of confirming the effect of CHIR99021 in re-forming sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-12.
  • 13 is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph showing the results of confirming the effect of CHIR99021 in re-forming sheet-like retinal tissue in adhesion culture in Reference Example 1-12.
  • Fluorescence microscopy photographs showing the results of investigating the effect of various factors on maintaining retinal cells in Reference Example 1-13.
  • Fluorescence microscopy photographs showing the results of an investigation into effective conditions for the maintenance culture of retinal progenitor cells in Reference Example 1-14.
  • 1 is a stereomicroscope photograph showing the results of re-forming a sheet on collagen in Reference Example 1-15.
  • 1 is a fluorescence micrograph showing a transplant graft prepared from a re-sheeted retinal cell sheet in Reference Example 1-16. Fluorescence stereomicroscope and fluorescence microscopic photographs showing the results of observing the fundus of the retina after transplantation in Reference Example 1-16.
  • 1 is a graph showing the results of FACS analysis for sorting an Rx::Venus-positive fraction from a cell population dispersed into single cells in Reference Example 1-17, (A) is a dot plot, and (B) is a histogram plot.
  • 1 shows stereomicroscope and fluorescent stereomicroscope photographs of cell populations with and without sorting in Reference Example 1-17.
  • 1 shows confocal laser scanning fluorescence micrographs of cell populations with/without sorting in Reference Example 1-17.
  • 1 shows confocal laser scanning fluorescence micrographs of cell populations with/without sorting in Reference Example 1-17.
  • 1 shows bright field and fluorescent microscopic photographs of a sorted cell population in Reference Example 1-17. Fluorescence micrographs of Rx::Venus-positive cell populations observed when various proteins were added in Reference Example 1-18. Fluorescence micrographs of Rx::Venus-positive cell populations observed when various low molecular weight compounds were added in Reference Example 1-18. Fluorescence micrographs of Rx::Venus-positive cell populations observed when different concentrations of FGF2, FGF4, and FGF8 were added in Reference Example 1-18.
  • FIG. 1 shows bright field and fluorescent micrographs showing the effects of aggregate reformation and retinal differentiation by addition of sorting and FGF8 in Reference Example 1-19.
  • FIG. 1 shows bright field microscopic and fluorescent microscopic photographs and a graph showing the results of FACS analysis, showing the aggregate reformation and retinal differentiation effects by addition of sorting and FGF8 in Reference Example 1-19.
  • 1 shows bright field microscopic and fluorescent microscopic photographs and a graph showing the results of FACS analysis, which indicate the aggregate reformation and retinal differentiation effects by the addition of FGF8 in Reference Example 1-19.
  • 1 shows bright field and fluorescence micrographs showing the effect of addition of FGF8 on re-sheet formation in Reference Example 1-20.
  • FIG. 1 shows bright field and fluorescence micrographs showing the effect of addition of FGF8 on re-sheet formation in Reference Example 1-20.
  • FIG. 13 is a graph showing bright field microscopic and fluorescent microscopic photographs and FACS analysis results showing the effects of sheet re-formation and retinal differentiation by the addition of FGF8 in Reference Example 1-20.
  • 1 shows stereomicroscope and fluorescent stereomicroscope photographs showing the time course of changes in the re-sheeted retinal sheet in Reference Example 1-21.
  • FIG. 1 shows markers focused on in surface antigen screening in Reference Example 1-22.
  • 1 is a graph showing the results of cell sorting using various surface antigens in Reference Example 1-22.
  • 1 is a graph showing the results of cell sorting using various surface antigens in Reference Example 1-22.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of cell sorting using various surface antigens in Reference Example 1-22.
  • 1 is a graph showing the results of cell sorting using various surface antigens in Reference Example 1-22.
  • 1 is a graph showing the results of cell sorting using various surface antigens in Reference Example 1-22.
  • These are bright field and fluorescence microscope photographs of the differentiation state into brain organoid in Reference Example 1-23. This is a confocal laser scanning fluorescence microscope photograph observing the differentiation state into brain organoid in Reference Example 1-23.
  • This is a graph showing the results of FACS analysis of the expression of CD39, CD73, and CXCR4 in Brain Organoid in Reference Example 1-23.
  • 1 shows bright field and fluorescent micrographs showing the results of differentiation induction by SAG at different concentrations in Reference Example 1-24.
  • 1 shows the results of FACS analysis and a graph showing the numerical values for the expression of CD39 and CXCR4 after differentiation induction with different concentrations of SAG in Reference Example 1-24.
  • 1 shows confocal laser scanning fluorescence micrographs of immunostained tissues in which differentiation was induced by SAG at different concentrations in Reference Example 1-24.
  • 1 shows confocal laser scanning fluorescence micrographs of immunostained tissues in which differentiation was induced by SAG at different concentrations in Reference Example 1-24.
  • 1 shows the results of FACS analysis of the expression of CD39 and BV421 after treatment with different concentrations of SAG in Reference Example 1-24, as well as confocal laser scanning fluorescence micrographs showing immunostained images of tissues in which differentiation was induced by different concentrations of SAG.
  • 1 shows confocal laser scanning fluorescence micrographs of immunostained tissues in which differentiation was induced by SAG at different concentrations in Reference Example 1-24.
  • 1 shows confocal laser scanning fluorescence micrographs of immunostained tissues in which differentiation was induced by SAG at different concentrations in Reference Example 1-24.
  • 1 is a graph showing the results of FACS analysis illustrating the results of investigating substances capable of enhancing CD39 expression in Reference Example 1-25.
  • FIG. 1 is a graph showing numerical values of FACS analysis results showing the results of investigating substances capable of enhancing CD39 expression in Reference Example 1-25.
  • A shows the results of CD39 positivity and RX::venus positivity
  • B shows the results of CXCR4 negativity and RX::venus positivity.
  • these are bright field and fluorescence microscopic photographs showing the observation of Islet-1 KO hESC-retina sheets (dd74) produced with FGF8- and FGF8+, and the process of cutting out grafts for transplantation.
  • This is a FACS dot plot showing the results of screening various surface antigens of NR in comparison with Brain Organoid in Reference Example 1-27.
  • FIG. 1 shows FACS dot plots showing the results of screening various surface antigens of NR in Reference Example 1-27.
  • FIG. 13 is a FACS dot plot showing the results of time-course changes in CD9 expression in hESC-retina in Reference Example 1-28.
  • FIG. 1 shows FACS dot plots illustrating the results of analyzing the expression of CD9 and SSEA-1 in hESC-retina in Reference Example 1-29.
  • 1 is a FACS dot plot showing the results of a purification study using CD9, CD90, CXCR4 and SSEA-1 in hESC-retina in Reference Example 1-30.
  • FIG. 1 is a FACS dot plot showing the results of a purification study using CD9, CD90, CXCR4 and SSEA-1 in hESC-retina in Reference Example 1-30.
  • 13 is a graph showing the results of a purification study using CD9, CD90, CXCR4 and SSEA-1 in hESC-retina in Reference Example 1-30.
  • 13 shows photographs illustrating the results of a purification study using CD9, CD90, CXCR4, and SSEA-1 in hESC-retina in Reference Example 1-30.
  • 13 shows photographs illustrating the results of a purification study using CD9, CD90, CXCR4, and SSEA-1 in hESC-retina in Reference Example 1-30.
  • FIG. 13 is a FACS diagram showing the results of time-dependent changes in the expression of CD9 and SSEA-1 in hESC-retina in Reference Example 1-31.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the process of investigating the combination of an RPE sheet and a retina sheet using gelatin in Reference Example 1-32. 1 shows stereomicroscope and fluorescent microscopic photographs of an RPE sheet and a re-sheet of neural retina cultured on the Transwell used for composite formation using gelatin in Reference Example 1-32. 13 is a stereomicroscope photograph showing the process of peeling the RPE sheet and the re-sheeted neural retina from the Transwell and adding gelatin in Reference Example 1-32.
  • 13 shows stereomicroscope photographs showing the process of adding gelatin to an RPE sheet and a re-sheet of neural retina in Reference Example 1-32.
  • 1 shows stereomicroscope and fluorescent microscope photographs showing the process of combining an RPE sheet and a re-sheeted neural retina in Reference Example 1-32.
  • 13 shows stereomicroscope and fluorescent microscope photographs showing that the RPE sheet and the re-sheeted neural retina are combined and then lifted up with tweezers in Reference Example 1-32.
  • 13 shows stereomicroscope and fluorescent microscopic photographs showing that an RPE sheet and a re-sheeted neural retina are combined and then cut out with scissors in Reference Example 1-32.
  • 1 shows stereomicroscope and fluorescent micrographs of cross sections of the composite RPE sheet and the reconstituted neural retina in Reference Example 1-32.
  • 13 shows stereomicroscope and fluorescent microscopic photographs of the suction and ejection of the cut composite RPE sheet and re-sheeted neural retina in Reference Example 1-32.
  • 1 shows stereomicroscope and fluorescent microscopic photographs of an RPE sheet cultured on the Transwell used for conjugation with fibron in Reference Example 1-33, and a re-sheet of neural retina.
  • 13 shows stereomicroscope and fluorescent microscope photographs showing the process of a combination study in which an RPE sheet and a re-sheet of neural retina are detached from a Transwell in Reference Example 1-33.
  • 13 shows stereomicroscope and fluorescent microscopic photographs showing the process of investigating the combination of Fibrinogen and Thorombin added to the recovered RPE sheets and re-formed sheets in Reference Example 1-33.
  • 1 shows stereomicroscope and fluorescent microscope photographs showing the process of combining an RPE sheet and a re-sheeted neural retina in Reference Example 1-33.
  • 1 shows stereomicroscope and fluorescent microscope photographs showing the process of combining an RPE sheet and a re-sheeted neural retina in Reference Example 1-33.
  • 13 shows stereomicroscope and fluorescent microscope photographs showing that the RPE sheet and the re-sheeted neural retina are combined and then lifted up with tweezers in Reference Example 1-33.
  • 13 shows stereomicroscope and fluorescent microscope photographs showing the combined state of an RPE sheet and a re-sheeted neural retina in Reference Example 1-33.
  • 13 shows stereomicroscope and fluorescent microscopic photographs showing the process of examining the combination of an RPE sheet and a Transwell mesh in Reference Example 1-33.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram and photographs illustrating the results of a study on the discharge of unnecessary hydrogel using a cell sifter in Reference Example 1-34. Photographs showing the process of preparing a flattened sheet on a temperature-sensitive culture dish and peeling it off in Reference Example 1-35.
  • 112 shows human iPS cells (LPF11 strain) seeded at various cell densities and patterned cultured in Reference Example 2-2. The results are shown 1 hour, 1 day, 2 days, and 3 days after seeding.
  • 113 shows the results of immunostaining for Chx10 of human iPS cells (LPF11 strain) (20 days after seeding) seeded at various cell densities and patterned in Reference Example 2-2.
  • BMP(+) indicates patterning culture in the presence of BMP4, and BMP(-) indicates patterning culture in the absence of BMP4.
  • 114 shows the results of varying the duration of exposure to Y-27632 in patterning culture of human iPS cells (LPF11 strain) in Reference Example 2-3. Bright field microscopy images and immunostaining results for Chx10 are shown 20 days after seeding.
  • 115 shows the results of varying the duration of Y-27632 exposure in patterning culture of human iPS cells (DSP-SQ strain) in Reference Example 2-3. The results of immunostaining of Chx10 on the 20th day after seeding are shown.
  • 116 shows the results of changing the BMP4 concentration in patterning culture of human iPS cells (LPF11 strain) in Reference Example 2-4.
  • FIG. 117 shows the expression of Chx10 and Rx (retinal progenitor cell marker genes) and Emx2 (non-target cell marker gene) in human iPS cells (LPF11 line) patterned and cultured at various BMP4 concentrations in Reference Example 2-4.
  • Figure 118 shows the expression of marker genes in cells cultured in the patterning culture method of WO2023/003025 (white) and the patterning culture method of Reference Example 2 (black) in Reference Example 2. The left side of the dashed line is the neural retina marker gene, and the right side is the non-target cell marker gene.
  • FIG. 119 shows an experimental outline of Example 1.
  • Figure 120 is a bright-field micrograph showing the morphology of aggregates formed in Example 1 on days 3, 13, and 23 after seeding in three-dimensional culture from a retinal progenitor cell sheet on day 20 of patterning culture.
  • Figure 121 is a confocal laser microscope photograph showing immunostained images (Chx10, Pax6, Rx, Crx, ZO-1) of aggregates formed 23 days after seeding in three-dimensional culture in Example 1, in which a retinal progenitor cell sheet on the 20th day of patterning culture was dispersed into single cells.
  • FIG. 122 shows an experimental outline of Example 2.
  • Figure 123 is a bright-field micrograph showing the morphology of aggregates formed in Example 2 on days 3, 13, and 23 after seeding in two-dimensional culture from a retinal progenitor cell sheet on day 20 of patterning culture.
  • Figure 124 is a confocal laser microscope photograph showing immunostained images (Chx10, Pax6, Rx, Crx, ZO-1) of aggregates formed 23 days after seeding in two-dimensional culture in Example 2, in which a retinal progenitor cell sheet on the 20th day of patterning culture was dispersed into single cells.
  • FIG. 125 shows an experimental outline of Example 3.
  • FIG. 125 shows an experimental outline of Example 3.
  • Figure 126 shows the results of dispersing a retinal progenitor cell sheet on day 20 of patterning culture into single cells and purifying a CD9-positive cell fraction in Example 3.
  • Figure 127 is a bright field micrograph (right) showing the morphology of aggregates formed 23 days after seeding under 3D culture from CD9-positive cells sorted from a retinal progenitor cell sheet on day 20 of patterning culture in Example 3, and a confocal laser microscope photograph (left) showing immunostained images (Chx10, Pax6, Rx, Crx, ZO-1).
  • Figure 128 shows the results of measuring the expression levels of Rx (neural retina marker) and Emx2 (dorsal telencephalon marker) by real-time PCR for aggregates formed from CD9-positive cells sorted from a retinal progenitor cell sheet in Example 3.
  • FIG. 129 shows an experimental outline of Example 4.
  • Figure 130 shows a bright field micrograph (right) showing the morphology of aggregates formed 23 days after seeding under two-dimensional culture from CD9-positive cells sorted from a retinal progenitor cell sheet on day 20 of patterning culture in Example 4, and a confocal laser microscope photograph (left) showing immunostained images (Chx10, Pax6, Rx, Crx, ZO-1).
  • Figure 131 is a bright-field micrograph showing the morphology of aggregates formed 23 days after seeding in 3D culture in the presence of Y27632 (final concentration 0 or 10 ⁇ M), SAG (final concentration 0, 150, 300, or 600 nM), and CHIR99021 (final concentration 0, 1.5, 3, or 6 ⁇ M) in Example 5, in which a retinal progenitor cell sheet on day 20 of patterning culture was dispersed into single cells.
  • Y27632 final concentration 0 or 10 ⁇ M
  • SAG final concentration 0, 150, 300, or 600 nM
  • CHIR99021 final concentration 0, 1.5, 3, or 6 ⁇ M
  • Figure 132 is a bright-field micrograph showing the morphology of aggregates formed 23 days after seeding in 3D culture in the presence of Y27632 (final concentration 10 ⁇ M), SAG (final concentration 300 nM), and CHIR99021 (final concentrations 0, 1.5, 3, or 6 ⁇ M) in Example 5, in which a retinal progenitor cell sheet on day 20 of patterning culture was dispersed into single cells.
  • Stem cells refer to undifferentiated cells that have differentiation and proliferation capabilities (particularly self-renewal capabilities). Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells, depending on their differentiation capabilities.
  • Pluripotent stem cells refer to stem cells that can be cultured in vitro and have the ability (pluripotency) to differentiate into all cell lineages belonging to the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm) and/or extraembryonic tissues.
  • Multipotent stem cells refer to stem cells that have the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, but not all types.
  • Unipotent stem cells refer to stem cells that have the ability to differentiate into specific tissues and cells.
  • pluripotent stem cells can be derived from fertilized eggs, cloned embryos, germline stem cells, tissue stem cells, somatic cells, etc.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), EG cells (embryonic germ cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • Muse cells multi-lineage differentiating stress ending cells obtained from mesenchymal stem cells (MSCs) and GS cells created from germ cells (e.g. testes) are also included in pluripotent stem cells.
  • Embryonic stem cells Human embryonic stem cells were established in 1998 and are being used in regenerative medicine. Embryonic stem cells can be produced by culturing inner cell aggregates on feeder cells or in a medium containing bFGF. Methods for producing embryonic stem cells are described in, for example, WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718, etc. Embryonic stem cells can be obtained from a designated institution, and can also be purchased commercially. For example, human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2, and KhES-3 are available from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University. Human embryonic stem cells Crx::Venus and Rx::Venus (both derived from KhES-1) are available from the National Institute of Physical and Chemical Research.
  • “Induced pluripotent stem cells” are cells whose pluripotency has been induced by reprogramming somatic cells using known methods.
  • induced pluripotent stem cells in mouse cells (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676).
  • induced pluripotent stem cells were also established in human fibroblast cells, and they have the same pluripotency and self-renewal ability as embryonic stem cells (Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106).
  • induced pluripotent stem cells include cells in which pluripotency is induced by reprogramming somatic cells differentiated into fibroblasts or peripheral blood mononuclear cells through the expression of any combination of multiple genes selected from a group of reprogramming genes including Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb, etc.
  • Preferred combinations of reprogramming factors include (1) Oct3/4, Sox2, Klf4, and Myc (c-Myc or L-Myc), and (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28, and L-Myc (Stem Cells, 2013;31:458-466).
  • induced pluripotent stem cells can also be induced from somatic cells by adding chemical compounds (Science, 2013, 341, pp. 651-654).
  • induced pluripotent stem cell lines for example, human induced pluripotent cell lines such as 201B7 cells, 201B7-Ff cells, 253G1 cells, 253G4 cells, 1201C1 cells, 1205D1 cells, 1210B2 cells, and 1231A3 cells established at Kyoto University are available from Kyoto University and iPS Academia Japan Inc.
  • established induced pluripotent stem cell lines for example, Ff-I01 cells, Ff-I14 cells, and QHJI01s04 cells established at Kyoto University are available from Kyoto University.
  • the pluripotent stem cells are preferably embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, and more preferably induced pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells, preferably human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human embryonic stem cells (ES cells).
  • iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • ES cells human embryonic stem cells
  • Pluripotent stem cells such as human iPS cells can be subjected to maintenance culture and expansion culture using methods well known to those skilled in the art.
  • Nervous tissue refers to tissue composed of nervous system cells, such as the developing or adult cerebrum, midbrain, cerebellum, spinal cord, retina, peripheral nerves, forebrain, hindbrain, telencephalon, and diencephalon. Nervous tissue may form a layered epithelial structure (neuroepithelium), and the amount of neuroepithelium present in a cell aggregate can be evaluated by bright-field observation using an optical microscope.
  • nervous system cells such as the developing or adult cerebrum, midbrain, cerebellum, spinal cord, retina, peripheral nerves, forebrain, hindbrain, telencephalon, and diencephalon.
  • Nervous tissue may form a layered epithelial structure (neuroepithelium), and the amount of neuroepithelium present in a cell aggregate can be evaluated by bright-field observation using an optical microscope.
  • Neural cells refers to cells of ectoderm-derived tissues other than epidermal cells. In other words, it includes cells such as neural progenitor cells, neurons (nerve cells), glia, neural stem cells, neuronal progenitor cells, and glial progenitor cells. Neural cells also include cells that make up the retinal tissue described below (retinal cells), retinal progenitor cells, retinal layer-specific nerve cells, neural retinal cells, and retinal pigment epithelial cells. Neural cells can be identified using markers such as nestin, TuJ1, PSA-NCAM, and N-cadherin.
  • Neuronal cells are functional cells that form neural circuits and contribute to signal transmission, and can be identified using the expression of immature neuronal markers such as TuJ1, Dcx, and HuC/D, and/or mature neuronal markers such as Map2 and NeuN.
  • Neural precursor cells are a collection of precursor cells, including neural stem cells, neuronal precursor cells, and glial precursor cells, and have the ability to proliferate and produce neurons and glia. Neural precursor cells can be identified using markers such as Nestin, GLAST, Sox2, Sox1, Musashi, and Pax6. Alternatively, cells that are positive for neural cell markers and proliferation markers (Ki67, pH3, MCM) can also be identified as neural precursor cells.
  • Retinal tissue refers to tissue in which one or more types of retinal cells that make up each retinal layer in a living retina exist in a certain order
  • neural retina refers to retinal tissue that includes the inner neural retinal layer, which does not include the retinal pigment epithelium layer, among the retinal layers described below.
  • Retinal cells refers to cells that make up each retinal layer in a living retina, or their precursor cells.
  • Retinal cells include, but are not limited to, photoreceptors (rod photoreceptors, cone photoreceptors), horizontal cells, amacrine cells, interneurons, retinal ganglion cells (ganglion cells), bipolar cells (rod bipolar cells, cone bipolar cells), Müller glial cells, retinal pigment epithelial (RPE) cells, ciliary bodies, their precursor cells (e.g. photoreceptor precursor cells, bipolar cell precursor cells, retinal pigment epithelial precursor cells, etc.), neural retinal precursor cells, retinal precursor cells, etc.
  • precursor cells e.g. photoreceptor precursor cells, bipolar cell precursor cells, retinal pigment epithelial precursor cells, etc.
  • the cells that make up the neural retinal layer specifically include photoreceptor cells (rod photoreceptor cells, cone photoreceptor cells), horizontal cells, amacrine cells, interneuron cells, retinal ganglion cells (ganglion cells), bipolar cells (rod bipolar cells, cone bipolar cells), Müller glial cells, and their precursor cells (e.g. photoreceptor precursor cells, bipolar cell precursor cells, etc.).
  • neural retinal cells do not include retinal pigment epithelial cells and ciliary body cells.
  • “Mature retinal cells” refers to cells that can be contained in the retinal tissue of human adults, specifically, differentiated cells such as photoreceptors (rod photoreceptors, cone photoreceptors), horizontal cells, amacrine cells, interneurons, retinal ganglion cells (ganglion cells), bipolar cells (rod bipolar cells, cone bipolar cells), Müller glial cells, retinal pigment epithelial (RPE) cells, and ciliary cells.
  • “Immature retinal cells” refers to precursor cells that are committed to differentiating into mature retinal cells (e.g., photoreceptor precursor cells, bipolar cell precursor cells, retinal precursor cells, etc.).
  • Photoreceptor precursor cells horizontal cell precursor cells, bipolar cell precursor cells, amacrine cell precursor cells, retinal ganglion cell precursor cells, Müller glial precursor cells, and retinal pigment epithelial precursor cells refer to precursor cells that are committed to differentiating into photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, Müller glial cells, and retinal pigment epithelial cells, respectively.
  • Retinal progenitor cells refer to precursor cells that can differentiate into any immature retinal cell, such as photoreceptor precursor cells, horizontal cell precursor cells, bipolar cell precursor cells, amacrine cell precursor cells, retinal ganglion cell precursor cells, Müller glial cells, and retinal pigment epithelial precursor cells, and ultimately, precursor cells that can differentiate into any mature retinal cell, such as photoreceptors, rod photoreceptors, cone photoreceptors, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal ganglion cells, and retinal pigment epithelial cells.
  • Neural retinal progenitor cells refer to precursor cells that can differentiate into any immature neural retinal cell, such as photoreceptor precursor cells, horizontal cell precursor cells, bipolar cell precursor cells, amacrine cell precursor cells, retinal ganglion cell precursor cells, and Muller glial cells, and ultimately, can differentiate into any mature neural retinal cell, such as photoreceptors, rod photoreceptors, cone photoreceptors, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and retinal ganglion cells. Neural retinal progenitor cells do not have the ability to differentiate into retinal pigment epithelial cells.
  • photoreceptor cells exist in the photoreceptor layer of the retina and have the role of absorbing light stimuli and converting them into electrical signals.
  • photoreceptor cells There are two types of photoreceptor cells: cones that function in bright places and rods that function in dark places (called cone photoreceptors and rod photoreceptors, respectively).
  • cone photoreceptor cells include S cone photoreceptor cells that express S-opsin and receive blue light, L cone photoreceptor cells that express L-opsin and receive red light, and M cone photoreceptor cells that express M-opsin and receive green light.
  • Photoreceptor cells differentiate and mature from photoreceptor precursor cells.
  • a cell is a photoreceptor cell or a photoreceptor precursor cell by, for example, the expression of cell markers (Crx and Blimp1 expressed in photoreceptor precursor cells, Recoverin expressed in photoreceptor cells, rhodopsin, S-Opsin, and M/L-Opsin expressed in mature photoreceptor cells, etc.) described below, the formation of an outer segment structure, etc.
  • the photoreceptor precursor cells are Crx-positive cells
  • the photoreceptor cells are rhodopsin, S-Opsin, and M/L-Opsin-positive cells.
  • the rod photoreceptor cells are NRL and Rhodopsin-positive cells.
  • the S cone photoreceptor cells are S-opsin-positive cells
  • the L cone photoreceptor cells are L-opsin-positive cells
  • the M cone photoreceptor cells are M-opsin-positive cells.
  • neural retinal cell markers neural retinal cell markers
  • neural retinal markers neural retinal cell markers
  • proportion of neural retinal cell marker-positive cells in a cell population or tissue can be easily confirmed by a person skilled in the art.
  • a method using an antibody, a method using a nucleic acid primer, and a method using a sequence reaction can be mentioned.
  • the expression of the protein of the neural retinal cell marker can be confirmed by dividing the number of cells positive for a specific neural retinal cell marker by the total number of cells, for example, by flow cytometry (FACS) using a commercially available antibody, immunostaining, etc.
  • FACS flow cytometry
  • the expression of the RNA of the neural retinal cell marker can be confirmed, for example, by the PCR method, semi-quantitative PCR method, or quantitative PCR method (e.g., real-time PCR method).
  • the expression of the RNA of the neural retinal cell marker can be confirmed, for example, by using a nucleic acid sequencer (e.g., next-generation sequencer).
  • Neural retinal cell markers include Rx (also called Rax) and PAX6 expressed in retinal progenitor cells, Rx, PAX6 and Chx10 (also called Vsx2) expressed in neural retinal progenitor cells, Crx and Blimp1 expressed in photoreceptor progenitor cells, etc.
  • Chx10 which is strongly expressed in bipolar cells, PKC ⁇ , Go ⁇ , VSX1 and L7 expressed in bipolar cells, TuJ1 and Brn3 expressed in retinal ganglion cells, Calretinin and HPC-1 expressed in amacrine cells, Calbindin expressed in horizontal cells, Recoverin expressed in photoreceptor cells and photoreceptor progenitor cells, Rhodopsin expressed in rod cells, Rod photoreceptor cells and Examples of such antigens include Nrl expressed in rod photoreceptor precursor cells, S-opsin and LM-opsin expressed in cone photoreceptor cells, RXR- ⁇ expressed in cone cells, cone photoreceptor precursor cells and ganglion cells, TR ⁇ 2, OTX2 and OC2 expressed in cone photoreceptor cells or their precursor cells that appear in the early differentiation stage among cone photoreceptor cells, and Pax6 expressed in common in horizontal cells, amacrine cells and ganglion cells.
  • “Positive cells” refer to cells that express a particular marker on the cell surface or intracellularly.
  • Chx10 positive cells refer to cells that express Chx10 protein.
  • Retinal pigment epithelial cells refers to epithelial cells present outside the neural retina in a living retina. Whether a cell is a retinal pigment epithelial cell can be easily confirmed by a person skilled in the art, for example, by the expression of cell markers (MITF, Pax6, PMEL17, TYRP1, TRPM1, ALDH1A3, GPNMB, RPE65, CRALBP, MERTK, BEST1, TTR, etc.), the presence of melanin granules (black-brown), tight junctions between cells, characteristic polygonal/cobblestone cell morphology, etc.
  • cell markers MIRF, Pax6, PMEL17, TYRP1, TRPM1, ALDH1A3, GPNMB, RPE65, CRALBP, MERTK, BEST1, TTR, etc.
  • the retinal pigment epithelial cells are RPE65-positive cells, MITF-positive cells, or RPE65-positive and MITF-positive cells.
  • Retinal pigment epithelial cell sheet refers to a monolayer or multilayer sheet-like structure consisting of single or multiple retinal pigment epithelial cells that are biologically bonded to each other at least in two dimensions.
  • Retinal layers refers to the layers that make up the retina, and specifically includes the retinal pigment epithelium layer, photoreceptor layer, outer limiting membrane, outer nuclear layer, outer plexiform layer, inner nuclear layer, inner plexiform layer, ganglion cell layer, nerve fiber layer, and inner limiting membrane.
  • Neuronal retinal layer refers to each layer that constitutes the neural retina, and specifically includes the photoreceptor layer, outer limiting membrane, outer nuclear layer, outer plexiform layer, inner nuclear layer, inner plexiform layer, ganglion cell layer, nerve fiber layer, and inner limiting membrane.
  • Photoreceptor layer refers to the retinal layer that is formed on the outermost side of the neural retina and contains a large amount of one or more types of cells selected from the group consisting of photoreceptors (rod photoreceptors, cone photoreceptors), photoreceptor precursor cells, and retinal progenitor cells. Each layer other than the photoreceptor layer is called an inner layer. It can be confirmed which retinal layer each cell constitutes by a known method, such as the presence or absence of expression or the degree of expression of a cell marker.
  • the layer containing the proliferating neural retinal precursor cells is called the "neuroblastic layer", and there is an inner neuroblastic layer and an outer neuroblastic layer.
  • the neutral layer there is an inner neuroblastic layer and an outer neuroblastic layer.
  • Ciliary body includes the developing and adult “ciliary body”, “ciliary margin” and “ciliary body”. Markers of the “ciliary body” include Zic1, MAL, HNF1beta, FoxQ1, CLDN2, CLDN1, GPR177, AQP1 and AQP4.
  • the "ciliary marginal zone (CMZ)" can be, for example, a tissue that exists in the boundary region between the neural retina and the retinal pigment epithelium in a living retina, and can be an area that contains retinal tissue stem cells (retinal stem cells).
  • the ciliary margin is also called the ciliary margin or retinal margin, and the ciliary margin, ciliary margin and retinal margin are equivalent tissues.
  • the ciliary body margin is known to play an important role in supplying retinal progenitor cells and differentiated cells to retinal tissue, maintaining retinal tissue structure, and the like.
  • Marker genes for the ciliary body margin include, for example, the Rdh10 gene (positive), the Otx1 gene (positive), and the Zic1 (positive).
  • the "ciliary body margin-like structure" refers to a structure similar to the ciliary body margin.
  • Cerebral tissue refers to tissue in which one or at least multiple types of cells constituting the fetal or adult cerebrum (e.g., cortical neural precursor cells, dorsal cerebral nervous system precursor cells, ventral cerebral nervous system precursor cells, cerebral layer structure-specific nerve cells (neurons), layer I neurons, layer II neurons, layer III neurons, layer IV neurons, layer V neurons, layer VI neurons, glial cells (astrocytes and oligodendrocytes), their precursor cells, etc.) are arranged three-dimensionally in layers.
  • the fetal cerebrum is also called the forebrain or telencephalon.
  • the presence of each cell can be confirmed by known methods, such as the presence or absence or the degree of expression of cell markers.
  • Cerebral layers refers to each layer that constitutes the adult or fetal cerebrum, specifically including the molecular layer, external granular layer, external pyramidal cell layer, internal granular layer, neuronal cell layer (inner pyramidal cell layer), polymorphic cell layer, first layer, second layer, third layer, fourth layer, fifth layer, sixth layer, cortical zone, intermediate zone, subventricular zone, and ventricular zone.
  • Cerebral nervous system precursor cells include neuron precursor cells, layer 1 neuron precursor cells, layer 2 neuron precursor cells, layer 3 neuron precursor cells, layer 4 neuron precursor cells, layer 5 neuron precursor cells, layer 6 neuron precursor cells, astrocyte precursor cells, oligodendrocyte precursor cells, etc.
  • Each cell is a precursor cell that is determined to differentiate into layer 1 neurons, layer 2 neurons, layer 3 neurons, layer 4 neurons, layer 5 neurons, layer 6 neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.
  • “Cerebral nervous system progenitor cells” include multipotent stem cells (multipotent neural stem cells) that have the ability to differentiate (multi-differentiation ability) into at least several of the following lineages: layer I neurons, layer II neurons, layer III neurons, layer IV neurons, layer V neurons, layer VI neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.
  • Cerebral layer-specific neurons refers to cells that make up the cerebral layer and are specific to the cerebral layer. Examples of cerebral layer-specific neurons include layer 1 neurons, layer 2 neurons, layer 3 neurons, layer 4 neurons, layer 5 neurons, layer 6 neurons, cerebral excitatory neurons, and cerebral inhibitory neurons.
  • Cerebral cell markers include FoxG1 (also known as Bf1) expressed in cerebral cells, Sox2 and Nestin expressed in cerebral nervous system progenitor cells, Pax6 and Emx2 expressed in dorsal cerebral nervous system progenitor cells, Dlx1, Dlx2 and Nkx2.1 expressed in ventral cerebral nervous system progenitor cells, Tbr2, Nex and Svet1 expressed in neuronal progenitor cells, Tbr1 expressed in layer 6 neurons, Ctip2 expressed in layer 5 neurons, ROR ⁇ expressed in layer 4 neurons, Cux1 or Brn2 expressed in layer 3 or layer 2 neurons, and Reelin expressed in layer 1 neurons.
  • FoxG1 also known as Bf1 expressed in cerebral cells
  • Sox2 and Nestin expressed in cerebral nervous system progenitor cells Pax6 and Emx2 expressed in dorsal cerebral nervous system progenitor cells
  • Dlx1, Dlx2 and Nkx2.1 expressed in ventral cerebral nervous system progenitor cells Tbr2, Nex and Svet1
  • cell aggregate is not particularly limited as long as it is a three-dimensional structure formed by adhesion of multiple cells, and refers to, for example, a mass formed by the gathering of cells dispersed in a medium such as a culture medium, or a mass of cells formed through cell division. Cell aggregates also include those that form a specific tissue.
  • Spherical cell aggregate refers to a cell aggregate having a three-dimensional shape close to a sphere.
  • a three-dimensional shape close to a sphere is a shape having a three-dimensional structure, and examples of such shapes include a spherical shape that is circular or elliptical when projected onto a two-dimensional surface, and a shape formed by the fusion of multiple spherical shapes (for example, a shape formed by two to four overlapping circular or elliptical shapes when projected onto a two-dimensional surface).
  • the core of the aggregate has a vesicular layered structure, and is characterized by being observed under a bright-field microscope with a dark center and a bright outer edge.
  • Epithelial tissue refers to tissue formed by cells tightly covering the surface of the body, lumen (such as the digestive tract), and body cavity (such as the pericardial cavity). Cells forming epithelial tissue are called epithelial cells. Epithelial cells have apical-basal polarity. Epithelial cells can form strong bonds between themselves through adherens junctions and/or tight junctions to form cell layers. Epithelial tissue is a tissue formed by stacking one to a dozen or so cell layers. Tissues that can form epithelial tissue include fetal and/or adult retinal tissue, cerebrospinal tissue, ocular tissue, and neural tissue. The neural retina in this specification is also epithelial tissue. "Epithelial structure” refers to a structure that epithelial tissue has characteristically (e.g., having basal and apical polarity).
  • Continuous epithelial tissue refers to tissue having a continuous epithelial structure.
  • a continuous epithelial structure refers to a state in which epithelial tissue is continuous.
  • a continuous epithelial tissue refers to a state in which, for example, 10 cells to 10 cells are lined up in the tangential direction of the epithelial tissue, preferably 30 cells to 10 cells, and more preferably 10 cells to 10 cells are lined up in the tangential direction.
  • the continuous epithelial structure formed in retinal tissue has an apical surface characteristic of epithelial tissue, and the apical surface is formed on the surface of the retinal tissue generally parallel to and continuous with at least the photoreceptor layer (outer nuclear layer) among the layers that form the neural retina.
  • the apical surface is formed on the surface of the aggregate, and 10 or more, preferably 30 or more, more preferably 100 or more, and even more preferably 400 or more photoreceptor cells or photoreceptor precursor cells are regularly and continuously arranged in the tangential direction to the surface.
  • epithelial tissue is polarized to form an "apical surface," a “basal surface,” and a “basement membrane.”
  • Basal membrane refers to the layer on the basal side (basement membrane) produced by epithelial cells, contains a lot of laminin and type IV collagen, and has a thickness of 50 to 100 nm.
  • Basal surface refers to the surface (superficial surface) formed on the “basement membrane” side.
  • “Apical surface” refers to the surface (superficial surface) formed on the opposite side to the “basement membrane.” In one aspect, “apical surface” refers to the surface in contact with the photoreceptor layer (outer nuclear layer) where the outer limiting membrane is formed and photoreceptors and photoreceptor precursor cells are present in retinal tissue at a developmental stage where photoreceptors or photoreceptor precursor cells can be found, in which the outer limiting membrane is formed and the photoreceptor layer (outer nuclear layer) where the photoreceptors and photoreceptor precursor cells are present.
  • apical surfaces can be identified by immunostaining methods well known to those skilled in the art using antibodies against apical surface markers (e.g., atypical PKC (hereinafter abbreviated as "aPKC”), tight junction marker (Zo-1), ERM proteins Ezrin, E-cadherin, and N-cadherin).
  • aPKC atypical PKC
  • Zo-1 tight junction marker
  • ERM proteins Ezrin E-cadherin
  • E-cadherin E-cadherin
  • N-cadherin N-cadherin
  • One aspect of the present invention is a method for producing a cell aggregate containing retinal tissue having an epithelial structure (or a multi-layered structure) from a dispersed retinal cell population (herein, a "cell aggregate containing retinal tissue” may be simply referred to as "retinal tissue”), which comprises subjecting a dispersed retinal cell population to suspension or adhesion culture in a medium containing a substance acting on the Wnt signaling pathway.
  • the retinal system cells are as defined above.
  • the retinal system cells include one or more types of cells selected from the group consisting of retinal progenitor cells and photoreceptor progenitor cells, and may also include other cells such as photoreceptors (rod photoreceptors, cone photoreceptors), horizontal cells, amacrine cells, retinal ganglion cells (ganglion cells), bipolar cells (rod bipolar cells, cone bipolar cells), and Müller glial cells.
  • the retinal system cells are preferably neural retinal system cells. .
  • the retinal cells derived from pluripotent stem cells as starting cells in the production method of the present invention can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • the retinal cell population as starting cells is (1) Seeding pluripotent stem cells into region A on a culture substrate having, on its surface, a region A having cell adhesiveness and a region B adjacent to at least a portion of region A and having lower cell adhesiveness than region A; (2) culturing the pluripotent stem cells seeded in step (1) in a medium containing a ROCK inhibitor; (3) culturing the cells obtained after step (2) in a medium containing a substance acting on the BMP signaling pathway to obtain retinal tissue; and (4) dispersing the retinal tissue obtained in step (3) to obtain a dispersed retinal cell population.
  • Region A is a region where pluripotent stem cells can be maintained in adhesion culture.
  • Region B is a region with lower cell adhesiveness than region A to such an extent that, when pluripotent stem cells are seeded in region A, the cells do not spread into region B adjacent to region A during induction of differentiation into retinal tissue (i.e., the period until differentiation into retinal tissue can be confirmed).
  • Comparison of cell adhesiveness can be performed by seeding an excess amount (e.g., 5 ⁇ 10 5 to 10 ⁇ 10 5 cells/cm 2 ) of pluripotent stem cells relative to the area, culturing at 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours, and then comparing the ratio of the area to which the cells adhere.
  • the cell adhesiveness is usually evaluated after removing the medium after 24 hours of culture, washing the cells with medium or buffer solution, and removing unadhered cells.
  • Region A may be, for example, a region where pluripotent stem cells are seeded in an excess amount relative to the area (e.g., 5 x 10 to 10 x 10 cells/cm), and after culturing for 24 hours at 37°C and 5% CO2 , the cells adhere to 70% or more, 80% or more, or 90% or more of the area.
  • region B is a cell non-adhesive region.
  • a cell non-adhesive region means a region that does not have sufficient cell adhesiveness to maintain pluripotent stem cells in adherent culture.
  • a cell non-adhesive region may be, for example, a region in which cells adhere to 30% or less, 20% or less, or 10% or less of the area after seeding pluripotent stem cells in an excess amount relative to the area (e.g., 5 ⁇ 10 5 to 10 ⁇ 10 5 cells/cm 2 ) and culturing for 24 hours at 37° C. and 5% CO 2.
  • the culture substrate may be made of any material as long as it is possible to form regions A and B on its surface.
  • the culture substrate may be made of inorganic materials such as metal, glass, and silicone, or organic materials such as plastics (e.g., polystyrene resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, polyvinyl chloride resin, polytetrafluoroethylene tetrafluoroethylene resin).
  • the culture substrate is glass or plastic, particularly polystyrene resin.
  • the culture substrate may have any shape generally used for cell culture, and is not particularly limited.
  • the culture substrate may be, for example, a culture vessel such as a petri dish, a plate, a bottle, a chamber, a multi-well plate (e.g., a 6-, 12-, 24-, 48-, 96-, or 384-well plate), a film, or a porous membrane.
  • the culture substrate usually has region A and region B on a surface that is horizontal to the direction of gravity (on the bottom surface in the case of a culture vessel). In one embodiment, the culture substrate has region A and region B on the same plane. In one embodiment, when the culture vessel has region A and region B on the plane of the bottom surface, the inner wall surface of the culture vessel is not region B.
  • the culture substrate has a convex portion on its surface and has region A on the upper surface of the convex portion
  • the side surface of the convex portion adjacent to the upper surface of the convex portion is region B, but region A on the upper surface of the convex portion and region B on the side surface of the convex portion are considered to be in the same plane.
  • Area A may be an area where the surface of a cell-adhesive culture substrate is exposed, or it may be an area where the surface of the culture substrate is coated with a cell-adhesive substance in order to impart cell adhesiveness to the surface of the culture substrate or to increase the cell adhesiveness of the surface of the culture substrate.
  • cell adhesive substances include positively charged polymers such as poly-L-lysine and poly-L-ornithine; laminin; collagens such as type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, type V collagen, and type VII collagen; tenascin; fibrillin; fibronectin; vitronectin; elastin; entactin; proteoglycans composed of sulfated glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, and dermatan sulfate, and core proteins; glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, and hyaluronic acid; Synthemax (registered trademark, a vitronectin derivative), Matrigel (registered trademark), and the like.
  • region A is coated with laminin.
  • Laminin is a heterotrimeric molecule consisting of three subunit chains, an ⁇ chain, a ⁇ chain, and a ⁇ chain. There are five known types of ⁇ chains, ⁇ 1 to ⁇ 5, three known types of ⁇ chains, ⁇ 1 to ⁇ 3, and three known types of ⁇ chains, ⁇ 1 to ⁇ 3. Each laminin isoform is represented by a number indicating the constituent subunits (for example, laminin 111 is composed of an ⁇ 1 chain, a ⁇ 1 chain, and a ⁇ 1 chain).
  • Laminins include laminin 111, laminin 121, laminin 211, laminin 213, laminin 222, laminin 311 (laminin 3A11), laminin 332 (laminin 3A32), laminin 321 (laminin 3A21), laminin 3B32, laminin 411, laminin 421, laminin 423, laminin 511, laminin 521, laminin 522, laminin 523, or fragments thereof. Fragments of laminins include E8 fragments, which are fragments of the integrin binding site, such as laminin 211-E8, laminin 311-E8, laminin 411-E8, laminin 511-E8, and the like.
  • the laminin is laminin 511 or a fragment thereof. In a further embodiment, the laminin is a laminin 511-E8 fragment.
  • commercially available products such as iMatrix-511 (Nippi, Inc.) can be used.
  • iMatrix-511 (Nippi, Inc.) contains the laminin 511-E8 fragment.
  • Region B may be an exposed region of the culture substrate having a lower cell adhesiveness than region A, or may be a region in which the surface of the culture substrate is coated with some substance to make the region have a lower cell adhesiveness than region A. In one embodiment, region B is coated with a cell non-adhesive substance.
  • cell non-adhesive substances examples include MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) polymer; celluloses such as methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and sodium carboxymethylcellulose; polyethylene oxide; carboxyvinyl polymer; polyvinylpyrrolidone; polyethylene glycol; polyamides such as polyacrylamide and poly-N-isopropylacrylamide; polysaccharides such as chitin, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, starch, pectin, carrageenan, guar gum, gum arabic, and dextran; albumin and derivatives thereof.
  • the cell non-adhesive substance is an MPC polymer.
  • region A is not particularly limited, and examples thereof include a circle, an ellipse, and a polygon (e.g., a triangle, a rectangle, a pentagon, a hexagon, an octagon, a decagon, a dodecagon, etc.).
  • region A is a circle.
  • a circle is used to mean a shape that is recognized in the art as being substantially circular, and is used to mean an approximately circular shape including a perfect circle.
  • the area of region A may be, for example, but is not limited to, 0.01 to 100 cm 2 , 0.01 to 30 cm 2 , 0.01 to 10 cm 2 , 0.03 to 30 cm 2 , 0.03 to 10 cm 2 , or 0.1 to 10 cm 2 . In one embodiment, the area of region A is greater than or equal to 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1 cm2, and less than or equal to 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 , or 1 cm2 (the upper and lower limits are independently selected).
  • the area of region A can be 0.5-10 cm2 , 0.7-10 cm2 , 1-10 cm2 , 0.5-5 cm2 , 0.7-5 cm2 , 1-5 cm2 , 0.5-2 cm2 , 0.7-2 cm2 , 0.5-1 cm2, or 0.7-1 cm2 .
  • Area A may be circular or polygonal with an area equivalent thereto, with a diameter of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, or 1 cm or more, and 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 cm or less (the upper and lower limits are independently selected).
  • area A is circular with a diameter of 0.1-10 cm, 0.1-5 cm, 0.1-3 cm, or 0.2-1 cm. In a further embodiment, area A is circular with a diameter of 1-10 cm, 1-5 cm, or 1-3 cm.
  • Area A is adjacent to region B at least in part. In one embodiment, the entire outer edge of region A is adjacent to region B (i.e., surrounded by region B).
  • the culture substrate may have multiple regions A and/or multiple regions B on its surface. When the culture substrate includes multiple regions A on its surface, the distance between two regions A that sandwich region B is, but is not limited to, about 1 mm or more, for example.
  • Area A and area B may be formed on the surface of the culture substrate by any method used for cell patterning. Area A and area B can be formed on the surface of the culture substrate by techniques such as soft lithography, photolithography, and 3D printing.
  • Regions A and B can be formed by treating a portion of the surface of the culture substrate to make the cellular adhesiveness of the treated and untreated regions different. Regions A and B can be formed, for example, by coating a portion of the surface of the culture substrate with a cell adhesive or non-cell adhesive substance. For example, it is conceivable to mask a portion of the surface of the culture substrate and coat the unmasked region with a cell adhesive or non-cell adhesive substance. Alternatively, a layer of a cell adhesive or non-cell adhesive substance may be formed on the culture substrate, and a portion of the layer may be treated to change the cellular adhesiveness. The treated portion may be an exposed portion of the surface of the culture substrate, or a portion in which the properties of the cell non-adhesive or cell adhesive substance have been changed by the treatment.
  • a sheet having holes of the shape and size of region A can be created using a mold printed with a 3D printer, the surface of the culture substrate can be covered with this sheet, the surface not covered with the sheet can be coated with a cell adhesive substance, and then the sheet can be removed to form region A and region B on the culture substrate.
  • a sheet of the shape and size of region A can be created, placed on the surface of the culture substrate, the surface not covered with the sheet can be coated with a cell non-adhesive substance, and then the sheet can be removed and the surface covered with the sheet can be coated with a cell adhesive substance to form region A and region B on the culture substrate.
  • the sheet can be formed from a biocompatible material such as polydimethylsiloxane (PDMS), polyethylene glycol hydrogel, or agarose gel.
  • the coating can be performed, for example, by contacting the culture substrate with a solution of a cell adhesive substance or a cell non-adhesive substance and reacting it at 37° C. or room temperature for a required time (e.g., 1 hour or more).
  • the concentrations of the cell adhesive substance and the cell non-adhesive substance can be appropriately determined by one skilled in the art, but in the case of laminin, for example, the concentrations can be 0.1 to 1 ⁇ g/cm 2 , 0.1 to 0.5 ⁇ g/cm 2 , or about 0.25 ⁇ g/cm 2.
  • Regions A and B can also be formed on the culture substrate by forming droplets of a solution of the cell adhesive substance on the culture substrate and allowing them to react, without using the above-mentioned sheet.
  • the culture substrate may have a convex portion (also called a pillar) on its surface, and may have region A on the upper surface of the convex portion.
  • the side surface of the convex portion adjacent to the upper surface of the convex portion is designated as region B.
  • the shape of the convex portion is not particularly limited, and may be a cylinder or a prism.
  • a cylinder is used to mean a column whose cross section is substantially circular, including a perfect circle, as long as it has a shape that is recognized in the industry as being substantially circular.
  • the convex portion is cylindrical.
  • the height of the convex portion is not limited, and may be, for example, 0.1 mm to 10 mm, 0.1 mm to 5 mm, 1 mm to 5 mm, or 3 mm to 5 mm, for example, 4 mm.
  • the material of the convex portion may be the same as or different from the culture substrate.
  • Examples of materials for the convex portion include, in addition to those exemplified in this specification as materials for the culture substrate, polydimethylsiloxane (PDMS), polymethyl methacrylate (PMMA), polyethylene terephthalate (PET), polyamide (PA), polymethyl glutarimide (PMGI), polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene glycol (PEG), polyethylene vinyl acetate (PEVA), polyethylene oxide (PEO), etc.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PET polyethylene terephthalate
  • PA polyamide
  • PMGI polymethyl glutarimide
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PEG polyethylene glycol
  • PEVA polyethylene vinyl acetate
  • PEO polyethylene oxide
  • the cells may be seeded only in region A, or may be seeded over the entire culture substrate including regions A and B. For example, when region B is a non-cell-adhesive region, the cells may be seeded over the entire culture substrate.
  • the pluripotent stem cells are seeded onto the culture substrate at a cell number such that the cells occupy 70% or more of region A.
  • the pluripotent stem cells are at or above 0.5x10 , 0.6x10, 0.7x10 , 0.8x10 , 0.9x10 , 1.0x10 , 1.1x10 , 1.2x10, 1.3x10 , 1.4x10 , 1.5x10, 1.6x10, 1.7x10, 1.8x10, 1.9x10 , 2.0x10 , 2.1x10 , 2.2x10, 2.3x10 , or 2.4x10 cells/ cm2 .
  • pluripotent stem cells collected and dispersed using a cell dispersion solution containing an enzyme e.g., trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, papain
  • an enzyme e.g., trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, papain
  • a chelating agent e.g., ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the cell dispersion solution for example, commercially available products such as TrypLE TM Select (Thermo Fisher Scientific) and TrypLE TM Express (Thermo Fisher Scientific) may be used.
  • the induction of differentiation of pluripotent stem cells into retinal lineage cells is carried out by adhesion culture on the culture substrate. After seeding the pluripotent stem cells on the culture substrate, they may be cultured for a certain period of time in a medium containing factors for maintaining undifferentiation, and then the induction of differentiation of the pluripotent stem cells into retinal lineage cells may be initiated.
  • the time when the culture in a medium not containing factors for maintaining undifferentiation is initiated is regarded as the time when the induction of differentiation into retinal lineage cells is initiated.
  • inducing differentiation of pluripotent stem cells into retinal lineage cells includes culturing the pluripotent stem cells in a medium containing a substance that acts on the BMP signaling pathway.
  • the culture in the medium containing the substance that acts on the BMP signaling pathway may be started at the start of differentiation induction or may be started a certain period of time after the start of differentiation induction (e.g., 4 to 6 days).
  • Inducing differentiation of pluripotent stem cells into retinal lineage cells may include culturing the pluripotent stem cells in a medium containing a BMP signaling pathway inhibitor prior to culturing in a medium containing a BMP signaling pathway agonist. Culturing the cells in the presence of a BMP signaling pathway inhibitor prior to adding the BMP signaling pathway agonist can increase the efficiency of differentiation into retinal tissue.
  • the medium used to induce differentiation of pluripotent stem cells into retinal cells can be prepared using a medium normally used for culturing animal cells as the basal medium.
  • basal media include IMDM medium, DMEM medium, F-12 medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and mixtures thereof.
  • the medium may be a basal medium to which one or more components selected from serum, serum replacements, growth factors, undifferentiated maintenance factors, proteins (e.g., cytokines, insulin), fatty acids, lipids, vitamins, amino acids (e.g., non-essential amino acids, retinoids, glutamine, taurine), antioxidants, 2-mercaptoethanol, 1-thioglycerol, antibiotics, buffers, and inorganic salts have been added as necessary.
  • serum replacements include albumins such as bovine serum albumin (BSA), transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 1-thioglycerol, and equivalents thereof, as well as mixtures thereof.
  • the medium was KnockOut TM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific), Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX TM Supplement (Thermo Fisher Scientific), Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX TM Supplement (Thermo Fisher Scientific), B 27 Supplement (Thermo Fisher).
  • the medium may contain commercially available serum substitutes such as basal medium, N2 Supplement (Thermo Fisher Scientific), ITS Supplement (Thermo Fisher Scientific), etc.
  • the medium may be a commercially available product in which the above components are added to a basal medium, such as Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX TM Supplement (Thermo Fisher Scientific), DMEM/F-12, GlutaMAX TM supplement (Thermo Fisher Scientific), etc.
  • a basal medium such as Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX TM Supplement (Thermo Fisher Scientific), DMEM/F-12, GlutaMAX TM supplement (Thermo Fisher Scientific), etc.
  • the medium is preferably a serum-free medium.
  • Serum-free medium means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum, and also includes media containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components as long as they do not contain unconditioned or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain a serum substitute.
  • Differentiation induction is preferably performed in the absence of feeder cells (also referred to as under feeder-free conditions). Differentiation induction is also preferably performed under xeno-free conditions.
  • xeno-free means not containing components derived from a biological species different from the biological species of the cells to be cultured.
  • the undifferentiated state maintaining factor includes FGF signaling pathway active substance, TGF ⁇ family signaling pathway active substance and insulin.
  • the FGF signaling pathway active substance includes FGF (e.g., bFGF, FGF4, FGF8).
  • the FGF signaling pathway active substance and the TGF ⁇ family signaling pathway active substance include TGF ⁇ signaling pathway active substance and Nodal/Activin signaling pathway active substance.
  • the TGF ⁇ signaling pathway active substance includes TGF ⁇ 1 and TGF ⁇ 2.
  • the Nodal/Activin signaling pathway active substance includes Nodal, ActivinA and ActivinB.
  • the undifferentiated state maintaining factor preferably includes bFGF.
  • the concentration of the undifferentiated state maintenance factor may be any concentration capable of maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells, and can be appropriately set by one skilled in the art.
  • concentration of bFGF may be 4 ng to 500 ng/mL, 10 ng to 200 ng/mL, or 30 ng to 150 ng/mL.
  • Examples of media containing factors for maintaining undifferentiation include StemFit (registered trademark) AK02N (Ajinomoto Co., Inc.), StemFit (registered trademark) AK03N (Ajinomoto Co., Inc.), S-medium (DS Pharma Biomedical Co.), StemPro TM (Thermo Fisher Scientific), mTeSR1 TM (STEMCELL Technologies), mTeSR2 TM (STEMCELL Technologies), TeSR TM -E8 TM (STEMCELL Technologies), and hESF9 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008 Sep 9; 105(36):13409-14) may be used.
  • the medium containing an undifferentiated maintenance factor is StemFit (registered trademark) AK02N (Ajinomoto Co., Inc.).
  • Culturing in a medium containing an undifferentiated maintenance factor is, but is not limited to, for example, 1 to 10 days, 1 to 9 days, 1 to 8 days, 1 to 7 days, 1 to 6 days, 1 to 5 days, 1 to 4 days, 1 to 3 days, or 2 to 3 days.
  • pluripotent stem cells Prior to culturing in a medium containing a substance acting on the BMP signaling pathway, pluripotent stem cells are cultured in a medium containing a ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor may be added to a medium containing an undifferentiated maintenance factor.
  • Examples of ROCK inhibitors include Y-27632, Fasudil (HA1077), and H-1152.
  • the concentration of the ROCK inhibitor is appropriately determined depending on the type of inhibitor, and is, for example, 1 to 100 ⁇ M, 5 to 50 ⁇ M, or about 10 ⁇ M, or a concentration that shows the same activity as Y-27632 at the above concentrations.
  • the culture period in the medium containing the ROCK inhibitor is 1 hour to 16 hours, 1 hour to 14 hours, 1 hour to 12 hours, 1 hour to 10 hours, 1 hour to 8 hours, 1 hour to 6 hours, 1 hour to 4 hours, 1 hour to 3 hours, 1 hour to 2 hours, 2 hours to 16 hours, 2 hours to 14 hours, 2 hours to 12 hours, 2 hours to 10 hours, 2 hours to 8 hours, 2 hours to 6 hours, 2 hours to 4 hours, or 2 hours to 3 hours.
  • the culture period in the medium containing the ROCK inhibitor is 1 hour to 3 hours.
  • the culture period in the medium containing the undifferentiation maintenance factor and the ROCK inhibitor may be a part or the whole of the culture period in the medium containing the undifferentiation maintenance factor.
  • the cells after culturing for 1 hour to 16 hours in the medium containing the undifferentiation maintenance factor and the ROCK inhibitor, the cells may be cultured in a medium containing the undifferentiation maintenance factor but not the ROCK inhibitor until the culture period in the medium containing the undifferentiation maintenance factor reaches a predetermined culture period.
  • BMPs (bone morphogenetic proteins) include, for example, BMP2, BMP4, BMP7, and BMP12 (GDF7).
  • BMP signaling pathway agonists and BMP signaling pathway inhibitors may be agonists and inhibitors of one or more of these BMPs, respectively.
  • BMP signaling pathway inhibitors refers to substances that inhibit signal transduction mediated by BMP, and include substances that act on BMP or its receptor, substances that suppress the gene expression of BMP or its receptor, and substances that inhibit the binding between BMP and its receptor.
  • BMP signaling pathway inhibitors include LDN-193189 (4-[6-(4-Piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline), Dorsomorphin (6-[4-[2-(1-Piperizinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine), and DMH1 (4-(6-(4-isopropoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline).
  • the BMP signaling pathway inhibitor is LDN-193189.
  • the concentration of the BMP signaling pathway inhibitor is determined appropriately depending on the type of inhibitor, but is, for example, 1 to 1000 nM, 10 to 500 nM, 30 to 300 nM, or about 100 nM, or a concentration that exhibits activity equivalent to that of LDN-193189 at the above concentrations.
  • Culture in a medium containing a BMP signal inhibitor is, but is not limited to, for example, 1 to 10 days, 2 to 9 days, 3 to 7 days, 4 to 6 days, or about 5 days.
  • a substance acting on the BMP signaling pathway means a substance that enhances signaling mediated by BMP, and includes substances that act on BMP or its receptor, substances that enhance gene expression of BMP or its receptor, and substances that promote the binding of BMP to its receptor.
  • substances acting on the BMP signaling pathway include BMP2, BMP4, BMP7, BMP12 (GDF7), or fragments thereof, or anti-BMP receptor antibodies.
  • the substance acting on the BMP signaling pathway is BMP4.
  • the concentration of the substance acting on the BMP signaling pathway is appropriately determined depending on the type of the substance, and is, for example, 0.01 to 1000 nM, 0.1 to 100 nM, 1 to 10 nM, 1 to 3 nM, or about 1.5 nM, or a concentration that exhibits activity equivalent to that of BMP4 at the aforementioned concentrations.
  • the concentration of the BMP signaling pathway agent is 3 to 15 nM or 3 to 12 nM, for example, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 nM, or a concentration that exhibits activity equivalent to that of BMP4 at said concentrations.
  • the culture in the medium containing the BMP signaling pathway active substance is carried out for a period required for differentiation into retinal cells.
  • the culture period is not limited, but may be, for example, 1 to 30 days, 2 to 20 days, 3 to 15 days, 4 to 12 days, or 5 to 10 days (e.g., 5, 6, 7, 8, 9, or 10 days).
  • the concentration of the BMP signaling pathway active substance may be constant or may be changed during the culture period. For example, the concentration of the BMP signaling pathway active substance may be gradually reduced at a rate of 40 to 60% reduction every 2 to 4 days.
  • the concentration of the BMP signaling pathway active substance in the medium can be gradually reduced by replacing a part (e.g., half) of the medium with a medium not containing the BMP signaling pathway active substance every 2, 3, or 4 days.
  • a medium containing a BMP signaling pathway inhibitor or a BMP signaling pathway activator is a 1:1 mixture of F-12 medium and IMDM medium, to which KnockOut TM Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific) (e.g., 0.5% to 30%, 1% to 20%, or 10%), Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher Scientific), BSA, and 1-thioglycerol are added.
  • KnockOut TM Serum Replacement e.g. 0.5% to 30%, 1% to 20%, or 10%
  • Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific
  • BSA 2-thioglycerol
  • the medium After culturing in a medium containing a substance acting on the BMP signaling pathway, the medium may be replaced with one not containing the substance acting on the BMP signaling pathway, and culturing may be continued.
  • This culturing period is not limited, but may be, for example, 1 to 100 days, 10 to 90 days, 20 to 80 days, 30 to 70 days, 40 to 60 days, or about 50 days.
  • the cells may be cultured in a medium containing a Wnt signaling pathway inhibitor.
  • a Wnt signaling pathway inhibitor means a substance that inhibits signal transduction mediated by Wnt, and includes substances that act on Wnt or its receptor, substances that suppress gene expression of Wnt or its receptor, and substances that inhibit the binding of Wnt to its receptor.
  • inhibitors of the Wnt signaling pathway include CKI-7 (N-(2-aminoethyl)-5-chloro-8-isoquinolinesulfonamide), D4476 (4-(4-(2,3-Dihydrobenzo[1,4]dioxin-6-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)benzoamide), and IWR-1-endo (IWR1e) (4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3 a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinylbenzamide), and IWP-2 (N-(6-methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthioeno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thi
  • the medium may be replaced as appropriate. For example, part or all of the medium may be replaced every 1 to 4 days.
  • the entire medium may be replaced with a medium containing that component at a desired concentration, or part of the medium may be replaced so that the component reaches the desired final concentration (for example, half of the medium may be replaced with a medium containing twice the final concentration).
  • the concentration of that component may be constant or may be changed.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO2 concentration can be set appropriately.
  • the culture temperature is, for example, 30° C. to 40° C., or about 37° C.
  • the CO2 concentration is, for example, 1% to 10%, or about 5%.
  • Differentiation into retinal tissue can be confirmed by detecting the expression of neural retinal cell markers in cells in the tissue.
  • the neural retinal cell markers are as described above. Expression of the markers is confirmed, for example, on days 10 to 100 (e.g., days 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100) or later after differentiation induction. In one embodiment, expression of the markers is confirmed on days 16 to 22 after differentiation induction.
  • the retinal tissue as starting cells obtained by the method described herein can also be referred to as a retinal sheet, and typically contains retinal progenitor cells, and is also referred to herein as a "retinal progenitor cell sheet.”
  • the retinal tissue (retinal sheet) as starting cells has a percentage of Chx10-positive cells or a percentage of Chx10-positive and Rx-positive cells of 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • the percentage of marker-positive cells may be the percentage on day 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, or later after differentiation induction.
  • the retinal tissue has a percentage of Chx10 and Rx positive cells on days 16 to 22 (e.g., days 16, 18, or 20) of differentiation induction of 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more. In a further embodiment, the retinal tissue has a percentage of Chx10 and Rx positive cells on days 16 to 22 (e.g., days 16, 18, or 20) of differentiation induction of 90% or more, or 95% or more.
  • the retinal tissue (retinal sheet) as starting cells has a proportion of neural retinal cells of 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • the proportion of cells may be the proportion on days 16 to 100 (e.g., days 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100) of differentiation induction, or thereafter.
  • the retinal tissue preferably has cells that form a layer structure.
  • the thickness of the retinal tissue (retinal sheet) as starting cells can be 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 ⁇ m or more, or 500, 400, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, or 220 ⁇ m or less (upper and lower limits are independently selected).
  • the retinal tissue is 50 ⁇ m to 300 ⁇ m thick.
  • the retinal tissue does not need to be the same thickness throughout, and when specifying a range of thickness of the retinal tissue, it is sufficient that the thickness of any part of the retinal tissue is within that range.
  • the retinal tissue (retinal sheet) as starting cells usually has up to about 30 cells in the direction perpendicular to the culture substrate, or a thickness of 500 ⁇ m or less.
  • the retinal tissue (retinal sheet) as the starting cells is cultured by the following steps: (1) Seeding pluripotent stem cells at a density of 0.5 ⁇ 10 5 cells/cm 2 to 2.5 ⁇ 10 5 cells/cm 2 into region A on a culture substrate having , on its surface, a region A having cell adhesiveness and a region B adjacent to at least a portion of region A and having lower cell adhesiveness than region A ; (2) culturing the pluripotent stem cells seeded in step (1) in a medium containing a ROCK inhibitor for 1 to 16 hours; and (3) culturing the cells obtained after step (2) in a medium containing a substance that acts on a BMP signaling pathway to obtain a retinal tissue (retinal sheet).
  • the retinal tissue (retinal sheet) as the starting cells covers 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more of region A.
  • the method for measuring the proportion of the area covered by the retinal tissue in region A is not particularly limited, but can be measured, for example, by staining the retinal tissue.
  • the presence or absence of expression of the above-mentioned neuroretinal cell marker e.g., Chx10
  • can be stained e.g., immunostaining with fluorescently labeled anti-Chx10 antibody).
  • imaging software or the like e.g., ImageJ software (NIH)
  • NIR ImageJ software
  • retinal tissue with a high expression level of genes expressed in neuroretinal cells and a low expression level of genes expressed in non-target cells are as described above.
  • the non-target cells include eye-related cells (e.g., ciliary body, lens, retinal pigment epithelium, etc.) and brain/spinal cord-related cells (telencephalon, midbrain, spinal cord, etc.), and the markers thereof are as described above.
  • eye-related cells e.g., ciliary body, lens, retinal pigment epithelium, etc.
  • brain/spinal cord-related cells telencephalon, midbrain, spinal cord, etc.
  • the retinal tissue (retinal sheet) as the starting cells is obtained by the following method:
  • the method includes the following steps: (1) seeding pluripotent stem cells at a density of 0.5 ⁇ 10 5 cells/cm 2 to 2.5 ⁇ 10 5 cells /cm 2 in a region A on a culture substrate having, on its surface, a region A having cell adhesiveness and a region B adjacent to at least a part of the region A and having lower cell adhesiveness than the region A; (2) culturing the pluripotent stem cells seeded in step (1) in a medium containing a ROCK inhibitor for 1 to 16 hours; and (3) culturing the cells obtained after step (2) in a medium containing a substance acting on a BMP signaling pathway to obtain a retinal tissue (retinal sheet),
  • the medium in step (2) contains a factor for maintaining undifferentiation, and the medium in step (3) does not contain a factor for maintaining undifferentiation;
  • the method further comprises, after step (2), culturing the cells in a medium containing
  • the retinal tissue (retinal sheet) as the starting cells is obtained by the following method:
  • the method includes the following steps: (1) seeding pluripotent stem cells at a density of 0.5 ⁇ 10 5 cells/cm 2 to 2.5 ⁇ 10 5 cells /cm 2 in a region A on a culture substrate having, on its surface, a region A having cell adhesiveness and a region B adjacent to at least a part of the region A and having lower cell adhesiveness than the region A; (2) culturing the pluripotent stem cells seeded in step (1) in a medium containing a ROCK inhibitor for 1 to 16 hours; and (3) culturing the cells obtained after step (2) in a medium containing a BMP signaling pathway agent to obtain a retinal tissue (retinal sheet), wherein: The medium in step (2) contains a factor for maintaining undifferentiation, and the medium in step (3) does not contain a factor for maintaining undifferentiation; Step (3) is carried out for 5 to 10 days from 6 to 8 days after the sowing in step (1);
  • the retinal tissue (retinal sheet) obtained by steps (1) to (3) is dispersed as described below.
  • the retinal tissue (retinal sheet) may be dispersed without being recovered from the culture substrate, or may be dispersed after recovery from the culture substrate.
  • the retinal tissue (retinal sheet) can be recovered from the culture substrate by a conventional method.
  • the retinal tissue can be recovered with a tool such as tweezers.
  • the culture substrate is coated with a stimuli-responsive polymer (e.g., a temperature-responsive polymer or a light-responsive polymer), the retinal tissue can be recovered by applying a corresponding stimulus.
  • a stimuli-responsive polymer e.g., a temperature-responsive polymer or a light-responsive polymer
  • the retinal tissue when a temperature-responsive polymer is used, the polymer properties of which reversibly change from cell adhesive (hydrophobic) to cell non-adhesive (hydrophilic) at a certain temperature, the retinal tissue can be recovered by placing the culture substrate at that certain temperature.
  • Dispersion refers to separating cells or tissues into small cell fragments or cell clumps (2 to 100 cells, preferably 50 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less, 5 or less; for example, a clump of 2 to 5 cells) or single cells by a dispersion treatment such as an enzyme treatment or a physical treatment.
  • a dispersed cell population refers to a collection of a certain number of cell fragments or cell clumps or single cells.
  • a "dispersed retinal cell population” refers to a cell population in a dispersed state, and can be obtained by dispersing a cell clump such as a biological tissue or a cell aggregate. The dispersed retinal cell population is preferably obtained by dispersing the above-mentioned clump of retinal cells.
  • the dispersion method may be any method capable of dispersing cells alive, such as mechanical dispersion treatment, cell dispersion liquid treatment, and cell protective agent addition treatment. These treatments may be combined. Preferably, cell dispersion liquid treatment is performed first, followed by mechanical dispersion treatment.
  • Mechanical dispersion methods include pipetting or scraping with a scraper.
  • Cell dispersion liquids used in cell dispersion treatment include solutions containing enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, papain, and chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid.
  • enzymes such as trypsin, collagenase, hyaluronidase, elastase, pronase, DNase, papain, and chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid.
  • Commercially available cell dispersion liquids such as TrypLE Select (Life Technologies), TrypLE Express (Life Technologies), and nerve cell dispersion liquid (FujiFilm), can also be used.
  • cell death When cells are dispersed, cell death may be suppressed by treating the cells with a cell protective agent.
  • cell protective agents used in the cell protective agent treatment include substances acting on the FGF signaling pathway, heparin, substances acting on the IGF signaling pathway, serum, or serum substitutes.
  • a Rho-associated coiled-coil containing protein kinase (“ROCK” or "Rho kinase”) inhibitor (ROCK inhibitor) or a myosin inhibitor may be added during dispersion.
  • ROCK inhibitors include Y-27632, Fasudil (HA1077), and H-1152.
  • myosin inhibitors include blebbistatin.
  • a preferred cytoprotective agent is a ROCK inhibitor.
  • the dispersed retinal cell population includes single cells, and for example, 70% or more, preferably 80% or more of the total number of cells in the cell population are single cells, and clumps of 2 to 50 cells account for 30% or less, preferably 20% or less of the total number of cells in the cell population.
  • the dispersed retinal cell population there is almost no adhesion between cells (e.g., surface adhesion). It is also preferable that the dispersed retinal cell population is composed of single cells as much as possible, and such a dispersed retinal cell population can be obtained by removing clumps of cells that have not become single cells after the dispersion process.
  • dispersed cells are in a state in which there is almost no cell-cell bonding (e.g., adherens bonding).
  • the retinal tissue may contain unnecessary cells such as retinal pigment epithelial cells.
  • the area containing unnecessary cells such as retinal pigment epithelial cells can be separated and the retinal cell population dispersed.
  • Retinal pigment epithelial cells can be distinguished by their morphology and pigments, and can be easily excised by a person skilled in the art.
  • a step for increasing the purity of the retinal progenitor cells or neural retinal progenitor cells may be carried out as described below, and further, the dispersed retinal cell population may be maintained and expanded.
  • the medium is not particularly limited as long as it is a medium in which the retinal cells can survive and proliferate (such as DMEM medium). Since a frozen and thawed retinal cell population can also be used as the starting cells for the production method of the present invention, it is also possible to freeze and store the dispersed retinal cell population. There is no particular restriction on the freezing and storage liquid, and a commercially available freezing and storage liquid can be used.
  • a step (purification step) of increasing the proportion (purity) of retinal progenitor cells, preferably the proportion (purity) of neural retinal progenitor cells, may be performed on the dispersed retinal cell population.
  • an operation such as cell sorting using a specific marker expressed in retinal progenitor cells and/or neural retinal progenitor cells may be performed.
  • Cell sorting can be performed using well-known techniques such as FACS and MACS.
  • retinal pigment epithelial progenitor cells and/or neural retinal progenitor cells By performing a purification step of retinal progenitor cells and/or neural retinal progenitor cells, it is possible to reduce the contamination of RPE cells and non-target cells in the manufacturing method described herein.
  • the generation of retinal pigment epithelial progenitor cells and/or retinal pigment epithelial cells is suppressed by the step of increasing the proportion of retinal progenitor cells contained in the dispersed retinal cell population. Whether the generation of retinal pigment epithelial progenitor cells and/or retinal pigment epithelial cells is suppressed may be determined by whether retinal pigment epithelial cells are generated based on the markers, morphology, properties, etc.
  • retinal pigment epithelial precursor cells and/or retinal pigment epithelial cells are inhibited if the ratio of retinal pigment epithelial cells to the total number of cells after the above-mentioned culture is inhibited compared to the case where the step of increasing the ratio of retinal progenitor cells is not carried out. If the ratio of retinal pigment epithelial cells is at the level described in paragraph 0151, it can be determined that the generation of retinal pigment epithelial precursor cells and/or retinal pigment epithelial cells is inhibited.
  • Rx and Chx10 are well known as markers (positive markers) for retinal progenitor cells.
  • markers positive markers
  • Rx and Chx10 are well known as markers (positive markers) for retinal progenitor cells.
  • these genes are expressed intracellularly, it is necessary to use ingenuity, such as using cells in which the gene is linked to a fluorescent protein by recombinant gene technology, or cells in which the gene has been replaced with a fluorescent protein (e.g., Rx::Venus cells).
  • CD9 Genbank ID: NM_001769.4, NM_001330312.2
  • CD24 Genbank ID: NM_001291737.1, NM_001291738.1, NM_001291739.1, NM_001359084.
  • CD49f (Genbank ID: NM_000210.4, NM_001079818.3, NM_001316306.2, NM_001365529.2, NM_001365530.2), CD57 (Genbank ID: NM_00136 7973.1, NM_018644.3, NM_054025.3), CD73 (Genb ank ID: NM_001204813.1, NM_002526.4), CD82 (Genbank ID: NM_001024844.2, NM_002231.4), CD90 (Genbank ID: NM_001311160.2, NM_00 1311162.2, NM_001372050.1, NM_006288.5), CD16 4 (Genbank ID: NM_001142401.2, NM_001142402.2, NM_001142403.3, NM_001142404.2, NM_001346500.2, NM_006016.6), CD200 (Genbank ID :NM_001004196.3, NM_001318826.1,
  • Preferred cell surface markers include, for example, CD9, CD39, CD90 and CXCR4.
  • a method for improving the proportion of retinal progenitor cells in a cell population which includes a step of contacting the cell population containing retinal progenitor cells with a substance (e.g., an antibody, a peptide, etc.) that binds to one or more antigens selected from the group consisting of CD9, CD39, CD90, and CXCR4, and isolating a positive fraction, may be performed before starting culture in a medium containing the above-mentioned Wnt signaling pathway active substance. This method makes it possible to reduce contamination with RPE cells in the production method described herein.
  • negative markers for these cells i.e., markers whose expression is not observed in these cells, have been found, such as SSEA1 (Genbank ID: NM_002033.3), CD66b (Genbank ID: NM_001816.4), CD69 (Genbank ID: NM_001781.2), and CD84 (Genbank ID: NM_001184879.2, NM_001184881.2, NM_001184882.1, NM_001330742.2, NM_003874.4).
  • SSEA1 Genebank ID: NM_002033.3
  • CD66b Genebank ID: NM_001816.4
  • CD69 Genebank ID: NM_001781.2
  • CD84 Genebank ID: NM_001184879.2, NM_001184881.2, NM_001184882.1, NM_001330742.2, NM_003874.4.
  • a method for improving the proportion of retinal progenitor cells in a cell population may be performed before starting culture in a medium containing a substance acting on the Wnt signaling pathway, the method including a step of contacting the cell population containing retinal progenitor cells with a substance (e.g., an antibody) that binds to one or more antigens selected from the group consisting of CD9, CD39, CD90, and CXCR4, preferably with a substance (e.g., an antibody) that binds to one or more antigens selected from the group consisting of SSEA1, CD66b, CD69, and CD84, and separating a positive fraction of the former marker and a negative fraction of the latter marker.
  • a substance e.g., an antibody
  • the step of contacting the dispersed retinal cell population with a substance (e.g., an antibody) that binds to one or more antigens selected from the group consisting of SSEA1, CD66b, CD69, and CD84 and separating a negative fraction of these markers is a step of obtaining a cell population in which the expression level of the antigen is equal to or lower than a reference value.
  • a reference value can be set arbitrarily by a person skilled in the art.
  • a negative fraction can be isolated by treating a cell population with a fluorescently labeled antibody against the antigen that has the same fluorescence intensity as that obtained when the cell population is treated with a fluorescently labeled isotype control antibody.
  • the method of increasing the proportion of retinal progenitor cells and/or neural retinal progenitor cells in a cell population using a substance (e.g., an antibody) that binds to the above-mentioned positive markers and negative markers is not limited to being a method as one step of the manufacturing method described in this specification.
  • the method of increasing the proportion of retinal progenitor cells and/or neural retinal progenitor cells using a cell surface marker can also be used as one step of the manufacturing method for other retinal tissues, for example.
  • the retinal progenitor cells and/or neural retinal progenitor cells may, for example, account for 30% or more of the total number of cells, preferably 50% or more of the total number of cells, more preferably 80% or more of the total number of cells, and even more preferably 90% or more of the total number of cells.
  • cells that are positive for at least one marker selected from the group consisting of CD9, CD39, CD90, and CXCR4 and positive for Rx and/or Chx10 are included in 50% or more of the total number of cells in the cell population, preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • the cell population is negative for one or more, preferably two or more, three or more, or all of the antigens selected from the group consisting of SSEA1, CD66b, CD69, and CD84.
  • negative means that it is below the above-mentioned reference value.
  • the method for producing retinal tissue according to the present invention comprises adhesion culture or suspension culture of a dispersed retinal cell population in a medium containing a substance acting on the Wnt signaling pathway. Either culture method makes it possible to re-form an epithelial structure (multi-layered structure) from the dispersed retinal cell population. In order to produce a sheet-like retinal tissue having an epithelial structure (or multi-layered structure), adhesion culture is preferred.
  • the medium used for culturing the dispersed retinal cell population is not particularly limited as long as it is a medium in which the retinal cells can survive and grow.
  • the medium used for culturing the dispersed retinal cell population is a medium for maintaining continuous epithelial tissue.
  • a medium for maintaining continuous epithelial tissue is a medium obtained by compounding Neurobasal medium (e.g., Thermo Fisher Scientific, 21103049) with B27 supplement (e.g., Thermo Fisher Scientific, 12587010).
  • the Wnt signaling pathway active substance contained in the culture medium is not particularly limited as long as it is capable of enhancing signaling mediated by Wnt.
  • Wnt signaling pathway active substances include GSK3 ⁇ inhibitors (e.g., 6-bromoindirubin-3'-oxime (BIO)), CHIR99021, Kenpaullone, Wnt proteins such as Wnt2b and Wnt3a, and partial peptides thereof, and may be one substance or two or more substances.
  • the Wnt signaling pathway active substance is preferably one or more substances, two or more substances, or three or more substances selected from the group consisting of CHIR99021, BIO, Wnt2b, and Wnt3a.
  • the Wnt signaling pathway active substance can increase the size of the aggregates and can re-form an epithelial structure (or multi-layer structure) with apical/basement membrane polarity.
  • the Wnt signaling pathway active substance can also suppress the formation of rosette-like structures.
  • the concentration of the Wnt signaling pathway active substance may be any concentration that can induce the formation of a desired cell aggregate (e.g., re-formation of an epithelial structure (or multi-layer structure)).
  • the concentration of the Wnt signaling pathway active substance may be 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 3 ⁇ M to 6 ⁇ M.
  • the concentration may be any concentration that exhibits the same level of Wnt signal activation activity as CHIR99021 at the above-mentioned concentration.
  • the Wnt signal activation activity can be measured by a person skilled in the art, for example, by a method such as confirming the expression of ⁇ -Catenin.
  • the timing of adding the substance acting on the Wnt signaling pathway is not particularly limited, but it is preferable to add it as soon as possible after the start of suspension culture or adhesion culture for re-forming the sheet. In one embodiment, it is preferable to culture in a medium containing a substance acting on the Wnt signaling pathway from the start of culture.
  • the number of days of culture in a medium containing a substance acting on the Wnt signaling pathway is not particularly limited as long as the effect of re-forming an epithelial structure (or multi-layered structure) with apical/basement membrane polarity is observed, but is, for example, 1 to 14 days.
  • the medium may further contain one or more substances selected from the group consisting of a ROCK inhibitor, a substance acting on the SHH (Sonic Hedgehog) signaling pathway, and a substance acting on the fibroblast growth factor (FGF) signaling pathway.
  • a ROCK inhibitor has the effect of promoting the re-aggregation of dispersed retinal progenitor cell populations
  • the addition of a substance acting on the SHH signaling pathway has the effect of promoting the proliferation of cell aggregates and enlarging the cell aggregates
  • the addition of a substance acting on the FGF signaling pathway e.g., FGF2, FGF8 has the effect of reducing cell damage and suppressing the induction of differentiation into RPE cells.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho kinase (ROCK), and examples thereof include Y-27632 (see, for example, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983(2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284(2000)), Fasudil/HA1077 (see, for example, Uenata et al., Nature 389:990-994(1997)), and the like.
  • Y-27632 see, for example, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983(2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284(2000)
  • Fasudil/HA1077 see, for example, Uenata et al., Nature 389:990-994(1997)
  • antibodies include those described herein include ribonucleic acid (RIA)-dependent agonists (e.g., ribonucleic acid (ROCK)), H-1152 (e.g., Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93:225-232(2002)), Wf-536 (e.g., Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4):319-324(2003)) and their derivatives, as well as antisense nucleic acids against ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids (e.g., siRNA), dominant negative mutants, and expression vectors thereof.
  • RIA ribonucleic acid
  • ROCK ribonucleic acid
  • H-1152 e.g., Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93:225-232(2002)
  • Wf-536 e.g., Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4):319-324(2003)
  • ROCK inhibitors other low molecular weight compounds are also known as ROCK inhibitors, and such compounds or their derivatives can also be used in the present invention (see, for example, U.S. Patent Application Publication Nos. 20050209261, 20050192304, 20040014755, 20040002508, 20040002507, 20030125344, 20030087919, and International Publication Nos. 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976, and 2004/039796).
  • the ROCK inhibitor preferably contains one or more substances selected from the group consisting of Y-27632, Fasudil (HA1077), and H-1152.
  • the concentration of the ROCK inhibitor may be any concentration capable of promoting reaggregation of the dispersed retinal progenitor cell population.
  • the concentration may be 0.1 ⁇ M to 1 mM, preferably 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, and more preferably 5 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • the concentration may be any concentration that exhibits the same degree of ROCK inhibitory activity as the above-mentioned concentration of Y-27632.
  • a person skilled in the art can measure the ROCK inhibitory activity, for example, by a method such as expression analysis of phosphorylation of MLC2.
  • a substance acting on the SHH (Sonic Hedgehog) signaling pathway is a substance that can enhance signaling mediated by SHH (sometimes written as Shh).
  • substances acting on the SHH signaling pathway include proteins belonging to the Hedgehog family (e.g., Shh and Ihh), SHH receptors, Shh receptor agonists, PMA (Purmorphamine; 9-cyclohexyl-N-[4-(4-morpholinyl)phenyl]-2-(1-naphthalenyloxy)-9H-purin-6-amine), and SAG (Smoothened Agonist; N-methyl-N'-(3-pyridinylbenzyl)-N'-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane).
  • the substance acting on the Shh signaling pathway may contain one or more of these.
  • the Shh signaling pathway active substance is preferably one or more substances selected from the group consisting of Shh (Genbank accession numbers: NM_000193, NP_000184), SAG, or PMA.
  • the concentration of the substance acting on the SHH signaling pathway can be appropriately set by a person skilled in the art depending on the experimental conditions. In one embodiment, the concentration may be within a range in which the effect of enlarging cell aggregates is observed.
  • SAG is usually used at a concentration of 1 to 2000 nM, preferably 10 to 700 nM.
  • PMA is usually used at a concentration of 0.002 to 20 ⁇ M, preferably 0.02 to 2 ⁇ M.
  • SHH is usually used at a concentration of 4 to 500 ng/mL, preferably 10 to 200 ng/mL.
  • the concentration may be such that they exhibit the same degree of SHH signal activation as SAG at the above-mentioned concentration.
  • the SHH signal activation can be measured by a person skilled in the art, for example, by a method such as expression analysis of downstream signals (SMO and GLI).
  • the FGF signaling pathway active substance is not particularly limited as long as it is a substance that can enhance signal transduction mediated by FGF.
  • FGF signaling pathway active substances include fibroblast growth factors (e.g., bFGF, FGF4, FGF8, and FGF9).
  • the FGF signaling pathway active substance is preferably one or more fibroblast growth factors selected from the group consisting of FGF2, FGF4, and FGF8.
  • the concentration of the substance acting on the FGF signaling pathway can be set as appropriate depending on the experimental conditions.
  • the concentration may be within a range in which the effect of suppressing differentiation induction into RPE cells is observed.
  • the concentration is about 4 to 500 ng/mL, preferably about 10 to 200 ng/mL, and more preferably about 25 to 100 ng/mL.
  • the concentration may be such that they exhibit the same degree of FGF signal activation effect as FGF8 at the above-mentioned concentration.
  • a person skilled in the art can measure the FGF signal activation effect, for example, by a method such as expression analysis of downstream signals (Akt, MEK).
  • the timing of adding the ROCK inhibitor, the substance acting on the SHH (Sonic Hedgehog) signaling pathway, and/or the substance acting on the FGF signaling pathway is not particularly limited, but it is preferable to culture in a medium containing a ROCK inhibitor, a substance acting on the SHH (Sonic Hedgehog) signaling pathway, and/or a substance acting on the FGF signaling pathway from the start of culture.
  • These substances are preferably added to the medium at the same time, and more preferably added to the medium at the same time as a substance acting on the Wnt signaling pathway.
  • the dispersed retinal cells may be cultured in a medium containing these substances for 1 to 14 days.
  • Suspension culture is the cultivation of cells in a non-adherent state to a culture vessel, and can be carried out using, but is not limited to, a culture vessel that has not been artificially treated (e.g., coated with an extracellular matrix, etc.) to improve adhesion to the cells, or a culture vessel that has been artificially treated to suppress adhesion (e.g., coated with polyhydroxyethyl methacrylate (poly-HEMA), nonionic surface-active polyol (Pluronic F-127, etc.), or a phospholipid-like structure (e.g., a water-soluble polymer (Lipidure) whose constituent unit is 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine).
  • a culture vessel that has not been artificially treated e.g., coated with an extracellular matrix, etc.
  • a culture vessel that has been artificially treated to suppress adhesion e.g., coated with polyhydroxyethyl methacrylate (poly
  • Floating culture can be performed, for example, by using dispersed retinal cells as starting cells and the SFEB (serum-free floating culture of embryoid bodies-like aggregates) method (WO2005/12390) or the SFEBq method (WO2009/148170).
  • SFEB serum-free floating culture of embryoid bodies-like aggregates
  • Adhesion culture refers to culturing cells in a state of adhesion to a culture vessel, and can be carried out using, but is not limited to, a culture vessel that has been artificially treated to improve adhesion to the cells. Adhesion culture is preferably carried out using a culture vessel coated with an extracellular matrix and/or a temperature-sensitive polymer.
  • One embodiment of the method for producing retinal tissue includes a step of exposing the culture vessel coated with a temperature-sensitive polymer to a temperature at which the properties of the temperature-sensitive polymer change, thereby peeling off the sheet-like retinal tissue from the culture vessel.
  • sheet-like retinal tissue By culturing the cells in an adhesion culture vessel coated with an extracellular matrix, sheet-like retinal tissue can be produced, as described below.
  • Culturing in the presence of an extracellular matrix allows the cells to recognize the basement membrane side, making it easier for the apical surface to be formed, and the cells are oriented approximately perpendicular to the layer direction, resulting in retinal tissue with a better layer structure.
  • the retinal tissue with the formed epithelial structure (or multilayer structure) can be easily peeled off from the culture vessel by temperature change alone, and no enzyme treatment is required. Therefore, strong sheet-like retinal tissue can be recovered without weakening the bonds between cells due to enzyme treatment.
  • a culture vessel coated with an extracellular matrix and/or a temperature-sensitive polymer particularly both an extracellular matrix and a temperature-sensitive polymer.
  • the culture surface of the culture vessel is coated with the above-mentioned temperature-sensitive polymer, and the upper surface of the polymer is coated with the above-mentioned extracellular matrix.
  • the culture surface refers to the surface of the culture vessel to which the cells adhere
  • the upper surface of the polymer refers to the surface opposite to the surface in contact with the culture surface of the polymer coating.
  • extracellular matrix refers to biopolymers that make up the space outside cells, and includes cell adhesive proteins such as fibronectin, vitronectin, laminin, etc., fibrous proteins such as collagen and elastin, fragments of these proteins, glycosaminoglycans or proteoglycans such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate, and matrigel.
  • the extracellular matrix is preferably one or more substances selected from the group consisting of collagen, laminin, fibronectin, matrigel, vitronectin, and fragments of these proteins.
  • laminin fragments include commercially available products such as iMatrix-511, iMatrix-411, and iMatrix-221.
  • Matrigel is a basement membrane preparation derived from the Engelbreth Holm Swarn (EHS) mouse sarcoma. Matrigel can be prepared, for example, by the method disclosed in US Patent No. 4,829,000, or it can be purchased commercially. The main components of Matrigel are laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
  • EHS Engelbreth Holm Swarn
  • a temperature-sensitive polymer is a polymer whose properties change with temperature. That is, it has a lower critical solution temperature (LCST) in water, and at a certain temperature above which the hydrophobic bonds within or between the molecules become stronger, causing the polymer chains to aggregate, while at a lower temperature the polymer chains bind water molecules and become hydrated, showing a phase transition behavior.
  • LCST critical solution temperature
  • LCST poly-N-isopropylacrylamide
  • LCST poly-N-isopropylacrylamide
  • Cell culture is usually carried out at approximately 37°C, and considering the damage that low temperatures can cause to cells, a temperature-sensitive polymer with an LCST in the range of approximately 20°C to 35°C is preferable.
  • Temperature-responsive cell culture equipment for cell sheet recovery with a temperature-sensitive polymer fixed to the surface (CellSeed: UpCell (registered trademark)) is also available commercially.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40°C, preferably about 37°C, and the culture is performed in an atmosphere of CO2- containing air, and the CO2 concentration is preferably about 2 to 5%.
  • Substances acting on the Wnt signaling pathway are required for the formation of layered structures in sheet-like retinal tissue, and in particular for the formation of apical/basal polarity.
  • the concentration of the Wnt signaling pathway active substance may be any concentration capable of inducing sheet-like retinal tissue having a layer structure and an apical surface.
  • the concentration of the Wnt signaling pathway active substance may be 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, and more preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the concentration may be such that they exhibit the same degree of Wnt signal activation effect as CHIR99021 at the above-mentioned concentration.
  • a layer structure has been formed, for example, by observing with a microscope or measuring the thickness with a device such as OCT. Whether an apical surface has been formed can be confirmed by staining with, for example, an anti-Zo-1 antibody, an anti-Ezrin antibody, or an anti-typical-PKC antibody.
  • the timing of adding the substance acting on the Wnt signaling pathway is not particularly limited, but it is preferable to add it as soon as possible after the start of adhesion culture. In one embodiment, it is preferable to culture in a medium containing a substance acting on the Wnt signaling pathway from the start of culture.
  • the number of days of culture in a medium containing a substance acting on the Wnt signaling pathway is not particularly limited as long as the effect of reforming a multilayer structure (or multilayer structure) with apical/basement membrane polarity is observed, but is, for example, 1 to 15 days, preferably 1 to 9 days.
  • Culture may be continued in a medium that does not contain substances that act on the Wnt signaling pathway. Continuing culture thickens the layer structure and advances differentiation of retinal cells.
  • the culture period is not particularly limited, and may be a period during which the seeded dispersed retinal cell population proliferates and at least an epithelial structure (or multi-layered structure) is formed, and may be cultured until a sheet-like retinal tissue at the desired differentiation stage is produced. From the viewpoint of forming an epithelial structure (or multi-layered structure), it is desirable to culture for at least 7 days.
  • the culture period may be, for example, 7 to 60 days or less, or may be 40 days or less, 30 days or less, 20 days or less, or 16 days or less (e.g., 16 days).
  • the cells may be further cultured to proliferate, differentiate, or mature.
  • the medium used for further culture may or may not contain a substance acting on the Wnt signaling pathway, a ROCK inhibitor, a substance acting on the SHH (Sonic Hedgehog) signaling pathway, and/or a substance acting on the integrin transmission pathway.
  • multilayer structure refers to a structure formed by stacking two or more cell layers in which cells are aligned in the same direction in tissue that has a polarity between the basement membrane side and the apical side (i.e., has an epithelial structure), and the tangential directions of the surfaces of the different layers are approximately parallel to each other.
  • the multilayer structure preferably has a polarity of the basal surface and the apical surface, and in one embodiment, the retinal tissue having a multilayer structure may be a sheet-like retinal tissue, and the cell aggregate containing the retinal tissue having a multilayer structure may be a sheet-like cell aggregate.
  • the cell layer may be a neural retinal progenitor cell layer, a ganglion cell layer, or a photoreceptor cell layer.
  • the orientation of the cells may be approximately perpendicular to the layer direction.
  • cell orientation refers to the direction in which the shape of the nucleus and the orientation of the cell body extend toward the basement membrane side and the apical side.
  • approximately perpendicular to the layer direction refers to a direction perpendicular to the direction in which the individual cells are lined up in contact with each other in the layers of the multi-layer structure (i.e., the tangent direction of the surface of the layer), and refers to a perpendicular or longitudinal direction to the layers.
  • the method may further include a step of cutting out the retinal tissue (particularly sheet-like retinal tissue) having an epithelial structure (or multi-layer structure) obtained by suspension culture or adhesion culture to a size required for transplantation.
  • the tissue can be cut out using tweezers, a knife, scissors, etc.
  • One aspect of the present invention is a sheet-like retina (neural retina) tissue having an epithelial structure.
  • One aspect of the sheet-like retina tissue is composed of a retinal cell layer having a multi-layer structure, the multi-layer structure having basal and apical polarities, the retinal cell layer having the multi-layer structure containing one or more types of cells selected from the group consisting of retinal progenitor cells, photoreceptor progenitor cells, and photoreceptor cells, and the orientation of the cells in the retinal cell layer is approximately perpendicular to the layer direction.
  • the term "sheet-like” refers to a single-layer or multi-layer structure composed of a single or multiple cells having biological connections in at least two-dimensional directions.
  • One advantage of the present invention is that it is possible to produce sheet-shaped retinal tissue of any size depending on the culture equipment used. In other words, it is possible to produce sheet-shaped retinal tissue of a size that was previously impossible to produce, and in cases where a disease affects a wide area, treatment is possible by transplanting a single sheet.
  • the long axis (also referred to as diameter) of the sheet-like retinal tissue of the present invention is, for example, 2 mm or more, 4 mm or more, 5 mm or more, 7.5 mm or more, or 10 mm or more.
  • the short axis of the sheet-like retinal tissue of the present invention is, for example, 2 mm or more, 3 mm or more, 4 mm or more, or 5 mm or more. In principle, there is no upper limit to the long axis and short axis, but the size of the dish or the like used for culture is the limit.
  • the long axis may be 10 cm or less, 5 cm or less, 4 cm or less, 3 cm or less, 2 cm or less, or 1 cm or less.
  • the height of the sheet-like retinal tissue of the present invention may be, for example, 50 ⁇ m to 1500 ⁇ m, and is preferably 200 ⁇ m to 700 ⁇ m.
  • the method for measuring the long diameter, short diameter and height of the sheet-like retinal tissue is not particularly limited, and may be, for example, measured from an image captured under a microscope.
  • a front image of the sheet-like retinal tissue captured with the apical surface facing the objective lens and a lateral image captured with the cut surface tilted so that it is perpendicular to the objective lens can be captured with a stereomicroscope, and measurements can be made from the captured images.
  • the long diameter means the longest line segment and its length among the line segments connecting two end points on the sheet cross section in the front image.
  • the short diameter means the longest line segment and its length among the line segments connecting two end points on the sheet cross section in the front image that are perpendicular to the long diameter.
  • the height means the longest line segment and its length among the line segments perpendicular to the sheet cross section and having the intersection with the sheet cross section and the apex of the retinal sheet as their end points.
  • the basal and apical surfaces are as defined above. "The multilayer structure has a polarity of basal and apical surfaces” means that the multilayer structure has a basal surface on one side and an apical surface on the other side. A basement membrane may be present on the basal surface.
  • the sheet-shaped retinal tissue does not contain RPE cells.
  • the ratio of the number of RPE cells to the total number of cells in the sheet-shaped retinal tissue is 10% or less, preferably 9% or less, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less.
  • the ratio of the number of RPE cells to the total number of cells in the sheet-shaped retinal tissue can be measured, for example, by using flow cytometry (FACS) or the like to measure the ratio of cells expressing the above-mentioned RPE cell markers.
  • FACS flow cytometry
  • the ratio of the area of RPE cells to the total area of the sheet-shaped retinal tissue is 10% or less, preferably 9% or less, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less. Since RPE cells are black, the ratio of the area of RPE cells to the total area of the sheet-shaped retinal tissue can be calculated from the ratio of the area that shows black under a microscope. In addition, cells expressing RPE cell markers can also be detected by PCR or the like. The method for reducing the proportion of RPE cells in sheet-like retinal (neural retinal) tissue is as described above.
  • a sheet-like retinal tissue comprising retinal cell layers having a multilayer structure
  • the retinal cell layer having a multilayer structure has basal and apical polarity
  • the retinal cell layer having the multilayer structure includes one or more types of cells selected from the group consisting of retinal progenitor cells, photoreceptor progenitor cells, and photoreceptor cells; (3) In each layer of the retinal cell layer, the cells are oriented approximately perpendicular to the layer direction, and (4) The diameter is 8 mm or more.
  • the retinal tissue may include a retinal cell layer having the above-mentioned multi-layer structure and a sheet-like retinal pigment epithelial cell bonded to the retinal cell layer, and the retinal cell layer and the sheet-like retinal pigment epithelial cell may be a complex (composite sheet) in which the tangential directions of the respective surfaces of the retinal cell layer and the sheet-like retinal pigment epithelial cell are approximately parallel, the apical surface of the retinal cell layer and the apical surface of the sheet-like retinal pigment epithelial cell face each other, and the retinal cell layer and the sheet-like retinal pigment epithelial cell are bonded to each other by an adhesion factor present between them.
  • the sheet-like neural retina is also called a neural retina sheet or NR sheet
  • the sheet-like retinal pigment epithelial cell is also called a retinal pigment epithelial cell sheet or RPE cell sheet (RPE sheet).
  • RPE sheet retinal pigment epithelial cell sheet
  • one embodiment of the present invention also provides a complex (composite sheet) of neural retina and RPE cells.
  • Another embodiment of the present invention includes a complex (composite sheet) in which dispersed retinal pigment epithelial cells are bonded to the apical surface side of a sheet-like retinal cell layer (sheet-like neural retina) by an adhesion factor.
  • the tangential directions of the neural retina sheet and the retinal pigment epithelial cell sheet are approximately parallel to each other.
  • approximately parallel tangential directions means that the tangential directions of the opposing surfaces of the neural retina and the retinal pigment epithelial cell sheet are parallel to each other.
  • the apical surface of the neural retina and the apical surface of the retinal pigment epithelial cells face each other. In other words, the apical surface of the neural retina and the apical surface of the retinal pigment epithelial cells are in close proximity to each other.
  • a composite of neural retina and RPE cells can be prepared by joining a sheet-like retinal cell layer (neural retina sheet) with an RPE cell sheet or dispersed RPE cells in the presence of an adhesion factor, as described below.
  • the sheet-like retinal cell layer can be produced by the above-mentioned method for producing a cell aggregate containing retinal tissue having an epithelial structure (or multi-layer structure).
  • the RPE cell sheet can be produced by the method for producing a retinal pigment epithelial cell sheet, which is described below.
  • Retinal pigment epithelial (RPE) cells are derived from pluripotent stem cells, and can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • Methods for producing retinal pigment epithelial cells include, but are not limited to, those disclosed in WO2005/070011, WO2006/080952, WO2011/063005, WO2012/173207, WO2015/053375, WO2015/053376, WO2015/068505, WO2017/043605, Stem Cell Reports, 2(2), 205-218 (2014) and Cell Stem Cell, 10(6), 771-785 (2012).
  • the retinal pigment epithelial cells may be produced as a cell sheet or a spherical cell aggregate.
  • the RPE cell sheet can be prepared by cutting open the cell aggregate using tweezers, a knife, scissors, or the like.
  • pluripotent stem cells are cultured in the absence of feeder cells under the conditions of 1) treating with a TGF ⁇ family signaling pathway inhibitor and a sonic hedgehog signaling pathway activating substance one day before differentiation induction, and 2) not treating with a sonic hedgehog signaling pathway activating substance at the start of differentiation induction. Then, the above-mentioned steps (B) and (C) are performed. Furthermore, it is preferable to start the above-mentioned step (D) earlier. Specifically, step (D) is started about 9 days (e.g., 7, 8, 9, 10, or 11 days) after the start of the suspension culture in step (B).
  • a spherical cell aggregate of RPE cells can be obtained.
  • the cell aggregate may be dispersed to prepare a cell suspension, or an RPE cell sheet may be prepared by cutting the cell aggregate open using tweezers, a knife, scissors, or the like.
  • RPE cell sheets can also be prepared by culturing the dispersed cell suspension in adherent culture.
  • Dispersed RPE cells can also be obtained by dispersing RPE cell sheets or aggregates of RPE cells.
  • the retinal pigment epithelial cell sheet may be further cultured until it has a polygonal or pavement-like cell morphology before being brought into contact with the neural retina cell aggregate.
  • the medium is not particularly limited, but it can be replaced with a maintenance medium for retinal pigment epithelial cells (hereinafter, sometimes referred to as RPE maintenance medium) and further cultured. This allows for more clear observation of melanin pigmented cell groups and cell groups with polygonal flat morphology adhering to the basement membrane.
  • the culture in RPE maintenance medium is not limited as long as colonies that grow while maintaining the properties of retinal pigment epithelial cells are formed, but for example, the culture is performed for 5 days or more (e.g., about 5 to 20 days) with the entire medium replaced at least once every 3 days.
  • the maintenance medium for retinal pigment epithelial cells may be, for example, the medium described in IOVS, March 2004, Vol. 45, No. 3, Masatoshi Haruta et al., IOVS, November 2011, Vol. 52, No. 12, Okamoto et al., Cell Science 122 (17), Fumitaka Osakadar et al., ebruary 2008, Vol. 49, No. 2, and Gamm et al. can be used.
  • the long diameter of the retinal pigment epithelial cell sheet may be the same as the long diameter of the sheet-like retinal tissue (neural retinal sheet). In one embodiment, the long diameter of the retinal pigment epithelial cell sheet may be in the range of, for example, 3 mm to 50 mm, 5 mm to 30 mm, or 10 mm to 20 mm.
  • the minor axis of the retinal pigment epithelial cell sheet may be the same as the minor axis of the sheet-like retinal tissue (neural retinal sheet). In one embodiment, the minor axis of the retinal pigment epithelial cell sheet may be in the range of, for example, 2 mm to 40 mm, 5 mm to 30 mm, or 10 mm to 20 mm.
  • the degree of melanin pigmentation in the retinal pigment epithelial cell sheet is not particularly limited. It is preferable that the degree of melanin pigmentation in the retinal pigment epithelial cells contained in the retinal pigment epithelial cell sheet is the same among the cells.
  • the average melanin content of the retinal pigment epithelial cell sheet may be less than 20 pg/cell, less than 15 pg/cell, less than 10 pg/cell, less than 8 pg/cell, less than 7 pg/cell, less than 6 pg/cell, less than 5 pg/cell, less than 4 pg/cell, less than 3 pg/cell, less than 2 pg/cell, or less than 1 pg/cell.
  • the average melanin content of the retinal pigment epithelial cell sheet may also be 0.1 pg/cell or more, 0.5 pg/cell or more, 1 pg/cell or more, 2 pg/cell or more, or 5 pg/cell or more.
  • the melanin content in the retinal pigment epithelial cell sheet can be measured, for example, by dispersing the retinal pigment epithelial cell sheet, followed by extraction of the cells with NaOH or the like, using a spectrophotometer or the like.
  • the average melanin content can be calculated by dividing the melanin content by the total number of cells contained in the retinal pigment epithelial cell sheet.
  • the above-mentioned composite can be produced by joining a neural retina sheet and dispersed RPE cells or an RPE cell sheet.
  • a composite sheet in which a neural retina sheet and an RPE cell sheet are joined is preferable.
  • the above-mentioned neural retina sheet and RPE cell sheet can be easily removed from the cultureware using tweezers, a knife, scissors, etc. Both sheets that have been removed may be transferred to a new container (such as cultureware), or one may be left in the cultureware and the other transferred to the cultureware. By producing them in cultureware of the same size, the size of the sheet-like tissue to be joined can be made uniform.
  • the start date of production may be staggered.
  • the above-mentioned neural retinal sheet and retinal pigment epithelial cells are preferably brought into contact in the presence of an adhesion factor.
  • the adhesion factor means a substance that has the effect of adhering cells to each other, and is not particularly limited, but examples thereof include the above-mentioned extracellular matrix and artificial hydrogels.
  • the adhesion factor does not need to be an isolated single substance, and includes preparations from living organisms or cells, such as Matrigel, interphotoreceptor matrix, and serum.
  • Matrigel is a basement membrane preparation derived from Engelbreth Holm Swarn (EHS) mouse sarcoma. Matrigel can be prepared, for example, by the method disclosed in US Patent No. 4829000, and can also be purchased commercially.
  • the main components of Matrigel are laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
  • Interphotoreceptor matrix is a general term for the extracellular matrix present between retinal cells such as photoreceptors in the living retina, and includes, for example, hyaluronic acid. Those skilled in the art can collect interphotoreceptor matrix from a living retina by, for example, placing the retina in distilled water and expanding it to separate it, and it can also be purchased commercially.
  • the adhesion factor is preferably an extracellular matrix or a hydrogel.
  • the extracellular matrix is preferably one or more extracellular matrices selected from the group consisting of hyaluronic acid, fibrin, laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin.
  • the hydrogel is preferably one or more hydrogels selected from the group consisting of gelatin, fibrin, collagen, pectin, hyaluronic acid, and alginic acid.
  • the adhesion factor may be one or more substances selected from gelatin, fibrin, fibronectin, hyaluronic acid, laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin, and is particularly preferably gelatin or fibrin.
  • Fibrin gel is a gel-like fibrin obtained by reacting a fibrinogen solution with a thrombin solution.
  • the commercially available Bolheal (registered trademark) tissue adhesive can also be used.
  • the fibrinogen solution and the thrombin solution can be reacted by contacting or mixing them.
  • “Gelatin” is water-insoluble collagen that has been pretreated with, for example, an acid or alkali and then solubilized by thermal hydrolysis. It is also possible to obtain gelatin commercially, such as Gelatin LS-H (Nitta Gelatin Co., Ltd., pigskin alkali-treated gelatin, non-heat-treated gelatin, high jelly strength) and Gelatin LS-W (Nitta Gelatin Co., Ltd., pigskin alkali-treated gelatin, heat-treated gelatin, low jelly strength). Alkali-treated (lime-treated) gelatin (type B gelatin) is preferred, and heat-treated gelatin is also preferred.
  • Hydrogels undergo a phase change from gel to sol and from sol to gel when heated or cooled. When cooled, hydrogels lose fluidity and become gel (jelly), and when heated, they become sol (aqueous solution).
  • melting point means the temperature at which a sol forms under a constant pressure
  • freezing point means the temperature at which a gel forms under a constant pressure. It is preferable that the hydrogel is decomposed in the living body.
  • a hydrogel e.g., gelatin having a melting point close to body temperature (25°C to 40°C) is preferable.
  • the hydrogel in this specification may have a melting point of 20°C to 40°C (e.g., 20°C to 35°C, 25°C to 35°C, 30°C to 40°C, 35°C to 40°C).
  • the melting point of a gel is a measure of the strength of the network
  • the melting point of a hydrogel e.g., gelatin
  • increasing the solid content by adding sugars tends to raise the melting point and freezing point. In this way, it is possible to vary the melting point and freezing point within a certain range.
  • There are no particular limitations on the method for measuring the melting point of a hydrogel and it can be measured, for example, by the method specified in JIS K6503.
  • the strength of a hydrogel may be such that the hydrogel does not collapse during the operation for transplantation.
  • "Jelly strength” is an index of the strength of a hydrogel.
  • the “jelly strength” of a hydrogel means the mechanical strength of an object formed from the gel. It is usually expressed as the force required to deform a gel of a certain shape or the force required to break the gel (unit: g, dyne (s)/ cm2 or g/ cm2 ), and is mainly a measure of the hardness of the gel.
  • 1 dyne is defined as the force that, when acting on an object with a mass of 1 gram (g), gives an acceleration of 1 centimeter per second per second (cm/ s2 ) in that direction.
  • the jelly strength of gelatin can be measured by the method specified in JIS K6503.
  • the jelly strength of a hydrogel (e.g., gelatin) gel may be 50 g or more, 100 g or more, 200 g or more, 500 g or more, 1000 g or more, 1200 g or more, 1300 g or more, 1400 g or more, or 1500 g or more.
  • the jelly strength of a hydrogel (gelatin) may be 3000 g or less, 2500 g or less, or 2000 g or less.
  • the concentration of the adhesion factor varies depending on the size of the neural retina sheet or retinal pigment epithelial cell sheet and the number of retinal pigment epithelial cells, but a person skilled in the art can easily determine the concentration by checking the adhesion state of the RPE cells.
  • concentration of the adhesion factor extracellular matrix
  • Matrigel it is preferable to add a concentration of 200 to 10,000 times diluted ready-made product (Corning), and in the case of iMatrix511, it is preferable to add it at a concentration of 0.1 to 5 ⁇ g/mL.
  • the neural retina sheet and the retinal pigment epithelial cells or the retinal pigment epithelial cell sheet may be cultured in a medium containing an adhesion factor (extracellular matrix) to adhere to each other.
  • the medium to be used is not particularly limited, but examples thereof include media used for culturing retinal pigment epithelial cells or neural retina (e.g., DMEM/F12 medium, Neurobasal medium, a mixed medium of these, RPE maintenance medium, etc.).
  • the culture for adhesion may be performed in the presence of other components such as growth factors such as EGF together with the extracellular matrix.
  • the culture may be continued in the above-mentioned medium containing the adhesion factor, or after a certain period of culture (e.g., 1 to 10 days) in the above-mentioned medium containing the adhesion factor, the medium may be replaced with a medium not containing the adhesion factor, and the culture may be continued.
  • a certain period of culture e.g. 1 to 10 days
  • the neural retina sheet or the retinal pigment epithelial cell sheet Before culturing to adhere the neural retina sheet to the retinal pigment epithelial cells or retinal pigment epithelial cell sheet, the neural retina sheet or the retinal pigment epithelial cell sheet may be coated with an adhesion factor.
  • the neural retina sheet or the retinal pigment epithelial cell or the retinal pigment epithelial cell sheet may be cultured in the above-mentioned medium containing the adhesion factor.
  • a person skilled in the art can set the culture time appropriately, but it is sufficient to culture for about 10 minutes to 5 hours (for example, 10 minutes to 60 minutes). After culturing, the sheet may be washed with a medium such as PBS.
  • the adhesive factor, hydrogel or matrix gel is preferably fibrin gel.
  • Fibrin gel is a gel-like fibrin obtained by reacting a fibrinogen solution with a thrombin solution.
  • a substance that has the property of forming a gel by reaction is called a matrix precursor, and for example, thrombin and fibrinogen that react to form a fibrin gel are an example of a matrix precursor.
  • the fibrinogen solution can be prepared by dissolving fibrinogen powder or the like in a dissolving solution that contains aprotinin and can dissolve fibrinogen.
  • the concentration is not particularly limited, but is, for example, 40 to 480 mg/mL, preferably 80 mg/mL to 320 mg/mL (e.g., 160 mg/mL).
  • the concentration may be 37.5 units/mL to 225 units/mL (e.g., 75 units/mL).
  • the thrombin solution can be prepared by dissolving thrombin powder or the like in a thrombin dissolving solution containing calcium chloride hydrate, and the concentration is not particularly limited, but is, for example, 125 units/mL to 750 units/mL (e.g., 75 units/mL).
  • the fibrinogen solution and the thrombin solution can be reacted by contacting or mixing them, and in this case, the fibrinogen solution and the thrombin solution are preferably used in an activity ratio of 1:1 to 1:9, preferably 1:3 to 1:4.
  • a method for producing a composite using a fibrin gel is shown below. Specifically, the neural retina sheet and the retinal pigment epithelial cells or retinal pigment epithelial cell sheet are adhered to each other using a fibrin gel produced by reacting fibrinogen with thrombin.
  • one tissue that has been contacted with a fibrinogen solution and the other tissue (retinal pigment epithelial cells or neural retina) that has been contacted with a thrombin solution may be brought into contact with each other to cause a reaction between the fibrinogen and thrombin, resulting in gelation.
  • contact with the solution refers to contacting at least the adhesive surface of the tissue (the surface that faces the other tissue when adhering to the other tissue with the fibrin gel) with the fibrinogen solution or thrombin solution to the extent that the solution adheres to the adhesive surface of the tissue.
  • the neural retina sheet when adhering a neural retina sheet to a retinal pigment epithelial cell sheet, the neural retina sheet is immersed in a fibrinogen solution, and the retinal pigment epithelial cell sheet is immersed in a thrombin solution (the solutions can be reversed). It is preferable to use a fibrinogen solution and a thrombin solution in a volume ratio of 3:1 to 1:3. Before adhesion, excess fibrinogen or thrombin attached to the tissues may be removed. This operation allows the thickness of the fibrin gel to be adjusted.
  • the two may be brought into contact.
  • bringing the tissues into contact means bringing the surface with the fibrinogen solution and the surface with the thrombin solution into contact, i.e., overlapping them.
  • the tissue may be contacted with a fibrinogen solution, and then a thrombin solution may be added to the fibrinogen solution to react the fibrinogen and thrombin.
  • a thrombin solution may be added to the fibrinogen solution to react the fibrinogen and thrombin.
  • the tissue is embedded in a fibrin gel.
  • the manufacturing method of the present invention may further include a step of cutting out a composite of a size required for transplantation from the composite. Since two or more tissues are firmly adhered by the fibrin gel, when a graft is cut out from the composite, the tissues can be easily cut out to the desired size without peeling off from the composite. When cutting out, tweezers, a knife, scissors, etc. can be used.
  • compositions, methods of treatment, therapeutic agents and uses includes a pharmaceutical composition comprising retinal tissue (e.g., sheet-like retinal tissue).
  • the pharmaceutical composition preferably further comprises a medicamentously acceptable carrier in addition to the retinal tissue of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be used to treat disorders of neural retinal cells or neural retina or diseases caused by damage to the neural retina.
  • diseases caused by disorders of neural retinal cells or neural retina include ophthalmic diseases such as retinal degeneration disease, macular degeneration, age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, glaucoma, corneal disease, retinal detachment, central serous chorioretinopathy, cone dystrophy, and cone-rod dystrophy.
  • damaged states of the neural retina include states in which photoreceptor cells are degenerated and dead.
  • a physiological aqueous solvent such as physiological saline, a buffer solution, or a serum-free medium
  • the pharmaceutical composition may contain preservatives, stabilizers, reducing agents, isotonicity agents, etc. that are commonly used in medicines containing tissues or cells to be transplanted in transplantation medicine.
  • One aspect of the present invention provides a therapeutic agent for a disease caused by a disorder of the neural retina, comprising the retinal tissue (e.g., sheet-like retinal tissue) obtained by the present invention.
  • Another aspect of the present invention includes a method for treating a disease caused by a disorder of neural retinal cells or the neural retina, or a disease caused by damage to the neural retina, comprising transplanting the retinal tissue obtained by the present invention into a subject requiring transplantation (e.g., under the retina of an eye with an ophthalmic disease).
  • the retinal tissue of the present invention can be used as a therapeutic agent for a disease caused by a disorder of the neural retina, or to replenish the damaged site of the neural retina in a damaged state of the neural retina.
  • the sheet-like retinal tissue of the present invention can be transplanted into a patient having a disease caused by a disorder of the neural retina or a patient having a damaged state of the neural retina, requiring transplantation, to replenish the neural retinal cells or the damaged neural retina, thereby treating the disease caused by a disorder of the neural retina or the damaged state of the neural retina.
  • An example of a transplantation method is a method of transplanting retinal tissue under the retina at the damaged site by incising the eyeball, etc. Methods for transplantation include, for example, injecting using a thin tube or pinching with tweezers, and examples of thin tubes include injection needles.
  • a retinal tissue obtained by the present invention for use in treating a disease caused by a disorder of retinal cells or retinal tissue or damage to retinal tissue.
  • a retinal tissue obtained by the present invention in the manufacture of a therapeutic agent for a disease caused by a disorder of retinal cells or retinal tissue or damage to retinal tissue.
  • a specific maintenance culture operation for human ES and human iPS cells was performed as follows. First, human ES/iPS cells that had become subconfluent (about 60% of the culture area was covered with cells) were washed with PBS and then dispersed into single cells using TrypLE Select (trade name, manufactured by Life Technologies).
  • dispersion into single cells means dispersion to form single cells, and the cell population dispersed into single cells may contain clumps of 2 to 50 cells in addition to single cells.
  • the human ES cells dispersed into single cells were seeded on a plastic culture dish coated with Laminin511-E8, and cultured under feeder-free conditions in StemFit medium in the presence of Y-27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M).
  • Y-27632 ROCK inhibitor, 10 ⁇ M
  • the number of human ES/iPS cells dispersed into the single cells was 0.4 to 1.2 ⁇ 10 4 cells per well.
  • the medium was replaced with StemFit medium not containing Y-27632.
  • the medium was replaced with StemFit medium not containing Y-27632 once every 1 to 2 days.
  • the medium was cultured under feeder-free conditions until one day before reaching subconfluency.
  • the human ES cells one day before reaching subconfluency were cultured under feeder-free conditions for one day in the presence of SB431542 (TGF ⁇ signaling pathway inhibitor, 5 ⁇ M) and SAG (Shh signaling pathway agonist, 300 nM) (Preconditioning treatment).
  • human ES/iPS cells were treated with cell dispersion liquid using TrypLE Select, and further dispersed into single cells by pipetting.
  • the human ES cells dispersed into single cells were suspended in 100 ⁇ L of serum-free medium so that the number of cells was 1.2 ⁇ 10 4 per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (product name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and cultured in suspension at 37 ° C. and 5% CO 2.
  • the serum-free medium (gfCDM + KSR) used at that time was a serum-free medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, and 1 ⁇ chemically defined lipid concentrate to a 1:1 mixture of F-12 medium and IMDM medium.
  • Y-27632 (ROCK inhibitor, final concentration 10 ⁇ M or 20 ⁇ M) and SAG (Shh signaling pathway active substance, 300 nM, 30 nM, or 0 nM) were added to the above serum-free medium.
  • SAG Shh signaling pathway active substance, 300 nM, 30 nM, or 0 nM
  • 50 ⁇ L of medium containing no Y-27632 or SAG but exogenous human recombinant BMP4 product name: Recombinant Human BMP-4, manufactured by R&D Systems
  • half of the medium was replaced once every three days with medium containing no Y-27632, SAG, or human recombinant BMP4.
  • the aggregates from the 14th to 18th days after the start of the suspension culture were transferred to a 90 mm low-adhesion culture dish (suspension culture dish 90 ⁇ (deep type), manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and cultured for 3 to 4 days at 37 ° C. and 5% CO 2 in serum-free medium (DMEM / F12 medium with 1% N2 Supplement added) containing a Wnt signaling pathway active substance (CHIR99021, 3 ⁇ M) and an FGF signaling pathway inhibitor ( SU5402 , 5 ⁇ M).
  • serum-free medium DMEM / F12 medium with 1% N2 Supplement added
  • the aggregates were cultured for a long period of time in a serum medium (NucT0 medium) that does not contain a Wnt signaling pathway active substance and an FGF signaling pathway inhibitor in a 90 mm low-adhesion culture dish (suspension culture dish 90 ⁇ (deep type), manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).
  • the aggregates on the 16th day (derived from 1231A3) or 27th day (derived from KhES-1) after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37°C for 20-30 minutes, the cells were dispersed into single cells by pipetting.
  • Example 2 Search for factors promoting layer structure formation and aggregate growth Human ES cells (KhES-1 line, (Non-Patent Document 3)) genetically modified to have the Rx::Venus reporter gene were cultured under feeder-free conditions according to the method described in "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)".
  • StemFit medium product name: AK03N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 product name, manufactured by Nippi Co., Ltd. was used as a scaffold instead of feeder cells.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on the 20th day (1231A3) and 27th day (KhES-1) after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37 ° C, they were dispersed into single cells by pipetting.
  • the state of aggregate reformation was observed using a bright field microscope and a fluorescent microscope (Keyence BZ-X810) on the 1st, 7th, and 14th days after suspension culture for aggregate reformation.
  • the results for KhES-1-derived cells are shown in Figures 3 to 5.
  • the area of the aggregates was measured using Image J.
  • the results for KhES-1-derived cells are shown in Figure 6 (average value of 12 measurements).
  • the results for 1231A3-derived cells, in which the state of aggregate reformation was observed on the 1st day after suspension culture, are shown in Figure 7.
  • ⁇ Reference Example 1-3 Search for factors promoting layer structure formation and aggregate growth>
  • Human ES cells KhES-1 line, (Non-Patent Document 3)
  • Rx::Venus reporter gene Human ES cells (KhES-1 line, (Non-Patent Document 3)) genetically modified to have the Rx::Venus reporter gene were cultured under feeder-free conditions according to the method described in "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)”.
  • StemFit medium product name: AK03N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 product name, manufactured by Nippi Co., Ltd.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on the 26th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and a nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37°C, the cells were dispersed into single cells by pipetting. These cells were suspended in 100 ⁇ L of serum-free medium to 3.0 ⁇ 10 4 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (trade name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and cultured in suspension at 37°C and 5% CO 2 .
  • a nerve cell dispersion liquid manufactured by Wako
  • the aggregates were fixed with 4% PFA on the 15th day (corresponding to the 41st day of differentiation) and 28th day (corresponding to the 54th day of differentiation) and frozen sections were prepared. These frozen sections were stained with DAPI and anti-Chx10 antibody (trade name: Anti CHX10 Antibody, EXalpha), anti- ⁇ -Catenin antibody (R&D Systems), anti-Collagen IV antibody (Abcam), anti-Zo-1 antibody (Invitrogen), anti-Ki67 antibody (BD), anti-Pax6 antibody (BioLegend), and anti-RxR- ⁇ (RxRg) antibody.
  • DAPI and anti-Chx10 antibody trade name: Anti CHX10 Antibody, EXalpha
  • anti- ⁇ -Catenin antibody R&D Systems
  • Anti-Collagen IV antibody Abcam
  • Anti-Zo-1 antibody Invitrogen
  • anti-Ki67 antibody BD
  • Anti-Pax6 antibody BioLegend
  • RxRg anti-RxR- ⁇
  • Immunostaining was performed using anti-IL-1 antibody (Spring Bioscience), anti-CRX antibody (Abnova), anti-NRL antibody (R&D Systems), anti-Recoverin antibody (Proteintech), anti-Islet-1 antibody (DSHB), anti-GS antibody (Sigma), anti-Brn3 antibody (Santa Cruz), and anti-Calretinin antibody (R&D Systems).
  • Figures 11 to 20 These immunostained sections were observed using a bright field microscope, a fluorescence microscope (Keyence BZ-X810), and a confocal laser scanning fluorescence microscope (Leica SP-8), and the results are shown in Figures 11 to 20.
  • Figures 11, 14, 15, and 18 confirm that when CHIR99021 was added, a layer structure containing Rx::Venus-positive and Chx10-positive neural retinal progenitor cells was formed on the outermost side of the aggregate.
  • Figures 12, 16, and 17 also confirm that when CHIR99021 was added, a Zo-1-positive apical surface was formed on the outermost side of the aggregate, and a collagen-positive basal surface was formed inside, and epithelial tissue with apical and basal polarity was formed.
  • Figure 17 in particular, in the group to which CHIR99021 was not added, it was observed that there was no cell polarity or that a rosette-like structure was shown.
  • Figures 19 and 20 confirm that RxR-gamma (RxRg)-positive and CRX-positive cone precursor cells, Recoverin-positive and CRX-positive photoreceptor precursor cells were differentiated, and differentiation of Islet-1-positive and Brn3-positive retinal ganglion cells and Calretinin-positive amacrine cells was also confirmed.
  • RxR-gamma (RxRg)-positive and CRX-positive cone precursor cells Recoverin-positive and CRX-positive photoreceptor precursor cells were differentiated, and differentiation of Islet-1-positive and Brn3-positive retinal ganglion cells and Calretinin-positive amacrine cells was also confirmed.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on the 18th, 25th, 40th, 61st, and 75th days after the start of suspension culture (dd18, dd25, dd40, dd61, dd75) were washed with PBS and nerve cell dispersion liquid (manufactured by WAKO) was added. After incubation at 37 ° C, the cells were dispersed into single cells by pipetting.
  • Figure 21 shows the results of observing the state of aggregate reformation using a bright field microscope and a fluorescent microscope on the 3rd, 15th, and 21st days (Day 3, Day 15, and Day 21) of culture for the reformation of aggregates.
  • Figure 21 confirms that aggregates were reformed and a layered structure was formed in cell aggregates on all differentiation days, dd18, dd25, dd40, dd61, and dd75. It was also observed that the characteristics of Rx::Venus-positive retinal tissue were maintained (Figure 21).
  • the aggregates thus prepared 40 days after the start of suspension culture were washed with PBS, and a nerve cell dispersion liquid (manufactured by WAKO) was added. After incubation at 37 ° C, the cells were dispersed into single cells by pipetting.
  • the dispersed cells were suspended in 100 ⁇ L of serum-free medium containing 10 mM Y-27632 (Wako), 300 nM SAG (Enzo) and 3 ⁇ M CHIR99021 (Wako) so that the number of cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (trade name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) was 5 ⁇ 10 5 cells, and the suspension culture was performed at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • a non-cell-adhesive 96-well culture plate trade name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • Figure 22 shows the results of bright field and fluorescence microscopy of the state of aggregate reformation on days 3, 15, and 21 of culture for the reformation of aggregates.
  • Figure 22 confirms that aggregates are reformed and a layered structure is formed in Rx::Venus-negative telencephalic organoids as well, just like in retinal organoids.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on the 31st day after the start of suspension culture were washed with PBS and nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37°C, the aggregates were dispersed into single cells by pipetting.
  • PBS nerve cell dispersion liquid
  • the cells were suspended in 100 ⁇ L of serum-free medium containing 10 ⁇ M Y-27632 (Wako), 300 nM SAG (Enzo), and 3 ⁇ M CHIR99021 (Wako) to give a density of 2.0 ⁇ 10 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (product name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and cultured in suspension at 37°C and 5% CO2 .
  • a non-cell-adhesive 96-well culture plate product name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • the single cells were suspended at 1.0 x 10 6 cells/mL in the following cryopreservation solutions, Cell Banker 1 (TaKaRa), Stem Cell Banker (TaKaRa), CultureSure (registered trademark) cryopreservation solution (CultureSure (registered trademark) Freezing Medium; Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation), STEMdiff (trademark) Neural Progenitor Freezing Medium (Stemcell), StemSure (registered trademark) cryopreservation solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation), and Bambanker (Nippon Genetics Co., Ltd.), and were cryopreserved at -80 °C using Bicell as the frozen group.
  • cryopreservation solutions Cell Banker 1 (TaKaRa), Stem Cell Banker (TaKaRa), CultureSure (registered trademark) cryopreservation solution (CultureSure (registered trademark) Freezing Medium; Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation),
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 25 to 35 days after the start of suspension culture were fixed with 4% PFA and frozen sections were prepared. These frozen sections were immunostained using DAPI and anti-Laminin antibody (trade name: Anti Laminin Antibody, Abcam), anti-Fibronectin antibody (R&D Systems), and anti-Collagen IV antibody (Abcam). These immunostained sections were observed using a confocal laser microscope. As a result, it was confirmed that the aggregates expressed at least Laminin, Fibronectin, and Collagen IV, which are components of the basement membrane (Figure 25). In other words, in this self-organizing culture system, it was found that human retinal tissue formed its own basement membrane and expressed laminin, fibronectin, and collagen IV.
  • Laminin 511, Laminin 521, Laminin 411, Fibronectin, Collagen IV, etc. may be useful as extracellular matrices for regenerating retinal sheets in adhesive culture.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on the 16th day after the start of suspension culture were washed with PBS and nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37°C, the aggregates were dispersed into single cells by pipetting.
  • PBS nerve cell dispersion liquid
  • Matrigel As an extracellular matrix to promote re-sheet formation, Matrigel (Corning) and Laminin511-E8 (trade name iMatrix511, manufactured by Nippi) were used.
  • the above-mentioned dispersed single cells of retinal system cells were suspended and seeded in 300 ⁇ L of serum- free medium containing 10 ⁇ M Y-27632 (Wako), 300 nM SAG (Enzo) and 3 ⁇ M CHIR99021 (Wako) in 24-well Transwell (Corning) under the following three conditions so that the number of cells was 0.5 to 4 ⁇ 10 5 per well.
  • Condition 1 Seeding in 24-well Transwells pre-coated with Matrigel (Matrigel (Pre coat))
  • Condition 2 Seeded onto 24-well Transwells pre-coated with Laminin511-E8 (iMatrix511 (Pre coat))
  • Condition 3 Cells were seeded in a culture medium containing Laminin 511-E8 onto a 24-well Transwell that had not been previously coated (Mix method).
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on days 15 to 30 after the start of suspension culture were washed with PBS, and a nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37° C., the aggregates were dispersed into single cells by pipetting.
  • the cells were suspended in 300 ⁇ L of serum-free medium containing (1) 10 ⁇ M Y-27632 (Wako), (2) 10 ⁇ M Y-27632 (Wako) and 300 nM SAG (Enzo), (3) 10 ⁇ M Y-27632 (Wako) and 5 ⁇ M CHIR99021 (Wako), or (4) 10 ⁇ M Y-27632 (Wako), 300 nM SAG (Enzo), and 3 ⁇ M CHIR99021 (Wako) at 8 ⁇ 10 5 cells per well in a 12-well Transwell coated with Laminin 511-E8, and cultured as adherent cells at 37°C and 5% CO 2 .
  • the medium was replaced with serum-free medium (NucT0) not containing Y-27632, SAG, or CHIR99021 once every 3 to 4 days.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 33 days after the start of suspension culture (dd33) were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37 ° C, they were dispersed into single cells by pipetting.
  • retinal sheets can be regenerated in single-cell dispersed retinal cells (NR) by adding CHIR99021 at a concentration of at least 1-9 ⁇ M for 3-9 days.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 24 days after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37°C, the aggregates were dispersed into single cells by pipetting.
  • retinal sheets can be recreated from single-cell dispersed aggregates (NR) using not only iMatrix511 and Matrigel, but also a variety of scaffold proteins.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on the 15th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37 ° C, the cells were dispersed into single cells by pipetting. After dispersion, the cells were suspended in 200 ⁇ L of serum-free medium containing 10 ⁇ M Y-27632, 300 nM SAG, and 3 ⁇ M CHIR99021 in a 24-well Transwell coated with Laminin511-E8 so that the number of cells per well was 2.0 ⁇ 10 5 , and cultured at 37 ° C, 5% CO 2 for 3 days. After 3 days from seeding, the medium was replaced once every 3 to 4 days with serum-free medium (NucT0) medium not containing Y-27632, SAG, and CHIR99021.
  • serum-free medium NucT0
  • the aggregates on the 29th day after the start of suspension culture were used to re-form a sheet in the same manner.
  • the cell sheet on the 28th day (Day 67) of the reorganization culture was fixed with 4% PFA and frozen sections were prepared. These frozen sections were immunostained using DAPI and anti-Ki67 antibody (R&D Systems), anti-Chx10 antibody (trade name: Anti CHX10 Antibody, EX alpha), anti-Pax6 antibody (BD Pharmingen), anti-Brn3 antibody (Santa Cruz), anti-RxR- ⁇ (RxRg) antibody (Spring Bioscience), and anti-Crx antibody (abnova).
  • dd70 3D Retina (cell aggregates) that had not been flattened (re-sheeted) were also stained (FIGS. 35 to 37). Furthermore, after the cell sheet on Day 57 was fixed with 4% PFA, whole-body immunostaining was performed without preparing sections.
  • DAPI and anti-Chx10 antibody product name: Anti CHX10 Antibody, EX alpha), anti-Sox2 antibody (BD Pharmingen), anti-Ki67 antibody (BD), anti-Pax6 antibody (BioLegend), anti-Brn3 antibody (Santa Cruz) , anti-TUJ1 antibody (Millipore), anti-Islet-1 antibody (R&D Systems), anti-Crx antibody (abnova), anti-Recoverin antibody (Proteintech), anti-Zo-1 antibody (Invitrogen), anti-Collagen IV antibody (Abc Immunostaining was performed using am Co., Ltd.).
  • the dd112 cell sheet was immunostained in the sheet state without cutting.
  • anti-Ribeye antibody CtBP2, BD
  • anti-Recoverin antibody Proteintech
  • anti-Pax6 antibody BioLegend
  • anti-Chx10 antibody trade name: Anti CHX10 Antibody, SantaCruz
  • ⁇ Reference Example 1-13 Maintenance culture of retinal cells using Rx::Venus strain> Human ES cells (KhES-1 line, (Non-Patent Document 3)) genetically modified to have the Rx::Venus reporter gene were cultured under feeder-free conditions according to the method described in "Scientific Reports 4, 3594 (2014)".
  • StemFit medium product name: AK03N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 product name, manufactured by Nippi Co., Ltd.
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on day 31 after the start of suspension culture were washed with PBS, and a nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37° C., the aggregates were dispersed into single cells by pipetting. After dispersion, 10 ⁇ L of Laminin511-E8-coated 12-well Transwells were seeded with 2.0 ⁇ 10 cells per well in 500 ⁇ L of serum-free DMEM/F12 containing 10 ⁇ M Y-27632, 300 nM SAG, and 3 ⁇ M CHIR99021, and N2 was added to the medium.
  • a nerve cell dispersion liquid manufactured by Wako
  • the medium contained (1) Control, (2) 20 ng/mL FGF2, (3) 20 ng/mL EGF, (4) 100 nM SAG, (5) 1 unit LIF, (6) 10 ng/mL IGF-1, (7) 100 ng/mL PDGF-AA, (8) 100 ng/mL PDGF-AB, (9) 10 ⁇ g/mL GDNF, (10) 20 ⁇ g/mL BDNF, (11) 2 ⁇ M Pyrintegrin, and (12) 1 ⁇ M BMP4 were added, and the cells were cultured for 3 days at 37° C. and 5% CO 2. From day 3 after seeding, the medium was replaced once every 3 to 4 days with serum-free medium (DMEM/F12 supplemented with N2) that did not contain Y-27632, SAG, or CHIR99021.
  • serum-free medium DMEM/F12 supplemented with N2
  • the aggregates (NR) prepared in Reference Example 1-1 on the 27th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and a nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37°C, the cells were dispersed into single cells by pipetting. After dispersion, the cells were suspended in 500 ⁇ L of the following medium containing 10 ⁇ M Y-27632, 300 nM SAG, and 3 ⁇ M CHIR99021 to a density of 8.0 ⁇ 10 5 cells/well and seeded on a 12-well Transwell coated with 10 ⁇ L of Laminin511-E8.
  • NeuroCult NS-A (STEMCELL Technologies), (2) STEMdiff Neural Progneitor (STEMCELL Technologies), (3) StemPro NSC SFM (Thermo Fisher), and (4) RHB-A (TaKaRa) were cultured for one month with 20 ng/mL FGF2 and 20 ng/mL EGF.
  • NucT0 medium was used as a control. After 3 days from seeding, the medium was replaced once every 3 to 4 days with a medium that did not contain Y-27632, SAG, and CHIR99021.
  • a collagen gel was prepared using beMatrix low endotoxin collagen solution (Nitta Gelatin Co., Ltd.). Specifically, collagen AT, 5xDME, and reconstitution buffer were mixed in a ratio of 7:2:1, coated on the mesh of a Transwell, and incubated at 37°C in a 5% CO2 incubator for 30 minutes. After incubation, medium was added to the inside and outside of the insert.
  • the aggregates (NR) prepared in Reference Example 1-1 on the 26th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37°C, the cells were dispersed into single cells by pipetting. After dispersion, the cells were seeded on the collagen gel of a 12-well Transwell at 8.0 x 10 5 cells/well. For the first three days, the cells were cultured in the presence of 10 ⁇ M Y-27632, 300 nM SAG, and 3 ⁇ M CHIR99021. After 3 days from seeding, the medium was replaced once every 3 to 4 days with serum-free medium (NucT0 medium) that does not contain Y-27632, SAG, and CHIR99021.
  • serum-free medium NucT0 medium
  • the 26th day aggregates (NR) on the collagen gel prepared as in Reference Example 1-15 were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37°C, the cells were dispersed into single cells by pipetting. After dispersion, the cells were seeded on the collagen gel of a 12-well Transwell at 8.0 x 10 5 cells/well. For the first 3 days, the cells were cultured in the presence of 10 ⁇ M Y-27632, 300 nM SAG, and 3 ⁇ M CHIR99021. After 3 days from seeding, the medium was replaced once every 3 to 4 days with serum-free medium (NucT0 medium) that did not contain Y-27632, SAG, and CHIR99021.
  • serum-free medium NucT0 medium
  • the retinal cell sheets on days 63 and 70 of differentiation after 37 and 44 days of culture were treated with Collagenase (Roche) for 30 minutes at 37°C and detached.
  • the detached retinal sheets were cut into strips using tweezers and scissors to prepare grafts for transplantation with a length of approximately 1.8 cm (Figure 47).
  • the prepared grafts were transplanted under the retina of immunodeficient retinal-deficient rats (SD Foxn) using a glass Pasteur pipette.
  • the sorted cells were seeded on 12-well Transwells (Corning) coated with Laminin511-E8 at 1.6-8.0 x 10 5 cells per well. A sheet without sotting was also prepared as a control.
  • the cells were cultured in the presence of 10 ⁇ M Y-27632, 300 nM SAG, and 3 ⁇ M CHIR99021.
  • the medium was replaced with serum-free medium (NucT0 medium) that did not contain Y-27632, SAG, or CHIR99021 once every 3 to 4 days.
  • the cells were observed using a fluorescent stereomicroscope on the 26th day (FIG. 50).
  • the cell sheet purified with Rx::Venus was fixed with 4% PFA, and immunostaining was performed on the sheet without preparing sections. Immunostaining was performed using DAPI and anti-Recoverin antibody (Proteintech). As a control, a retinal sheet that had not been sorted was also stained ( Figures 51, 52, and 53). After that, frozen sections were prepared and immunostaining was performed using DAPI and anti-Ki67 antibody (BD), anti-Chx10 antibody (trade name: Anti CHX10 Antibody, Santa Cruz), and anti-CRX antibody (TaKaRa) ( Figure 53).
  • ⁇ Reference Example 1-18 Search for factors that maintain the properties of Retina when re-formed into a sheet>
  • Human ES cells KerES-1 line, (Non-Patent Document 3)
  • Rx::Venus reporter gene were cultured under feeder-free conditions according to the method described in "Scientific Reports 4, 3594 (2014).
  • StemFit medium product name: AK03N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 product name, manufactured by Nippi Co., Ltd. was used as a scaffold instead of feeder cells.
  • the aggregates (NR) prepared in Reference Example 1-1 on the 25th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37 ° C., the cells were dispersed into single cells by pipetting, and sorting was performed using Cell sorter ARIAII (BD) with Rx::Venus as an index.
  • the cells after sorting were seeded on a 96-well glass bottom plate (Greiner) coated with Laminin511-E8 using Easy iMatrix, with 5 ⁇ 10 4 cells per well, and 100 ⁇ L of NucT0 was added with Y-27632, CHIR99021, and SAG. At the same time as seeding, the proteins shown in Table 1 or the low molecular weight compounds shown in Table 2 were added.
  • the aggregates (NR) prepared in Reference Example 1-1 on the 24th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37°C, the cells were dispersed into single cells by pipetting, and sorting was performed using Cell sorter ARIAII (BD) with Rx::Venus as an index. The cells after sorting were seeded at 2.0 to 5.0 x 10 4 cells per well on low-adhesion Vplate. As controls, a group without FGF8 (FGF8-) and a group without sorting (no sorting) were also placed.
  • FGF8- group without FGF8
  • no sorting were also placed.
  • the medium was changed once every 3-4 days. FGF8 was also added when changing the medium.
  • Rx::Venus-negative cell clusters or RPE cells were observed in the group without sorting and FGF8- ( Figure 57).
  • FGF8+ FGF8 addition
  • RPE cells were partially observed.
  • Rx::Venus-positive aggregates were formed, and RPE cells or Rx::Venus-negative clusters were not observed.
  • the aggregates on the 54th day of culture (30 days after reseeding) for the purpose of re-formation of the aggregates were washed with PBS and dispersed into single cells using a neuronal cell dispersion liquid (Wako), and then fixed with formaldehyde using Fixation buffer (BD). After washing with Perm/Wash buffer (BD), the cells were stained with anti-CHX10-Alexa Fluo 647 Conjugate antibody (Santacruz), anti-Sox2-BV421 antibody (Biolegend), anti-Ki67-Alexa Fluo 647 Conjugate antibody (BD), and anti-CRX-Alexa Fluo 647 Conjugate antibody (Santacruz).
  • the aggregates (NR) prepared in Reference Example 1-1 on the 24th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37 ° C., the cells were dispersed into single cells by pipetting, and sorting was performed using Cell sorter ARIAII (BD) with Rx::Venus as an index. The cells after sorting were suspended and seeded in 24-well Transwell (Corning) at 2.0 ⁇ 10 5 cells per well in NucT0 medium containing Y-27632, CHIR99021, SAG, and FGF8. As a control, a group without FGF8 (FGF8-) was also placed.
  • FGF8- nerve cell dispersion liquid
  • the medium was changed once every 3-4 days. FGF8 was also added when changing the medium.
  • the sheets on day 63 of differentiation, 40 days after reseeding, were observed under a fluorescent stereomicroscope ( Figures 60 and 61).
  • the aggregates on day 64 of differentiation, 41 days after reseeding were washed with PBS and dispersed into single cells using a nerve cell dispersion liquid (Wako), and then fixed with formaldehyde using Fixation buffer (BD).
  • Wako nerve cell dispersion liquid
  • BD Fixation buffer
  • the aggregates prepared as in Reference Example 1-1 on the 27th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (manufactured by Wako) was added. After incubation at 37 ° C, they were dispersed into single cells by pipetting. After dispersion, the cells were suspended in 200 ⁇ L of serum-free medium containing 10 ⁇ M Y-27632, 300 nM SAG, 3 ⁇ M CHIR99021, and 100 ng / mL FGF8 so that there were 2.0 ⁇ 10 5 cells per well in a 24-well Transwell coated with Laminin 511-E8, and cultured at 37 ° C, 5% CO 2 for 3 days. After 3 days from seeding, the medium was replaced once every 3 to 4 days with serum-free medium (NucT0) medium not containing Y-27632, SAG, CHIR99021, and FGF8.
  • serum-free medium NucT0
  • the above cells were used to initiate suspension culture for differentiation induction as described in Reference Example 1-1.
  • 300 nM SAG was added.
  • the aggregates (NR) on the 19th and 26th days after the start of suspension culture were washed with PBS, and neural cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37°C, the cells were dispersed into single cells by pipetting, and surface antigen screening was performed using a surface antigen screening kit, MACS (registered trademark) Marker Screen, human (Miltenyi) (fluorescent dye conjugate antibody group with Alexa 647). Human ES cells (hESC) were stained as a control. A total of 371 markers were used for screening ( Figures 64-69).
  • FACS analysis was performed using MACS Quant10 (Miltenyi) and FlowJo. Gating was performed on the populations shown by FSC and SSC in Figure 65. First, it was confirmed that staining and analysis were performed accurately using E-Cadherin, SSEA-4, and SSEA-5, which are expressed in hESCs and lose their expression upon differentiation ( Figure 66). The results of the subsequent analysis are summarized in Figure 64.
  • hESC high or there is expression in human ES cells
  • hESC: low means that the expression level is low or there is no expression in human ES cells
  • NR: low means that the expression level is low or there is no expression in neural retinal cells.
  • CD39, CD73, CXCR4, and further CD29, CD49b, CD49c, CD49f, CD57, CD82, CD90, and CD200 may be markers that can distinguish Rx::Venus-positive cells from other cells (Rx::Venus-negative cells, hESCs) ( Figure 67).
  • CD39, CD73, and CD184 were analyzed by FACS analysis using mouse IgG1-APC-Conjugate antibody (Miltenyi), anti-CD39-APC-Conjugate antibody (Miltenyi), anti-CD73-APC-Conjugate antibody (Miltenyi), and anti-CD184 (CXCR4)-APC-Conjugate antibody (Miltenyi) at dd18, dd25, dd53, and dd81 (d18, d25, d53, and d81 in Figure 68) after the start of suspension culture ( Figure 68).
  • the morphology of aggregates created 26 days after the start of suspension culture by adding (1) 0 nM, (2) 30 nM, or (3) 300 nM SAG at the start of differentiation induction was observed under a microscope. As a result, it was confirmed that the aggregates were larger and the layer structure was more clearly visible when 0 nM and 30 nM SAG were added compared to when 300 nM SAG was added at the start of suspension culture (dd0) ( Figure 73).
  • the above aggregates were dispersed into single cells using a nerve cell dispersion liquid, and FACS analysis was performed on the expression of CD39 and CXCR4 using anti-CD39-APC conjugate antibody (Miltenyi) and anti-CXCR4-APC conjugate antibody (Miltenyi).
  • the proportion of expressing cell population was measured using a FACSCantoII (BD Bioscience), and analysis was performed using FlowJo.
  • ⁇ Reference Example 1-25 Examination of enhancement of CD39 expression> Human ES cells (KhES-1 line, (Non-Patent Document 3)) genetically modified to have the Rx::Venus reporter gene were cultured under feeder-free conditions according to the method described in "Scientific Reports 4, 3594 (2014)".
  • StemFit medium product name: AK03N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 product name, manufactured by Nippi Co., Ltd. was used as a scaffold instead of feeder cells.
  • CD39 expression can be enhanced by adding ATP and an A2A receptor agonist.
  • BD Cell sorter ARIAII
  • the medium was changed once every 3-4 days. FGF8 was also added when changing the medium.
  • Crx::Venus cell populations were observed to be sparse in the group where FGF8 was not added, whereas they were uniformly present in the group where FGF8 was added ( Figure 82).
  • the sheets thus produced were collected using collagenase on the 88th day after the start of suspension culture, and a long graft for transplantation was then excised using microscissors (Figure 82), which was then transplanted under the retina of immunodeficient retinal dysfunction rats (SD Foxn).
  • retinal sheets produced from cells sorted by CD39 can be transplanted.
  • the aggregates (NR) were prepared 24-26 days after the start of suspension culture by adding 30 nM SAG at the start of suspension culture (dd0). They were dispersed into single cells using a nerve cell dispersion liquid (Wako) and stained using a surface antigen screening kit, MACS (registered trademark) Marker Screen, human (Miltenyi), to perform surface antigen screening (Alexa 647 fluorescent dye conjugate antibody group).
  • a brain organoid prepared without adding BMP4 on the third day after the start of differentiation induction was stained.
  • FACS analysis was performed using MACS Quant10 (Miltenyi) and analysis was performed using FlowJo. Searching for surface antigens that were not expressed (or were expressed) in Brain Organoids and were expressed (or not expressed) in the Rx::Venus positive group on days 24-26 after the start of suspension culture, it was shown that CD9, CD15, CD49c, CD66b, CD69, CD82, CD164, EpCAM, and ErbB2 (CD340) could be distinguished from Brain Organoids ( Figure 83).
  • CD9, CD24, CD49c, CD90, CXCR4, and EpCAM may be useful markers for distinguishing Rx::Venus positive and negative cells ( Figure 84).
  • hESCs and aggregates (NR) of dd4, dd11, dd18, dd25, dd32, and dd46 which were produced by adding 30 nM SAG at the start of suspension culture (dd0, when differentiation induction began), were dispersed into single cells in a neural cell dispersion medium (Wako), stained with anti-CD9 antibody (BioLegend) conjugated with APC, and after washing the antibody, FACS analysis was performed. FACS analysis was performed using a MACS Quant10 (Miltenyi) and analysis was performed using FlowJo.
  • NR 25th day aggregates prepared by adding 30nM SAG at the start of suspension culture (at the start of differentiation induction, dd0) were dispersed into single cells in a neural cell dispersion medium (Wako), stained with anti-CD9 antibody conjugated with APC (BioLegend), and anti-SSEA1 antibody conjugated with BV421 (BioLegend), measured using a FACSCantoII (BD Bioscience), and analyzed using FlowJo.
  • the percentage of Rx-positive cells in the entire aggregate was approximately 87%, but when CD9-positive cells were gated, it was found that the percentage of Rx-positive cells increased to 94%. Furthermore, when CD9-positive and SSEA1-negative cells were gated, it was found that the percentage of Rx-positive cells increased to approximately 96% ( Figure 86).
  • retinal cells can be further purified.
  • ⁇ Reference Example 1-30 Study of the combination of CD9, CD90, CXCR4, and SSEA1> Human ES cells (KhES-1 line, (Non-Patent Document 3)) genetically modified to have the Rx::Venus reporter gene were cultured under feeder-free conditions according to the method described in "Scientific Reports 4, 3594 (2014)".
  • StemFit medium product name: AK03N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 product name, manufactured by Nippi Co., Ltd. was used as a scaffold instead of feeder cells.
  • NR neural cell dispersion medium
  • the cells were stained with (5) anti-CD9-APC-Conjugate antibody (BioLegend) and anti-CD90-BV421-Conjugate antibody (BioLegend), and (6) anti-CD90-APC-Conjugate antibody (BD) and anti-SSEA1-BV421-Conjugate antibody (BioLegend). After staining, sorting was performed using ARIA II (BD) with the frame shown in FIG. 87 as an index. The cells collected by sorting were subjected to FACS analysis using MACS Quant10 (Miltenyi) to confirm that the target cell fraction was purified (FIG. 87).
  • retinal sheets sorted for CD9 and CD9 and SSEA1 negative or CD90 positive fractions were better than those sorted for Rx::Venus positive, as they were able to remove the RPE fraction.
  • hESCs and aggregates (NR) of dd4, dd11, dd18, dd25, dd32, and dd46 which were produced by adding 30 nM SAG at the start of suspension culture (dd0, when differentiation induction began), were dispersed into single cells using neural cell dispersion medium (Wako), stained with anti-CD9-APC-Conjugate antibody (BioLegend) and anti-SSEA1-BV421-Conjugate antibody (BioLegend), and subjected to FACS analysis. Measurements were performed using a FACSCantoII (BD Bioscience), and analysis was performed using FlowJo.
  • CD9 and SSEA1 were sorted as indicators, and 10 ⁇ M Y-27632, 3 ⁇ M CHIR99021, 300 nM SAG, and 100 ng/mL FGF8 were added.
  • the retinal sheets prepared on the 12-well Transwells were then collected using a scalpel or scissors on the 48th and 62nd days after the start of suspension culture, and long grafts for transplantation were then cut out using microscissors and transplanted under the retina of immunodeficient retinal insufficient rats (SD Foxn) (not shown).
  • retinal sheets produced using cells sorted with CD9 and SSEA1 are transplantable.
  • the aggregates (NR) prepared in Reference Example 1-1 on the 18th to 30th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37 ° C., the cells were dispersed into single cells by pipetting, and 4.0 to 8.0 ⁇ 10 5 cells were seeded per well in a 12-well Transwell. At the time of seeding, Y-27632, SAG, and CHIR99021 were added to the NucT0 medium. Thereafter, the medium was replaced once every 3 to 4 days with NucT0 medium not containing Y-27632, SAG, and CHIR99021, and the culture was continued for more than one month.
  • PBS nerve cell dispersion liquid
  • the RPE aggregates which were differentiated at the same time after 80 days from the start of the floating culture prepared in Reference Example 1-1, were seeded on a dish coated with Laminin511-E8 in a medium containing DMEM (SIGMA) and F12 Ham (SIGMA) medium supplemented with B27 (Gibco), L Glutamin, 10 ng/mL FGF2, and SB431542, and cultured.
  • SIGMA DMEM
  • F12 Ham F12 Ham
  • B27 Gibco
  • L Glutamin 10 ng/mL FGF2, and SB431542
  • 1.0 x 10 6 cells of RPE were seeded on a 12-well TransWell coated with Laminin511-E8, and the medium was changed once every 3 to 4 days, and the culture was continued for more than one month.
  • BeMatrix LS-W gelatin (Nitta Gelatin) was used to adhere the RPE sheet and sheet-like retinal tissue cultured as described above. Specifically, each sheet was retrieved from the Transwell using tweezers and scissors, and the sheet-like retinal tissue and RPE sheet were blended with 10% (w/v) gelatin, then blended with 20% gelatin, and finally 30% gelatin was added to adhere the sheet-like retinal tissue and RPE sheet. After adhesion, the sheets were rapidly cooled to 4°C and incubated for 20 minutes to solidify, and then retrieved to produce a composite sheet in which the sheet-like retinal tissue and RPE sheet were adhered ( Figures 93 to 98).
  • the retinal tissue-RPE composite sheet thus prepared was cut out using tweezers and scissors. First, the composite sheet was cut in half, and then cut into strips along the cut surface (Figure 99). As a result, both sheets were cut out in a state of being adhered to each other via gelatin. When the cross section of the cut composite sheet was observed, RPE with black pigment was confirmed on one side, and Rx::Venus-positive sheet-like retinal tissue was confirmed on the other side, with gelatin packed between them ( Figure 100). To check whether the cut composite sheet would come off during the aspiration and discharge operations of the transplantation process, a 1 mL tip with its tip cut off was used to perform the aspiration and discharge operations. As a result, the composite sheet could be aspirated and discharged many times without separation (Figure 101).
  • a transplantable retinal tissue-RPE composite sheet can be produced by using a sheet-like retinal tissue, an RPE sheet, and gelatin.
  • the aggregates (NR) prepared in Reference Example 1-1 on the 18th to 30th day after the start of suspension culture were washed with PBS, and nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37°C, the cells were dispersed into single cells by pipetting, and 4.0 to 8.0 x 10 5 cells were seeded per well in a 12-well Transwell. At the time of seeding, Y-27632, SAG, and CHIR99021 were added to the NucT0 medium. Thereafter, the medium was replaced once every 3 to 4 days with NucT0 medium not containing Y-27632, SAG, and CHIR99021, and the culture was continued for more than one month (Figure 102).
  • the RPE aggregates which were differentiated at the same time after 80 days from the start of the floating culture prepared in Reference Example 1-1, were seeded on a dish coated with iMatrix511 in a medium containing DMEM (SIGMA) and F12 Ham (SIGMA) medium supplemented with B27 (Gibco), L Glutamin, 10 ng/mL FGF2, and SB431542, and cultured. After the RPE adhered and grew and spread, only the RPE was scraped off using a tip and seeded on another dish coated with iMatrix511 for purification. After expansion culture, 1.0 x 10 6 cells of RPE were seeded on a 12-well TransWell coated with iMatrix511, and the medium was replaced once every 3 to 4 days, and the culture was continued for more than one month (FIG. 102).
  • the retinal tissue sheet cultured as described above was attached to the RPE sheet using Bolheal Tissue Adhesive (Teijin Pharma). Specifically, each sheet was retrieved from the Transwell using tweezers and scissors, 100 ⁇ L of Fibrinogen was added to the retinal tissue sheet and 100 ⁇ L of Thorombin was added to the RPE sheet, and after blending, they were removed (Figs. 103-104). Again, 100 ⁇ L of Fibrinogen was added to the retinal tissue sheet and 100 ⁇ L of Thorombin was added to the RPE sheet (Fig. 104).
  • the RPE sheet was placed on a culture dish with the apical side facing up and the mesh side facing the culture dish, and the retinal tissue sheet was placed on top so that the apical side faced the RPE side (Fig. 105). After adhesion, the sheet was incubated at room temperature for 5 minutes to solidify, and then retrieved to produce an attached sheet (Figs. 106-107).
  • the retinal tissue-RPE composite sheet thus prepared was turned over using tweezers, placed so that the sheet-like retinal tissue was on the bottom and the retinal pigment epithelium sheet was on the top, and observed ( Figure 108). The Transwell mesh that had been attached was also removed ( Figure 109).
  • a retinal tissue-RPE composite sheet can be produced by using a sheet-like retinal tissue, an RPE sheet, and fibrin.
  • ⁇ Reference Example 1-35 Preparation of a planarized sheet on a temperature-sensitive culture dish and examination of detachment and transplantation>
  • Human ES cells KerE-1 line, (Non-Patent Document 3)
  • Rx::Venus reporter gene were cultured under feeder-free conditions according to the method described in "Scientific Reports 4, 3594 (2014).
  • StemFit medium product name: AK03N, manufactured by Ajinomoto Co., Inc.
  • Laminin511-E8 product name, manufactured by Nippi Co., Ltd. was used as a scaffold instead of feeder cells.
  • the aggregates (NR) prepared in Reference Example 1-1 on Day 18-30 were washed with PBS, and a nerve cell dispersion liquid (Wako) was added. After incubation at 37°C, the cells were dispersed into single cells by pipetting, and the cells were seeded at 8.0 x 10 5 cells/well on a 24-well Laminin511-E8-coated temperature-sensitive culture dish (Cell Seed) with seven stages of different detachment degrees. The medium was replaced once every 3-4 days, and after 30 days after seeding, the sheet was formed with a thickness, and then the temperature was lowered to room temperature, incubated for 2 hours, and observed. As a result, it was observed that the retinal sheet could be detached by bringing it to room temperature in multiple wells 2b, 2c, 3, and 4 of the temperature-sensitive culture dishes with seven stages of detachment degrees (Figure 111).
  • retinal sheets can be harvested by culturing them in a temperature-sensitive culture dish.
  • Rx::Venus was sorted as an indicator, and 10 ⁇ M Y-27632, 3 ⁇ M CHIR99021, 300 nM SAG, and 100 ng/mL FGF8 were added.
  • the retinal sheet on the temperature-sensitive culture dish was then incubated at 4°C for 1 hour on the 62nd day after the start of the floating culture, and then harvested.
  • a long graft for transplantation was then cut out using microscissors and transplanted under the retina of immunodeficient retinal insufficient rats (SD Foxn) (not shown).
  • Human iPS cells (LPF11 and DSP-SQ strains, established by Sumitomo Pharma Co., Ltd.) were reprogrammed using commercially available Sendai virus vectors (Oct3/4, Sox2, KLF4, and c-Myc, four factors, IDPharma Cytotune Kit) according to the published protocol of Thermo Fisher Scientific (iPS2.0 Sendai Reprogramming Kit, Publication Number MAN0009).
  • CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310 the published protocol of Kyoto University (Establishment and maintenance of human iPS cells in a feeder-free environment, CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310, http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html), using StemFit medium (AK03, Ajinomoto Co., Inc.) and Laminin511-E8 (Nippi Co., Ltd.).
  • the human iPS cells (LPF11 and DSP-SQ strains) were cultured in a feeder-free manner according to the method described in Scientific Reports, 4, 3594 (2014).
  • StemFit medium (AK03N, Ajinomoto Co., Inc.) was used as the feeder-free medium
  • Laminin511-E8 (Nippon Pharmaceuticals, Inc.) was used as the feeder-free scaffold.
  • human iPS cells LPF11 strain and DSP-SQ strain
  • TrypLE Select TrypLE Select
  • the human iPS cells dispersed into the single cells were seeded on a plastic culture dish coated with Laminin511-E8, and cultured feeder-free in StemFit medium in the presence of Y-27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M).
  • a 6-well plate Iwaki, for cell culture, culture area 9.4 cm 2
  • the seeded cell number of the human iPS cells dispersed into the single cells was 1.0 ⁇ 10 4.
  • the medium was replaced with StemFit medium not containing Y-27632. Thereafter, the medium was replaced with StemFit medium not containing Y-27632 once every 1 to 2 days, and the cells were then cultured for 6 days after seeding.
  • the patterning procedure involved first creating a droplet ( 1 cm in diameter) of a solution (Laminin 511-E8 concentration 3.925 ng/ ⁇ l) made by adding 0.785 ⁇ l of Laminin 511-E8 (Nippon) to 100 ⁇ l of PBS in the center of the well of a 12-well plate (Iwaki, for cell culture, culture area 3.8 cm 2 ), and then incubating the plate at 37°C or room temperature for 1 to 3 hours to prepare a 12-well plate for patterning culture (Laminin 511-E8: 0.5 ⁇ g/cm 2 ).
  • the subconfluent human iPS cells (LPF11 strain) were washed with PBS and dispersed into single cells using TrypLE Select (Life Technologies). The dispersed human iPS cells were then seeded into one well of a culture plate for patterning culture at various cell densities of 0.5 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , and cultured in a feeder-free manner in Stemfit medium in the presence of Y-27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M) ( FIG. 112 ).
  • ROCK inhibitor 10 ⁇ M
  • Y-27632 was then applied for various periods ranging from 2 to 32 hours, after which the medium was replaced with 2 ml of StemFit medium (ROCK inhibitor, 0 ⁇ M) that did not contain Y-27632 ( Figure 114).
  • DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% N2 supplement, and 100 ⁇ M taurine
  • ⁇ Reference Example 2-2 Examination of seeding density of human iPS cells in patterning culture> Human iPS cells (LPF11 strain) were seeded onto a patterning culture plate at various cell densities (cells/cm 2 ) to examine the optimal conditions.
  • the seeding cell concentration of undifferentiated human iPS cells is preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 2.5 ⁇ 10 5 cells/cm 2 in the method for producing retinal tissue by the patterning culture method.
  • ⁇ Reference Example 2-3 Examination of the duration of action of ROCK inhibitor when cells are seeded in patterning culture> The optimal Y-27632 exposure time when seeding human iPS cells (LPF11 and DSP-SQ strains) onto a patterning culture plate was investigated.
  • a 12-well plate for patterning culture prepared by the method described in Reference Example 2-1 was prepared, and subconfluent human iPS cells (LPF11 strain and DSP-SQ strain) were washed with PBS and dispersed into single cells using TrypLE Select (Life Technologies).
  • the human iPS cells dispersed into single cells were then seeded into one well of a culture plate for patterning culture at a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 and cultured feeder-free in Stemfit medium in the presence of Y-27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M). After that, 2, 4, 8, 16, or 32 hours, the medium was replaced with 2 ml of StemFit medium not containing Y-27632.
  • Chx10 anti-Chx10 antibody, Exalpha
  • a retinal progenitor cell marker a retinal progenitor cell marker
  • observation was performed with a fluorescence microscope (Keyence), revealing that no retinal progenitor cells were present in the holes on the surface of the sheet.
  • the percentage of Chx10-positive areas on the sheet surface was calculated using ImageJ software (NIH). The percentage was 91% for sheets exposed to Y-27632 for 32 hours, whereas it was 97% or more for exposure times of 16 hours or less (16 hours: 97%, 8 hours: 99%, 4 hours: 98%, 2 hours: 99%).
  • Chx10-negative holes was counted for each exposure time of Y-27632, and it was found that the large number of holes formed on the sheet surface could be suppressed by limiting the exposure time of Y-27632 to 16 hours or less.
  • human iPS cells DSP-SQ strain
  • a 12-well plate for patterning culture prepared by the method described in Reference Example 2-1 was prepared, and human iPS cells (LPF11 strain) that had become subconfluent were washed with PBS and dispersed into single cells using TrypLE Select (Life Technologies). Thereafter, the human iPS cells dispersed into single cells were seeded in one well of a culture plate for patterning culture at a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , and cultured feeder-free in Stemfit medium in the presence of Y-27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M). After 2 hours, the medium was replaced with 2 ml of StemFit medium not containing Y-27632, and patterning culture was performed by the method described in Reference Example 2-1.
  • human iPS cells LPF11 strain
  • TrypLE Select TrypLE Select
  • the medium was replaced with serum-free medium (gfCDM+KSR) containing exogenous human recombinant BMP4 (R&D) at a final concentration of 0, 1.5, 3, 6, or 12 nM. Thereafter, half of the medium was replaced once every 2-3 days with serum-free medium (gfCDM+KSR) not containing human recombinant BMP4. For half-medium replacement, half the volume of the medium in the culture vessel, i.e. 1 ml, was discarded and 1 ml of new serum-free medium (gfCDM+KSR) was added, making the total medium volume 2 ml.
  • serum-free medium gfCDM+KSR
  • retinal progenitor cell marker Rx (anti-Rx antibody, Takara). These immunostained cells were observed under a fluorescence microscope (Keyence), and the results are shown in Figure 116. Analysis of the images in Figure 116 revealed that the retinal progenitor cell marker Rx was more strongly expressed in retinal tissue in which retinal differentiation was induced at BMP4 concentrations of 3 to 12 nM compared to 1.5 nM BMP4.
  • concentration of total RNA was measured using a measuring device (Nanodrop, Thermo Scientific), and then reverse transcribed into cDNA using reverse transcriptase and primers (Reverse Transcription Master Mix Kit, Fluidigm).
  • a multiplex-PCR reaction was performed using the cDNA and all probes used for verification using a PCR device (Veriti 96well thermal cycler, Applied Biosystems).
  • the pre-run reaction solution was then injected into a multi-well with flow channels (96.96 Dynamic Array IFC, Fluidigm) using an IFC Controller HX (Fluidigm), and the expression levels of marker genes for neural retina and by-products other than neural retina were measured by real-time PCR using a multi-analyte real-time PCR system (Biomark HD, Fluidigm).
  • the final concentration of BMP4, which induces retinal differentiation is preferably 3 to 15 nM when producing retinal tissue using the patterning culture method.
  • a 12-well plate for patterning culture prepared by the method described in Reference Example 2-1 was prepared, and subconfluent human iPS cells (LPF11 strain) were washed with PBS and then dispersed into single cells using TrypLE Select (Life Technologies, Inc.).
  • the human iPS cells dispersed into single cells were seeded into one well of the culture plate for patterning culture at a density of 5.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 in the conventional method and 2.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 in the optimized method, and cultured feeder-free in Stemfit medium in the presence of Y-27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M).
  • the medium was replaced with serum-free medium (gfCDM+KSR) containing exogenous human recombinant BMP4 (R&D) at a final concentration of 1.5 nM in the method of WO2023/003025 and 6 nM in the optimized method. Thereafter, half of the medium was replaced with serum-free medium (gfCDM+KSR) not containing human recombinant BMP4 once every 2-3 days. For the half-medium replacement operation, half the volume of the medium in the culture vessel, i.e. 1 ml, was discarded and 1 ml of new serum-free medium (gfCDM+KSR) was added, making the total medium volume 2 ml.
  • serum-free medium gfCDM+KSR
  • the expression levels of marker genes (Table 3) for neural retina and by-products other than neural retina in the retinal tissue were measured by the method described in Reference Example 2-4.
  • the analysis results of the relative mRNA expression levels of each gene are shown in FIG. 118.
  • the expression levels of neural progenitor cell and retinal progenitor cell marker genes were higher in the retinal tissue differentiated by the method in which various conditions were optimized (optimization method) than in the retinal tissue differentiated by the method of WO2023/003025. It was also found that the expression of various non-target cell marker genes was suppressed to a low level in the retinal tissue differentiated by the optimization method.
  • Example 1 Production of reorganized organoids using retinal progenitor cell sheets
  • the cell aggregates containing retinal progenitor cells prepared by the SFEBq method can be used as a starting material to reorganize and re-form into a sheet.
  • a differentiation method by patterning culture can be used as a method for producing a cell aggregate (adhesive cell aggregate) containing retinal progenitor cells.
  • Retinal tissue containing retinal progenitor cells which is a cell aggregate prepared by patterning culture (also referred to as a retinal sheet or retinal progenitor cell sheet in this specification), has a commonality in cell composition with cell aggregates containing retinal progenitor cells prepared by the SFEBq method, but the cell culture state is different. Therefore, it was examined whether the retinal progenitor cell sheet prepared by patterning can be used as a starting material to reorganize and re-form into a sheet.
  • Human iPS cells (LPF11 line, established by Sumitomo Pharma Co., Ltd.) were regenerated using commercially available Sendai virus vectors (four factors: Oct3/4, Sox2, KLF4, and c-Myc, Cytotune Kit manufactured by IDPharma) according to the published protocol of Thermo Fisher Scientific (iPS2.0 Sendai Reprogramming Kit, Publication Number MAN0009378, Revision 1.0) and the published protocol from Kyoto University (Establishment and maintenance of human iPS cells in a feeder-free environment, CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310, http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html), using StemFit medium (AK03, Ajinomoto Co.) and Laminin511-E8 (Nippi Co.).
  • Sendai virus vectors four factors: Oct3/4, Sox2, KLF4, and c-Myc, Cytotune
  • the human iPS cells were cultured in a feeder-free manner according to the method described in Scientific Reports, 4, 3594 (2014).
  • StemFit medium (AK03N, Ajinomoto Co., Inc.) was used as the feeder-free medium
  • Laminin511-E8 (Nippon Pharmaceuticals, Inc.) was used as the feeder-free scaffold.
  • human iPS cells LPF11 strain
  • TrypLE Select Life Technologies
  • the human iPS cells dispersed into the single cells were then seeded on a plastic culture dish coated with Laminin511-E8 and cultured feeder-free in StemFit medium in the presence of Y27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M).
  • a 6-well plate Iwaki, for cell culture, culture area 9.4 cm 2
  • the seeded cell number of the human iPS cells dispersed into the single cells was 1.0 ⁇ 10 4.
  • the medium was replaced with StemFit medium not containing Y27632. Thereafter, the medium was replaced with StemFit medium (ROCK inhibitor, 0 ⁇ M) not containing Y27632 once every 1 to 2 days, and the cells were cultured until the 6th day after seeding.
  • StemFit medium (ROCK inhibitor, 0 ⁇ M) not containing Y27632
  • the patterning procedure involved first creating a droplet ( 1 cm in diameter) of a solution (Laminin 511-E8 concentration 3.925 ng/ ⁇ l) made by adding 0.785 ⁇ l of Laminin 511-E8 (Nippi) to 100 ⁇ l of PBS in the center of the well of a 12-well plate (Iwaki, for cell culture, culture area 3.8 cm 2 ), and then incubating the plate at 37°C or room temperature for 1 to 3 hours to prepare a 12-well plate for patterning culture (Laminin 511-E8 0.5 ⁇ g/cm 2 ).
  • the subconfluent human iPS cells (LPF11 strain) were washed with PBS and dispersed into single cells using TrypLE Select (Life Technologies).
  • the human iPS cells dispersed into single cells were then seeded into one well of a culture plate for patterning culture at a cell density of 1.0 ⁇ 10 5 cells/cm 2 and cultured feeder-free in Stemfit medium in the presence of Y27632 (ROCK inhibitor, 10 ⁇ M). After that, Y27632 was allowed to act for 2 hours, and the medium was replaced with 2 ml of StemFit medium (ROCK inhibitor, 0 ⁇ M) that did not contain Y27632.
  • the medium was replaced with 2 ml of serum-free medium (gfCDM + KSR). Five days later, the medium was replaced with gfCDM + KSR containing 6 nM human recombinant BMP4 (R&D).
  • half of the medium was replaced with gfCDM+KSR not containing human recombinant BMP4 once every 2-3 days.
  • half the volume of the medium in the culture vessel i.e. 1 ml, was discarded and 1 ml of new gfCDM+KSR was added, making the total medium volume 2 ml.
  • retinal progenitor cell sheets were produced by culturing the cells under 5% CO2 conditions using a control maturation medium (DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% N2 supplement, and 100 ⁇ M taurine).
  • DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% N2 supplement, and 100 ⁇ M taurine.
  • the retinal progenitor cell sheet on the 20th day of patterning culture was dispersed into single cells using a nerve cell dispersion liquid (manufactured by WAKO Co., Ltd.), and the cells were suspended in a control maturation medium so that 1.2 x 104 cells were placed per well in a non-cell-adhesive 96-well plate (product name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and cultured three-dimensionally.
  • Y27632 final concentration 10 ⁇ M
  • SAG final concentration 300 nM
  • CHIR99021 final concentration 3 ⁇ M
  • the reorganized organoids on the 23rd day of suspension culture were fixed with 4% paraformaldehyde and immunostained with retinal progenitor cell markers Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha), Pax6 (anti-Pax6 antibody, BD Biosciences), and Rx (anti-Rx antibody, Takara), photoreceptor progenitor cell marker Crx (anti-Crx antibody, Takara), and apical cell polarity marker ZO-1 (anti-ZO-1 antibody, Invitrogen). These immunostained cells were observed using a confocal laser microscope (LSM880, ZEISS) ( Figure 121).
  • Example 2 Production of a reorganized sheet using a retinal progenitor cell sheet
  • a reorganized sheet could be produced by dispersing the retinal progenitor cell sheet obtained by patterning culture and inducing reorganization under two-dimensional culture ( FIG. 122 ).
  • the retinal progenitor cell sheet on the 20th day of patterning culture prepared by the method described in Example 1 was dispersed into single cells using a nerve cell dispersion liquid (manufactured by WAKO), and the cells were seeded in a control maturation medium at 0.5 x 105 cells per well on a 24-well Transwell (Corning) previously coated with Laminin511-E8 (manufactured by Nippi) and cultured two-dimensionally.
  • Y27632 final concentration 10 ⁇ M
  • SAG final concentration 300 nM
  • CHIR99021 final concentration 3 ⁇ M
  • the reorganized sheets on the 23rd day after seeding in the Transwells were fixed with 4% paraformaldehyde and immunostained for the retinal progenitor cell markers Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha), Pax6 (anti-Pax6 antibody, BD Biosciences), and Rx (anti-Rx antibody, Takara), the photoreceptor progenitor cell marker Crx (anti-Crx antibody, Takara), and the apical cell polarity marker ZO-1 (anti-ZO-1 antibody, Invitrogen).
  • Chx10 anti-Chx10 antibody, Exalpha
  • Pax6 anti-Pax6 antibody, BD Biosciences
  • Rx anti-Rx antibody, Takara
  • the photoreceptor progenitor cell marker Crx anti-Crx antibody, Takara
  • the apical cell polarity marker ZO-1 anti-ZO-1 antibody, Invitrogen
  • the reorganized sheet like the reorganized organoid, was formed of Chx10-, Pax6-, and Rx-positive retinal progenitor cells, and Crx-positive photoreceptor progenitor cells were scattered throughout. Furthermore, since the upper side of the sheet (the side not in contact with the well membrane) was ZO-1 positive, it was found that this reorganized sheet had polarity and was a retinal tissue with the apical surface formed on the upper side.
  • Example 3 Production of reorganized organoids using retinal progenitor cells sorted from retinal progenitor cell sheets
  • the retinal progenitor cell sheet on the 20th day of patterning culture prepared by the method described in Example 1, was dispersed into single cells using a neural cell dispersion liquid (WAKO), and the surface antigen was stained with APC-Conjugate CD9 antibody (BioLegend) at 4°C for 1 hour, and sorting was performed using a MACS Quant Tyto Cell Sorter (Miltenyi).
  • the cells before and after sorting were analyzed by flow cytometry using a MACS Quant Analyzer 10 Flow Cytometer (Miltenyi), and it was confirmed that the CD9-positive cell fraction had been purified ( Figure 126).
  • the purified cells were suspended in control maturation medium and cultured three-dimensionally in a non-cell-adhesive 96-well plate (product name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) at 1.2 x 104 cells per well.
  • a non-cell-adhesive 96-well plate product name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • Y27632 final concentration 10 ⁇ M
  • SAG final concentration 300 nM
  • CHIR99021 final concentration 3 ⁇ M
  • the reorganized organoids were fixed with 4% paraformaldehyde and immunostained for retinal progenitor cell markers Chx10 (anti-Chx10 antibody, Exalpha), Pax6 (anti-Pax6 antibody, BD Biosciences), Rx (anti-Rx antibody, Takara), photoreceptor progenitor cell marker Crx (anti-Crx antibody, Takara), and apical cell polarity marker ZO-1 (anti-ZO-1 antibody, Invitrogen).
  • Chx10 anti-Chx10 antibody, Exalpha
  • Pax6 anti-Pax6 antibody, BD Biosciences
  • Rx anti-Rx antibody, Takara
  • photoreceptor progenitor cell marker Crx anti-Crx antibody, Takara
  • apical cell polarity marker ZO-1 anti-ZO-1 antibody, Invitrogen
  • the reorganized organoids produced from CD9-positive cells sorted from the retinal progenitor cell sheet also had a Chx10, Pax6, and Rx-positive retinal progenitor cell layer with a thickness of about 5 to 10 cells, in which Crx-positive photoreceptor precursor cells were scattered. Furthermore, since the outer surface was ZO-1 positive, it was found that the apical surface was formed on the outside.
  • the expression levels of the neural retina marker Rx gene and the dorsal telencephalon marker Emx2 were measured by real-time PCR.
  • the total RNA concentration was measured using a measuring device (Nanodrop, Thermo Scientific), and then reverse transcribed to cDNA using reverse transcriptase and primers (Reverse Transcription Master Mix Kit, Fluidigm).
  • a multiplex-PCR reaction pre-run was performed using a PCR device (Veriti 96well thermal cycler, Applied Biosystems).
  • the pre-run reaction solution was injected into a multi-well with a channel (96.96 Dynamic Array IFC, Fluidigm) using an IFC controller HX (Fluidigm), and the expression levels of the Rx gene and Emx2 gene were measured by real-time PCR using a multi-analyte real-time PCR system (Biomark HD, Fluidigm).
  • Example 4 Production of a reorganized sheet using retinal progenitor cells sorted from a retinal progenitor cell sheet
  • the retinal progenitor cell sheet on the 20th day of patterning culture prepared by the method described in Example 1 was dispersed into single cells using a neural cell dispersion liquid (WAKO), and the surface antigen was stained with APC-Conjugate CD9 antibody (BioLegend) at 4°C for 1 hour, and sorted using a MACS Quant Tyto Cell Sorter (Miltenyi).
  • the collected cells were seeded at 0.5 x 105 cells per well into 24-well Transwells (Corning) that had been previously coated with Laminin 511-E8 (Nippi). When cells were seeded, Y27632 (final concentration 10 ⁇ M), SAG (final concentration 300 nM), and CHIR99021 (final concentration 3 ⁇ M) were added simultaneously to promote reorganization.
  • the reorganized sheet made from CD9-positive cells sorted from the retinal progenitor cell sheet was formed from Chx10-, Pax6-, and Rx-positive retinal progenitor cells, with Crx-positive photoreceptor precursor cells scattered throughout. Furthermore, since the upper side of the sheet (the side not in contact with the well membrane) was ZO-1 positive, it was found that this reorganized organoid had polarity and was retinal tissue with the apical surface formed on the outside.
  • Example 5 Examination of the optimal concentration of CHIR required for reorganization We investigated the optimal concentrations of a ROCK inhibitor, a substance acting on the Wnt signaling pathway, and a substance acting on the Shh signaling pathway, which are important when dispersing and reorganizing retinal progenitor cell sheets prepared by the patterning culture method.
  • the retinal progenitor cell sheet on the 20th day of patterning culture prepared by the method described in Example 1 was dispersed into single cells using a nerve cell dispersion liquid (manufactured by WAKO Co., Ltd.), and 1.2 x 104 cells per well were suspended and cultured in a control maturation medium on a non-cell-adhesive 96-well plate (product name: PrimeSurface 96-well V-bottom plate , manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).
  • Y27632 final concentration 0 or 10 ⁇ M
  • SAG final concentration 0, 150, 300, or 600 nM
  • CHIR99021 final concentration 0, 1.5, 3, or 6 ⁇ M
  • retinal progenitor cell sheets obtained by patterning culture adhere to the dish and have different properties from floating cell aggregates, they have been demonstrated to be able to be reorganized and remade into sheets as a starting material, and the optimal concentration of the reorganization factors added during this process was clarified.
  • Retinal progenitor cell sheets produced by patterning culture can be mass-produced in a variety of shapes and sizes, making them a useful starting material for reorganization and remaking into sheets, and the feasibility of this has now been demonstrated.

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Abstract

本開示は、上皮構造を有する網膜組織の製造方法であって、以下の工程：（１）細胞接着性を有する領域Ａと、前記領域Ａの少なくとも一部に隣接する前記領域Ａよりも細胞接着性の低い領域Ｂとをその表面に有する培養基材上の領域Ａに、多能性幹細胞を播種すること；（２）工程（１）で播種した多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で培養すること；（３）工程（２）の後に得られた細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で培養し、網膜組織を得ること；（４）工程（３）で得られた網膜組織を分散させ、分散された網膜系細胞集団を得ること；及び（５）工程（４）で得られた分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養又は接着培養すること、を含む方法などを含む。

Description

網膜組織の製造方法
　本出願は、日本国特許出願第２０２３－０５４０１１号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本発明は、網膜組織の製造方法に関する。
　近年、マウス生体の正常な網膜において、適切な分化段階の視細胞前駆細胞を移植すると、機能的に生着することが報告され（非特許文献１）、網膜色素変性等の視細胞の変性疾患に対する移植治療の可能性が示された。
　自己組織化培養による多能性幹細胞から立体網膜組織への分化誘導方法が多数報告されており、層構造を有する立体網膜組織を製造し移植することが可能になりつつある。例えば、多能性幹細胞から多層の網膜組織を得る方法（非特許文献２及び特許文献１）、均一な多能性幹細胞の凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、得られた凝集体を基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、血清培地中で浮遊培養することによって、多層の網膜組織を得る方法（非特許文献３及び特許文献２）、及び、多能性幹細胞の凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養することによって網膜組織を得る方法（非特許文献４及び特許文献３）等が報告されている。これらの網膜組織は、スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状の細胞凝集体として製造される。また、パターニング培養により、多能性幹細胞から網膜組織（網膜シート）を得る方法も報告されている（特許文献４）。
　一方、ニワトリにおいて、Ｗｎｔ２ｂが網膜の上皮構造形成に効果を示すことが報告されているが（非特許文献５）、ニワトリ以外の生物における同様の効果は報告されていない。
国際公開第２０１１／０５５８５５号 国際公開第２０１３／０７７４２５号 国際公開第２０１５／０２５９６７号 国際公開第２０２３／００３０２５号
Maclaren RE et al., "Retinal Repair by Transplantation of Photoreceptor Precursors", Nature, 444, 203-207, (2006) Eiraku M. et al., "Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture", Nature, 472, 51-56, (2011) Nakano T. et al., "Self-formation of Optic Cups and Storable Stratified Neural Retina From Human ESCs" Cell Stem Cell, 10(6), 771-785, (2012) Kuwahara A. et al., "Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue" Nature Communications, 6, 6286, (2015) Nakagawa, S. et al., "Identification of the laminar-inducing factor Wnt-signal from the anterior rim induces correct laminar formation of the neural retina in vitro." Developmental Biology, 260, 414-425, (2003)
　そこで、本発明は上記事情に鑑みて、網膜系細胞から網膜組織の神経上皮構造を再形成させる方法及び当該方法を応用した網膜組織の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、分散した網膜系細胞を出発細胞として、神経上皮構造を再形成させ、網膜組織を製造する際、分散化した網膜系細胞にＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を添加することで神経上皮構造を再形成できることを見出した。また、（１）ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質及び／又は線維芽細胞増殖因子をさらに添加すること、（２）特にシート状での良好な神経上皮構造の再形成のためには細胞接着の足場となる細胞外マトリクスをコーティングした培養プレート上で培養すること、並びに（３）出発細胞として網膜前駆細胞の純度を向上させることにより、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）などの不純細胞が除去されることをさらに見出した。しかし、臨床応用には多数の網膜組織を準備する必要があり、神経上皮構造を再形成する際の原材料としての網膜系細胞のスケールアップが必要であるが、１個のスフィア状の網膜組織から得られる細胞数には限界があり、複数のスフィア状の網膜組織の製造及びそれらからの網膜系細胞の調製は煩雑であった。本発明者らは、網膜シートから得られる網膜系細胞を出発細胞とすることを着想し、この細胞が神経上皮構造の再形成に適することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の各発明に関する。
［１］
　上皮構造を有する網膜組織の製造方法であって、下記の工程を含む方法：
（１）細胞接着性を有する領域Ａと、前記領域Ａの少なくとも一部に隣接する前記領域Ａよりも細胞接着性の低い領域Ｂとをその表面に有する培養基材上の領域Ａに、多能性幹細胞を播種すること、
（２）工程（１）で播種した多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で培養すること、
（３）工程（２）の後に得られた細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で培養し、網膜組織を得ること、及び
（４）工程（３）で得られた網膜組織を分散させ、分散された網膜系細胞集団を得ること、及び
（５）工程（４）で得られた分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養又は接着培養すること。
［２］
　上記領域Ａが、細胞接着性物質でコーティングされている、［１］に記載の方法。
［３］
　上記細胞接着性物質が、ラミニンである、［２］に記載の方法。
［４］
　上記領域Ａが、上記領域Ｂに囲まれている、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
　上記多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　上記工程（１）において、上記多能性幹細胞を０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種する、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
　上記工程（１）において、上記多能性幹細胞を０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２～１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種する、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
　上記工程（２）において、上記ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中での培養が１時間～１６時間である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
　上記工程（２）において、上記ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中での培養が１時間～３時間である、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
　上記工程（２）において、上記ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中での培養が約２時間である、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
　上記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）及びＨ－１１５２からなる群から選択される１以上の物質である、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］
　上記工程（３）において、上記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養が５～１０日間である、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
　上記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地が、３ｎＭ～１５ｎＭのＢＭＰ４、または上記濃度のＢＭＰ４と同等の活性を示す濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
　上記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選択される１以上の物質である、［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
　上記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ４である、［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
　上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ２ｂ及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される１以上の物質である、［１］～［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］
　上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上の物質をさらに含む、［１］～［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］
　上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中のＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）及びＨ－１１５２からなる群から選択される１以上の物質である、［１７］に記載の製造方法。
［１９］
　上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中のＳＨＨシグナル伝達経路作用物質が、ＳＡＧ、ＰＭＡ及びＳＨＨからなる群から選択される１以上の物質である、［１７］又は［１８］に記載の製造方法。
［２０］
　上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８からなる群から選択される１以上の線維芽細胞増殖因子である、［１７］～［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］
　上記工程（５）において、上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養することを含み、上記上皮構造を有する網膜組織が、シート状網膜組織である、［１］～［２０］のいずれかに記載の製造方法。
［２２］
　上記接着培養が、細胞外マトリクス及び／又は温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を用いて行われる、［２１］に記載の製造方法。
［２３］
　上記培養容器の培養面が、上記温度感受性ポリマーでコーティングされ、上記温度感受性ポリマーの上面が、上記細胞外マトリクスでコーティングされる、［２２］に記載の製造方法。
［２４］
　上記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル及びビトロネクチンからなる群から選択される１以上の物質である、［２２］又は［２３］に記載の製造方法。
［２５］
　上記温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を、該温度感受性ポリマーの性質が変化する温度にさらすことにより、上記シート状網膜組織を該培養容器からはがす工程をさらに含む、［２２］～［２４］のいずれかに記載の製造方法。
［２６］
　上記工程（５）に先立ち、上記工程（４）で得られた上記分散された網膜系細胞集団中に含まれる網膜前駆細胞の割合を高める工程をさらに含む、［１］～［２５］のいずれかに記載の製造方法。
［２７］
　網膜色素上皮細胞の混入又は分化が抑制される、［２６］に記載の方法。
［２８］
　上記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、上記分散された網膜系細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させ、当該抗原を発現する細胞集団を得る工程を含む、［２６］又は［２７］に記載の製造方法。
［２９］
　上記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、上記分散された網膜系細胞集団を、さらにＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させ、当該抗原の発現量が基準値以下である細胞集団を得る工程を含む、［２８］に記載の製造方法。
［３０］
　網膜前駆細胞及び／又は視細胞前駆細胞が、上記網膜系細胞集団に含まれる全細胞数の５０％以上を占める、［１］～［２９］のいずれかに記載の製造方法。
［３１］
　網膜前駆細胞及び／又は視細胞前駆細胞が、上記網膜系細胞集団に含まれる全細胞数の８０％以上を占める、［１］～［２９］のいずれかに記載の製造方法。
［３２］
　上記工程（５）において、上記浮遊培養又は接着培養の開始時から、上記分散された網膜系細胞集団を、上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養する、［１］～［３１］のいずれかに記載の製造方法。
［３３］
　上記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地が、３μＭ～６μＭのＣＨＩＲ９９０２１、または上記濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同等の活性を示す濃度のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む、［１］～［３２］のいずれかに記載の製造方法。
［３４］
　上記上皮構造において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっている、［１］～［３３］のいずれかに記載の製造方法。
［３５］
　上記工程（５）の浮遊培養又は接着培養によって得られた上皮構造を有する網膜組織を、移植に必要な大きさに切り出す工程をさらに含む、［１］～［３４］のいずれかに記載の製造方法。
［３６］
　上記上皮構造が、多層構造である、［１］～［３５］のいずれかに記載の製造方法。
［３７］
　［２１］～［３６］のいずれかに記載の方法によりシート状網膜組織を製造すること、及び、上記シート状網膜組織を、接着因子の存在下、シート状又は分散された網膜色素上皮細胞と接合させることを含む、網膜組織（神経網膜及びＲＰＥ細胞の複合体（複合シート））の製造方法。
［３８］
　［２１］～［３６］のいずれかに記載の方法により製造されるシート状網膜組織を、接着因子の存在下、シート状又は分散された網膜色素上皮細胞と接合させることを含む、網膜組織（神経網膜及びＲＰＥ細胞の複合体（複合シート））の製造方法。
［３９］
　上記接着因子が細胞外マトリクス又はハイドロゲルである、［３７］または［３８］に記載の製造方法。
［４０］
　上記接着因子が、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンから選択される１以上の物質である、［３７］～［３９］のいずれかに記載の製造方法。
［４１］
　上記接着因子が、ゼラチン又はフィブリンである、［３７］～［４０］のいずれかに記載の製造方法。
［４２］
　［１］～［４１］のいずれかに記載の方法により製造される網膜組織。
［４３］
　多層構造を有する網膜系細胞層を含む、［４２］に記載の網膜組織。
［４４］
　上記多層構造を有する網膜系細胞層と、上記網膜系細胞層に接合しているシート状網膜色素上皮細胞とを含み、上記網膜系細胞層と上記シート状網膜色素上皮細胞とはそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行しており、上記網膜系細胞層の頂端面と上記シート状網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っており、かつ、上記網膜系細胞層と上記シート状網膜色素上皮細胞とは両者の間に存在する接着因子により接合している、［４３］に記載の網膜組織。
［４５］
　上記接着因子が細胞外マトリクス又はハイドロゲルである、［４４］に記載の網膜組織。
［４６］
　上記接着因子が、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンから選択される１以上の物質である、［４４］又は［４５］に記載の網膜組織。
［４７］
　上記接着因子が、ゼラチン又はフィブリンである、［４４］～［４６］のいずれかに記載の網膜組織。
［４８］
　［４２］～［４７］のいずれかに記載の網膜組織を含む、医薬組成物。
［４９］
　［４２］～［４７］のいずれかに記載の網膜組織を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の、治療方法。
［５０］
　網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療に使用するための、［４２］～［４７］のいずれかに記載の網膜組織。
［５１］
　網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療薬の製造における、［４２］～［４７］のいずれかに記載の網膜組織の使用。
　本発明によれば、網膜系細胞から網膜組織の層構造を再形成させる方法及び当該方法を応用した網膜組織の製造方法、並びに網膜組織を提供することが可能となる。
参考例１－１において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目の凝集体の再形成状態を示す明視野顕微鏡写真である。 参考例１－１において、１２３１Ａ３由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目の凝集体の再形成状態を示す明視野顕微鏡写真である。 参考例１－２において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目に再形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。 参考例１－２において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後７日目に再形成された凝集体の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１４日目に再形成された凝集体の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２において、ＫｈＥＳ－１由来の単一細胞が再形成された凝集体の面積をＩｍａｇｅ　Ｊにて計測した結果を示すグラフである。（Ａ）は播種後１日目、７日目及び１４日目の凝集体の面積を示し、（Ｂ）は播種後１日目の凝集体の面積に対する、７日目及び１４日目の凝集体の面積の比（面積比）を示す。 参考例１－２において、１２３１Ａ３由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１４日目に形成された凝集体の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１５日目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｒｘ::Ｖｅｎｕｓ、Ｃｈｘ１０）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１５日目の凝集体の免疫染色（β-ｃａｔｅｎｉｎ）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後１５日目の凝集体の免疫染色（ＣｏｌｌａｇｅｎＩＶ、Ｚｏ－１）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｃｈｘ１０、Ｋｉ６７、Ｐａｘ６）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いてＲｘ::Ｖｅｎｕｓの蛍光を観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＣｏｌｌａｇｅｎＩＶ、Ｚｏ－１）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｒｘ::Ｖｅｎｕｓ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ、Ｚｏ－１）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｃｈｘ１０、Ｋｉ６７、Ｐａｘ６）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＣＲＸ、ＲｘＲｇ、ＮＲＬ、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－３において、ＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後２８日目の凝集体の免疫染色（ＤＡＰＩ、Ｉｓｌｅｔ－１、Ｂｒｎ３、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ）された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－４において、分化日数が１８日目、２５日目、４０日目、６１日目、及び７５日目のＫｈＥＳ－１由来の凝集体を単一細胞に分散し、播種後３日目、１５日目、２１日目に再形成された凝集体の状態を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－５において、分化日数が４０日目のＫｈＥＳ－１由来の凝集体（ＢＭＰ４＋／ＢＭＰ４－）を単一細胞に分散し、播種後３日目、１５日目、２１日目に再形成された凝集体の状態を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡（Ｒｘ::Ｖｅｎｕｓ）写真である。 参考例１－６において、各種凍結保存液にて凍結保存された分散された網膜系細胞を播種して１日後及び７日後に形成された凝集体の形態を観察した蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－６において、各種凍結保存液にて凍結保存された分散された網膜系細胞を起眠した後の生細胞率（Ａ）、及び起眠した網膜系細胞を用いて再形成された凝集体の面積（Ｂ）を示すグラフである。 参考例１－７において、浮遊培養で形成された網膜組織において発現している基底膜を免疫染色した切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。 参考例１－７において、マウスの胎児神経網膜組織において発現しているＬａｍｉｎｉｎのアイソフォームを調べた結果を示す免疫組織染色像である。 参考例１－８において、条件１～３において、網膜系細胞の単一細胞懸濁液から、接着培養でのシート状網膜組織の再形成を確認した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－８において、条件１～３において、網膜系細胞の単一細胞懸濁液から、接着培養でのシート状網膜組織の再形成を確認した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－９において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成に対する各種因子の効果を確認した結果を示す明視野顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－９において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成における各種因子の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１０において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度及び添加期間を検討した結果を示す明視野顕微鏡写真、蛍光顕微鏡写真及び共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１０において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度及び添加期間を検討した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１１において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＴｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種時の足場を検討した結果を示す明視野顕微鏡写真、明視野及び蛍光顕微鏡写真、並びに、蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す明視野顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１２において、接着培養でのシート状網膜組織の再形成におけるＣＨＩＲ９９０２１の効果を確認した結果を示す共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１３において、各種因子による網膜細胞の維持効果を検討した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１４において、網膜前駆細胞の維持培養に有効な条件の検討結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１５において、コラーゲン上にて再シート化した結果を示す実体顕微鏡写真である。 参考例１－１６において、再シート化した網膜細胞シートから作製した移植用グラフトを示す蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１６において、移植後網膜の眼底を観察した結果を示す蛍光実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１７において、単一細胞に分散された細胞集団からＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の画分をＳｏｒｔｉｎｇするためのＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフである。（Ａ）はドットプロットであり、（Ｂ）はヒストグラムプロットである。 参考例１－１７において、Ｓｏｒｔｉｎｇ有／Ｓｏｒｔｉｎｇ無の細胞集団を観察した実体顕微鏡及び蛍光実体顕微鏡写真である。 参考例１－１７において、Ｓｏｒｔｉｎｇ有／Ｓｏｒｔｉｎｇ無の細胞集団を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１７において、Ｓｏｒｔｉｎｇ有／Ｓｏｒｔｉｎｇ無の細胞集団を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１７において、Ｓｏｒｔｉｎｇした細胞集団を観察した明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１８において、各種タンパク質を添加した場合のＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞集団を観察した蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１８において、各種低分子化合物を添加した場合のＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞集団を観察した蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１８において、異なる濃度のＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８を添加した場合のＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞集団を観察した蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１９において、Ｓｏｒｔｉｎｇ及びＦＧＦ８の添加による凝集体再形成及び網膜分化効果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－１９において、Ｓｏｒｔｉｎｇ及びＦＧＦ８の添加による凝集体再形成及び網膜分化効果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真並びにＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。 参考例１－１９において、ＦＧＦ８の添加による凝集体再形成及び網膜分化効果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真並びにＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。 参考例１－２０において、ＦＧＦ８の添加による再シート化時の影響を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２０において、ＦＧＦ８の添加による再シート化時の影響を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２０において、ＦＧＦ８の添加による再シート化及び網膜分化効果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真及びＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。 参考例１－２１において、再シート化した網膜シートの継時変化を示す実体顕微鏡、蛍光実体顕微鏡写真である。 参考例１－２２において、表面抗原スクリーニングにおいて着目したマーカーを示す図である。 参考例１－２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。 参考例１－２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。 参考例１－２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。 参考例１－２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。 参考例１－２２において、各種表面抗原を用いた細胞Ｓｏｒｔｉｎｇの結果を示すグラフである。 参考例１－２３において、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄへの分化状態を観察した明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２３において、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄへの分化状態を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２３において、でＢｒａｉｎ　ＯｒｇａｎｏｉｄでのＣＤ３９及びＣＤ７３、ＣＸＣＲ４の発現についてのＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。 参考例１－２４において、異なる濃度のＳＡＧによる分化誘導の結果を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２４において、異なる濃度のＳＡＧによる分化誘導後のＣＤ３９及びＣＸＣＲ４の発現についてのＦＡＣＳ解析結果並びに数字化したグラフである。 参考例１－２４において、異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２４において、異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２４において、異なる濃度のＳＡＧによる後のＣＤ３９及びＢＶ４２１の発現についてのＦＡＣＳ解析結果並びに異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２４において、異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２４において、異なる濃度のＳＡＧにより分化誘導した組織の免疫染色像を観察した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２５において、ＣＤ３９の発現を増強し得る物質の検討結果を示すＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。 参考例１－２５において、ＣＤ３９の発現を増強し得る物質の検討結果を示すＦＡＣＳ解析結果を数字化したグラフである。（Ａ）はＣＤ３９陽性かつＲＸ：：ｖｅｎｕｓ陽性の結果であり、（Ｂ）ＣＸＣＲ４陰性かつＲＸ：：ｖｅｎｕｓ陽性の結果である。 参考例１－２６において、ＦＧＦ８－及びＦＧＦ８＋で作製したＩｓｌｅｔ－１　ＫＯ　ｈＥＳＣ－網膜シート（ｄｄ７４）を観察、移植用グラフトを切り出す工程を示す明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－２７において、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄと対比して、ＮＲの各種表面抗原のスクリーニングの結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。 参考例１－２７において、ＮＲの各種表面抗原のスクリーニングの結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。 参考例１－２８において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９の発現の経時変化の結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。 参考例１－２９において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９及びＳＳＥＡ－１の発現を解析した結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。 参考例１－３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。 参考例１－３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示すＦＡＣＳドットプロットである。 参考例１－３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示すグラフである。 参考例１－３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示す写真である。 参考例１－３０において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４及びＳＳＥＡ－１を用いた純化検討の結果を示す写真である。 参考例１－３１において、ｈＥＳＣ－網膜におけるＣＤ９及びＳＳＥＡ－１の発現の経時変化の結果を示すＦＡＣＳ図である。 参考例１－３２において、ゼラチンを用いたＲＰＥシート及び網膜シートの複合化検討を行った過程を示す模式図である。 参考例１－３２において、ゼラチンを用いた複合化に用いたトランズウェル上で培養したＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を観察した実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜をトランズウェルから剥離させ、ゼラチンを添加する過程を示す実体顕微鏡写真である。 参考例１－３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜にゼラチンを添加する過程を示す実体顕微鏡写真である。 参考例１－３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させる過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させた後ピンセットを用いて持ち上げていることを示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３２において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させた後、ハサミを用いて切り出していることを示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３２において、複合化ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を切り出した断面を観察した実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３２において、切り出した複合化ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜の吸引・吐出を観察した実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３３において、Ｆｉｂｒｉｎを用いた複合化に用いたトランズウェル上で培養したＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を観察した実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜をトランズウェルから剥離させる複合化検討の過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３３において、回収したＲＰＥシート及び再シート化に対してＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ及びＴｈｏｒｏｍｂｉｎを添加する複合化検討の過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させる過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させる過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させた後ピンセットを用いて持ち上げていることを示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３３において、ＲＰＥシート及び再シート化した神経網膜を複合化させた状態を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３３において、ＲＰＥシートをトランズウェルのメッシュから剥離させる複合化検討の過程を示す実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡写真である。 参考例１－３４において、セルシフターを用いた不要なハイドロゲルの排出検討結果を示す模式図及び写真である。 参考例１－３５において、温度感受性培養皿上で平面化シートを作製し、剥離する過程を示す写真である。 図１１２は、参考例２－２において、各種細胞密度で播種しパターニング培養したヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）を示す。播種後、１時間、１日、２日、または３日目の結果を示す。 図１１３は、参考例２－２において、各種細胞密度で播種しパターニング培養したヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）（播種後２０日目）をＣｈｘ１０について免疫染色した結果を示す。ＢＭＰ（＋）はＢＭＰ４存在下、ＢＭＰ（－）は非存在下でのパターニング培養を示す。 図１１４は、参考例２－３において、ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）のパターニング培養においてＹ－２７６３２の作用時間を変更した結果を示す。播種後２０日目の明視野顕微鏡像およびＣｈｘ１０の免疫染色結果を示す。 図１１５は、参考例２－３において、ヒトｉＰＳ細胞（ＤＳＰ－ＳＱ株）のパターニング培養においてＹ－２７６３２の作用時間を変更した結果を示す。播種後２０日目のＣｈｘ１０の免疫染色結果を示す。 図１１６は、参考例２－４において、ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）のパターニング培養においてＢＭＰ４濃度を変更した結果を示す。播種後２０日目の明視野顕微鏡像およびＲｘの免疫染色結果を示す。 図１１７は、参考例２－４において、各種ＢＭＰ４濃度でパターニング培養したヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）におけるＣｈｘ１０およびＲｘ（網膜前駆細胞マーカー遺伝子）並びにＥｍｘ２（目的外細胞マーカー遺伝子）の発現を示す。 図１１８は、参考例２－５において、ＷＯ２０２３／００３０２５のパターニング培養法（白）と参考例２のパターニング培養法（黒）とでそれぞれ培養した細胞におけるマーカー遺伝子の発現を示す。破線より左側が神経網膜マーカー遺伝子、右側が目的外細胞マーカー遺伝子である。 図１１９は、実施例１の実験概要を示す。 図１２０は、実施例１において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを単一細胞に分散し、３次元培養下で播種後３日、１３日、および２３日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。 図１２１は、実施例１において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを単一細胞に分散し、３次元培養下で播種後２３日目に形成された凝集体の免疫染色像（Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６、Ｒｘ、Ｃｒｘ、ＺＯ－１）を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。 図１２２は、実施例２の実験概要を示す。 図１２３は、実施例２において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを単一細胞に分散し、２次元培養下で播種後３日、１３日、および２３日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。 図１２４は、実施例２において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを単一細胞に分散し、２次元培養下で播種後２３日目に形成された凝集体の免疫染色像（Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６、Ｒｘ、Ｃｒｘ、ＺＯ－１）を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。 図１２５は、実施例３の実験概要を示す。 図１２６は、実施例３において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを単一細胞に分散し、ＣＤ９陽性の細胞画分を純化した結果を示す。 図１２７は、実施例３において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートからソーティングしたＣＤ９陽性細胞から、３次元培養下で播種後２３日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真（右）及び免疫染色像（Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６、Ｒｘ、Ｃｒｘ、ＺＯ－１）を示す共焦点レーザー顕微鏡写真（左）である。 図１２８は、実施例３において、網膜前駆細胞シートからソーティングしたＣＤ９陽性細胞から形成された凝集体について、Ｒｘ（神経網膜マーカー）およびＥｍｘ２（終脳背側マーカー）の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す。 図１２９は、実施例４の実験概要を示す。 図１３０は、実施例４において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートからソーティングしたＣＤ９陽性細胞から、２次元培養下で播種後２３日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真（右）及び免疫染色像（Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６、Ｒｘ、Ｃｒｘ、ＺＯ－１）を示す共焦点レーザー顕微鏡写真（左）である。 図１３１は、実施例５において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを単一細胞に分散し、Ｙ２７６３２（終濃度０、または１０μＭ）、ＳＡＧ（終濃度０、１５０、３００、または６００ｎＭ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（終濃度０、１．５、３、または６μＭ）の存在下、３次元培養下で播種後２３日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。 図１３２は、実施例５において、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを単一細胞に分散し、Ｙ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＳＡＧ（終濃度３００ｎＭ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（終濃度０、１．５、３、または６μＭ）の存在下、３次元培養下で播種後２３日目に形成された凝集体の形態を示す明視野顕微鏡写真である。
〔定義〕
　「幹細胞」とは、分化能及び増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞系譜すべてに分化しうる能力（分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
　「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。
　１９９８年にヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、内部細胞凝集体をフィーダー細胞上又はｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ株及びＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ株（いずれもＫｈＥＳ－１由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。
　「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。
　人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106）。
　人工多能性幹細胞は、具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ又はＬ－Ｍｙｃ）、（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ－Ｍｙｃ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２０１３；３１：４５８－４６６）を挙げることが出来る。
　人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等により体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。
　また、株化された人工多能性幹細胞を入手することも可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ－Ｉ０１細胞、Ｆｆ－Ｉ１４細胞及びＱＨＪＩ０１ｓ０４細胞が、京都大学より入手可能である。
　本明細書において、多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞である。
　本明細書において、多能性幹細胞は、ヒトの多能性幹細胞であり、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。
　ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、当業者に周知の方法で維持培養及び拡大培養に付すことができる。
　「神経組織」とは、発生期又は成体期の大脳、中脳、小脳、脊髄、網膜、末梢神経、前脳、後脳、終脳、間脳等の、神経系細胞によって構成される組織を意味する。神経組織は、層構造をもつ上皮構造（神経上皮）を形成することがあり、細胞凝集体中の神経上皮は光学顕微鏡を用いた明視野観察により存在量を評価することができる。
　「神経系細胞（Ｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌ）」とは、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。すなわち、神経系前駆細胞、ニューロン（神経細胞）、グリア、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞等の細胞を含む。神経系細胞には、下述する網膜組織を構成する細胞（網膜細胞）、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、神経網膜細胞、網膜色素上皮細胞も包含される。神経系細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、ＴｕＪ１、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ等をマーカーとして同定することができる。
　「神経細胞（Ｎｅｕｒｏｎ・Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌ）」は、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞であり、ＴｕＪ１、Ｄｃｘ、ＨｕＣ／Ｄ等の幼若神経細胞マーカー、及び／又は、Ｍａｐ２、ＮｅｕＮ等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。
　「神経系前駆細胞（Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌ）」は、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞を含む前駆細胞の集合体であり、増殖能とニューロン及びグリア産生能をもつ。神経系前駆細胞はＮｅｓｔｉｎ、ＧＬＡＳＴ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｐａｘ６等をマーカーとして同定することができる。あるいは、神経系細胞のマーカー陽性かつ増殖マーカー（Ｋｉ６７、ｐＨ３、ＭＣＭ）陽性の細胞を、神経系前駆細胞として同定することもできる。
　「網膜組織（Ｒｅｔｉｎａｌ　ｔｉｓｓｕｅ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する網膜系細胞が、一種類又は複数種類、一定の秩序に従い存在する組織を意味し、「神経網膜（Ｎｅｕｒａｌ　Ｒｅｔｉｎａ）」は、網膜組織であって、後述する網膜層のうち網膜色素上皮層を含まない内側の神経網膜層を含む組織を意味する。
　「網膜系細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ　ｃｅｌｌ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する細胞又はその前駆細胞を意味する。網膜系細胞には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体、これらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞等）、神経網膜前駆細胞、網膜前駆細胞等の細胞が含まれるがこれらに限定されない。網膜系細胞のうち、神経網膜層を構成する細胞（神経網膜細胞又は神経網膜系細胞（Ｎｅｕｒａｌ　ｒｅｔｉｎａ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌ）ともいう）として、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、及びこれらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）等の細胞が挙げられる。すなわち、神経網膜系細胞には網膜色素上皮細胞及び毛様体細胞が含まれない。
　「成熟した網膜系細胞」とは、ヒト成人の網膜組織に含まれ得る細胞を意味し、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体細胞等の分化した細胞を意味する。「未成熟な網膜系細胞」とは、成熟した網膜系細胞への分化が決定づけられている前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、網膜前駆細胞等）を意味する。
　視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
　「網膜前駆細胞」とは、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮前駆細胞等のいずれの未成熟な網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞であって、最終的に、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞等のいずれの成熟した網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。「神経網膜前駆細胞」とは、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜神経節細胞前駆細胞、ミュラーグリア細胞等のいずれの未成熟な神経網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞であって、最終的に、視細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞等のいずれの成熟した神経網膜系細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。神経網膜前駆細胞は、網膜色素上皮細胞への分化能は有しない。
　「視細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｃｅｌｌ）」とは、生体においては網膜の視細胞層に存在し、光刺激を吸収し電気信号へと変換する役割を持つ。視細胞には、明所で機能する錐体（ｃｏｎｅ）と暗所で機能する杆体（又は桿体、ｒｏｄ）の２種類がある（それぞれ、錐体視細胞、杆体視細胞という）。また、錐体視細胞としては、Ｓ－ｏｐｓｉｎを発現し青色光を受容するＳ錐体視細胞、Ｌ－ｏｐｓｉｎを発現し赤色光を受容するＬ錐体視細胞、及びＭ－ｏｐｓｉｎを発現し緑色光を受容するＭ錐体視細胞を挙げることができる。視細胞は視細胞前駆細胞から分化し、成熟する。細胞が視細胞若しくは視細胞前駆細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば後述する細胞マーカー（視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１、視細胞で発現するリカバリン（Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）、成熟視細胞で発現するロドプシン、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ等）の発現、外節構造の形成等により容易に確認できる。一態様において、視細胞前駆細胞はＣｒｘ陽性細胞であり、視細胞はロドプシン、Ｓ－Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ－Ｏｐｓｉｎ陽性細胞である。一態様において、桿体視細胞はＮＲＬ及びＲｈｏｄｏｐｓｉｎ陽性細胞である。一態様において、Ｓ錐体視細胞はＳ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞、Ｌ錐体視細胞はＬ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞、及びＭ錐体視細胞はＭ－ｏｐｓｉｎ陽性細胞である。
　神経網膜系細胞の存在は、神経網膜系細胞関連遺伝子（以下、「神経網膜系細胞マーカー」、又は「神経網膜マーカー」という場合がある。）の発現の有無によって確認することができる。神経網膜系細胞マーカーの発現の有無、又は細胞集団若しくは組織における神経網膜系細胞マーカー陽性細胞の割合は、当業者であれば容易に確認することができる。例えば、抗体を用いた手法、核酸プライマーを用いた手法、シーケンス反応を用いた手法が挙げられる。抗体を用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのタンパク質の発現を、例えば、市販の抗体を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫染色等の手法によって、特定の神経網膜系細胞マーカー陽性細胞の数を全細胞数で除することにより確認することができる。核酸プライマーを用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのＲＮＡの発現を、例えば、ＰＣＲ法、半定量ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法（例：リアルタイムＰＣＲ法）で確認することができる。シーケンス反応を用いた手法としては、神経網膜系細胞マーカーのＲＮＡの発現を、例えば、核酸シーケンサ（例：次世代シーケンサ）を用いて確認することができる。
　神経網膜系細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲｘ（Ｒａｘとも言う）及びＰＡＸ６、神経網膜前駆細胞で発現するＲｘ、ＰＡＸ６及びＣｈｘ１０（Ｖｓｘ２とも言う）、視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１等が挙げられる。また、双極細胞で強発現するＣｈｘ１０、双極細胞で発現するＰＫＣα、Ｇｏα、ＶＳＸ１及びＬ７、網膜神経節細胞で発現するＴｕＪ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ及びＨＰＣ－１、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞及び視細胞前駆細胞で発現するＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、桿体細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞で発現するＮｒｌ、錐体視細胞で発現するＳ－ｏｐｓｉｎ及びＬＭ－ｏｐｓｉｎ、錐体細胞、錐体視細胞前駆細胞及び神経節細胞で発現するＲＸＲ－γ、錐体視細胞のうち、分化初期に出現する錐体視細胞又はその前駆細胞で発現するＴＲβ２、ＯＴＸ２及びＯＣ２、水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞で共通して発現するＰａｘ６等が挙げられる。本願参考例において同定された網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の表面抗原を、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞のマーカーとして用いることもできる。詳細は後述する。
　「陽性細胞」とは、特定のマーカーを細胞表面上又は細胞内に発現している細胞を意味する。例えば、「Ｃｈｘ１０陽性細胞」とは、Ｃｈｘ１０タンパク質を発現している細胞を意味する。
　「網膜色素上皮細胞」とは、生体網膜において神経網膜の外側に存在する上皮細胞を意味する。細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば細胞マーカー（ＭＩＴＦ、Ｐａｘ６、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＴＲＰＭ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＧＰＮＭＢ、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１、ＴＴＲ等）の発現や、メラニン顆粒の存在（黒褐色）、細胞間のタイトジャンクション、多角形・敷石状の特徴的な細胞形態等により容易に確認できる。細胞が網膜色素上皮細胞の機能を有するか否かは、ＶＥＧＦ及びＰＥＤＦ等のサイトカインの分泌能や視細胞外節の貪食能等により容易に確認できる。一態様において、網膜色素上皮細胞はＲＰＥ６５陽性細胞、ＭＩＴＦ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭＩＴＦ陽性細胞である。
　「網膜色素上皮細胞シート」とは、網膜色素上皮細胞が少なくとも二次元の方向に生物学的結合により互いに接着し、単一又は複数の細胞から構成される単層又は重層のシート状の構造体を意味する。
　「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。
　「神経網膜層」とは、神経網膜を構成する各層を意味し、具体的には、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。「視細胞層」とは、神経網膜の最も外側に形成され、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を多く含む網膜層を意味する。視細胞層以外の各層を内層という。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現の有無又は発現の程度等によって確認できる。
　視細胞又は視細胞前駆細胞の出現割合が少ない段階の網膜組織の場合、増殖する神経網膜前駆細胞を含む層を「ニューロブラスティックレイヤー（neuroblastic layer）」といい、inner neuroblatic layerとouter neuroblastic layerが存在する。当業者であれば周知の方法、例えば明視野顕微鏡の下では、色の濃淡（outer neuroblastic layerが薄く、inner neuroblatic layerが濃い）により判断することができる。
　「毛様体」は、発生過程及び成体の「毛様体」、「毛様体周縁部」、「Ｃｉｌｉａｒｙ　ｂｏｄｙ」を含む。「毛様体」のマーカーとしては、Ｚｉｃ１、ＭＡＬ、ＨＮＦ１ｂｅｔａ、ＦｏｘＱ１、ＣＬＤＮ２、ＣＬＤＮ１、ＧＰＲ１７７、ＡＱＰ１及びＡＱＰ４があげられる。「毛様体周縁部（ｃｉｌｉａｒｙｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ；ＣＭＺ）」としては、例えば、生体網膜において神経網膜と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ｃｉｌｉａｒｙｍａｒｇｉｎ）又は網膜縁（ｒｅｔｉｎａｌｍａｒｇｉｎ）とも呼ばれ、毛様体周縁部、毛様体縁及び網膜縁は同等の組織である。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞、分化細胞の供給、網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Ｒｄｈ１０遺伝子（陽性）、Ｏｔｘ１遺伝子（陽性）及びＺｉｃ１（陽性）を挙げることができる。「毛様体周縁部様構造体」とは、毛様体周縁部と類似した構造体のことである。
　「大脳組織」とは、胎児期又は成体の大脳を構成する細胞（例、大脳神経系前駆細胞（cortical neural precursor cell）、背側大脳神経系前駆細胞、腹側大脳神経系前駆細胞、大脳層構造特異的神経細胞（ニューロン）、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、グリア細胞（アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）、これらの前駆細胞など）が、一種類又は少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。胎児期の大脳は、前脳又は終脳とも呼ばれる。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無若しくはその程度等により確認できる。
　「大脳層」とは、成体大脳又は胎児期大脳を構成する各層を意味し、具体的には、分子層、外顆粒層、外錐体細胞層、内顆粒層、神経細胞層（内錐体細胞層）、多型細胞層、第一層、第二層、第三層、第四層、第五層、第六層、皮質帯、中間帯、脳室下帯、及び、脳室帯（ventricular zone）を挙げることができる。
　「大脳神経系前駆細胞」としては、ニューロン前駆細胞、第一層ニューロン前駆細胞、第二層ニューロン前駆細胞、第三層ニューロン前駆細胞、第四層ニューロン前駆細胞、第五層ニューロン前駆細胞、第六層ニューロン前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞等を挙げることができる。それぞれの細胞は、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、アストロサイト、及び、オリゴデンドロサイトへの分化が決定付けられている前駆細胞である。
　「大脳神経系前駆細胞」は、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、アストロサイト、及び、オリゴデンドロサイトのうちの少なくとも複数の分化系譜への分化能（多分化能）をもつ複能性幹細胞（複能性神経幹細胞、multi-potent neural stem cell）を含む。
　「大脳層特異的神経細胞」とは、大脳層を構成する細胞であって大脳層に特異的な神経細胞を意味する。大脳層特異的神経細胞としては、第一層ニューロン、第二層ニューロン、第三層ニューロン、第四層ニューロン、第五層ニューロン、第六層ニューロン、大脳興奮性ニューロン、大脳抑制性ニューロン等を挙げることができる。
　大脳細胞マーカーとしては、大脳細胞で発現するＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、大脳神経系前駆細胞で発現するＳｏｘ２及びＮｅｓｔｉｎ、背側大脳神経系前駆細胞で発現するＰａｘ６及びＥｍｘ２、腹側大脳神経系前駆細胞で発現するＤｌｘ１、Ｄｌｘ２及びＮｋｘ２．１、ニューロン前駆細胞で発現するＴｂｒ２、Ｎｅｘ、Ｓｖｅｔ１、第六層ニューロンで発現するＴｂｒ１、第五層ニューロンで発現するＣｔｉｐ２、第四層ニューロンで発現するＲＯＲβ、第三層ニューロン又は第二層ニューロンで発現するＣｕｘ１又はＢｒｎ２、第一層ニューロンで発現するＲｅｅｌｉｎなどが挙げられる。
　「細胞凝集体」（Ｃｅｌｌ　Ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、複数の細胞同士が接着して立体構造を形成しているものであれば特に限定はなく、例えば、培地等の媒体中に分散していた細胞が集合して形成する塊、又は細胞分裂を経て形成される細胞の塊等をいう。細胞凝集体には、特定の組織を形成している場合も含まれる。
　「スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状細胞凝集体」は、球状に近い立体的な形を有する細胞凝集体を意味する。球状に近い立体的な形とは、三次元構造を有する形であって、二次元面に投影したときに、例えば、円形又は楕円形を示す球状形、及び球状形が複数融合して形成される形状（例えば二次元に投影した場合に２～４個の円形若しくは楕円形が重なりあって形成する形を示す）が挙げられる。一態様において、凝集体のコア部は、小胞性層状構造を有し、明視野顕微鏡の下では、中央部が暗く外縁部分が明るく観察されるという特徴を有する。
　「上皮組織」とは、体表面、管腔（消化管など）、体腔（心膜腔など）などの表面を細胞が隙間なく覆うことで形成される組織である。上皮組織を形成している細胞を上皮細胞という。上皮細胞は、細胞が頂端（ａｐｉｃａｌ）－基底（ｂａｓａｌ）方向の極性を持つ。上皮細胞は、接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）及び／又は密着結合（ｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）により上皮細胞同士で強固な結合をつくり、細胞の層を形成できる。この細胞層が、１ないし十数層重なってできた組織が上皮組織である。上皮組織を形成し得る組織には、胎児期及び／又は成体の網膜組織、脳脊髄組織、眼球組織、神経組織等も含まれる。本明細書における神経網膜も上皮組織である。「上皮構造」とは、上皮組織が特徴的に有する構造（例：基底面及び頂端面の極性を有する）を意味する。
　「連続上皮組織」とは、連続上皮構造を有する組織である。連続上皮構造とは、上皮組織が連続している状態のことである。上皮組織が連続しているとは、例えば、上皮組織に対する接線方向に１０細胞～１０７細胞、好ましくは接線方向に３０細胞～１０７細胞、さらに好ましくは１０２細胞～１０７細胞、並んでいる状態のことである。
　例えば、網膜組織において形成される連続上皮構造は、網膜組織が上皮組織に特有の頂端面を持ち、頂端面が神経網膜層を形成する各層のうち、少なくとも視細胞層（外顆粒層）等と概ね平行に、かつ連続的に網膜組織の表面に形成される。例えば、多能性幹細胞より作製した網膜組織を含む細胞凝集体の場合、凝集体の表面に頂端面が形成され、表面に対して接線方向に１０細胞以上、好ましくは３０細胞以上、より好ましくは１００細胞以上、さらに好ましくは４００細胞以上の視細胞又は視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。
　一態様において、上皮組織は極性化して「頂端面（ａｐｉｃａｌ　ｓｕｒｆａｃｅ）」と「基底面」及び「基底膜」ができる。「基底膜」とは、上皮細胞が産生した基底（ｂａｓａｌ）側の層（基底膜）のことをいい、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンを多く含み、５０～１００ｎｍの厚さを有する。「基底面」は「基底膜」側に形成される表面（表層面）のことをいう。「頂端面」は、「基底膜」と反対側に形成される表面（表層面）のことをいう。一態様において、「頂端面」は視細胞又は視細胞前駆細胞が認められる程度に発生段階が進行した網膜組織においては、外境界膜が形成され、視細胞、視細胞前駆細胞が存在する視細胞層（外顆粒層）に接する面のことをいう。また、このような頂端面は、頂端面のマーカー（例：ａｔｙｐｉｃａｌ－ＰＫＣ（以下、「ａＰＫＣ」と略す）、Ｔｉｇｈｔ　Ｊｕｎｃｔｉｏｎマーカー（Ｚｏ－１）、ＥＲＭタンパク質であるＥｚｒｉｎ、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）に対する抗体を用いて、当業者に周知の免疫染色法等で同定することができる。
〔細胞凝集体の製造方法〕
　本発明の一態様は、分散された網膜系細胞集団から、上皮構造（又は多層構造）を有する網膜組織を含む細胞凝集体（本明細書において、「網膜組織を含む細胞凝集体」を単に「網膜組織」という場合がある）を製造するための製造方法である。該方法は、分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養又は接着培養することを含む。
　網膜系細胞は、上記に定義されているとおりであり、一態様において、網膜系細胞は網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、他に視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞等の細胞を含んでもよい。網膜系細胞は神経網膜系細胞であることが好ましい。。
（出発細胞としての網膜系細胞集団の分化誘導方法）
　本発明の製造方法の出発細胞としての多能性幹細胞由来の網膜系細胞は、多能性幹細胞を分化誘導することによって得ることができる。具体的には、出発細胞としての網膜系細胞集団は、
（１）細胞接着性を有する領域Ａと、前記領域Ａの少なくとも一部に隣接する前記領域Ａよりも細胞接着性の低い領域Ｂとをその表面に有する培養基材上の領域Ａに、多能性幹細胞を播種すること、
（２）工程（１）で播種した多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で培養すること、
（３）工程（２）の後に得られた細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で培養し、網膜組織を得ること、及び
（４）工程（３）で得られた網膜組織を分散させ、分散された網膜系細胞集団を得ること
を含む方法により得ることができる。
　領域Ａは、多能性幹細胞を接着培養で維持できる領域である。領域Ｂは、領域Ａに多能性幹細胞を播種した場合に、網膜組織への分化誘導中に（すなわち、網膜組織への分化が確認できるまでの期間）、前記領域Ａに隣接する領域Ｂに細胞が伸展しない程度に、領域Ａよりも細胞接着性の低い領域である。細胞接着性の比較は、その面積に対して過剰量（例えば、５×１０５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の多能性幹細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養後、細胞が接着する面積の割合を比較することにより行うことができる。前記の細胞接着性は、通常、２４時間培養後に培地を除去し、培地または緩衝液で細胞を洗浄して、未接着の細胞を除去した後に評価する。
　領域Ａは、例えば、その面積に対して過剰量（例えば、５×１０５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の多能性幹細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養後、その面積の７０％以上、８０％以上、または９０％以上に細胞が接着する領域でありうる。
　一態様において、領域Ｂは、細胞非接着性の領域である。細胞非接着性の領域とは、多能性幹細胞を接着培養で維持するのに十分な細胞接着性を有さないことを意味する。細胞非接着性の領域は、例えば、その面積に対して過剰量（例えば、５×１０５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の多能性幹細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養後、その面積の３０％以下、２０％以下、または１０％以下に細胞が接着する領域でありうる。
　培養基材は、その表面に領域Ａと領域Ｂとを形成することができれば、いずれの材質で形成されていてもよい。培養基材は、例えば、金属、ガラス、およびシリコーン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリテトラフルオロエチレン４フッ化エチレン樹脂）等の有機材料でありうる。一態様において、培養基材は、ガラスまたはプラスチック、特にポリスチレン樹脂である。
　培養基材は、一般的に細胞培養に使用される形状であればよく、特に限定されない。培養基材は、例えば、シャーレ、プレート、ボトル、チャンバー、マルチウェルプレート（例えば、６、１２、２４、４８、９６、または３８４ウェルプレート）などの培養容器、フィルム、または多孔質膜でありうる。培養基材は、通常、重力の方向に対して水平方向の表面上（培養容器の場合、底部表面上）に領域Ａおよび領域Ｂを有する。一態様において、培養基材は、同一平面上に領域Ａおよび領域Ｂを有する。一態様において、培養容器が底部表面の平面上に領域Ａおよび領域Ｂを有する場合、培養容器の内壁面は領域Ｂではない。本明細書において、後述のとおり、培養基材が表面に凸部を有し、その凸部上面に領域Ａを有する場合、凸部上面に隣接する凸部側面を領域Ｂとするが、凸部上面の領域Ａと凸部側面の領域Ｂとは同一平面状に存在するとみなす。
　領域Ａは、細胞接着性の培養基材の表面が露出した領域であってもよく、培養基材の表面に細胞接着性をもたせるため、または培養基材の表面の細胞接着性を高めるため、培養基材の表面を細胞接着性の物質でコーティングした領域であってもよい。細胞接着性物質としては、ポリＬ－リジンおよびポリＬ－オルニチンなどの正電荷ポリマー；ラミニン；Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン等のコラーゲン；テネイシン；フィブリリン；フィブロネクチン；ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）；エラスチン；エンタクチン；コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸等の硫酸化グルコサミノグリカンと、コアタンパク質とから構成されるプロテオグリカン；コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸等のグルコサミノグリカン；Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標、ビトロネクチン誘導体）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）などが挙げられる。
　一態様において、領域Ａは、ラミニンでコーティングされている。ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ三量体分子であり、α鎖はα１～α５の５種類、β鎖はβ１～β３の３種類、γ鎖はγ１～γ３の３種類が知られており、各ラミニンアイソフォームは構成サブユニットを示す数字で表される（例えば、ラミニン１１１は、α１鎖、β１鎖、およびγ１鎖から構成される）。ラミニンには、ラミニン１１１、ラミニン１２１、ラミニン２１１、ラミニン２１３、ラミニン２２２、ラミニン３１１（ラミニン３Ａ１１）、ラミニン３３２（ラミニン３Ａ３２）、ラミニン３２１（ラミニン３Ａ２１）、ラミニン３Ｂ３２、ラミニン４１１、ラミニン４２１、ラミニン４２３、ラミニン５１１、ラミニン５２１、ラミニン５２２、ラミニン５２３、またはこれらの断片が含まれる。ラミニンの断片としては、インテグリン結合部位の断片であるＥ８断片、例えば、ラミニン２１１－Ｅ８、ラミニン３１１－Ｅ８、ラミニン４１１－Ｅ８、ラミニン５１１－Ｅ８などが挙げられる。一態様において、ラミニンは、ラミニン５１１またはその断片である。さらなる態様において、ラミニンは、ラミニン５１１－Ｅ８断片である。ラミニンによるコーティングのため、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ．　Ｉｎｃ．）などの市販品を用いることもできる。ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ．　Ｉｎｃ．）はラミニン５１１－Ｅ８断片を含む。
　領域Ｂは、領域Ａよりも細胞接着性の低い培養基材の表面が露出した領域であってもよく、領域Ａよりも細胞接着性の低い領域とするため、培養基材の表面を何らかの物質でコーティングした領域であってもよい。一態様において、領域Ｂは、細胞非接着性の物質によりコーティングされている。細胞非接着性物質としては、ＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマー；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ポリエチレンオキサイド；カルボキシビニルポリマー；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；ポリアクリルアミド、ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド等のポリアミド；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、デキストラン等の多糖類；アルブミンおよびこれらの誘導体などが挙げられる。一態様において、細胞非接着性物質は、ＭＰＣポリマーである。
　領域Ａの形状は、特に限定されず、例えば、円形、楕円形、および多角形（例えば、三角形、四角形、五角形、六角形、八角形、十角形、十二角形など）が挙げられる。一態様において、領域Ａは円形である。本明細書において、円形とは、当業界で実質的に円形と認識される形状であればよく、真円を含む略円形の意味で用いられる。領域Ａの面積は、例えば、０．０１～１００ｃｍ２、０．０１～３０ｃｍ２、０．０１～１０ｃｍ２、０．０３～３０ｃｍ２、０．０３～１０ｃｍ２、または０．１～１０ｃｍ２でありうるが、これに限定されない。一態様において、領域Ａの面積は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１ｃｍ２以上、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１　ｃｍ２以下（上限および下限は独立に選択される）である。例えば、領域Ａの面積は、０．５～１０ｃｍ２、０．７～１０ｃｍ２、１～１０ｃｍ２、０．５～５ｃｍ２、０．７～５ｃｍ２、１～５ｃｍ２、０．５～２ｃｍ２、０．７～２ｃｍ２、０．５～１ｃｍ２、または０．７～１ｃｍ２でありうる。
　領域Ａは、直径が、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１ｃｍ以上、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｃｍ以下（上限および下限は独立に選択される）の、円形、またはこれと同面積の多角形でありうる。一態様において、領域Ａは、直径が、０．１～１０ｃｍ、０．１～５ｃｍ、０．１～３ｃｍまたは０．２～１ｃｍの円形である。さらなる態様において、領域Ａは、直径が、１～１０ｃｍ、１～５ｃｍ、または１～３ｃｍの円形である。
　領域Ａは、その少なくとも一部が領域Ｂに隣接する。一態様において、領域Ａは、その外縁全体が領域Ｂに隣接する（すわなち、領域Ｂに囲まれている）。培養基材はその表面上に複数の領域Ａおよび／または複数の領域Ｂを有してもよい。培養基材がその表面上に複数の領域Ａを含む場合、領域Ｂを挟む２つの領域Ａの間隔は、限定はされないが、例えば、約１ｍｍまたはこれ以上である。
　領域Ａおよび領域Ｂは、細胞のパターニングに用いられるいずれの方法により培養基材表面に形成してもよい。領域Ａおよび領域Ｂは、例えば、ソフトリソグラフィー、フォトリソグラフィー、３Ｄプリンティングなどの技術により培養基材表面に形成することができる。
　領域Ａおよび領域Ｂは、培養基材の表面の一部を処理して処理領域と非処理領域の細胞接着性を異なるものとすることにより、形成することができる。領域Ａおよび領域Ｂは、例えば、培養基材の表面の一部を細胞接着性物質または細胞非接着性物質でコーティングすることにより、形成することができる。例えば、培養基材の表面の一部をマスキングし、マスキングされてない領域を細胞接着性物質または細胞非接着性物質でコーティングすることが考えられる。あるいは、培養基材上に細胞接着性物質または細胞非接着性物質の層を形成し、その一部を処理して細胞接着性を変化させてもよい。処理した部分は、培養基材の表面が露出した部分、または細胞非接着性物質または細胞接着性物質の性質が前記処理により変化した部分でありうる。
　例えば、領域Ａの形状およびサイズの穴を有するシートを３Ｄプリンターでプリントした鋳型により作成し、培養基材の表面をこのシートで覆い、シートで覆われていない表面を細胞接着性物質によりコーティングし、その後シートを取り除くことにより、培養基材上に領域Ａおよび領域Ｂを形成することができる。あるいは、領域Ａの形状およびサイズのシートを作成し、培養基材の表面に置き、シートで覆われていない表面を細胞非接着性物質によりコーティングした後、シートを取り除き、シートで覆われていた表面を細胞接着性物質でコーティングすることにより、培養基材上に領域Ａおよび領域Ｂを形成することもできる。シートは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレングリコールハイドロゲル、またはアガロースゲルなどの生体適合性材料により形成することができる。コーティングは、例えば、培養基材を細胞接着性物質または細胞非接着性物質の溶液と接触させて３７℃または室温で必要な時間（例えば、１時間以上）反応させることにより行うことができる。細胞接着性物質および細胞非接着性物質の濃度は、当業者が適宜決定しうるが、例えば、ラミニンの場合、０．１～１μｇ／ｃｍ２、０．１～０．５μｇ／ｃｍ２、または約０．２５μｇ／ｃｍ２でありうる。また、上記のようなシートを用いずに、培養基材上に細胞接着性物質の溶液の液滴を作り反応させることによっても、培養基材上に領域Ａおよび領域Ｂを形成することができる。
　本開示において、培養基材は表面に凸部（ピラー（ｐｉｌｌａｒ）ともいう）を有し、その凸部上面に領域Ａを有してもよい。この場合、凸部上面に隣接する凸部側面を領域Bとする。凸部の形状は、特に限定されず、円柱または角柱であってもよい。本明細書において、円柱は、その断面が当業界で実質的に円形と認識される形状であればよく、断面が真円を含む略円形の柱の意味で用いられる。一態様では、凸部が円柱状である。凸部の高さは、限定はされないが、例えば、０．１ｍｍ～１０ｍｍ、０．１ｍｍ～５ｍｍ、１ｍｍ～５ｍｍ、または３ｍｍ～５ｍｍ、例えば４ｍｍである。凸部の材質は、培養基材と同じてあっても異なっていてもよい。凸部の材質としては、培養基材の材質として本明細書に例示されるものに加え、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ＰＡ）およびポリメチルグルタルイミド（ＰＭＧＩ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン酢酸ビニル（ＰＥＶＡ）、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）などが挙げられる。
　細胞は、領域Ａのみに播種しても、領域Ａと領域Ｂとを含む培養基材上全体に播種してもよい。例えば、領域Ｂが細胞非接着性の領域である場合、培養基材上全体に播種することができる。一態様において、多能性幹細胞は、細胞が領域Ａの７０％以上を占めるような細胞数で培養基材に播種される。別の態様において、多能性幹細胞は、０．５×１０５、０．６×１０５、０．７×１０５、０．８×１０５、０．９×１０５、１．０×１０５、１．１×１０５、１．２×１０５、１．３×１０５、１．４×１０５、１．５×１０５、１．６×１０５、１．７×１０５、１．８×１０５、１．９×１０５、２．０×１０５、２．１×１０５、２．２×１０５、２．３×１０５、または２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上、２．５×１０５、２．４×１０５、２．３×１０５、２．２×１０５、２．１×１０５、２．０×１０５、１．９×１０５、１．８×１０５、１．７×１０５、１．６×１０５、１．５×１０５、１．４×１０５、１．３×１０５、１．２×１０５、１．１×１０５、１．０×１０５、０．９×１０５、０．８×１０５、０．７×１０５、または０．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下（上限および下限は独立に選択される）で培養基材に播種される。例えば、多能性幹細胞は、０．５×１０５～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、１．０×１０５～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、１．５×１０５～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、０．５×１０５～２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、１．０×１０５～２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ、または０．５×１０５～１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種されうる。典型的には、酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、パパイン）および／またはキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））を含む細胞分散液を用いて回収および分散した多能性幹細胞を、所望の培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養基材上に加える。細胞分散液として、例えば、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの市販品を用いてもよい。
　多能性幹細胞の網膜系細胞への分化誘導は、前記培養基材上で接着培養により行う。多能性幹細胞を培養基材へ播種後、未分化維持因子を含む培地で一定期間培養した後、多能性幹細胞の網膜系細胞への分化誘導を開始してもよい。出発細胞としての網膜系細胞の製造に関して記載する場合、未分化維持因子を含まない培地での培養を開始した時点を、網膜系細胞への分化誘導を開始した時点とする。
　本開示において、多能性幹細胞の網膜系細胞への分化誘導は、多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することを含む。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養は、分化誘導開始時から開始しても、分化誘導開始から一定期間後（例えば、４～６日後）に開始してもよい。
　多能性幹細胞の網膜系細胞への分化誘導は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養に先立ち、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を含む培地で多能性幹細胞を培養することを含んでもよい。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加に先立ち細胞をＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下で培養すると、網膜組織への分化効率を高めることができる。
　多能性幹細胞の網膜系細胞への分化誘導に用いる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、またはこれらの混合培地が挙げられる。
　培地は、血清、血清代替物、増殖因子、未分化維持因子、タンパク質（例えば、サイトカイン、インシュリン）、脂肪酸、脂質、ビタミン、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸、レチノイド類、グルタミン、タウリン）、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、１－チオグリセロール、抗生物質、緩衝剤、無機塩類から選択される１種以上の成分を、必要に応じて基礎培地に加えたものでありうる。血清代替物としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、１－チオグリセロール、およびこれらの均等物、並びにこれらの混合物が挙げられる。培地は、ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘ，　ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＩＴＳ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの市販の血清代替物を含んでもよい。培地は、基礎培地に上記の成分を添加した市販品、例えば、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘ，　ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２，　ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などであってもよい。
　培地は、好ましくは無血清培地である。無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分を含む培地も、無調整または未精製の血清を含まない限り、無血清培地に含まれる。無血清培地は、血清代替物を含んでもよい。
　分化誘導は、好ましくはフィーダー細胞の非存在下（フィーダーフリー条件下とも記載する）で行なわれる。分化誘導はまた、好ましくはゼノフリー条件で行われる。本開示において、ゼノフリーとは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分を含まないことを意味する。
　未分化維持因子としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質およびインシュリンが挙げられる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、ＦＧＦ（例えば、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８）が挙げられる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質およびＮｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質としては、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２が挙げられる。Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質としては、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡおよびＡｃｔｉｖｉｎＢが挙げられる。ヒト多能性幹細胞の場合、未分化維持因子は好ましくはｂＦＧＦを含む。未分化維持因子の濃度は、多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であればよく、当業者が適宜設定することができるが、例えば、ヒト多能性幹細胞の培養にｂＦＧＦを用いる場合、ｂＦＧＦの濃度は、４ｎｇ～５００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ～２００ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ～１５０ｎｇ／ｍＬでありうる。未分化維持因子を含む培地として、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ　Ｃｏ．，　Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ　Ｃｏ．，　Ｉｎｃ．）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳ　Ｐｈａｒｍａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏ）、ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｍＴｅＳＲ１ＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ２ＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴｅＳＲＴＭ－Ｅ８ＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｈＥＳＦ９（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　２００８　Ｓｅｐ　９；１０５（３６）：１３４０９－１４）などを用いてもよい。一態様では、未分化維持因子を含む培地は、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ　Ｃｏ．，　Ｉｎｃ．）である。
　未分化維持因子を含む培地での培養は、限定はされないが、例えば１～１０日間、１～９日間、１～８日間、１～７日間、１～６日間、１～５日間、１～４日間、１～３日間、または２～３日間である。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養に先立ち、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で多能性幹細胞を培養する。ＲＯＣＫ阻害剤は未分化維持因子を含む培地に添加されてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（ＨＡ１０７７）およびＨ－１１５２などが挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、阻害剤の種類の応じて適宜決定されるが、例えば１～１００μＭ、５～５０μＭ、もしくは約１０μＭ、または前記濃度のＹ－２７６３２と同等の活性を示す濃度である。一態様において、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地での培養期間は、１時間～１６時間、１時間～１４時間、１時間～１２時間、１時間～１０時間、１時間～８時間、１時間～６時間、１時間～４時間、１時間～３時間、１時間～２時間、２時間～１６時間、２時間～１４時間、２時間～１２時間、２時間～１０時間、２時間～８時間、２時間～６時間、２時間～４時間、または２時間～３時間である。好ましい態様として、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地での培養期間は、１時間～３時間である。未分化維持因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地での培養期間は、未分化維持因子を含む培地での培養期間の一部であっても全体であってもよい。例えば、未分化維持因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で１時間～１６時間培養した後、未分化維持因子を含む培地での培養期間が所定の培養期間となるまで、未分化維持因子を含みＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。
　ＢＭＰ（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）には、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ１２（ＧＤＦ７）が含まれる。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質およびＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質それぞれ、これらＢＭＰの１または複数に対する作用物質および阻害物質であってよい。
　ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質とは、ＢＭＰによって媒介されるシグナル伝達を阻害する物質を意味し、ＢＭＰまたはその受容体に作用する物質、ＢＭＰまたはその受容体の遺伝子発現を抑制する物質、ＢＭＰとその受容体との結合を阻害する物質が含まれる。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、ＬＤＮ－１９３１８９（４－［６－（４－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（６－［４－［２－（１－Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］－３－（４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、およびＤＭＨ１（４－（６－（４－ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が挙げられる。一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、ＬＤＮ－１９３１８９である。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、阻害物質の種類の応じて適宜決定されるが、例えば１～１０００ｎＭ、１０～５００ｎＭ、３０～３００ｎＭ、もしくは約１００ｎＭまたは前記濃度のＬＤＮ－１９３１８９と同等の活性を示す濃度である。
　ＢＭＰシグナル阻害物質を含む培地での培養は、限定はされないが、例えば１～１０日間、２～９日間、３～７日間、４～６日間、または約５日間である。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰによって媒介されるシグナル伝達を増強する物質を意味し、ＢＭＰまたはその受容体に作用する物質、ＢＭＰまたはその受容体の遺伝子発現を増強する物質、ＢＭＰとその受容体との結合を促進する物質が含まれる。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７）もしくはこれらの断片、または抗ＢＭＰ受容体抗体が挙げられる。一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、ＢＭＰ４である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、作用物質の種類の応じて適宜決定されるが、例えば０．０１～１０００ｎＭ、０．１～１００ｎＭ、１～１０ｎＭ、１～３ｎＭ、もしくは約１．５ｎＭ、または前記濃度のＢＭＰ４と同等の活性を示す濃度である。一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、３～１５ｎＭまたは３～１２ｎＭ、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｎＭ、または前記濃度のＢＭＰ４と同等の活性を示す濃度である。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養は、網膜系細胞への分化に必要な期間行われる。培養期間は、限定はされないが、例えば１～３０日間、２～２０日間、３～１５日間、４～１２日間、または５～１０日間（例えば、５、６、７、８、９、または１０日間）である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、培養期間中、一定としても変化させてもよい。例えば、２～４日につき４０～６０％減の割合で、段階的にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度を低下させてもよい。例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養の開始後、２、３、または４日毎に培地の一部（例えば、半量）をＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない培地に交換することにより、培地中のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度を段階的に低下させることができる。
　一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質またはＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地は、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に、ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（例えば、０．５％～３０％、１％～２０％、または１０％）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢＳＡ、および１－チオグリセロールを加えた培地である。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養後、培地をＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まないものに交換し、培養を継続してもよい。この培養期間は、限定はされないが、例えば１～１００日間、１０～９０日間、２０～８０日間、３０～７０日間、４０～６０日間、または約５０日間である。
　ＢＭＰシグナル作用薬を含む培地での培養後の培養期間の一部また全体において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む培地で細胞を培養してもよい。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質とは、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を阻害する物質を意味し、Ｗｎｔまたはその受容体に作用する物質、Ｗｎｔまたはその受容体の遺伝子発現を抑制する物質、Ｗｎｔとその受容体との結合を阻害する物質が含まれる。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、ＣＫＩ－７（Ｎ－（２－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－５－ｃｈｌｏｒｏ－８－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、Ｄ４４７６（４－（４－（２，３－Ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［１，４］ｄｉｏｘｉｎ－６－ｙｌ）－５－ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ　（ＩＷＲ１ｅ）　（４－［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）－１，３，３ａ，４，７，７ａ－Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１，３－ｄｉｏｘｏ－４，７－ｍｅｔｈａｎｏ－２Ｈ－ｉｓｏｉｎｄｏｌ－２－ｙｌ］－Ｎ－８－ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、およびＩＷＰ－２（Ｎ－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［（３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－４－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）などが挙げられる。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、阻害物質の種類の応じて適宜決定されるが、例えば、０．１～１００μＭ、０．３～３０μＭ、または１μＭ～１０μＭである。
　培養期間中、適宜培地交換を行ってよい。例えば、１～４日おきに培地の一部または全部を交換する。特定の成分を含む培地での培養を開始する場合、培地全量をその成分を所望の濃度で含む培地に置き換えてもよく、その成分が所望の最終濃度となるように培地の一部を置き換えてもよい（例えば、培地半量を最終濃度の２倍の濃度の培地で置き換えうる）。また、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質について記載したように、特定の成分を含む培地での培養期間中、その成分の濃度は一定としても変化させてもよい。
　培養温度およびＣＯ２濃度などの培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば３０℃～４０℃、または約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば１％～１０％、または約５％である。
　網膜組織への分化は、組織中の細胞における神経網膜系細胞マーカーの発現を検出することにより確認することができる。神経網膜系細胞マーカーは上述のとおりである。マーカーの発現は、例えば、分化誘導１０～１００日目（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００日目）、またはこれ以降に確認する。一態様では、マーカーの発現は、分化誘導１６～２２日目に確認する。
　本明細書に記載の方法により得られる出発細胞としての網膜組織は網膜シートともいうことができ、通常、網膜前駆細胞を含み、本明細書において「網膜前駆細胞シート」とも称される。一態様において、出発細胞としての網膜組織（網膜シート）は、Ｃｈｘ１０陽性の細胞の割合またはＣｈｘ１０陽性およびＲｘ陽性の細胞の割合が、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である。前記マーカー陽性細胞の割合は、分化誘導１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日目、またはこれ以降における割合でありうる。一態様において、網膜組織は、分化誘導１６～２２日目（例えば、１６、１８、または２０日目）の、Ｃｈｘ１０およびＲｘ陽性細胞の割合が、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である。さらなる態様において、網膜組織は、分化誘導１６～２２日目（例えば、１６、１８、または２０日目）の、Ｃｈｘ１０およびＲｘ陽性細胞の割合が、９０％以上または９５％以上である。
　一態様において、出発細胞としての網膜組織（網膜シート）は、神経網膜系細胞の割合が、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である。前記細胞の割合は、分化誘導１６～１００日目（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００日目）、またはこれ以降における割合でありうる。網膜組織は、好ましくは細胞が層構造を形成している。
　出発細胞としての網膜組織（網膜シート）は、厚さが、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μｍ以上、５００、４００、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０または２２０μｍ以下（上限および下限は独立に選択される）でありうる。一態様において、網膜組織は、厚さ５０μｍ～３００μｍである。網膜組織は全体が同じ厚さである必要はなく、網膜組織の厚さの範囲を規定する場合、当該網膜組織の任意の箇所の厚さがその範囲内にあればよい。出発細胞としての網膜組織（網膜シート）は、通常、培養基材に対して垂直方向の細胞数が約３０個まで、または厚さが５００μｍ以下である。
　一態様において、出発細胞としての網膜組織（網膜シート）は、以下の工程：
（１）細胞接着性を有する領域Ａと、前記領域Ａの少なくとも一部に隣接する前記領域Ａよりも細胞接着性の低い領域Ｂとをその表面に有する培養基材上の領域Ａに、０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で多能性幹細胞を播種すること、
（２）工程（１）で播種した多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で１時間～１６時間培養すること、および
（３）工程（２）の後に得られた細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で培養し、網膜組織（網膜シート）を得ること
を含む方法により得られる。
　本態様の方法によれば、領域Ａ上に穴や空隙（細胞の存在しない部分）が少なく均一な網膜組織を製造することができる。一態様において、出発細胞としての網膜組織（網膜シート）は、領域Ａの９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上を覆う。領域Ａにおける網膜組織が覆う領域の割合の測定方法は特に限定されないが、例えば、網膜組織を染色することで測定することができる。例えば、上述の神経網膜系細胞マーカー（例：Ｃｈｘ１０）の発現の有無を染色（例：蛍光標識した抗Ｃｈｘ１０抗体による免疫染色）することができる。その上で、例えばイメージングソフトウェア等（例：ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ））を用いて、領域Ａの面積に対する、神経網膜系細胞マーカー陽性領域の面積の割合を算出すればよい。また、本態様の方法によれば、目的外細胞の割合が低く、網膜細胞の割合が高い網膜組織を効率的に製造することができる。具体的には、神経網膜系細胞において発現する遺伝子の発現量が高く、目的外の細胞において発現する遺伝子の発現が低い網膜組織を製造することができる。神経網膜系細胞およびそのマーカーについては、上述の通りである。目的外細胞として、眼球関連細胞（例：毛様体、水晶体、網膜色素上皮など）、脳脊髄関連細胞（終脳、中脳、脊髄など）が挙げられ、これらのマーカーは上述のとおりである。
　一態様において、出発細胞としての網膜組織（網膜シート）は、以下の方法により得られる：
下記の工程
（１）細胞接着性を有する領域Ａと、前記領域Ａの少なくとも一部に隣接する前記領域Ａよりも細胞接着性の低い領域Ｂとをその表面に有する培養基材上の領域Ａに、０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で多能性幹細胞を播種すること、
（２）工程（１）で播種した多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で１時間～１６時間培養すること、および
（３）工程（２）の後に得られた細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で培養し、網膜組織（網膜シート）を得ること
を含む方法であって、
　工程（２）の培地は未分化維持因子を含み、工程（３）の培地は未分化維持因子を含まず、
　工程（２）の後、工程（３）に先立ち、細胞を、未分化維持因子を含みＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養し、その後、未分化維持因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養することをさらに含む、方法。
　一態様において、出発細胞としての網膜組織（網膜シート）は、以下の方法により得られる：
下記の工程
（１）細胞接着性を有する領域Ａと、前記領域Ａの少なくとも一部に隣接する前記領域Ａよりも細胞接着性の低い領域Ｂとをその表面に有する培養基材上の領域Ａに、０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で多能性幹細胞を播種すること、
（２）工程（１）で播種した多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で１時間～１６時間培養すること、および
（３）工程（２）の後に得られた細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で培養し、網膜組織（網膜シート）を得ること
を含み、ここで、
　工程（２）の培地は未分化維持因子を含み、工程（３）の培地は未分化維持因子を含まず、
　工程（３）は、工程（１）の播種後６～８日目から５～１０日間であり、
　工程（２）の後、工程（３）に先立ち、細胞を、工程（１）の播種後１～３日目まで、未分化維持因子を含みＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養し、その後、工程（１）の播種後６～８日目まで、未分化維持因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養することをさらに含む、方法。
　工程（１）～（３）により得られた網膜組織（網膜シート）は、後述のとおり分散される。網膜組織（網膜シート）は、培養基材から回収することなく分散しても、培養基材から回収後に分散してもよい。網膜組織（網膜シート）は、通常の方法で培養基材から回収することができる。例えば、網膜組織は、ピンセットなどの器具で回収することができる。あるいは、培養基材を刺激応答性ポリマー（例えば、温度応答性ポリマーまたは光応答性ポリマー）でコーティングした場合、対応する刺激を与えることにより、網膜組織を回収することができる。例えば、所定の温度を境にポリマーの性質が可逆的に細胞接着性（疎水性）から細胞非接着性（親水性）に変化する温度応答性ポリマーを使用した場合、培養基材をその所定の温度におくことで、網膜組織を回収することができる。
（分散された網膜系細胞集団）
　「分散」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片又は細胞の集合体（Cell clump）（２細胞以上１００細胞以下、好ましくは５０細胞以下、３０細胞以下、２０細胞以下、１０細胞以下、５細胞以下；例えば２～５個の細胞の集合体）又は単一細胞まで分離させることをいう。分散された細胞集団とは、細胞片若しくは細胞の集合体又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。「分散された網膜系細胞集団」とは、分散された状態の細胞集団を意味し、生体組織又は細胞凝集体等の細胞の集合体を分散することによって得ることができる。分散された網膜系細胞集団は、好ましくは、上記の網膜系細胞の凝集体を分散することによって得ることが好ましい。
　一態様において、分散方法は、細胞を生きたままに分散できる方法であればよく、例えば機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
　機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
　細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、パパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）やＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、神経細胞分散液（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）を用いることもできる。
　細胞を分散する際に、細胞保護剤で処理することにより、細胞の細胞死を抑制してもよい。細胞保護剤処理に用いられる細胞保護剤としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ＩＧＦシグナル伝達経路作用物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される細胞死（特に、ヒト多能性幹細胞の細胞死）を抑制するために、分散の際に、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ（「ＲＯＣＫ」又は「Ｒｈｏキナーゼ」）の阻害物質（ＲＯＣＫ阻害剤）又はＭｙｏｓｉｎの阻害物質を添加してもよい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ－１１５２等を挙げることができる。Ｍｙｏｓｉｎの阻害物質としてはＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。
　分散された網膜系細胞集団は、単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ）を含み、例えば細胞集団の全細胞数に対して７０％以上、好ましくは８０％以上が単一細胞であり、また、２～５０細胞の塊が細胞集団の全細胞数に対して３０％以下、好ましくは２０％以下存在する状態が挙げられる。分散された網膜系細胞集団において、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなっている。また、分散された網膜系細胞集団は、できるだけ単一細胞からなることより好ましく、このような分散された網膜系細胞集団は、分散処理後、単一細胞になっていない細胞の塊を除去することによって得ることができる。細胞の塊の除去方法は特に限定されないが、例えばメンブレンフィルター（セルストレーナー）による塊の除去等が挙げられる。一態様において、分散された細胞とは、細胞－細胞間結合（例えば、接着結合）がほとんどなくなった状態が挙げられる。
　網膜組織から出発細胞としての網膜系細胞集団を準備する場合、網膜色素上皮細胞などの不要な細胞が網膜組織に含まれる場合がある。この場合、網膜色素上皮細胞など不要な細胞が存在する領域を切り離した上で、網膜系細胞集団を分散させればよい。網膜色素上皮細胞の場合は、形態や色素により判別可能であり、当業者であれば容易に切除可能である。
　後述するＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養を開始する前に、後述の通り網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の純度を高めるための工程（純化工程）を実施してもよく、さらに分散された網膜系細胞集団の維持・拡大培養を実施してもよい。培地は、網膜系細胞が生存及び増殖可能な培地（ＤＭＥＭ培地など）であれば特に限定されない。凍結融解した網膜系細胞集団を本発明の製造方法の出発細胞として用いることもできるため、分散された網膜系細胞集団を凍結保存しておくことも可能である。凍結保存液は特に問わず、市販の凍結保存液を用いることができる。
〔網膜前駆細胞の純化〕
　上述した分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養を開始する前に、分散された網膜系細胞集団に対し、網膜前駆細胞の割合（純度）、好ましくは神経網膜前駆細胞の割合（純度）を高める工程（純化工程）を実施してもよい。純化工程では、網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞で発現する特定のマーカーを用いたセルソーティング等の操作を実施してもよい。セルソーティングは、ＦＡＣＳやＭＡＣＳなどの周知技術を用いて実施することができる。網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞の純化工程を実施することにより、本明細書に記載の製造方法においてＲＰＥ細胞や目的外細胞の混入を減少させることが可能である。分散された網膜系細胞集団中に含まれる網膜前駆細胞の割合を高める工程によって、網膜色素上皮前駆細胞及び／又は網膜色素上皮細胞の生成が抑制される。網膜色素上皮前駆細胞及び／又は網膜色素上皮細胞の生成が抑制されたか否かは、分散された網膜系細胞集団を後述する培養方法により培養した後に、上述した網膜色素上皮細胞のマーカーや形態、性質等に基づき網膜色素上皮細胞が生成したか否かで判断すればよい。網膜色素上皮前駆細胞及び／又は網膜色素上皮細胞の生成が抑制されるとは、上記培養後の全細胞数に対する網膜色素上皮細胞の割合が、網膜前駆細胞の割合を高める工程を実施しなかった場合と比較して、抑制されていればよい。段落０１５１に記載されている程度の網膜色素上皮細胞の割合であれば、網膜色素上皮前駆細胞及び／又は網膜色素上皮細胞の生成が抑制されたと判断できる。
　網膜前駆細胞の細胞のマーカー（ポジティブマーカー）として、ＲｘやＣｈｘ１０などがよく知られている。しかしながら、これら遺伝子は細胞内で発現しているため、例えば遺伝子組換え技術により当該遺伝子と蛍光タンパク質と連結した細胞、又は当該遺伝子を蛍光タンパク質で置き換えた細胞を用いるなどの工夫が必要である（例：Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ細胞）。そこで、網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞のポジティブマーカーの探索を行い、ＣＤ９（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１７６９．４、ＮＭ＿００１３３０３１２．２）、ＣＤ２４（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１２９１７３７．１、ＮＭ＿００１２９１７３８．１、ＮＭ＿００１２９１７３９．１、ＮＭ＿００１３５９０８４．１、ＮＭ＿０１３２３０．３）、ＣＤ２９（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００２２１１．４、ＮＭ＿０３３６６８．２、ＮＭ＿１３３３７６．２）、ＣＤ３９（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１０９８１７５．２、ＮＭ＿００１１６４１７８．１、ＮＭ＿００１１６４１７９．２、ＮＭ＿００１１６４１８１．１、ＮＭ＿００１１６４１８２．２、ＮＭ＿００１１６４１８３．２、ＮＭ＿００１３１２６５４．１、ＮＭ＿００１３２０９１６．１、ＮＭ＿００１７７６．６）、ＣＤ４７（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１７７７．３、ＮＭ＿１９８７９３．２）、ＣＤ４９ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００２２０３．４）、ＣＤ４９ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００２２０４．４）、ＣＤ４９ｆ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿０００２１０．４、ＮＭ＿００１０７９８１８．３、ＮＭ＿００１３１６３０６．２、ＮＭ＿００１３６５５２９．２、ＮＭ＿００１３６５５３０．２）、ＣＤ５７（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１３６７９７３．１、ＮＭ＿０１８６４４．３、ＮＭ＿０５４０２５．３）、ＣＤ７３（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１２０４８１３．１、ＮＭ＿００２５２６．４）、ＣＤ８２（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１０２４８４４．２、ＮＭ＿００２２３１．４）、ＣＤ９０（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１３１１１６０．２、ＮＭ＿００１３１１１６２．２、ＮＭ＿００１３７２０５０．１、ＮＭ＿００６２８８．５）、ＣＤ１６４（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１１４２４０１．２、ＮＭ＿００１１４２４０２．２、ＮＭ＿００１１４２４０３．３、ＮＭ＿００１１４２４０４．２、ＮＭ＿００１３４６５００．２、ＮＭ＿００６０１６．６）、ＣＤ２００（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１００４１９６．３、ＮＭ＿００１３１８８２６．１、ＮＭ＿００１３１８８２８．１、ＮＭ＿００１３１８８３０．１、ＮＭ＿００１３６５８５１．２、ＮＭ＿００１３６５８５２．１、ＮＭ＿００１３６５８５３．１、ＮＭ＿００１３６５８５４．１、ＮＭ＿００１３６５８５５．１、ＮＭ＿００５９４４．７）、ＣＤ３４０（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１００５８６２．２、ＮＭ＿００１２８９９３６．１、ＮＭ＿００１２８９９３７．１、ＮＭ＿００１２８９９３８．１、ＮＭ＿００４４４８．３）及びＣＸＣＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１００８５４０．２、ＮＭ＿００１３４８０５６．２、ＮＭ＿００１３４８０５９．２、ＮＭ＿００１３４８０６０．２、ＮＭ＿００３４６７．３）が、これらの細胞の細胞表面で発現していることを見出した。好ましい細胞表面マーカーとして、例えば、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４が挙げられる。一態様として、前記網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質（例：抗体、ペプチドなど）と接触させ陽性画分を分取する工程を含む、細胞集団における網膜前駆細胞の割合を向上させる方法を、上述したＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養を開始する前に実施してもよい。当該方法により、本明細書に記載の製造方法においてＲＰＥ細胞の混入を減少させることが可能である。
　さらに、これらの細胞のネガティブマーカー、すなわちこれらの細胞での発現が認められないマーカーとして、ＳＳＥＡ１（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００２０３３．３）、ＣＤ６６ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１８１６．４）、ＣＤ６９（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１７８１．２）及びＣＤ８４（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＮＭ＿００１１８４８７９．２、ＮＭ＿００１１８４８８１．２、ＮＭ＿００１１８４８８２．１、ＮＭ＿００１３３０７４２．２、ＮＭ＿００３８７４．４）等を見出した。上述したポジティブマーカーと組み合わせることにより、網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞の純度をより高めることが可能である。一態様として、前記網膜前駆細胞を含む細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質（例：抗体）、好ましくはさらに、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質（例：抗体）と接触させ、前者のマーカーの陽性画分及び後者のマーカーの陰性画分を分取する工程を含む、細胞集団における網膜前駆細胞の割合を向上させる方法を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中での培養を開始する前に実施してもよい。上記分散された網膜系細胞集団を、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質（例：抗体）と接触させ、これらのマーカーの陰性画分を分取する工程においては、当該抗原の発現量が基準値以下である細胞集団を得る工程である。ここで、基準値は、当業者が任意に設定することができる。例えば、蛍光標識したアイソタイプコントロール抗体を細胞集団に処理した場合の蛍光強度と同等の強さの蛍光標識した上記抗原に対する抗体を細胞集団に処理した細胞集団を得ることで、陰性の画分を分取することができる。
　なお、上述したポジティブマーカー及びネガティブマーカーに結合する物質（例：抗体）を用いた、細胞集団における網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞の割合を向上させる方法は、本明細書に記載の製造方法の一工程としての方法に限定されない。細胞表面マーカーを用いた網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞の割合を向上させる方法は、例えば他の網膜組織の製造方法の一工程としても用いることができる。
　一態様において、分散された網膜系細胞集団において、網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞は、例えば全細胞数の３０％以上を占めていてよく、全細胞数の５０％以上を占めていることが好ましく、全細胞数の８０％以上を占めていることがより好ましく、全細胞数の９０％以上を占めることがさらに好ましい。さらに、例えば、分散された網膜系細胞集団において、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーが陽性であり、かつ、Ｒｘ及び／又はＣｈｘ１０陽性である細胞（網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞）を、細胞集団の全細胞数に対して５０％以上含み、好ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上含む。さらに、上記細胞集団は、ＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上、好ましくは２以上、３以上又は全部の抗原が陰性であることが好ましい。ここでいう陰性とは、上述した基準値以下であればよい。
（分散された網膜系細胞集団の培養による層構造の再形成）
　本発明に係る網膜組織の製造方法は、分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養又は浮遊培養することを含む。いずれの培養方法によっても、分散された網膜系細胞集団から上皮構造（多層構造）を再形成させることが可能である。上皮構造（又は多層構造）を有するシート状網膜組織を製造するためには、接着培養が好ましい。
　分散された網膜系細胞集団の培養に用いられる培地は、網膜系細胞が生存及び増殖可能な培地であれば特に限定されない。一態様において、分散された網膜系細胞集団の培養に用いられる培地としては、連続上皮組織維持用培地が挙げられる。一例として、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、２１１０３０４９）にＢ２７サプリメント（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック、１２５８７０１０）を配合した培地を連続上皮組織維持用培地として挙げることができる。
　培地中に含まれるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、Ｗｎｔタンパク質であるＷｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３ａ等、及びその部分ペプチド等を挙げることができ、１つの物質であってもよく、２つ以上の物質であってもよい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ２ｂ及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される１以上の物質、２以上の物質、又は３以上の物質である。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、分散された網膜系細胞集団を再凝集化させる過程において、凝集体を大きくするとともに、頂端面／基底膜の極性を有する上皮構造（又は多層構造）を再形成させることができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質により、ロゼット様構造形成も抑制できる。
　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、所望の細胞凝集体の形成（例えば、上皮構造（又は多層構造）の再形成）を誘導可能な濃度であればよい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合には、０．０１μＭ～１００μＭであってよく、好ましくは０．１μＭ～１０μＭ、より好ましくは１μＭ～１０μＭ、より好ましくは３μＭ～６μＭである。その他のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上述した濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同程度のＷｎｔシグナル活性化作用を示す濃度であればよい。Ｗｎｔシグナル活性化作用は、当業者であれば、例えばβ-Ｃａｔｅｎｉｎの発現の確認等の方法により測定可能である。
　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を添加するタイミングは特に限定されないが、再シート化のための浮遊培養又は接着培養開始後できるだけ早い時期に添加する方が好ましい。一態様として、培養開始時からＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することが好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養日数は、頂端面／基底膜の極性を有する上皮構造（又は多層構造）を再形成させる効果が認められる範囲で特に限定されないが、例えば、１日間～１４日間である。
　一態様において、培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上の物質をさらに含んでいてよい。例えば、ＲＯＣＫ阻害剤の添加によって、分散された網膜前駆細胞集団の再凝集化を促進する効果が認められ、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質の添加によって、細胞凝集体の増殖を促進し、細胞凝集体を大きくする効果が認められ、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質（例：ＦＧＦ２、ＦＧＦ８）添加によって、細胞のダメージを軽減し、またＲＰＥ細胞への分化誘導が抑制される効果が認められる。
　ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ－２７６３２（例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983(2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284(2000)参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Uenata et al., Nature 389:990-994(1997)参照）、Ｈ－１１５２（例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93:225-232(2002)参照）、Ｗｆ－５３６（例えば、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4):319-324(2003)参照）及びそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくはＹ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ－１１５２からなる群から選択される１以上の物質を含んでいる。
　ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、当業者であれば実験条件に応じて適宜設定可能である。一態様として、分散された網膜前駆細胞集団の再凝集化を促進することが可能な濃度であればよい。例えばＹ－２７６３２を用いる場合、０．１μＭ～１ｍＭであってよく、好ましくは１μＭ～１００μＭ、より好ましくは５μＭ～２０μＭである。Ｙ－２７６３２以外のＲＯＣＫ阻害剤を用いる場合には、上述した濃度のＹ－２７６３２と同程度のＲＯＣＫ阻害作用を示す濃度であればよい。ＲＯＣＫ阻害作用は、当業者であれば、例えばＭＬＣ２のリン酸化の発現解析等の方法により測定可能である。
　ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質とは、ＳＨＨ（Ｓｈｈと記載することもある）によって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属する蛋白質（例えば、ＳｈｈやＩｈｈ）、ＳＨＨ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、ＰＭＡ（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ；９－シクロヘキシル－Ｎ－［４－（４－モルホリニル）フェニル］－２－（１－ナグタレニルオキシ）－９Ｈ－プリン－６－アミン）、又はＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　Ａｇｏｎｉｓｔ；Ｎ－メチル－Ｎ’－（３－ピリジニルベンジル）－Ｎ’－（３－クロロベンゾ［ｂ］チオフェン－２－カルボニル）－１，４－ジアミノシクロヘキサン）等が挙げられる。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＳｈｈ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００１９３、ＮＰ＿０００１８４）、ＳＡＧ又はＰＭＡからなる群から選択される１以上の物質である。
　ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質の濃度は、当業者であれば実験条件に応じて適宜設定可能である。一態様として、細胞凝集体を大きくする効果が認められる範囲の濃度であればよい。例えば、ＳＡＧは、通常１～２０００ｎＭ、好ましくは１０～７００ｎＭの濃度で使用される。ＰＭＡは、通常０．００２～２０μＭ、好ましくは０．０２～２μＭの濃度で使用される。ＳＨＨは、通常４～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０～２００ｎｇ／ｍＬで使用される。その他のＳＨＨシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上述した濃度のＳＡＧと同程度のＳＨＨシグナル活性化作用を示す濃度であればよい。ＳＨＨシグナル活性化作用は、当業者であれば、例えば下流のシグナル（ＳＭＯやＧＬＩ）の発現解析等の方法により測定可能である。
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とは、ＦＧＦによって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８及びＦＧＦ９）が挙げられる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８からなる群から選択される１以上の線維芽細胞増殖因子である。
　ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、当業者であれば実験条件に応じて適宜設定可能である。一態様として、ＲＰＥ細胞への分化誘導が抑制される効果が認められる範囲の濃度であればよい。例えば、ＦＧＦ２、４又は８を用いる場合、４～５００ｎｇ／ｍＬ程度、好ましくは１０～２００ｎｇ／ｍＬ程度、より好ましくは２５～１００ｎｇ／ｍＬ程度である。その他のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上述した濃度のＦＧＦ８等と同程度のＦＧＦシグナル活性化作用を示す濃度であればよい。ＦＧＦシグナル活性化作用は、当業者であれば、例えば下流のシグナル（Ａｋｔ、ＭＥＫ）の発現解析等の方法により測定可能である。
　ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を添加するタイミングは特に限定されないが、培養開始時からＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質及び／又はＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することが好ましい。これらの物質は同時に培地に添加されることが好ましく、さらに、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質と同時に培地に添加されることが好ましい。一態様として、１日～１４日間、これらの物質を含む培地において分散された網膜系細胞を培養すればよい。
　浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－１２７等）又はリン脂質類似構造物（例えば、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ））によるコーティング処理した培養容器を使用して行うことができる。
　浮遊培養は、例えば、分散された網膜系細胞を出発細胞として、ＳＦＥＢ（Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　Ｆｌｏａｔｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｅｍｂｒｙｏｉｄ　Ｂｏｄｉｅｓ－ｌｉｋｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）法（ＷＯ２００５／１２３９０）やＳＦＥＢｑ法（ＷＯ２００９／１４８１７０）を用いることにより行うことができる。
　接着培養とは、細胞を培養容器へ接着の状態で培養することであり、特に限定されないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理されている培養容器等を使用して行うことができる。接着培養は、細胞外マトリクス及び／又は温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器等を用いて行われることが好ましい。一態様の網膜組織の製造方法として、温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を、該温度感受性ポリマーの性質が変化する温度にさらすことにより、シート状網膜組織を該培養容器からはがす工程を含む。
　細胞外マトリクスでコーティングされた培養容器上で接着培養することにより、後述するシート状網膜組織を製造することができる。
　細胞外マトリクス存在下で培養することにより、細胞が基底膜側を認識することができるため、頂端面が形成されやすく、また、細胞が層方向に対して凡そ垂直方向に向き、より良好な層構造を有する網膜組織が得られる。温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器等を用いることにより、温度変化のみによって、形成された上皮構造（又は多層構造）を有する網膜組織を容易に培養容器等から剥がすことができ、酵素処理が不要であり、そのため酵素処理により細胞間の結合が弱くなることなく、丈夫なシート状の網膜組織を回収することができる。そのため、細胞外マトリクス及び／又は温度感受性ポリマー、特に細胞外マトリクス及び温度感受性ポリマーの両方によりコーティングされた培養容器等を用いることが好ましく、例えば、培養容器の培養面が、上記温度感受性ポリマーでコーティングされ、そのポリマーの上面が、上記細胞外マトリクスでコーティングされることが挙げられる。ここで、培養面とは、培養容器において、細胞が接着する面を指し、ポリマーの上面とは、ポリマーコーディングの培養面に接する面と反対の面を指す。
　細胞外マトリクスとは、細胞の外側の空間を構成する生体高分子を意味し、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質、コラーゲン、エラスチン等の線維性タンパク質、これらのタンパク質のフラグメント、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカン又はプロテオグリカン、マトリゲル等が挙げられる。細胞外マトリクスは、好ましくは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチン及びこれらのタンパク質のフラグメントからなる群から選択される１以上の物質である。ラミニンフラグメントとして、例えば、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｉＭａｔｒｉｘ－４１１、ｉＭａｔｒｉｘ－２２１などの市販品が挙げられる。
　マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ　Ｈｏｌｍ　Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。マトリゲルは、例えばＵＳ　ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ．４８２９０００に開示された方法により調製することができ、市販のものを購入することもできる。マトリゲルの主成分はラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンである。
　温度感受性ポリマーとは、温度の変化によりポリマーの性質が変化するポリマーである。すなわち、水中で下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution temperature, LCST）を有し、ある温度を境にそれより高い温度ではその分子内、或いは分子間の疎水結合が強まりポリマー鎖が凝集し、逆に、低い温度ではポリマー鎖が水分子を結合し水和する相転移挙動を示す。具体的には、例えば、培養温度（約３７℃）においては器材表面の疎水性の状態を保ち、培養温度よりも低い温度、例えば２０～３０℃程度においては器材表面が親水性に変化し、培養細胞がはがれやすくなる温度感受性ポリマーが挙げられる。従って、細胞剥離において酵素処理を必要とせず、酵素処理による細胞への細胞と細胞の間にあるタンパク質を壊さず一枚の大きなシートとしても回収することが可能である。このような温度感受性ポリマーとしては、例えばポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）（ＬＣＳＴが３２℃）好ましく用いられる。通常細胞培養は約３７℃の条件下で行われ、低温による細胞へのダメージも考慮すると、ＬＣＳＴが約２０℃～３５℃の範囲の温度感受性ポリマーが好ましい。市販品として、温度感受性ポリマーが表面に固定された細胞シート回収用温度応答性細胞培養器材（セルシード社：ＵｐＣｅｌｌ（登録商標））なども入手可能である。
　培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
　シート状網膜組織における層構造の形成及び、特に頂端面/基底面（Ａｐｉｃａｌ/Ｂａｓａｌの極性）の形成には、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が必要である。
　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、層構造及び頂端面を有するシート状網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合には、０．０１μＭ～１００μＭであってよく、好ましくは０．１μＭ～１０μＭ、より好ましくは１μＭ～１０μＭである。その他のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上述した濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同程度のＷｎｔシグナル活性化作用を示す濃度であればよい。層構造が形成されているか否かは、当業者であれば、例えば顕微鏡での観察や、ＯＣＴ等の装置による厚みを計測することにより容易に判断することができる。頂端面が形成されているかどうかは、例えば抗Ｚｏ－１抗体や抗Ｅｚｒｉｎ抗体、抗ａｔｙｐｉｃａｌ－ＰＫＣ抗体を用いて染色することにより確認することができる。
　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を添加するタイミングは特に限定されないが、接着培養開始後できるだけ早い時期に添加する方が好ましい。一態様として、培養開始時からＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養することが好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養日数は、頂端面／基底膜の極性を有する多層構造（又は多層構造）を再形成させる効果が認められる範囲で特に限定されないが、例えば、１日間～１５日間、好ましくは１日間～９日間である。
　Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質等を除いた培地で培養を継続してもよい。培養を継続することにより、層構造は厚くなり、網膜系細胞の分化は進む。培養期間は、特に限定されず、播種した分散された網膜系細胞集団が増殖し、少なくとも上皮構造（又は多層構造）が形成されるまでの期間であればよく、目的とする分化段階のシート状網膜組織が製造されるまで培養すればよい。上皮構造（又は多層構造）の形成の観点から培養は、少なくとも７日間行われることが望ましい。培養期間は例えば、７日間から６０日間以下であってよく、４０日間以下、３０日間以下、２０日間以下、１６日間以下（例えば１６日間）であってもよい。
　上皮構造（又は多層構造）が形成された後においても、細胞を増殖させ、分化又は成熟させるために、さらに培養を継続してもよい。更なる培養に用いる培地は、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）シグナル伝達経路作用物質及び／又はインテグリン伝達経路作用物質を含んでいても含まなくてもよい。
　「多層構造」とは、基底膜側と頂端側の極性を有する（すなわち上皮構造を有する）組織において、細胞が同一方向に並んでいる細胞層が２以上重ね合わせてできた構造であり、異なる層同士がそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行している構造である。当該多層構造は、基底面及び頂端面の極性を有する方が好ましく、一態様において、多層構造を有する網膜組織が、シート状網膜組織であってよく、多層構造を有する網膜組織を含む細胞凝集体は、シート状細胞凝集体であってよい。また、一態様において、細胞層が神経網膜前駆細胞層、神経節細胞層、又は視細胞層であってよい。
　本発明の一態様では、多層構造において、細胞の向きが凡そ層方向に対して垂直方向になっていてよい。ここで、「細胞の向き」とは、核の形、細胞体の向きが、基底膜側と頂端側に伸びている方向性を示す。また、層方向に対して凡そ垂直方向とは、多層構造における層において一つ一つの細胞が接して並んでいる方向（すなわち、層の表面の接線方向）に直交する方向のことをいい、層に対して垂直方向又は縦方向のことをいう。
　本発明の一態様では、浮遊培養又は接着培養によって得られた上皮構造（又は多層構造）を有する網膜組織（特にシート状網膜組織）を、移植に必要な大きさに切り出す工程をさらに含んでもよい。例えば、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて切り出すことができる。
　一方、上述の方法でシート状網膜組織を製造した場合、一定の割合でＲＰＥ細胞が製造され混入するという課題を見出した。これらＲＰＥ細胞は目視により確認することができ、除去することもできるが、品質や製造効率の観点で当初からＲＰＥ細胞は含まれない方が好ましい。そこで、当該課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下に開示する方法を用いることにより、ＲＰＥ細胞の混入を大幅に減少させることが可能になった。
〔シート状網膜組織〕
　本発明の一態様は、上皮構造を有するシート状網膜（神経網膜）組織である。該シート状網膜組織の一態様は、多層構造を有する網膜系細胞層からなり、当該多層構造が基底面及び頂端面の極性を有し、上記多層構造を有する網膜系細胞層が網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、上記網膜系細胞層において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっている。ここで、「シート状」とは、少なくとも二次元の方向に生物学的結合を有する単一又は複数の細胞から構成される単層又は重層の構造体をいう。
　用いる培養器材に応じて、任意の大きさのシート状網膜組織を製造することができる点が、本発明の一つの利点である。すなわち、これまでに製造できなかった大きさのシート状網膜組織を製造することが可能であり、広い範囲に疾患が及ぶ場合に、１つのシートの移植により治療が可能となる。
　一態様において、本発明に係るシート状網膜組織の長径（直径ともいう）は、例えば２ｍｍ以上、４ｍｍ以上、５ｍｍ以上、７．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以上である。一態様において、本発明に係るシート状網膜組織の短径は、例えば２ｍｍ以上、３ｍｍ以上、４ｍｍ以上、５ｍｍ以上である。原理上、長径及び短径に上限はないが、培養に用いるディッシュ等の大きさが限度になる。一態様として、長径は、１０ｃｍ以下、５ｃｍ以下、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、２ｃｍ以下、１ｃｍ以下であってよい。一態様において、本発明に係るシート状網膜組織の高さは、例えば５０μｍ～１５００μｍであってよく、好ましくは２００μｍ～７００μｍである。
　シート状網膜組織の長径、短径及び高さを測定する方法は、特に限定されず、例えば、顕微鏡下で撮像した画像から測定すればよい。例えば、シート状網膜組織について、頂端面を対物レンズ側に向けた状態で撮像した正面画像と、切断面が対物レンズから見て垂直になるよう傾けた状態で撮像した横面画像とを、実体顕微鏡で撮像し、撮像した画像から測定できる。ここで、長径とは、正面画像において、該シート断面上の２つの端点を結ぶ線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。短径とは、正面画像において、該シート断面上の２つの端点を結ぶ線分で長径と直交する線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。高さとは、該シート断面に直交する線分で、該シート断面との交点と網膜シートの頂点を端点とする線分のうち、最も長い線分及びその長さを意味する。
　基底面及び頂端面は上述の定義に記載した通りである。「多層構造が基底面及び頂端面の極性を有し」とは、多層構造の一方に基底面が存在し、他方に頂端面が存在することを意味する。基底面上には、基底膜が存在していてもよい。
　「細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向」とは、網膜系細胞層の各層に存在する細胞の長径が、層方向に対し凡そ垂直方向を向いていることを意味する。凡そ垂直方向とは、層方向と細胞の長径がなす鋭角が、凡そ７５°（又は８０°）以上９０°以下である。本明細書において、各層に存在する細胞の約５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上が、層方向に対して凡そ垂直方向に向いていれば、「細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっている」と判断する。
　シート状網膜組織はＲＰＥ細胞を含まない方が好ましい。一態様において、シート状網膜組織における総細胞数に対するＲＰＥ細胞数の割合は、１０％以下、好ましくは９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下である。シート状網膜組織における総細胞数に対するＲＰＥ細胞数の割合は、例えば上述したＲＰＥ細胞のマーカーを発現する細胞の割合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）等を用いて測定することが可能である。一態様において、シート状網膜組織の総面積におけるＲＰＥ細胞の面積の占める割合は、１０％以下、好ましくは９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下である。ＲＰＥ細胞は黒色を呈するため、シート状網膜組織の総面積におけるＲＰＥ細胞の面積の占める割合は、顕微鏡下において黒色を示す面積の割合から算出することが可能である。また、ＲＰＥ細胞のマーカーを発現する細胞を、ＰＣＲ等によって検出することも可能である。なお、シート状網膜（神経網膜）組織におけるＲＰＥ細胞の割合を減少させる方法は上述した通りである。
　一態様の多層構造を有する網膜系細胞層からなるシート状網膜組織は、
（１）当該多層構造を有する網膜系細胞層が基底面及び頂端面の極性を有し、
（２）上記多層構造を有する網膜系細胞層が、網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞及び視細胞からなる群から選択される１種以上の細胞を含み、
（３）上記網膜系細胞層の各層において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっており、かつ、
（４）直径が８ｍｍ以上である。
（シート状網膜系細胞層（神経網膜）－網膜色素上皮細胞の複合体（複合シート））
　本発明の一態様として、網膜組織は、上記多層構造を有する網膜系細胞層と、上記網膜系細胞層に接合しているシート状網膜色素上皮細胞とを含んでもよく、上記網膜系細胞層と上記シート状網膜色素上皮細胞とはそれぞれの表面の接線方向が凡そ平行しており、上記網膜系細胞層の頂端面と上記シート状網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っており、かつ、上記網膜系細胞層と上記シート状網膜色素上皮細胞とは両者の間に存在する接着因子により接合している複合体（複合シート）でありうる。シート状神経網膜は、神経網膜シート又はＮＲシートともいい、シート状網膜色素上皮細胞は、網膜色素上皮細胞シート又はＲＰＥ細胞シート（ＲＰＥシート）ともいう。すなわち、本発明の一態様は、神経網膜及びＲＰＥ細胞の複合体（複合シート）も提供する。本発明の別態様として、シート状網膜系細胞層（シート状神経網膜）の頂端面側に、分散された網膜色素上皮細胞が接着因子により接合した、複合体（複合シート）も挙げられる。
　本明細書の複合体において、神経網膜シートと網膜色素上皮細胞シートとは、それぞれ接線方向が凡そ平行している。「接線方向が凡そ平行している」とは、神経網膜と網膜色素上皮細胞シートの向かい合った面の接線方向が平行していることを意味する。また、本発明に係る複合体において、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが向き合っている。すなわち、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞の頂端面とが近接した状態で存在する。
　神経網膜及びＲＰＥ細胞の複合体（複合シート）は、後述する通り、接着因子の存在下で、シート状網膜系細胞層（シート状神経網膜）とＲＰＥ細胞シート若しくは分散されたＲＰＥ細胞とを接合させることで準備することができる。シート状網膜系細胞層（シート状神経網膜）は、上述の上皮構造（又は多層構造）を有する網膜組織を含む細胞凝集体の製造方法によって製造することができる。ＲＰＥ細胞シートは、後述の網膜色素上皮細胞シートの製造方法によって製造することができる。
（網膜色素上皮細胞シートの製造方法）
　網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、多能性幹細胞由来であり、具体的に多能性幹細胞を分化誘導することによって得ることができる。網膜色素上皮細胞を製造する方法は、ＷＯ２００５／０７００１１、ＷＯ２００６／０８０９５２、ＷＯ２０１１／０６３００５、ＷＯ２０１２／１７３２０７号、ＷＯ２０１５／０５３３７５号、ＷＯ２０１５／０５３３７６号、ＷＯ２０１５／０６８５０５号、ＷＯ２０１７／０４３６０５、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　２（２），　２０５－２１８　（２０１４）及びＣｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，　１０（６），　７７１－７８５　（２０１２）に開示されている方法が挙げられるが、特に限定されない。また、上述したＷＯ２０１６／０６３９８５に記載の方法を改良することで網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞シートを調製することも可能である。網膜色素上皮細胞は、細胞シート又はスフェア状細胞凝集体として製造されてもよい。スフェア状細胞凝集体として製造された場合、例えば、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて細胞凝集体を切り開くことでＲＰＥ細胞シートを調製可能である。
　ＷＯ２０１６／０６３９８５に記載の方法の改良法としては、上述した方法のうち、多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）分化誘導一日前にＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理し、２）分化誘導開始時にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を処理しない条件で培養する。その後、上述した工程（Ｂ）及び（Ｃ）を行う。さらに、上記工程（Ｄ）の開始時期を早める方が好ましい。具体的には、工程（Ｂ）の浮遊培養開始９日前後（例：７日、８日、９日、１０日、１１日後）に工程（Ｄ）を開始する。その後、上述した工程（Ｅ）を実施すればよい。本方法により、スフェア状のＲＰＥ細胞の細胞凝集体が得られる。当該細胞凝集体を分散させて細胞懸濁液にしてもよいし、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて細胞凝集体を切り開くことでＲＰＥ細胞シートを調製することもできる。分散させた細胞懸濁液を接着培養で培養することにより、ＲＰＥ細胞シートを調製することもできる。また、ＲＰＥ細胞シート又はＲＰＥ細胞の凝集体の分散により、分散されたＲＰＥ細胞を得ることもできる。
　網膜色素上皮細胞シートは、神経網膜の細胞凝集体と接触させる前に、多角形又は敷石状の細胞形態を有するまでさらに培養してもよい。この場合の培地は、特に限定されないが、網膜色素上皮細胞の維持培地（以下、ＲＰＥ維持培地と記載することもある。）に交換し、さらに培養することもできる。それにより、さらにはっきりとメラニン色素沈着細胞群や基底膜に接着する多角扁平状の形態を有する細胞群を観察することができる。ＲＰＥ維持培地による培養は、網膜色素上皮細胞の性質が維持されたまま増殖するコロニーが形成される限り限定されないが、例えば３日に１回以上の頻度で全量培地交換を行いながら５日以上（例：５～２０日間程度）培養を行う。当業者であれば、当該形態を確認しながら、培養期間を容易に設定することができる。網膜色素上皮細胞の維持培地は、例えばＩＯＶＳ，Ｍａｒｃｈ２００４， Ｖｏｌ． ４５， Ｎｏ．３、ＭａｓａｔｏｓｈｉＨａｒｕｔａら，ＩＯＶＳ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１１， Ｖｏｌ． ５２， Ｎｏ． １２、Ｏｋａｍｏｔｏら，ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１２２ （１７）、Ｆｕｍｉｔａｋａ Ｏｓａｋａｄａｒら，ｅｂｒｕａｒｙ ２００８， Ｖｏｌ． ４９， Ｎｏ． ２、Ｇａｍｍらに記載のものを使用することができる。
　網膜色素上皮細胞シートの長径はシート状網膜組織（神経網膜シート）の長径と同じであってもよい。一態様において、網膜色素上皮細胞シートの長径は、例えば３ｍｍ～５０ｍｍ、５ｍｍ～３０ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍなどの範囲であってよい。
　網膜色素上皮細胞シートの短径はシート状網膜組織（神経網膜シート）の短径と同じであってもよい。一態様において、網膜色素上皮細胞シートの短径は、例えば２ｍｍ～４０ｍｍ、５ｍｍ～３０ｍｍ、１０ｍｍ～２０ｍｍなどの範囲であってよい。
　網膜色素上皮細胞シートのメラニン色素沈着の程度は特に限定されない。網膜色素上皮細胞シート中に含まれる網膜色素上皮細胞におけるメラニン色素沈着の程度は、細胞間で同程度である方が好ましい。一態様として、網膜色素上皮細胞シートの平均メラニン含有量は、２０ｐｇ／細胞未満、１５ｐｇ／細胞未満、１０ｐｇ／細胞未満、８ｐｇ／細胞未満、７ｐｇ／細胞未満、６ｐｇ／細胞未満、５ｐｇ／細胞未満、４ｐｇ／細胞未満、３ｐｇ／細胞未満、２ｐｇ／細胞未満、１ｐｇ／細胞未満であってよい。また、網膜色素上皮細胞シートの平均メラニン含有量は、０．１ｐｇ／細胞以上、０．５ｐｇ／細胞以上、１ｐｇ／細胞以上、２ｐｇ／細胞以上、５ｐｇ／細胞以上であってもよい。
　網膜色素上皮細胞シート中のメラニン含有量は、例えば、網膜色素上皮細胞シートを分散させた後、ＮａＯＨなどを用いて抽出した細胞抽出物を用いて、分光光度計等を用いて測定することができる。平均メラニン含有量は、メラニン含有量を網膜色素上皮細胞シートに含まれる総細胞数で除することにより求めることができる。
　上述の複合体は、神経網膜シートと分散されたＲＰＥ細胞又はＲＰＥ細胞シートを接合させることによって製造することができる。神経網膜シートとＲＰＥ細胞シートを接合させた複合シートの方が好ましい。上述の神経網膜シート及びＲＰＥ細胞シートは、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いることにより、培養器材より容易に取り出すことができる。取り出した両シートを新たな容器（培養器材など）に移してもよいが、一方を培養器材中に残したまま、別の一方を当該培養器材中に移してもよい。同じ大きさの培養器材で製造することにより、接合させるシート状組織の大きさを揃えることができる。また、接触させる神経網膜シート及び網膜色素上皮細胞について、上述の製造方法における異なる培養日数の神経網膜シート及び網膜色素上皮細胞を用いる場合、製造を開始する日をずらせばよい。
　上述の神経網膜シート及び網膜色素上皮細胞は、接着因子の存在下で接触させることが好ましい。接着因子とは、細胞同士を接着させる作用を有している物質を意味し、特に限定はないが、例えば、上述した細胞外マトリクスや人工的なハイドロゲル等が挙げられる。接着因子は、単離された単一の物質である必要はなく、例えばマトリゲル、視細胞間マトリクス、血清等の生体や細胞からの調製物も含まれる。マトリゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ　Ｈｏｌｍ　Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。マトリゲルは、例えばＵＳ　ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ．４８２９０００に開示された方法により調製することができ、市販のものを購入することもできる。マトリゲルの主成分はラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンである。視細胞間マトリクスは、生体網膜における視細胞等の網膜系細胞の間に存在する細胞外マトリクスの総称であり、例えばヒアルロン酸が含まれる。視細胞間マトリクスは、当業者であれば、例えば網膜を蒸留水中に置き、膨張させて分離するという方法により、生体網膜から採取することが可能であり、市販のものを購入することもできる。接着因子としては、細胞外マトリクス又はハイドロゲルであることが好ましい。さらに、細胞外マトリクスとして、ヒアルロン酸、フィブリン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンからなる群から選択される１又は複数の細胞外マトリクスであることが好ましい。ハイドロゲルとして、ゼラチン、フィブリン、コラーゲン、ペクチン、ヒアルロン酸、アルギン酸からなる群から選択される１又は複数のハイドロゲルであることが好ましい。細胞外マトリクス及びハイドロゲルのどちらにも分類される物質が存在するが、本明細書においては、ゲル状の接着因子として用いる場合には、ハイドロゲルとして扱う。市販の細胞外マトリクスとしては、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス、ｉＭａｔｒｉｘ５１１等が挙げられる。接着因子としては、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンから選択される１以上の物質であってよく、特に、ゼラチン又はフィブリンであることが好ましい。
　フィブリンゲルとは、フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液とを反応させることで得られるゲル状フィブリンである。市販のボルヒール（登録商標）組織接着用を使用することもできる。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を接触又は混合させることで、両者を反応させることができる。
　「ゼラチン」とは、水に不溶性のコラーゲンを、例えば酸あるいはアルカリで前処理し、熱加水分解するなどにより可溶化したものである。市販のゼラチンを入手することも可能であり、例えば、ゼラチンＬＳ－Ｈ（新田ゼラチン（株）、豚皮アルカリ処理ゼラチン、非加熱処理ゼラチン、高ゼリー強度）、ゼラチンＬＳ－Ｗ（新田ゼラチン（株）、豚皮アルカリ処理ゼラチン、加熱処理ゼラチン、低ゼリー強度）が挙げられる。アルカリ処理（石灰処理）ゼラチン（Ｂタイプゼラチン）が好ましく、加熱処理ゼラチンが好ましい。
　ハイドロゲルは、加熱又は冷却によって、溶液がゲルからゾル、ゾルからゲルに相変化する。ハイドロゲルは、冷却して流動性を失うことでゲル（ゼリー）化し、加熱して流動性を獲得することによりゾル（水溶液）化する。ここで、「融解点」とは、一定圧力のもとで、ゾル化する温度を意味し、「凝固点」とは、一定圧力のもとで、ゲル化する温度を意味する。ハイドロゲルは、生体で分解される方が好ましい。一態様として、融解点が体温付近の温度（２５℃～４０℃）のハイドロゲル（例：ゼラチン）が好ましい。本明細書におけるハイドロゲルは、融解点が２０℃～４０℃（例：２０℃～３５℃、２５℃～３５℃、３０℃～４０℃、３５℃～４０℃）であってもよい。一般に、ゲルの融点は、ネットワークの強さの尺度であり、ハイドロゲルの濃度及び分子量の上昇に伴い、ハイドロゲル（例：ゼラチン）の融解点は上昇する。また、例えば、糖類により固形分を増加させると融解点及び凝固点は上昇する傾向にある。このように、一定の範囲で融解点及び凝固点を変動させることが可能である。ハイドロゲルの融解点の測定方法は、特に限定されず、例えば、ＪＩＳ　Ｋ６５０３に定められた方法によって測定できる。
　ハイドロゲルの強度は、移植のための操作においてハイドロゲルが崩れない程度であればよい。ハイドロゲルの強度の指標として「ゼリー強度」がある。ハイドロゲルの「ゼリー強度」とは、ゲルを形成した物体の機械的強度を意味する。通常一定形状のゲルを変形させるのに要する力又はゲルを破断させるのに要する力（単位：ｇ、ｄｙｎｅ（ｓ）／ｃｍ２又はｇ／ｃｍ２）で表現され、主としてゲルの硬さの尺度である。なお、１ダイン（ｄｙｎｅ（ｓ））は、質量１グラム（ｇ）の物体に働くとき、その方向に１センチメートル毎秒毎秒（ｃｍ／ｓ２）の加速度を与える力と定義される。例えば、ゼラチンのゼリー強度は、ＪＩＳ　Ｋ６５０３に定められた方法において測定することができる。本明細書において、例えば、ハイドロゲル（例：ゼラチン）ゲルのゼリー強度は、５０ｇ以上、１００ｇ以上、２００ｇ以上、５００ｇ以上、１０００ｇ以上、１２００ｇ以上、１３００ｇ以上、１４００ｇ以上又は１５００ｇ以上であってよい。また、ハイドロゲル（ゼラチン）のゼリー強度は、３０００ｇ以下、２５００ｇ以下又は２０００ｇ以下であってよい。
　接着因子（細胞外マトリクス）の濃度は、神経網膜シート若しくは網膜色素上皮細胞シートの大きさや網膜色素上皮細胞の細胞数により異なるが、当業者であればＲＰＥ細胞の接着の状態を確認することにより容易に設定可能である。例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌであれば、既製品（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を２００～１００００倍希釈した濃度、ｉＭａｔｒｉｘ５１１であれば、０．１～５μｇ／ｍＬの濃度で添加するのが好ましい。
　細胞外マトリクスを用いた上記複合体の製造方法の一態様として、接着因子（細胞外マトリクス）を含む媒体中で、神経網膜シートと網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートとを接着させるための培養を行えばよい。使用する媒体としては、特に限定されないが、例えば、網膜色素上皮細胞又は神経網膜の培養に用いられる培地（例：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、これらの混合培地、ＲＰＥ維持培地等）が挙げられる。また、細胞外マトリクスと共に、ＥＧＦ等の成長因子等の他の成分の存在下で接着のための培養を行ってもよい。上述した神経網膜シートと網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートとを接着させるための培養期間中、継続して接着因子を含む上記媒体中で培養してもよいし、接着因子を含む上記媒体中で一定期間（例：１日～１０日間）培養後、接着因子を含まない媒体に交換して培養を継続してもよい。
　神経網膜シートと網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートを接着させるための培養を行う前に、神経網膜シート又は網膜色素上皮細胞若しくは網膜色素上皮細胞シートを接着因子でコーティングしてもよい。具体的には、接着因子を含む上記媒体中で、神経網膜シート又は網膜色素上皮細胞若しくは網膜色素上皮細胞シートを培養すればよい。当業者であれば培養時間は適宜設定可能であるが、１０分～５時間（例えば、１０分～６０分）程度培養すればよい。培養後、ＰＢＳ等の媒体により洗浄してもよい。
　接着因子、ハイドロゲルもしくはマトリクスゲルは好ましくはフィブリンゲルである。フィブリンゲルとは、フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液とを反応させることで得られるゲル状フィブリンである。本明細書において、反応によってゲルを形成する性質の物質をマトリクス前駆体といい、例えば、反応することによってフィブリンゲルを形成するトロンビン及びフィブリノーゲンはマトリクス前駆体の一例である。フィブリノーゲン溶液は、フィブリノーゲン粉末などを、アプロチニンを含むフィブリノーゲンを溶解できる溶解液に溶解させることで作製でき、その濃度は特に限定されないが、例えば４０～４８０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、８０ｍｇ／ｍＬ～３２０ｍｇ／ｍＬ（例：１６０ｍｇ／ｍＬ）である。また、正常人血漿１ｍＬ中に含まれる血液凝固第ＶＩＩＩ因子活性を１単位とした時、３７．５単位／ｍＬ～２２５単位／ｍＬ（例：７５単位／ｍＬ）であってよい。トロンビン溶液は、トロンビン粉末などを、塩化カルシウム水和物を含むトロンビン溶解液に溶解させることで作製でき、その濃度は特に限定されないが、例えば１２５単位／ｍＬ～７５０単位／ｍＬ（例：７５単位／ｍＬ）である。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を接触又は混合させることで、両者を反応させることができ、その際、フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を活性比で、１：１～１：９、好ましくは１：３～１：４の範囲で使用されることが好ましい。
　ハイドロゲルを用いた上記複合体の製造方法の一態様として、フィブリンゲルを用いた複合体の製造方法を下記に示す。具体的には、フィブリノーゲン及びトロンビンを反応させることによって生成するフィブリンゲルにより、神経網膜シートと網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートを接着させる。
　一態様において、上記の２つの組織のうち、フィブリノーゲン溶液を接触させた１の組織（神経網膜又は網膜色素上皮細胞）、及び、トロンビン溶液に接触させた他の１の組織（網膜色素上皮細胞又は神経網膜）を、互いに接触させることでフィブリノーゲン及びトロンビンを反応させて、ゲル化させてもよい。ここで溶液との接触とは、少なくとも組織の接着面（フィブリンゲルによって他の組織と接着する際、他の組織に向いている面）をフィブリノーゲン溶液又はトロンビン溶液に、溶液によって組織の接着面に付着する程度に触れさせることをいう。
　より具体的には、例えば、神経網膜シートと網膜色素上皮細胞シートとを接着させる場合、神経網膜シートをフィブリノーゲン溶液に浸し、網膜色素上皮細胞シートをトロンビン溶液に浸していればよい（溶液は逆でもよい）。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液を、容量比で、３：１～１：３の範囲で使用されることが好ましい。接着させる前に、組織に付着した余分のフィブリノーゲン又はトロンビンを取り除いてもよい。この操作によってフィブリンゲルの厚さを調整することができる。
　フィブリノーゲン溶液を接触させた神経網膜シートと、トロンビン溶液に接触させた網膜色素上皮細胞シートとを接着させるために、両者を接触させればよい。ここで組織を接触させるとは、フィブリノーゲン溶液が付着した面と、トロンビン溶液が付着した面とを接触させる、すなわち、重ね合わせることをいう。また、網膜色素上皮細胞シート及び神経網膜が、それぞれの表面の接線方向が凡そ平行となり、かつ、神経網膜の頂端面と網膜色素上皮細胞シートの頂端面とが向き合うように、両者を接着させることが好ましい。
　一態様において、上記の組織をフィブリノーゲン溶液に接触させ、続いてトロンビン溶液をフィブリノーゲン溶液に添加することでフィブリノーゲン及びトロンビンを反応させてもよい。この場合、上記の組織がフィブリンゲルに包埋される。
　一態様において、本発明の製造方法は、複合体から、移植に必要な大きさの複合体を切り出す工程をさらに含んでもよい。フィブリンゲルによって２以上の組織が強固に接着されているため、複合体から移植片を切り出す際に、複合体から組織が剥がれることなく、容易に所望のサイズに切り出すことができる。切り出す際は、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いることが可能である。
〔医薬組成物、治療方法、治療薬及び使用〕
　本発明の一態様として、網膜組織（例えば、シート状網膜組織）を含む医薬組成物が挙げられる。医薬組成物は好ましくは、本発明の網膜組織の他にさらに医薬として許容される担体を含む。医薬組成物は、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害又は神経網膜の損傷に基づく疾患の治療に使用し得る。神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患としては、例えば、網膜変性疾患、黄斑変性症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、緑内障、角膜疾患、網膜剥離、中心性漿液性網脈絡膜症、錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー等の眼科疾患が挙げられる。神経網膜の損傷状態としては、例えは、視細胞が変性死している状態等が挙げられる。
　医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることができる。必要に応じて、医薬組成物には、移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
　本発明の一態様として、本発明で得られる網膜組織（例えば、シート状網膜組織）を含む、神経網膜の障害に基づく疾患の治療薬を提供する。また、本発明の一態様として、本発明で得られる網膜組織を、移植を必要とする対象（例えば、眼科疾患が起きている眼の網膜下）に移植することを含む、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害又は神経網膜の損傷に基づく疾患を治療する方法が挙げられる。神経網膜の障害に基づく疾患の治療薬として、又は、当該神経網膜の損傷状態において、該当する損傷部位を補充するために、本発明の網膜組織を用いることができる。移植を必要とする、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患を有する患者、又は神経網膜の損傷状態の患者に、本発明のシート状網膜組織を移植し、当該神経網膜系細胞又は、障害を受けた神経網膜を補充することによって、神経網膜系細胞若しくは神経網膜の障害に基づく疾患、又は神経網膜の損傷状態を治療することができる。移植方法としては、例えば、眼球の切開などにより損傷部位の網膜下に網膜組織を移植する方法が挙げられる。移植する方法としては、例えば細い管を用いて注入する方法やピンセットで挟んで移植する方法が挙げられ、細い管としては注射針等が挙げられる。
　本発明の一態様として、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療に使用するための、本発明で得られる網膜組織（例えば、シート状網膜組織）を提供する。また、本発明の一態様として、網膜系細胞若しくは網膜組織の障害又は網膜組織の損傷に基づく疾患の治療薬の製造における、本発明で得られる網膜組織の使用を提供する。
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
＜参考例１－１　凝集体再形成因子の探索＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株（非特許文献３））、及びヒトｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株、京都大学より入手）を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　４，　３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　具体的なヒトＥＳ及びヒトｉＰＳ細胞（ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞）の維持培養操作は、以下のように行った。まず、サブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になったヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。なお、ここで、単一細胞への分散とは、単一細胞となるように分散することであり、単一細胞に分散された細胞集団は、単一細胞のほか、２～５０個の細胞の塊を含み得る。その後、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。上記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ２）を用いた場合、上記単一細胞へ分散されたヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の播種細胞数は１ウェルあたり０．４～１．２×１０４細胞とした。播種した１日後に、Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１～２日に１回Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて培地交換した。その後、サブコンフレントに達する１日前までフィーダーフリー条件下で培養した。当該サブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞を、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、５μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ）の存在下（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ処理）で、１日間フィーダーフリー条件下で培養した。
　ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて細胞分散液処理し、さらにピペッティング操作によって単一細胞に分散した後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。
　浮遊培養開始時（分化誘導開始時、０日目）に、上記無血清培地にＹ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、終濃度１０μＭ又は２０μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ又は３０ｎＭ、又は０ｎＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧを含まず、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を終濃度１．５ｎＭで含む培地を５０μＬ用いた。浮遊培養開始後６日目以降、３日に１回Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ及びヒト組み換えＢＭＰ４を含まない培地で半量交換した。
　ＫｈＥＳ－１由来の細胞凝集体については、さらに当該浮遊培養開始後１４日目から１８日目の凝集体を、９０ｍｍの低接着培養皿（浮遊培養用シャーレ　９０Φ（深型）、住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｎ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で３７℃、５％ＣＯ２で、３～４日間培養した。その後、９０ｍｍの低接着培養皿（浮遊培養用シャーレ　９０Φ（深型）、住友ベークライト社製）にて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＮｕｃＴ０培地）で長期培養した。
　浮遊培養開始後１６日目（１２３１Ａ３由来）又は２７日目（ＫｈＥＳ－１由来）の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃で２０～３０分間インキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２×１０５細胞（ＫｈＥＳ－１由来）又は５×１０５細胞（１２３１Ａ３由来）になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。細胞添加と同時に、（１）添加無し（ｃｏｎｔｒｏｌ）、（２）１０μＭ又は２０μＭ（１２３１Ａ３由来）　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、（３）３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（４）１０μｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社）、（５）１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、（６）３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（７）１０μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ社）、（８）３μＭ　ＩＷＲ－１（Ｗａｋｏ社）をそれぞれ添加した。
　（１）～（８）のいずれの条件においても２週間程度培養すると凝集体が再形成されることが確認されたが（参考例１－３の結果を参照）、Ｙ－２７６３２を添加した場合、凝集体の再形成のための浮遊培養後１～２日目（Ｄａｙ１～Ｄａｙ２）から凝集体が再形成されていることが確認された（図１:ＫｈＥＳ－１、図２:１２３１Ａ３）。一方で、Ｙ－２７６３２以外の化合物では、早期の凝集体の再形成促進効果は認められなかった（図１及び図２）。よって、単一細胞に分散された網膜前駆細胞において、Ｙ－２７６３２を添加することで、早期から凝集体の再形成を促進することがわかった。
＜実施例２　層構造形成促進因子及び凝集体増殖促進因子の探索＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後２０日目（１２３１Ａ３）及び２７日目（ＫｈＥＳ－１）の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２～５×１０５細胞になるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。細胞添加と同時に、（１）添加無し（１０μＭ　Ｙ－２７６３２のみ）、（２）３０ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（３）３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（４）１０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社）、（５）１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、（６）３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（７）１０μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ社）、（８）３μＭ　ＩＷＲ－１（ＫｈＥＳ－１由来）又は１０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ（１２３１Ａ３由来）を添加した。
　凝集体再形成のための浮遊培養後１日目、７日目、及び１４日目に凝集体の再形成状態を明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）にて観察した。ＫｈＥＳ－１由来細胞の結果を図３～５に示す。また、凝集体の面積をＩｍａｇｅ　Ｊにて計測した。ＫｈＥＳ－１由来細胞の結果を図６に示す（１２個計測した平均値）。また、浮遊培養後１日目の凝集体の再形成状態を観察した１２３１Ａ３由来細胞の結果を図７に示す。図３～７により、Ｙ－２７６３２に加えてＳＡＧ（３００ｎＭ）又はＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）を添加した群は、Ｙ－２７６３２のみ添加した群より大きな凝集体が再形成されていることが確認された。よって、ＳＡＧとＣＨＩＲ９９０２１は凝集体の増殖、再形成を促進する効果が確認された。
＜参考例１－３　層構造形成促進因子及び凝集体増殖促進因子の探索＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後２６日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり３．０×１０４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。細胞添加と同時に（１）添加無し（ｃｏｎｔｒｏｌ）、（２）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、（３）３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（４）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（５）３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（６）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（７）３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（８）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を添加した。
　凝集体再形成のための浮遊培養後１日目、１４日目及び２８日目（Ｄａｙ１、Ｄａｙ１４、Ｄａｙ２８）、すなわち、分化誘導のための浮遊培養開始後２７日目、４０日目及び５４日目（ｄｄ２７、ｄｄ４０、ｄｄ５４）に凝集体の再形成状態を観察した結果を図８、図９、図１０に示す。図８、図９、図１０により、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した際、凝集体が再形成されていることが確認された。またＣＨＩＲ９９０２１に加えてＳＡＧを添加すると凝集体がより大きいことが確認された。
　凝集体の再形成のための浮遊培養後１５日目（分化４１日目相当）及び２８日目（分化５４日目相当）凝集体を、４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ　ａｌｐｈａ社）、抗β－Ｃａｔｅｎｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）、抗Ｚｏ－１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ社）、抗Ｐａｘ６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗ＲｘＲ－γ（ＲｘＲｇ）抗体（Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗ＣＲＸ抗体（Ａｂｎｏｖａ社）、抗ＮＲＬ抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）、抗Ｉｓｌｅｔ－１抗体（ＤＳＨＢ社）、抗ＧＳ抗体（Ｓｉｇｍａ社）、抗Ｂｒｎ３抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、抗Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて免疫染色を行った。
　これらの免疫染色された切片を、明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡観察（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製ＳＰ－８）を用いて観察し、その結果を図１１～２０に示す。図１１、図１４、図１５、図１８により、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合、凝集体の最も外側にＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜前駆細胞が含まれる層構造が形成されていることを確認した。また、図１２、図１６、図１７により、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合、凝集体の最も外側にＺｏ－１陽性の頂端面が、内部にコラーゲン陽性の基底面が形成されており、ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性を有する上皮組織が形成されていることを確認した。一方で特に図１７のように、ＣＨＩＲ９９０２１を添加していない群では、細胞の極性がない、もしくはロゼット様の構造を示していることが観察された。さらに、図１９、図２０により、ＲｘＲ－γ（ＲｘＲｇ）陽性及びＣＲＸ陽性の錐体前駆細胞、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ陽性及びＣＲＸ陽性の視細胞前駆細胞が分化していることが確認され、Ｉｓｌｅｔ－１陽性及びＢｒｎ３陽性の網膜神経節細胞、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ陽性アマクリン細胞の分化も確認された。
　これらの結果から、一度分散した網膜系細胞の単一細胞懸濁液において、ＣＨＩＲ９９０２１を添加することで、Ａｐｉｃａｌ　ｂａｓａｌの極性を有する上皮組織としての網膜組織を再組織化・網膜分化できることが分かった。
＜参考例１－４　凝集体再形成させる分化時期について＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後１８日目、２５日目、４０日目、６１日目、及び７５日目（ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ４０、ｄｄ６１、ｄｄ７５）の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２～５×１０５細胞になるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。
　凝集体の再形成のための培養３日目、１５日目、２１日目（Ｄａｙ３、Ｄａｙ１５、Ｄａｙ２１）に凝集体の再形成状態を明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察した結果を図２１に示す。図２１により、ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ４０、ｄｄ６１、ｄｄ７５のどの分化日数の細胞凝集体においても、凝集体が再形成され、層構造が形成されていることが確認された。また、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜組織の特性が維持されていることが観察された（図２１）。
　これらの結果から、どの分化段階の網膜組織においてもＹ－２７６３２並びにＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を添加することで凝集体を再形成できることがわかった。
＜参考例１－５　脳オルガノイドの再凝集体形成について＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　浮遊培養開始後３日目に、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧを含まず、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＢＭＰ－４、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を終濃度１．５ｎＭで含む培地を５０μＬ用いた。また、脳オルガノイドを作製するために、ＢＭＰ４を添加しない群をおいた。浮遊培養開始後６日目以降、３日に１回Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ及びヒト組み換えＢＭＰ４を含まない培地で半量交換した。
　このように作製された浮遊培養開始後４０日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散した細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり５×１０５細胞になるように、１０ｍＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。
　凝集体の再形成のための培養３日目、１５日目、２１日目に凝集体の再形成状態を明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡した結果を図２２に示す。図２２により、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の終脳オルガノイドにおいても、網膜オルガノイドと同様に凝集体が再形成され、層構造が形成されていることが確認された。
　これらの結果から、網膜オルガノイドだけでなく終脳オルガノイド等の神経上皮組織においても凝集体を再形成できることがわかった。
＜参考例１－６　凍結保存検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後３１日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。
　分散後、非凍結群においては、非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２．０×１０５細胞になるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。
　分散後、凍結群として、陰性対照のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）と、以下の凍結保存液、Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ　１（ＴａＫａＲａ社）、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ（ＴａＫａＲａ社）、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）凍結保存溶液（ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標）　Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ；富士フイルム和光純薬株式会社）、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）　Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）凍結保存溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（日本ジェネティクス株式会社）を用いて、上記単一細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、バイセルを用いて－８０℃にて凍結保存した。
　凍結保存１日後、起眠し、生細胞率を確認した。起眠直後の生細胞率は、ＰＢＳ群では激減したが、いずれの凍結保存液でも生細胞率は高く、ＳＴＥＭｄｉｆｆ以外の凍結保存液（Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ　１、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）では、非凍結と遜色なく９０％以上を示した（図２４（Ａ））。
　これらの細胞を、非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）の１ウェルあたり２×１０５細胞になるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む１００μＬのＮｕｃＴ０培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。
　播種１日後、いずれの凍結保存液（Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ　１、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ、ＳＴＥＭｄｉｆｆ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ）においても、非凍結と比較して遜色なく凝集体が再形成されていることが確認された（図２３、図２４（Ｂ））。特に、Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ　１では、他の凍結保存液で見られる凝集体の周辺部に存在する小さなＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞凝集体が確認されず、非凍結に近い観察像が得られた（図２３）。
　凝集体の再形成のための培養７日後、いずれの凍結保存液においても、非凍結と比較して遜色なく凝集体が再形成されていることがわかった。
　これらの結果から、一度分散して得られた網膜系細胞の単一細胞懸濁液を、凍結保存させても、起眠後、Ｙ－２７６３２、ＳＡＧ、及びＣＨＩＲ９９０２１を添加して培養することで、凝集体を再形成させることができることがわかった。
＜参考例１－７　網膜凝集体の発現している足場タンパク質について＞
　参考例１－１～６の検討で、網膜系細胞を分散し、多能性幹細胞を網膜分化させて網膜系細胞を含む細胞凝集体を得て、細胞凝集体を分散して単一細胞懸濁液を得て、当該単一細胞懸濁液を、播種時にＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及びＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を添加して浮遊培養することで、層構造を持ち、極性を有する網膜組織を再組織化できることがわかった。次に、広いシート状網膜組織を作製するための検討として、接着培養を行うことを構想した。そして、接着培養するための、細胞外マトリクスを検討することとした。
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後２５～３５日後の凝集体を４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｌａｍｉｎｉｎ抗体（商品名：Ａｎｔｉ　Ｌａｍｉｎｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂｃａｍ社）、抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。その結果、凝集体は少なくとも基底膜の構成成分であるＬａｍｉｎｉｎやＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶを発現していることを確認した（図２５）。すなわち、この自己組織化培養系では、ヒト網膜組織が自ら基底膜を形成し、ＬａｍｉｎｉｎやＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶを発現することがわかった。
　公知の基底膜に特化したマウス胎児の組織染色に関するデータベース（MOUSE BASEMENT MEMBRANE BODYMAP; http://dbarchive.biosciencedbc.jp/archive/matrixome/bm/home.html）の情報から、マウスの胎児神経網膜組織において発現しているＬａｍｉｎｉｎのアイソフォームを調査した。その結果、ＬａｍｉｎｉｎのアイソフォームとしてＬａｍｉｎｉｎαが１、４、５、Ｌａｍｉｎｉｎβが１，２、Ｌａｍｉｎｉｎγが１ということが明らかとなった（図２６）。
　この結果から、神経網膜組織に適した細胞外マトリクスとして、Ｌａｍｉｎｉｎα、Ｌａｍｉｎｉｎβ、Ｌａｍｉｎｉｎγの組み合わせで、Ｌａｍｉｎｉｎの５１１、５２１、４１１、４２１、１１１、１２１（特に５１１、５２１、４１１）が有用である可能性が示唆された。
　すなわち、接着培養でシート状網膜シートを再形成させるための、細胞外マトリクスとして、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１、Ｌａｍｉｎｉｎ５２１、Ｌａｍｉｎｉｎ４１１、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ等が有用である可能性が示唆された。
＜参考例１－８　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種　細胞外マトリクス検討＞
　参考例１－１～６の検討で、網膜系細胞の単一細胞懸濁液から、浮遊培養で、層構造を持つ網膜組織を含む凝集体を再形成させる手法を検討した。参考例１－７にて、接着培養に用いる細胞外マトリクスの候補を検討した。これらを組み合わせ、網膜系細胞の単一細胞懸濁液から、接着培養での、シート状網膜組織の再形成法（再シート化）を検討した。
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後１６日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。
　再シート化を促進させる細胞外マトリクスとして、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）とＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名ｉＭａｔｒｉｘ５１１、ニッピ社製）を用いた。上記分散した網膜系細胞の単一細胞を、以下の３条件で２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、１ウェル当たり０．５～４×１０５細胞となるように、１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む３００μＬの無血清培地に浮遊させて播種した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ｇｆＣＤＭ）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
条件１：Ｍａｔｒｉｇｅｌで予めコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに播種（Ｍａｔｒｉｇｅｌ　（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ））
条件２：Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８で予めコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに播種（ｉＭａｔｒｉｘ５１１　（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ））
条件３：予めコートをしなかった２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８を添加した培養液を用いて細胞を播種（Ｍｉｘ法）。
　凝集体の再形成のための培養１４日以降、いずれの条件においてもシート状の細胞凝集体（細胞シート）が形成された。シート状の細胞凝集体を４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｃｈｘ１０抗体（ＥｘＡｌｐｈａ社）、抗Ｚｏ－１抗体（商品名：Ａｎｔｉ　Ｚｏ－１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ）、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ）、Ｍｉｘ法の全てにおいて、Ｃｈｘ１０陽性の神経網膜前駆細胞が存在することが確認された（図２７）。さらに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ）及びｉＭａｔｒｉｘ５１１（Ｐｒｅ　ｃｏａｔ）の条件では、Ａｐｉｃａｌ面（上皮組織のｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎはＡｐｉｃａｌ面に形成される）のマーカーであるＺｏ－１が、シート状の細胞凝集体の上側（ウェルに接していない側）に、Ｂａｓａｌ面のマーカーであるＣｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶが、シート状の細胞凝集体の下側（ウェルに接している側）にて確認された（図２８）。ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性を有するＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜前駆細胞のシートが再形成されていることが確認された。一方で、細胞外マトリクスを同時に投与するＭｉｘ法では極性が形成されていないことが確認された。
　これらの結果から、単一細胞に分散された網膜系細胞（ＮＲ）において、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８もしくはＭａｔｒｉｇｅｌを足場として事前にコートすることでＡｐｉｃａｌ－ｂａｓａｌの極性を有するシート状網膜組織を再度作製（再シート化）できることが分かった。
＜参考例１－９　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種・再シート化　ＣＨＩＲ９９０２１の効果確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後１５～３０日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、１ウェルあたり８×１０５細胞となるように（１）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、（２）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、（３）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び５μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、（４）１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む３００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で接着培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
　凝集体の再形成のための培養１４日に得られた細胞シートを観察したところ、全ての条件において、細胞が生着していることが観察された（図２９）。そこで、これらの細胞シートを４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｚｏ－１抗体（商品名：Ａｎｔｉ　Ｚｏ－１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片を、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果ＣＨＩＲ９９０２１を添加した場合、ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性を有するＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜前駆細胞のシートが再度形成されていることが確認された。一方で、ＣＨＩＲ９９０２１を添加しなかった場合、Ａｐｉｃａｌ面が構成されず、極性が形成さていないことが確認された（図３０）。
　これらの結果から、単一細胞に分散された網膜系細胞（ＮＲ）において、ＣＨＩＲ９９０２１を添加することでＡｐｉｃａｌ－ｂａｓａｌの極性を有する網膜シートを再度作製できることが分かった。
＜参考例１－１０　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種・再シート化　ＣＨＩＲ９９０２１の濃度・添加期間の検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後３３日（ｄｄ３３）の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり２～４×１０５細胞となるように播種し、１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）に加え、１μＭ、３μＭ又は９μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）を含む３００μＬの無血清培地を添加し、３日間（０～３日目）又は６日間（０～６日目）又は９日間（０～９日目）、３７℃、５％ＣＯ２で接着培養した。播種３日以降に３～４日に１回、培地交換を行った。
　凝集体の再形成のための培養１４日後（Ｄａｙ１４、ｄｄ４７）に得られた細胞シートを、観察したところ、ＣＨＩＲ９９０２１を９μＭで６日間、９日間添加群以外は生着していることが観察された（図３１）。そこで、これらの細胞シートを４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩを用いて免疫染色を行った。ＣＨＩＲ９９０２１を１μＭから９μＭで３日間から９日間添加することで、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜前駆細胞のシートが厚く再形成されていることが確認された（図３２）。
　これらの結果から、単一細胞に分散された網膜系細胞（ＮＲ）において、ＣＨＩＲ９９０２１を少なくとも１～９μＭで３～９日間添加することで網膜シートを再度作製できることが分かった。
＜参考例１－１１　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種時の足場の検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後２４日の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、（１）コーディングなし（Ｎｏｎ　Ｃｏａｔ）、並びに、（２）２μＬのｉＭａｔｒｉｘ５１１（商品名、ニッピ社製）、（３）２μＬのｉＭａｔｒｉｘ４１１（商品名、ニッピ社製）、（４）２μＬのｉＭａｔｒｉｘ２１１（商品名、ニッピ社製）、（５）２μＬのＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　（ＶＴＮ－Ｎ）　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社）、（６）２μＬのＣｅｌｌ　Ｓｔａｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）、（７）５μLのＬａｍｉｎｉｎ１１１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ１２１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ２１１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ２２１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ４１１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ４２１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ５１１、５μLのＬａｍｉｎｉｎ５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、（８）５μLのＬａｍｉｎｉｎ３３２、（９）２μLのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり２．０×１０５細胞となるように播種し、１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及び３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）に加え、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、１００μｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８（Ｗａｋｏ社）を含む２００μＬの無血清培地を添加し、３日間、３７℃、５％ＣＯ２で接着培養した。播種３日以降に３～４日に１回、培地交換を行った。
　播種２２日後に得られた細胞シートを、観察したところ、Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｒｔ以外の足場で良好な神経網膜シートが得られた（図３３）。
　これらの結果から、単一細胞に分散された凝集体（ＮＲ）において、ｉＭａｔｒｉｘ５１１やＭａｔｒｉｇｅｌだけでなく、様々な足場タンパク質においても網膜シートを再度作製できることが分かった。
＜参考例１－１２　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種・再シート化・網膜分化の確認＞
　Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後１５日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、１ウェルあたり２．０×１０５細胞となるように、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含む２００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
　播種４４日後（Ｄａｙ４４、ｄｄ５９）に得られた細胞シートを、観察したところ、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の視細胞が分化してきていることが観察された（図３４）。
　さらに、浮遊培養開始後２９日目の凝集体を用いて、同様に再シート化した。再組織化培養２８日目（Ｄａｙ６７）の細胞シートを４％ＰＦＡで固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、ＤＡＰＩ及び抗Ｋｉ６７抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ　ａｌｐｈａ社）、抗Ｐａｘ６抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗Ｂｒｎ３抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、抗ＲｘＲ－γ（ＲｘＲｇ）抗体（Ｓｐｒｉｎｇ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗Ｃｒｘ抗体（ａｂｎｏｖａ社）を用いて免疫染色を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌとして平面化（再シート化）させていないｄｄ７０の３Ｄ　Ｒｅｔｉｎａ（細胞凝集体）も染色を行った（図３５～３７）。
　また、Ｄａｙ５７の細胞シートを４％ＰＦＡで固定した後、切片は作製せず、全体免疫染色を行った。ＤＡＰＩ及び抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＥＸ　ａｌｐｈａ社）、抗Ｓｏｘ２抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ社）、抗Ｐａｘ６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、抗Ｂｒｎ３抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、抗ＴＵＪ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、抗Ｉｓｌｅｔ－１抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、抗Ｃｒｘ抗体（ａｂｎｏｖａ社）、抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）、抗Ｚｏ－１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、抗Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ＩＶ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色を行った。
　その結果、Ｃｈｘ１０陽性、Ｐａｘ６陽性及びＫｉ６７陽性の網膜前駆細胞、Ｂｒｎ３陽性の網膜神経節細胞、ＲｘＲｇ陽性、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性及びＣｒｘ陽性の錐体細胞前駆細胞が、Ｃｏｎｔｒｏｌの３Ｄ　Ｒｅｔｉｎａと遜色なく分化していることが確認された。また、透過光でＴｒａｎｓｗｅｌｌとの位置関係を観察したところ、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上に網膜シートが形成されており、Ｂａｓａｌ側に局在するＰａｘ６強陽性、Ｃｈｘ１０陰性の網膜神経節細胞がＴｒａｎｓｗｅｌｌ側に局在していることが確認された（図３８）。さらに、切片を作製せずに全体を共焦点顕微鏡で観察したところ、ＡｐｉｃａｌとＢａｓａｌの極性を有し、極性に従って各種網膜細胞が分化していることが確認された（図３９、図４０、図４１）。
　さらに長期間培養し、ｄｄ１１２の細胞シートについて、切片は作製せず、シートの状態で免疫染色を行った。抗Ｒｉｂｅｙｅ抗体（ＣｔＢＰ２、ＢＤ社）と抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）、抗Ｐａｘ６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を用いて染色したところ、Ｃｒｘ：：ＶｅｎｕｓとＲｅｃｏｖｅｒｉｎが同一の細胞で発現が観察され、Ｒｉｂｅｙｅが発現していることが確認された（図４２）。よって、再シート化した網膜から分化した視細胞は、シナプスタンパク質を発現する程度にまで成熟することが確認された。また、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ、がＡｐｉｃａｌ側に、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６が内側に局在された状態で、シートが形成されていることが確認された（図４３）。
　これらの結果から、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上で再組織化した網膜シートにおいて網膜細胞の分化が確認され、極性が維持されていることが観察された。
＜参考例１－１３　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ株で網膜系細胞の維持培養＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後３１日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、１０μＬのＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、１ウェルあたり２．０×１０５細胞となるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含む５００μＬの血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２にＮ２を添加した培地に（１）Ｃｏｎｔｒｏｌ、（２）２０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、（３）２０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ、（４）１００ｎＭ　ＳＡＧ、（５）１ユニットＬＩＦ、（６）１０ｎｇ／ｍＬ　ＩＧＦ－１、（７）１００ｎｇ／ｍＬ　ＰＤＧＦ－ＡＡ、（８）１００ｎｇ／ｍＬ　ＰＤＧＦ－ＡＢ、（９）１０μｇ／ｍＬ　ＧＤＮＦ、（１０）２０μｇ／ｍＬ　ＢＤＮＦ、（１１）２μＭ　Ｐｙｒｉｎｔｅｇｒｉｎ、（１２）１μＭ　ＢＭＰ４を添加して、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＮ２を添加）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
　３４日後、細胞シートを４％ＰＦＡで固定し、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の面積に着目して観察し、網膜系の細胞の維持の状態について検討を行った。蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）を用いて、観察したところ、２０ｎｇ／ｍＬ　ＥＧＦ及びＦＧＦ２を添加し続けた際、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞が広く維持されていることが確認された（図４４）。
　よって、ＥＧＦやＦＧＦを網膜の再組織化の際に添加すると、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の維持に効果があることがわかった。
＜参考例１－１４　平面化培養時の網膜前駆細胞の維持培養＞
　Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後２７日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、１０μＬのＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした１２ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌに８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含む５００μＬの以下の培地に懸濁して、細胞を播種した。網膜前駆細胞を維持する培地を検討するため、（１）ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ　ＮＳ－Ａ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、（２）ＳＴＥＭｄｉｆｆ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｏｇｎｅｉｔｏｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、（３）ＳｔｅｍＰｒｏ　ＮＳＣ　ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）、（４）ＲＨＢ－Ａ（ＴａＫａＲａ社）の培地に２０ｎｇ／ｍＬＦＧＦ２と２０ｎｇ／ｍＬＥＧＦを添加して１か月間培養した。ＣｏｎｔｒｏｌとしてＮｕｃＴ０培地をおいた。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
　凝集体の再形成のための培養１６日後、視細胞前駆細胞マーカーＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標に分化をしていない条件（蛍光顕微鏡で観察した場合、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓが光っていない条件）を調べたところ、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ　ＮＳ－Ａ及びＲＨＢ－Ａ培地がある程度分化を遅らせる効果があることが認められた（図４５）。
　よって、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ　ＮＳ－Ａ及びＲＨＢ－Ａ培地とＥＧＦやＦＧＦを再シート化の際に添加すると、網膜前駆細胞の維持、及び分化を遅らせる効果があることがわかった。
＜参考例１－１５　コラーゲンゲル上で培養＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　ｂｅＭａｔｒｉｘ低エンドトキシン化コラーゲン液（新田ゼラチン社）を用いてコラーゲンゲルを作製した。具体的な操作としては、コラーゲンＡＴと５ｘＤＭＥ、再構成用緩衝液を７：２：１の割合で混合し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのメッシュの上にコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３０分インキュベートした。インキュベート後、インサートの内外に培地を添加した。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後２６日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、１２ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌのコラーゲンゲル上に８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。最初の３日間は、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０培地）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
　凝集体の再形成のための培養３３日後、実体顕微鏡にて、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標に再シート化の具合を観察したところ、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのコラーゲンゲル上で前面にＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞が存在していることが認められた（図４６）。
　よって、コラーゲンゲル上においても、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を添加することで再シート化ができることがわかった。
＜参考例１－１６　移植検討＞
　Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１５のようにして作製されたコラーゲンゲル上で２６日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、１２ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌのコラーゲンゲル上に８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。最初の３日間は、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０培地）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
　凝集体の再形成のための培養３７日及び４４日の分化６３日目及び７０日目の網膜細胞シートに関してＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて３０分間３７℃で処理し、剥離させた。剥離させた網膜シートをピンセットとハサミを用いて細長く切り出し、長さ１．８ｃｍ程度の移植用のグラフトを用意した（図４７）。
　用意したグラフトについて、ガラスパスツールピペットを用いて、免疫不全網膜不全ラット（ＳＤ　Ｆｏｘｎ）の網膜下に移植した。
　移植後１年のラットの眼を取り出し、４％ＰＦＡで固定した。蛍光実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ　ＢＺ－Ｘ８１０）を用いて、観察したところＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性のグラフトが生着していることが確認された（図４８）。
　よって、再シート化した網膜シートは移植後に生着することができることがわかった。
＜参考例１－１７　ソーティング検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後１４～２５日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いて、ＦＳＣとＳＳＣで目的の細胞集団をゲーティングした後、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の画分を分取した（図４９）。
　分取した細胞を、１ウェルあたり１．６～８．０×１０５細胞となるように、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングしておいた１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種した。コントロールとしてＳｏｔｉｎｇしていないシートも作製した。最初の３日間は、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１の存在下で培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０培地）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。播種後、２６日目に蛍光実体顕微鏡を用いて観察した（図５０）。
　また、分化８２日目のＳｏｔｉｎｇによりＲｘ：：Ｖｅｎｕｓで純化した細胞シートを４％ＰＦＡで固定した後、切片は作製せず、シートのまま免疫染色を行った。ＤＡＰＩ及び抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）を用いて免疫染色を行った。ＣｏｎｔｒｏｌとしてＳｏｔｉｎｇしていない網膜シートも染色を行った（図５１、図５２、図５３）。その後、凍結切片を作製しＤＡＰＩ及び抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ社）、抗Ｃｈｘ１０抗体（商品名：Ａｎｔｉ　ＣＨＸ１０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、抗ＣＲＸ抗体（ＴａＫａＲａ社）を用いて免疫染色を行った。（図５３）。
　その結果、　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性画分をソーティングせずに播種すると、一部においてＲＰＥ細胞の塊が観察された。もっとも、目視で確認できるため、ＲＰＥ細胞を除去することは可能である。一方、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性画分をＳｏｒｔｉｎｇした場合、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜シートが作製できていることが観察された。さらに、ＲＰＥ細胞が大部分除去できていることが確認された（図４９、図５０）。しかしながら、Ｓｏｒｔｉｎｇしても、ＲＰＥ細胞が混入する場合があり、これはＳｏｒｔｉｎｇでＲＰＥ細胞を完全に除去できなかったためか、又は、Ｓｏｒｔｉｎｇ後に分化されたかは不明である。しかし、混入したＲＰＥ細胞は神経網膜組織と混ざり合っていないことが確認できた（図５２）。目視で確認できるため、ＲＰＥ細胞を除去することは可能である。
　また、Ｓｏｒｔｉｎｇを行った網膜シートにおいて、ＣｏｎｔｒｏｌであるＳｏｒｔｉｎｇ無の網膜シートと遜色なく、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ陽性の視細胞が分化していることが確認された（図５１、図５３）。Ｚ　Ｓｔａｃｋ解析及び、切片の免疫組織学的な解析から、網膜組織の層構造が再形成されていること、Ｃｈｘ１０陽性及びＫｉ６７陽性の網膜前駆細胞、Ｃｒｘ陽性の視細胞前駆細胞の存在が確認された（図５３）。
　よって、ＦＳＣ及びＳＳＣで目的の細胞集団をゲーティングした後、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｒｔｉｎｇすることにより、大部分のＲＰＥ細胞を除去することができ、かつ、再シート化をした際問題なく網膜細胞が分化することが観察された。
＜参考例１－１８　再シート化時のＲｅｔｉｎａの性質を維持する因子探索＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後２５日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞をＥａｓｙ　ｉＭａｔｒｉｘを用いてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８コートした９６Ｗｅｌｌガラスボトムプレート（グライナー社）に１ウェルあたり５×１０４細胞を１００μＬのＮｕｃＴ０にＹ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＡＧを添加して播種した。播種と同時に表１に示すタンパク質、又は表２に示す低分子化合物を添加した。
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　播種３日後にも同様に表１及び２に記載の低分子化合物又はタンパク質の濃度を維持するように培地交換を行った。その後７日目に表１及び２に記載の低分子化合物又はタンパク質を含まないＮｕｃＴ０培地で培地交換を実施した。播種１０日後、４％ＰＦＡで固定し、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）でＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標に、Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞の評価を行った。その結果、タンパク質のうち、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８を添加したシートでは、ＣｏｎｔｒｏｌであるＰＢＳと比較して、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓの発現強度が高いことが観察された（図５４）。また、低分子化合物のうち、ＩＷＲ１　ｅｎｄｏを添加したシートでは、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓの発現強度が高いことが観察された（図５５）。さらに、濃度依存性が確認され、ＦＧＦ８を１００μｇ／ｍＬ添加した際、最もＲｘ：：Ｖｅｎｕｓの発現強度が高いことが観察された（図５６）。
　よって、細胞播種直後にＦＧＦシグナルを活性化させることで、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の細胞集団を維持できることがわかった。
＜参考例１－１９　ＦＧＦ８の添加による凝集体再形成、網膜分化確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後２４日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞を低接着Ｖｐｌａｔｅに１ウェルあたり２．０～５．０×１０４細胞播種した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＦＧＦ８を添加していない群（ＦＧＦ８－）、Ｓｏｒｔｉｎｇしていない群（Ｓｏｒｔｉｎｇ無）も置いた。
　３～４日に１回培地交換を実施した。なお、培地交換時にＦＧＦ８も添加した。再播種後１０日目に顕微鏡で観察したところ、Ｓｏｒｔｉｎｇ無、ＦＧＦ８－の群では、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の細胞塊、又はＲＰＥ細胞が観察された（図５７）。一方、ＦＧＦ８を添加した群（ＦＧＦ８＋）では、これらの細胞塊が減少していることが観察された。Ｓｏｒｔｉｎｇ有、ＦＧＦ８－の群では、ＲＰＥ細胞が部分的に観察された。ＳｏｒｔｉｎｇによってＲＰＥ細胞は除去されていることから、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の一部の集団がＲＰＥ細胞に分化したことが示唆された。一方で、Ｓｏｒｔｉｎｇ有、ＦＧＦ８＋の群では、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の凝集体が形成され、ＲＰＥ細胞、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の塊は観察されなかった。
　これらの結果から、ＦＧＦ８を添加することによって、ＲＰＥ細胞、又はＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性細胞の分化を減少させることができると分かった。
　さらに凝集体の再形成のための培養５４日目（再播種後３０日目）の凝集体を、ＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を用いて、単一細胞に分散した後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）を用いてホルムアルデヒド固定を行った。その後、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）で洗浄した後、抗ＣＨＸ１０－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）、抗Ｓｏｘ２－ＢＶ４２１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗Ｋｉ６７－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢＤ社）、抗ＣＲＸ－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）で染色を行った。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）で抗体を洗浄後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。なお、コントロールとして、再組織化をしていない、同分化日数の神経網膜組織も置いた。
　その結果、Ｓｏｒｔｉｎｇ無でかつ、ＦＧＦ８を添加していない群では、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓネガティブの細胞集団が多数観察され、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率が低い傾向にあった。一方で、Ｓｏｒｔｉｎｇ無においても、ＦＧＦ８を添加した群ではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率が高い傾向にあることが示された（図５８）。
　また、Ｓｏｒｔｉｎｇを行うとＦＧＦ８を添加しない群においてもＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率は高い傾向であった（図５８）。一方で、Ｓｏｒｔｉｎｇを行いかつ、ＦＧＦ８を添加した群では、Ｃｈｘ１０陽性及びＳｏｘ２陽性の神経網膜前駆細胞の割合が高く、Ｃｒｘ陽性の視細胞前駆細胞の割合が低い傾向であった（図５９）。
　これらの結果から、Ｓｏｒｔｉｎｇだけでなく、ＦＧＦ８を添加することによって、ＲＰＥやＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性細胞の分化を減少させ、均一で良好な凝集体を得ることができると分かった。
＜参考例１－２０　再シート化時のＦＧＦ８の効果の確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後２４日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞をＹ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１及びＳＡＧ、ＦＧＦ８を含むＮｕｃＴ０培地に２４ウェルトランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１ウェルあたり２．０×１０５細胞を懸濁し、播種した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＦＧＦ８を添加していない群（ＦＧＦ８－）も置いた。
　３～４日に１回培地交換を実施した。なお、培地交換時にＦＧＦ８も添加した。分化６３日、再播種後４０日を経過したシートを、蛍光実体顕微鏡で観察をした（図６０、図６１）。また、ＦＡＣＳ解析のため、分化６４日、再播種後４１日の凝集体を、ＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を用いて、単一細胞に分散した後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）を用いてホルムアルデヒド固定を行った。その後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）ＢＤ社）を用いて固定し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）で洗浄した後、抗ＣＨＸ１０－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）、抗Ｓｏｘ２－ＢＶ４２１　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、抗Ｋｉ６７抗体（ＢＤ社）、抗ＣＲＸ－Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏ　６４７　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）で染色を行った。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社）で抗体を洗浄後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。なお、コントロールとして、再組織化をしていない、同分化日数の神経網膜組織も置いた（図６２）。
　その結果、Ｓｏｒｔｉｎｇをした後、ＦＧＦ８を添加していないシートでは、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓネガティブの細胞集団が多数観察され、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞がウェルの周辺部に偏って、塊上に存在している傾向にあった。一方で、Ｓｏｒｔｉｎｇ後にＦＧＦ８を添加したシートではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞がウェル全体に均一に存在しており、良好なシートが作製されていることが観察された（図６０、図６１）。また、ＦＧＦ８を添加していないシートでは黒いＲＰＥ（図６１、矢印）が観察された一方、ＦＧＦ８を添加したシートではほとんど観察されなかった。
　また、ＦＡＣＳ解析において、ＦＧＦ８を添加していないシートでは、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率が６０％と減少していたが、ＦＧＦ８を添加した群では９５％以上と、神経網膜組織と遜色ない陽性率を維持できていることがわかった（図６２）。さらに、Ｃｈｘ１０陽性及びＳｏｘ２陽性の神経網膜前駆細胞やＣｒｘ陽性の視細胞前駆細胞の割合も神経網膜組織と比較しても同等であった。Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性でかつ、Ｋｉ６７陽性の増殖性のある網膜系細胞の割合は神経網膜組織と比較して多い傾向であった（図６２）。
　これらの結果から、再シート化を行う際、Ｓｏｒｔｉｎｇ後にＦＧＦ８を添加することによって、ＲＰＥやＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性細胞の分化を減少させ、均一で良好なシートを得ることができると分かった。
＜参考例１－２１　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上への播種・再シート化後の経時変化確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１のように作製された浮遊培養開始後２７日目の凝集体をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。分散後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコーティングした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに、１ウェルあたり２.０×１０５細胞となるように、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８を含む２００μＬの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。播種３日以降にＹ－２７６３２、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ８を含まない無血清培地（ＮｕｃＴ０）培地で３～４日に１回、培地交換を行った。
　凝集体の再形成のための培養３日、６日、９日、１２日、２２日、４０日後（ｄｄ３０、ｄｄ３３、ｄｄ３６、ｄｄ３９、ｄｄ４９、ｄｄ６７）に得られた細胞シートを、４％ＰＦＡで固定後、蛍光実体顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にシート化を観察したところ、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜細胞が増殖し、厚みの持ったシートが形成されてきていることが観察された（図６３）。特に２２日から４０日後には全面がＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞に覆われた厚い細胞シートが確認された
　これらの結果から、２２日から４０日後に移植やアッセイ等に用いられる再組織化網膜シートが得られることが観察された。
＜参考例１－２２　ＲＰＣ表面抗原スクリーニング～ｈＥＳ細胞とＮＲの比較～＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　上記細胞を用いて、参考例１－１に記載のように分化誘導のための浮遊培養を開始した。なお、分化誘導開始時にＳＡＧ　３００ｎＭを添加した。浮遊培養開始後１９及び２６日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、表面抗原スクリーニングキット　ＭＡＣＳ（登録商標） Ｍａｒｋｅｒ　Ｓｃｒｅｅｎ,　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、表面抗原スクリーニングを実施した（Ａｌｅｘａ　６４７で蛍光色素Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体群）。ＣｏｎｔｒｏｌとしてヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）を染色した。なお、スクリーニングに使用したマーカーは全部で３７１個であった（図６４～６９）。
　ＦＡＣＳ解析はＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。図６５に示すＦＳＣ及びＳＳＣで示される集団でゲーティングを行い解析した。まず、ｈＥＳＣで発現され、分化すると発現が消失されるＥ－ＣａｄｈｅｒｉｎやＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－５で染色及び解析が正確に行われていることを確認した（図６６）。その後の解析結果を図６４に纏める。なお、「ｈＥＳＣ：高い」はヒトＥＳ細胞での発現レベルが高い又は発現があることを意味し、「ｈＥＳＣ：低い」はヒトＥＳ細胞での発現レベルが低い又は発現がないことを意味し、「ＮＲ：高い」は神経網膜細胞での発現レベルが高いことを意味し、「ＮＲ：低い」は神経網膜細胞での発現レベルが低い又は発現がないことを意味する。
　ｈＥＳＣでは発現が無く（又は発現がある）、浮遊培養開始後１９日目又は２６日目でＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の集団が発現している（又は発現していない）表面抗原を探索したところ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＸＣＲ４、さらにはＣＤ２９、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５７、ＣＤ８２、ＣＤ９０、ＣＤ２００が、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞とその他の細胞（Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性細胞、ｈＥＳＣ）とを区別できるマーカーである可能性が示唆された（図６７）。
　さらにＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ３９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ７３－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ4）－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、浮遊培養開始後ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ５３、ｄｄ８１（図６８中、ｄ１８、ｄ２５、ｄ５３、ｄ８１）におけるＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１８４(ＣＸＣＲ４)の発現を、ＦＡＣＳ解析した（図６８）。
　その結果、ＣＤ３９及びＣＤ７３は、ｄｄ２５で最も発現している細胞の割合が高く、ＣＤ１８４に関しては、ｄｄ１８及びｄｄ２５で発現が低い細胞の割合が高いことがわかった。
　よって、神経網膜前駆細胞を純化するために表面抗原ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１８４を用いる場合は、浮遊培養開始後１８日目以降、２５日目付近が良いことがわかった（図６８）。
＜参考例１－２３　でのＣＤ３９及びＣＤ７３、ＣＸＣＲ４の発現解析＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　浮遊培養開始時（分化誘導開始時）にＳＡＧ　３００ｎＭを添加し、浮遊培養開始後の３日目にＢＭＰ４を添加せず、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄを作製した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＢＭＰ４を添加する群をおいた。このようにして作製された浮遊培養開始後２６日目のＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄに関して、蛍光顕微鏡観察を行った（図７０）。その結果、ＢＭＰ４を添加した群ではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の網膜組織が分化していることが観察された一方、ＢＭＰ４を添加していない群ではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陰性の神経上皮細胞が分化していることが観察された。さらに、これらの凝集体を４％ＰＦＡで固定し、切片を作製し、ＤＡＰＩ及び抗ＦｏｘＧ１抗体（ＴａＫａＲａ社）で染色し、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製ＢＺ－Ｘ８１０）で観察を行った。その結果、ＢＭＰ４を添加した群ではＦｏｘＧ１は陰性である一方、ＢＭＰ４を添加していない群ではＦｏｘＧ１陽性が確認され、Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄが分化されていることを確認された（図７１）。
　このようにして作製された浮遊培養開始後２５日目のＢｒａｉｎ　ＯｒｇａｎｏｉｄをＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、抗ＣＤ３９－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ７３－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、及び抗ＣＸＣＲ４－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて染色し、ＦＡＣＳ測定はＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて発現細胞集団の割合を測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。
　その結果、ＣＤ３９及びＣＤ７３はＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄで発現しておらず、一方でＣＸＣＲ４はＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄの大部分の細胞で発現していることが観察された（図７２）。
　よって、ＣＤ３９陽性、ＣＤ７３陽性、及びＣＸＣＲ４陰性の細胞集団を指標にすることでＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄと区別して、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の集団を分取できることが確認された
＜参考例１－２４　ＣＤ３９発現解析＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　分化誘導開始時にＳＡＧを（１）０ｎＭ、（２）３０ｎＭ、（３）３００ｎＭを添加して作製された浮遊培養開始後２６日目の凝集体（ＮＲ）の形態を顕微鏡で観察した。その結果、浮遊培養開始時（ｄｄ０）にＳＡＧ　３００ｎＭ添加した場合に比べ、ＳＡＧ　０ｎＭ及びＳＡＧ　３０ｎＭを添加した場合には、凝集体がより大きく、また、層構造もよりはっきりわかることが確認された（図７３）。
　さらに、上記凝集体に関して、神経細胞分散液を用いて単一細胞に分散し、抗ＣＤ３９－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）及び抗ＣＸＣＲ４－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）用いて、ＣＤ３９及びＣＸＣＲ４の発現についてＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて発現細胞集団の割合を測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。また、これら凝集体を４％ＰＦＡ固定し、切片を作製後、抗ＡＬＤＨ１Ａ１抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）、抗ＣｏｕｐＴＦ１抗体（ＰＰＭＸ社）、抗ＬＨＸ２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、抗Ｃｈｘ１０抗体（ＥｘＡｌｐｈａ社製）、抗Ｐａｘ２抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ社製）、抗ＮＫＸ２．１抗体（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて染色を行った。
　その結果、浮遊培養開始時（ｄｄ０）にＳＡＧ　３００ｎＭ添加した凝集体ではＣＤ３９の発現があり、ＣＸＣＲ４の発現が低いことが観察された（図７４）。また、ｄｄ０におけるＳＡＧの添加により、背側マーカーであるＡＬＤＨ１Ａ１の発現の低下、及び、腹側マーカーであるＣｏｕｐＴＦ１の発現の上昇が認められた（図７５、図７６）。また、ＳＡＧの刺激を加えない方が、細胞凝集体におけるＲｘの発現度が均一であることが判明した（図７７）。しかしながら、ＬＨＸ２及び、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ２に関して３００ｎＭ添加した凝集体でＲｘの発現が低い領域においても発現が確認され、ＮＫＸ２．１は陰性であったことから、神経網膜組織であることは確認されている（図７８、図７９）。
　よって、分化誘導開始時にＳＡＧを３００ｎＭ添加することで、ＣＤ３９陽性かつＣＸＣＲ４陰性の神経網膜前駆細胞の集団を得ることができることがわかった。
＜参考例１－２５　ＣＤ３９発現増強検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　分化誘導開始時（ｄｄ０）にＳＡＧ　３００ｎＭを添加し作製された凝集体（ＮＲ）に対して、浮遊培養開始後１７日目に１０個の神経網膜組織を低接着浮遊培養用シャーレ６０ｍｍＤｉｓｈ（住友ベークライト社製）に移し、４ｍＬのＮｕｃＴ０培地中に１ｍＭ、０．２ｍＭ　Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（Ａ２Ａ受容体Ａｇｏｎｉｓｔ、Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．０４ｍＭ　ＡＭＰ－ＰＮＰ（Ｔｏｃｒｉｓ社製）、５ｍＭ、１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．０４ｍＭ　ＡＴＰ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ｔｏｃｒｉｓ社製）、及び１μＭ、０．２μＭ、０．０４μＭ　ＣＧＳ　２１６８０（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　Ａ２Ａ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｇｏｎｉｓｔ、Ｔｏｃｒｉｓ社製）を添加して浮遊培養開始後２５日目まで培養し、ＣＤ３９及びＣＸＣＲ４の発現変化をＭｏｕｓｅ　ＩｇＧ１－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、抗ＣＤ３９－ＢＶ４２１　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び抗ＣＸＣＲ４－ＡＰＣ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。なお、ＣｏｎｔｒｏｌとしてＤＭＳＯ添加群を置いた。
　その結果、ＡＴＰ及びＡ２Ａ受容体ＡｇｏｎｉｓｔがＣＤ３９の発現を増強させ、ＣＸＣＲ４の発現を減少させる効果があることがわかった（図８０、図８１）。
　よって、ＣＤ３９の発現をＡＴＰ及びＡ２Ａ受容体Ａｇｏｎｉｓｔを添加することで増強できることがわかった。
＜参考例１－２６　ＣＤ３９でＳｏｒｔｉｎｇし、ＦＧＦ８添加により作製したＩｓｌｅｔ－１　ＫＯ　ｈＥＳＣ－網膜シートの移植＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変し、かつＩｓｌｅｔ－１遺伝子をＫＯしたヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」及びＷＯ２０１８／０９７２５３に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　浮遊培養開始（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ３００ｎＭで分化させた凝集体に対して、浮遊培養開始２５日目の凝集体（ＮＲ）を単一細胞に分散し、抗ＣＤ３９－ＡＰＣＣｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて３７℃で１５分間染色した後、Ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ社）を用いてＣＤ３９－ＡＰＣを指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ後の細胞をＣｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌコートした１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり８．０×１０５細胞播種した。播種時にＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）及びＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、５０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８（Ｗａｋｏ社）を添加した。また、Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＦＧＦ８を添加していない群（ＦＧＦ８－）もおいた。
　３～４日に一回培地交換を実施した。なお、培地交換時にＦＧＦ８も添加した。浮遊培養開始後７３日目に顕微鏡で観察したところ、ＦＧＦ８を添加していない群では、Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ細胞集団がまばらに観察されるのに対して、ＦＧＦ８を添加した群においては、均一に存在していることが観察された（図８２）。
　このようにして作製されたシートを浮遊培養開始後８８日目にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅを用いてシートを回収後、マイクロシザースを用いて移植用グラフトを長く切り出し（図８２）、免疫不全網膜不全ラット（ＳＤ　Ｆｏｘｎ）の網膜下への移植を実施した。
　よって、ＣＤ３９でＳｏｒｔｉｎｇした細胞から製造した網膜シートは移植可能であることが確認された。
＜参考例１－２７　ＲＰＣ表面抗原スクリーニング～Ｂｒａｉｎ　ＯｒｇａｎｏｉｄとＮＲの比較～＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加し作製された浮遊培養開始後２４～２６日目の凝集体（ＮＲ）に関して、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）を用いて単一細胞に分散し、表面抗原スクリーニングキットＭＡＣＳ（登録商標）　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓｃｒｅｅｎ,　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて染色し、表面抗原スクリーニングを実施した（Ａｌｅｘａ　６４７で蛍光色素Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体群）。Ｃｏｎｔｒｏｌとして分化誘導開始後３日目にＢＭＰ４を添加せずに作製したＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄを染色した。
　ＦＡＣＳ解析はＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。Ｂｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄでは発現が無く（又は発現がある）、浮遊培養開始後２４～２６日目でＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の集団が発現している（又は発現していない）表面抗原を探索したところ、ＣＤ９、ＣＤ１５、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ８２、ＣＤ１６４、ＥｐＣＡＭ、ＥｒｂＢ２（ＣＤ３４０）においてＢｒａｉｎ　Ｏｒｇａｎｏｉｄと区別できる可能性が示された（図８３）。
　また、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞と陰性細胞を区別するマーカーとして、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、ＥｐＣＡＭが有用である可能性が示された（図８４）。
＜参考例１－２８　ＣＤ９の発現経時変化確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　ｈＥＳＣ及び、浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加して作製されたｄｄ４、ｄｄ１１、ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ３２、ｄｄ４６の凝集体（ＮＲ）を神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）で単一細胞に分散し、ＡＰＣがＣｏｎｊｕｇａｔｅされた抗ＣＤ９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で染色し、抗体を洗浄した後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳ解析はＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。
　その結果、ＣＤ９はｈＥＳＣでは発現しているものの、分化開始Ｄａｙ４では一度発現が落ち、Ｄａｙ１１（図８５中ｄ１１）頃から発現し始め、ｄｄ１８（図８５中ｄ１８）からｄｄ２５（図８５中ｄ２５）、ｄｄ３２（図８５中ｄ３２）頃で陽性細胞率が高まることが分かった。純化する時期として、ｄｄ１１以降であることがよく、より好ましくはｄｄ１８からｄｄ３２以降で純化するとよいことが確認された（図８５）。
＜参考例１－２９　ＳＳＥＡ１を指標とした目的外細胞の除去検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加して作製された２５日目の凝集体（ＮＲ）を神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）で単一細胞に分散し、ＡＰＣがＣｏｎｊｕｇａｔｅされた抗ＣＤ９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）に加えて、ＢＶ４２１をＣｏｎｊｕｇａｔｅした抗ＳＳＥＡ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。
　その結果、凝集体全体ではＲｘ陽性細胞は約８７％であるが、ＣＤ９陽性細胞をゲーティングしたところ、Ｒｘ陽性細胞は９４％まで向上することがわかった。さらにＣＤ９陽性でかつＳＳＥＡ１陰性の細胞をゲーティングしたところ、Ｒｘ陽性細胞は約９６％まで向上することがわかった（図８６）。
よって、ＣＤ９に加えて、ＳＳＥＡ１を組み合わせることで、より網膜系の細胞を純化できることがわかった
＜参考例１－３０　ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ１の組み合わせ検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加して作製された２５日目の凝集体（ＮＲ）２００個を神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）で単一細胞に分散し、７等分に細胞を分け、次の７条件で表面抗原を４℃で１時間染色した。（１）非染色（Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標に純化）、（２）抗ＣＤ９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、（３）抗ＣＤ９０－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢＤ社）、（４）抗ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、（５）抗ＣＤ９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗ＳＳＥＡ１－ＢＶ４２１－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、（６）抗ＣＤ９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗ＣＤ９０－ＢＶ４２１－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、並びに、（７）抗ＣＤ９０－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢＤ社）及び抗ＳＳＥＡ１－ＢＶ４２１－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を用いて染色した。染色後、ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ社）を用いて、図８７に示す枠を指標にＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇにより回収した細胞を、ＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてＦＡＣＳ解析を行い、目的の細胞画分で純化できていることを確認した（図８７）。純化後の細胞の集団におけるＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性細胞の割合を測定したところ、Ｓｏｒｔｉｎｇ前と比較し、（１）Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性画分でＳｏｒｔｉｎｇしたサンプルで最も純度は高かったが、ＣＤ９陽性でかつＳＳＥＡ－１陰性の画分で純化したサンプルではＲｘ：：Ｖｅｎｕｓで純化したものと遜色なく、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性率が高かった（図８８、図８９）。
　これらのＳｏｒｔｉｎｇ後の細胞をＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８コートした２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり２．０×１０５細胞播種した。播種時に１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｗａｋｏ社）、３００ｎＭ　ＳＡＧ（Ｅｎｚｏ社）、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社）、及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８（Ｗａｋｏ社）を添加した。播種後、３～４日に一回培地交換を実施した。
　再シート化培養開始後１日目及び１２日目に蛍光顕微鏡で明視野及び蛍光観察をしたところ、播種後１日目ではいずれの純化後の細胞でもＴｒａｎｓｗｅｌｌのメッシュ上に細胞が生着していることが観察された（図９０）。さらに１２日後の観察では、Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性で純化したサンプルでは黒いＲＰＥがいくつか観察されたのに対し、ＣＤ９陽性、及びＣＤ９陽性／ＳＳＥＡ１陰性（ＣＤ９／ＳＳＥＡ１）の集団、ＣＤ９陽性／ＣＤ９０陽性（ＣＤ９／ＣＤ９０）の集団のＣＤ９で純化しているシートにおいて、黒いＲＰＥは観察されなかった（図９１）。
　よって、ＣＤ９及びＣＤ９とＳＳＥＡ１陰性又はＣＤ９０陽性の画分でＳｏｒｔｉｎｇした網膜シートはＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性でＳｏｒｔｉｎｇするよりもＲＰＥ画分を除去でき、より良好であることが確認された。
＜参考例１－３１　ＣＤ９及びＳＳＥＡ１の発現の経時変化確認＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　ｈＥＳＣ及び、浮遊培養開始時（分化誘導開始時、ｄｄ０）にＳＡＧ　３０ｎＭを添加して作製されたｄｄ４、ｄｄ１１、ｄｄ１８、ｄｄ２５、ｄｄ３２、ｄｄ４６の凝集体（ＮＲ）を神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社）で単一細胞に分散し、抗ＣＤ９－ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及び抗ＳＳＥＡ１－ＢＶ４２１－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で染色しＦＡＣＳ解析を行った。ＦＡＣＳＣａｎｔｏII（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析を行った。
　その結果、ｈＥＳＣにおいて、ＣＤ９は陽性でかつＳＳＥＡ１は陰性であるが、分化開始後４日目になると、ＣＤ９は陰性でかつＳＳＥＡ１は陽性となる（図９２）。さらに分化１１日目からＣＤ９陽性でかつＳＳＥＡ１陰性の集団が現れ始め、Ｄａｙ１８、Ｄａｙ２５と目的の集団の割合が増殖することがわかった。Ｄａｙ３２やＤａｙ４６においても発現し続けていることも測定された。
　よって、純化する時期として、ｄｄ１１（図９２中ｄ１１）以降であることがよく、ｄｄ１８（図９２中ｄ１８）から、ｄｄ３２（図９２中ｄ３２）以降で純化するとよいことが確認された（図９２）。
　このようにしてＣＤ９及びＳＳＥＡ１を指標にＳｏｔｉｎｇして１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８を添加して、作製された１２ウェルトランズウェル上の網膜シートを浮遊培養開始後４８及び６２日目にメスやハサミを用いてシートを回収後、マイクロシザースを用いて移植用グラフトを長く切り出し、免疫不全網膜不全ラット（ＳＤ　Ｆｏｘｎ）の網膜下への移植を実施した（図無）。
　よって、ＣＤ９及びＳＳＥＡ１でＳｏｒｔｉｎｇした細胞を用いて製造した網膜シートは移植可能であることが確認された。
＜参考例１－３２　ゼラチンを用いたＲＰＥ－網膜組織複合化検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後１８～３０日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり４．０～８．０×１０５細胞播種した。播種時、ＮｕｃＴ０培地にＹ－２７６３２及びＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した。その後、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を含まないＮｕｃＴ０培地で３～４日に一回培地交換を実施し、１カ月以上培養を行った。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後８０日以降のＲＰＥも同時に分化された凝集体をＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコートしたディッシュにＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）及びＦ１２　Ｈａｍ（ＳＩＧＭＡ社）培地にＢ２７（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌ　Ｇｌｕｔａｍｉｎ，１０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、ＳＢ４３１５４２を添加した培地に播種し、培養した。ＲＰＥが接着後、増殖し広がってきたら、ＲＰＥのみを１ｍＬのチップを用いて削り取り、別のＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコートしたディッシュに播種し、純化を行った。その後、拡大培養した後、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８でコートした１２ウェルＴｒａｎｓＷｅｌｌに１．０×１０６細胞のＲＰＥを播種し、３～４日に１回培地交換を実施し、１カ月以上培養を行った。
　上記のようにして培養されたＲＰＥシートとシート状網膜組織の接着作業をＢｅＭａｔｒｉｘ　ＬＳ－Ｗゼラチン（新田ゼラチン社）を用いて行った。具体的な操作としては、ピンセットやハサミを用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌからそれぞれのシートを回収し、１０％（ｗ／ｖ）のゼラチンでシート状網膜組織、ＲＰＥシートをなじませた後、２０％ゼラチンでなじませ、最終的に３０％のゼラチンを添加し、シート状網膜組織とＲＰＥシートを接着させる。接着後４℃に急冷し、２０分間インキュベートすることで固め、回収することでシート状網膜組織とＲＰＥシートを接着させた複合シートを作製した（図９３～図９８）。
　このようにして作製された網膜組織－ＲＰＥ複合シートをピンセットとハサミを用いて、切り出しを行った。まず、複合シートを半割した後、切り出した面に沿うように細長く切り出した（図９９）。その結果、両シートがゼラチンを介して接着した状態で切り出すことができた。この切り出した複合シートの断面を観察したところ、片方に黒い色素を持ったＲＰＥが、反対側にＲｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性のシート状網膜組織が確認され、その間にゼラチンが詰まっていることが観察された（図１００）。この切り出した複合シートが移植の作業である、吸引、吐出の動作によって、剥がれたりしないか、先端を切り落とした１ｍＬのチップを用いて、吸引・吐出の作業を行った。その結果、複合シートは分離することなく、何度も吸引・吐出することができた（図１０１）。
　よって、シート状網膜組織とＲＰＥシート、及びゼラチンを用いることによって、移植可能な、網膜組織－ＲＰＥ複合シートを作製することができることがわかった。
＜参考例１－３３　フィブリンを用いたＲＰＥ－網膜組織複合化検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後１８～３０日目の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌに１ウェルあたり４．０～８．０×１０５細胞播種した。播種時、ＮｕｃＴ０培地にＹ－２７６３２及びＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した。その後、Ｙ－２７６３２及びＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を含まないＮｕｃＴ０培地で３～４日に一回培地交換を実施し、１カ月以上培養を行った（図１０２）。
　参考例１－１で作製された浮遊培養開始後８０日以降のＲＰＥも同時に分化された凝集体をｉＭａｔｒｉｘ５１１でコートしたディッシュにＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社）及びＦ１２　Ｈａｍ（ＳＩＧＭＡ社）培地にＢ２７（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｌ　Ｇｌｕｔａｍｉｎ，１０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２、ＳＢ４３１５４２を添加した培地に播種し、培養した。ＲＰＥが接着後、増殖し広がってきたら、ＲＰＥのみをチップを用いて削り取り、別のｉＭａｔｒｉｘ５１１でコートしたディッシュに播種し、純化を行った。その後、拡大培養した後、ｉＭａｔｒｉｘ５１１でコートした１２ウェルＴｒａｎｓＷｅｌｌ　１．０×１０６細胞のＲＰＥを播種し、３～４日に一回培地交換を実施し、１カ月以上培養を行った（図１０２）。
　上記のようにして培養されたシート状網膜組織とＲＰＥシートの接着作業をボルヒール組織接着用（帝人ファーマ社）を用いて行った。具体的な操作としては、ピンセットやハサミを用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌからそれぞれのシートを回収し、シート状網膜組織にＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎを１００μＬ、ＲＰＥシートにＴｈｏｒｏｍｂｉｎを１００μＬ添加し、なじませた後、除去した（図１０３～１０４）。再度、シート状網膜組織にＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎを１００μＬ、ＲＰＥシートにＴｈｏｒｏｍｂｉｎを１００μＬ添加した（図１０４）。ＲＰＥシートを培養皿の上にＡｐｉｃａｌ側が上側に、メッシュ側を培養皿側に置き、シート状網膜組織をＡｐｉｃａｌ面がＲＰＥ側にむくように上から乗せた（図１０５）。接着後室温で５分間インキュベートすることで固め、回収することで接着させたシートを作製した（図１０６～１０７）。このようにして作製された網膜組織－ＲＰＥ複合シートをピンセットを用いて裏返し、下側にシート状網膜組織、上側に網膜色素上皮シートが向くように置き、観察した（図１０８）。また、接着させていたトランズウェルのメッシュをはいた（図１０９）。
　よって、シート状網膜組織とＲＰＥシート、及びフィブリンを用いることによって、網膜組織－ＲＰＥ複合シートを作製することができることがわかった。
＜参考例１－３４　セルシフターを用いた２つのシート間の不要なゼラチンの除去の検討＞
　参考例１－３２で検討した複合化したシートでは、二つのシートの間に多くのゼラチンが含まれて厚くなることがわかった。そこで、複合化工程時に、二つのシートの間の不要なゼラチンを押し出して除去できるように、ゼラチンが逃げる通り道を作った複合化デバイスの検討を行った。
　スライドガラス上に、シリコンシートを用いて、通り道が２つ、４つ、５つでかつ堤防状にしたものを作成し、ゼラチンを間に添加した２枚のセルシフター（Ｃｅｌｌ　Ｓｅｅｄ社）を用いて、上から押し出して、ゼラチンが流れ出るか観察した。
　その結果、流路を５つにし、堤防状にシリコンシートをのせたデバイスで最も余分なゼラチンが流れ出ることがわかった（図１１０）。
＜参考例１－３５　温度感受性培養皿上で平面化シートを作製し、剥離・移植検討＞
　Ｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１株、（非特許文献３））を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ４，３５９４　（２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。
　参考例１－１で作製されたＤａｙ１８～３０日の凝集体（ＮＲ）をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散し、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８コーティングした２４ウェルの７段階の剥離度の異なる温度感受性培養皿（Ｃｅｌｌ　ｓｅｅｄ社）に８．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種した。３～４日に一回培地交換を実施し、播種後３０日以降でシートが厚みをもって形成された後、室温に下げて、２時間インキュベートし、観察した。その結果、７段階の剥離度の温度感受性培養皿のうち、２ｂ、２ｃ、３、４と複数のウェルにおいて、網膜シートが室温にすることで剥離できることが観察された（図１１１）。
　よって、温度感受性培養皿で培養することで、網膜シートを回収できることがわかった。
　このようにしてＲｘ：：Ｖｅｎｕｓを指標にＳｏｔｉｎｇして１０μＭ　Ｙ－２７６３２、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、３００ｎＭ　ＳＡＧ及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ８を添加して、作製された温度感受性培養皿上の網膜シートを浮遊培養開始後６２日目に４℃で１時間インキュベートして回収後、マイクロシザースを用いて移植用グラフトを長く切り出し、免疫不全網膜不全ラット（ＳＤ　Ｆｏｘｎ）の網膜下への移植を実施した（図無）。
　よって、温度感受性培養皿上で培養した網膜シートは移植可能であることが確認された。
＜参考例２－１　パターニング培養による網膜組織の製法検討の条件＞
　網膜前駆細胞を含む細胞凝集体（接着細胞凝集体）の製造方法として、パターニング培養による分化法が知られている（ＷＯ２０２３／００３０２５）。パターニング培養に着目し、未分化ヒトｉＰＳ細胞から網膜組織を作製する製法の比較検討を行った。
　ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株およびＤＳＰ－ＳＱ株、住友ファーマ株式会社にて樹立）は、市販されているセンダイウイルスベクター（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子、ＩＤＰｈａｒｍａ社製サイトチューンキット）を用いて、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の公開プロトコル（ｉＰＳ２．０　Ｓｅｎｄａｉ　Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　Ｋｉｔ，　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＭＡＮ０００９３７８，　Ｒｅｖｉｓｉｏｎ　１．０）、および京都大学の公開プロトコル（フィーダーフリーでのヒトｉＰＳ細胞の樹立・維持培養、ＣｉＲＡ＿Ｆｆ－ｉＰＳＣ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ＪＰ＿ｖ１４０３１０，　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｒａ．ｋｙｏｔｏ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｊ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ）記載の方法を基に、ＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０３、味の素社製）およびＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（ニッピ社製）を用いて樹立した。
　当該ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株およびＤＳＰ－ＳＱ株）を、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　４，　３５９４　（２０１４）に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダーフリー足場にはＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（ニッピ社製）を用いた。
　具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフレントになったヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株およびＤＳＰ－ＳＱ株）を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。前記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ２）を用いた場合、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞の播種細胞数は１．０×１０４とした。播種した１日後に、Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１日～２日に一回Ｙ－２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて培地交換した。その後、播種した６日後まで培養した。
　パターニングの手順としては、まず１２ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積３．８ｃｍ２）のウェル中心部に、０．７８５μｌのＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（ニッピ社製）を１００μｌのＰＢＳに加えた溶液（Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８濃度３．９２５ｎｇ／μｌ）の液滴（直径１ｃｍ）を作り、その後、１時間以上３時間以下、３７℃または室温でインキュベートすることによって、パターニング培養用１２ウェルプレートを作製した（Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８：０．５μｇ／ｃｍ２）。
　次に、サブコンフレントになったヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）をＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、０．５×１０５～５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の様々な細胞密度でパターニング培養用培養プレートの１ウェルに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、Ｓｔｅｍｆｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した（図１１２）。
　その後、２～３２時間の様々な時間に区切ってＹ－２７６３２を作用させた後、Ｙ－２７６３２を含まない２　ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＲＯＣＫ阻害剤、０　μＭ）に交換した（図１１４）。
　パターニング培養用プレートにｉＰＳ細胞を播種した２日後に、培地を２　ｍｌの無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）に交換した。その５日後に、培地をヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）を含むｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲに交換した。外来性のヒト組み換えＢＭＰ４の終濃度０～１２ｎＭの複数の濃度を比較した（図１１６、１１７）。
　その後、２～３日に１回、ヒト組み換えＢＭＰ４を含まない無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）にて半量培地交換した。半量培地交換操作としては、培養器中の培地を体積の半分量即ち１ｍｌを廃棄し、新しい無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）を１ｍｌ加え、培地量は合計２ｍｌとした。
　パターニング培養１７日目以降の細胞は、コントロール成熟培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、１０％牛胎児血清、１％Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、及び１００μＭタウリンが添加された培地）を使用し、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　パターニング培養２０日目に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、網膜前駆細胞マーカーであるＣｈｘ１０（抗Ｃｈｘ１０抗体、Ｅｘａｌｐｈａ社）およびＲｘ（抗Ｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）について免疫染色を行い、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて観察した。詳細な分化法の最適化検討の結果を参考例２－２～４で示した。
＜参考例２－２　パターニング培養におけるヒトｉＰＳ細胞の播種密度検討＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）を、パターニング培養用プレートへ種々の細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）で播種し、最適な条件を検討した。
　まず、参考例２－１記載の方法で作製したパターニング培養用１２ウェルプレートを準備し、サブコンフレントになったヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）をＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、０．５×１０５、１．０×１０５、２．５×１０５、または５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でパターニング培養用培養プレートの１ウェルに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、Ｓｔｅｍｆｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。その後、２時間後に、Ｙ－２７６３２を含まない２ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。
　ヒトｉＰＳ細胞をパターニング培養用プレートに播種後、１時間、１日、２日、または３日目の細胞を明視野顕微鏡にて観察した結果を図１１２に示した。図１１２の画像を解析した結果、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度では細胞接着性領域に対してヒトｉＰＳ細胞が不均一に接着する一方、０．５×１０５～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度では満遍なく接着することがわかった。
　その後、参考例２－１記載の方法でパターニング培養を行い、播種２０日目の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、網膜前駆細胞マーカーであるＣｈｘ１０（抗Ｃｈｘ１０抗体、Ｅｘａｌｐｈａ社）について免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞を蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）にて観察し、その結果を図１１３に示した。図１１３の画像を解析した結果、１．０×１０５および２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種条件では均一にＣｈｘ１０陽性細胞が存在する網膜組織が製造できていた。一方、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種条件では細胞シート表面にＣｈｘ１０陽性細胞が欠落した穴や空隙が生じてしまい、均一に分化した網膜組織の形成効率が良くないことがわかった。
　これら結果から、パターニング培養法で網膜組織を作る製法として、未分化ヒトｉＰＳ細胞の播種細胞濃度は好ましくは１．０×１０５～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２であることがわかった。
＜参考例２－３　パターニング培養における細胞播種時のＲＯＣＫ阻害剤作用時間の検討＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株およびＤＳＰ－ＳＱ株）をパターニング培養用プレートへ播種する際の最適なＹ－２７６３２作用時間を検討した。
　まず、参考例２－１記載の方法で作製したパターニング培養用１２ウェルプレートを準備し、サブコンフレントになったヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株およびＤＳＰ－ＳＱ株）をＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でパターニング培養用培養プレートの１ウェルに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、Ｓｔｅｍｆｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。その後、２、４、８、１６、または３２時間後に、Ｙ－２７６３２を含まない２ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。全条件で、ヒトｉＰＳ細胞は生存し、培養を継続することができたことから、細胞接着性領域に対して、ヒトｉＰＳ細胞がコンフルエントに近い状態で接着していれば、Ｙ－２７６３２を短時間で除去しても問題ないことがわかった。
　その後、参考例２－１記載の方法でパターニング培養を行い、播種２０日目の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、明視野像を蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）で撮像した。ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）を用いた結果を図１１４に示した。この結果から、Ｙ－２７６３２の作用時間が長くなるほど、細胞シート表面に穴が多く生じてしまい、均一に分化した網膜組織の形成効率が良くないことがわかった。網膜前駆細胞マーカーであるＣｈｘ１０（抗Ｃｈｘ１０抗体、Ｅｘａｌｐｈａ社）で免疫染色を行い、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用いて観察したところ、シート表面の穴部分には網膜前駆細胞が存在しないことがわかった。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いてシート表面におけるＣｈｘ１０陽性領域の割合を算出したところ、Ｙ－２７６３２を３２時間作用させたシートでは９１％であるのに対して、１６時間以下の作用時間では９７％以上であった（１６時間：９７％、８時間：９９％、４時間：９８％、２時間：９９％）。さらに、Ｙ－２７６３２の各作用時間におけるＣｈｘ１０陰性の穴の数をカウントしたところ、Ｙ－２７６３２の作用時間を１６時間以内にすることで、シート表面に形成される多数の穴を抑制できることがわかった。ヒトｉＰＳ細胞（ＤＳＰ－ＳＱ株）を用いた場合も同様に、Ｙ－２７６３２の作用時間を短くすることで、シート表面のＣｈｘ１０陰性領域を少なくできることがわかった（図１１５）。
　これらの結果から、パターニング培養法で網膜組織を作る製法として、未分化ヒトｉＰＳ細胞の播種時のＲＯＣＫ阻害剤の作用時間は好ましくは１～１６時間であることがわかった。
＜参考例２－４　パターニング培養の網膜分化におけるＢＭＰ作用薬添加濃度の検討＞
　次に、パターニング培養時、ヒトｉＰＳ細胞に作用させるＢＭＰ４の最適な濃度を検討した。
　まず、参考例２－１記載の方法で作製したパターニング培養用１２ウェルプレートを準備し、サブコンフレントになったヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）をＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でパターニング培養用培養プレートの１ウェルに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、Ｓｔｅｍｆｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。２時間後に、Ｙ－２７６３２を含まない２ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換し、参考例２－１記載の方法でパターニング培養を実施した。
　パターニング培養７日目に、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）を終濃度０、１．５、３、６、または１２　ｎＭとなるように調整した無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）に培地交換した。その後、２～３日に１回、ヒト組み換えＢＭＰ４を含まない無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）にて半量培地交換した。半量培地交換操作としては、培養器中の培地を体積の半分量即ち１ｍｌ廃棄し、新しい無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）を１ｍｌ加え、培地量は合計２ｍｌとした。
　パターニング培養２０日目の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、網膜前駆細胞マーカーであるＲｘ（抗Ｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）について免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞を蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）にて観察し、その結果を図１１６に示した。図１１６の画像を解析した結果、１．５ｎＭのＢＭＰ４濃度と比べて、３～１２ｎＭのＢＭＰ４濃度で網膜分化を誘導した網膜組織の方が、網膜前駆細胞マーカーであるＲｘが強く発現していることがわかった。
　次に、網膜組織から、スピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ）を用いてキット記載の方法によりｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度を測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて測定した後に、逆転写酵素およびプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｋｉｔ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）を用いてｃＤＮＡへと逆転写した。ｃＤＮＡと、検証に使用する全プローブを使用して、ＰＣＲ装置（Ｖｅｒｉｔｉ　９６ｗｅｌｌ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ－ＰＣＲ反応（Ｐｒｅ－Ｒｕｎ）を実施した。その後、Ｐｒｅ－Ｒｕｎ済みの反応液を、ＩＦＣコントローラ　ＨＸ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）を用いて流路付マルチウェル（９６．９６　Ｄｙｎａｍｉｃ　Ａｒｒａｙ　ＩＦＣ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）に注入し、多検体リアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏｍａｒｋ　ＨＤ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）を用いて神経網膜および神経網膜以外の副産物のマーカー遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。
　各遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量の解析結果を図１１７に示した。具体的には、目的遺伝子のＣｔ値と内部標準として用いた遺伝子であるＧＡＰＤＨのＣｔ値の差からΔＣｔ値を算出し、試料間のΔＣｔの差（ΔΔＣｔ）から各遺伝子発現の量比を計算した。その結果、免疫染色によるＲｘの発現と同様に、１．５ｎＭのＢＭＰ４濃度と比べて、３～１２ｎＭのＢＭＰ４濃度で網膜分化を誘導した網膜組織の方が、網膜前駆細胞マーカー遺伝子であるＣｈｘ１０とＲｘの発現量が高いことがわかった。また、３～１２ｎＭのＢＭＰ４濃度で網膜分化を誘導した網膜組織では、目的外細胞マーカー遺伝子であるＥｍｘ２の発現が低く抑えられていることも判明した。
　これらの結果から、パターニング培養法で網膜組織を作る製法として、網膜分化を誘導するＢＭＰ４の終濃度は好ましくは３～１５ｎＭであることがわかった。
＜参考例２－５　各種条件を最適化したパターニング培養＞
　ＷＯ２０２３／００３０２５の方法で分化した網膜組織と、参考例２－２～４の検討で各種条件を最適化した方法（最適化法）で分化した網膜組織の品質を、神経網膜および神経網膜以外の副産物のマーカー遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定することによって、比較した。
　まず、参考例２－１記載の方法で作製したパターニング培養用１２ウェルプレートを準備し、サブコンフレントになったヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）をＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。次に、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、従来法では５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、最適化法では２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でパターニング培養用培養プレートの１ウェルに播種し、Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、Ｓｔｅｍｆｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。その後、ＷＯ２０２３／００３０２５の方法では２４時間、最適化法では２時間が経過したタイミングで、Ｙ－２７６３２を含まない２ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換し、参考例２－１記載の方法でパターニング培養を続けた。
　パターニング培養７日目に、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）をＷＯ２０２３／００３０２５の方法では終濃度１．５ｎＭ、最適化法では終濃度６ｎＭとなるように調整した無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）に培地交換した。その後、２～３日に１回、ヒト組み換えＢＭＰ４を含まない無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）にて半量培地交換した。半量培地交換操作としては、培養器中の培地を体積の半分量即ち１ｍｌ廃棄し、新しい無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）を１ｍｌ加え、培地量は合計２ｍｌとした。
　パターニング培養２０日目に、網膜組織における神経網膜および神経網膜以外の副産物のマーカー遺伝子（表３）の発現量を、参考例２－４記載の方法で測定した。各遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量の解析結果を図１１８に示した。その結果、ＷＯ２０２３／００３０２５の方法で分化した網膜組織と比べて、各種条件を最適化した方法（最適化法）で分化した網膜組織の方が、神経前駆細胞および網膜前駆細胞マーカー遺伝子の発現量が高いことがわかった。また最適化法で分化し網膜組織では、各種目的外細胞マーカー遺伝子の発現が低く抑えられていることがわかった。

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例１　網膜前駆細胞シートを用いた再組織化オルガノイドの製造＞
　本願参考例１に記載しているように、ＳＦＥＢｑ法で作製した網膜前駆細胞を含む細胞凝集体を出発原料として、再組織化・再シート化できることがわかっている。また、ＷＯ２０２３／００３０２５および本願参考例２に記載しているように、網膜前駆細胞を含む細胞凝集体（接着細胞凝集体）の製造方法として、パターニング培養による分化法が利用可能であることがわかっている。パターニング培養で作製した細胞凝集体である網膜前駆細胞を含む網膜組織（本明細書において、網膜シートまたは網膜前駆細胞シートとも称する）は、ＳＦＥＢｑ法で作製した網膜前駆細胞を含む細胞凝集体と、細胞の組成に共通点はあるものの、細胞の培養状態は異なっている。そこで、パターニングで作製した網膜前駆細胞シートを原料に、再組織化・再シート化できるのかを検討した。
　まず、パターニング培養で得られた網膜前駆細胞シートを分散し、３次元培養下で再組織化を誘導することによって、再組織化オルガノイドを作製できるか検討した（図１１９）。
　ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株、住友ファーマ株式会社にて樹立）は、市販されているセンダイウイルスベクター（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子、ＩＤＰｈａｒｍａ社製サイトチューンキット）を用いて、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の公開プロトコル（ｉＰＳ２．０　Ｓｅｎｄａｉ　Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　Ｋｉｔ，　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　ＭＡＮ０００９３７８，　Ｒｅｖｉｓｉｏｎ　１．０）および京都大学の公開プロトコル（フィーダーフリーでのヒトｉＰＳ細胞の樹立・維持培養、ＣｉＲＡ＿Ｆｆ－ｉＰＳＣ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ＿ＪＰ＿ｖ１４０３１０，　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｉｒａ．ｋｙｏｔｏ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｊ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ）記載の方法を基に、ＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０３、味の素社製）およびＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（ニッピ社製）を用いて樹立した。
　当該ヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）を、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　４，　３５９４　（２０１４）に記載の方法に準じてフィーダーフリー培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダーフリー足場にはＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（ニッピ社製）を用いた。
　具体的な維持培養操作としては、まず、サブコンフレントになったヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。前記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ２）を用いた場合、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞の播種細胞数は１．０×１０４とした。播種した１日後に、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１日～２日に一回Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＲＯＣＫ阻害剤、０μＭ）にて培地交換し、播種後６日目まで培養した。
　パターニングの手順としては、まず１２ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積３．８ｃｍ２）のウェル中心部に、０．７８５μｌのＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（ニッピ社製）を１００μｌのＰＢＳに加えた溶液（Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８濃度　３．９２５ｎｇ／μｌ）の液滴（直径１ｃｍ）を作り、その後、１時間以上３時間以下、３７℃または室温でインキュベートすることによって、パターニング培養用１２ウェルプレートを作製した（Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８　０．５μｇ／ｃｍ２）。
　次に、サブコンフレントになったヒトｉＰＳ細胞（ＬＰＦ１１株）をＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度でパターニング培養用培養プレートの１ウェルに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、１０μＭ）存在下、Ｓｔｅｍｆｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。その後Ｙ２７６３２を２時間作用させた後、Ｙ２７６３２を含まない２ｍｌのＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＲＯＣＫ阻害剤、０μＭ）に交換した。
　パターニング培養用プレートにｉＰＳ細胞を播種した２日後に、培地を２ｍｌの無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）に交換した。その５日後に、培地を６ｎＭのヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ社製）を含むｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲに交換した。
　その後、２～３日に１回、ヒト組み換えＢＭＰ４を含まないｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲで半量培地交換した。半量培地交換操作としては、培養器中の培地を体積の半分量、即ち１ｍｌを廃棄し、新しいｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲを１ｍｌ加え、培地量は合計２ｍｌとした。
　パターニング培養１７日目以降は、コントロール成熟培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、１０％牛胎児血清、１％Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、及び１００μＭタウリンが添加された培地）を使用し、５％ＣＯ２条件下で培養することによって、網膜前駆細胞シートを作製した。
　次に、パターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を用いて単一細胞へ分散し、非細胞接着性の９６ウェルプレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）に、１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるようにコントロール成熟培地に浮遊させ３次元培養した。細胞播種の際、Ｙ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＳＡＧ（終濃度３００ｎＭ）およびＣＨＩＲ９９０２１（終濃度３μＭ）を同時に添加して、再組織化を促進した。
　その後、３～４日に１回、コントロール成熟培地で半量培地交換し、浮遊培養開始３日目、１３日目および２３日目の凝集体を明視野顕微鏡にて観察した。その結果、時間経過とともに再組織化オルガノイドの表面に層構造が形成され、サイズが増大していくことが確認できた（図１２０）。浮遊培養開始２３日目の再組織化オルガノイドは、４％パラホルムアルデヒドで固定し、網膜前駆細胞マーカーであるＣｈｘ１０（抗Ｃｈｘ１０抗体、Ｅｘａｌｐｈａ社）、Ｐａｘ６（抗Ｐａｘ６抗体、ＢＤバイオサイエンス社）、Ｒｘ（抗Ｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）、視細胞前駆細胞マーカーであるＣｒｘ（抗Ｃｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）、さらに頂端側の細胞極性マーカーであるＺＯ－１（抗ＺＯ－１抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ８８０、ＺＥＩＳＳ社製）にて観察した（図１２１）。その結果、再組織化オルガノイドの表面には、５～１０細胞程度の厚さのＣｈｘ１０、Ｐａｘ６およびＲｘ陽性の網膜前駆細胞層が形成されており、Ｃｒｘ陽性の視細胞前駆細胞が点在していることがわかった。さらに、外表面がＺＯ－１陽性であることから、この再組織化オルガノイドは極性を有し、頂端面（ａｐｉｃａｌ　ｓｕｒｆａｃｅ）が外側に形成された網膜組織であることがわかった。
　これらの結果から、パターニング培養で得られた網膜前駆細胞シートを出発原料として、再組織化網膜オルガノイドが作製できることを実証できた。
＜実施例２　網膜前駆細胞シートを用いた再組織化シートの製造＞
パターニング培養で得られた網膜前駆細胞シートを分散し、２次元培養下で再組織化を誘導することによって、再組織化シートを作製できるか検討した（図１２２）。
　まず、実施例１記載の方法で作製したパターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を用いて単一細胞へ分散し、予めＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（ニッピ社製）でコーティングを施した２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、１ウェル当たり０．５×１０５細胞となるようにコントロール成熟培地に播種し２次元培養した。細胞播種の際、Ｙ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＳＡＧ（終濃度３００ｎＭ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（終濃度３μＭ）を同時に添加して、再組織化を促進した。
　その後、３～４日に１回、コントロール成熟培地で半量培地交換し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌへ播種後３日目、１３日目および２３日目目の再組織化シートを明視野顕微鏡にて観察した。その結果、３日目で細胞がシート状に凝集しており、時間経過とともに高密度になっていくことが確認できた（図１２３）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌへ播種後２３日目の再組織化シートを４％パラホルムアルデヒドで固定し、網膜前駆細胞マーカーであるＣｈｘ１０（抗Ｃｈｘ１０抗体、Ｅｘａｌｐｈａ社）、Ｐａｘ６（抗Ｐａｘ６抗体、ＢＤバイオサイエンス社）、Ｒｘ（抗Ｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）、視細胞前駆細胞マーカーであるＣｒｘ（抗Ｃｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）、さらに頂端側の細胞極性マーカーであるＺＯ－１（抗ＺＯ－１抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ８８０、ＺＥＩＳＳ社製）にて観察した（図１２４）。その結果、再組織化シートは、再組織化オルガノイドと同様に、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６およびＲｘ陽性の網膜前駆細胞で形成されており、Ｃｒｘ陽性の視細胞前駆細胞が点在していることがわかった。さらに、シートの上側（ウェルメンブレンに接していない側）がＺＯ－１陽性であることから、この再組織化シートは極性を有し、頂端面（ａｐｉｃａｌ　ｓｕｒｆａｃｅ）が上側に形成された網膜組織であることがわかった。
　これらの結果から、パターニング培養で得られた網膜前駆細胞シートを出発原料として、再組織化網膜シートが作製できることを実証できた。
＜実施例３　網膜前駆細胞シートからソーティングした網膜前駆細胞を用いた再組織化オルガノイドの製造＞
　パターニング培養で得られた網膜前駆細胞シートからＣＤ９陽性網膜前駆細胞をソーティングし、３次元培養下で再組織化を誘導することによって、目的外細胞が少ない再組織化オルガノイドを作製できるか検討した（図１２５）。
　まず、実施例１記載の方法で作製したパターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を用いて単一細胞へ分散し、ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ＣＤ９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で表面抗原を４℃で１時間染色し、ＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてＳｏｒｔｉｎｇを実施した。Ｓｏｒｔｉｎｇ前後の細胞を、ＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　１０　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ＣＤ９陽性の細胞画分で純化できていることを確認した（図１２６）。
　純化した細胞は、非細胞接着性の９６ウェルプレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）に、１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるようにコントロール成熟培地に浮遊させ３次元培養した。細胞播種の際、Ｙ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＳＡＧ（終濃度３００ｎＭ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（終濃度３μＭ）を同時に添加して、再組織化を促進した。
　その後、３～４日に１回、コントロール成熟培地で半量培地交換し、浮遊培養開始２３日目目の凝集体を明視野顕微鏡にて観察し、表面に上皮の層構造が形成された再組織化オルガノイドができていることを確認した（図１２７）。次に、この再組織化オルガノイドを４％パラホルムアルデヒドで固定し、網膜前駆細胞マーカーであるＣｈｘ１０（抗Ｃｈｘ１０抗体、Ｅｘａｌｐｈａ社）、Ｐａｘ６（抗Ｐａｘ６抗体、ＢＤバイオサイエンス社）、Ｒｘ（抗Ｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）、視細胞前駆細胞マーカーであるＣｒｘ（抗Ｃｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）、さらに頂端側の細胞極性マーカーであるＺＯ－１（抗ＺＯ－１抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ８８０、ＺＥＩＳＳ社製）にて観察した（図１２７）。その結果、実施例１の条件で作製した再組織化オルガノイドと同様、網膜前駆細胞シートからソーティングしたＣＤ９陽性細胞で作製した再組織化オルガノイドも、５～１０細胞程度の厚さのＣｈｘ１０、Ｐａｘ６およびＲｘ陽性の網膜前駆細胞層が形成されており、Ｃｒｘ陽性の視細胞前駆細胞が点在していることがわかった。さらに、外表面がＺＯ－１陽性であることから、頂端面（ａｐｉｃａｌ　ｓｕｒｆａｃｅ）が外側に形成されていることがわかった。
　次に、網膜前駆細胞シートからソーティングしたＣＤ９陽性細胞で作製した再組織化オルガノイドにおいて、目的外細胞が除去されていることを確認するため、神経網膜マーカーであるＲｘ遺伝子および終脳背側マーカーであるＥｍｘ２の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。
　まず、ＣＤ９陽性細胞（ＣＤ９ソーティング）、または未分画細胞（ソーティングなし）から作製した再組織化オルガノイドから、スピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ）を用いてキット記載の方法によりｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度を測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて測定した後に、逆転写酵素およびプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｋｉｔ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）を用いてｃＤＮＡへと逆転写した。ｃＤＮＡと、検証に使用する全プローブを使用して、ＰＣＲ装置（Ｖｅｒｉｔｉ　９６ｗｅｌｌ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ－ＰＣＲ反応（Ｐｒｅ－Ｒｕｎ）を実施した。その後、Ｐｒｅ－Ｒｕｎ済みの反応液を、ＩＦＣコントローラ　ＨＸ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）を用いて流路付マルチウェル（９６．９６　Ｄｙｎａｍｉｃ　Ａｒｒａｙ　ＩＦＣ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）に注入し、多検体リアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏｍａｒｋ　ＨＤ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）を用いてＲｘ遺伝子およびＥｍｘ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。
　両遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量の解析結果を図１２８に示した。具体的には、目的遺伝子のＣｔ値と内部標準として用いた遺伝子であるＧＡＰＤＨのＣｔ値の差からΔＣｔ値を算出し、試料間のΔＣｔの差（ΔΔＣｔ）から各遺伝子発現の量比を計算した。その結果、ソーティングなしに比べ、ＣＤ９ソーティングの再組織化オルガノイドでは、網膜前駆細胞マーカーであるＲｘの発現量が多く、目的外細胞マーカー遺伝子であるＥｍｘ２の発現量が少ないことが分かった。以上の結果から、網膜前駆細胞シートからソーティングしたＣＤ９陽性細胞を用いることによって、目的外細胞が少ない再組織化オルガノイドが作製できることを確認できた。なお、表面抗原としてＣＤ９だけではなく、ＣＤ９０を用いた検討も行い、網膜前駆細胞シートで発現していることと、ソーティングできることを確認している。
　これらの結果から、パターニング培養で作製した網膜前駆細胞シートからソーティングした、網膜前駆細胞を出発原料として、再組織化網膜オルガノイドが作製できることが実証できた。
＜実施例４　網膜前駆細胞シートからソーティングした網膜前駆細胞を用いた再組織化シートの製造＞
　パターニング培養で得られた網膜前駆細胞シートからＣＤ９陽性網膜前駆細胞をソーティングし、２次元培養下で再組織化を誘導することによって、目的外細胞が少ない再組織化シートを作製できるか検討した。（図１２９）。
　まず、実施例１記載の方法で作製したパターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を用いて単一細胞へ分散し、ＡＰＣ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ＣＤ９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）で表面抗原を４℃で１時間染色し、ＭＡＣＳ　Ｑｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いてＳｏｒｔｉｎｇを実施した。回収した細胞を、予めＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（ニッピ社製）でコーティングを施した２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に、１ウェル当たり０．５×１０５細胞となるように播種した。細胞播種の際、Ｙ２７６３２（終濃度１０μＭ）、ＳＡＧ（終濃度３００ｎＭ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（終濃度３μＭ）を同時に添加して、再組織化を促進した。
　その後、３～４日に１回、コントロール成熟培地で半量培地交換を行い、維持培養をした。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌへ播種後２３日目目の細胞シートを明視野顕微鏡にて観察した結果、細胞がシート状に再組織化していることが確認できた（図１３０）。この再組織化シートを４％パラホルムアルデヒドで固定し、網膜前駆細胞マーカーであるＣｈｘ１０（抗Ｃｈｘ１０抗体、Ｅｘａｌｐｈａ社）、Ｐａｘ６（抗Ｐａｘ６抗体、ＢＤバイオサイエンス社）、Ｒｘ（抗Ｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）、視細胞前駆細胞マーカーであるＣｒｘ（抗Ｃｒｘ抗体、Ｔａｋａｒａ社）、さらに頂端側の細胞極性マーカーであるＺＯ－１（抗ＺＯ－１抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ８８０、ＺＥＩＳＳ社製）にて観察した（図１３０）。
　その結果、実施例２の条件で作製した再組織化シートと同様、網膜前駆細胞シートからソーティングしたＣＤ９陽性細胞で作製した再組織化シートも、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６およびＲｘ陽性の網膜前駆細胞で形成されており、Ｃｒｘ陽性の視細胞前駆細胞が点在していることがわかった。さらに、シートの上側（ウェルメンブレンに接していない側）がＺＯ－１陽性であることから、この再組織化オルガノイドは極性を有し、頂端面（ａｐｉｃａｌ　ｓｕｒｆａｃｅ）が外側に形成された網膜組織であることがわかった。
　これらの結果から、パターニング培養で作製した網膜前駆細胞シートからソーティングした、網膜前駆細胞を出発原料として、再組織化網膜シートが作製できることが実証できた。
＜実施例５　再組織化する際に必要なＣＨＩＲの最適濃度の検討＞
　パターニング培養法で作製した網膜前駆細胞シートを分散し、再組織化する際に重要となるＲＯＣＫ阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、およびＳｈｈシグナル伝達経路作用物質の最適な作用濃度を検討した。
　まず、実施例１記載の方法で作製したパターニング培養２０日目の網膜前駆細胞シートを、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を用いて単一細胞へ分散し、非細胞接着性の９６ウェルプレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルＶ底プレート、住友ベークライト社製）に、１ウェルあたり１．２×１０４細胞をコントロール成熟培地に浮遊させ培養した。細胞播種の際、Ｙ２７６３２（終濃度０、または１０μＭ）、ＳＡＧ（終濃度０、１５０、３００、または６００ｎＭ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（終濃度０、１．５、３、または６μＭ）を同時に添加して、再組織化を促進した。
　その後、３～４日に１回、コントロール成熟培地にて半量培地交換し、浮遊培養開始２３日目目の凝集体を明視野顕微鏡にて観察した（図１３１）。その結果、３μＭ以上のＣＨＩＲ９９０２１濃度で再組織化したオルガノイドの表面に上皮が形成され、その層構造は６μＭの濃度でより良好な形態となることが分かった（図１３２）。
　以上のように、パターニング培養で得られた網膜前駆細胞シートはディッシュに接着していて、浮遊上の細胞凝集体と異なる性質があるものの、出発原料として再組織化・再シート化できることを実証し、その際に添加する再組織化因子の最適な濃度を明らかにした。パターニング培養で作製する網膜前駆細胞シートは、様々な形態、大きさのものを大量生産できるため、再組織化・再シート化に有用な出発原料となり得るが、今回、その実現可能性を実証することができた。

Claims (31)

  1. 　上皮構造を有する網膜組織の製造方法であって、下記の工程を含む方法：
    （１）細胞接着性を有する領域Ａと、前記領域Ａの少なくとも一部に隣接する前記領域Ａよりも細胞接着性の低い領域Ｂとをその表面に有する培養基材上の領域Ａに、多能性幹細胞を播種すること、
    （２）工程（１）で播種した多能性幹細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で培養すること、
    （３）工程（２）の後に得られた細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で培養し、網膜組織を得ること、
    （４）工程（３）で得られた網膜組織を分散させ、分散された網膜系細胞集団を得ること、及び
    （５）工程（４）で得られた分散された網膜系細胞集団を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で浮遊培養又は接着培養すること。
  2. 　前記領域Ａが、細胞接着性物質でコーティングされている、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細胞接着性物質が、ラミニンである、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記領域Ａが、前記領域Ｂに囲まれている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記工程（１）において、前記多能性幹細胞を０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２～２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記工程（２）において、前記ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中の培養が１時間～１６時間である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）及びＨ－１１５２からなる群から選択される１以上の物質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地が、３ｎＭ～１５ｎＭのＢＭＰ４、または前記濃度のＢＭＰ４と同等の活性を示す濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選択される１以上の物質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、Ｗｎｔ２ｂ及びＷｎｔ３ａからなる群から選択される１以上の物質である、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群から選択される１以上の物質をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
  12. 　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中のＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）及びＨ－１１５２からなる群から選択される１以上の物質である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中のＳＨＨシグナル伝達経路作用物質が、ＳＡＧ、ＰＭＡ及びＳＨＨからなる群から選択される１以上の物質である、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
  14. 　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質が、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４及びＦＧＦ８からなる群から選択される１以上の線維芽細胞増殖因子である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の製造方法。
  15. 　前記工程（５）において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地中で接着培養することを含み、前記上皮構造を有する網膜組織が、シート状網膜組織である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の製造方法。
  16. 　前記接着培養が、細胞外マトリクス及び／又は温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を用いて行われる、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　前記培養容器の培養面が、前記温度感受性ポリマーでコーティングされ、前記温度感受性ポリマーの上面が、前記細胞外マトリクスでコーティングされる、請求項１６に記載の製造方法。
  18. 　前記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル及びビトロネクチンからなる群から選択される１以上の物質である、請求項１６又は１７に記載の製造方法。
  19. 　前記温度感受性ポリマーによりコーティングされた培養容器を、該温度感受性ポリマーの性質が変化する温度にさらすことにより、前記シート状網膜組織を該培養容器からはがす工程をさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の製造方法。
  20. 　前記工程（５）に先立ち、前記工程（４）で得られた前記分散された網膜系細胞集団中に含まれる網膜前駆細胞の割合を高める工程をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の製造方法。
  21. 　網膜色素上皮細胞の混入又は分化が抑制される、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、前記分散された網膜系細胞集団を、ＣＤ９、ＣＤ３９、ＣＤ９０及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させ、当該抗原を発現する細胞集団を得る工程を含む、請求項２０又は２１に記載の製造方法。
  23. 　前記網膜前駆細胞の割合を高める工程が、前記分散された網膜系細胞集団を、さらにＳＳＥＡ１、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９及びＣＤ８４からなる群から選択される１以上の抗原に結合する物質と接触させ、当該抗原の発現量が基準値以下である細胞集団を得る工程を含む、請求項２２に記載の製造方法。
  24. 　前記工程（５）において、前記浮遊培養又は接着培養の開始時から、前記分散された網膜系細胞集団を、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地で培養する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の製造方法。
  25. 　前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む培地が、３μＭ～６μＭのＣＨＩＲ９９０２１、または前記濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同等の活性を示す濃度のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 　前記上皮構造において、細胞の向きが層方向に対して凡そ垂直方向になっている、請求項１～２５のいずれか一項に記載の製造方法。
  27. 　前記工程（５）の浮遊培養又は接着培養によって得られた上皮構造を有する網膜組織を、移植に必要な大きさに切り出す工程をさらに含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の製造方法。
  28. 　前記上皮構造が、多層構造である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の製造方法。
  29. 　請求項１５～２８のいずれか一項に記載の方法により製造されるシート状網膜組織を、接着因子の存在下、シート状又は分散された網膜色素上皮細胞と接合させることを含む、網膜組織の製造方法。
  30. 　上記接着因子が細胞外マトリクス又はハイドロゲルである、請求項２９に記載の製造方法。
  31. 　前期接着因子が、ゼラチン、フィブリン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンから選択される１以上の物質である、請求項２９又は３０に記載の製造方法。
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