WO2024237245A1 - ペプチドフラグメント及びその利用 - Google Patents

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WO2024237245A1
WO2024237245A1 PCT/JP2024/017702 JP2024017702W WO2024237245A1 WO 2024237245 A1 WO2024237245 A1 WO 2024237245A1 JP 2024017702 W JP2024017702 W JP 2024017702W WO 2024237245 A1 WO2024237245 A1 WO 2024237245A1
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construct
cell
amino acid
peptide fragment
cells
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PCT/JP2024/017702
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English (en)
French (fr)
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菜穂子 ベイリー小林
徹彦 吉田
エリック ネルソン ベイリー
賢一郎 吉田
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Toagosei Co Ltd
Original Assignee
Toagosei Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • foreign substances such as polypeptides have been introduced into the cells (eukaryotic cells) of humans and other mammals to change the characteristics of those cells (and even tissues and organs made up of those cells) or to improve or enhance the functions of those cells.
  • a peptide fragment (cell membrane-permeable peptide) that has cell membrane permeability and can pass through the cell membrane from outside the cell to introduce a foreign substance into the cytoplasm.
  • Japanese Patent Application Publication No. 2022-014707 discloses an example of a construct that includes a cell membrane-permeable peptide and a foreign substance bound to the peptide.
  • the present disclosure provides a peptide fragment (synthetic peptide) having cell membrane permeability.
  • One embodiment of the peptide fragment disclosed herein has the following amino acid sequence: VLSRVVQLLREKLTRKK (SEQ ID NO: 1); and VLSRVQLREKLTR (SEQ ID NO: 2); It consists of either A peptide fragment having such a structure has cell membrane permeability, and therefore a construct containing the peptide fragment is introduced from the outside of a cell to the inside of the cell (at least into the cytoplasm).
  • the present disclosure also provides a construct for introducing an exogenous substance (hereinafter, simply referred to as a "construct") that can introduce a desired exogenous substance from the outside of a eukaryotic cell into the inside of the cell.
  • a construct for introducing an exogenous substance (hereinafter, simply referred to as a "construct") that can introduce a desired exogenous substance from the outside of a eukaryotic cell into the inside of the cell.
  • One embodiment of the construct disclosed herein comprises a peptide fragment and an exogenous substance bound to the N-terminus and/or C-terminus of the peptide fragment, wherein the peptide fragment has the following amino acid sequence: VLSRVVQLLREKLTRKK (SEQ ID NO: 1); and VLSRVQLREKLTR (SEQ ID NO: 2);
  • VLSRVQLLREKLTRKK SEQ ID NO: 1
  • VLSRVQLREKLTR SEQ ID NO: 2
  • the foreign substance is placed on the C-terminus side of the peptide fragment. This allows the construct to be efficiently introduced into eukaryotic cells.
  • the present disclosure also provides a method for introducing a foreign substance of interest into at least the cytoplasm of a eukaryotic cell from outside the cell in vitro or in vivo.
  • One aspect of the method disclosed herein includes the steps of (1) preparing a construct disclosed herein, and (2) supplying the construct into a sample containing the eukaryotic cell of interest. This allows the foreign substance of interest to be introduced into the eukaryotic cell.
  • the eukaryotic cell into which the construct is introduced is a mammalian cell. This allows the introduction of a desired foreign substance into the mammalian cell.
  • Matters necessary for carrying out the technology e.g., general matters such as chemical synthesis of peptides, cell culture techniques, and preparation of constructs containing peptides or nucleic acids as components
  • Matters necessary for carrying out the technology can be understood as design matters for those skilled in the art based on conventional techniques in the fields of cell engineering, physiology, medicine, pharmacology, organic chemistry, biochemistry, genetic engineering, protein engineering, molecular biology, genetics, etc.
  • the technology disclosed herein can be implemented based on the contents disclosed herein and the common general technical knowledge in the field.
  • amino acids may be represented by one-letter symbols in accordance with the nomenclature for amino acids set forth in the IUPAC-IUB guidelines.
  • amino acid residue includes the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
  • amino acid residues constituting a peptide or protein may be of either the L-form or the D-form, unless otherwise specified.
  • the left side always represents the N-terminus and the right side represents the C-terminus.
  • the number of amino acid residues in the peptide fragments disclosed herein is not limited as long as cell membrane permeability is not impaired.
  • the number of amino acid residues in the peptide fragments can be, for example, 30 or less, 25 or less, or 20 or less.
  • the peptide fragment disclosed herein may contain a modified sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, so long as the cell membrane permeability is not impaired.
  • the "modified sequence” refers to an amino acid sequence (modified amino acid sequence) formed by substituting, deleting and/or adding (inserting) one or several (typically two or three) amino acid residues.
  • modified sequences in this specification include sequences resulting from conservative substitution of one, two or three amino acid residues (so-called conservative amino acid replacement), sequences in which one, two or three amino acid residues are added (inserted) or deleted from a given amino acid sequence, etc.
  • conservative substitutions include sequences in which a basic amino acid residue is replaced with another basic amino acid residue (e.g., mutual replacement of a lysine residue with an arginine residue), etc.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 consists of 17 amino acid residues.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 consists of 13 amino acid residues.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is an amino acid sequence obtained as a result of extensive research conducted by the present inventors to shorten the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is composed of an amino acid sequence in which 4 amino acid residues have been deleted from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
  • the construct disclosed herein comprises a peptide fragment disclosed herein and a foreign substance.
  • the foreign substance is bound to the N-terminus and/or C-terminus of the peptide fragment.
  • the construct is designed and constructed by directly or indirectly binding (linking) a foreign substance to the N-terminus and/or C-terminus of the peptide fragment.
  • a linker is disposed between the peptide fragment and the foreign substance.
  • the linker is not particularly limited, and may be a peptidic linker or a non-peptidic linker. A combination of a peptidic linker and a non-peptidic linker may also be used.
  • the method for directly or indirectly binding the peptide fragment and the foreign substance is not particularly limited, and may be carried out according to various scientific methods known in the art.
  • the peptidic linker may be composed of one or more amino acid residues.
  • the number of amino acid residues constituting the peptidic linker is not particularly limited.
  • the number of amino acid residues constituting the peptidic linker is, for example, one or more or two or more.
  • the number of amino acid residues constituting the peptidic linker is, for example, 10 or less or 5 or less.
  • the amino acid sequence constituting the peptidic linker is an amino acid sequence that does not cause steric hindrance and is flexible.
  • Such a peptidic linker may include, for example, glycine, alanine, and/or serine.
  • the peptidic linker may include ⁇ -alanine.
  • Non-peptide linkers include, but are not limited to, alkyl linkers, PEG (polyethylene glycol) linkers, aminohexanoyl spacers, and the like.
  • crosslinkers having homobifunctional or heterobifunctional groups may be used as non-peptide linkers.
  • Examples of common functional groups that crosslinkers have include N-hydroxysuccinimide activated esters (NHS esters), maleimides, azides, and iodoacetamides.
  • NHS esters can react and bond efficiently with amines at a neutral pH or higher.
  • maleimides can selectively react and bond with SH groups.
  • a cysteine residue when using a crosslinker containing maleimide, can be added as a linker to the N-terminus or C-terminus of the peptide fragment, or a peptide fragment having a cysteine residue at the N-terminus or C-terminus can be prepared to easily bond the peptide fragment to the crosslinker.
  • Suitable crosslinking agents having homobifunctional groups include N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ), dithiobis(succinimidyl propionate) (DSP), dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST), etc.
  • bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ) can be preferably used.
  • crosslinking agents having heterobifunctional groups include N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), succinimidyl 4-[maleimidophenyl]butyrate (SMPB), succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-( ⁇ -maleimidobutyloxy)succinimide ester (GMBS), m-maleimidopropionic acid-N-hydroxysuccinimide ester (MPS), and N-succinimidyl (4-iodoacetyl)aminobenzoate (SIAB).
  • EMCS and MBS having NHS ester and maleimide as reactive functional groups can be preferably used.
  • the foreign substance is not particularly limited as long as it has a molecular size and chemical properties that allow it to be introduced into eukaryotic cells, and may be, for example, an organic compound or an inorganic compound.
  • Organic substances include, for example, amino acids, polypeptides, nucleic acids, dyes, drugs, etc.
  • the foreign substance may contain one type alone, or may contain two or more types. When two or more types of foreign substances are contained, two or more types of foreign substances may be bound to the N-terminus or C-terminus of the peptide fragment. In addition, one or more types of foreign substances may be bound to each of the N-terminus and C-terminus of the peptide fragment.
  • the polypeptide (amino acid sequence) to be adopted is not particularly limited.
  • the term "polypeptide” refers to a polymer (including dimers, trimers, and oligomers) having a structure in which a plurality of amino acids are bound by peptide bonds. It is not limited by the number of peptide bonds (i.e., the number of amino acid residues).
  • a polypeptide for example, a peptide having about 2 to 100 amino acid residues, a polypeptide having about 100 to 300 amino acid residues, or a protein (a polymeric compound typically consisting of 300 or more amino acid residues) having a relatively large number of amino acid residues may also be adopted as a foreign substance.
  • polypeptides and proteins are not strictly distinguished from each other.
  • the upper limit of the number of amino acid residues constituting the polypeptide is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of synthesis (biosynthesis, chemical synthesis), it is preferable that the number is, for example, 1,000 or less, 600 or less, 500 or less, 400 or less, or 300 or less.
  • the polypeptide may be a mature or precursor (including pro- and prepro-) polypeptide involved in functions such as the development, differentiation, proliferation, canceration, homeostasis, and metabolic regulation of various cells and tissues (organs).
  • the polypeptide may also be a polypeptide whose function has not been previously known. The technology disclosed herein makes it possible to clarify the function of a polypeptide whose function is unknown within a cell (in a living tissue).
  • the eukaryotic cells to which a foreign substance is introduced are mammalian (human or other mammalian) stem cells
  • stem cells include somatic stem cells, embryonic stem cells, and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • polypeptides that can inhibit the suppression of the immune surveillance mechanism of the cancer cells are bacteria-infected cells or virus-infected cells
  • various polypeptides involved in the induction of apoptosis of the infected cells polypeptides that can suppress the proliferation of bacteria or viruses in the infected cells
  • polypeptides that can suppress the spread of infection of bacteria or viruses from the infected cells may contain a modified amino acid sequence formed by the substitution, deletion and/or addition (insertion) of one or several amino acid residues, so long as it retains its function.
  • a peptide chain can be designed to contain the amino acid sequence constituting the polypeptide and the amino acid sequence constituting the peptide fragment, and the peptide chain can be biosynthesized or chemically synthesized to produce a construct in which the polypeptide is directly linked to the peptide fragment.
  • nucleic acid employed as the foreign substance is not particularly limited, and may include, for example, so-called nucleic acid drugs.
  • nucleic acid refers to a polymer of nucleotides, and includes DNA, RNA, and DNA/RNA hybrids (also called DNA-RNA chimeras) that contain both DNA and RNA.
  • nucleic acid is not limited by the number of bases. Nucleic acid may be single-stranded (including hairpin-type single-stranded) or double-stranded.
  • the nucleotides that make up the nucleic acid may contain modified groups in the phosphate moiety, sugar moiety, or base moiety.
  • the type of nucleic acid drug is not particularly limited, and examples include siRNA, miRNA, antisense, aptamer, decoy, ribozyme, CpG oligo, etc.
  • the type of dye used as the foreign substance is not particularly limited.
  • the dye may include various fluorescent dye compounds such as FAM and FITC.
  • FAM fluorescent dye compounds
  • FITC fluorescent dye compounds
  • the construct contains a dye, it becomes easier to evaluate the introduction of the construct. For example, the efficiency of introduction into eukaryotic cells can be evaluated using introduction microscopy (e.g., fluorescence microscopy), flow cytometry, immunochemical techniques (e.g., Western blot, immunocytostaining, etc.).
  • Drugs may include various organic compounds, such as antitumor agents including nucleic acid-based antitumor agents such as 5-fluorouracil (5FU) and antiviral agents such as azidothymidine (AZT).
  • antitumor agents including nucleic acid-based antitumor agents such as 5-fluorouracil (5FU) and antiviral agents such as azidothymidine (AZT).
  • nucleic acid-based antitumor agents such as 5-fluorouracil (5FU)
  • antiviral agents such as azidothymidine (AZT).
  • the ⁇ -amino group of the amino acid residue on the N-terminus of the peptide fragment is acetylated.
  • the ⁇ -amino group of the amino acid on the N-terminus of many proteins in eukaryotic cells is acetylated, so this type of configuration can improve the stability of the construct within the cell.
  • the construct is preferably amidated at the C-terminal amino acid residue.
  • Amidation of the carboxyl group of an amino acid residue can improve the structural stability (e.g., protease resistance) of the construct in the cytoplasm or nucleus.
  • Amidation of the carboxyl group can also improve the hydrophilicity of the construct, thereby improving the solubility of the construct in aqueous solvents.
  • aqueous solvents include water, various buffer solutions, physiological saline (e.g., PBS), cell culture medium, and the like.
  • the carboxyl group of the amino acid residue at the C-terminus of the peptide fragment is amidated.
  • the carboxyl group of the C-terminal amino acid residue of the polypeptide is amidated.
  • the peptide fragment or the peptide portion of the construct can be easily produced, for example, according to a general chemical synthesis method.
  • a general chemical synthesis method for example, any of the conventionally known solid-phase synthesis method or liquid-phase synthesis method may be adopted.
  • a solid-phase synthesis method using Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as a protecting group for the amino group is preferable.
  • the above-mentioned peptide portion having the desired amino acid sequence and modified portion can be synthesized by a solid-phase synthesis method using a commercially available peptide synthesizer. Note that only a part of the peptide chain may be synthesized by the above method, for example, only the peptide fragment, or a peptide chain including the peptide fragment and the peptidic linker portion may be synthesized.
  • the peptide fragment or the peptide portion of the construct may be biosynthesized based on genetic engineering techniques. That is, a polynucleotide (typically DNA) of a nucleotide sequence (including an ATG start codon) encoding the desired amino acid sequence is synthesized. Then, a recombinant vector having an expression gene construct consisting of the synthesized polynucleotide (DNA) and various regulatory elements (including promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis elements that control the expression level) for expressing the amino acid sequence in a host cell is constructed according to the host cell.
  • DNA synthesized polynucleotide
  • various regulatory elements including promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis elements that control the expression level
  • This recombinant vector is introduced into a given host cell (e.g., yeast, insect cell, or plant cell) using a common technique, and the host cell or a tissue or individual containing the cell is cultured under given conditions. This allows the target peptide to be produced within the cell. The peptide portion is then isolated from the host cell (or from the medium if secreted), and the target peptide portion can be obtained by refolding, purification, etc. as necessary.
  • the method of constructing a recombinant vector and the method of introducing the constructed recombinant vector into a host cell may be any method conventionally used in the field, and since such methods themselves do not particularly characterize the present technology, detailed explanations thereof will be omitted.
  • a fusion protein expression system can be used to efficiently produce a large amount of the construct in a host cell.
  • a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of the target polypeptide is chemically synthesized, and the synthetic gene is introduced into a suitable site of a suitable fusion protein expression vector (for example, a GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vector such as the pET series provided by Novagen and the pGEX series provided by Amersham Biosciences).
  • a host cell typically Escherichia coli
  • the obtained transformant is cultured to prepare the target fusion protein.
  • the protein is extracted and purified.
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a specific enzyme (protease), and the released target peptide fragment (i.e., the designed artificial polypeptide) is recovered by a method such as affinity chromatography.
  • a specific enzyme protease
  • affinity chromatography a method such as affinity chromatography.
  • a template DNA for a cell-free protein synthesis system i.e., a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide portion of the construct
  • various compounds ATP, RNA polymerase, amino acids, etc.
  • ATP ATP, RNA polymerase, amino acids, etc.
  • cell-free protein synthesis systems for example, Shimizu et al.'s paper (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001)) and Madin et al.'s paper (Madin et al., Proc. Natl.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the peptide portion of the construct and/or a nucleotide sequence complementary thereto can be easily produced (synthesized) by a conventional method. For example, by selecting a codon corresponding to the amino acid residue constituting the peptide portion, a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence can be easily determined and provided. Once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single-stranded) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like.
  • the desired double-stranded DNA can be obtained by employing various enzymatic synthesis means (typically PCR) using the obtained single-stranded DNA as a template.
  • the polynucleotide may be in the form of DNA or in the form of RNA (mRNA, etc.).
  • the DNA may be provided in a double-stranded or single-stranded form. When provided in a single-stranded form, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) of a sequence complementary thereto.
  • the polynucleotide thus obtained can be used as a material for constructing a recombinant gene (expression cassette) for peptide production in various host cells or in a cell-free protein synthesis system, as described above.
  • the nucleic acid as the foreign substance can also be prepared in the same manner as in the above-mentioned production method.
  • constructs disclosed herein may be suitably used as active ingredients in compositions for applications based on the function of the foreign substance.
  • the constructs may be in the form of a salt, so long as the function of the foreign substance is not lost.
  • acid addition salts that can be obtained by addition reaction of commonly used inorganic or organic acids according to standard methods can be used. Therefore, the "constructs" described in this specification and claims may include those in such salt form.
  • the construct can be used as an active ingredient of a composition which can contain various medicamentally (pharmacologically) acceptable carriers depending on the form of use.
  • the above-mentioned carrier is preferably a carrier generally used in peptide medicines as a diluent, excipient, etc.
  • the carrier may vary depending on the purpose and form of the construct for introducing a foreign substance, but typically includes water, physiological buffer solutions, and various organic solvents.
  • the carrier may be an aqueous solution of alcohol (such as ethanol) at an appropriate concentration, glycerol, a non-drying oil such as olive oil, or a liposome.
  • secondary components that may be contained in the pharmaceutical composition include various fillers, bulking agents, binders, wetting agents, surfactants, dyes, fragrances, etc.
  • compositions may be in the form of a liquid, suspension, emulsion, aerosol, foam, granule, powder, tablet, capsule, ointment, etc.
  • the composition may be in the form of a freeze-dried product or granules that are dissolved in physiological saline or a suitable buffer solution (e.g., PBS) immediately before use to prepare a drug solution for injection or the like.
  • physiological saline e.g., PBS
  • PBS physiological saline
  • the process of preparing various forms of drugs (compositions) using constructs (main components) and various carriers (secondary components) may be in accordance with conventionally known methods, and detailed explanations of such formulation methods are omitted since they do not characterize the present technology.
  • Comprehensive Medicinal Chemistry edited by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990) is an example of a detailed information source regarding formulations.
  • the present disclosure provides a method for introducing a foreign substance of interest from the outside of a eukaryotic cell to the inside of the cell in vivo or in vitro using the construct disclosed herein.
  • inside a eukaryotic cell refers to the inside of a eukaryotic cell surrounded by a cell membrane, and includes, for example, the cytoplasm, cytosol, and intracellular organelles (e.g., nucleus, mitochondria, endoplasmic reticulum, microtubules, lysosomes, Golgi, etc.).
  • a construct can be introduced into at least the cytoplasm (and even intracellular organelles) of a eukaryotic cell.
  • the method disclosed herein roughly comprises the following steps (1) and (2): (1) providing a construct as disclosed herein; and (2) supplying the construct into a sample containing a target eukaryotic cell.
  • the method disclosed herein may further include, after the step (2), a step (3) of incubating the sample to which the construct has been supplied, thereby introducing the construct into the eukaryotic cell in the sample.
  • eukaryotic cells include, for example, various tissues, organs, blood, and lymph fluids in vivo.
  • the above-mentioned “eukaryotic cells” include, for example, various cell masses, tissues, organs, blood, and lymph fluids, as well as cell lines, etc., extracted from living organisms in vitro.
  • Examples of eukaryotic cells include cells from the animal kingdom, such as mammals, birds, fish, amphibians, reptiles, and insects, cells from the fungus kingdom, and cells from the plant kingdom, but are preferably cells of humans or mammals other than humans (mammalian cells).
  • the method disclosed herein includes, for example, preparing a composition containing the construct disclosed herein and supplying it to a sample containing eukaryotic cells.
  • a composition can be used in a manner and dosage depending on its form and purpose.
  • a liquid agent it can be administered in a desired amount to an affected area (e.g., malignant tumor tissue, virus-infected tissue, inflammatory tissue, etc.) of a patient (i.e., a living body) by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, or intraperitoneal injection.
  • a solid form such as a tablet or a gel or aqueous jelly such as an ointment can be administered directly to a predetermined tissue (i.e., an affected area such as a tissue or organ containing, for example, tumor cells, virus-infected cells, inflammatory cells, etc.).
  • a solid form such as a tablet can be administered orally.
  • an appropriate amount of the construct or composition may be supplied to the culture medium of the eukaryotic cells being cultured at least once.
  • the amount and number of times of supply per time are not particularly limited because they may vary depending on the type of eukaryotic cells to be cultured, cell density (cell density at the start of culture), number of passages, culture conditions, type of medium, and other conditions.
  • it is preferable to add once, twice, or more times so that the peptide fragment concentration in the culture medium is generally within the range of 0.05 ⁇ M to 100 ⁇ M, for example, within the range of 0.5 ⁇ M to 50 ⁇ M, and for example, within the range of 1 ⁇ M to 30 ⁇ M.
  • the incubation time after addition of the construct is also not particularly limited because it may vary depending on the type of eukaryotic cells and various conditions. For example, it may be 0.5 hours or more, 1 hour or more, 4 hours or more, 8 hours or more, or 20 hours or more.
  • the incubation conditions are not particularly limited because they may vary depending on the type of eukaryotic cells, but for example, it can be incubated in a 5% CO 2 atmosphere at 37°C. An example of an in vitro introduction method is shown in the test example described below.
  • Item 1 The following amino acid sequence: VLSRVVQLLREKLTRKK (SEQ ID NO: 1); and VLSRVQLREKLTR (SEQ ID NO: 2); A peptide fragment consisting of either Item 2: A peptide fragment, A construct comprising a foreign substance bound to the N-terminus and/or C-terminus of the peptide fragment, The peptide fragment has the following amino acid sequence: VLSRVVQLLREKLTRKK (SEQ ID NO: 1); and VLSRVQLREKLTR (SEQ ID NO: 2); A structure consisting of either Item 3: The construct according to Item 2, wherein the foreign substance is at least one organic compound selected from the group consisting of a polypeptide, a nucleic acid, a dye, and a drug.
  • the foreign substance is at least one organic compound selected from the group consisting of a polypeptide, a nucleic acid, a dye, and a drug.
  • Item 4 The construct according to Item 2 or 3, wherein the foreign substance is bound to the C-terminus of the peptide fragment.
  • Item 5 A method for introducing a foreign substance of interest from the outside of a eukaryotic cell to the inside of the cell in vitro, comprising the steps of: (1) A step of preparing a construct according to any one of items 2 to 4; (2) providing the construct into a sample containing a target eukaryotic cell.
  • Item 6 The method according to Item 5, wherein the eukaryotic cell into which the construct is to be introduced is a mammalian cell.
  • construct 1 was prepared, which was composed of a peptide fragment (synthetic peptide) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which the amino group of the N-terminal valine residue was acetylated, and FAM (C 21 H 12 O 7 : 5(6)-Carboxyfluorescein, molecular weight 376.3, excitation wavelength 495 nm, fluorescence wavelength 520 nm), which is a fluorescent dye bound to the C-terminal side of the peptide fragment.
  • synthetic peptide synthetic peptide
  • FAM C 21 H 12 O 7 : 5(6)-Carboxyfluorescein, molecular weight 376.3, excitation wavelength 495 nm, fluorescence wavelength 520 nm
  • construct 2 was prepared, which was composed of a synthetic peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which the amino group of the N-terminal valine residue was acetylated, and FAM, which is a fluorescent dye bound to the C-terminal side of the synthetic peptide.
  • Construct 1 was diluted with dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare sample solution 1 in which construct 1 had a concentration of 2 mM.
  • construct 2 was diluted with DMSO to prepare sample solution 2 in which construct 2 had a concentration of 2 mM.
  • a fluorescent dye, FAM was dissolved in DMSO to prepare a 2 mM FAM solution.
  • NSC-34 cells were cultured in a culture medium, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Cat No. 044-29765)) containing 10% FBS (fetal bovine serum). After washing the NSC-34 cells attached to the culture plate with PBS, 0.25% trypsin/EDTA solution was added and incubated at 37°C for 3 minutes. After the incubation, the above-mentioned 10% FBS-containing DMEM was added, trypsin was inactivated, and the cells were precipitated by centrifugation at 150 x g for 5 minutes.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Cat No. 044-29765)
  • FBS fetal bovine serum
  • the above-mentioned 10% FBS-containing DMEM was added to the precipitate (cell pellet) to prepare a cell suspension of approximately 2 x 10 5 cells/mL. 1 mL of the cell suspension was added to a well of a commercially available 6-well plate (manufactured by AGC Technoglass Co., Ltd.), cells were seeded (approximately 2 x 10 5 cells/well), and the plate was incubated for approximately 2 to 3 hours until the cells adhered to the bottom of the well. Thereafter, the above-prepared 2 mM sample solution 1 was diluted with the above-prepared 10% FBS-containing DMEM to prepare sample solution 1 with a sample concentration of 20 ⁇ M.
  • the concentration of construct 1 in the culture solution in the well was 10 ⁇ M, and the DMSO concentration was 0.5%).
  • the cells were incubated at 37° C. for 20 hours under 5% CO2 conditions.
  • the culture supernatant was removed from the wells, and the cells in the wells were washed twice with 1 mL of PBS.
  • 100 ⁇ L of 0.25% trypsin/EDTA solution was added to the wells, and the wells were incubated at 37°C for 3 minutes.
  • 900 ⁇ L of the above 10% FBS-containing DMEM was added to the wells to inactivate trypsin, and the cell suspension in the wells was transferred to a tube to recover the cells. After that, the cells remaining in the wells were further washed and recovered into the tube. This tube was centrifuged for 5 minutes at 4°C and 210 ⁇ g.
  • the obtained cells were subjected to analysis of cell membrane permeability using a flow cytometer, On-Chip Flowcytometer (manufactured by On-Chip Biotechnologies Co., LTD.).
  • the cell pellet obtained above was suspended in 50 ⁇ L of On-chip T buffer to prepare a cell suspension for analysis.
  • the above flow cytometer was used to perform gating based on forward scatter (FSC) and side scatter (SSC), set a gate for the cell population to be analyzed, and measured the fluorescence intensity of the cell population within the gate.
  • the number of cells in the cell population to be analyzed was set to 10,000 or more, and analysis was performed.
  • the fluorescence intensity was measured using the fluorescence detector FL2 (optimum detection wavelength: approximately 543 nm) of the above flow cytometer, which is capable of detecting the fluorescence wavelength of FAM.
  • the measurement results were analyzed using the commercially available analysis software "FlowJo" (manufactured by TreeStar), and the median fluorescence intensity (MFI) of the cell population to be measured was obtained (see Table 1).
  • Example 2 Example 2 was carried out in the same manner as Example 1, except that sample solution 2 was used instead of sample solution 1.
  • Example 3 was carried out in the same manner as Example 1, except that a FAM solution was used instead of sample solution 1.
  • the concentration of the FAM solution was the same as that of sample solution 1 (i.e., the FAM concentration of the culture solution in the well was 10 ⁇ M, and the DMSO concentration was 0.5%).
  • Figure 1 shows a histogram measured by the above-mentioned flow cytometer.
  • the vertical axis of Figure 1 shows the cell number, and the horizontal axis shows the fluorescence intensity.
  • Examples 1 and 2 had a higher MFI than Example 3.
  • a greater amount of FAM was introduced into the cells by the peptide fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Therefore, it can be seen that the peptide fragment containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 exhibits cell membrane permeability and can introduce foreign substances from the outside to the inside of the cells.
  • a peptide fragment and a construct having the peptide fragment are provided that can introduce a foreign substance of interest from the outside of a eukaryotic cell (particularly various animal cells such as humans and other mammals that do not have a cell wall) to the inside of the cell.
  • a eukaryotic cell particularly various animal cells such as humans and other mammals that do not have a cell wall
  • the foreign substance of interest can be effectively introduced into the target cell, and biological tissues such as cells and organs into which the foreign substance has been introduced can be obtained.
  • the peptide fragments or constructs disclosed herein can be used in drug delivery technology to provide therapeutic agents for various diseases.

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Abstract

ここで開示されるペプチドフラグメントは、ＶＬＳＲＶＶＱＬＬＲＥＫＬＴＲＫＫ（配列番号１）、および、ＶＬＳＲＶＱＬＲＥＫＬＴＲ（配列番号２）のいずれかのアミノ酸配列を含む。

Description

ペプチドフラグメント及びその利用
　本開示は、ペプチドフラグメント及びその利用に関する。なお、本出願は、２０２３年５月１７日に出願された日本国特許出願第２０２３－０８１４５２号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中の参照として組み入れられている。
　従来から、ヒトやそれ以外の哺乳動物等の細胞（真核細胞）内にポリペプチド等の外来物質を導入し、当該細胞（さらには該細胞から成る組織や器官）の形質を転換させること或いは当該細胞の機能を改善・向上させることが行われている。
　上述した技術には、例えば、細胞の外部から細胞膜を通過して細胞質内に外来物質を導入させ得る細胞膜透過性を有するペプチドフラグメント（細胞膜透過性ペプチド）が用いられる。日本国特許出願公開第２０２２－０１４７０７号公報には、細胞膜透過性ペプチドと、該ペプチドに結合した外来物質とを備える構築物の一例が開示されている。
日本国特許出願公開第２０２２－０１４７０７号公報
　細胞膜透過性ペプチドは、例えばドラッグデリバリーシステム等の技術へ利用できるため、多様な細胞膜透過性ペプチドの開発が望まれている。
　本開示により、細胞膜透過性を有するペプチドフラグメント（合成ペプチド）が提供される。ここで開示されるペプチドフラグメントの一態様は、以下のアミノ酸配列：
　　ＶＬＳＲＶＶＱＬＬＲＥＫＬＴＲＫＫ（配列番号１）；および
　　ＶＬＳＲＶＱＬＲＥＫＬＴＲ（配列番号２）；
のいずれかから成る。
　かかる構成のペプチドフラグメントは、細胞膜透過性を有している。そのため、当該ペプチドフラグメントを含む構築物は、細胞外部から細胞内部（少なくとも細胞質内）へと導入される。
　また、本開示により、真核細胞の外部から当該細胞の内部に目的とする外来物質を導入することができる外来物質導入用の構築物（以下、単に「構築物」ともいう）が提供される。ここで開示される構築物の一態様は、ペプチドフラグメントと、上記ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した外来物質とを含み、上記ペプチドフラグメントが、以下のアミノ酸配列：
　　ＶＬＳＲＶＶＱＬＬＲＥＫＬＴＲＫＫ（配列番号１）；および
　　ＶＬＳＲＶＱＬＲＥＫＬＴＲ（配列番号２）；
のいずれかから成る。かかる構築物によれば、上記外来物質を真核細胞の外部から当該細胞の内部（例えば、少なくとも細胞質）に導入することができる。
　ここで開示される構築物の一態様は、上記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群より選択される少なくとも１種の有機化合物である。これにより、多様な機能を有する有機物を真核細胞内に導入することができる。
　ここで開示される構築物の一態様は、上記外来物質が、上記ペプチドフラグメントのＣ末端側に配置される。これにより、構築物を効率よく真核細胞の内部へ導入することができる。
　また、本開示により、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロまたはインビボにおいて導入する方法が提供される。ここで開示される方法の一態様は、（１）ここで開示される構築物を用意する工程と、（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程とを包含する。これにより、目的とする外来物質を真核細胞の内部に導入することができる。
　ここで開示される方法の一態様では、上記構築物を導入する対象の真核細胞が哺乳類細胞である。これにより、哺乳類細胞の内部に目的とする外来物質を導入することができる。
ＮＳＣ－３４細胞の培養液に対し、一実施形態に係る構築物またはＦＡＭを添加して培養した後、当該細胞をフローサイトメータにより解析することで得られたヒストグラムである。
　以下、ここで開示される技術のいくつかの実施形態について説明する。本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって、本技術の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドや核酸を成分として含む構築物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。
　また、ここで開示される技術は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、本明細書において、アミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記で表す場合がある。なお、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
　また、本明細書において、「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成あるいは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物中で安定して存在し得るペプチド（ペプチドフラグメント）をいう。ここで「ペプチド」とは、１または複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマー（ダイマー、トリマー、オリゴマーを含む）を指す用語であり、アミノ酸残基の数によって限定されない。
　また、本明細書において、ペプチドまたはタンパク質を構成するアミノ酸残基は、特に断りがない限り、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよい。
　なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側を表す。
　ここで開示されるペプチドフラグメントは、ＶＬＳＲＶＶＱＬＬＲＥＫＬＴＲＫＫ（配列番号１）またはＶＬＳＲＶＱＬＲＥＫＬＴＲ（配列番号２）を含む合成ペプチドである。一態様において、ここで開示されるペプチドフラグメントは配列番号１または２に示すアミノ酸配列により構成されている。配列番号１または２に示すアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントは、細胞膜透過性を有しており、真核細胞の細胞膜の外部から内部へと効率よく導入される。そのため、ここで開示されるペプチドフラグメントを含む構築物は、真核細胞の細胞膜の外部から内部へと効率よく導入される。
　ここで開示されるペプチドフラグメントのアミノ酸残基の数は、細胞膜透過性を損なわれない限りにおいて限定されるものではない。ペプチドフラグメントのアミノ酸残基の数は、例えば、３０以下、２５以下、２０以下であり得る。
　また、ここで開示されるペプチドフラグメントは、細胞膜透過性を損なわない限りにおいて、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列の改変配列を含んでもよい。ここで、「改変配列」とは、１個または数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）である。
　本明細書における改変配列の典型例としては、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列や、所定のアミノ酸配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等が挙げられる。同類置換の典型例としては、例えば、塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列（例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）等が挙げられる。
　配列番号１に示すアミノ酸配列は、１７のアミノ酸残基から成る。配列番号２に示すアミノ酸配列は、１３のアミノ酸残基から成る。配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列をより短くするために本発明者が鋭意検討した結果得られたアミノ酸配列である。配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列のうちの４アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列で構成されている。
　ここで開示される構築物は、ここで開示されるペプチドフラグメントと、外来物質とを含む。外来物質は、ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合している。
　いくつかの態様において、構築物は、ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に、外来物質を直接的または間接的に結合（連結）することによって、設計・構築される。ペプチドフラグメントと外来物質とが間接的に結合している場合には、例えば、ペプチドフラグメントと外来物質との間にリンカーが配置される。リンカーは、特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーであってもよく、非ペプチド性リンカーであってもよい。また、ペプチド性リンカーと非ペプチド性リンカーの併用であってもよい。なお、ペプチドフラグメントと外来物質を直接的または間接的に結合する方法は、特に限定されず、従来公知の種々の科学的手法に従って実施することができる。
　ペプチド性リンカーは、１または２以上のアミノ酸残基で構成され得る。ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、特に限定されない。ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１以上または２以上である。また、ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、例えば、１０以下または５以下である。いくつかの態様において、ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸配列は、立体障害を生じさせず、かつ、柔軟なアミノ酸配列である。このようなペプチド性リンカーは、例えば、グリシン、アラニン、及び／又はセリンを含み得る。また、いくつかの態様において、ペプチド性リンカーはβアラニンを含み得る。
　非ペプチド性リンカーとしては、特に限定されるものではないが、例えばアルキルリンカー、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカー、アミノヘキサノイルスペーサ等が挙げられる。また、非ペプチド性リンカーとして、ホモ二官能性基またはヘテロ二官能性基を備える架橋剤を用いてもよい。架橋剤が有する一般的な官能基としては、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル（ＮＨＳエステル）、マレイミド、アジドおよびヨードアセトアミド等が挙げられる。このなかでも、ＮＨＳエステルは、アミンと中性以上のｐＨで効率良く反応して結合することができる。また、マレイミドは、ＳＨ基と選択的に反応して結合することができる。例えば、マレイミドを含む架橋剤を使用する場合には、システイン残基をペプチドフラグメントのＮ末端またはＣ末端にリンカーとして付加する、若しくは、Ｎ末端またはＣ末端にシステイン残基を備えるペプチドフラグメントを準備することでペプチドフラグメントと架橋剤との結合を容易に実現できる。
　ホモ二官能性基を有する好適な架橋剤としては、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－ＤＳＴ）等が挙げられる。特に、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）を好ましく使用し得る。
　また、ヘテロ二官能性基を有する好適な架橋剤としては、Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４－［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ－マレイミドプロピオニックアシド－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）等を好ましく用いることができる。特に、反応性官能基にＮＨＳエステルおよびマレイミドを備えたＥＭＣＳやＭＢＳを好ましく用いることができる。
　外来物質は、真核細胞内に導入可能な分子サイズおよび化学的性質を有しているものであれば特に限定されず、例えば、有機化合物または無機化合物であり得る。有機物は、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、核酸、色素、薬剤等を含む。外来物質は、１種を単独で含んでもよく、２種以上を含んでもよい。外来物質を２種以上含む場合には、ペプチドフラグメントのＮ末端側またはＣ末端側に２種以上の外来物質が結合していてもよい。また、ペプチドフラグメントのＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれ１種または２種以上の外来物質が結合していてもよい。
　外来物質がポリペプチドの場合、採用するポリペプチド（アミノ酸配列）は、特に限定されない。本明細書において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造を有するポリマー（ダイマー、トリマー、オリゴマーを含む）をいう。ペプチド結合の数（即ち、アミノ酸残基数）によって限定されない。ポリペプチドとして、例えばアミノ酸残基数が２～１００程度のペプチド、アミノ酸残基数が１００～３００程度のポリペプチド、若しくはタンパク質（典型的には３００以上のアミノ酸残基から成る高分子化合物）のような、比較的アミノ酸残基数が多いものも外来物質として採用し得る。当該分野においては、ポリペプチドとタンパク質とは厳密に区分されるものではない。
　ポリペプチドを構成するアミノ酸残基数の上限は特に限定されないが、合成（生合成、化学合成）の容易性の観点から、例えば、１０００以下、６００以下、５００以下、４００以下、または３００以下であることが好ましい。
　ポリペプチドは、種々の細胞や組織（器官）の発生、分化、増殖、がん化、ホメオスタシス（恒常性）、代謝の調節、等の機能にかかわるポリペプチドの成熟型あるいは前駆体（プロ型、プレプロ型を包含する。）であり得る。また、ポリペプチドは機能が従来知られていないポリペプチドであってもよい。ここで開示される技術により、機能が知られていないポリペプチドの細胞内（生体組織内）における機能の解明を行うことができる。
　例えば、外来物質を導入する対象となる真核細胞が哺乳類細胞（ヒト又はその他哺乳動物）の幹細胞である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々の生理活性を有するポリペプチドの成熟型またはその前駆体の利用が好ましい。なお、「幹細胞」は、体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：ｉＰＳ細胞）を包含する。また、外来物質を導入する対象となる真核細胞ががん細胞（腫瘍細胞）である場合、当該がん細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドの利用が好ましい。あるいは、この場合においては、がん細胞（腫瘍細胞）が免疫監視機構の機能を抑制することを阻害し得るポリペプチドの利用が好ましい。さらに、導入の対象となる真核細胞が細菌感染細胞やウイルス感染細胞である場合、当該感染細胞のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドや、当該感染細胞において細菌もしくはウイルスが増殖することを抑制し得るポリペプチドや、当該感染細胞から細菌もしくはウイルスの感染が拡大することを抑制し得るポリペプチドの利用が好ましい。
　なお、ペプチドフラグメントと同様、外来物質としてのポリペプチドは、その機能を保持する限りにおいて、１個または数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列を含んでいてもよい。
　外来物質がポリペプチドである場合には、例えば、該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、ペプチドフラグメントを構成するアミノ酸配列とを含むようにペプチド鎖を設計し、該ペプチド鎖を生合成あるいは化学合成することによって、ポリペプチドをペプチドフラグメントに直接結合した構築物を作製することができる。
　外来物質として採用される核酸の種類は、特に限定されるものではなく、例えば、いわゆる核酸医薬品を含み得る。本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡとＲＮＡとの両方を含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（ＤＮＡ－ＲＮＡキメラともいう。）を包含する。また、「核酸」は、塩基数によって限定されない。核酸は一本鎖（ヘアピン型一本鎖を含む）でもよく、二本鎖であってもよい。また、核酸を構成するヌクレオチドは、リン酸部、糖部、または塩基部に修飾基を含んでいてもよい。核酸医薬の種類は特に限定されず、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、デコイ、リボザイム、ＣｐＧオリゴ等が挙げられる。
　外来物質として採用される色素の種類は、特に限定されない。色素は、例えばＦＡＭやＦＩＴＣ等の種々の蛍光色素化合物を含み得る。構築物が色素を含むことで、構築物の導入が評価し易くなる。例えば、導入顕微鏡観察（例えば蛍光顕微鏡観察）、フローサイトメトリー、免疫化学的手法（例えばウエスタンブロットや免疫細胞染色等）等を使用して、真核細胞への導入効率を評価することができる。
　外来物質として採用される薬剤の種類は、特に限定されない。薬剤は、例えば、５－フルオロウラシル（５ＦＵ）等の核酸系抗腫瘍剤を含む抗腫瘍剤やアジドチミジン（ＡＺＴ）等の抗ウイルス剤等の種々の有機化合物を含み得る。
　構築物において、ペプチドフラグメントのＣ末端側に外来物質が結合している場合には、ペプチドフラグメントのＮ末端側のアミノ酸残基のα－アミノ基がアセチル化されていることが好ましい。詳細なメカニズムは不明だが、真核細胞中のタンパク質の多くはＮ末端側のアミノ酸のα－アミノ基はアセチル化修飾されるため、このような構成であれば、構築物の細胞内での安定性が向上し得る。
　また、構築物は、Ｃ末端側のアミノ酸残基がアミド化されていることが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基をアミド化すると、かかる構築物の細胞質内または核内における構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）が向上し得る。また、カルボキシル基がアミド化されることで、構築物の親水性が向上するため、かかる構築物の水系溶媒への溶解性を向上させることができる。かかる水系溶媒としては、例えば、水、種々の緩衝液、生理食塩水（例えばＰＢＳ）、細胞培養液等が挙げられる。
　例えば、ペプチドフラグメントのＮ末端側に外来物質が結合している構築物の場合、ペプチドフラグメントのＣ末端側のアミノ酸残基のカルボキシル基がアミド化されていることが好ましい。また、例えば外来物質がポリペプチドであり、かかるポリペプチドがペプチドフラグメントのＣ末端側に結合している場合は、当該ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基をアミド化することが好ましい。
　ペプチドフラグメントまたは構築物のうちペプチド部分（外来物質としてのポリペプチド、ペプチドフラグメント、及びペプチド性リンカー）は、例えば、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。即ち、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化等）部分を有する上記ペプチド部分を合成することができる。なお、上記方法でペプチド鎖の一部のみを合成してもよく、例えば、ペプチドフラグメントのみ、または、ペプチドフラグメントとペプチド性リンカー部分とを含むペプチド鎖を合成してもよい。
　或いは、遺伝子工学的手法に基づいてペプチドフラグメントまたは構築物のペプチド部分を生合成により作製してもよい。即ち、所望するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
　一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチド部分を単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のペプチド部分を得ることができる。
　なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本技術を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
　また、構築物のペプチド部分の製造には、例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（即ち設計した人工ポリペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的の構築物（人工ポリペプチド）を製造することができる。
　或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち、構築物のペプチド部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド部分の合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のペプチド部分をインビトロで合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。
　構築物のペプチド部分をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。例えば、ペプチド部分を構成するアミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、かかるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
　なお、外来物質としての核酸についても、上述した製造方法と同様に準備することができる。
　ここで開示される構築物は、外来物質の機能に基づく用途の組成物の有効成分として好適に使用し得る。なお、構築物は、外来物質の機能を失わない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸または有機酸を付加反応させることにより得られ得る酸付加塩を使用することができる。従って、本明細書および請求の範囲に記載の「構築物」は、かかる塩形態のものを包含し得る。
　構築物は、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る組成物の有効成分として使用され得る。
　上記担体としては、例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。かかる担体としては、外来物質導入用構築物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。また、かかる担体は、適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得、或いはリポソームであってもよい。また、医薬用組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
　組成物の形態は、特に限定されない。例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏などの形態が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水または適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
　構築物（主成分）および種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本技術を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
　本開示により、ここで開示される構築物を用いて、生体内（インビボ）、または、生体外（インビトロ）において真核細胞の外部から当該細胞の内部に目的とする外来物質を導入する方法が提供される。ここで、「真核細胞の内部」とは、細胞膜で囲まれた真核細胞の内側のことをいい、例えば、細胞質、サイトゾル、細胞内小器官（例えば、核、ミトコンドリア、小胞体、微小管、リソソーム、ゴルジ等）等を含む。ここで開示される方法では、例えば、構築物を真核細胞の少なくとも細胞質（さらには、細胞内小器官）に導入することができる。
　ここで開示される方法では、おおまかにいって、以下の（１）～（２）の工程：
（１）ここで開示される構築物を用意する工程と、
（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と
を包含する。また、ここで開示される方法では、さらに、上記（２）の工程の後、（３）の工程として、上記構築物が供給された試料をインキュベートして、該試料中の真核細胞の内部にかかる構築物を導入する工程を含み得る。
　上記「真核細胞」は、インビボにおいては、例えば種々の組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液等を包含する。上記「真核細胞」は、インビトロにおいては、例えば生体から摘出された種々の細胞塊、組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液ならびに、セルライン等を包含する。真核細胞としては、例えば、哺乳類、鳥類、魚類、両生類、爬虫類、昆虫などの動物界由来の細胞、菌界由来の細胞、植物界由来の細胞等が挙げられるが、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物の細胞（哺乳類細胞）であり得る。
　ここで開示される方法は、例えば、ここで開示される構築物を含む組成物を準備して
、真核細胞を含む試料中に供給する。インビボにおいて、かかる組成物は、その形態および目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者（即ち生体）の患部（例えば悪性腫瘍組織、ウイルス感染組織、炎症組織等）に所望する量だけ投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織（即ち、例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、炎症細胞等を含む組織や器官等の患部）に投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護（コーティング）材の適用が好ましい。
　生体外（インビトロ）においては、培養している真核細胞に対し、構築物または組成物の適当量を、少なくとも１回、目的とする真核細胞の培養液に供給するとよい。１回当たりの供給量および供給回数は、培養する真核細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。例えば、培養液中のペプチドフラグメント濃度が概ね０．０５μＭ以上１００μＭ以下の範囲内、例えば０．５μＭ以上５０μＭ以下の範囲内、また例えば１μＭ以上３０μＭ以下の範囲内となるように１回、２回またはそれ以上の複数回添加することが好ましい。また、構築物添加後のインキュベート時間についても、真核細胞の種類及び各種条件により異なり得るため特に限定されない。例えば、０．５時間以上、１時間以上、４時間以上、８時間以上、２０時間以上であり得る。なお、インキュベートの条件についても、真核細胞の種類により異なり得るため、特に限定されるものではないが、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃下でインキュベートすることができる。
　なお、インビトロにおける導入方法について、一例を後述の試験例において示している。
　以上の通り、ここで開示される技術の具体的な態様として、以下の各項に記載のものが挙げられる。
項１：以下のアミノ酸配列：
　　ＶＬＳＲＶＶＱＬＬＲＥＫＬＴＲＫＫ（配列番号１）；および
　　ＶＬＳＲＶＱＬＲＥＫＬＴＲ（配列番号２）；
のいずれかから成る、ペプチドフラグメント。
項２：
　ペプチドフラグメントと、
　上記ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した外来物質と
を含む構築物であって、
　上記ペプチドフラグメントが、以下のアミノ酸配列：
　　ＶＬＳＲＶＶＱＬＬＲＥＫＬＴＲＫＫ（配列番号１）；および
　　ＶＬＳＲＶＱＬＲＥＫＬＴＲ（配列番号２）；
のいずれかから成る、構築物。
項３：上記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群より選択される少なくとも１種の有機化合物である、項２に記載の構築物。
項４：上記外来物質が、上記ペプチドフラグメントのＣ末端側に結合している、項２または３に記載の構築物。
項５：
　真核細胞の外部から該細胞の内部に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
　（１）項２～４のいずれか一項に記載の構築物を用意する工程と、
　（２）上記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と
を含む方法。
項６：上記構築物を導入する対象の上記真核細胞が哺乳類細胞である、項５に記載の方法。
　以下、ここで開示される技術に関するいくつかの試験例を説明するが、ここで開示される技術をかかる試験例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜構築物の準備＞
　例１～２において、それぞれ表１に示す構築物を準備した。例１では、Ｎ末端のバリン残基のアミノ基がアセチル化されている配列番号１に示すアミノ酸配列から成るペプチドフラグメント（合成ペプチド）と、該ペプチドフラグメントのＣ末端側に結合された蛍光色素であるＦＡＭ（Ｃ２１Ｈ１２Ｏ７：5(6)-Carboxyfluorescein、分子量３７６．３、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）とから構成される構築物１を準備した。例２では、Ｎ末端のバリン残基のアミノ基がアセチル化されている配列番号２に示すアミノ酸配列から成る合成ペプチドと、該合成ペプチドのＣ末端側に結合された蛍光色素であるＦＡＭとから構成される構築物２を準備した。構築物１をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、構築物１の濃度が２ｍＭのサンプル溶液１を調製した。同様に、構築物２をＤＭＳＯで希釈し、構築物２の濃度が２ｍＭのサンプル溶液２を調製した。また、蛍光色素のＦＡＭをＤＭＳＯで溶解した２ｍＭのＦＡＭ溶液を調製した。
＜細胞膜透過性の評価＞
　真核細胞としてＮＳＣ－３４細胞（mouse motor neuron-like hybrid cell line）を使用し、上記調製した構築物の細胞膜透過性を評価した。
（例１）
　ＮＳＣ－３４細胞を培養培地である１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）含有ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium（富士フィルム和光純薬株式会社製、Cat No. 044-29765））で培養した。
　培養プレートに接着したＮＳＣ－３４細胞をＰＢＳで洗浄後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃中で３分間インキュベートを行った。該インキュベート後、上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを加え、トリプシンを不活性化させた後、１５０×ｇで５分間の遠心分離を行い細胞を沈殿させた。遠心分離によって生じた上清を取り除いた後、沈殿（細胞ペレット）に上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを加え、凡そ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を市販の６穴（ウェル）プレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製）のウェルに１ｍＬ加え、細胞を播種し（凡そ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル）、細胞がウェルの底面に接着するまで凡そ２～３時間インキュベートした。その後、上記調製した２ｍＭサンプル溶液１を上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈し、サンプル濃度が２０μＭのサンプル溶液１を準備した。そして、該ウェルに上記２０μＭサンプル溶液１を１ｍＬ添加した（即ち、ウェル中の培養液の構築物１の濃度が１０μＭ、ＤＭＳＯ濃度が０．５％となるようにした）。細胞を５％ＣＯ２条件下で、３７℃で２０時間インキュベートを行った。
　２０時間のインキュベート後、ウェルから培養上清を取り除き、１ｍＬのＰＢＳでウェル中の細胞を２回洗浄した。次に、ウェルに１００μＬの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加し、３７℃中で３分間インキュベートを行った。該インキュベート後、ウェルに９００μＬの上記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加することでトリプシンを不活性化し、ウェル中の細胞懸濁液をチューブに移して細胞を回収した。その後、さらに共洗いしてウェル中に残った細胞を上記チューブへと回収した。このチューブを４℃、２１０×ｇの条件で５分間遠心分離を行った。遠心分離後、上清を取り除き、沈殿（細胞ペレット）を１ｍＬのＰＢＳで懸濁（洗浄）し、上記と同じ条件で遠心分離を行った。そして、上清を取り除き、サンプル含有培地で培養した細胞（細胞ペレット）を得た。
　上記得られた細胞（細胞ペレット）について、フローサイトメータを用いて細胞膜透過性の解析を行った。フローサイトメータとして、Ｏｎ－Ｃｈｉｐ　Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ(On-Chip Biotechnologies Co., LTD.）製）を使用した。
　かかる解析のために、上記得られた細胞ペレットを５０μＬのＯｎ－ｃｈｉｐ　Ｔ　ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、解析用の細胞懸濁液を用意した。
　上記のフローサイトメータを用いて前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）および側方散乱（ｓｉｄｅ　ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）に基づくゲーティングを行い、解析対象とする細胞集団についてのゲートを設定し、かかるゲート内の細胞集団について、蛍光強度を測定した。なお、解析する該細胞集団の細胞数が１００００個以上となるように設定し、解析を行った。蛍光強度の測定には、ＦＡＭの蛍光波長を検出可能な上記フローサイトメータの蛍光検出器ＦＬ２（最適検出波長５４３ｎｍ付近）を使用した。かかる測定結果について、市販の解析ソフト「ＦｌｏｗＪｏ」（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いて解析を行い、測定対象細胞集団の蛍光強度の中央値（ｍｅｄｉａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を得た（表１参照）。
　（例２）
　例２では、サンプル溶液１の代わりにサンプル溶液２を用いた以外は例１と同様に実施した。
（例３）
　例３では、サンプル溶液１の代わりにＦＡＭ溶液を使用した以外は例１と同様に実施した。なお、かかるＦＡＭ溶液の濃度はサンプル溶液１の濃度（即ち、ウェル中の培養液のＦＡＭ濃度が１０μＭ、ＤＭＳＯ濃度が０．５％）と同じになるように用いた。
　例１～３で得られた結果を表１および図１に示す。図１は、上記フローサイトメータによって測定されたヒストグラムを示す。図１の縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１および図１に示すように、例１および２は、例３よりもＭＦＩが高かった。即ち、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列から成るペプチドフラグメントにより、ＦＡＭが細胞内により多く導入されたことがわかる。したがって、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントは、細胞膜透過性を発揮し、外来物質を細胞の外部から内部へ導入させることができることがわかる。
　なお、詳細なデータは示していないが、本発明者の検討によって、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列から成るペプチドフラグメントと、外来物質としてポリペプチド、核酸、または薬剤を外来物質として含む構築物は、効率よく真核細胞の外部から当該細胞の内部に導入されることが確認された。
　以上、ここで開示される技術の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、請求の範囲を限定するものではない。請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
　本開示によれば、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から当該細胞の内部に、目的とする外来物質を導入可能なペプチドフラグメント及び該ペプチドフラグメントを有する構築物が提供される。かかる構築物を利用することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入させ、該外来物質が導入された細胞並びに器官等の生体組織を得ることができる。また、ここで開示されるペプチドフラグメント又は構築物をドラッグデリバリー技術に利用し、各種疾患に対する治療薬を提供することができ得る。

Claims (6)

  1. 　以下のアミノ酸配列：
    　　ＶＬＳＲＶＶＱＬＬＲＥＫＬＴＲＫＫ（配列番号１）；および
    　　ＶＬＳＲＶＱＬＲＥＫＬＴＲ（配列番号２）；
    のいずれかから成る、ペプチドフラグメント。
  2. 　ペプチドフラグメントと、
    　前記ペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した外来物質と
    を含む構築物であって、
    　前記ペプチドフラグメントが、以下のアミノ酸配列：
    　　ＶＬＳＲＶＶＱＬＬＲＥＫＬＴＲＫＫ（配列番号１）；および
    　　ＶＬＳＲＶＱＬＲＥＫＬＴＲ（配列番号２）；
    のいずれかから成る、
    構築物。
  3. 　前記外来物質が、ポリペプチド、核酸、色素および薬剤から成る群より選択される少なくとも１種の有機化合物である、請求項２に記載の構築物。
  4. 　前記外来物質が、前記ペプチドフラグメントのＣ末端側に結合している、請求項２に記載の構築物。
  5. 　真核細胞の外部から該細胞の内部に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
    　（１）請求項２～４のいずれか一項に記載の構築物を用意する工程と、
    　（２）前記構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と
    を含む方法。
  6. 　前記構築物を導入する対象の前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項５に記載の方法。
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