WO2024219688A1 - L-트립토판 생산 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 - Google Patents

L-트립토판 생산 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법 Download PDF

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protein
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박슬기
정무영
박소희
이수민
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    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/09—Phosphotransferases with paired acceptors (2.7.9)
    • C12Y207/09001—Pyruvate, phosphate dikinase (2.7.9.1)

Definitions

  • the present application relates to a Corynebacterium genus microorganism having L-tryptophan production ability, into which a pyruvate phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus or a polynucleotide encoding the same has been introduced; a method for producing L-tryptophan, comprising a step of culturing the microorganism in a medium; a composition for producing L-tryptophan, comprising the microorganism, a culture of the microorganism, a fermentation product of the microorganism, or a combination of two or more thereof; and a use of the microorganism for producing L-tryptophan.
  • the process of producing a target substance (e.g., amino acid) from microorganisms has been studied in various ways as an environmentally friendly and safe production method, and among them, research has been continuously conducted to produce a large amount of the target substance from microorganisms of the genus Corynebacterium.
  • Microorganisms of the genus Corynebacterium, especially Corynebacterium glutamicum are gram-positive microorganisms that are widely used in the production of L-amino acids and other useful substances.
  • various studies are being conducted to develop highly efficient producing microorganisms and fermentation process technologies.
  • L-tryptophan is one of the essential amino acids and has been widely used as a feed additive, a raw pharmaceutical ingredient such as an infusion solution, and a health food ingredient. L-tryptophan can be produced through chemical synthesis, enzymatic reaction, and fermentation, but currently, direct fermentation using microorganisms is mainly used.
  • Microorganisms have an aromatic biosynthetic pathway in which phosphoenol pyruvate (PEP), an intermediate in glycolysis, and E4P (erythrose-4-phosphate), a product of the pentose phosphate pathway, are polymerized by DAHP synthase (3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase, EC 2.5.1.54) during L-tryptophan biosynthesis. According to previous studies, it has been proven through actual quantitative analysis in cells that tryptophan requires the highest level of energy among the 20 amino acids (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(2002) V99, pp3695-3700).
  • PEP phosphoenol pyruvate
  • E4P erythrose-4-phosphate
  • gluconeogenesis is generally known to be very active in a nutrient-rich culture environment (J Bacteriol. 2013 Sep, 195(18), 4283-4296.; Nature Communications volume 8, Article number: 14316, 2017), and furthermore, there is a problem that the production of L-tryptophan decreases due to the production of by-products such as acetic acid during the production process of L-tryptophan, which reduces the amount of phosphoenolpyruvate, a tryptophan precursor.
  • the present inventors completed the present application by confirming that the L-tryptophan productivity of a Corynebacterium microorganism introduced with pyruvate, phosphate dikinase protein (PPDK) derived from Komagataebacter xylinus or a polynucleotide encoding the same increases.
  • PPDK phosphate dikinase protein
  • One aspect of the present application provides a Corynebacterium genus microorganism having L-tryptophan production ability, into which a pyruvate phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus or a polynucleotide encoding the same has been introduced.
  • the pyruvate phosphate dikinase derived from Komagataebacter xylinus may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the pyruvate phosphate dikinase derived from Komagataebacter xylinus may be encoded by the ppdK gene.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum.
  • Corynebacterium genus microorganism may have increased L-tryptophan production ability compared to a non-modified microorganism.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing L-tryptophan, comprising the step of culturing a Corynebacterium genus microorganism having L-tryptophan production ability, into which a pyruvate phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus or a polynucleotide encoding the same has been introduced, in a medium.
  • the method may additionally comprise a step of recovering L-tryptophan from the cultured microorganism, a culture of the microorganism, a fermented product of the microorganism, or the culture medium.
  • compositions for producing L-tryptophan comprising a microorganism of the genus Corynebacterium having L-tryptophan production ability, into which a pyruvate phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus or a polynucleotide encoding the same has been introduced; a culture of the microorganism, a fermented product of the microorganism, or a combination of two or more thereof.
  • Another aspect of the present application provides a use for producing L-tryptophan, comprising a composition comprising a microorganism of the genus Corynebacterium having L-tryptophan production ability, into which a pyruvate phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus or a polynucleotide encoding the same has been introduced; a culture of the microorganism, a fermentation product of the microorganism, or a combination of two or more thereof.
  • a Corynebacterium genus microorganism having L-tryptophan production ability into which a pyruvate phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus of the present invention or a polynucleotide encoding the same has been introduced, can produce L-tryptophan at a high yield and thus can be usefully utilized in the industrial production of L-tryptophan.
  • the term “about” may be presented before a specific numerical value.
  • the term “about” as used in this application includes not only the exact number described after the term, but also a range that is or is nearly that number. Whether the number is or is nearly the specific number referred to can be determined based on the context in which it is presented. As an example, the term “about” may refer to a range of -10% to +10% of a numerical value. As another example, the term “about” may refer to a range of -5% to +5% of a given numerical value. However, the present invention is not limited thereto.
  • first, second, third, may be used to distinguish each component.
  • these terms may be used in connection with steps of a method, use or analysis, these terms do not imply that they are performed consecutively or in sequence, for example, there may be no time interval between these steps, they may be performed simultaneously, or they may be performed sequentially, in reverse, or randomly, with intervals of seconds, minutes, hours, days, or months.
  • the term “consisting of” means that the proportion of a specific feature, step, component or other component(s) described below the term totals 100%.
  • the features, steps, components or other components described below the term “consisting of” may be essential or mandatory.
  • any other feature, step, component or other component, or any non-essential feature, step, component or other component may be excluded.
  • the term “consisting essentially of” means that the presence of one or more unspecified features, steps, components or other components of the subject matter claimed in this application is not substantially affected by the presence of the unspecified one or more features, steps, components or other components.
  • the term “comprising” means the presence of a feature, step, component or other component described below the term, but does not exclude the presence of one or more additional features, steps, components or other components.
  • the features, steps, components or other components described below “comprising” in this application may be essential or mandatory, but in some embodiments, other optional or non-essential features, steps, components or other components may be further included.
  • protein or "polypeptide” means a polymer or oligomer of consecutive amino acid residues.
  • polypeptide polypeptide
  • protein and “peptide” may be used interchangeably.
  • the “active amino acid sequence” may refer to the “polypeptide,” “protein,” or “peptide,”
  • mature polypeptide or mature protein means a polypeptide or protein in a form without a signal sequence or a propeptide sequence.
  • a mature polypeptide or mature protein can be a functional form of a polypeptide or protein.
  • a mature polypeptide or mature protein means a polypeptide in its final form after translation; and/or after posttranslational modification.
  • posttranslational modifications may include, but are not limited to, N-terminal processing, C-terminal truncation, glycosylation, phosphorylation, leader sequence removal, etc.
  • amino acid sequences are described in N-terminal ⁇ C-terminal orientation unless otherwise indicated.
  • a polypeptide or protein "comprising" an amino acid sequence set forth in a specific sequence number may also include a polypeptide or protein in which some amino acid(s) are deleted, modified, substituted, conservatively substituted or added, if it has the same or corresponding activity as a polypeptide or protein consisting of the amino acid sequence of the corresponding sequence number.
  • the above polypeptide or protein may also include a polypeptide or protein having a sequence addition or deletion, a naturally occurring mutation, a silent mutation or a conservative substitution within or preceding or following (the N-terminal or C-terminal) the polypeptide or protein sequence that does not alter the function of the protein, if it has the same or corresponding activity.
  • polypeptide or protein conjugated with an N-terminal signal (or leader) sequence that is involved in co-translationally or post-translationally translocation of a protein (polypeptide), or a polypeptide or protein conjugated with another sequence or linker so that the polypeptide or protein can be identified, purified, or synthesized may also be included in the scope of the polypeptide or protein having the amino acid sequence set forth in the specific sequence number.
  • conservative substitution means replacing an amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and/or amphipathic nature of the residues.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine
  • negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and aspartic acid
  • amino acids having nonpolar side chains include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline
  • Amino acids with polar or hydrophilic side chains include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • amino acids with charged side chains include arginine, lysine, histidine, glutamic acid, and aspartic acid
  • amino acids with uncharged side chains include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be classified as aromatic amino acids.
  • valine, leucine, and isoleucine can be classified as branched amino acids.
  • the 20 amino acids can be classified into five groups based on size, starting from a group of amino acids with relatively small volume: glycine, alanine, and serine; cysteine, proline, threonine, aspartic acid, asparagine; valine, histidine, glutamic acid, and glutamine; isoleucine, leucine, methionine, lysine, arginine; and phenylalanine, tryptophan, and tyrosine.
  • this is not necessarily limited to these.
  • conservative substitutions may have little or no effect on the activity of a polypeptide or protein.
  • the term "gene” refers to a polynucleotide encoding a functional molecule and a polynucleotide comprising regions preceding and following the polynucleotide, or to a functional RNA.
  • a gene may have a sequence (intron) inserted between each coding region (exon).
  • polynucleotide means a polymer of nucleotides in which nucleotide units (monomers) are covalently bonded to form a long chain, and a strand of DNA (e.g., cDNA or genomic DNA) or RNA (e.g., mRNA) of a certain length or longer.
  • RNA e.g., mRNA
  • identity or “homology” mean the degree of similarity between two given amino acid or base sequences, which may be expressed as a percentage. In this application, “homology” and “identity” may often be used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides is determined by standard alignment algorithms, possibly with a default gap penalty established by the program being used.
  • Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences are homologous, similar or identical can be determined using well-known computer algorithms such as the "FASTA” program using default parameters as in, for example, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444.
  • the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as performed in the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.
  • GAP computer program such as the Smith-Waterman algorithm (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482) can be determined by comparing the sequence information (GCG program package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, and [CARILLO et al .](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
  • homology, similarity or identity can be determined using BLAST from the National Center for Biotechnology Information Database, or ClustalW.
  • homologous or identical polynucleotide sequences can generally hybridize along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire or full-length of the sequences under stringent conditions.
  • stringent conditions means conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are specifically described in the literature (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8). For example, it may be a condition in which polynucleotides having a high degree of homology or identity hybridize with each other, or polynucleotides having a homology or identity of 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more hybridize with each other, and polynucleotides having a lower degree of homology or identity do not hybridize with each other, or a condition in which washing conditions for typical southern hybridization are performed once, or specifically twice to three times, at a salt concentration and temperature corresponding to 60°C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS,
  • the hybridized polynucleotides may contain some mismatches between bases depending on the stringency of the hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that can hybridize with each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Accordingly, the polynucleotides of the present application may include isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence as well as substantially similar base sequences.
  • a polynucleotide having homology or identity with the polynucleotide of the present application can be hybridized and detected at a Tm value of 55°C.
  • the Tm value may be, but is not limited to, 60°C, 63°C, or 65°C, and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art depending on the purpose.
  • nucleic acid construct in this application means a single or double-stranded nucleic acid molecule that contains one or more regulatory sequences and is artificially synthesized, engineered to contain a specific sequence in a way that does not exist in nature, or isolated from nature.
  • vector refers to a DNA preparation for delivering a target polynucleotide into a suitable host or host cell.
  • a suitable expression control region or expression control sequence
  • the above expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector may be transformed into a suitable host cell (microorganism) and replicate or function independently of the host genome, or may be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art can be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors
  • pDZ series, pDC series, pBR series, pUC series, pBluescriptII series, pGEM series, pTZ series, pCL series, and pET series can be used as plasmid vectors.
  • pDZ, pDC, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors can be used.
  • a target polynucleotide can be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosomal insertion.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome can be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker for confirming whether the chromosome has been inserted can be additionally included.
  • the selection marker is for selecting cells transformed with the vector, that is, confirming whether the target polynucleotide has been inserted, and markers that confer a selectable phenotype, such as drug resistance, nutrient requirement, resistance to cytotoxic agents, or expression of a surface polypeptide, can be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selection marker survive or exhibit other phenotypic traits, so that the transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” means introducing a vector containing a target polynucleotide into a host cell (microorganism) to change the genetic characteristics of the host cell (microorganism).
  • the transformed polynucleotide may be inserted and located in the chromosome of the host cell (microorganism) or may be located outside the chromosome.
  • the polynucleotide may include DNA or RNA.
  • the polynucleotide may be introduced in an appropriate form depending on the purpose of introduction.
  • a polynucleotide for expressing a target polypeptide may be introduced into a host cell (microorganism) in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may typically include a promoter, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal that are operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell (microorganism) in its own form and operably linked to a sequence necessary for expression in the host cell (microorganism), but is not limited thereto.
  • operably linked means a configuration in which a regulatory sequence is positioned at an appropriate location such that the regulatory sequence controls the expression of a coding sequence.
  • operably linked includes a regulatory region of a functional domain having a known or desired activity, such as a promoter, terminator, signal sequence, or enhancer region, attached or linked to a target (gene or polypeptide) so that the expression, secretion, or function of the target can be controlled according to the known or desired activity.
  • a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a polypeptide is functionally linked to the polynucleotide sequence.
  • expression includes any step involved in the production of a polypeptide, such as, but not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.
  • expression vector means a linear or circular nucleic acid molecule comprising a target polynucleotide sequence and a regulatory sequence operably linked to enable expression thereof.
  • it may comprise a base sequence of a polynucleotide encoding a target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so as to enable expression of the target polypeptide in a suitable host.
  • regulatory sequence means a polynucleotide sequence necessary for regulating the expression of a target polynucleotide sequence.
  • Each regulatory sequence may be a natural (same origin) or foreign (derived from another gene) sequence for the coding sequence, or a mutant sequence thereof, or another artificial sequence.
  • the regulatory sequence include a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a signal peptide sequence, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating transcription and translation termination.
  • the minimum unit of the regulatory sequence may include a promoter, a transcription and translation termination sequence.
  • genetic recombination means a natural or artificial process in which elements that make up genes, such as DNA or RNA, are changed from their original sequence during the disassembly and reassembly process.
  • the term “recombinant gene” means a gene having a new genetic configuration that is created as a result of genetic recombination, such as chemical synthesis or genetic engineering techniques.
  • the terms “recombinant gene,” “recombinant DNA,” and “recombinant polynucleotide” may be used interchangeably.
  • the recombinant gene may include an artificial combination of nucleic acid fragments, such as regulatory sequences, that are not found together in nature.
  • recombinant protein means a protein produced as a result of genetic recombination.
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and prokaryotic or eukaryotic microorganisms that have undergone genetic modification naturally or artificially, and may be a microorganism that includes genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein or product, as a microorganism whose specific mechanism has been weakened or increased due to causes such as insertion of an external gene or increased or inactivated activity of an endogenous gene.
  • the terms "microorganism”, “strain”, “host”, and “host cell” in this application may be used interchangeably.
  • the term "recombinant microorganism” refers to a microorganism that has been genetically modified such that it exhibits a different genotype and/or phenotype compared to a naturally occurring microorganism (e.g., when the genetic modification affects the nucleic acid sequence coding for the microorganism), and may include any progeny or potential progeny of the microorganism.
  • the terms "recombinant microorganism,” “genetically modified microorganism,” “recombinant host cell,” “recombinant cell,” and “recombinant strain” may be used interchangeably as used herein.
  • the recombinant microorganism may, for example, express a gene that is not found in its native (non-recombinant) form; may not express a gene that is expressed in its native form; or may express a native gene in a manner different from that in which it is expressed in its native form.
  • the microorganism of the present application may be, but is not limited to, a microorganism (e.g., a recombinant microorganism) into which a pyruvate or phosphate dikinase protein or a polynucleotide encoding the same has been introduced.
  • a microorganism e.g., a recombinant microorganism
  • a pyruvate or phosphate dikinase protein or a polynucleotide encoding the same has been introduced.
  • microorganism having L-tryptophan production ability refers to a microorganism capable of producing L-tryptophan within the organism, and may include both a microorganism that does not inherently have L-tryptophan production ability but is endowed with L-tryptophan production ability, and a microorganism that inherently has L-tryptophan production ability.
  • the L-tryptophan production ability can be endowed or enhanced by species improvement.
  • unmodified microorganism does not exclude a microorganism (strain) that includes a mutation that can occur naturally, and may mean a wild-type microorganism (strain) or a natural microorganism (strain) itself, or a microorganism (strain) before its phenotype is changed by a genetic mutation caused by natural or artificial factors.
  • an unmodified microorganism may mean a microorganism (strain) into which the pyruvate, phosphate dikinase protein of the present application or a polynucleotide encoding the same is not introduced, or before it is introduced, but is not limited thereto. Additionally, in the present application, the unmodified microorganism may be, but is not limited to, a microorganism that does not contain a polypeptide comprising sequence number 1 or a polynucleotide comprising sequence number 2.
  • the term "increase" of protein (polypeptide) activity means that the activity of the protein (polypeptide) within a host cell (microorganism) is increased compared to the intrinsic activity.
  • the increase may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and enhancement.
  • the host cell (microorganism) may be a prokaryotic or eukaryotic microorganism.
  • the increase in the above protein (polypeptide) activity may include the display of a protein (polypeptide) activity that the host cell (microorganism) did not inherently possess, or the display of an enhanced protein (polypeptide) activity compared to the inherent activity or the activity before modification.
  • exhibiting a protein (polypeptide) activity that was not inherently present or “exhibiting an improved protein (polypeptide) activity” may be due to, but is not limited to, "introduction of a protein (polypeptide).”
  • the term "introduction" of a protein means that a gene that a microorganism did not originally have is expressed in the microorganism, thereby causing the activity of a specific protein to be exhibited, or that the activity of the polypeptide is strengthened, increased or improved compared to the intrinsic activity of the protein or the activity before modification. For example, it may be due to the introduction of a gene encoding the protein (polypeptide) into a host cell (microorganism).
  • a polynucleotide encoding a specific protein may be introduced into the chromosome of a host cell (microorganism), or a vector containing a polynucleotide encoding a specific protein (polypeptide) may be introduced into a host cell (microorganism) so that its activity is exhibited or improved.
  • intrinsic activity refers to the activity of a specific protein (polypeptide) originally possessed by a host cell (microorganism) or a non-transformed host cell (microorganism) before transformation, when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activity before transformation.”
  • An increase in the activity of a protein (polypeptide) compared to the intrinsic activity means that the activity and/or concentration (expression amount) of the protein (polypeptide) of the host cell (microorganism) is enhanced compared to the activity and/or concentration (expression amount) of the protein (polypeptide) originally present in the host cell (microorganism) before transformation or in the non-transformed host cell (microorganism).
  • the increase may be, but is not limited to, an increase in the activity or concentration of the corresponding protein (polypeptide) from a previously absent activity to an increase in the activity or concentration thereof, typically by at least about 1%, at least about 10%, at least about 25%, at least about 50%, at least about 75%, at least about 100%, at least about 150%, at least about 200%, at least about 300%, at least about 400%, or at least about 500%, up to at least about 1000% or at least about 2000%, relative to the activity or concentration in the host cell (microorganism) before transformation or in the untransformed host cell (microorganism).
  • An increase in the activity of the above protein (polypeptide) can be achieved by introducing an exogenous protein (polypeptide) or by increasing the activity of an endogenous protein (polypeptide). Whether the activity of the above protein (polypeptide) has increased can be confirmed by an increase in the activity level of the protein (polypeptide), the expression amount, or the amount of a product resulting from the activity of the protein (polypeptide).
  • the increase in the activity of the above protein (polypeptide) can be achieved by various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target protein (polypeptide) can be increased compared to the host cell (microorganism) before transformation. Specifically, it may be, but is not limited to, genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which are routine methods of molecular biology (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • the increase in activity of the protein (polypeptide) of the present application is
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the protein (polypeptide) above 1) may be caused by introduction of a vector including a polynucleotide encoding the protein (polypeptide) operably linked to an appropriate regulatory sequence into the host cell (microorganism).
  • a vector including a polynucleotide encoding the protein (polypeptide) operably linked to an appropriate regulatory sequence may be introduced into the chromosome of the host cell (microorganism).
  • the introduction into the chromosome may be performed by introduction of a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell (microorganism), but is not limited thereto.
  • the vector is as described above.
  • the regulatory sequence may be a natural (same origin) or foreign (derived from another gene) sequence for the coding polynucleotide sequence, or a mutant sequence thereof, or another artificial sequence, and may induce expression of the polynucleotide in the host cell (microorganism).
  • the above 2) replacement of the gene expression control region (or expression control sequence) on the chromosome encoding the protein (polypeptide) with a sequence having strong activity may be, for example, introduction of a mutation in the sequence by deletion, insertion, substitution, or a combination thereof to further increase the activity of the expression control region, or replacement with a sequence having stronger activity.
  • the expression control region may include, but is not particularly limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation. As an example, it may be, but is not limited to, replacing an original promoter with a strong promoter.
  • Examples of known strong promoters include, but are not limited to, the cj1 to cj7 promoters (US Patent No. US 7662943 B2), the lac promoter, the trp promoter, the trc promoter, the tac promoter, the lambda phage PR promoter, the PL promoter, the tet promoter, the gapA promoter, the SPL7 promoter, the SPL13 (sm3) promoter (US Patent No. US 10584338 B2), the O2 promoter (US Patent No. US 10273491 B2), the tkt promoter, and the yccA promoter.
  • modification of the base sequence of the region encoding the initiation codon or 5'-UTR of the gene encoding the protein may be, for example, a modification that encodes another initiation codon having a higher protein (polypeptide) expression rate than the endogenous initiation codon, or an RBS sequence having a higher protein (polypeptide) expression rate than the endogenous RBS (ribosome binding site) sequence, but is not limited thereto.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of the protein (polypeptide) of the above 4) and 5) may be, but is not limited to, introducing a mutation in the sequence by deletion, insertion, substitution or a combination thereof in the amino acid sequence of the protein (polypeptide) or the polynucleotide sequence encoding the protein (polypeptide) so as to increase the activity of the protein (polypeptide), or replacing it with an amino acid sequence or polynucleotide sequence modified to increase the activity.
  • the replacement may be performed, for example, by inserting a polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the introduction of the foreign polynucleotide exhibiting the activity of the above 6) protein (polypeptide) may be the introduction into the host cell (microorganism) of a foreign polynucleotide encoding a protein (polypeptide) exhibiting the same/similar activity as the above protein (polypeptide).
  • the foreign polynucleotide is not limited in its origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the above protein (polypeptide).
  • the method used for the above introduction can be performed by a person skilled in the art appropriately selecting a known transformation method, and the protein (polypeptide) can be produced by expressing the introduced polynucleotide in the host cell, thereby increasing its activity.
  • codon optimization of a polynucleotide encoding a protein may be codon optimization of an endogenous polynucleotide to increase transcription or translation within a host cell (microorganism), or codon optimization of a foreign polynucleotide to achieve optimized transcription or translation within a host cell (microorganism).
  • analyzing the tertiary structure of a protein (polypeptide) and selecting an exposed portion to modify or chemically modify may be done by, for example, comparing the sequence information of the protein (polypeptide) to be analyzed with a database storing the sequence information of known proteins, determining a template protein candidate based on the degree of sequence similarity, confirming the structure based on this, and selecting an exposed portion to modify or chemically modify and modifying or modifying it.
  • Such an increase in protein (polypeptide) activity may be, but is not limited to, an increase in the activity or concentration of the corresponding protein (polypeptide) relative to the activity or concentration of the protein (polypeptide) expressed in the wild type or pre-transformed host cell (microorganism), or an increase in the amount of a product resulting from the activity of the corresponding protein (polypeptide).
  • Modification of part or all of the polynucleotide in the microorganism of the present application may be induced by, but is not limited to, (a) a method using homologous recombination using a vector for chromosome insertion into the microorganism, or genome editing using engineered nuclease (e.g., CRISPR-Cas9), and/or (b) treatment with light and/or chemicals such as ultraviolet rays and radiation.
  • engineered nuclease e.g., CRISPR-Cas9
  • the term "cultivation” means growing microorganisms under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culturing process can be carried out according to appropriate media and culturing conditions known in the art. This culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected microorganism. Specifically, the culturing may be batch, continuous, and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” means a material containing nutrients necessary for culturing microorganisms as main components, and supplies nutrients and growth factors, including water essential for survival and growth.
  • the medium and other culture conditions used for culturing the microorganisms of this application may be any medium used for culturing general microorganisms without particular limitation.
  • the microorganisms of this application may be cultured in a general medium containing appropriate carbon sources, nitrogen sources, phosphorus, inorganic compounds, amino acids, and/or vitamins, while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions.
  • a culture medium for microorganisms of the genus Corynebacterium can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].
  • the carbon source may include carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose, etc.; sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, etc.; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid, etc.; amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, etc.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolysate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugarcane residue, and corn steep liquor may be used, and specifically, carbohydrates such as glucose and sterilized pretreated molasses (i.e., molasses converted into reducing sugar) may be used, and other appropriate amounts of carbon sources may be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • the nitrogen source may include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium nitrate, etc.; organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc.; peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, fish or its decomposition product, defatted soybean cake or its decomposition product, etc. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium nitrate, etc.
  • organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc.
  • the above-mentioned personnel may include potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, or their corresponding sodium-containing salts.
  • the inorganic compounds may include sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc.
  • amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium in batch or continuous manner. However, the present invention is not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. may be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester may be used to suppress bubble formation.
  • oxygen or an oxygen-containing gas may be injected into the medium, or in order to maintain the anaerobic and microaerobic state, no gas may be injected, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas may be injected, but is not limited thereto.
  • the culture temperature can be maintained at 20 to 45°C, specifically 25 to 40°C, and the culture can be performed for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the term "culture” means a culture solution, a concentrated culture solution, a dried product of a culture solution, a culture filtrate, a concentrated culture filtrate, or a dried product of a culture filtrate obtained by culturing a specific microorganism in a culture medium, wherein the culture solution means that it contains a specific microorganism, and the culture filtrate means that it does not substantially contain a specific microorganism (here, substantially means excluding a specific microorganism separated by filtration or the like, but does not mean that the filtrate completely excludes microorganisms).
  • the culture is not limited in its formulation, and may be, for example, a liquid, an emulsion, or a solid.
  • fertilization means a process in which microorganisms decompose organic matter using their own enzymes, but it is not a putrefaction reaction. Fermentation and putrefaction reactions proceed through similar processes, but if a useful substance is created as a result of the decomposition, it is called fermentation, and if an unpleasant-smelling or harmful substance is created, it is called putrefaction.
  • the method for obtaining a fermented product from the microorganism in the present application is not particularly limited, and can be obtained according to a method commonly used in the relevant technical field or a similar field.
  • the term "fermentation” includes all kinds of substances including a fermentation product produced from the microorganism, such as not only the fermented substance itself, but also a substance including a fermented microorganism, a culture produced from the fermented microorganism, a fermentation product of the culture, a concentrated fermentation product, a dried product of the fermentation product, a fermentation product filtrate, a concentrated fermentation product filtrate, or a dried product of the fermentation product filtrate, an extract of the fermentation product, or a dilution of the fermentation product.
  • a fermentation product produced from the microorganism such as not only the fermented substance itself, but also a substance including a fermented microorganism, a culture produced from the fermented microorganism, a fermentation product of the culture, a concentrated fermentation product, a dried product of the fermentation product, a fermentation product filtrate, a concentrated fermentation product filtrate, or a dried product of the fermentation product filtrate, an extract of the fermentation product, or a dilution of
  • One aspect of the present application provides a Corynebacterium genus microorganism having L-tryptophan production ability, into which a pyruvate phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus or a polynucleotide encoding the same has been introduced.
  • pyruvate, phosphate dikinase means an enzyme of a family of transferases that catalyzes the reaction [ATP + pyruvate + phosphate ⁇ phosphoenolpyruvate (PEP) + diphosphate].
  • PPDK pyruvate, phosphate dikinase
  • the pyruvate, phosphate dikinase of the present application can be used interchangeably with PPDK.
  • the pyruvate, phosphate dikinase of the present application may be a protein having pyruvate, phosphate dikinase activity encoded by the ppdk gene, but is not particularly limited in type as long as it has an activity corresponding to pyruvate, phosphate dikinase.
  • the pyruvate, phosphate dikinase encoded by the above ppdk gene is known in the art, and the amino acid and polynucleotide sequences of the pyruvate, phosphate dikinase can be obtained from known databases, including, but not limited to, NCBI's GenBank.
  • the pyruvate, phosphate dikinase protein derived from Komagataeibacter xylinus may include an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 60% or more homology or identity therewith, but is not limited thereto as long as it has pyruvate, phosphate dikinase protein activity.
  • it may be included in the pyruvate, phosphate dikinase protein.
  • a protein having an amino acid sequence having at least 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology or identity with the amino acid sequence of the above sequence number 1, comprising, consisting of, or essentially consisting of the above amino acid sequence and exhibiting an effect corresponding to the above pyruvate, phosphate dikinase protein may be included in the above pyruvate, phosphate dikinase protein.
  • sequence of a polynucleotide encoding a pyruvate, phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus having the amino acid sequence of the above sequence number 1 or an amino acid sequence having 60% or more homology or identity therewith can be obtained, for example, based on codon information known in the art.
  • the pyruvate, phosphate dikinase protein may be encoded by a polynucleotide having or including a sequence of the above sequence number 2 or a base sequence having 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more homology or identity with the sequence of the above sequence number 2, or consisting of or consisting essentially of the above base sequence, but is not limited thereto.
  • the base sequence of the above sequence number 2 can be obtained from a known database, such as, but not limited to, NCBI's GenBank.
  • the polynucleotide (gene) including the base sequence of SEQ ID NO: 2 may be used interchangeably with a polynucleotide (gene) having the base sequence of SEQ ID NO: 2, a polynucleotide (gene) consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, or ppdk .
  • the polynucleotide of the present application can have various modifications in the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the pyruvate, phosphate dikinase protein of the present application due to the degeneracy of the codon or in consideration of the codon preferred in an organism that is intended to express the pyruvate, phosphate dikinase protein of the present application.
  • polynucleotide that can be translated into a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the pyruvate, phosphate dikinase protein of the present application or a polypeptide having homology or identity therewith due to codon degeneracy can also be included in the polynucleotide of the present application.
  • the polynucleotide of the present application can be SEQ ID NO: 2 or a degenerated sequence thereof.
  • the polynucleotide of the present application may have or comprise a base sequence that is at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% homologous or identical to SEQ ID NO: 2, or may consist of or consist essentially of a base sequence that is at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% homologous or identical to SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • polynucleotide of the present application may include, without limitation, a probe that can be prepared from a known genetic sequence, for example, a sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence to all or part of the polynucleotide sequence of the present application, so long as it encodes the pyruvate phosphate dikinase protein of the present application.
  • the microorganism of the present application may include any microorganism capable of producing the desired L-tryptophan by introducing a pyruvate, phosphate dikinase protein or a polynucleotide encoding the same.
  • the microorganism of the present application is characterized by having increased L-tryptophan productivity by introducing a pyruvate, phosphate dikinase protein or a polynucleotide encoding the same, and may be a genetically modified microorganism or a recombinant microorganism, but is not limited thereto.
  • the recombinant strain having increased L-tryptophan productivity may be a microorganism having increased L-tryptophan productivity compared to a natural wild-type microorganism or an unmodified microorganism having intrinsic activity of pyruvate, phosphate dikinase or lacking intrinsic activity of pyruvate, phosphate dikinase, but is not limited thereto.
  • a microorganism having L-tryptophan production ability is a prokaryotic or eukaryotic microorganism strain capable of producing L-tryptophan within a living organism, and may include all microorganisms that inherently have L-tryptophan production ability or microorganisms that are endowed with L-tryptophan production ability due to the activity of the pyruvate, phosphate dikinase protein introduced in the present application to a parent strain that does not have L-tryptophan production ability.
  • L-tryptophan production ability can be endowed or enhanced by species improvement.
  • the microorganism of the present application may include any microorganism into which a pyruvate or phosphate dikinase protein or a polynucleotide encoding the same has been introduced by various known methods.
  • the recombinant microorganism having L-tryptophan production ability of the present application may include all microorganisms capable of producing L-tryptophan, which have been transformed via a vector and into which an exogenous gene encoding pyruvate, phosphate dikinase of the present application, specifically, an exogenous gene encoding pyruvate, phosphate dikinase derived from Komagataebacter xylinus, has been introduced.
  • the microorganism producing the L-tryptophan may be a microorganism into which a polynucleotide sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a protein comprising an amino acid sequence having at least 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has been introduced.
  • the microorganism producing the L-tryptophan may be a microorganism introduced with a polynucleotide capable of encoding a protein including an amino acid sequence having at least 80% homology to the amino acid sequence of the sequence number 1; or a polynucleotide including a base sequence of the sequence number 2, or a base sequence having at least 60%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% homology or identity with the base sequence of the sequence number 2.
  • the microorganism with increased L-tryptophan productivity of the present application may be a microorganism with increased L-tryptophan productivity compared to a non-modified microorganism, but is not limited thereto.
  • the non-modified microorganism which is a target strain for comparing whether or not the L-tryptophan productivity is increased, may be the CM05-9157 strain, but is not limited thereto.
  • the microorganism with increased L-tryptophan productivity may have an increase of about 1% or more, specifically, about 1% or more, about 2.5% or more, about 5% or more, about 6% or more, about 7% or more, about 8% or more, about 9% or more, about 10% or more, about 15% or more, about 16% or more, about 17% or more, or about 18% or more (the upper limit is not particularly limited, and may be, for example, about 200% or less, about 150% or less, about 100% or less, about 50% or less, about 45% or less, about 40% or less, about 35% or less, about 30% or less, about 25% or less, or about 20% or less) compared to the L-tryptophan productivity of the parent microorganism (parent strain) before mutation or the non-mutated microorganism.
  • the upper limit is not particularly limited, and may be, for example, about 200% or less, about 150% or less, about 100% or less, about 50% or less, about 45% or less, about 40% or less, about
  • the recombinant strain with increased L-tryptophan productivity may have an L-tryptophan productivity increased by about 1.1 times or more, about 1.15 times or more, about 1.16 times or more, about 1.17 times or more, or about 1.18 times or more (the upper limit is not particularly limited, and may be, for example, about 10 times or less, about 5 times or less, about 3 times or less, about 2 times or less, about 1.5 times or less, about 1.4 times or less, about 1.3 times or less, or about 1.2 times or less) compared to the parent microorganism before mutation or the non-mutated microorganism, but is not limited thereto.
  • the microorganism having L-tryptophan production ability of the present application may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, but specifically may be a prokaryotic cell.
  • the prokaryotic cell may include, but is not limited to, a microorganism belonging to the genus Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonella sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp., and Norcardia sp., or a fungus or yeast.
  • it may be a microorganism of the genus Escherichia, the genus Corynebacterium, the genus Leptospira, and yeast. More specifically, it may be a microorganism of the genus Corynebacterium .
  • the microorganism of the present application may be a microorganism of the genus Corynebacterium .
  • the microorganism of the present application is Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis , Corynebacterium deserti , Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae , Corynebacterium stationis , Corynebacterium singulare , Corynebacterium halotolerans , Corynebacterium striatum , Corynebacterium ammoniagenes , It may be Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans , Corynebacterium testudinoris or Corynebacterium flavescens .
  • the microorganism of the present application may be a microorganism of the genus Corynebacterium, more specifically, Corynebacterium glutamicum , but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism of the genus Corynebacterium, more specifically, Corynebacterium glutamicum , but is not limited thereto.
  • the Corynebacterium genus microorganism having L-tryptophan production ability of the present application may include all of a natural wild-type microorganism itself, a Corynebacterium genus microorganism having improved L-tryptophan production ability by increasing or decreasing the activity of a gene related to the L-tryptophan production mechanism, or a Corynebacterium genus microorganism having improved L-tryptophan production ability by introducing or increasing the activity of an external gene.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing L-tryptophan, comprising the step of culturing a Corynebacterium genus microorganism having L-tryptophan production ability, into which a pyruvate phosphate dikinase protein derived from Komagataebacter xylinus of the present application or a polynucleotide encoding the same has been introduced, in a medium.
  • any culture conditions and culture methods known in the art can be used for culturing microorganisms. Those skilled in the art can easily adjust and use this culture process according to the selected microorganism.
  • L-tryptophan produced by the culture of the present invention can be secreted into the medium or remain within the cells.
  • the method for producing L-tryptophan of the present application may further comprise a step of preparing a microorganism of the present application, a step of preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (in any order), for example, prior to the culturing step.
  • the method for producing L-tryptophan of the present application may further include a step of recovering a target substance, specifically L-tryptophan, from the cultured microorganism, a culture of the microorganism, a fermented product of the microorganism, or the culture medium.
  • the recovering step may be additionally included after the culturing step.
  • the above recovery may be to collect the target L-tryptophan using a suitable method known in the art, depending on the culture method of the microorganism of the present application, such as a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art, depending on the culture method of the microorganism of the present application, such as a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • various chromatographies such as centrifugation, filtration, treatment with a crystallized protein precipitant (salting out method), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, HPLC or a combination of these methods may be used, and the target substance, specifically L-tryptophan, can be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the method for producing L-tryptophan of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification may be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step may be performed sequentially or discontinuously regardless of the order, or may be performed simultaneously or integrated into one step, but is not limited thereto.
  • each component present in the composition of the present application may be included in a microbiologically effective amount, or an amount that can be suitably present in the production composition.
  • ppsA Phosphoenolpyruvate synthase
  • ppdK Pyruvate, phosphate dikinase
  • phosphate dikinase with high gluconeogenic activity, we searched for organisms derived from acetic acid bacteria and methanogens that utilize carbon sources consisting of 1 to 3 carbons based on the results of a literature review. Among them, considering the biosafety level applicable to the production strain and the possibility of acquisition, four microorganisms expected to possess phosphoenolpyruvate synthase or pyruvate, phosphate dikinase were selected as shown in Table 1 below.
  • Example 2 Production of L-tryptophan producing microorganisms introducing foreign pyruvate and phosphate dikinase
  • Example 2-1 Production of plasmids for gene insertion
  • Plasmids were constructed to introduce genes for pyruvate, phosphate dikinase, or phosphoenolpyruvate synthase by homologous recombination into the transposon gene site in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 as a template, the primer pairs of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, and the primer pairs of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, to obtain each fragment.
  • PCR was performed using Solg TM Pfu-X DNA polymerase under the following conditions: denaturation at 95°C for 4 minutes, followed by 27 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, polymerization at 72°C for 50 seconds, and then polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • the primer sequences used are shown in Table 2 below.
  • the two fragments amplified through the above PCR and the transformation vector pDCM2 (Korean Patent No. 10-2278000) digested with SmaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) to obtain a recombinant plasmid, which was named pDCM2- ⁇ Tn.
  • Example 2-2 Komagataebacter xylinus ( Komagataeibacter xylinus ) Production of Corynebacterium microorganisms introducing pyruvate and phosphate dikinase
  • the ppdK gene (SEQ ID NO: 2) of K. xylinus was first synthesized using the gene synthesis service of Bionics Co., Ltd., and the ppdK gene was amplified by PCR using the primer pairs of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and the PCR amplification conditions were as follows: denaturation at 95°C for 2 minutes, 27 cycles of denaturation at 95°C for 20 seconds, annealing at 60°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, followed by polymerization reaction at 72°C for 5 minutes.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 using p117-cj7-gfp (US 7662943 B2) as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase SolGent co.
  • the PCR amplification conditions were denaturation at 95 °C for 2 minutes, followed by 27 cycles of denaturation at 95 °C for 20 seconds, annealing at 60 °C for 40 seconds, and polymerization at 72 °C for 30 seconds, and then polymerization reaction was performed at 72 °C for 5 minutes.
  • Pcj7-ppdK(K.xy) vector was transformed into the tryptophan-producing strain CM05-9157 (Korean Patent No. 10-2278000) by electroporation (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), a strain in which one copy of the Pcj7-ppdK(K.xy) gene was inserted between transposon genes on the chromosome was obtained through a second crossing-over process.
  • the strain was identified by PCR using primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 that can amplify external regions of the upstream and downstream regions of the position where the gene was inserted, and by sequencing.
  • the strain obtained by the above method was named CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(K.xy).
  • Example 2-3 Acetobacter pasteurianus subsp. Production of Corynebacterium spp. microorganisms introducing pyruvate and phosphate dikinase
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and the PCR amplification conditions were as follows: denaturation at 95 ° C. for 2 minutes, followed by 27 cycles of denaturation at 95 ° C. for 20 seconds, annealing at 60 ° C. for 40 seconds, and polymerization at 72 ° C. for 1 minute, and then polymerization reaction at 72 ° C. for 5 minutes.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 23 using p117-cj7-gfp (US 7662943 B2) as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase SolGent co.
  • the PCR amplification conditions were denaturation at 95 °C for 2 minutes, followed by 27 cycles of denaturation at 95 °C for 20 seconds, annealing at 60 °C for 40 seconds, and polymerization at 72 °C for 30 seconds, and then polymerization reaction was performed at 72 °C for 5 minutes.
  • the ppdK gene of Acetobacter pasteurianus subsp. amplified from the above, the Pcj7 promoter region, and the pDCM2- ⁇ Tn constructed in Example 2-1, which was cleaved with ScaI restriction enzyme, were cloned using the Gibson assembly method (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix), thereby obtaining a recombinant plasmid, which was named pDCM2- ⁇ Tn:: Pcj7-ppdK (A.pa). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each fragment in the calculated molar number and then storing it at 50°C for 1 hour.
  • the constructed pDCM2- ⁇ Tn:: Pcj7-ppdK(A.pa) vector was transformed into the tryptophan-producing strain CM05-9157 (Korean Patent No. 10-2278000) by electroporation (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), and a second crossing over process was performed to obtain a strain in which one copy of the Pcj7-ppdK(A.pa) gene was inserted between transposon genes on the chromosome.
  • the strain was identified by PCR using primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 that can amplify external regions of the upstream and downstream regions of the position where the gene was inserted, respectively, and by sequencing.
  • the strain obtained by the above method was named CM05-9157 :: Pcj7-ppdK (A.pa).
  • Example 2-4 Methanosarcina acetivorans str. C2 Production of Corynebacterium spp. microorganisms introducing pyruvate and phosphate dikinase from A
  • a gene (NZ_AE010299.1, SEQ ID NO: 6) encoding pyruvate phosphate dikinase (SEQ ID NO: 5) derived from Methanosarcina acetivorans str. C2A into Corynebacterium glutamicum, the ppdK gene (SEQ ID NO: 6) of Methanosarcina acetivorans str. C2A was first synthesized using the gene synthesis service of Bionics Co., Ltd. and the ppdK gene was amplified by PCR using the primer pairs of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25 as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and the PCR amplification conditions were as follows: denaturation at 95°C for 2 minutes, 27 cycles of denaturation at 95°C for 20 seconds, annealing at 60°C for 40 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, followed by polymerization reaction at 72°C for 5 minutes.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 26 using p117-cj7-gfp (US 7662943 B2) as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase SolGent co.
  • the polymerase was used as the polymerase, and the PCR amplification conditions were as follows: denaturation at 95 °C for 2 minutes, denaturation at 95 °C for 20 seconds, annealing at 60 °C for 40 seconds, polymerization at 72 °C for 30 seconds repeated 27 times, and then polymerization reaction was performed at 72 °C for 5 minutes.
  • the Gibson assembly method DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
  • the constructed pDCM2- ⁇ Tn:: Pcj7-ppdK(M.ac) vector was transformed into the tryptophan-producing strain CM05-9157 (Korean Patent No. 10-2278000) by electroporation (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), and a second crossing over process was performed to obtain a strain in which one copy of the Pcj7-ppdK(M.ac) gene was inserted between transposon genes on the chromosome.
  • the strain was identified by PCR using primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 that can amplify external regions of the upstream and downstream regions of the position where the gene was inserted, respectively, and by sequencing.
  • the strain obtained by the above method was named CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(M.ac).
  • Example 2-5 Escherichia coli Production of Corynebacterium spp. microorganisms introducing pyruvate and phosphate dikinase
  • the ppsA gene was amplified by PCR using the Escherichia coli W3110 chromosomal DNA as a template and the primer pair of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and the PCR amplification conditions were as follows: denaturation at 95 °C for 2 minutes, 27 cycles of denaturation at 95 °C for 20 seconds, annealing at 60 °C for 40 seconds, and polymerization at 72 °C for 1 minute, and then polymerization reaction at 72 °C for 5 minutes.
  • Sequence number designation Sequence (5' ⁇ 3') Sequence number 27 ppsA(E.co)-F aacgaaaggaacactcATGTCCAACAATGGCTCG Sequence number 28 ppsA(E.co)-R AATCACCGCATCCagtTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGG
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 29 using p117-cj7-gfp (US 7662943 B2) as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase SolGent co.
  • the PCR amplification conditions were denaturation at 95 °C for 2 minutes, followed by 27 cycles of denaturation at 95 °C for 20 seconds, annealing at 60 °C for 40 seconds, and polymerization at 72 °C for 30 seconds, and then polymerization reaction was performed at 72 °C for 5 minutes.
  • Example 2-1 the amplified Escherichia coli ppsA gene, Pcj7 promoter region, and pDCM2- ⁇ Tn constructed in Example 2-1, which was cleaved with ScaI restriction enzyme, were cloned using the Gibson assembly method (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix), thereby obtaining a recombinant plasmid, which was named pDCM2- ⁇ Tn:: Pcj7-ppsA(E.co). Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each fragment in the calculated molar number and then storing it at 50°C for 1 hour.
  • the Gibson assembly method DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
  • the constructed pDCM2- ⁇ Tn:: Pcj7-ppsA(E.co) vector was transformed into the tryptophan-producing strain CM05-9157 (Korean Patent No. 10-2278000) by electroporation (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), and a second crossing over process was performed to obtain a strain in which one copy of the Pcj7-ppsA(E.co) gene was inserted between transposon genes on the chromosome.
  • the strain was identified by PCR using primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 that can amplify external regions of the upstream and downstream regions of the position where the gene was inserted, respectively, and by sequencing.
  • the strain obtained by the above method was named CM05-9157 :: Pcj7-ppsA (E.co).
  • Example 2-6 Corynebacterium glutamicum Production of an introduced Corynebacterium spp. strain containing pyruvate and phosphate dikinase derived from ATCC13869
  • the ppsA gene was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used as the polymerase, and the PCR amplification conditions were as follows: denaturation at 95 °C for 2 minutes, 27 cycles of denaturation at 95 °C for 20 seconds, annealing at 60 °C for 40 seconds, and polymerization at 72 °C for 1 minute, and then polymerization reaction at 72 °C for 5 minutes.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 32 with p117-cj7-gfp (US 7662943 B2) as a template.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase SolGent co.
  • the PCR amplification conditions were denaturation at 95 °C for 2 minutes, followed by 27 cycles of denaturation at 95 °C for 20 seconds, annealing at 60 °C for 40 seconds, and polymerization at 72 °C for 30 seconds, and then polymerization reaction was performed at 72 °C for 5 minutes.
  • the amplified ppsA gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13869, the Pcj7 promoter region, and the pDCM2- ⁇ Tn constructed in Example 2-1, which was cleaved with ScaI restriction enzyme, were cloned using the Gibson assembly method (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix), thereby obtaining a recombinant plasmid, which was named pDCM2- ⁇ Tn:: Pcj7-ppsA(C.gl).
  • Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in a calculated molar number and then storing it at 50°C for 1 hour.
  • the constructed pDCM2- ⁇ Tn:: Pcj7-ppsA(C.gl) vector was transformed into the tryptophan-producing strain CM05-9157 (Korean Patent No. 10-2278000) by electroporation (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), and a strain was obtained in which one copy of the Pcj7-ppsA(C.gl) gene was inserted between transposon genes on the chromosome through a second crossing over process.
  • the strain was identified by PCR using primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 that can amplify external regions of the upstream and downstream regions of the position where the gene was inserted, respectively, and by sequencing.
  • the strain obtained by the above method was named CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(C.gl).
  • Example 3 Evaluation of L-tryptophan production ability of L-tryptophan producing microorganisms introduced with foreign pyruvate, phosphate dikinase genes or their orthologs
  • the strains were cultured using the following method.
  • Each strain was inoculated into a 250-mL corner-baffle flask containing 25 mL of seed medium, and cultured at 30°C for 20 hours with shaking at 200 rpm. Then, 1 mL of the seed culture was inoculated into a 250-mL corner-baffle flask containing 25 mL of production medium, and cultured at 30°C for 24 hours with shaking at 200 rpm. After completion of the culture, the production amount of L-tryptophan was measured by HPLC.
  • the compositions of the seed medium and production medium are as follows, and the concentration of L-tryptophan in the culture solution for each strain tested is shown in Table 14 below.
  • Glucose 20 g peptone 10 g, yeast extract 5 g, urea 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, biotin 100 ⁇ g, thiamine HCl 1000 ⁇ g, calcium pantothenic acid 2000 ⁇ g, nicotinamide 2000 ⁇ g (per 1 liter of distilled water).
  • Glucose 30 g ( NH4 ) 2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, yeast extract 5 g, biotin 900 ⁇ g, thiamine hydrochloride 4500 ⁇ g, calcium pantothenic acid 4500 ⁇ g, CaCO3 30 g (based on 1 liter of distilled water).
  • CM05-9157 56.5 1.88 6.37 CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(C.gl) 56.3 1.89 6.38 CM05-9157 :: Pcj7ppsA(E.co) 56.1 1.9 6.40 CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(A.pa) 56.8 1.85 6.34 CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(K.xy) 52.1 2.35 7.52 CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(M.ac) 57.8 1.64 5.51
  • the tryptophan production of the CM05-9157 :: Pcj7-ppsA (C.gl) strain into which the phosphoenolpyruvate synthase gene from Corynebacterium glutamicum was introduced was 1.89 g/L, which was almost the same as the tryptophan production of the parent strain, CM05-9157.
  • CM05-9157 :: Pcj7-ppdK (K.xy) strain into which the pyruvate, phosphate dikinase gene from Komagataebacter xylinus was introduced produced a final L-tryptophan of 2.35 g/L in flask culture, confirming an approximately 18% increase in L-tryptophan productivity compared to the parent strain CM05-9157 and/or CM05-9157 :: Pcj7-ppsA (C.gl) strain.

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Abstract

본 출원은 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물; 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판의 생산 방법; 상기 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-트립토판 생산용 조성물; 및 상기 미생물의 L-트립토판 생산 용도에 관한 것이다.

Description

L-트립토판 생산 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법
본 출원은 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물; 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판의 생산 방법; 상기 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-트립토판 생산용 조성물; 및 상기 미생물의 L-트립토판 생산 용도에 관한 것이다.
미생물에서 목적 물질(예를 들어, 아미노산)을 생산하는 공정은 친환경적이고 안전한 생산 방법으로 다양한 연구가 진행되어 왔으며, 그 중 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 물질을 다량으로 생산하기 위한 연구가 지속적으로 이루어져 왔다. 코리네박테리움(Corynebacterium sp.) 속 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다.
L-트립토판(L-tryptophan)은 필수 아미노산의 하나로 사료 첨가제, 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔다. 이와 같은, L-트립토판은 화학 합성법, 효소 반응법, 발효법 등을 통해 생산될 수 있으나, 현재에는 미생물을 이용한 직접 발효법이 주로 이용되고 있다.
미생물은 L-트립토판 생합성 시 해당과정 (glycolysis)의 중간 물질인 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate, PEP)와 5탄당 인산 경로 (pentose phosphate pathway)의 생성물인 E4P (erythrose-4-phosphate)가 DAHP 신타제 (3-Deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate synthase, EC 2.5.1.54)에 의해 중합반응을 시작하는 방향족 생합성 경로를 가지고 있다. 선행 연구들에 따르면, 20개 아미노산 중 트립토판 생합성시 가장 높은 수준의 에너지를 필요로 하는 것이 세포 내 실제 정량 분석으로 증명된 바 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(2002) V99, pp3695-3700).
이에, 전구체인 E4P를 안정적으로 공급하기 위하여 트랜스케톨라제 (transketolase, EC 2.2.1.1)를 코딩하는 tktA 유전자(NCBI gene ID: 12931960)의 발현을 강화시켜 생합성을 증가시키는 방법이 연구된 바 있으며(Current Opinion in Biotechnology, (2009) V20, pp651-658), 세포내 에너지 수준을 유지시키기 위하여 고 에너지 물질인 ATP를 적게 사용하도록 하는 방향의 연구(FEMS Microbiol Lett, (2009)V297, pp217-224)가 진행된 바 있다.
그러나, 포도당신생합성(gluconeogenesis)은 일반적으로 영양소가 풍부한 배양환경에서는 활성이 매우 낮다고 알려져 있으며(J Bacteriol. 2013 Sep, 195(18), 4283-4296.; Nature Communications volume 8, Article number: 14316, 2017), 더욱이, L-트립토판의 생산 과정 중 아세트산과 같은 부산물의 생성으로 인해 트립토판 전구체인 포스포에놀 피루베이트의 양이 감소하여 L-트립토판의 생산이 감소한다는 문제점이 있다.
따라서, 효과적인 L-트립토판 생산능 증가를 위한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명자들은 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질(pyruvate, phosphate dikinase, PPDK) 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 코리네박테리움 속 미생물의 L-트립토판 생산능이 증가함을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 양태는 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
하나의 구체예에서, 상기 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
다른 하나의 구체예에서, 상기 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제는 ppdK 유전자에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 비변형 미생물과 비교하여 L-트립토판 생산능이 증가된 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 생산 방법을 제공한다.
하나의 구체예에서, 상기 방법은 상기 배양된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 상기 배양 배지에서 L-트립토판을 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물; 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-트립토판 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물; 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 조성물의 L-트립토판 생산 용도를 제공한다.
본 출원의 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은, 고수율로 L-트립토판을 생산할 수 있어 L-트립토판의 공업적 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
정의
본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 관사("a", "an", 및 "the")는 달리 언급되지 않는 한 복수의 대상을 포함할 수 있다. 또한 달리 언급되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고 복수형 용어는 단수형을 포함할 수 있다. 또한 본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "제1, 제2, 제3,," "i), ii), iii),," 또는 "(a), (b), (c), (d),,"와 같은 기재는 각각의 구성을 구별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 용어가 방법, 용도 또는 분석의 단계(step)와 관련하여 사용되었을 경우 이들 용어는 연속적이거나 순서대로 수행되는 것을 의미하는 것이 아니며, 예를 들어, 이들 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간, 수 일, 또는 수 개월 간격을 두고 순차적, 역순, 또는 무작위적으로 수행될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "이루어지는(consisting of)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특정한 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소(들)의 비율이 총 100%인 것을 의미한다. 용어 "이루어지는" 이하에 기재되는 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소는 필수적이거나 의무적인 것일 수 있다. 예를 들어, "이루어지는" 이하에 오는 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소 외에, 다른 임의의 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소, 또는 필수적이지 않은 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소는 배제될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 본 출원에서 청구하는 대상의 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소가 불특정한 하나 이상의 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소의 존재에 실질적으로 영향을 받지 않는 경우, 상기 불특정한 하나 이상의 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소의 존재를 의미하며, 추가적인 하나 이상의 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소의 존재를 배제하지 않는다. 본 출원에서 "포함하는" 이하에 기재되는 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소는 필수적이거나 의무적인 것일 수 있으나, 일부 구체예에서는 다른 임의의 혹은 필수적이지 않은 특징, 단계, 성분 또는 그 외의 구성 요소를 더 포함할 수 있다.
단백질, 폴리펩티드
본 출원에서, 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 연속적인 아미노산 잔기의 폴리머 또는 올리고머를 의미한다. 본 출원에서, "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
또한, 경우에 따라, "활성을 나타내는 아미노산 서열"은 상기 "폴리펩티드", "단백질" 또는 "펩티드"를 의미할 수 있으며,
상기 "폴리펩티드", "단백질", "펩티드" 및 "활성을 나타내는 아미노산 서열"이 촉매 활성을 가지는 경우, "효소"로 지칭할 수 있다.
본 츨원에서, 용어 "성숙 폴리펩티드(mature polypeptide) 또는 성숙 단백질(mature protein)"은 신호 서열(signal sequence) 또는 프로펩티드 서열(propeptide sequence)이 없는 형태의 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 성숙 폴리펩티드 또는 성숙 단백질은, 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 형태일 수 있다. 성숙 폴리펩티드 또는 성숙 단백질은 번역 후; 및/또는 번역 후 변형(posttranslational modification) 후;의 최종 형태(final form)의 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 상기 번역 후 변형의 예시로는 N-말단 처리(N-terminal processing), C-말단 절단(C-terminal truncation), 글리코실화(glycosylation), 인산화(phosphorylation), 리더 서열(leader sequence) 제거 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서 아미노산 서열은 달리 표시되지 않는 한, N-말단 → C-말단 배향으로 기재된다.
본 출원에서 아미노산 서열과 관련하여, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드 또는 단백질, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 "이루어진" 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "갖는" 폴리펩티드 또는 단백질에는 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 아미노산(들)이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 폴리펩티드 또는 단백질도 포함될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 또는 단백질에는 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 폴리펩티드 또는 단백질 서열 내부나 앞뒤(N-말단 또는 C-말단)에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 부가나 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 폴리펩티드 또는 단백질도 포함될 수 있다.
예를 들어, 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질(폴리펩티드)의 이동(translocation)에 관여하는 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트된 폴리펩티드 또는 단백질이나, 폴리펩티드 또는 단백질을 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트된 폴리펩티드 또는 단백질 또한 상기 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열의 폴리펩티드 또는 단백질의 범위에 포함될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들어, 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘; 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산; 비극성 곁사슬(nonpolar side chain)을 갖는 아미노산(비극성 아미노산)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린; 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 곁사슬을 갖는 아미노산(극성 아미노산)은 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민이 속하는 것으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 전하를 띠는 곁사슬을 가지는 아미노산인(electrically charged amino acid) 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산과, 전하를 띠지 않는 곁사슬을 갖는 아미노산(uncharged amino acid; neutral amino acid로도 지칭)인 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 방향족 아미노산(aromatic amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 발린, 류신, 이소류신은 분지쇄 아미노산(branched amino acid)으로 분류할 수 있다. 다른 일 예로, 20종 아미노산을 크기에 따라 분류하여 상대적으로 부피(volume)가 작은 아미노산 그룹부터 글리신, 알라닌, 세린; 시스테인, 프롤린, 쓰레오닌, 아스파르트산, 아스파라긴; 발린, 히스티딘, 글루탐산, 글루타민; 이소류신, 류신, 메치오닌, 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신의 5군으로 분류할 수 있다. 그러나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 통상적으로, 보존적 치환은 폴리펩티드 또는 단백질의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
유전자, 폴리뉴클레오티드
본 출원에서 용어, "유전자(gene)"는 기능적 분자(functional molecule)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드의 앞뒤의 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미하거나, 또는 기능적 RNA (functional RNA)를 의미한다. 일부 구체예에서, 유전자는 각각의 코딩 영역(엑손; exon) 사이에 삽입되는 서열(인트론; intron)을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드", "핵산" 또는 "핵산분자"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 가닥을 의미한다. 본 출원에서, "폴리뉴클레오티드", "핵산", 및 "핵산분자"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
동일성, 상동성
본 출원에서 용어, "동일성 (identity)" 또는 "상동성 (homology)" 은 두 개의 주어진 아미노산 또는 염기 서열간의 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 출원에서, "상동성" 및 "동일성"은 종종 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되거나 또는 Smith-Waterman 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482)과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 적절한 혼성화 조건하에서 써던 혼성화(hybridization) 실험에 의해 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내의 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 폴리뉴클레오티드 서열은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 혼성화(hybridization) 할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 혼성화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 혼성화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 혼성화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건일 수 있다.
상기 혼성화는 두 개의 뉴클레오티드가 상보적 서열일 것을 요구하나, 혼성화된 폴리뉴클레오티드들은 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 일부 미스매치(mismatch)를 포함할 수 있다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 유사한 염기 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
핵산 구조체, 벡터, 형질전환
본 출원에서 용어, "핵산 구조체(nucleic acid construct)"는, 하나 이상의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하고, 인위적으로 합성되거나, 자연계에 존재하지 않는 방법으로 특정 서열을 포함하도록 조작되거나, 자연으로부터 분리된 단일 혹은 이중가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 또는 숙주세포 내로 목적 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위한 DNA 제조물을 의미한다. 일 예로 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포(미생물) 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pDC계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 일 예로, pDZ, pDC, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일 예로, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 목적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포(미생물) 내에 도입하여 숙주세포(미생물)의 유전 형질을 변화시키는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포(미생물)의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 도입 목적에 따라 적절한 형태로 도입될 수 있다. 예를 들면, 목적 폴리펩티드를 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포(미생물)에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포(미생물)에 도입되어 숙주세포(미생물)에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 제어하도록 조절 서열이 적절한 위치에 배치되는 구성을 의미한다. 따라서 "작동가능하게 연결된"은, 프로모터, 종결자, 신호 서열 또는 인핸서 영역과 같이 알려진 혹은 원하는 활성을 가진 기능적 도메인의 조절 영역이 타겟(유전자 또는 폴리펩티드)의 발현, 분비 또는 기능을 상기의 알려진 혹은 원하는 활성에 따라 조절할 수 있도록 그 타겟에 부착되거나 연결된 것을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다.
본 출원에서 용어, "발현"은 폴리펩티드의 생성에 관여하는 임의의 단계, 예를 들어 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "발현 벡터"는 목적 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 발현을 위해 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 선형 혹은 환형 핵산 분자를 의미한다. 예를 들어, 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "조절 서열(regulatory sequence)"은 목적 폴리뉴클레오티드 서열의 발현의 조절에 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 각각의 조절 서열은 코딩 서열에 대해 천연형이거나(기원이 동일함) 또는 외래(foreign; 다른 유전자에서 유래함) 서열, 또는 이들의 변이 서열이거나 다른 인공적 서열일 수 있다. 상기 조절 서열의 예시는 리더 서열(leader sequence), 폴리아데닐레이션 서열(polyadenylation sequence), 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 번역 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 조절 서열의 최소 단위는 프로모터, 전사 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "유전자 재조합"은 DNA나 RNA와 같이 유전자를 이루는 요소가 해체와 재조립 과정에서 원래의 서열과는 다르게 뒤바뀌는 자연적 또는 인위적 과정을 의미한다.
본 출원에서 용어, "재조합 유전자"는 화학적 합성 또는 유전 공학 기술 등 유전자 재조합의 결과로 발생하는 새로운 유전체 구성을 갖는 유전자를 의미한다. 본 출원에서 용어, "재조합 유전자", "재조합 DNA" 및 "재조합 폴리뉴클레오티드" 는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일 예로, 상기 재조합 유전자는 천연에서 함께 발견되지 않는 조절 서열과 같은 핵산 단편의 인위적인 조합을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "재조합 단백질"은 유전자 재조합의 결과로 생산된 단백질을 의미한다.
미생물
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 원핵 또는 진핵 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 증가되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 증가된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다. 본 출원에서 용어, "미생물", "균주", "숙주", 및 "숙주세포"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "재조합 미생물"은 유전적으로 변형되어 , 자연 발생 미생물과 비교하여 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타내는(예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열 코딩에 영향을 미칠 때) 미생물로서, 상기 미생물의 자손 또는 잠재적 자손을 모두 포함할 수 있다. 본 출원에서 용어, "재조합 미생물", "유전자 변형된 미생물", "재조합 숙주세포", "재조합 세포" 및 "재조합 균주"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 재조합 미생물은 예를 들어, 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나; 천연 형태 내에서 발현되는 유전자를 발현하지 않거나 또는 천연 형태 내에서 발현되는 것과는 다른 양상으로 천연 유전자를 발현할 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 미생물은 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 미생물(예컨대, 재조합 미생물)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "L-트립토판 생산능을 가지는 미생물"은 L-트립토판 을 생물체 내에서 생산할 수 있는 미생물로서, 내재적으로　L-트립토판　생산능이 없으나 L-트립토판 의 생산능이 부여된 미생물, 또는 내재적으로 L-트립토판　생산능을 갖는 미생물을 모두 포함할 수 있다.　L-트립토판　생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물(균주)"은 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 미생물(균주)을 제외하는 것이 아니며, 야생형 미생물(균주) 또는 천연형 미생물(균주) 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 미생물(균주)을 의미할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "비변형 미생물(균주)"은 "변형 전 미생물(균주)", "비변이 미생물(균주)", "모미생물", "모균주", "야생형 미생물(균주)", "참조 미생물(균주) " 또는 "기준 미생물(균주)"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 출원에서 비변형 미생물은 본 출원의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되지 않거나, 도입되기 전의 미생물(균주)을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원에서 비변형 미생물은 서열번호 1로 이루어진 폴리펩티드 또는 서열번호 2로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단백질(폴리펩티드) 활성의 증가
본 출원에서 용어, 단백질(폴리펩티드) 활성의 "증가(increase)"는, 숙주세포(미생물)내에서 단백질(폴리펩티드)의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 증가는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 강화(enhancement) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 상기 숙주세포(미생물)는 원핵 또는 진핵 미생물일 수 있다.
상기 단백질(폴리펩티드) 활성의 증가는 숙주세포(미생물)가 내재적으로 가지고 있지 않았던 단백질(폴리펩티드) 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 단백질(폴리펩티드) 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 "내재적으로 가지고 있지 않았던 단백질(폴리펩티드) 활성을 나타내게 되는 것" 또는 향상된 단백질(폴리펩티드) 활성을 나타내게 되는 것은 "단백질(폴리펩티드)의 도입"에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, 단백질(폴리펩티드)의 "도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 유전자가 그 미생물내에서 발현됨에 따라 특정 단백질의 활성을 나타나게 되는 것 또는 해당 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 폴리펩티드 활성이 강화, 증가 또는 향상되는 것을 의미한다. 예를 들어, 숙주세포(미생물)내로의 상기 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 특정 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포(미생물) 내 염색체로 도입되거나, 특정 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 숙주세포(미생물) 내로 도입되어 이의 활성이 나타나거나 향상되는 것일 수 있다.
상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변환 전 숙주세포(미생물) 또는 비변형 숙주세포(미생물)가 본래 가지고 있던 특정 단백질(폴리펩티드)의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다.
단백질(폴리펩티드)의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가한다는 것은, 숙주세포(미생물)의 단백질(폴리펩티드)의 활성 및/또는 농도(발현량)가 형질 변환 전 숙주세포(미생물) 또는 비변형 숙주세포(미생물)가 본래 가지고 있던 상기 단백질(폴리펩티드)의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
일 예로, 상기 증가는 상응하는 단백질(폴리펩티드)의 활성이 없던 것이 나타나거나, 또는 이의 활성 또는 농도가 형질 변환 전 숙주세포(미생물) 또는 비변형 숙주세포(미생물)에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 약 1 % 이상, 약 10 % 이상, 약 25 % 이상, 약 50 % 이상, 약 75 % 이상, 약 100 % 이상, 약 150 % 이상, 약 200 % 이상, 약 300 % 이상, 약 400 % 이상 또는 약 500 % 이상, 최대 약 1000 % 또는 약 2000 % 이상까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질(폴리펩티드)의 활성의 증가는 외래의 단백질(폴리펩티드)을 도입하거나, 내재적인 단백질(폴리펩티드)의 활성 증가를 통해 달성할 수 있다. 상기 단백질(폴리펩티드)의 활성의 증가 여부는 해당 단백질(폴리펩티드)의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질(폴리펩티드) 활성에 기인한 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 단백질(폴리펩티드)의 활성의 증가는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으며, 목적 단백질(폴리펩티드)의 활성을 변형전 숙주세포(미생물)보다 증가시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 단백질(폴리펩티드)의 활성의 증가는
1) 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역의 변형(예를 들어, 발현조절영역 내 변이 도입, 더욱 강한 활성을 갖는 서열로의 교체, 또는 더욱 강한 활성을 갖는 서열 삽입);
3) 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 영역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 단백질(폴리펩티드) 활성이 증가되도록 상기 단백질(폴리펩티드)의 아미노산 서열의 변형;
5) 단백질(폴리펩티드) 활성이 증가되도록 상기 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 단백질(폴리펩티드)의 활성이 증가되도록 변형된 단백질(폴리펩티드)을 코딩하도록 상기 단백질(폴리펩티드) 코딩 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 단백질(폴리펩티드)의 활성을 나타내는 외래 단백질(폴리펩티드) 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 단백질(폴리펩티드)의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합에 의한 것일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예를 들어,
상기 1) 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 숙주세포(미생물) 내로 도입된 것일 수 있다. 또는, 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 상기 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포(미생물) 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입된 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포(미생물) 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포(미생물) 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다. 상기 조절 서열은 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 천연형이거나(기원이 동일함) 또는 외래(foreign; 다른 유전자에서 유래함) 서열, 또는 이들의 변이 서열이거나 다른 인공적 서열 일 수 있으며 숙주세포(미생물) 내에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있다.
상기 2) 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로의 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 증가하도록 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 도입, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 유전자의 개시코돈 또는 5'-UTR을 코딩하는 영역의 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 단백질(폴리펩티드) 발현율이 더 높은 다른 개시코돈이나, 내재적 RBS(ribosome binding site) 서열에 비해 단백질(폴리펩티드)의 발현율이 더 높은 RBS 서열을 코딩하도록 하는 변형일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 단백질(폴리펩티드)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 단백질(폴리펩티드)의 활성이 증가하도록 상기 단백질(폴리펩티드)의 아미노산 서열 또는 상기 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 도입, 또는 활성이 증가하도록 변형된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 교체는 예를 들어 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 단백질(폴리펩티드)의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 단백질(폴리펩티드)과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포(미생물) 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질(폴리펩티드)과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질(폴리펩티드)이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 단백질(폴리펩티드)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포(미생물) 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포(미생물) 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 단백질(폴리펩티드)의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 단백질(폴리펩티드)의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 단백질(폴리펩티드) 활성의 증가는, 상응하는 단백질(폴리펩티드)의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형 전 숙주세포(미생물)에서 발현된 단백질(폴리펩티드)의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질(폴리펩티드) 활성에 기인한 산물의 양이 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합(homologous recombination) 을 이용한 방법이나 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)를 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
배양
본 출원에서, 용어 "배양"은 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 예를 들어, 코리네박테리움 속 미생물에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올; 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃ 를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 용어 "배양물"이란 특정 미생물을 배양 배지에서 배양하여 수득한 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하며, 상기 배양액은 특정 미생물을 포함하는 것을 의미하고, 상기 배양 여과액은 특정 미생물을 실질적으로(여기서, 실질적으로는 여과등에 의해 분리되는 특정 미생물을 배제한다는 것을 의미하는 것으로서 여과액에 미생물이 완전히 배제된다는 것을 의미하지는 않는다.) 포함하지 않는 것을 의미한다. 상기 배양물은 그 제형이 제한되지 아니하고, 일 예로 액체, 에멀젼, 또는 고체일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "발효"는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시키는 과정 중 부패반응이 아닌 것을 의미한다. 발효 반응과 부패 반응은 비슷한 과정에 의해 진행되지만, 분해 결과 유용한 물질이 만들어지면 발효라 하고 악취가 나거나 유해한 물질이 만들어지면 부패라고 한다.
본 출원에서 상기 미생물로부터 발효물을 수득하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야 또는 유사 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수득할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "발효물"은 발효된 물질 자체뿐만 아니라, 발효된 미생물을 포함하는 물질, 발효된 미생물로부터 발생한 배양물, 배양물의 발효물, 농축 발효물, 발효물의 건조물, 발효물 여과액, 농축 발효물 여과액, 또는 발효물 여과액의 건조물, 발효물의 추출물 또는 발효물의 희석액 등, 상기 미생물로부터 발생한 발효물을 포함하는 모든 종류의 물질을 포함한다.
본 출원의 구체적 설명
이하, 본 출원의 구체예를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 출원의 하나의 양태는 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "피루베이트, 포스페이트 디키나제(pyruvate, phosphate dikinase, PPDK)"는 [ATP + 피루베이트 + 포스페이트 ↔ 포스포에놀피루베이트(PEP) + 디포스페이트] 반응을 촉매하는 트란스퍼라제의 패밀리 중의 한 효소를 의미한다. 본 출원의 피루베이트, 포스페이트 디키나제는 PPDK로 혼용하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 피루베이트, 포스페이트 디키나제는 ppdk 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트, 포스페이트 디키나제 활성을 갖는 단백질일 수 있으나, 피루베이트, 포스페이트 디키나제에 상응하는 활성을 가지는 것이라면, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상기 ppdk 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트, 포스페이트 디키나제는 당업계에 공지되어 있으며, 상기 피루베이트, 포스페이트 디키나제의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 코마가테이박터 자일리너스(Komagataeibacter xylinus) 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 60% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 활성을 갖는 한, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열을 포함하더라도 상기 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 단백질이라면 상기 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질에 포함될 수 있다. 또한 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지며(essentially consisting of) 상기 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 단백질이라면 상기 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질에 포함될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 60% 이상의 상동성 (homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은, 예를 들어, 당업계에 공지된 코돈 정보에 기초하여 수득할 수 있다. 일 예로 상기 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질은 서열번호 2의 서열 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 염기 서열을 가지거나 포함하거나, 상기 염기 서열로 이루어지거나, 본질적으로 이루어질 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 서열번호 2의 염기 서열은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서, 본 출원에서, 상기 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(유전자)는 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드(유전자), 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드(유전자) 또는 ppdk와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 본 출원의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 본 출원의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 이의 축퇴성 서열(degenerated sequence)일 수 있다.
다른 예시로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2와 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 염기 서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2와 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 염기 서열로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드에는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 혼성화하여, 본 출원의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원의 목적상, 본 출원의 미생물은 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어, 목적하는 L-트립토판을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 미생물은 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써, L-트립토판　생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 L-트립토판 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 피루베이트, 포스페이트 디키나제의 내재적 활성을 가지거나, 피루베이트, 포스페이트 디키나제의 내재적 활성이 없는 비변형 미생물에 비하여 L-트립토판 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, L-트립토판 생산능을 가지는 미생물은 L-트립토판을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서,　내재적으로 L-트립토판　생산능을 갖는 미생물 또는 L-트립토판　생산능이 없는 모균주에 본 출원의 도입된 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질의 활성으로 인해 L-트립토판의 생산능이 부여된 미생물을 모두 포함할 수 있다.　L-트립토판　생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다.
본 출원의 미생물은 다양한 공지의 방법에 의해 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 미생물을 모두 포함할 수 있다.
일 예로, 본 출원의 L-트립토판 생산능을 가지는 재조합 미생물은 벡터를 통해 형질전환되어 본 출원의 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 코딩하는 외래 유전자, 구체적으로, 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 코딩하는 외래 유전자가 도입되어 L-트립토판을 생산할 수 있는 모든 미생물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 L-트립토판을 생산하는 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 도입된 미생물일 수 있다.
예를 들어, 상기 L-트립토판을 생산하는 미생물은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 2의 염기서열, 또는 서열번호 2의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;가 도입된 미생물일 수 있다.
일 예로, 본 출원의 L-트립토판 생산능이 증가된 미생물은 비변형 미생물과 비교하여 L-트립토판 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로, 상기 L-트립토판 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 비변형 미생물은 CM05-9157 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 L-트립토판 생산능이 증가된 미생물은 변이 전 모미생물(모균주) 또는 비변형 미생물의 L-트립토판 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 16% 이상, 약 17%이상 또는 약 18% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 45% 이하, 약 40% 이하, 약 35% 이하, 약 30% 이하, 약 25% 이하 또는 약 20% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모미생물(모균주) 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 L-트립토판 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모미생물(모균주) 또는 비변형 미생물에 비하여, L-트립토판 생산능이 약 1.1배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.16배 이상, 약 1.17배 이상 또는 약 1.18배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 약 2배 이하, 약 1.5배 이하, 약 1.4배 이하, 약 1.3배 이하 또는 약 1.2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의　L-트립토판　생산능을 갖는 미생물은 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는, 일 예로 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.) 및 노카디아 속(Norcardia sp.), 또는 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물과 효모일 수 있다. 더욱 구체적으로는, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 미생물로서, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물일 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속 미생물, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속 미생물, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 출원의 L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 천연의 야생형 미생물 자체, L-트립토판 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 증가시키거나 감소시켜 향상된 L-트립토판 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 외부 유전자의 활성을 도입 또는 증가시켜 향상된 L-트립토판 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 생산 방법을 제공한다.
본 출원의 방법에 있어서, 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-트립토판은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 출원의 L-트립토판 생산 방법은 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-트립토판 생산방법은, 상기 배양된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 상기 배양 배지에서 목적 물질, 구체적으로는 L-트립토판을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-트립토판을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적물질, 구체적으로는 L-트립토판을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-트립토판 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-트립토판 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 피루베이트, 포스페이트 디키나제, 도입 및 L-트립토판 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물; 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-트립토판 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 조성물은 L-트립토판 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 구체예로, 본 출원의 조성물에 존재하는 각 구성요소는 미생물학적으로 유효한 양, 또는 생산용 조성물에서 적절하게 존재할 수 있는 양으로 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물에서, 피루베이트, 포스페이트 디키나제, 도입 및 L-트립토판 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물의 L-트립토판 생산 용도를 제공한다.
본 출원의 용도에서, 피루베이트, 포스페이트 디키나제, 도입 및 L-트립토판 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 포스포에놀피루베이트 신타아제(Phosphoenolpyruvate synthase, ppsA) 또는 피루베이트, 포스페이트 디키나제(Pyruvate, phosphate dikinase, ppdK) 유전자 탐색 및 선별
gluconeogenesis 활성이 높은 포스포에놀피루베이트 신타아제 또는 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 선별하기 위해 문헌 조사 결과를 기반으로 1~3개의 carbon으로 구성된 탄소원을 이용하는 acetic acid bacteria, methanogen 유래의 생물들을 탐색하였다. 그 중 생산 균주에 적용 가능한 생물 안전도 (Biosafety level)와 확보 가능성을 고려하여 하기 표 1 과 같이 포스포에놀피루베이트 신타아제 또는 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 보유 하고 있는 것으로 예상되는 4종의 미생물을 선정하였다.
순서 균주 단백질 등록 번호 게놈 등록 번호 생물 안전도
1 Komagataeibacter xylinus WP_007399515.1 NZ_CP024644.1 1
2 Acetobacter pasteurianus subsp. ASC06387.1 NZ_CP021922.1 1
3 Methanosarcina acetivorans str. C2A WP_011023333.1 NZ_AE010299.1 1
4 Escherichia coli WP_000069375.1 NZ_CP084899.1 1
5 Corynebacterium glutamicum ATCC13869 WP_011013725.1 NZ_CP016335.1 1
실시예 2. 외래 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 도입한 L-트립토판 생산 미생물의 제작
실시예 2-1. 유전자 삽입을 위한 플라스미드의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내 트랜스포존 유전자 부위로, 상동성 재조합(Homologous recombination)에 의해 피루베이트, 포스페이트 디키나제 또는 포스포에놀피루베이트 신타아제의 유전자를 도입하기 위한 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍, 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 을 수행, 각각의 단편을 수득하였다. PCR은 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 이용하여, 95℃에서 4분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 50초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다. 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 11 HR1 F AATTCGAGCTCGGTACCCGATGGAACTACGAGACTG
서열번호 12 HR1 R TGACAATCACCGCATCCagtactGGATATTCGAGACAGCTT
서열번호 13 HR2 F GCTGTCTCGAATATCCagtactGGATGCGGTGATTGTCAG
서열번호 14 HR2 R GGTCGACTCTAGAGGATCCCCTAACCACGACGACTGCAA
상기의 PCR을 통해 증폭된 두 단편과 SmaI 제한효소로 절단된 형질전환용 벡터 pDCM2(대한민국 등록특허 제 10-2278000호)를 깁슨 어셈블리 방법(DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDCM2-△Tn로 명명하였다.
실시예 2-2. 코마가테이박터 자일리너스( Komagataeibacter xylinus ) 유래 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 도입한 코리네박테리움 속 미생물의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰에 코마가테이박터 자일리너스 (Komagataeibacter xylinus, K.xylinus) 유래 피루베이트, 포스페이트 디키나제(서열번호 1)를 코딩하는 유전자 ppdK(NZ_ CP024644.1, 서열번호 2)를 도입하기 위해 먼저 바이오닉스(주)의 유전자 합성 서비스를 이용하여 합성한 K.xylinus의 ppdK 유전자(서열번호 2)를 주형으로 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 ppdK 유전자를 증폭하였다.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 15 ppdK(K.xy)-F cgaaaggaaacactcATGACCAAATGGGTTTACAGC
서열번호 16 ppdK(K.xy)-R AATCACCGCATCCagtTCAGGCCGGGCTGGC
또한, Pcj7 프로모터를 확보하기 위하여, p117-cj7-gfp (US 7662943 B2)를 주형으로 하여 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 17 Pcj7-F TCTCGAATATCCagtagaaacatcccagcgctact
서열번호 18 Pcj7(K.xy)-R AACCCATTTGGTCATgagtgtttcctttcgttggg
이어서, 상기로부터 증폭된 K.xylinus 의 ppdK 유전자, Pcj7 프로모터 부위 및 ScaI 제한효소로 절단된 상기 실시예 2-1에서 제작한 pDCM2-△Tn를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppdK(K.xy)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
상기 제작된 pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppdK(K.xy)벡터를 트립토판 생산 균주인 CM05-9157 균주(대한민국 등록특허 제10-2278000호)에 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 Pcj7-ppdK(K.xy) 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 균주는 유전자가 삽입된 위치의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 19와 서열번호 20의 프라이머를 이용한 PCR 법과 시퀀싱을 통해 동정하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 19 Confirm-Pcj7-ppsA/ppdK-F AACAACACCACATCTACATC
서열번호 20 Confirm-Pcj7-ppsA/ppdK-R CAGCCTTTTCCAGCACCA
위와 같은 방법으로 수득한 균주를 CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(K.xy) 로 명명하였다.
실시예 2-3. Acetobacter pasteurianus subsp. 유래 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 도입한 코리네박테리움 속 미생물의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰에 Acetobacter pasteurianus subsp. 유래 피루베이트, 포스페이트 디키나제(서열번호 3)를 코딩하는 유전자(NZ_CP021922.1, 서열번호 4)를 도입하기 위해 먼저 바이오닉스(주)의 유전자 합성 서비스를 이용하여 합성한 Acetobacter pasteurianus subsp.의 pddK 유전자(서열번호 4)를 주형으로 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 ppdK 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 21 ppdK(A.pa)-F cgaaaggaaacactcATGCGCAATCTCCTCGGC
서열번호 22 ppdK(A.pa)-R GCTGACAATCACCGCATCCagtTCAGGCTTTTACGGCCTTG
또한, Pcj7 프로모터를 확보하기 위하여, p117-cj7-gfp (US 7662943 B2)를 주형으로 하여 서열번호 17과 서열번호 23의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 23 Pcj7(A.pa)-R GAGGAGATTGCGCATgagtgtttcctttcgttggg
이어서, 상기로부터 증폭된 Acetobacter pasteurianus subsp.의 ppdK 유전자, Pcj7 프로모터 부위 및 ScaI 제한효소로 절단된 상기 실시예 2-1에서 제작한 pDCM2-△Tn를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppdK(A.pa)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
이어서, 상기 제작된 pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppdK(A.pa)벡터를 트립토판 생산 균주인 CM05-9157 균주(대한민국 등록특허 제10-2278000호)에 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 Pcj7-ppdK(A.pa)유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 균주는 유전자가 삽입된 위치의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 19와 서열번호 20의 프라이머를 이용한 PCR 법과 시퀀싱을 통해 동정하였다.
위와 같은 방법으로 수득한 균주를 CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(A.pa) 로 명명하였다.
실시예 2-4. Methanosarcina acetivorans str. C2 A 유래 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 도입한 코리네박테리움 속 미생물 제작
코리네박테리움 글루타미쿰에 Methanosarcina acetivorans str. C2A 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제(서열번호 5)를 코딩하는 유전자(NZ_AE010299.1, 서열번호 6)를 도입하기 위해 먼저 바이오닉스(주)의 유전자 합성 서비스를 이용하여 합성한 Methanosarcina acetivorans str. C2A의 ppdK 유전자(서열번호 6)를 주형으로 서열번호 24 및 서열번호 25의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 ppdK 유전자를 증폭하였다.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 24 ppdK(M.ac)-F acgaaaggaaacactcATGCCTGGAGATAAAAACAAATACATC
서열번호 25 ppdK(M.ac)-R AATCACCGCATCCagtTCAGAGCTCCTTTTCAGTTTC
또한, Pcj7 프로모터를 확보하기 위하여, p117-cj7-gfp (US 7662943 B2)를 주형으로 하여 서열번호 17과 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 26 Pcj7(M.ac)-R TTTATCTCCAGGCATgagtgtttcctttcgttggg
이어서, 상기로부터 증폭된 Methanosarcina acetivorans str. C2A의 ppdK 유전자, Pcj7 프로모터 부위및 상기 실시예 2-1에서 제작한 ScaI 제한효소로 절단된 상기 실시예 2-1에서 제작한 pDCM2-△Tn를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppdK(M.ac)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
이어서, 상기 제작된 pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppdK(M.ac)벡터를 트립토판 생산 균주인 CM05-9157 균주(대한민국 등록특허 제10-2278000호)에 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 Pcj7-ppdK(M.ac)유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 균주는 유전자가 삽입된 위치의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 19와 서열번호 20의 프라이머를 이용한 PCR 법과 시퀀싱을 통해 동정하였다.
위와 같은 방법으로 수득한 균주를 CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(M.ac) 로 명명하였다.
실시예 2-5. Escherichia coli 유래 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 도입한 코리네박테리움 속 미생물 제작
코리네박테리움 글루타미쿰에 피루베이트 포스페이트 디키나제 유전자(ppdk)의 상동 유전자(ortholog)인 Escherichia coli 유래의 포스포에놀피루베이트 신타아제(서열번호 7)를 코딩하는 유전자 ppsA(NZ_CP084899.1, 서열번호 8)를 도입하기 위해
먼저 Escherichia coli W3110 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 27과 서열번호 28의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 ppsA 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 27 ppsA(E.co)-F aacgaaaggaaacactcATGTCCAACAATGGCTCG
서열번호 28 ppsA(E.co)-R AATCACCGCATCCagtTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGG
또한, Pcj7 프로모터를 확보하기 위하여, p117-cj7-gfp (US 7662943 B2)를 주형으로 하여 서열번호 17과 서열번호 29의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 29 Pcj7(E.co)-R GCCATTGTTGGACATgagtgtttcctttcgttggg
이어서, 상기로부터 증폭된 Escherichia coli의 ppsA 유전자, Pcj7 프로모터 부위및 ScaI 제한효소로 절단된 상기 실시예 2-1에서 제작한 pDCM2-△Tn를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppsA(E.co)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
이어서, 상기 제작된 pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppsA(E.co)벡터를 트립토판 생산 균주인 CM05-9157 균주(대한민국 등록특허 제10-2278000호)에 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 Pcj7-ppsA(E.co) 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 균주는 유전자가 삽입된 위치의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 19와 서열번호 20의 프라이머를 이용한 PCR 법과 시퀀싱을 통해 동정하였다.
위와 같은 방법으로 수득한 균주를 CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(E.co) 으로 명명하였다.
실시예 2-6. Corynebacterium glutamicum ATCC13869 유래 피루베이트, 포스페이트 디키나제를 도입한 도입된 코리네박테리움 속 미생물 제작
코리네박테리움 글루타미쿰에 피루베이트 포스페이트 디키나제 유전자(ppdk)의 상동 유전자(ortholog)인 Corynebacterium glutamicum ATCC13869 유래의 포스포에놀피루베이트 신타아제(서열번호 9)를 코딩하는 유전자 ppsA (NZ_CP016335.1, 서열번호 10)를 도입하기 위해피루베이트
먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 30과 서열번호 31의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 ppsA 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합 반응하는 조건으로 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 30 ppsA(C.gl)-F caacgaaaggaaacactcATGACCAACAGTTTGAACATCC
서열번호 31 ppsA(C.gl)-R ACAATCACCGCATCCagtTTACTTCGTGCCGGTCATTG
또한, Pcj7 프로모터를 확보하기 위하여, p117-cj7-gfp (US 7662943 B2)를 주형으로 하여 서열번호 17과 서열번호 32의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.)를 사용하였으며, PCR증폭 조건은 95 ℃에서 2분간 변성 후, 95℃ 20초 변성, 60℃ 40초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 27회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 32 Pcj7(C.gl)-R CAAACTGTTGGTCATgagtgtttcctttcgttggg
이어서, 증폭된 Corynebacterium glutamicum ATCC13869의 ppsA 유전자, Pcj7 프로모터 부위및 ScaI 제한효소로 절단된 상기 실시예 2-1에서 제작한 pDCM2-△Tn를 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppsA(C.gl)로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
이어서, 상기 제작된 pDCM2-△Tn:: Pcj7-ppsA(C.gl)벡터를 트립토판 생산 균주인 CM05-9157 균주(대한민국 등록특허 제10-2278000호)에 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545)으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 트랜스포존 유전자의 사이에 1 카피의 Pcj7-ppsA(C.gl) 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 균주는 유전자가 삽입된 위치의 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 19와 서열번호 20의 프라이머를 이용한 PCR 법과 시퀀싱을 통해 동정하였다.
위와 같은 방법으로 수득한 균주를 CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(C.gl) 로 명명하였다.
실시예 3. 외래 피루베이트, 포스페이트 디키나제 유전자 또는 이의 상동 유전자(ortholog)를 도입한 L-트립토판 생산 미생물의 L-트립토판 생산능 평가
상기 실시예 2-2, 2-3, 2-4, 2-5 에서 각각 제작한 CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(K.xy), CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(A.pa), CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(M.ac), CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(E.co) 균주;와 외래 유전자가 도입되지 않은 모균주 CM05-9157 및 실시예 1-6에서 제작한 CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(C.gl) 균주;의 L-트립토판 생산능을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 배양하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-트립토판의 생산량을 측정하였다. 상기 종배지 및 생산배지의 조성은 다음과 같으며, 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-트립토판 농도는 하기 표 14에 나타내었다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준).
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 30g, (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
OD562 트립토판 생산량 (g/L) 트립토판 수율
(*100 g/g, %)
CM05-9157 56.5 1.88 6.37
CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(C.gl) 56.3 1.89 6.38
CM05-9157 :: Pcj7ppsA(E.co) 56.1 1.9 6.40
CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(A.pa) 56.8 1.85 6.34
CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(K.xy) 52.1 2.35 7.52
CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(M.ac) 57.8 1.64 5.51
그 결과, 상기 표 14에 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 포스포에놀피루베이트 신타아제 유전자가 도입된 CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(C.gl) 균주의 트립토판 생산량은 1.89 g/L로 모균주인 CM05-9157 균주의 트립토판 생산량과 거의 동일함을 확인하였다.
또한, 다양한 미생물 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 유전자 또는 이의 상동 유전자(ortholog)인 포스포에놀피루베이트 신타아제 유전자 중에서 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 유전자가 도입된 CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(K.xy) 균주에서만 플라스크 배양에서 최종 2.35 g/L 의 L-트립토판을 생산하여, 모균주 CM05-9157 및/또는 CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(C.gl) 균주에 비해 약 18% L-트립토판 생산능이 증가한 것을 확인하였다.
반면, 코마가테이박터 자일리너스 유래 외의 외래 포스포에놀피루베이트 신타아제 또는 피루베이트, 포스페이트 디키나제가 도입된 3종의 균주(CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(A.pa), CM05-9157 :: Pcj7-ppdK(M.ac), CM05-9157 :: Pcj7-ppsA(E.co))는 대조군인 CM05-9157에 대비하여 오히려 소폭 트립토판 생산이 감소하거나 증가 폭이 상대적으로 미미함을 확인하였다.
이와 같은 결과는, 코리테박테리움 속 미생물에 특정 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 유전자가 도입된 경우만이 특이적으로 L-트립토판 생산능을 증가시킬 수 있음을 의미한다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제는 서열번호 1 또는 이와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제는 ppdK 유전자에 의해 코딩되는 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 비변형 미생물과 비교하여 L-트립토판 생산능이 증가된 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배양된 미생물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 상기 배양 배지에서 L-트립토판을 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
  8. 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물; 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-트립토판 생산용 조성물.
  9. 코마가테이박터 자일리너스 유래의 피루베이트, 포스페이트 디키나제 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된, L-트립토판 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물; 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 발효물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 조성물의 L-트립토판 생산 용도.
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