WO2024237210A1 - グルコース経路活性化による膵島細胞の増殖活性化 - Google Patents

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WO2024237210A1
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islet
glucose
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泰広 山田
利忠 平野
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University of Tokyo NUC
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for sustaining and promoting the proliferation of pancreatic islet cells into which the Mycl gene or its gene product has been introduced or whose expression has been induced, by regulating a pathway activated by glucose.
  • the medical expenses for diabetes and its complications worldwide are estimated at 90 trillion yen per year, and the pressure on medical expenses has become a major social issue. Diabetes can cause complications such as retinopathy, neuropathy, and kidney damage, and in the final stages, artificial dialysis may be necessary.
  • diabetes can cause complications such as retinopathy, neuropathy, and kidney damage, and in the final stages, artificial dialysis may be necessary.
  • blood sugar control is particularly poor, with repeated episodes of severe hypoglycemia that can lead to coma or death.
  • the onset of severe hypoglycemia can lead to aftereffects of brain damage, including dementia, and a worsening prognosis, so avoiding the onset of severe hypoglycemia is an important clinical issue.
  • the mainstream treatment for diabetes is symptomatic treatment, such as administering drugs that suppress sugar absorption and insulin preparations, and most of these do not treat the diabetes itself.
  • pancreas transplantation and islet transplantation have been performed, and remarkable effects have been observed, such as suppressing the onset of severe hypoglycemia, as well as achieving insulin weaning and good glycemic control.
  • pancreas transplantation and islet transplantation are not offered as a treatment option for early intervention for patients who simply have a history of severe hypoglycemia, high-risk groups with depleted insulin secretion, or even ordinary type I diabetes patients.
  • the present invention aims to provide a method for sustaining the proliferation of mature islet cells by the Mycl gene, enabling continuous induction of proliferation.
  • the inventors discovered that it is possible to proliferate islet cells and expand mature islet cells over the long term by regulating pathways activated by glucose, such as activating the proliferation of mature islet cells by the Mycl gene in a glucose concentration-dependent manner, activating the proliferation of mature islet cells by the Mycl gene with a glucokinase activator, and repeating short-term stimulation with high concentrations of glucose, and thus completed the present invention.
  • the present invention has the following aspects.
  • [1] A method for promoting and/or sustaining the proliferation activity of pancreatic islet cells into which a Mycl gene or its gene product has been introduced or whose expression has been induced, by using an activator of a glucose-stimulated activation pathway.
  • the glucose-stimulated activation pathway activator is at least one selected from the group consisting of glucose, sucrose, and glucokinase activators.
  • the Mycl gene is The method according to [1] or [2], comprising: (1) a nucleic acid comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; or (2) a nucleic acid encoding a polypeptide that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and has the function of sustaining and/or promoting the proliferation activity of pancreatic islet-like cells in a glucose concentration-dependent manner when expression of the Mycl gene is induced.
  • the Mycl gene product is The method according to [1] or [2], comprising: (1) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4; or (2) a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having the function of sustaining and/or promoting the proliferation activity of pancreatic islet-like cells in a glucose concentration-dependent manner.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the Mycl gene is transiently expressed.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein high and low concentrations of glucose are applied alternately.
  • pancreatic islet cells are primary pancreatic islet cells isolated from the pancreas, cultured pancreatic islet cells, or stem cell-derived islet cells.
  • stem cells are selected from the group consisting of iPS cells, ES cells, and somatic stem cells.
  • pancreatic islet cells are proliferated and the proliferation activity of pancreatic islet-like cells is maintained for a long period of time, making it possible to treat diabetes or related diseases in which insulin production is desired.
  • 1 shows the activation of proliferation of Mycl-induced islet cells in a test by glucose.
  • 1 shows glucose concentration-dependent activation of proliferation of Mycl-induced pancreatic islet cells.
  • 1 shows changes in the proliferation efficiency of Mycl-induced pancreatic islet cells by glucokinase activator (GKA).
  • GKA glucokinase activator
  • 1 shows the change in proliferation efficiency of Mycl-induced pancreatic islet cells by glucokinase inhibitors (GKIs).
  • GKIs glucokinase inhibitors
  • 1 shows the activation of proliferation of Mycl-induced pancreatic islet cells in vivo by glucose.
  • 1 shows a decrease in the proliferation activity of Mycl-induced pancreatic islet cells under culture conditions with high glucose concentration.
  • 1 shows sustained proliferation activity of Mycl-induced pancreatic islet cells by high-low glucose treatment.
  • 1 shows sustained proliferation activity of Mycl-induced pancreatic islet cells by high-low glucose treatment. 1 shows that expression of Mycl gene promotes the proliferation of mature hormone-producing cells. 1 shows efficient induction of ⁇ -cell proliferation by coordination of Mycl gene expression and glucose. 1 shows recovery of diabetic mice by long-term culture of pancreatic islet cells.
  • the present invention relates to a method for sustaining and/or promoting the proliferation activity of pancreatic islet cells (hereinafter sometimes referred to as "pancreatic islet-like cells") into which the Mycl gene or its gene product has been introduced or whose expression has been induced, in a glucose concentration-dependent manner.
  • pancreatic islet-like cells pancreatic islet cells
  • Islet-like cells and preparation method thereof (1) Islet-like cells and preparation method thereof
  • Islet-like cells refers to mature islet cells into which the Mycl gene or its gene product has been introduced.
  • islet-like cells that have been forced to express the Mycl gene and have transitioned to the proliferation phase may be referred to as “islet precursor cell-like cells”.
  • the cells can be differentiated into islet cells including cells with insulin production ability (hereinafter also referred to as "insulin-producing cells”). That is, according to the present invention, the number of islet-like cells can be increased by transient expression of the Mycl gene, and the cells can be differentiated into islet cells including insulin-producing cells.
  • the “islet precursor cell-like cells” are positive for at least one, preferably two, more preferably three or more of the genes selected from, for example, Fev, Pax4, Cck, CDK4, and Ki67.
  • the islets are also characterized in that, in particular, insulin and glucagon production is reduced compared to that observed in normal pancreatic islets, and somatostatin production is prominent.
  • Pancreatic islet cells are generally referred to as islets of Langerhans, and refer to endocrine cells that make up about 1-2% of the total cells in the pancreas, which are a cell aggregate called a pancreatic islet that controls the endocrine function of the pancreas.
  • pancreatic islet cells is used interchangeably with “mature pancreatic islet cells”.
  • pancreatic islet cells are mainly composed of five types of cells, namely ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, and PP cells.
  • the main cells that make up the cell aggregate called a pancreatic islet are ⁇ cells.
  • ⁇ cells make up about 60-80% of pancreatic islet cells and secrete insulin, which allows glucose to be transferred to most cells in the body.
  • ⁇ cells make up about 10-30% of pancreatic islets and secrete glucagon, which is released during starvation, which breaks down glycogen stored in the liver to allow glucose to be released into the blood in order to maintain normal blood sugar.
  • ⁇ cells make up about 5-10% of pancreatic islet cells and secrete somatostatin, which further regulates glucose concentration.
  • ⁇ -cells and PP-cells secrete ghrelin and pancreatic polypeptide, respectively.
  • Pancreatic polypeptide-producing cells (approximately 5-10% of the islet cells) release hormones that alter exocrine and gastrointestinal function.
  • islet cell types including endothelial cells, neural cells, and progenitor cells.
  • pancreatic islet cells include the above-mentioned pancreatic islet cells and pancreatic islet precursor cells, which are precursor cells of pancreatic islet cells, and may be intermediate cells that arise during the process of development into pancreatic islet cells or during the process of differentiation induction from somatic stem cells/pluripotent stem cells before reaching pancreatic islet cells or pancreatic islet precursor cells.
  • intermediate cells are preferably cells that are destined to differentiate into pancreatic islet cells.
  • pancreatic islet cells may be those prepared from pancreatic islet-like cells or pancreatic islet precursor cell-like cells into which the Mycl gene or its gene product has been introduced.
  • type I diabetes cellular infiltration of the pancreatic islets, mainly composed of lymphocytes, is observed shortly after the onset of the disease. Eventually, as beta cells are selectively lost, the volume of the islets decreases and alpha cells become predominant. Although the islets have a reserve capacity for insulin secretion, type I diabetes develops when the beta cells are lost and the necessary amount of insulin can no longer be secreted. On the other hand, in type II diabetes, it is common for morphological changes in the islets, such as a marked decrease in the number of beta cells, to not be observed. In type II diabetes, the main cause of the disease is a decrease in the blood sugar regulating effect of insulin, caused by insulin resistance in peripheral tissues.
  • the origin or source of the islet cells into which the Mycl gene or its gene product is introduced is not limited, but may be primary islet cells isolated from an individual's pancreas, or islet cells cultured by a known culture method.
  • Cultured islet cells may include, but are not limited to, established islet cells, and islet cells derived from stem cells (e.g., iPS cells, ES cells, somatic stem cells) (see, for example, Kimura, A., et al., Cell Chemical Biology, 2020, doi.org/10.1016/j.chembiol.2020.08.018).
  • the islet cells into which the Mycl gene or its gene product is introduced may be islet cells obtained from islet-like cells and/or islet precursor-like cells, or the Mycl gene or its gene product may be repeatedly introduced into islet-like cells and/or islet precursor-like cells into which the Mycl gene has already been introduced.
  • the Mycl gene or its gene product may be repeatedly introduced into islet-like cells and/or islet precursor-like cells into which the Mycl gene has already been introduced.
  • islet cells collected from a donor or islet cells derived from stem cells can be preferably used.
  • the islet cells from the donor used may be either autologous or allogeneic to the recipient.
  • islet precursor-like cells can be grown in vitro and then returned (transplanted) to the patient, thereby treating diabetes.
  • the islet cells in cases where the islet cells are allogeneic to the patient, they can be used in combination with known methods such as administering an immunosuppressant to the patient as appropriate, matching the HLA type of the donor tissue to be transplanted with that of the recipient, embedding the donor tissue in alginic acid, alginic acid derivatives, semipermeable membranes, etc.
  • the above-mentioned islet-like cells, islet precursor cell-like cells, or cells capable of producing insulin, or any combination thereof can be used for transplantation into the patient.
  • pancreatic islets used as the source of islet cells before the Mycl gene is introduced may be islets that contain a large number of normal ⁇ cells, or may be islets from which the majority of the ⁇ cells have been lost.
  • the present invention can also be used in gene therapy for type I diabetes patients who have lost ⁇ cells, by using islet-like cells introduced with the Mycl gene.
  • Pluripotent stem cells refer to cells that have the ability to self-replicate and differentiate, and have the ability to form all the cells that make up a living organism.
  • Self-replicating ability refers to the ability of a single cell to create undifferentiated cells that are identical to itself.
  • Differenceentiation ability refers to the ability of a cell to differentiate. Examples of pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), Muse cells (Multi-lineage differentiating Stress Enduring cells), spermatogonial stem cells (GS cells), and embryonic germ cells (EG cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Muse cells Multi-lineage differentiating Stress Enduring cells
  • GS cells spermatogonial stem cells
  • EG cells embryonic germ cells
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are preferably ES cells.
  • the origin of the pluripotent stem cells may be any of mammals, birds, fish, reptiles, and amphibians, and is not particularly limited. Mammals include primates (humans, monkeys, etc.), rodents (mice, rats, guinea pigs, etc.), cats, dogs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats, ferrets, and the like.
  • ES cells refers to pluripotent stem cells that have the ability to differentiate into all tissue cells that make up an individual, which exist in the early developmental stage, and which have been established to be cultured in vitro. ES cells, like pluripotent stem cells in early embryos, can be multiplied virtually indefinitely while retaining the ability to differentiate into all cells that make up an individual. Specifically, mouse ES cells were first described in 1981 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634-7638, 1981; Nature 292, 154-156, 1981). ES cells have pluripotency and can give rise to all tissue and cell types that make up an individual.
  • Pluripotent embryonic stem cells have been isolated from a wide variety of species, including rats (Iannaconns et al., Dev. Biol. 163, 288-292, 1994), hamsters (Dev. Biol. 127, 224-227, 1988), rabbits (Mol. Reprod. Dev. 36, 424-433, 1993), birds, fish, pigs (Reprod. Fertil. Dev. 6, 563-568, 1994), cows (Reprod. Fertil. Dev. 6, 553-562, 1994), and primates (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7844-7848, 1995).
  • ES cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, KH2 cells, RF8 cells, JI cells, CGR8 cells, MG1.19 cells, 129SV cells, C57/BL6 cells, DBA-1 cells, etc.
  • any established ES cell line can be used.
  • it is effective to create a cloned embryo using the individual's somatic cells and establish an ES cell line from it.
  • this method it is possible to establish ES cells that have the same genetic elements as the individual.
  • somatic cell clones a phenomenon known as "initialization" occurs, in which the nucleus of the somatic cell introduced into the egg changes to a state similar to that of the nucleus of a fertilized egg.
  • ES cells also have activity similar to that of eggs (Curr. Biol., 11, 1553-1558, 2001). In other words, it is expected that by fusing an individual's somatic cells with ES cells, it will be possible to convert somatic cells into cells similar to ES cells.
  • ES cells can be genetically manipulated in vitro, it is expected that by performing this with ES cells in which factors involved in immune rejection, such as the MHC gene group, have been manipulated in advance, it will be possible to avoid rejection reactions without using techniques such as the creation of somatic cell clone embryos.
  • iPS cells refers to cells with pluripotency similar to that of ES cells, obtained by introducing genes for transcription factors such as Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc into somatic cells. Like ES cells, iPS cells can also be multiplied indefinitely while retaining their pluripotency.
  • the basic method for producing iPS cells is to introduce the four transcription factors Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc into cells using a virus (Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126(4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131(5), 861-72, 2007).
  • Examples of cells that can be used to produce iPS cells include lymphocytes (T cells, B cells), fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, mucosal epithelial cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, adipose stem cells, dental pulp stem cells, and neural stem cells.
  • iPS cells can be performed by methods well known to those skilled in the art, and is outlined, for example, in Addgene's Blog/Post, "Delivery Methods for Generating iPSCs" (https://blog.addgene.org/delivery-methods-for-generating-ipscs).
  • Methods for introducing the Mycl gene into iPS cells include, but are not limited to, introduction methods using recombinant viruses (e.g., retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, Sendai viruses, etc.), recombinant plasmids, minicircles, or episomes (e.g., oriP/Epstein-Barr nuclear antigen-1 (EBNA1)-based episomal vectors), or methods for directly introducing RNA (including mRNA) encoding the Mycl gene or the Mycl protein itself into cells.
  • viruses e.g., retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, Sendai viruses, etc.
  • recombinant plasmids minicircles, or episomes
  • episomes e.g., oriP/Epstein-Barr nuclear antigen-1 (EBNA1)-based episomal vectors
  • RNA including mRNA
  • EG cells refer to any embryonic germline stem cell produced from a primordial germ cell, and there are no particular limitations on its origin.
  • GS cells refer to germline stem cells produced from testicular germ cells, and are a cell line that allows spermatogonial stem cells (spermatogonial stem cells) to be cultured outside the body (Cell. 119, 1001-1012, 2004). Of the GS cells, mGS cells (multipotent germline stem cells), which have properties similar to ES cells and also have pluripotency, are particularly preferred.
  • the Mycl (also called “L-Myc”) gene is one of the members of the Myc gene family, which includes the c-Myc gene and Mycn (the "N-Myc” gene).
  • the Mycl gene is an oncogene like the c-Myc gene, and is also known as an initialization gene.
  • the Mycl gene has almost no transformation ability (Nakagawa, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 107, p.14152-14157, 2010).
  • the mouse and human cDNA sequence information of Mycl are available under the NCBI accession numbers NM 008506 and NM
  • the cDNA can be obtained by reference to US Pat. No. 6,001,033,081, and a person skilled in the art can easily isolate the cDNA.
  • the base sequence of the Mycl gene can be identified by the NCBI accession number, but usable Mycl genes also include single-stranded or double-stranded DNA and its RNA complement.
  • DNA includes, for example, naturally occurring DNA, recombinant DNA, chemically synthesized DNA, DNA amplified by PCR, chemically modified DNA, and combinations thereof.
  • DNA is preferable as the nucleic acid used in the present invention. As is well known, there is degeneracy in codons, and there are amino acids for which multiple base sequences exist that code for one amino acid.
  • pancreatic islet cells i.e., pancreatic islet-like cells
  • pancreatic islet-like cells into which the Mycl gene has been introduced undergo cell proliferation due to the expression of the Mycl gene and have the effect of promoting insulin production due to the cessation of the expression.
  • the Mycl gene is (1) a nucleic acid comprising or consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3; or (2) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising or consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and that encodes a polypeptide having the function of sustaining and/or promoting the proliferation activity of pancreatic islet-like cells when the expression of the Mycl gene is induced; or (3) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising or consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and that has the effect of sustained proliferation of insulin-producing cells and, ultimately, the effect of sustained promotion of insulin production as a result of the proliferation of pancreatic islet-like cells into which the Mycl gene has been introduced.
  • under stringent conditions means hybridization under moderately or highly stringent conditions.
  • moderately stringent conditions can be easily determined by a person skilled in the art with ordinary skill in the art, for example, based on the length of the DNA.
  • the basic conditions are described in Sambrook, J.
  • the hybridization conditions as set forth in W.
  • nitrocellulose filters include the use of a pre-wash solution of 5x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), hybridization conditions of about 50% formamide, 2x SSC to 6x SSC (or other similar hybridization solutions, such as Stark's solution in about 50% formamide at about 42°C) at about 40-50°C, and wash conditions of 0.5x SSC, 0.1% SDS at about 60°C. Highly stringent conditions can also be readily determined by one of skill in the art based on, for example, the length of the DNA.
  • such conditions include hybridization and/or washing at higher temperatures and/or lower salt concentrations than moderately stringent conditions, and are defined as, for example, hybridization conditions as described above, with a wash at about 68° C., 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • temperature and wash solution salt concentration can be adjusted as necessary depending on factors such as the length of the probe.
  • Homologous nucleic acids cloned using the above-mentioned nucleic acid amplification reaction or hybridization have at least 30% identity to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3, respectively, preferably 50% identity, more preferably 70% identity, even more preferably 90% identity, even more preferably 95% identity, and most preferably 98% identity.
  • the percent identity can be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • the percent identity of two nucleic acid sequences can be determined by comparing sequence information using the GAP computer program (GCG Wisconsin Package, version 10.3) described in Devereux et al., Nucl. Acids Res., 12, 387 (1984) and available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG).
  • the gene product of the Mycl gene is a polypeptide expressed from the Mycl gene described above.
  • the polypeptide is (1) a polypeptide comprising or consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4; or (2) a polypeptide having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having the function of sustaining and/or promoting the proliferation activity of pancreatic islet-like cells in a glucose concentration-dependent manner.
  • the gene product of the Mycl gene may be a variant of the polypeptide defined above, and may be an amino acid sequence comprising one or more amino acid deletions, substitutions, insertions and/or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the substitution may be a conservative substitution, which is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics.
  • conservative substitutions include substitutions between aliphatic group-containing amino acid residues, such as substitutions between Ile, Val, Leu or Ala, substitutions between polar residues, such as substitutions between Lys and Arg, Glu and Asp, Gln and Asn, etc.
  • Mutants resulting from deletion, substitution, insertion and/or addition of amino acids can be created by subjecting the Mycl gene to, for example, the well-known technique of site-directed mutagenesis (e.g., Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487-6500, 1982).
  • site-directed mutagenesis e.g., Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487-6500, 1982.
  • “one or more amino acids” refers to amino acids that can be deleted, substituted, inserted and/or added by site-directed mutagenesis.
  • one or more amino acids may refer to one or several amino acids, depending on the circumstances.
  • methods for deleting, substituting, inserting and/or adding one or more amino acids to the amino acid sequence of a polypeptide while retaining its activity include a method of treating the gene with a mutagen and a method of selectively cleaving the gene, then removing, substituting, inserting or adding selected nucleotides, and then ligating.
  • the gene product of the Mycl gene in the present invention may be a polypeptide having an activity of promoting insulin production, which consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids, preferably 9 or less, 7 or less, 5 or less, 3 or less, 2 or less, and more preferably 1 or less amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the variant is further a protein comprising an amino acid sequence having at least 80% or more, preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more amino acid identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, and is a polypeptide having the effect of proliferating pancreatic islet-like cells and/or the effect of promoting insulin production.
  • the percent identity of two amino acid sequences may be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • the percent identity of two protein sequences may be determined by comparing sequence information using the GAP computer program based on the algorithm of Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol., 48:443-453, 1970) and available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG).
  • Preferred default parameters for the GAP program include: (1) Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992); (2) a gap weight of 12; (3) a gap length weight of 4; and (4) no penalty for end gaps.
  • the method of introducing the Mycl gene into primary islet cells, cultured islet cells, or stem cells is not particularly limited, and any method known to those skilled in the art can be used.
  • Gene introduction means generally include "transformation” or “transfection”, which means a transient or stable genetic change induced in a cell after incorporation of an exogenous nucleic acid (e.g., DNA or RNA foreign to a host cell).
  • an exogenous nucleic acid e.g., DNA or RNA foreign to a host cell.
  • the genetic change can be achieved by incorporating an exogenous nucleic acid into the genome of the host cell, or by maintaining the exogenous nucleic acid transiently or stably as an episomal component or independently.
  • the introduced Mycl gene may be in a state of being incorporated into the genome of the host cell, or may be present as an episomal component, or may be present in the cytoplasm as a plasmid or vector containing the gene, as long as the expression of the gene can be controlled to be on/off.
  • a "vector” is used to introduce exogenous nucleic acid (preferably DNA) into a host cell.
  • vectors include viruses, particularly attenuated viruses and/or replication-incompetent viruses.
  • examples of viral vectors include retroviral vectors, lentiviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, and Sendai virus vectors.
  • the vector may contain control sequences such as a promoter, enhancer, ribosome binding sequence, terminator, and polyadenylation site so as to enable expression of the exogenous nucleic acid.
  • a selection marker sequence such as a drug resistance gene (e.g., a kanamycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, a puromycin resistance gene, etc.), a thymidine kinase gene, a diphtheria toxin gene, a fluorescent protein, a reporter gene sequence such as ⁇ -glucuronidase (GUS), and FLAG.
  • a drug resistance gene e.g., a kanamycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, a puromycin resistance gene, etc.
  • a thymidine kinase gene e.g., a thymidine kinase gene, a diphtheria toxin gene, a fluorescent protein, a reporter gene sequence such as ⁇ -glucuronidase (GUS), and FLAG.
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • the "promoter” is also intended to include a promoter component sufficient for promoter-dependent gene expression that is cell type-specifically
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed by, but is not limited to, electroporation (Meiner, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:14041-14046 (1996) etc.), calcium phosphate method, DEAE-dextran method, or a method using lipids for gene introduction (lipofectamine, lipofectin etc.).
  • Cells into which the vector has been introduced can then be selected based on the characteristics of a marker gene (e.g., drug resistance gene). Correct homologous recombination in the selected cells can be confirmed by Southern blotting or the like using a part of the target exogenous nucleic acid as a probe. In this way, cells can be produced that are heterozygous for the target gene, specifically, a gene in which a marker gene has been knocked into the Mycl gene.
  • the KH2 strain As ES cells, the KH2 strain can be used, which has an Frt sequence downstream of the Cola1 locus and expresses the reverse tetracycline-regulated transactivator M2-rtTA under the control of the endogenous Rosa26 promoter (Beard C, et al., Genesis, vol. 44, p. 23-28 (2006)).
  • the Mycl gene can be introduced into the ES cells using methods well known to those skilled in the art.
  • the Mycl gene can be inserted into an entry vector, pCR8-GW-TOPO vector (Invitrogen Life Technologies), by TA cloning, and then an LR reaction can be carried out between the vector and, for example, a Colla1-TetOP-AttR1-ccdB-AttR2-ires-mCherry vector, and the TetOP-Mycl-ires-mCherry vector can be used as a gene introduction vector.
  • pCR8-GW-TOPO vector Invitrogen Life Technologies
  • the "TetOP (operon)" sequence in the vector is a sequence (tetracycline response element: TRE) to which a reverse tetracycline-controlled transactivator binds, and the reverse tetracycline-controlled transactivator expressed from the host cell in response to a reverse tetracycline such as doxycycline (Dox) added to the cell binds, inducing the expression of a gene linked downstream.
  • TRE tetracycline response element
  • Dox doxycycline
  • ires internal ribosome entry site
  • mCherry is a gene (reporter gene) that codes for red fluorescent protein.
  • the Mycl gene can be integrated into the chromosome of the ES cells.
  • pBSSK(-)-IRES- ⁇ geo containing the "ires- ⁇ geo (a fusion gene of ⁇ -galactosidase and neomycin resistance gene) cassette" (Mountford P. et al., Proc. Natl. Sci. USA, 91: 4303-4307 (1994)) containing a resistance gene, or a similar vector containing an IRES-Hygro (hygromycin resistance gene) cassette may also be used.
  • the present invention is capable of controlling the transient expression of the Mycl gene, thereby allowing the proliferation of islet-like cells and their differentiation into insulin-producing cells.
  • the present invention is characterized by the transient expression of the Mycl gene.
  • the object of the present invention is achieved by controlling the expression of the Mycl gene "on.”
  • it is also possible to forcibly turn off the expression of the Mycl gene hereinafter referred to as "on/off" control).
  • the expression of the Mycl gene introduced into the host cells can be controlled to be on/off. That is, in the presence of reverse tetracycline, the Mycl gene continues to be expressed in the cells, allowing the proliferation of islet-like cells, while removing reverse tetracycline can stop the proliferation of the islet-like cells and induce differentiation into insulin-producing cells.
  • the transient expression (on state) of the Mycl gene introduced into the islet-like cells is preferably for a period of at least 2 days to a maximum of 100 days, for example, 90 days, 80 days, 70 days, or 60 days, from the start of cell culture. On the other hand, it is preferable that the islet-like cells into which the Mycl gene has been introduced proliferate for the above period.
  • a "photoregulated viral vector” (Tahara, M., et al., PNAS, vol. 116, 11587-11589, 2019) can be used, which allows the gene expression and cell proliferation of the viral vector to be precisely switched on and off by light irradiation.
  • This is a viral vector in which a gene encoding a light switch protein called magnet has been introduced, and the expression of a target gene incorporated into the vector can be controlled using blue light.
  • the object of the present invention in addition to introducing an isolated exogenous Mycl gene, the object of the present invention can be achieved by forcibly expressing the Mycl gene present in the cell.
  • the means for expressing the endogenous Mycl gene is not limited to, but may be a method of forcibly expressing the gene by replacing a wild-type promoter or enhancer with a strong promoter or enhancer for operably inducing the expression of the Mycl gene.
  • promoters used for replacement include the cytomegalovirus (CMV) promoter, which is a strong promoter, and an inducible promoter that functions in the presence of an inducer.
  • CMV cytomegalovirus
  • enhancers used for replacement include the SV40 enhancer, herpes B virus enhancer, cytomegalovirus enhancer, and ⁇ -fetoprotein enhancer.
  • CRISPR Type II including CRISPR-dCas9
  • molecules in which demethylases, histone modification enzymes, transcription activators, specifically VP64, p65, Rta, etc., capable of activating promoters and/or enhancers, have been added to the genome recognition sequences of CRISPR-type I, TALEN, and ZFN can be used.
  • the above-mentioned promoters, enhancers, enzymes and factors that activate them, or nucleic acid protein complexes or low molecular weight compounds may be referred to as "activators" for activating the Mycl gene.
  • Introduction of the gene product of Mycl gene Introduction of the Mycl gene product into cells can be carried out by a general method for introducing foreign genes or proteins into cells, including, but not limited to, a method using a transfection reagent, a method using a virus, electroporation, a particle gun method, sonoporation, a liposome fusion method, and an introduction method in which pores are formed in the cell membrane by a micromanipulator or laser light irradiation.
  • feeder cells e.g., MEF (mouse embryonic fibroblasts)
  • a medium for ES cells e.g., a medium obtained by adding 2-mercaptoethanol (2ME, GIBCO) and LIF (SIGMA) to knockout DMEM (GIBCO) containing 15% FBS, 50 U/mL penicillin/streptomycin, L-glutamine, and non-essential amino acids.
  • ES cells are introduced into a mammal to produce a knockout animal (Mycl gene knock-in animal).
  • a mouse is used as an example of a mammal, but the method of producing a knock-in mouse is well known to those skilled in the art.
  • a chimeric mouse can be produced by injecting the ES cells into a blastocyst of a mouse (e.g., C57BL/6, etc.) and transplanting it into the uterus of a pseudopregnant female mouse (ICR, etc.).
  • the chimeric mouse can then be mated with a normal mouse (C57BL/6, etc.) to produce a heterozygous mutant mouse in which the Mycl gene is knocked in heterozygously.
  • a homozygous mutant mouse in which the Mycl gene is knocked in homozygously can be obtained by mating heterozygous mutant mice with each other.
  • ECAT3 knock-in mice Tokuzawa, Y., et al., Molecular and Cellular Biology, 23 (8): 2699-2708 (2003)
  • ECAT4 knock-in mice Mitsubishi, K., et al., Cell, 113: 631-642 (2003)
  • ECAT5 knock-in mice Takahashi, K., K. Mitsui, and S. Yamanaka, Nature, 423 (6939): p. 541-545 (2003), JP 2003-265166 A), etc.
  • Chimera mammals can also be created using iPS cells, not just ES cells.
  • organs can be created from human iPS cells in non-human mammals using the blastocyst complementation method.
  • Nakauchi et al. have developed a human pancreas induced from human iPS cells in the body of an apancreatic cloned pig (see Nakauchi, H., et al., PNAS, Vol. 110, No. 1, 4557-4562 (2013)).
  • control of proliferation and differentiation of islet-like cells proliferation and differentiation of the islet-like cells prepared as described above can be controlled in vitro and in vivo.
  • the method of inducing the Mycl gene can be selected according to the above-mentioned method used for introducing the gene into cells. For example, when the Mycl gene is introduced into cells using the above-mentioned TetOP-Mycl-ires-mCherry vector as a gene introduction vector, a reverse tetracycline-controlled transactivator expressed from a host cell depending on reverse tetracycline such as doxycycline (Dox) binds to the cell, and the Mycl gene linked downstream is expressed, thereby inducing proliferation of islet-like cells.
  • Dox doxycycline
  • the concentration of Dox added to the cell culture system can be appropriately adjusted. For example, it may be 1 to 100 mg/mL.
  • proliferation can be stopped by, for example, replacing the medium with one not containing Dox, and cell differentiation such as insulin production can be induced.
  • proliferation of islet-like cells in the pancreas can be induced in the pancreas by, for example, providing water containing Dox to a chimeric non-human mammal.
  • concentration of Dox when added to water may be, for example, 1 to 100 mg/mL, and is preferably 2.0 mg/mL.
  • the pancreas grows with age up to 8 weeks after birth, so Dox can be administered when growth has stopped, for example, after 8 weeks of age, but the age is not limited as long as proliferation can be induced.
  • a method for producing islet cells or precursor cells thereof having insulin-producing ability includes, but is not limited to, using primary islet cells, cultured islet cells, or islet cells derived from stem cells as a raw material, introducing the Mycl gene into the islet cells, forcing the expression of the Mycl gene to grow the cells, and then stopping the expression of the gene to obtain islet cells or precursor cells thereof having insulin-producing ability.
  • the forced expression and stopping of the Mycl gene can be achieved, for example, by using an alternative means for controlling the expression of the gene on/off (e.g., the use of a photoregulated viral vector) or a doxycycline-sensitive reverse tetracycline-regulated transactivator.
  • an alternative means for controlling the expression of the gene on/off e.g., the use of a photoregulated viral vector
  • a doxycycline-sensitive reverse tetracycline-regulated transactivator e.g., the use of a photoregulated viral vector
  • pancreatic islet progenitor cells refer to cells (or groups of cells) that are in the process of differentiating into pancreatic islet cells capable of producing insulin after the expression of the Mycl gene has ceased, and can be identified using, for example, one or more markers selected from the group consisting of PDX1 positivity, PTF1a positivity, NKX6.1 positivity, Fev positivity, Pax4 positivity, and Cck gene as indicators.
  • a method for culturing islet cells into which Mycl gene or its gene product has been introduced or its expression has been induced using a medium containing a high concentration of glucose that is, a method for sustaining and/or promoting the proliferation activity of islet cells into which Mycl gene or its gene product has been introduced or its expression has been induced in a glucose concentration-dependent manner is provided.
  • Glucose concentration-dependent means that further proliferation of the islet cells can be induced by a higher concentration of glucose stimulation within a certain concentration range (e.g., 10 g/L or less).
  • the islet-like cells are cultured in a medium containing a high concentration of glucose (sometimes simply referred to as a "high glucose medium”) in accordance with the transient expression (on state) of the Mycl gene.
  • the high glucose medium refers to a medium having a glucose concentration of 3 g/L or more, and is preferably a medium having a glucose concentration of 3.5 to 10 g/L, more preferably 4 to 7 g/L, and even more preferably 4 to 6 g/L.
  • the cells may be cultured in a high glucose medium for a certain period of time, then in a low glucose medium for a certain period of time, and then again in a high glucose medium for a certain period of time, so that the high glucose medium and the low glucose medium are applied (used) alternately.
  • the proliferation activity of the islet-like cells can be maintained for a long period of time.
  • low glucose medium is used interchangeably with "low concentration glucose medium” and specifically refers to a medium having a glucose concentration of less than 3 g/L, preferably 0.1 to 2.8 g/L, more preferably 0.5 to 2.5 g/L, and even more preferably 1 to 2 g/L.
  • the timing of replacing the high glucose medium with the low glucose medium can be adjusted as appropriate, and can be, for example, in accordance with the timing of the passage of the islet-like cells (for example, but not limited to, once a day, once every 2 days, once every 3 days, once every 4 days, once every 5 days, once every 6 days, or once every 7 days).
  • the proliferation activity of the islet-like cells can be maintained for a long period of time, for example, one month or more, three months or more, six months or more, eight months or more, or one year or more.
  • the culture period by changing the glucose concentration is less than one year, preferably less than eight months, more preferably less than six months, even more preferably less than three months, and even more preferably less than one month.
  • regulating a pathway activated by glucose includes a method of activating a glucose-stimulated activation pathway and a method of alternating between periods in which the glucose-stimulated activation pathway is activated and periods in which it is not activated.
  • a glucose-stimulated activation pathway refers to a signal transduction pathway stimulated by glucose, and in one embodiment, for example, refers to the GK pathway.
  • the substance that activates the glucose-stimulated activation pathway which is added to maintain and/or promote the proliferation activity of islet-like cells by stimulation of the Mycl pathway in a concentration-dependent manner, is not particularly limited as long as it activates the glucokinase pathway, and examples thereof include, in addition to the above-mentioned glucose, sucrose, glucokinase activators (known Cpd A (Merck Millipore, CAS 603108-44-7; Sigma-Aldrich, 346021), glucokinase activator II (Sigma-Aldrich, 500487), glucokinase activator III (Merck Millipore, CAS 300353-13-3; Sigma-Aldrich, 509665), etc.
  • Cpd A Merck Millipore, CAS 603108-44-7; Sigma-Aldrich, 346021
  • glucokinase activator II Sigma-Aldrich, 500487
  • the high glucose medium and low glucose medium can be prepared by appropriately mixing commercially available basal medium for cell culture.
  • the basal medium for cell culture mainly contains carbon sources, nitrogen sources, amino acids (e.g., essential amino acids), vitamins (e.g., water-soluble vitamins, fat-soluble vitamins), and other micronutrients, inorganic salts, proteins (e.g., albumin, transferrin, insulin), reducing agents (e.g., glutathione), trace elements (e.g., ammonium metavanadate, manganese chloride, sodium selenite), and other substances (e.g., ethanolamine, hypoxanthine sodium, fatty acids, putrescine, pyruvic acid, thymidine, phenol red), but the components and concentrations of the components can be adjusted as appropriate.
  • amino acids e.g., essential amino acids
  • vitamins e.g., water-soluble vitamins, fat-soluble vitamins
  • other micronutrients e.g., inorganic salts
  • proteins
  • the basal medium that can be used to prepare the medium can be selected from commercially available basal media containing the above concentration of glucose based on the ingredient table published by the manufacturer, etc.
  • specific components e.g., glucose-stimulated activation pathway activators
  • basal media examples include commercially available DMEM-F12, DMEM, RPMI1640, etc.
  • the basal medium may further contain growth factors.
  • growth factors examples include, but are not limited to, EGF, FGF-10, Gastrin, Noggin, R-spondin, B27 supplement, and the like.
  • FGF-10 is generally known to have the effect of proliferating cells (including islet progenitor cells), but whether or not it is added, it is possible to maintain the proliferation activity of islet-like cells by regulating the pathway activated by glucose. For this reason, in the method of culturing the proliferation method of islet cells using a glucose-stimulated activation pathway activator in this specification, FGF10 may or may not be added, but it is preferable to add FGF10 from the viewpoint of more stable proliferation.
  • pancreatic islet cells in which Mycl gene or its gene product has been introduced or induced to be expressed in vivo. Specifically, it is sufficient to regulate the pathway activated by glucose in vivo.
  • a buffer solution adjusted so that the above glucose concentration is the final concentration may be administered in vivo.
  • the term “high glucose medium” may be distinguished as “high glucose buffer solution” and the term “low glucose medium” as “low glucose buffer solution”.
  • the timing of replacement of the "high glucose buffer solution” and “low glucose buffer solution” to be applied is not limited, but may be, for example, once a day, once every two days, once every three days, once every four days, once every five days, once every six days, or once every seven days. It may also be in the form of a drink containing glucose, sucrose, etc., which is expected to cause a sufficient increase in blood glucose when ingested by a living body.
  • the proliferation activity of islet-like cells can be increased, the proliferation activity of islet-like cells can be maintained for a long period of time, and insulin production can be promoted along with the proliferation of islet-like cells.
  • an insulin production promoter containing as active ingredients islet-like cells whose proliferation activity has been maintained or promoted for a long period of time by a Mycl gene or its gene product and a glucose-stimulated activation pathway activator such as glucose; a pharmaceutical composition containing the active ingredient and other pharma- ceutical acceptable ingredients (e.g., carrier, excipient, disintegrant, buffer, emulsifier, suspending agent, soothing agent, stabilizer, preservative, antiseptic, physiological saline, etc.); a method for preventing and/or treating diabetes patients using the insulin production promoter or pharmaceutical composition; and use of the Mycl gene and a glucose-stimulated activation pathway activator for producing the insulin production promoter or pharmaceutical composition are provided.
  • pharma- ceutical acceptable ingredients e.g., carrier, excipient, disintegrant, buffer, emulsifier, suspending agent, soothing agent, stabilizer, preservative, antiseptic, physiological saline, etc.
  • a method for transplanting islet-like cells the proliferation activity of which is enhanced by controlling the expression of an introduced Mycl gene and regulating a pathway activated by glucose, thereby sustaining and promoting the proliferation activity of islet-like cells for a long period of time, into a subject, for the purpose of preventing and/or treating diabetes.
  • ex vivo method of the present invention different aspects of the ex vivo method of the present invention are intended depending on the cells used.
  • islet-like cells obtained by introducing a gene into cells derived from adult islets are produced allogeneically in vitro or autologously in vitro (a narrow definition of ex vivo method including both);
  • islet-like cells obtained by inducing differentiation that is, islet-like cells obtained by introducing the Mycl gene into islet cells derived from stem cells (iPS cells, ES cells, somatic stem cells, etc.), are produced allogeneically in vitro or autologously in vitro (a broad definition of ex vivo method);
  • the Mycl gene is functionally expressed in the above (i) and (ii) to produce proliferating islet precursor cell-like cells; and
  • the cells are insulin-producing cells or islet cells (not including the Mycl gene) that are produced by differentiation from the above (i) to (iii).
  • the cells can be transplanted into the patient using a known method, specifically, the method described in Nature Medicine volume 22, pages 306-311 (2016). , doi: 10.1038/nm. 4030, Nature Biomedical Engineering volume 2, pages 810-821 (2016). , DOI: 10.1038/s41551-018-0275-1, EBioMedicine 12 (2016) 255-262. , DOI: https://doi. org/10.1016/j. ebio m.
  • the pancreatic islets to be transplanted may be encapsulated and administered using the method described in, for example, August 34, 2016. By encapsulating the pancreatic islets to be transplanted, it is possible to avoid the use of immunosuppressants or to reduce the dosage of the immunosuppressants.
  • isolated pancreatic islets can be appropriately genetically edited.
  • the genes to be edited are not particularly limited, but specifically, preferable characteristics for treatment can be added, such as correction of mutated genes contained in pancreatic islet cells by genome editing, modification of molecules that induce immune responses, such as surface antigens such as HLA and GAD proteins, and induction of immune tolerance by deletion of Beta-2 Microglobulin, RFX5, RFXANK, RFXAP, and CIITA genes.
  • the method of gene editing is not particularly limited, but specific examples include CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12, TALEN, ZFN, CRISPR-Cas3, CRISPR-TypeI-D, MAD7, and modified versions thereof, and transposon vectors such as piggyBAC for expressing functional molecules.
  • Applicable Diseases Diseases to which the present invention can be applied based on the above-mentioned aspects are diseases in which insulin does not function sufficiently in the living body. Typical examples of such diseases include pathologies in which reduced secretion is observed, type I diabetes, insulin resistance in which insulin is relatively insufficient, type II diabetes, and type 1.5 diabetes, which is an intermediate pathology between type I diabetes and type II diabetes.
  • the present invention by controlling the expression of the introduced Mycl gene and regulating the pathway activated by glucose, it is possible to promote insulin production by the islet-like cells whose proliferation activity is maintained and promoted for a long period of time, and, for example, have the effect of lowering blood glucose in diabetic patients.
  • the applicable disease is typically diabetes, but more specifically, severe hypoglycemia, type I diabetes (including slowly progressing type 1 diabetes or type 1.5 diabetes), type II diabetes, impaired glucose tolerance, hyperglycemia, dyslipidemia, obesity, or diseases, disorders or symptoms related to metabolic syndrome, and other specific mechanisms or diseases, such as genetic abnormalities involved in pancreatic ⁇ -cell function, genetic abnormalities involved in the transmission mechanism of insulin action, pancreatic exocrine diseases, endocrine diseases, liver diseases, drugs or chemicals, infectious diseases, rare pathologies due to immune mechanisms, or gestational diabetes, etc., associated with other diseases or conditions.
  • diabetic complications due to diabetes e.g., diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, etc.
  • insulin secretion deficiency caused by total pancreatectomy or partial pancreatectomy associated with pancreatitis or pancreatic cancer can also be included in the applicable disease.
  • the type of diabetes that can be treated by the method described in this specification is not particularly limited, but the method can provide a treatment that is less likely to cause hypoglycemia, in which physiological insulin is secreted depending on blood glucose levels.
  • a method described in a known literature can be used as one embodiment.
  • the method described in a known literature here is not limited, but can be, for example, Diabetes Care 2016 Jul; 39(7):1230-1240., DOI:10.2337/dc15-1988, The New England Journal of Medicine. 343(4):230-238. , DOI: 10.1056/NEJM200007273430401, The New England Journal of Medicine. 355(13): 1318-1330., DOI: 10.1056/NEJMoa061267, etc. are specific examples.
  • the number of islet cells, islet-like cells, islet precursor-like cells, or insulin-producing cells contained may be adjusted according to the insulin, blood glucose level, and/or C-peptide level of a type I diabetes patient at any time, in the fasting state, after glucose loading, and/or after glucagon stimulation, and the dosage of the agent for performing in vivo treatment may be determined by the method described herein.
  • Type I diabetes patients in an insulin-depleted state are at high risk of exhibiting hypoglycemic symptoms, and from the viewpoint that treatment using the method described herein is preferable, for example, type I diabetes patients with a blood C-peptide level of 0.5 ng/mL or less, preferably 0.2 ng/mL or less, more preferably 0.1 ng/mL or less in the fasting state and/or during glucagon stimulation can be treated.
  • the specific dosage of the agent may be adjusted, for example, with reference to the transplantation amount of donor islets that are usually transplanted for the indication of severe hypoglycemia.
  • the cells are pancreatic islet cells, pancreatic islet-like cells, pancreatic islet precursor-like cells, or insulin-producing cells equivalent to 500 IEQ/kg or more, preferably equivalent to 1000 IEQ/kg or more, more preferably equivalent to 2000 IEQ/kg or more, and even more preferably equivalent to 5000 IEQ/kg or more.
  • the number of islet cells, islet-like cells, islet precursor-like cells, or insulin-producing cells contained in a type II diabetes patient may be adjusted according to the amount of insulin, blood glucose level, and/or C-peptide at any time, fasting, after glucose loading, and/or after glucagon stimulation, and the dosage of the agent for in vivo treatment may be determined by the method described herein.
  • a pathological condition in which insulin is insufficient for example, type II diabetes patients whose blood C-peptide amount is 0.5 ng/mL or less, preferably 0.2 ng/mL or less, more preferably 0.1 ng/mL or less in fasting and/or glucagon stimulation can be treated.
  • the specific dosage of the agent may be adjusted, for example, with reference to the transplant amount of donor islets that are usually transplanted for the indication of severe hypoglycemia.
  • the cells are pancreatic islet cells, pancreatic islet-like cells, pancreatic islet precursor-like cells, or insulin-producing cells equivalent to 500 IEQ/kg or more, preferably equivalent to 1000 IEQ/kg or more, more preferably equivalent to 2000 IEQ/kg or more, and even more preferably equivalent to 5000 IEQ/kg or more.
  • the amount of the agent contained can be adjusted according to the amount of insulin, blood glucose level and/or C-peptide in the body, as in type I diabetes and/or type II diabetes, but is not limited thereto.
  • the islet cells, islet-like cells, islet precursor-like cells, or insulin-producing cells expanded by the method of the present specification are preferably derived from the patient's own cells.
  • the type of autoantibodies or HLA against islet cells in the blood is preferably examined in advance, and the patient's own islet cells can be expanded by the method of the present specification before or after falling into an insulin-dependent state and/or an insulin-deficient state, treatment without the need for immunosuppressants becomes possible, and the transition to an insulin-dependent state and/or an insulin-deficient state can be prevented, or the insulin-dependent state and/or an insulin-deficient state can be treated.
  • the autoantibody against islet cells in the blood or the type of HLA is involved in slowly progressing type I diabetes.
  • a known method may be used, such as checking whether islet-related autoantibodies such as islet cell antibody (ICA), GAD antibody, insulin autoantibody (IAA), and IA-2 antibody are positive in combination or alone.
  • ICA islet cell antibody
  • IAA insulin autoantibody
  • IA-2 antibody IA-2 antibody
  • a known method may be used to check whether or not a patient has an HLA associated with slowly progressing type I diabetes, such as HLA-DR4-DQA1*0301-B1*0401.
  • the ex vivo method is preferable for the treatment of severe hypoglycemia, but the method described in this specification allows the expansion of islet cells in the body (in vivo). Since the islet cells expanded in this way have the same effect as the ex vivo method, the treatment method of expanding islets in vivo can be preferably selected as a treatment method for severe hypoglycemia, as with the ex vivo method.
  • a method of expanding islet cells in the body (in vivo) can be selected taking into consideration the subject's sex, age, weight, condition of the affected area, condition of the cells used, etc. At this time, the method of expanding islet cells in the body (in vivo) can be combined with the ex vivo method.
  • such diseases can be prevented and/or treated.
  • the term “prevent” refers to preventing or delaying the onset/manifestation of the above-mentioned disease or its symptoms, or reducing the risk of onset/manifestation.
  • “Treatment” includes alleviating (alleviating) symptoms characteristic of the target disease or associated symptoms, preventing or delaying the worsening of symptoms, etc.
  • Prevention refers to preventing or delaying the onset/manifestation of a disease (disorder) or its symptoms, or reducing the risk of onset/manifestation.
  • “improvement” refers to alleviating (alleviating), improving, remission, or curing (including partial cure) a disease (disorder) or its symptoms.
  • an insulin production promoter or pharmaceutical composition containing as an active ingredient the islet-like cells whose proliferation activity has been maintained or promoted for a long period of time by the Mycl gene or its gene product and the glucose-stimulated activation pathway activator of the present invention can be provided for the prevention and treatment of the above-mentioned applicable diseases.
  • an embodiment of the islet cell proliferation promoter refers to an agent that proliferates any one of ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, and PP cells contained in a pancreatic islet, preferably any two or more of the islet cells.
  • an embodiment of the islet function improver refers to an agent that improves part or all of the functions of a pancreatic islet in a living body by administration
  • examples of part of the functions of a pancreatic islet include blood glucose regulating action by islet cells, blood glucose lowering action by insulin, glucose production/release action by glucagon, secretion suppression action of gastrin, secretin, insulin and/or glucagon by somatostatin or nutrient absorption suppression action in the digestive tract, appetite regulating action by ghrelin, and gallbladder contraction regulating action and appetite regulating action by pancreatic polypeptide.
  • an insulin production promoter is an agent that promotes physiological insulin secretion in response to blood glucose levels, which is one of the functions of pancreatic islets in vivo.
  • it may contain other pharma- ceutically acceptable ingredients (e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, physiological saline, etc.) in addition to the active ingredient Mycl gene or its gene product used in the above embodiment.
  • an activator for activating the Mycl gene may be included, if necessary.
  • the pancreatic islet cells derived from a living organism into which the Mycl gene or its gene product is introduced may be pancreatic islet cells from a healthy individual, or may be pancreatic islet cells from a patient with type I diabetes or a patient with terminal type II urinary catheter disease in which some or most of the ⁇ cells have been lost.
  • the pancreatic islet cells may be autologous or allogeneic to the recipient.
  • the insulin production promoter and pharmaceutical composition of the present invention can be obtained by suspending the above-obtained islet-like cells in physiological saline or an appropriate buffer solution (e.g., phosphate-buffered saline), although this is not limited thereto.
  • physiological saline or an appropriate buffer solution e.g., phosphate-buffered saline
  • the number of cells required for treatment can be obtained by forcibly expressing the Mycl gene and appropriately proliferating the cells.
  • dimethyl sulfoxide (DMSO) or serum albumin, etc. may be contained in the insulin production promoter and pharmaceutical composition to protect the cells, and antibiotics, etc. may be contained in the insulin production promoter and pharmaceutical composition to prevent bacterial contamination and growth.
  • other ingredients that are acceptable for formulation e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, antiseptics, physiological saline, etc.
  • Those skilled in the art can add these factors and drugs to the insulin production promoter and pharmaceutical composition at appropriate concentrations.
  • the number of islet cells, islet-like cells, islet precursor-like cells, or insulin-producing cells contained in the insulin production promoter and pharmaceutical composition prepared above can be appropriately adjusted taking into consideration the subject's sex, age, weight, condition of the affected area, condition of the cells used, etc., so as to obtain the desired effect (e.g., lowering blood glucose level) in the prevention and/or treatment of diabetes and related diseases.
  • the insulin production promoting agent and pharmaceutical composition of the present invention can be administered to various subjects, including, for example, mammals such as primates, humans, dogs, cats, cows, horses, pigs, and sheep, and preferably humans.
  • the route of administration to the subject is not limited, but can be parenteral administration, for example, administration by injection or infusion to any location in the body that can respond to glucose.
  • it can be implanted or administered into the pancreas, under the kidney capsule, preferably subcutaneously or intraperitoneally, more preferably intravascularly or intravenously, and even more preferably into the portal vein.
  • the method for activating the administered Mycl gene in vivo is not limited, but the above-mentioned system for "on” control or “on and/or off” control of Mycl gene expression can be used.
  • the above-mentioned "light-controlled viral vector” (Tahara, M., et al., PNAS, vol. 116, 11587-11589, 2019) may be used.
  • markers specifically expressed in pancreatic islet cells e.g., PDX1, C-peptide, insulin, MafA, Mnx1, Pax4, Pax6, NeroD1, Isl1, Nkx2.2, Ngn3, HNF1a, Foxa2, Nkx6.1, glucagon, Arx, MafB, RFX6, IRX1, IRX2, somatostatin
  • markers specifically expressed in pancreatic islet cells e.g., PDX1, C-peptide, insulin, MafA, Mnx1, Pax4, Pax6, NeroD1, Isl1, Nkx2.2, Ngn3, HNF1a, Foxa2, Nkx6.1, glucagon, Arx, MafB, RFX6, IRX1, IRX2, somatostatin
  • pancreatic islet cells When selecting a method for expanding pancreatic islet cells in vivo, specific examples of the route of administration to the subject include, but are not limited to, intrapancreatic, subcutaneous, intraperitoneal, preferably intravascular, intravenous, and even more preferably intraperitoneal artery, and intrapancreatic duct.
  • a method for preventing and/or treating a subject having diabetes or a disease related thereto is provided using islet-like cells whose proliferation activity has been maintained or promoted for a long period of time by the Mycl gene or its gene product and a glucose-stimulated activation pathway activator.
  • an activator for activating the Mycl gene can be administered, and may be administered before, simultaneously with, or after the administration of the insulin production promoter or pharmaceutical composition.
  • the concentration of glucose, etc. in the body may be adjusted by food, drinking water, infusion, etc.
  • kits for preventing and/or treating diabetes or a disease related thereto comprising an insulin production promoter or a pharmaceutical composition.
  • a kit may include an instruction manual for administering or transplanting the insulin production promoter or pharmaceutical composition to a subject.
  • the kit may further include an activator for activating the Mycl gene.
  • the Col1a1-TetOP-Mycl-ires-mCherry vector (hereinafter referred to as the "targeting vector") prepared by performing LR reaction between the pCR8-Mycl-TOPO vector into which the Mycl gene was inserted and the TetOP-AttR1-ccdB-AttR2-ires-mCherry vector was inserted into the Col1a1 locus of KH2-ES cells using the flip-in recombination system (Beard et al., 2006).
  • the cells were selected with 150 ⁇ g/mL hygromycin B (Roche), and the formed colonies were picked up to establish an ES cell line capable of inducing expression of the Mycl gene in a Dox-dependent manner.
  • Feeder cells (ii) Cell Culture Method Feeder cells (MEF; mouse embryonic fibroblasts) were cultured in DMEM (Nacalai Tesque) medium containing 10% FBS (GIBCO), 50 U/mL Penicillin-Streptomycin (P/S; Nacalai Tesque), L-glutamine (GIBCO), and NEAA (Nacalai Tesque).
  • ES cells were cultured in a medium containing 15% FBS, 50 U/mL P/S, L-glutamine, and NEAA, knock-out DMEM (GIBCO), to which 2-mercaptoethanol (2ME: GIBCO) and LIF (SIGMA) were added, on a gelatin-coated (SIGMA) dish seeded with feeder cells.
  • GIBCO knock-out DMEM
  • SIGMA 2-mercaptoethanol
  • SIGMA LIF
  • mice capable of inducing in vivo Mycl expression ES cells capable of inducing Mycl expression in a Dox (Sigma-Aldrich)-dependent manner were injected into mouse blastocysts (ICR, E3.5) and transplanted into the uterus of pseudopregnant mice on day 2 (Slc: ICR, Shimizu Experimental Materials) to produce chimeric mice having cells capable of inducing Mycl expression in a Dox-dependent manner.
  • the expression of the Mycl gene and the red fluorescent protein mCherry can be induced systemically by administration of Dox.
  • mice capable of tracking pancreatic islet cells (Ins1-ires-CreERT2; Gcg-CreERT2, Sst-ires-CreERT2)
  • CreERT2 tamoxifen-inducible Cre recombinase
  • DAB staining After washing twice with 1x PBS, in the case of DAB staining, 150 ⁇ L of DAB solution (using a DAB substrate kit from Nichirei Biosciences, one drop each of Reagent A and B were added and mixed in 1 mL of Elix water, and then one drop of Reagent C was added and mixed) was added to the tissue section, and an antigen-antibody reaction was performed, followed by observation under a microscope. In the case of fluorescent staining, one drop of mounting material was added to the tissue section, a cover glass was placed, and then observation under a microscope was performed.
  • DAB solution using a DAB substrate kit from Nichirei Biosciences, one drop each of Reagent A and B were added and mixed in 1 mL of Elix water, and then one drop of Reagent C was added and mixed
  • fluorescent staining one drop of mounting material was added to the tissue section, a cover glass was placed, and then observation under a microscope was performed.
  • Anti-mCherry antibody (Abcam, 1/500) - Anti-rabbit IgG antibody (Nichirei Biosciences) Anti-Synaptophysin antibody (Abcam, 1/500) - Anti-rabbit IgG antibody (Nichirei Biosciences) Anti-Chromogranin A antibody (DAKO, 1/500) - Anti-Rabbit IgG antibody (Nichirei Biosciences) Anti-Ki67 antibody (Abcam, 1/200) - Anti-rabbit IgG antibody (Nichirei Biosciences) Anti-insulin antibody (DAKO) - Anti-guinea pig IgG antibody (BIOTIUM) ⁇ Anti-Somatostatin antibody (Santa Cruz, 1/300) - Anti-mouse IgG antibody (BIOTIUM) ⁇ Anti-Glucagon antibody (Santa Cruz, 1/300) - Anti-mouse IgG antibody (BIOTIUM)
  • RNA recovery the cultured cells were washed with PBS(-) (Nakarai Tasque) and then lysed with 350 ⁇ L of LBP buffer.
  • RNA extraction was performed using NucreoSpin (registered trademark) RNA Plus (TAKARA) according to the recommended protocol.
  • cDNA synthesis was performed using Primescript single-stranded cDNA synthesis kit (TAKARA) according to the recommended protocol.
  • the pancreas was then removed, transferred to a 50 mL tube, and digested in a 37°C water bath for 14 minutes and 30 seconds.
  • the islets were suspended in 25 mL of cold M199 medium containing 10% FBS, and centrifuged twice (1000 rpm, 4°C, 2 minutes). The supernatant was discarded, and the cells were suspended in 10 mL of Histopaque (SIGMA), and then 10 mL of cold M199 medium containing 10% FBS was poured on top of the suspension, followed by centrifugation (1000 rpm, 4° C., 30 min). The supernatant was transferred to another 50 mL tube, and 25 mL of M199 medium containing 10% FBS was added. The islets were then separated by density gradient centrifugation (1000 rpm, 4° C., 2 min) using Lymphoprep.
  • (x) Primary mouse islet cell culture
  • the isolated islets were transferred to a 1.5 mL tube, and islet cells were separated using TrypLE. After washing with RPMI medium, the number of cells was measured.
  • the islet cells were seeded on a 96-well plate, and 30 ⁇ L of Matrigel was added thereon.
  • the cells and Matrigel were mixed with the tip of a pipette, and the 96-well plate was left to stand at 37°C in a CO2 incubator for 30 minutes to crosslink the gel. Then, 120 ⁇ L of medium was added, and the cells were cultured at 37°C and 5% CO2 .
  • KEYENCE BZ-710 was used to observe and capture the islet cells.
  • the islet cells were passaged once a week, and the culture medium used was RPMI1640 (Nacalai Tasque; 09892-15) to which 45 w/v% D(+)-glucose solution (Wako; 079-05511) was added so that the glucose concentration was an appropriate final concentration (e.g., 4.5 g/L, 4.5 g/L, etc.).
  • pancreatic islet cell transplantation experiment Diabetes was induced in immunodeficient mice (NOD/ShiJic-scid Jcl) by intraperitoneal administration of streptozotocin (100 mg/kg) three times a week. 5 x 105 pancreatic islet cells that had been passaged 18 times were transplanted under the renal capsule of these mice using a Hamilton syringe. Blood glucose levels were measured weekly, and blood glucose was measured at random.
  • IPGTT Intraperitoneal glucose tolerance test
  • the Mycl expression group and the control group were fasted for 12 to 16 hours. Then, the body weight of each mouse was measured, and D-glucose solution was injected intraperitoneally to give 2 g/kg (mouse) of D-glucose. After 15, 30, 60, and 120 minutes, blood was collected from the tail of each mouse, and blood glucose levels were measured using an Antsense stand (Horiba).
  • Example 1 Activation of proliferation of Mycl-induced islet cells in a test by glucose Expression of the Mycl gene can be confirmed by expression of the mCherry gene integrated downstream of the gene.
  • the mCherry gene is a gene encoding a red fluorescent protein, and expression of the gene causes cells to develop a red color.
  • the glucose concentration in the medium was changed to examine the difference in proliferation activity of Mycl-induced islet cells. It was found that the proliferation efficiency of Mycl-expressing islet cells was increased under culture conditions of a high glucose medium (D-glucose; 4.5 g/L) compared to culture conditions of a low glucose medium (D-glucose; 1.0 g/L) (see FIG. 1).
  • GKA glucokinase activator
  • GKI glucokinase inhibitor
  • Example 2 Activation of Mycl-induced islet cell proliferation in vivo by glucose Using mice capable of tracing islet cells (Ins1-ires-CreERT2; Gcg-CreERT2, Sst-ires-CreERT2), activation of Mycl-induced islet cell proliferation in vivo by glucose was examined.
  • glucose was added to the medium, but in this example, sucrose (glucose + fructose) was used instead of glucose.
  • sucrose glucose + fructose
  • the proliferation activity of islet cells was evaluated by immunostaining. The results are shown in Figure 5, and in the Dox induction + sucrose administration system, significant proliferation of islet cells was observed compared to other experimental systems. This showed that the administration of sucrose (glucose + fructose) also promotes islet proliferation by the Mycl gene in vivo.
  • Example 3 Effect of sustained culture in the presence of glucose on the proliferation activity of Mycl-induced islet cells The effect of sustained presence of glucose in the medium on the proliferation activity of Mycl-induced islet cells was examined. A high glucose concentration was used for the culture. The cells were subcultured a total of four times, with a culture period of 7 days being one cycle. It was observed that the activation of cell proliferation by Mycl induction decreased with repeated subcultures (see FIG. 6). This indicates that the proliferation ability of Mycl-expressing islet cells decreases when culture is sustained, even under culture conditions with a high glucose concentration, suggesting the involvement of so-called "glucotoxicity.”
  • Example 4 Possibility of sustained proliferation of Mycl-induced islet cells by adjusting glucose concentration
  • glucose concentration As shown in Example 3, the involvement of so-called “glucotoxicity” was suggested in continuous culture in a medium with a high glucose concentration, so we investigated whether cells could be sustained for a long period of time by adjusting the glucose concentration. Activation of cell proliferation was examined by alternating between high and low glucose concentrations every 24 hours. As shown in FIG. 7, under such culture conditions, it was found that the proliferation activity of Mycl-induced islet cells was sustained for at least 20 passages (about 22 weeks). This revealed that the high proliferation ability of Mycl-induced islet cells was maintained by repeating high glucose-low glucose (hereinafter referred to as "glucose high-low”), and sustained proliferation induction was possible.
  • glucose-low high glucose-low
  • the number of Mycl-induced islet cells in a high-low glucose culture system was counted to examine changes in cell proliferation over time. As shown in Figure 8, by repeating high glucose and low glucose, the high proliferation ability of Mycl-induced islet cells was maintained, demonstrating the possibility of sustained proliferation induction.
  • Example 5 Tracking test of pancreatic islet cells
  • Ins1 positive cells ⁇ cells
  • Gcg positive cells ⁇ cells
  • Sst positive cells ⁇ cells
  • Example 6 Recovery of diabetic mice
  • IPGTT intraperitoneal glucose tolerance test
  • the present invention makes it possible to induce sustained proliferation of islet cells, and is expected to lead to a cure for diabetes through islet cell transplantation.
  • by activating the Mycl gene together with glucose in the body it is possible to efficiently amplify islet cells in the body, and it is also expected that diabetes can be cured through gene therapy.

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Abstract

Ｍｙｃｌ遺伝子による成熟膵島細胞の増殖を持続させ、継続的な増殖誘導を可能とする方法を提供することを目的とする。本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞の増殖活性をグルコース刺激活性化経路賦活剤により促進及び／又は持続する方法を提供する。より具体的には、Ｍｙｃｌ遺伝子が、（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸；又は（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭｙｃｌ遺伝子が発現誘導された場合に、膵島様細胞の増殖活性を持続及び／又は促進させる機能を有するポリペプチドをコードする核酸を含む上記方法が提供される。

Description

グルコース経路活性化による膵島細胞の増殖活性化
　本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞の増殖をグルコースにより活性化される経路を調節することにより持続及び促進させる方法に関する。
　世界における糖尿病及びその合併症に対する医療費は年間９０兆円とされており、医療費圧迫が大きな社会問題となっている。糖尿病は網膜症、神経障害に加えて腎障害などの合併症を引き起こし、末期においては人工透析が必要となることもある。また、インスリン分泌がほとんど認められなくなった糖尿病末期の重症例においては、昏睡や死亡に至る可能性のある重症低血糖を繰り返し引き起こすなど、血糖コントロールが特に不良となる。重症低血糖の発症は、認知症を含めた脳障害の後遺症や予後悪化につながるため、重症低血糖の発症を回避することは臨床上の重要な課題となっている。糖尿病に対する治療法は、糖の吸収を抑える薬剤やインスリン製剤の投与等の対症療法が主流であり、そのほとんどが糖尿病そのものを治療するものではない。
　インスリン分泌が枯渇し、重症低血糖を何度も繰り返し引き起こす、血糖コントロールが特に不良な予後不良患者に対しては、膵臓移植、膵島移植が行われており、重症低血糖の発症抑制のみならず、インスリン離脱や良好な血糖コントロールの達成など、顕著な効果が認められている。しかしながら、ドナー不足や移植用膵島の分離施設が少ない等といった理由により、対象となる患者数は極めて限られており、単に重症低血糖の既往歴があるというだけの患者や、インスリン分泌が枯渇しているハイリスク群、さらには通常のＩ型糖尿病患者に対し、早期に介入するための治療選択肢として膵臓移植、膵島移植が提供されているわけではない。２０２０年にはドナー膵島移植が「同種死体膵島移植術」として保険収載されている。過去に比べ治療成績は向上してきているとはいえ、ドナー不足をはじめとして、ドナー膵島の個体差や膵島分離までの時間・方法のばらつきに起因する膵島の品質や収量確保に課題がある。これら課題により、移植できる患者数が限定される、予定されていた膵島移植が中止になる、インスリン離脱等の十分な治療効果を発揮するためには繰り返し移植が必要となるといった様々な問題が生じているのが実態である。多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞を使った細胞移植医療の開発が進められているものの、多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞は、機能的に未熟であることが大きな問題となっている。また、分化誘導工程が複雑なことから、多能性幹細胞から内胚葉、膵臓、膵島へ低コストで分化誘導するのは現状では困難である。
　これに対して、ドナー膵島細胞を十分量増殖させることができれば、比較的簡便な製造工程と品質管理により、安全で高品質な製品を比較的低コストで安定的に供給できるようになると期待される。また、高品質な膵島細胞を必要十分な量移植できるようになるため、１回の移植により十分な治療効果を発揮できる可能性がある。さらに、中間製品や最終製品を凍結保存することで計画的な移植治療が可能となり、膵島供給の不安定性に起因する移植中止リスクを最小化することができる。また、十分量の移植用膵島を安定的に供給することができれば、治療対象となる患者層が広がることが期待される。また、多能性幹細胞由来の膵島細胞を増殖させることができれば、移植用の多能性幹細胞由来膵島細胞製造の低コスト化が期待される。このような観点から、既存治療法と比較して、糖尿病の治療戦略に大きなインパクトを与えることが期待される。近年、Ｍｙｃｌ遺伝子導入により、成熟膵島細胞の増殖誘導が可能となった。Ｍｙｃｌによる膵島細胞の増殖誘導による移植医療の実現が期待されている（特許文献１）。Ｍｙｃｌ遺伝子導入による成熟膵島細胞の増殖誘導は限定的で、増幅効率が限られることが問題あった。
国際公開第２０２１／１１７８４０号
　従来、Ｍｙｃｌ遺伝子を発現させることで成熟膵島細胞に増殖活性を付与することが可能であるが、膵島増殖は一時的であり、数回の継代を経ると増殖活性が低下し、持続的な増幅はできなかった。そこで、本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子による成熟膵島細胞の増殖を持続させ、継続的な増殖誘導を可能とする方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、グルコース濃度依存的にＭｙｃｌ遺伝子による成熟膵島細胞の増殖を活性化すること、グルコキナーゼ活性化剤がＭｙｃｌ遺伝子による成熟膵島細胞の増殖を活性化すること、短期の高濃度グルコースによる刺激を繰り返すこと等、グルコースにより活性化される経路を調節することで膵島細胞を増殖させ、また、長期にわたって成熟膵島細胞の増幅が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、以下の態様を有する。
　［１］Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞の増殖活性をグルコース刺激活性化経路賦活剤により促進及び／又は持続する方法。
　［２］グルコース刺激活性化経路賦活剤が、グルコース、スクロース、及びグルコキナーゼ活性化剤から群から少なくとも１種選択される、［１］に記載の方法。
　［３］Ｍｙｃｌ遺伝子が、
　（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸；又は
　（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭｙｃｌ遺伝子が発現誘導された場合に、膵島様細胞の増殖活性をグルコース濃度依存的に持続及び／又は促進させる機能を有するポリペプチドをコードする核酸
を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
　［４］Ｍｙｃｌ遺伝子産物が、
　（１）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
　（２）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに膵島様細胞の増殖活性をグルコース濃度依存的に持続及び／又は促進させる機能を有するポリペプチド
を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
　［５］Ｍｙｃｌ遺伝子が一過的に発現する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］高濃度のグルコースと低濃度のグルコースを交互に適用する、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
　［７］膵島細胞が、膵臓から単離された初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞由来である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
　［８］幹細胞が、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、及び体性幹細胞からなる群から選択される、［７］に記載の方法。
　本発明によれば、グルコースにより活性化される経路を調節することによって膵島細胞を増殖させ、膵島様細胞の増殖活性を長期にわたって維持することにより、インスリン産生が望まれる糖尿病又はその関連疾患を治療することができる。
グルコースによる試験内でのＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性化を示す。 グルコース濃度依存的なＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性化を示す。 グルコキナーゼアクチベーター（ＧＫＡ）によるＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖効率の変化を示す。 グルコキナーゼインヒビター（ＧＫＩ）によるＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖効率の変化を示す。 グルコースによる生体内でのＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性化を示す。 高グルコース濃度の培養条件下でのＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性の低下を示す。 グルコースＨｉｇｈ－Ｌｏｗによる持続的なＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性を示す。 グルコースＨｉｇｈ－Ｌｏｗによる持続的なＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性を示す。 Ｍｙｃｌ遺伝子発現による成熟ホルモン産生細胞の増殖促進を示す。 Ｍｙｃｌ遺伝子発現とグルコースの協調によるβ細胞の効率的な増殖誘導を示す。 膵島細胞の長期培養による糖尿病マウスの回復を示す。
　本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞（以下、「膵島様細胞」と称することがある）をグルコース濃度依存的にその増殖活性を持続及び／又は促進させる方法に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
１．膵島様細胞及びその調製法
（１）膵島様細胞
　本明細書において使用するとき、「膵島様細胞」とは、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入された、成熟膵島細胞を指す。なお、本明細書では、Ｍｙｃｌ遺伝子の強制発現により、増殖期に移行した膵島様細胞を特に「膵島前駆細胞様細胞」と称することがある。さらに、該遺伝子の発現を停止させることによって、インスリン産生能を有する細胞（以下、「インスリン産生細胞」ともいう）を含む膵島細胞に分化させることができる。すなわち、本発明によれば、Ｍｙｃｌ遺伝子の一過性発現により、膵島様細胞の数を増やし、インスリン産生細胞を含む膵島細胞に分化させることができる。ここで、各細胞に発現したマーカーに着目すると、「膵島前駆細胞様細胞」は、例えば、Ｆｅｖ、Ｐａｘ４、Ｃｃｋ、ＣＤＫ４、及びＫｉ６７から選択される遺伝子のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ以上が陽性である。また、発現されるタンパク質に着目すると、特にインスリン及びグルカゴン産生が通常の膵島で認められる場合に比べ低下しているか、又はソマトスタチン産生が顕著であることによっても特徴付けられる。
（２）膵島細胞
　「膵島細胞」とは、一般的に、ランゲルハンス島とも言われ、膵臓の内分泌機能を司る膵島と呼ばれる細胞集合体であって、膵臓の全細胞の約１～２％を占める内分泌細胞を指す。なお、本明細書では、用語「膵島細胞」は、「成熟膵島細胞」と互換的に使用される。また、膵島細胞は、主にα細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、及びＰＰ細胞の５種類の細胞から構成される。膵島と呼ばれる細胞集合体を構成する主要な細胞は、β細胞である。β細胞は、膵島細胞の約６０～８０％を占め、体内のほとんどの細胞へのグルコース移行を可能にするインスリンを分泌する。一方、α細胞は、膵島の約１０～３０％を占め、正常の血糖を維持するために肝臓に貯蔵されたグリコーゲンを分解して血中へのグルコース放出を可能にする、飢餓の間に放出されるグルカゴンを分泌する。δ細胞は、膵島細胞の約５～１０％を占め、グルコース濃度をさらに調節するソマトスタチンを分泌する。また、ε細胞及びＰＰ細胞は、それぞれ、グレリン及び膵ポリペプチドを分泌越する。膵ポリペプチド産生細胞（膵島細胞の約５～１０％）は、外分泌機能と胃腸機能を変化させるホルモンを放出する。内皮細胞、神経細胞、及び前駆細胞などといった、その他の膵島細胞タイプもある。
　本明細書において使用される場合、膵島細胞には、上記した膵島細胞、膵島細胞の前駆細胞である膵島前駆細胞が含まれ、膵島細胞への発生の過程又は体性幹細胞／多能性幹細胞からの分化誘導の過程で生じる膵島細胞又は膵島前駆細胞に至るまでに生じる、中間体の細胞であってもよい。ここで、「中間体の細胞」とは、好ましくは膵島細胞へ分化することが運命決定されている細胞である。さらに、膵島細胞とは、本発明において、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入された膵島様細胞又は膵島前駆細胞様細胞から作製されたものであってもよい。
　Ｉ型糖尿病では、発症から間もない時期に膵島へリンパ球を主体とする細胞浸潤が認められる。やがてβ細胞が選択的に消失するとともに、膵島はその容積が減少し、α細胞が主体となる。膵島のインスリン分泌には予備能があるが、β細胞が消失し、必要な量のインスリン分泌が認められなくなった場合にＩ型糖尿病が発症する。一方で、ＩＩ型糖尿病ではβ細胞数の著明な減少といった膵島の形態学的な変化が認められない場合が一般的である。ＩＩ型糖尿病では末梢組織のインスリン抵抗性により生じるインスリンによる血糖調節作用の低下が疾患の主な原因である。
　本発明において、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入される膵島細胞の由来又は供給源は限定されないが、個体の膵臓から単離された初代膵島細胞、又は公知の培養方法によって培養された膵島細胞であってもよい。培養された膵島細胞には、限定されないが、株化された膵島細胞、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞）由来の膵島細胞（例えば、Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０２０，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０２０．０８．０１８参照）が含まれ得る。さらに、本発明において、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入される膵島細胞は、膵島様細胞及び／又は膵島前駆細胞様細胞から得られた膵島細胞でもよく、すでにＭｙｃｌ遺伝子が導入されている膵島様細胞及び／又は膵島前駆細胞様細胞に、繰り返しＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物を導入してもよい。特に、糖尿病を治療する目的の場合、ドナーから採取された膵島細胞又は幹細胞由来膵島細胞のいずれをも好ましく使用することができる。使用されるドナーからの膵島細胞は、レシピエントに対して、自家又は他家のいずれであってもよい。本発明によれば、このような膵島細胞にＭｙｃｌ遺伝子を導入することにより、インビトロで膵島前駆細胞様細胞を増殖させ、患者に戻す（移植する）ことによって、糖尿病を治療することが可能である。この場合、膵島細胞が、患者に対して他家である症例では、患者に、適宜、免疫抑制剤を投与する、移植するドナー組織とレシピエントのＨＬＡの型を一致させる、ドナー組織をアルギン酸やアルギン酸誘導体、半透膜等に包埋する等の公知の方法と組み合わせて使用することができる。また、患者への移植には、上述した膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、若しくはインスリン産生能を有する細胞、又はそれらの任意の組み合わせを用いることができる。
　上記に関連して、これまでに、少なくともマウスではβ細胞が脱落した場合に、α細胞が増殖し、その後α細胞の一部がβ細胞に分化転換するということが報告されている。したがって、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入される前の膵島細胞の原料としての膵島は、通常のβ細胞を多数含む膵島以外にも、大半のβ細胞が脱落した膵島であってもよい。このような観点から、本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子を導入した膵島様細胞等の使用により、β細胞が脱落したＩ型糖尿病患者の遺伝子治療にも使用できる。
（３）多能性幹細胞
　本明細書において使用するとき、「多能性幹細胞」とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、生体を構成するあらゆる細胞を形成する能力を備える細胞をいう。「自己複製能」とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を作る能力のことをいう。「分化能」とは、細胞が分化する能力をいう。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌ）、精子幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは、ＥＳ細胞である。なお、多能性幹細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類及び両生類のいずれでもよく、特に限定されない。哺乳動物は、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレットなどを含む。
　本明細書において使用するとき、「ＥＳ細胞」とは、発生初期に存在する個体を構成するすべての組織細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を取り出し、インビトロで培養できるように株化したものを意味する。ＥＳ細胞は、初期胚中の多能性幹細胞と同様に個体を構成するすべての細胞に分化する能力を保持したまま事実上無制限に増やすことができる。具体的には、ＥＳ細胞はマウスのものが１９８１年に初めて記載された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８，７６３４－７６３８，１９８１；Ｎａｔｕｒｅ　２９２，１５４－１５６，１９８１）。ＥＳ細胞は多分化能を有し、個体を構成するすべての組織及び細胞タイプを発生させ得る。ラット（Ｉａｎｎａｃｏｎｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３，２８８－２９２，１９９４）、ハムスター（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２７，２２４－２２７，１９８８）、ウサギ（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３６，４２４－４３３，１９９３）、鳥類、魚類、ブタ（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，５６３－５６８，１９９４）、ウシ（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６，５５３－５６２，１９９４）、並びに霊長類（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２，７８４４－７８４８，１９９５）を包含する多種多様な種から多分化能胚性幹細胞が単離されている。なお、本発明において使用可能なＥＳ細胞としては、限定されないが、ＫＨ２細胞、ＲＦ８細胞、ＪＩ細胞、ＣＧＲ８細胞、ＭＧ１．１９細胞、１２９ＳＶ細胞、Ｃ５７／ＢＬ６細胞、ＤＢＡ－１細胞などが挙げられる。
　胚性ヒト組織からのＥＳ細胞及びＥＳ細胞様幹細胞の単離についてもいくつかの研究チームが、成功している。初期の成功例は以下のようなものである。（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２，１１４５－１１４７，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５，１３７２６－１３７３１，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，３９９－４０４，２０００）。これらのＥＳ細胞株は、胚盤胞から分離したＩＣＭをフィーダー細胞上で培養することで樹立されている。他の最近の研究は、胚及び成熟哺乳動物細胞由来の核を脱核卵母細胞中に移植することにより胚及び胚性細胞を得ることが可能であることを示している。
　本発明においては、任意の樹立されたＥＳ細胞株を使用可能である。あるいは、本発明の方法によって作製されたＥＳ細胞を個体に適用した場合の免疫拒絶反応を防ぐためには、個体の体細胞を用いてクローン胚を作成し、そこからＥＳ細胞株を樹立する方法が有効である。この方法を用いれば個体と同一の遺伝的要素をもったＥＳ細胞を樹立することが可能である。
　あるいは、体細胞クローンの作成では卵子に導入された体細胞の核が受精卵の核と同じような状態に変化する、「初期化」と呼ばれる現象が起きると考えられている。卵子のもつこのような活性に類似した活性をＥＳ細胞ももつことが報告されている（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１１，１５５３－１５５８，２００１）。つまり、個体の体細胞とＥＳ細胞を融合することで、体細胞をＥＳ細胞のような細胞に変換できることが期待される。ＥＳ細胞はインビトロで遺伝子操作を行うことができるので、ＭＨＣ遺伝子群などの免疫拒絶に関与する因子をあらかじめ操作したＥＳ細胞でこれを行うことで、体細胞クローン胚作成などの手法を用いることなく拒絶反応を回避できることが期待される。
　本明細書において使用するとき、「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」とは、体細胞へＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃなどの転写因子の遺伝子を導入することにより得られた、ＥＳ細胞に似た分化多能性を有する細胞を意味する。ｉＰＳ細胞もまた、ＥＳ細胞と同様に、分化多能性を保持したまま無制限に増やすことができる。
　ｉＰＳ細胞を作製するための基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ：Ｃｅｌｌ　１２６（４），６６３－６７６，２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ，ｅｔ　ａｌ：Ｃｅｌｌ　１３１（５），８６１－７２，２００７）。また、ｉＰＳ細胞の作製に利用可能な細胞、即ち、ｉＰＳ細胞の由来である細胞の例として、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、粘膜上皮細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、歯髄幹細胞、神経幹細胞を挙げることができる。
　ｉＰＳ細胞の初期化は、当業者に周知の方法で行うことができ、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ’ｓ　Ｂｌｏｇ／Ｐｏｓｔ, “Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｉＰＳＣｓ”（https://blog.addgene.org/delivery-methods-for-generating-ipscs）に概説されている。Ｍｙｃｌ遺伝子のｉＰＳ細胞への導入方法としては、限定されないが、組換えウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなど）、組換えプラスミド、ミニサークル、又はエピソーム（例えば、ｏｒｉＰ／Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ核抗原－１（ＥＢＮＡ１）系エピソーマルベクター）を用いた導入方法、あるいは、Ｍｙｃｌ遺伝子をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）やＭｙｃｌタンパク質自体を直接細胞に導入する方法が挙げられる。
　本明細書において使用するとき、「ＥＧ細胞」は始原生殖細胞から作製される任意の胚性生殖幹細胞を意味し、その起原等は特に限定されない。また、本明細書において使用するとき、「ＧＳ細胞」は、精巣の生殖細胞より作製される生殖幹細胞で、精原幹細胞（精子幹細胞）を体外で培養できるようにした細胞株である（Ｃｅｌｌ．１１９，１００１－１０１２，２００４）。ＧＳ細胞のうち特にＥＳ細胞と同様の性質を有し、分化多能性も有する、ｍＧＳ細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）が好ましい。
（４）Ｍｙｃｌ遺伝子及びその遺伝子産物
　Ｍｙｃｌ（「Ｌ－Ｍｙｃ」とも呼ばれる）遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子及びＭｙｃｎ（「Ｎ－Ｍｙｃ」遺伝子）を含むＭｙｃ遺伝子のファミリーに属するメンバーの１つである。Ｍｙｃｌ遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子と同様に癌遺伝子であって、初期化遺伝子としても知られている。また、Ｍｙｃｌ遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子と異なり、形質転換能がほとんどないことが分かっている（Nakagawa, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 107, p.14152-14157, 2010）。なお、Ｍｙｃｌのマウス及びヒトのｃＤＮＡ配列情報は、それぞれＮＣＢＩアクセッション番号のＮＭ　００８５０６及びＮＭ　００１０３３０８１を参照することにより取得することができ、当業者は容易にｃＤＮＡを単離することができる。
　本発明によれば、単離されたＭｙｃｌ遺伝子及びその遺伝子産物を使用することが好ましい。Ｍｙｃｌ遺伝子は、上記の通り、ＮＣＢＩアクセッション番号によりその塩基配列を特定することができるが、使用可能なＭｙｃｌ遺伝子としては、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含まれる。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、化学修飾されたＤＮＡ及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入された膵島細胞（すなわち、膵島様細胞）が、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現により、細胞増殖し、その発現の停止によりインスリン産生を促す作用を有するものであれば、特に限定されない。
　一実施形態において、Ｍｙｃｌ遺伝子は、
　（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む若しくはそれからなる核酸；又は
　（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む若しくはそれからなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、並びにＭｙｃｌ遺伝子が発現誘導された場合に、膵島様細胞の増殖活性を持続及び／又は促進させる機能を有するポリペプチドをコードする核酸；又は
　（３）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む若しくはそれからなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、並びにＭｙｃｌ遺伝子が導入された膵島様細胞を増殖させた結果、インスリン産生細胞を持続的に増殖させる効果、ひいてはインスリン産生を持続的に促進させる効果を有するポリペプチドをコードする核酸を含む／それからなるものであり得る。
　本明細書において使用するとき、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２－７．４５（２００１）に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０～５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ～６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識する。
　上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列番号１又は３に記載の塩基配列に対して、それぞれ、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらになお好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。
　一実施形態において、Ｍｙｃｌ遺伝子の遺伝子産物は、上記されるＭｙｃｌ遺伝子から発現されたポリペプチドである。典型的には、該ポリペプチドは、
　（１）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなるポリペプチド；又は
　（２）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに膵島様細胞の増殖活性をグルコース濃度依存的に持続及び／又は促進させる機能を有するポリペプチドであり得る。
　一実施形態において、Ｍｙｃｌ遺伝子の遺伝子産物は、上記で定義されるポリペプチドの変異体であってもよく、配列番号２又は４のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列であり得る。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
　アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加による変異体は、Ｍｙｃｌ遺伝子に、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７－６５００，１９８２）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、場合により、１又は数個のアミノ酸を意味してもよい。
　なお、ポリペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入又は付加し、次いで連結する方法もある。限定されるものではないが、本発明におけるＭｙｃｌ遺伝子の遺伝子産物は、配列番号２又は４において１～１０個、好ましくは９個以下、７個以下、５個以下、３個以下、２個以下、より好ましくは１個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、インスリン産生を促進する活性を有するポリペプチドであり得る。
　変異体はさらに、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、膵島様細胞を増殖させる効果及び／又はインスリン産生を促進する効果を有するポリペプチドである。
　２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３－４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５－１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
（５）Ｍｙｃｌ遺伝子の導入
　本発明によれば、Ｍｙｃｌ遺伝子を初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞）に導入する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法を用いることができる。遺伝子導入手段として、「形質転換」又は「トランスフェクション」が一般的であり、これは、外因性の核酸（例えば、宿主細胞に対して外来ＤＮＡ又はＲＮＡ）の取込み後に細胞に誘導される一過的又は安定的な遺伝的変化を意味する。通常、遺伝的変化は、外因性の核酸を宿主細胞のゲノムに取り込むことによって、又はエピソーム成分として、若しくは独立して外因性の核酸を一過的又は安定的に維持することにより達成され得る。本発明によれば、導入されたＭｙｃｌ遺伝子は、該遺伝子の発現のオン／オフを制御することができれば、宿主細胞のゲノムに組み込まれた状態であってもよく、又はエピソーム成分として存在してもよく、又は該遺伝子を含むプラスミド若しくはベクターのまま細胞質に存在してもよい。
　通常、宿主細胞への外因性の核酸（好ましくはＤＮＡ）の導入には、「ベクター」が使用される。一般的に、ベクターとしては、ウイルス、特に弱毒化ウイルス及び／又は複製不能ウイルスが含まれる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、ベクターは、外因性の核酸の発現が可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。ここで、「プロモーター」はまた、細胞種特異的に制御可能な、組織特異的に制御可能な、又は外部のシグナルもしくは薬剤で誘導可能な、プロモーター依存性遺伝子発現に十分なプロモーター成分を含むことが意図される。そのような成分は、天然遺伝子の５’領域又は３’領域に位置している可能性がある。また、「機能的に結合された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が制御配列に結合されたときに発現が可能になるように、ＤＮＡ配列と制御配列が結合していることを意味する。
　また、宿主細胞へのベクターの導入は、限定されないが、エレクトロポレーション法（Ｍｅｉｎｅｒ，Ｖ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４０４１－１４０４６（１９９６）など）、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、遺伝子導入用リピッド（リポフェクタミン、リポフェクチンなど）を用いる方法により行われる。その後、ベクターが導入された細胞を、マーカー遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）の特性に基づき選択することができる。選択された細胞において正しく相同組換えが起こっていることは対象とする外因性の核酸の一部をプローブとして用いたサザンブロット等により確認することができる。このようにして、対象とする遺伝子、具体的には、Ｍｙｃｌ遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子をヘテロで含有する細胞を作製することができる。
　ＥＳ細胞としては、Ｃｏｌａ１遺伝子座の下流にＦｒｔ配列を有し、内在性のＲｏｓａ２６プロモーターの制御下でリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるＭ２－ｒｔＴＡを発現するＫＨ２株を用いることができる（Ｂｅａｒｄ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌ．４４，ｐ．２３－２８（２００６））。該ＥＳ細胞へのＭｙｃｌ遺伝子の導入は、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、例えば、Ｍｙｃｌ遺伝子をＴＡクローニングにより、エントリーベクターであるｐＣＲ８－ＧＷ－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入後、該ベクターと、例えば、Ｃｏｌｌａ１－ＴｅｔＯＰ－ＡｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ＡｔｔＲ２－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクター間でＬＲ反応を行って、ＴｅｔＯＰ－Ｍｙｃｌ－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターを遺伝子導入用ベクターとして使用することができる。ここで、ベクター中の「ＴｅｔＯＰ（オペロン）」配列は、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子が結合する配列（テトラサイクリン応答因子：ＴＲＥ）であり、細胞に添加されたドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのリバーステトラサイクリンに依存して宿主細胞から発現したリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子が結合し、その下流に連結された遺伝子の発現が誘導される。また、「ｉｒｅｓ」（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）はリボソーム内部認識配列であり、「ｍＣｈｅｒｒｙ」は、赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（レポーター遺伝子）である。該ベクターをｆｌｉｐａｓｅをコードする核酸とともにＫＨ２－ＥＳ細胞に導入することにより、Ｍｙｃｌ遺伝子をＥＳ細胞の染色体に組み込むことができる。また、上記のような「ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙ」を含むベクターの他に、耐性遺伝子を含有させた「ｉｒｅｓ－βｇｅｏ（βガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子）カセット」（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ　Ｐ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４３０３－４３０７（１９９４））を含有するｐＢＳＳＫ（－）－ＩＲＥＳ－βｇｅｏ、ＩＲＥＳ－Ｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシン耐性遺伝子）カセットを含有する同様のベクターなどを使用してもよい。
　本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子の一過性発現を制御することにより、膵島様細胞の増殖、及びインスリン産生細胞へと分化させることができる。このように、本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子の一過性発現を特徴とするが、Ｍｙｃｌ遺伝子を一過性に発現させた場合、膵島様細胞の細胞分裂に伴って、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入されている細胞数が相対的に減少するため、時間とともにＭｙｃｌ遺伝子の発現量を自然と減少又は停止させることができる。すなわち、一実施形態では、本発明は、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現の「オン」制御により、本発明の目的が達成される。また、別の実施形態では、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現を強制的に「オフ」にすることも可能である（以下、「オン／オフ」制御という）。
　上記のようにリバーステトラサイクリンを用いることにより、宿主細胞に導入されたＭｙｃｌ遺伝子の発現をオン／オフ制御することができる。すなわち、リバーステトラサイクリンの存在下では、Ｍｙｃｌ遺伝子は細胞内で発現し続け、膵島様細胞を増殖させることができ、一方、リバーステトラサイクリンを除くことによって、膵島様細胞の増殖を停止させ、インスリン産生細胞へと分化を誘導させることができる。本発明においては、膵島様細胞に導入されたＭｙｃｌ遺伝子の一過的な発現（オン状態）は、細胞培養開始から少なくとも２日から最大１００日、例えば、９０日、８０日、７０日、６０日の期間であることが好ましい。一方で、Ｍｙｃｌ遺伝子が導入された膵島様細胞は、上記の期間で増殖することが好ましい。
　Ｍｙｃｌ遺伝子の発現をオン／オフ制御する代替の手段として、ウイルスベクターの遺伝子発現及び細胞増殖を光照射で精度よくスイッチオン／オフできる「光制御性ウイルスベクター」（Ｔａｈａｒａ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１６，１１５８７－１１５８９，２０１９）を用いることができる。これは、マグネットと呼ばれる光スイッチタンパク質をコードする遺伝子がウイルスベクターに導入されたものであり、同ベクターに組み込んだ標的遺伝子の発現を青色光を使用して制御することができるものである。
　Ｍｙｃｌ遺伝子の発現をオン／オフ制御する代替の別の例としては、エピソーマルベクター（Ｏｋｉｔａ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ　８（５）：４０９－４１２）、センダイウイルス、ＲＮＡベクター（Ｗａｒｒｅｎ　Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２０１０　Ｎｏｖ　７（５）：６１８－６３０）が挙げられる。これらに限定されず、上記したｉＰＳ細胞の初期化（樹立）に使用した方法（すなわち、一時的に遺伝子を誘導する方法）を用いることができる。
　本発明によれば、単離された外来性Ｍｙｃｌ遺伝子を導入する他に、細胞に内在するＭｙｃｌ遺伝子を強制的に発現させることによって、本発明の目的を達成することができる。内因性のＭｙｃｌ遺伝子を発現させる手段としては、限定されないが、野生型のプロモーターやエンハンサーを、Ｍｙｃｌ遺伝子を操作可能に発現誘導させるための強力なプロモーターやエンハンサーで置換し、強制的に遺伝子発現させる方法であってもよい。置換に使用されるプロモーターの例としては、強力なプロモーターであるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、インデューサーの存在下で機能する誘導性プロモーターなどが挙げられる。一方、置換に使用されるエンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー、ヘルペスＢウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルスエンハンサー、α－フェトプロテインエンハンサーなどが挙げられる。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ　ＴｙｐｅＩＩ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９を含む）の他、ＣＲＩＳＰＲ－ｔｙｐｅ　Ｉ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮのゲノム認識配列にプロモーター及び／又エンハンサーを活性化させることができる脱メチル化酵素、ヒストン修飾酵素、転写活性化因子、具体的にはＶＰ６４、ｐ６５、Ｒｔａ等を付加した分子を利用することができる。本明細書においては、上記されるプロモーター、エンハンサー、これらを活性化する酵素及び因子、又は核酸タンパク質複合体若しくは低分子化合物を、Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための「活性剤」と呼ぶことがある。
（６）Ｍｙｃｌ遺伝子の遺伝子産物の導入
　Ｍｙｃｌ遺伝子産物の細胞への導入は、外来遺伝子やタンパク質を細胞に導入する一般的な方法により行うことができる。例えば、このような方法には、限定されないが、トランスフェクション試薬を用いる方法、ウイルスを用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ソノポレーション法、リポソーム融合法、及びマイクロマニピュレーター、レーザー光照射によって細胞膜に細孔を形成させることによる導入法などが挙げられる。
（７）キメラ哺乳動物の作製
　ＥＳ細胞を哺乳動物に導入して、キメラ哺乳動物を作製する方法は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。まず、上記のＭｙｃｌ遺伝子が導入されたＥＳ細胞の培養には、当業者に知られた如何なる培地を用いることができる。例えば、該ＥＳ細胞をフィーダー細胞上で培養する場合、フィーダー細胞（例えば、ＭＥＦ（マウス胎児繊維芽細胞））を用いることができ、このフィーダー細胞上で該ＥＳ細胞をＥＳ細胞用培地（例えば、１５％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸を含むノックアウトＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ、ＧＩＢＣＯ）及びＬＩＦ（ＳＩＧＭＡ）を添加した培地）を使用することができる。
　次に、上記ＥＳ細胞を哺乳動物に導入してノックアウト動物（Ｍｙｃｌ遺伝子ノックイン動物）を作製する。ここでは、哺乳度物としてマウスを例にして説明するが、ノックインマウスの作製方法は当業者に周知である。具体的には、上記ＥＳ細胞をマウス（例えばＣ５７ＢＬ／６等）の胚盤胞にインジェクトし、偽妊娠させたメスのマウス（ＩＣＲ等）の子宮内に移植することによりキメラマウスを作製することができる。その後、キメラマウスと通常のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６等）とを交配させ、Ｍｙｃｌ遺伝子がヘテロでノックインされたヘテロ変異マウスを作製することができる。ヘテロ変異マウス同士を交配させることにより、Ｍｙｃｌ遺伝子がホモでノックインされたホモ変異マウスを得ることができる。以上のノックインマウスの作製については、ＥＣＡＴ３ノックインマウス（Ｔｏｋｕｚａｗａ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３（８）：２６９９－２７０８（２００３））、ＥＣＡＴ４ノックインマウス（Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３：６３１－６４２（２００３））、ＥＣＡＴ５ノックインマウス（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｋ．Ｍｉｔｓｕｉ，ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｎａｔｕｒｅ，４２３（６９３９）：ｐ５４１－５４５（２００３）、特開２００３－２６５１６６号公報）等を参考にされたい。
　また、キメラ哺乳動物は、上記のＥＳ細胞に限らず、ｉＰＳ細胞を用いても作製することができる。例えば、胚盤胞補完作法を用いて、非ヒト哺乳動物内でヒトｉＰＳ細胞から臓器（器官）を作製することができる。例えば、中内らは、無膵性クローンブタの生体内で、ヒトｉＰＳから誘導したヒト膵臓を発生させている（Ｎａｋａｕｃｈｕ，Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．１，４５５７－４５６２（２０１３）を参照されたい）。
２．膵島様細胞の増殖及び分化の制御
　本発明によれば、インビトロ及びインビボにおいて、上記で作製した膵島様細胞の増殖及び分化を制御することができる。Ｍｙｃｌ遺伝子の誘導方法は、該遺伝子を細胞に導入するために用いた上述の方法に準じて選択可能である。例えば、上述したようなＴｅｔＯＰ－Ｍｙｃｌ－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターを遺伝子導入用ベクターとして使用して細胞にＭｙｃｌ遺伝子を導入した場合、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのリバーステトラサイクリンに依存して宿主細胞から発現したリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子が結合し、その下流に連結されたＭｙｃｌ遺伝子を発現させて、膵島様細胞の増殖を誘導することができる。細胞培養系にＤｏｘの添加する濃度は、適宜調整され得る。例えば、１～１００ｍｇ／ｍＬなどであってもよい。Ｄｏｘの添加によって膵島様細胞を増殖させた後、例えば、Ｄｏｘ不含の培地に置換することによって増殖を停止し、インスリン産生などの細胞分化を誘導することができる。
　インビボでは、キメラ非ヒト哺乳動物に、例えば、Ｄｏｘ含有の水を与えることによって、膵臓内で膵島様細胞の増殖を誘導することができる。水に添加した場合のＤｏｘの濃度は、例えば、例えば、１～１００ｍｇ／ｍＬなどであってもよく、好ましくは２．０ｍｇ／ｍＬである。キメラ非マウスを用いる場合、生後８週齢までは、膵臓が日齢の増加とともに成長するため、成長が停止した時期、例えば、生後８週齢以降にＤｏｘを投与することが挙げられるが、増殖さえ誘導することができれば、週齢は限定されない。
３．インスリン産生能を有する膵島細胞又はその前駆細胞の製造方法
　本発明によれば、インスリン産生能を有する膵島細胞又はその前駆細胞を製造する方法が提供される。このような製造方法は、限定されないが、初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞由来である膵島細胞を原料として、Ｍｙｃｌ遺伝子を該膵島細胞に導入し、Ｍｙｃｌ遺伝子の強制発現により細胞を増殖させた後、該遺伝子の発現を停止させることによって、インスリン産生能を有する膵島細胞又はその前駆細胞を得ることを含む。なお、Ｍｙｃｌ遺伝子の強制発現及び停止は、上述したように、例えば、該遺伝子の発現をオン／オフ制御する代替の手段（例えば、光制御性ウイルスベクターの使用）、又はドキシサイクリン感受性のリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子を利用することができる。本明細書において使用する場合、「膵島細胞の前駆細胞」又は「膵島前駆細胞」は、Ｍｙｃｌ遺伝子の発現停止後、インスリン産生能を有する膵島細胞へと分化していく途中の細胞（又は細胞群）を指し、例えば、ＰＤＸ１陽性、ＰＴＦ１ａ陽性、ＮＫＸ６．１陽性、Ｆｅｖ陽性、Ｐａｘ４陽性、及びＣｃｋ遺伝子からなる群から１つ以上選択されるマーカーを指標として同定され得る。
４．膵島様細胞の増殖方法
　これまで、Ｍｙｃｌ遺伝子導入による成熟膵島細胞の増幅効率が限られる場合があった。特に、膵島様細胞の増殖を長期間実施した場合に、増幅効率が低くなる場合が認められた。本発明によれば、より高濃度のグルコース刺激を与えることにより、Ｍｙｃｌ遺伝子による成熟膵島細胞のさらなる増殖を誘導することができる。従って、高濃度のグルコースを含有する培地を用いたＭｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞の培養方法、すなわちＭｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞の増殖活性をグルコース濃度依存的に持続及び／又は促進させる方法を提供する。グルコース濃度依存的とは、一定の濃度範囲において（例えば、１０ｇ／Ｌ以下）、より高濃度のグルコース刺激により、当該膵島細胞のさらなる増殖を誘導することができるという意味である。一実施形態では、膵島様細胞の培養は、Ｍｙｃｌ遺伝子の一過的な発現（オン状態）に合わせて、高濃度のグルコースを含有する培地（単に、「高グルコース培地」と称することがある）で行われる。高グルコース培地とは、培地中のグルコース濃度が３ｇ／Ｌ以上である培地を指し、好ましくは３．５～１０ｇ／Ｌ、より好ましくは４～７ｇ／Ｌ、さらに好ましくは４～６ｇ／Ｌのグルコース濃度を有する培地である。
　高グルコース培地を使用する一態様において、高グルコース培地により一定期間培養した後、低グルコース培地で一定期間培養し、その後、再度高グルコース培地により一定期間培養することにより、高グルコース培地と低グルコース培地を交互に適用（使用）してもよい。高グルコース培地と低グルコース培地を交互に適用（使用）して培養することにより、膵島様細胞の増殖活性を長期間にわたって維持することができる。「低グルコース培地」とは、「低濃度グルコース培地」と互換的に使用され、具体的には、培地中のグルコース濃度が３ｇ／Ｌ未満である培地を指し、好ましくは０．１～２．８ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５～２．５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１～２ｇ／Ｌのグルコースの濃度を有する培地である。なお、高グルコース培地と低グルコース培地とを交換する時期は、適宜調整することができるが、例えば、膵島様細胞の継代のタイミング（例えば、限定されないが、１日に１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、又は７日に１回など）に合わせることができる。このようなグルコース濃度の変更により、例えば、１カ月以上、３カ月以上、６カ月以上、８カ月以上、１年以上にわたって長期間膵島様細胞の増殖活性を維持することができる。膵島様細胞から膵島細胞へ成熟させた場合の機能、例えば、グルコース依存的インスリン分泌能を好ましく維持させるという観点では、グルコース濃度の変更により培養する期間は、１年未満、好ましくは８カ月未満、より好ましくは６カ月未満、さらに好ましくは３カ月未満、さらにより１カ月未満である。
　グルコースに限らず、グルコースにより活性化される経路を調節することにより、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞を増殖させることができる。本明細書において、グルコースにより活性化される経路を調節するとは、グルコース刺激活性化経路を賦活化させる方法及びグルコース刺激活性化経路を賦活化する期間と賦活化しない期間を交互に繰り返す方法を含む。グルコース刺激活性化経路とは、グルコース刺激活性化経路とは、グルコースによって刺激されるシグナル伝達経路をいい、例えば一態様として、ＧＫ経路をいう。本発明において、Ｍｙｃｌ経路刺激による膵島様細胞の増殖活性を濃度依存的に持続及び／又は促進させるために添加する、グルコース刺激活性化経路を賦活化させる物質は、グルコキナーゼ経路を活性化させるものであれば特に限定はなく、例えば、上記グルコースの他、スクロース、グルコキナーゼ活性化剤（公知のＣｐｄ　Ａ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＣＡＳ　６０３１０８－４４－７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，３４６０２１）、グルコキナーゼアクチベーターＩＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，５００４８７）、グルコキナーゼアクチベーターＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＣＡＳ　３００３５３－１３－３；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，５０９６６５）等が挙げられる。
　高グルコース培地及び低グルコース培地は、市販されている細胞培養用基礎培地を適宜配合して調製することができる。細胞培養用基礎培地には、主に炭素源、窒素源の他、アミノ酸類（例えば、必須アミノ酸）、ビタミン類（例えば、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン）等の微量栄養素、無機塩類、タンパク質（例えば、アルブミン、トランスフェリン、インスリン）、還元剤（例えば、グルタチオン）、微量元素（例えば、メタバナジン酸アンモニウム、塩化マンガン、亜セレン酸ナトリウム）及びその他の物質（例えば、エタノールアミン、ハイポキサンチンナトリウム、脂肪酸、プトレシン、ピルビン酸、チミヂン、フェノールレッド）が含まれるが、適宜含まれる成分や成分の濃度を調節することができる。当該培地の調製に使用可能な基礎培地は、市販の基礎培地から、メーカー等が公表している成分表に基づき、上記濃度のグルコースを含有する培地を適宜選択すればよい。また、特定の成分（特にグルコース刺激活性化経路賦活剤）を別途調製し好ましい濃度で添加することも、個別にカスタマイズした培地を培地メーカーから購入することも可能である。使用可能な基礎培地としては、例えば、市販のＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等を例示することができる。
　当該基礎培地には、さらに成長因子を含んでもよい。好ましく添加される成長因子としては、限定されないが、例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ－１０、Ｇａｓｔｒｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｂ２７サプリメントなどが挙げられる。例えば、ＦＧＦ－１０は細胞（膵島前駆細胞を含む）を増殖させる効果を持つことが一般的に知られているが、添加していてもされていなくても、グルコースにより活性化される経路を調節することによる膵島様細胞の増殖活性を維持することができる。このため、本明細書において、グルコース刺激活性化経路賦活剤を用いた膵島細胞の増殖方法を培養する方法では、ＦＧＦ１０の添加はしてもしなくてもよいが、より安定して増殖させるという観点からはＦＧＦ１０を添加することが好ましい。
　また、生体内において、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞を増幅させることも可能である。具体的には、生体内においてグルコースにより活性化される経路を調節すればよく、一態様として、「高グルコース培地」及び「低グルコース培地」の代わりに、上記グルコース濃度が最終濃度となるように調整された緩衝液の形態で生体内に投与してもよい。この場合、用語「高グルコース培地」を「高グルコース緩衝液」とし、用語「低グルコース培地」を「低グルコース緩衝液」として区別してもよい。なお、適用される「高グルコース緩衝液」と「低グルコース緩衝液」の交換する時期は、限定されないが、例えば、１日に１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、又は７日に１回などであり得る。また、生体に摂取される場合、十分量の血糖上昇を生じさせることが想定されるグルコースやスクロース等を含有する飲料の形態であってもよい。
５．医薬用途
　本発明によれば、導入されたＭｙｃｌ遺伝子の発現を制御し、グルコースにより活性化される経路を調節することにより、膵島様細胞の増殖活性を高め、膵島様細胞の増殖活性を長期間にわたり維持し、膵島様細胞の増殖とともにインスリン産生を促進させることができる。したがって、一態様では、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物及びグルコース等のグルコース刺激活性化経路賦活剤により増殖活性が長期間維持又は促進された膵島様細胞を有効成分として含むインスリン産生促進剤；上記有効成分及び薬学的に許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有する医薬組成物；上記インスリン産生促進剤又は医薬組成物を用いた糖尿病患者の予防及び／又は治療法；並びに上記インスリン産生促進剤又は医薬組成物を製造するためのＭｙｃｌ遺伝子及びグルコース刺激活性化経路賦活剤の使用が提供される。
　別の態様では、糖尿病の予防及び／又は治療目的で、導入されたＭｙｃｌ遺伝子の発現を制御し、グルコースにより活性化される経路を調節することにより、増殖活性を高め、膵島様細胞の増殖活性を長期間にわたり持続及び促進させた膵島様細胞を対象に移植する方法（エクスビボ法）が提供される。なお、本発明のエクスビボ法は、使用される細胞により、異なる態様が意図される。例えば、（ｉ）成体の膵島由来の細胞へ遺伝子導入して得られる膵島様細胞を他家インビトロ又は自家インビトロで製造する態様（いずれも含む狭義のエクスビボ法）；（ｉｉ）分化誘導して得られる膵島様細胞、即ち、幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞など）由来の膵島細胞のＭｙｃｌ遺伝子を導入して得られる膵島様細胞を他家インビトロ又は自家インビトロでの製造する態様（広義のエクスビボ法）；（ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）においてＭｙｃｌ遺伝子が機能発現して、増殖中の膵島前駆細胞様細胞であり得る態様；（ｉｖ）上記（ｉ）～（ｉｉｉ）から分化して生成されるインスリン産生細胞又は膵島細胞（Ｍｙｃｌ遺伝子を含まない）である態様が挙げられる。
　本発明の一態様として、細胞が、患者に対して自家であるか他家であるかを問わず、公知の方法、具体的にはＮａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｖｏｌｕｍｅ　２２，ｐａｇｅｓ３０６－３１１（２０１６）．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｖｏｌｕｍｅ　２，ｐａｇｅｓ８１０－８２１（２０１８）．，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１８－０２７５－１、ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ　１２（２０１６）２５５～２６２．，ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｂｉｏｍ．２０１６．０８．０３４等に記載の方法により、移植する膵島をカプセル化して投与してもよい。移植する膵島をカプセル化することにより、免疫抑制剤を使用しない、又は免疫抑制剤の投与量を低減することが可能である。
　本明細書の一態様として、単離した膵島について適宜遺伝子編集することができる。編集する遺伝子は特に限定されないが、具体的には、ゲノム編集による膵島細胞に含まれる変異遺伝子の修正、ＨＬＡやＧＡＤタンパク質等の表面抗原等、免疫反応を引き起こす分子の改変、Ｂｅｔａ－２　ＭｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎやＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＣＩＩＴＡ遺伝子の欠失により免疫寛容を誘導する等、治療において好ましい特徴を付加することができる。遺伝子編集の方法は特に限定されないが、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３、ＣＲＩＳＰＲ－ＴｙｐｅＩ－Ｄ、ＭＡＤ７及びこれらの改変体や、機能分子を発現させるためのｐｉｇｇｙＢＡＣ等のトランスポゾンベクターが具体的に挙げられる
（１）適応疾患
　上記の態様に基づいて適用され得る疾患は、生体においてインスリンが十分に機能していない状態にある疾患である。このような疾患としては、典型的には、分泌低下が認められる病態やＩ型糖尿病、インスリンが相対的に不足するインスリン抵抗性の状態やＩＩ型糖尿病、及びＩ型糖尿病とＩＩ型糖尿病の中間の病態である１．５型糖尿病が挙げられる。本発明によれば、導入されたＭｙｃｌ遺伝子の発現を制御し、グルコースにより活性化される経路を調節することにより、増殖活性を長期間にわたり持続及び促進させた膵島様細胞により、インスリン産生を促進することができ、例えば、糖尿病患者に対して血糖を低下させる作用を有する。適応疾患としては、典型的には、糖尿病であるが、より詳細には、重症低血糖症、Ｉ型糖尿病（緩徐進行１型糖尿病又は１．５型糖尿病を含む）、ＩＩ型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、異脂肪血症、肥満症又は代謝症候群に関連する疾患、障害又は症状、その他の特定の機序や疾患によるものであって、例えば、膵β細胞機能に関与する遺伝子異常、インスリン作用の伝達機構に関与する遺伝子異常、他の疾患や条件に伴うものとして膵外分泌疾患、内分泌疾患、肝疾患、薬剤や化学物質によるもの、感染症、免疫機序による希少な病態など、あるいは妊娠糖尿病などが挙げられる。さらに、糖尿病に起因した糖尿病性合併症（例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）も適応疾患に含めることができる。また、膵炎や膵臓癌に伴う膵臓全摘出手術又は膵臓部分切除の結果引き起こされるインスリン分泌不全状態も適応疾患に含めることができる。
　さらに、本明細書に記載される方法により治療し得る糖尿病の種類としては特に限定されないが、本方法により、血糖値に依存して生理的なインスリンを分泌する、低血糖症を生じにくい治療を提供することができる。例えば、重症低血糖症の治療に用いる場合には、限定されないが、重症低血糖症に対してドナー膵島が著明な効果を示すことが当業者に知られていることから、一態様として公知の文献に記載の方法を用いることができる。ここでいう公知の文献に記載の方法とは、限定されないが、例えば、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ　２０１６　Ｊｕｌ；　３９（７）：１２３０～１２４０．，ＤＯＩ：１０．２３３７／ｄｃ１５－１９８８、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３４３（４）：２３０～２３８．，ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭ２００００７２７３４３０４０１、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３５５（１３）：１３１８～１３３０．，ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０６１２６７等が具体的に挙げられる。
　また、Ｉ型糖尿病の治療に用いる場合、特に限定はないが、Ｉ型糖尿病に対する治療の一態様として、例えば、Ｉ型糖尿病患者の随時、空腹時、糖負荷後及び／又はグルカゴン刺激後のインスリン、血糖値及び／又はＣペプチド量に応じて、含有する膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞の数を調整してもよく、本明細書中に記載の方法により、インビボ治療を行うための剤の投与量を決定してもよい。インスリン枯渇状態であるＩ型糖尿病患者は、低血糖症状を呈するリスクが高く、本明細書に記載される方法を用いた治療が好ましいという観点からは、例えば、空腹時及び／又はグルカゴン刺激時の血中Ｃペプチド量が０．５ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以下のＩ型糖尿病患者を対象として治療することができる。具体的な剤の投与量は、例えば、通常重症低血糖症を適応として移植されるドナー膵島の移植量を参考にして調整すればよい。具体的には、例えば、５００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、好ましくは１０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、より好ましくは２０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、さらにより好ましくは５０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上の膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞である。
　また、ＩＩ型糖尿病の治療に用いる場合、特に限定はないが、例えば一態様として、体内に分泌されるインスリン量が不足する、インスリン依存状態のＩＩ型糖尿病の治療剤として使用することができる。具体的には、例えば、ＩＩ型糖尿病患者の随時、空腹時、糖負荷後及び／又はグルカゴン刺激後のインスリン、血糖値及び／又はＣペプチド量に応じて含有する膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞の数を調整してもよく、本明細書に記載される方法により、インビボ治療を行うための剤の投与量を決定してもよい。インスリンが不足している病態で好ましい効果が得られるという観点からは、例えば、空腹時及び／又はグルカゴン刺激時の血中Ｃペプチド量が０．５ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以下のＩＩ型糖尿病患者を対象として治療することができる。具体的な剤の投与量は、例えば、通常、重症低血糖症を適応として移植されるドナー膵島の移植量を参考にして調整すればよい。具体的には、例えば、５００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、好ましくは１０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、より好ましくは２０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上、さらにより好ましくは５０００ＩＥＱ／ｋｇ相当以上の膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞である。
　また、緩徐進行Ｉ型糖尿病の治療剤として使用する場合、限定されないが、Ｉ型糖尿病及び又はＩＩ型糖尿病と同様にして体内のインスリン、血糖値及び／又はＣペプチド量に応じて含有する剤の量を調整することができる。この場合、本明細書の方法により増幅させる膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞は、好ましくは患者自身の細胞を由来とする。例えば、緩徐進行Ｉ型糖尿病の治療の一態様として、好ましくは、血中の膵島細胞に対する自己抗体やＨＬＡのタイプを事前に調べておき、インスリン依存状態及び／又はインスリン枯渇状態に陥る前又は陥った後に自己の膵島細胞を本明細書の方法により増幅してやることができれば、免疫抑制剤が不要な治療が可能となり、インスリン依存状態及び／又はインスリン枯渇状態への移行を予防することができる、又はインスリン依存状態及び／又はインスリン枯渇状態を治療することができる。緩徐進行Ｉ型糖尿病であるかどうかを判別するためには、血中の膵島細胞に対する自己抗体やＨＬＡのタイプが緩徐進行Ｉ型糖尿病に関与していれば、特に限定されないが、例えば、膵島細胞抗体（ＩＣＡ）、ＧＡＤ抗体、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、ＩＡ－２抗体などの膵島関連自己抗体が重複もしくは単独で陽性を示すかどうかを確認するといった、公知の方法が挙げられる。さらに、ＨＬＡとしてＨＬＡ－ＤＲ４－ＤＱＡ１＊０３０１－Ｂ１＊０４０１等の緩徐進行Ｉ型糖尿病と関連するＨＬＡを保有するかどうかといった、公知の方法により確認してもよい。
　また、ドナー膵島により治療効果が認められるという観点からは、重症低血糖症の治療はエクスビボ法が好ましいが、本明細書に記載の方法により体内で（インビボで）膵島細胞を増幅させることができる。このようにして増幅させた膵島細胞により、エクスビボ法と同様の効果が認められるため、インビボで膵島を増幅させる治療方法もエクスビボ法と同様に重症低血糖症の治療方法として好ましく選択することができる。さらに、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、緩徐進行Ｉ型糖尿病の治療についても、エクスビボ法と同様に、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、体内で（インビボで）膵島細胞を増幅させる方法を選択することができる。この時、体内で（インビボで）膵島細胞を増幅させる方法とエクスビボ法を組み合わせることもできる。
　本発明によれば、このような疾患を予防及び／又は治療することができる。本明細書で使用する場合、用語「予防（する）」とは、上記の疾患又はその症状の発症／発現を防止若しくは遅延すること、又は発症／発現の危険性を低下させることをいう。「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病（障害）又はその症状の発症／発現を防止又は遅延すること、或いは発症／発現の危険性を低下させることをいう。一方、「改善」とは、疾病（障害）又はその症状が緩和（軽症化）、好転、寛解、又は治癒（部分的な治癒を含む）することをいう。
（２）インスリン産生促進剤及び医薬組成物
　本発明のＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物及びグルコース刺激活性化経路賦活剤により増殖活性が長期間維持又は促進された膵島様細胞を有効成分として含むインスリン産生促進剤又は医薬品組成物は、上記適応疾患に対する予防及び治療に提供され得る。ここで、膵島細胞増幅促進剤の一態様としては、膵島に含まれるα細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞のうちいずれか一つ、好ましくは任意の二つ以上の膵島細胞を増殖させる剤をいう。また、膵島機能改善剤の一態様としては、投与することにより、生体における膵島が担う機能の一部又は全部を改善させる剤のことをいい、膵島の機能の一部とは例えば、膵島細胞による血糖調節作用、インスリンよる血糖降下作用、グルカゴンによるグルコース産生・放出作用、ソマトスタチンによるガストリン、セクレチン、インスリン及び／又はグルカゴンの分泌抑制作用若しくは消化管における栄養吸収抑制作用等、グレリンによる食欲調節作用、膵ポリペプチドによる胆嚢収縮調節作用や食欲調節作用が具体的に挙げられる。また、インスリン産生促進剤の一態様としては、例えば、生体内で膵島が担う機能の一つである、血糖値に応じた生理的なインスリン分泌を促進する剤が挙げられる。また、医薬組成物として提供される場合、上記の態様で使用されるＭｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物の有効成分の他に、薬学的に許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。さらに、場合により、Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤を含めてもよい。
　Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物が導入される生体由来の膵島細胞は、健常者の膵島細胞であってもよく、又は一部若しくは大部分のβ細胞が消失したＩ型糖尿病患者若しくは終末期ＩＩ型導尿病患者由来の膵島細胞であり得る。この場合、膵島細胞は、レシピエントに対して、自家又は他家であってもよい。
　本発明のインスリン産生促進剤及び医薬組成物は、限定されないが、上記で得られた膵島様細胞を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。なお、治療に必要とする細胞数は、Ｍｙｃｌ遺伝子を強制発現させ、適宜細胞を増殖させることにより得ることができる。
　また、インスリン産生促進剤及び医薬組成物への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等をインスリン産生促進剤及び医薬組成物に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）をインスリン産生促進剤及び医薬組成物に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度でインスリン産生促進剤及び医薬組成物に添加することができる。
　上記で調製されるインスリン産生促進剤及び医薬組成物中に含有する膵島細胞、膵島様細胞、膵島前駆細胞様細胞、又はインスリン産生細胞の数は、糖尿病及びそれに関連する疾患の予防及び／又は治療において所望の効果（例えば、血糖値の低下）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。
　本発明のインスリン産生促進及び医薬組成物は、様々な対象に投与することができ、例えば、霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの哺乳動物が意図され、好ましくはヒトである。また、対象への投与経路としては、限定されないが、非経口投与、例えば、注射又は注入により体内のグルコースに応答し得る任意の場所へ投与することができる。具体的には、例えば、膵臓内、腎被膜下、好ましくは皮下、腹腔内、より好ましくは血管内、静脈内、さらにより好ましくは門脈内に移植又は投与することができる。
　投与されたＭｙｃｌ遺伝子を生体内で活性化させる方法は、限定されないが、上述したＭｙｃｌ遺伝子発現の「オン」制御、又は「オン及び／又はオフ」制御のシステムを利用することができる。例えば、上述した「光制御性ウイルスベクター」（Ｔａｈａｒａ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１６，１１５８７－１１５８９，２０１９）を用いてもよい。
　また、Ｍｙｃｌ遺伝子の膵臓へのターゲティングを目的とした場合、膵島細胞に特異的に発現しているマーカー（例えば、ＰＤＸ１、Ｃ－ペプチド、インスリン、ＭａｆＡ、Ｍｎｘ１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、ＮｅｒｕｒｏＤ１、Ｉｓｌ１、Ｎｋｘ２．２、Ｎｇｎ３、ＨＮＦ１ａ、Ｆｏｘａ２、Ｎｋｘ６．１、グルカゴン、Ａｒｘ、ＭａｆＢ、ＲＦＸ６、ＩＲＸ１、ＩＲＸ２、ソマトスタチン）を標的として遺伝子導入することができる。体内で（インビボで）膵島細胞を増幅させる方法を選択する場合の対象への投与経路としては、限定されないが、例えば、膵臓内、皮下、腹腔内、好ましくは血管内、静脈内、さらにより好ましくは腹腔動脈内、膵管内が具体的に挙げられる。
（３）治療方法
　本発明によれば、Ｍｙｃｌ遺伝子又はその遺伝子産物及びグルコース刺激活性化経路賦活剤により増殖活性が長期間維持又は促進された膵島様細胞を用いて、糖尿病又はそれに関連する疾患を有する対象を予防及び／又は治療する方法が提供される。さらに、本発明によれば、上記治療方法において、Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤を投与することができ、インスリン産生促進剤又は医薬組成物の投与前に、同時に、又は後に投与してもよい。また、Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞を生体内において増幅させるために、食事、飲料水、点滴等により、生体内におけるグルコース等の濃度を調整してもよい。
（４）キット
　本発明によれば、インスリン産生促進剤又は医薬組成物を含む、糖尿病又はそれに関連する疾患を予防及び／又は治療するために使用されるキットが提供される。このようなキットには、上記インスリン産生促進剤又は医薬組成物を対象に投与又は移植するための使用説明書を含むことができる。また、キットには、Ｍｙｃｌ遺伝子を活性化させるための活性剤をさらに含み得る。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
方法
（ｉ）ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ；Ｄｏｘ）依存的にＭｙｃｌ発現誘導可能なＥＳ細胞の樹立
　Ｍｙｃｌ遺伝子導入のためのＥＳ細胞として、Ｃｏｌａ１遺伝子座の下流にＦｒｔ配列を有し、内在性のＲｏｓａ２６プロモーターの制御下でリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子であるＭ２－ｒｔＴＡを発現するＫＨ２株を用いた（Ｂｅａｒｄ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌ．４４，ｐ．２３－２８（２００６））。該ＥＳ細胞由来のｃＤＮＡからＭｙｃｌのｃＤＮＡのクローニングを行い、このクローニング断片をｐＣＲ８－ＧＷ－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ挿入した。Ｍｙｃｌ遺伝子が挿入されたｐＣＲ８－Ｍｙｃｌ－ＴＯＰＯベクターとＴｅｔＯＰ－ＡｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ＡｔｔＲ２－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクター間でＬＲ反応を行い作製したＣｏｌ１ａ１－ＴｅｔＯＰ－Ｍｙｃｌ－ｉｒｅｓ－ｍＣｈｅｒｒｙベクター（以下、「ターゲティングベクター」と呼ぶ）をｆｌｉｐ－ｉｎリコンビネーションシステム（Ｂｅａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，２００６）を用いることでＫＨ２－ＥＳ細胞のＣｏｌ１ａ１遺伝子座に挿入した。Ｆｌｉｐ－ｉｎリコンビネーションを行う際には、Ｍｙｃｌ遺伝子が挿入されたターゲティングベクター５０μｇとｐＦｌａｐａｓｅベクター２５μｇ及び２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社）を含む高グルコースＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔａｓｑｕｅ社）培地で懸濁した細胞懸濁液をＧｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ　Ｘｃｅｌｌ　エレクトロポレーションシステム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてＫＨ２－ＥＳ細胞にエレクトロポレーション（Ｖｏｌｔａｇｅ：５５０　Ｖ，Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ：２５μＦ，Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：∞，Ｃｕｖｅｔｔｅ：４ｍｍ以上の条件で２回パルス供給）した。エレクトロポレーションを行なった２４時間後、ハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ社）１５０μｇ／ｍＬで選択し、形成されたコロニーを拾い、Ｄｏｘ依存的にＭｙｃｌ遺伝子を発現誘導可能なＥＳ細胞株を樹立した。
（ｉｉ）細胞の培養方法
　フィーダー細胞（ＭＥＦ；マウス胎仔繊維芽細胞）の培養には、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）、５０Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ；Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）、Ｌ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ＮＥＡＡ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）を含むＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）培地を用いた。
　ＥＳ細胞の培養には、１５％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬ　Ｐ／Ｓ、Ｌ－グルタミン、ＮＥＡＡを含むｋｎｏｃｋ　ｏｕｔ－ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ：ＧＩＢＣＯ社）及びＬＩＦ（ＳＩＧＭＡ社）を添加した培地を用いて、ゼラチンコート（ＳＩＧＭＡ）し、フィーダー細胞を播種したディッシュで培養した。ＥＳ細胞の継代の際は、０．２５％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）で３７℃にて約３分間処理し、１／１０量程度の細胞懸濁液を新たなディッシュに播種した。
（ｉｉｉ）生体内Ｍｙｃｌ発現誘導可能なマウス（ＫＨ２－Ｍｙｃｌ）の作製
　Ｄｏｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）依存的にＭｙｃｌの発現を誘導可能なＥＳ細胞をマウス胚盤胞（ＩＣＲ，Ｅ３．５）にインジェクションし、偽妊娠２日目マウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ，清水実験材料）の子宮内に移植することにより、Ｄｏｘ依存的にＭｙｃｌ発現を誘導可能な細胞を有したキメラマウスを作製した。このマウスは、Ｄｏｘを投与することにより、全身性にＭｙｃｌ遺伝子及び赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを発現誘導可能である。
（ｉｖ）膵島細胞を追跡可能なマウス（Ｉｎｓ１－ｉｒｅｓ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ｇｃｇ－ＣｒｅＥＲＴ２，Ｓｓｔ－ｉｒｅｓ－ＣｒｅＥＲＴ２）
　α細胞特異的に発現する遺伝子Ｇｃｇの内在性プロモーターの下流、及びβ細胞特異的に発現する遺伝子Ｉｎｓ１、δ細胞特異的に発現する遺伝子Ｓｓｔの内在性遺伝子の下流にタモキシフェン誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼ（ＣｒｅＥＲＴ２）を導入したマウスを作製した。
（ｖ）ドキシサイクリンの投与
　８週齢のマウスを使用し、２．０ｍｇ／ｍＬのＤｏｘを含む溶液を飲水投与した。培養細胞においては、終濃度２．０μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加した。
（ｖｉ）マウス諸臓器における病理標本の作製
　マウスを解剖後、各臓器を４％ＰＦＡ（和光純薬社）内において１日振とうした翌日に７０％ＥｔＯＨ（和光純薬１００％ＥｔＯＨを希釈して使用）に移し、さらに１日振とうした。翌日、スピンティッシュプロセッサーＳＴＲ１２０（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を使用し、推奨プロトコールに従いブロックを作製した。病理標本の作製はバイオゲート株式会社に委託した。
（ｖｉｉ）免疫染色
　組織切片をキシレン（和光純薬社）、その後、１００％ＥｔＯＨ（和光純薬社）に各３０分以上浸した。水道水で約１０分間洗浄し、沸騰させた抗原賦活化液ｐＨ９（ニチレイバイオサイエンス社、１０倍希釈で使用）内に移し、１０分間抗原賦活化処理を行った。ブロッキング溶液（２％ＢＳＡ＋１×ＰＢＳ）により各倍率で希釈した１次抗体溶液を組織切片上に２００μＬ添加し、３０分～１時間静置した。１×ＰＢＳで２回洗浄した後、２次抗体溶液を組織切片上に２滴添加し、３０分間静置した。１×ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＢ染色の場合はＤＡＢ溶液（ニチレイバイオサイエンス社、ＤＡＢ基質キット使用、１ｍＬのＥｌｉｘ水に試薬Ａ及びＢを各１滴ずつ添加・混合後、試薬Ｃを１滴添加・混合したもの）を組織切片上に１５０μＬ添加し、抗原抗体反応を行った後、顕微鏡下で観察を行った。蛍光染色の場合は、組織切片上に封入材を１滴添加し、カバーガラスをかけた後、顕微鏡下で観察を行った。
＜使用した１次抗体（希釈倍率）－２次抗体＞
・抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体（ａｂｃａｍ社、１／５００）－抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
・抗Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ抗体（ａｂｃａｍ社、１／５００）－抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
・抗Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ　Ａ抗体（ＤＡＫＯ社、１／５００）－抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
・抗Ｋｉ６７抗体（ａｂｃａｍ社、１／２００）－抗ウサギＩｇＧ抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
・抗Ｉｎｓｕｌｉｎ抗体（ＤＡＫＯ社）－抗モルモットＩｇＧ抗体（ＢＩＯＴＩＵＭ社）
・抗Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社、１／３００）－抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＴＩＵＭ社）
・抗Ｇｌｕｃａｇｏｎ抗体（Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社、１／３００）－抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＴＩＵＭ社）
（ｖｉｉｉ）ＲＮＡ回収、ＲＮＡ抽出、及びｃＤＮＡ合成
　ＲＮＡ回収においては、培養細胞をＰＢＳ（－）（Ｎａｋａｌａｉ　Ｔａｓｑｕｅ）で洗浄後、３５０μＬのＬＢＰ緩衝液で細胞を溶解した。ＲＮＡ抽出にはＮｕｃｒｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ　Ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて、推奨プロトコールに従った。ｃＤＮＡの合成には、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて推奨プロトコールに従った。
（ｉｘ）ｑＲＴ－ＰＣＲ
　ＧｏＴａｑ　ｑＰＣＲマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、推奨プロトコールに従った。Ｓｔｅｐｏｎｅ　Ｐｌｕｓシステム（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により解析を行った。プライマー及びＰＣＲ反応条件は以下のものを使用した。
（ｂ）ＰＣＲ反応条件
　・９５℃、２分間
　・９５℃（１５秒）、６０℃（１分）［４０サイクル］
　・９５℃（１５秒）、６０℃（１分）、９５℃（１５秒）
（ｘ）膵島単離
　８週齢のＫＨ２－Ｍｙｃｌマウスにソムノペンチル（共立製薬株式会社）を腹腔内注射することで麻酔した。開腹後、十二指腸総胆管開口部を同定したのち、総胆管上部及び腸管をブルドック鉗子で止めた。総胆管を十二指腸との境目で切れ目を入れ、Ｃｏｌａｌｇｅｎａｓｅ　Ｐ（Ｒｏｃｈｅ社）（２ｍｇ／ｍＬ）を含むＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ社）２ｍＬを注入した。その後、膵臓を摘出し、５０ｍＬチューブに膵臓を移し、３７℃の湯浴槽で１４分３０秒消化処理を行った。１０％ＦＢＳを含む冷Ｍ１９９培地２５ｍＬで懸濁し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、２分）を２回行った。上清を捨て、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（ＳＩＧＭＡ社）１０ｍＬで懸濁させた後、その上から１０％ＦＢＳを含む冷Ｍ１９９培地１０ｍＬを注ぎ、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、３０分）を行った。上清を別の５０ｍＬチューブに移し、さらに１０％ＦＢＳを含むＭ１９９培地２５ｍＬを加えた後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを用いた密度勾配遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、２分）を行うことで膵島を分離した。
（ｘｉ）膵島の分散
　単離した膵島を１．５ｍＬシリコンチューブに採取し、分散緩衝液（以下表２参照）１００μＬを添加した。３７℃にて１５分で静置後、ピペッティングすることで分散させた。
（ｘ）マウス初代膵島細胞培養
　単離した膵島を１．５ｍＬチューブに移し、ＴｒｙｐＬＥにより膵島細胞を分離させた。ＲＰＭＩ培地で洗浄をした後、細胞数を測定した。膵島細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、その上からＭａｔｒｉｇｅｌ　３０μＬを添加した。ピペットマンの先で細胞とマトリゲルを混和させ、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベーターで３７℃、３０分静置させることでゲルを架橋させた。その後、培地を１２０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。膵島細胞の観察及び撮像はＫＥＹＥＮＣＥ　ＢＺ－７１０を用いた。
（ｘｉ）膵島細胞の継代
　膵島細胞を培養しているマトリゲルにＴｒｙｐＬＥ１２０μＬを添加し、ピペッティングすることでゲルを破砕した。膵島細胞を１．５ｍＬチューブに移し、さらにＴｒｙｐＬＥを３００μＬ加え、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、１０分静置した。その後、２００ｇ、２分で遠心分離を行い、ＲＰＭＩ培地で洗浄した後、細胞数を測定した。膵島細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、引き続きマトリゲルによる三次元培養を行った。膵島細胞の継代は１週間に１回行い、培養液としては、ＲＰＭＩ１６４０（ｎａｃａｌａｉ　ｔａｓｑｕｅ；０９８９２－１５）に、グルコース濃度が適切な最終濃度（例えば、４．５ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌなど）になるように４５ｗ／ｖ％のＤ（＋）－グルコース溶液（Ｗａｋｏ；０７９－０５５１１）を添加したものを使用した。
（ｘｉｉ）細胞運命追跡実験
　８～１２週齢の細胞系譜追跡可能なマウス（ＫＨ２－Ｍｙｃｌ；Ｉｎｓ１／Ｇｃｇ／Ｓｓｔ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒ２６－ｍＴｍＧ）にタモキシフェン（２０ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬを１週間に５回腹腔内投与した。１週間後にマウスより膵島を単離した。ＴｒｙｐＬＥにより膵島細胞を分離したのち、１．０×１０５細胞／ウェルでＡｇｇｒｅＷｅｌｌに播種した。培養液には４－ＯＨＴ（１００ｎｍｏｌ／ｍＬ）を添加し、２日間培養した。膵島細胞を回収し、マトリゲルによる三次元培養を行った。さらに１週間後にＫＥＹＥＮＣＥ　ＢＺ－７１０による撮像及びＦＡＣＳによるＧＦＰ陽性細胞の割合を評価した。
（ｘｉｉｉ）膵島細胞移植実験
　免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ－ｓｃｉｄ　Ｊｃｌ）にストレプトゾトシン（１００ｍｇ／ｋｇ）を１週間に３回腹腔内投与することで糖尿病を誘発した。このマウスの腎被膜下に１８回継代した膵島細胞５×１０５細胞分をハミルトンシリンジを用いて移植した。血糖値は毎週測定し、測定は随時血糖とした。
（ｉｘ）腹腔内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）
　Ｍｙｃｌ発現群及び対照群を１２～１６時間絶食した。その後、各マウスの体重を計測し、Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ　２ｇ／ｋｇ（マウス）になるようにＤ－ｇｌｕｃｏｓｅ溶液をマウスの腹腔内に注射した。１５、３０、６０、１２０分後に各マウスの血液を尻尾から採血し、アントセンス台（Ｈｏｒｉｂａ社）を用いて血糖値を測定した。
実施例１：グルコースによる試験内でのＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖の活性化
　Ｍｙｃｌ遺伝子の発現は、その遺伝子の下流に組み込んだｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現により確認することができる。ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は、赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子であり、該遺伝子の発現により、細胞は赤色に発色する。培地中のグルコース濃度を変化させ、Ｍｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性の違いを検討した。高グルコース培地（Ｄ－グルコース；４．５ｇ／Ｌ）の培養条件は、低グルコース培地（Ｄ－グルコース；１．０ｇ／Ｌ）の培養条件と比較して、Ｍｙｃｌ発現膵島細胞の増殖効率が増加することが分かった（図１参照）。
　上記Ｍｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖が、グルコース濃度に依存的かどうかについて検討した。培地中のグルコース濃度を１．０、２．０、及び４．５ｇ／Ｌとし、上記と同様にＭｙｃｌ誘導膵島細胞を培養して、培養効率を評価した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現、及び相対的な細胞数の比較検討から、グルコースの濃度依存的にＭｙｃｌ発現膵島細胞の増殖効率が増加することが分かった（図２参照）
　グルコース代謝に関わる酵素であるグルコキナーゼを活性化する薬剤（グルコキナーゼアクチベーター；ＧＫＡ）を用いて、該薬剤によるＭｙｃｌ発現膵島細胞の増殖効率の変化を検討した。図３から明らかなように、ＧＫＡ（５０μＭ）の添加により、非添加（ＤＭＳＯ添加）と比較して、Ｍｙｃｌ発現膵島細胞の増殖効率が増加することが判明した。
　次に、グルコース代謝に関わる酵素であるグルコキナーゼの活性を抑制する薬剤（グルコキナーゼインヒビター；ＧＫＩ）を用いて、該薬剤によるＭｙｃｌ発現膵島細胞の増殖効率の変化を検討した。図４から明らかなように、ＧＫＩ（１０ｍＭ）の添加により、非添加（ＤＭＳＯ添加）と比較して、Ｍｙｃｌ発現膵島細胞の増殖効率が低下することが判明した。
実施例２：グルコースによる生体内でのＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖の活性化
　膵島細胞を追跡可能なマウス（Ｉｎｓ１－ｉｒｅｓ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ｇｃｇ－ＣｒｅＥＲＴ２，Ｓｓｔ－ｉｒｅｓ－ＣｒｅＥＲＴ２）を用いて、グルコースによる生体内でのＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖の活性化について検討した。実施例１（生体外）では、培地にグルコースを添加したが、本実施例では、グルコースの代わりにスクロース（グルコース＋フルクトース）を使用した。また、膵島細胞の増殖の活性は、免疫染色により評価した。結果を図５に示すが、Ｄｏｘ誘導＋スクロースの投与系では、他の実験系と比較して、膵島細胞の顕著な増殖が観察された。これにより、生体内においても、スクロース（グルコース＋フルクトース）投与によって、Ｍｙｃｌ遺伝子による膵島増殖が促進されることがわかった。
実施例３：グルコース存在下での持続培養によるＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性への影響
　培地中のグルコースの持続的な存在により、Ｍｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性への影響を調べた。培養では、高グルコース濃度を使用した。培養７日間を１サイクルとして、計４回、細胞を継代した。継代を重ねることにより、Ｍｙｃｌ誘導による細胞増殖の活性化が低下することが観察された（図６参照）。これにより、高グルコース濃度の培養条件であったても、培養を持続するとＭｙｃｌ発現膵島細胞の増殖能は低下することがわかり、いわゆる「糖毒性」の関与が示唆された。
実施例４：グルコース濃度の調節による持続的なＭｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖の可能性
　実施例３に示したように、高グルコース濃度の培地による継続的な培養では、いわゆる「糖毒性」の関与が示唆されたため、グルコース濃度を調節させることによって、持続的に細胞を長期間培養することができるかどうかを検討した。２４時間ごとに、高グルコース濃度と低グルコース濃度を交互に置換することにより、細胞増殖の活性化を調べた。図７に示されるように、このような培養条件下で、Ｍｙｃｌ誘導膵島細胞の増殖活性が、少なくとも２０継代（約２２週間）は持続することが見いだされた。これにより、高グルコース－低グルコースを繰り返すこと（以下、「グルコースＨｉｇｈ－Ｌｏｗ」と称する）により、Ｍｙｃｌ誘導膵島細胞の高い増殖能が維持され、持続的な増殖誘導が可能であることが判明した。
　グルコースＨｉｇｈ－Ｌｏｗの培養系におけるＭｙｃｌ誘導膵島細胞の細胞数をカウントすることにより、経時的な細胞増殖の変化を調べた。図８に示されるように、高グルコース－低グルコースを繰り返すことにより、Ｍｙｃｌ誘導膵島細胞の高い増殖能が維持され、持続的な増殖誘導が可能であることがわかった。
実施例５：膵島細胞の追跡試験
　膵島細胞に由来するβ細胞特異的に発現する遺伝子Ｉｎｓ１、α細胞特異的に発現する遺伝子Ｇｃｇ、及び細胞特異的に発現する遺伝子Ｓｓｔの発現を追跡した。常法によりＩｎｓ１陽性細胞（β細胞）、Ｇｃｇ陽性細胞（α細胞）、及びＳｓｔ陽性細胞（δ細胞）を標識して、各細胞が増殖するかどうかを検討した。より具体的には、レポーター遺伝子であるｍＧＦＰの発現により、各遺伝子の発現強度を比較検討した（図９参照）。図９のデータから、Ｍｙｃｌ遺伝子は、成熟ホルモン産生細胞であるβ細胞、α細胞、及びδ細胞の増殖を促進することがわかった。
　さらに、ＦＡＣＳ分析により成熟ホルモン産生細胞の増殖効率を検討したところ、Ｍｙｃｌ遺伝子と高グルコース濃度下での培養により、Ｉｎｓ１陽性細胞（β細胞）がより効率的に増殖することが判明した（図１０）。
実施例６：糖尿病マウスの回復
　グルコースＨｉｇｈ－Ｌｏｗ（高グルコース－低グルコースを繰り返す条件）により、長期増殖させたＭｙｃｌ誘導膵島細胞による糖尿病マウスの血糖値の変化を検討した。図１１に示されるように、糖尿病マウスにＭｙｃｌ誘導膵島細胞を移植すると血糖値を正常化することができた。これにより、腹腔内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）では、対糖能が改善し、長期間増殖させた膵島細胞は高い機能性を持つことを確認された。
＜まとめ＞
　上記実施例の結果によれば、まず、Ｍｙｃｌ遺伝子誘導による成熟膵島細胞の増殖活性はグルコース濃度に依存することを見出した（図１及び図２参照）。実際に、グルコースの細胞内代謝経路の分子であるグルコキナーゼを活性化するグルコキナーゼ活性化剤（ＧＫＡ）により膵島細胞の増殖が促進され、阻害剤であるグルコキナーゼ阻害剤（ＧＫＩ）により膵島細胞の増殖が抑制されることを示した（図３及び図４参照）。生体内においてもグルコースを付加しながらＭｙｃｌ遺伝子を発現させると、膵島細胞の増殖が強く促進されることを示した（図５参照）。一方で、高グルコース培養条件でも持続して培養すると、糖毒性により細胞増殖活性が低下することが分かった（図６参照）。糖毒性を回避するために、高グルコース条件と低グルコース条件を繰り返すことにより、持続して高い増殖活性を維持できることを示し、少なくとも半年以上にわたり増殖が誘導可能であった（図７及び図８参照）。高グルコースによって成熟β細胞の増殖が促進された（図９及び図１０参照）。持続して増幅させた膵島細胞は、生体内でグルコースに応答してインスリンを産生し、糖尿病モデル動物の血糖を低下させた。高い機能性を有することが明らかとなった（図１１参照）。
　本発明により、持続的な膵島細胞の増殖誘導が可能となり、膵島細胞移植による糖尿病の根治が期待できる。また、生体内でグルコースと共にＭｙｃｌ遺伝子を働かせることで、生体内での膵島細胞の効率的な増幅が可能であり、遺伝子治療による糖尿病の根治も期待される。
　本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims (8)

  1. 　Ｍｙｃｌ遺伝子若しくはその遺伝子産物が導入された又は発現誘導された膵島細胞の増殖活性をグルコース刺激活性化経路賦活剤により促進及び／又は持続する方法。
  2. 　グルコース刺激活性化経路賦活剤が、グルコース、スクロース、及びグルコキナーゼ活性化剤から群から少なくとも１種選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　Ｍｙｃｌ遺伝子が、
    　（１）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸；又は
    　（２）配列番号１又は３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭｙｃｌ遺伝子が発現誘導された場合に、膵島様細胞の増殖活性を持続及び／又は促進させる機能を有するポリペプチドをコードする核酸
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　Ｍｙｃｌ遺伝子産物が、
    　（１）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；又は
    　（２）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有し、並びに膵島様細胞の増殖活性を持続及び／又は促進させる機能を有するポリペプチド
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　Ｍｙｃｌ遺伝子が一過的に発現する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　高グルコース培地と低グルコース培地を交互に適用する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　膵島細胞が、膵臓から単離された初代膵島細胞、培養膵島細胞、又は幹細胞由来である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　幹細胞が、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、及び体性幹細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
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