WO2025018136A1 - ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法およびそのためのキット - Google Patents

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裕子 今井
大輔 川崎
渉 菊地
久美子 笹川
和枝 伊藤
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Nitto Boseki Co Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring TRACP-5b and a kit therefor, and more specifically, to a method for selectively measuring TRACP-5b without being affected by TRACP-5a and a kit therefor.
  • Acid phosphatase is an enzyme that has the hydrolytic activity of organic monophosphate esters under acidic conditions.
  • ACP that is known to exist in serum is derived from platelets, red blood cells, prostate, osteoclasts, macrophages, etc. These isozymes are separated by polyacrylamide gel electrophoresis, and osteoclast-derived and macrophage-derived ACPs are located fifth from the origin and are resistant to tartaric acid, and are therefore also called Band-5 tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP-5) (Patent Document 5, Lam W.K.W. et al., Clin. Chem.
  • TRACP-5 is classified into TRACP-5a, which has a high amount of sialic acid bound to the sugar chain, and TRACP-5b, which has a low amount of sialic acid bound to the sugar chain; 5a is said to be derived from macrophages and 5b from osteoclasts.
  • the concentration of TRACP-5b in serum sensitively reflects the activity of osteoclasts, and is therefore used as a bone resorption marker to aid in the diagnosis of metabolic bone diseases and bone metastatic cancer, as well as to assess the effectiveness of treatment. Therefore, methods for selectively measuring TRACP-5b from among the ACPs in serum are being investigated.
  • one method for measuring TRACP-5 involves performing an enzyme reaction using a synthetic substrate such as p-nitrophenyl phosphate in the presence of tartaric acid, and measuring the resulting reaction product colorimetrically to determine enzyme activity.
  • tartaric acid can inhibit prostate-derived ACP, TRACP-5a and red blood cell- and platelet-derived ACPs are resistant to tartaric acid, so this method also measures these isoenzymes and is not able to specifically measure TRACP-5b.
  • Non-Patent Document 3 A method for improving the TRACP-5b specificity of the above method is known in which serum is diluted 5-fold, incubated at 37°C for 1 hour, and then the enzyme activity is measured in the same manner. This method can avoid the effects of red blood cell-derived ACP as well as prostate-derived ACP, but it is still unable to avoid the effects of TRACP-5a and platelet-derived ACP.
  • Another method for specifically measuring TRACP-5b activity is to calculate TRACP-5b activity by subtracting ACP activity measured in the presence of tartaric acid and fluoride from ACP activity measured in the presence of tartaric acid (Patent Document 1).
  • This method makes it possible to avoid the effects of red blood cell-derived and platelet-derived ACPs by taking advantage of the difference in sensitivity to fluoride.
  • it is not possible to eliminate the effects of TRACP-5a, and TRACP-5b activity is calculated by subtraction, which has problems with accuracy.
  • a method for measuring the activity of TRACP-5b using a chemiluminescent substrate is known in which TRACP-5b is reacted with a chemiluminescent 1,2-dioxetane compound under acidic conditions, and then the reaction solution is made alkaline to measure the luminescence intensity (Patent Document 3).
  • a method has been reported in which a specific buffer such as MES is used during the enzyme reaction, or manganese ions or cobalt ions are added to increase the luminescence intensity ratio of TRACP-5b to TRAPC-5a, thereby specifically measuring TRACP-5b (Patent Document 4).
  • these methods are limited to activity measurements using chemiluminescent substrates, and there is a demand for a cheaper method that can specifically measure TRACP-5b.
  • An example of an immunoassay method for TRACP-5b using an antibody is a method in which an antibody specific to TRACP-5 is used to bind both TRACP-5a and TRACP-5b, and then TRACP-5b is specifically measured using the difference in the optimum pH between the two (Patent Document 5).
  • the difference in the optimum pH alone is not sufficient to provide specificity for TRACP-5b, and the amount of TRACP-5b is calculated by subtraction, which poses problems in terms of accuracy.
  • the present invention aims to provide a measurement method that can selectively detect TRACP-5b while further reducing the influence of coexisting TRACP-5a.
  • the present inventors have investigated a measurement method capable of selectively detecting TRACP-5b, and have found that by adding a compound having a sulfo group (--S(O) 2 OH), a sulfate group (--OS(O) 2 OH) and/or a salt thereof at a certain density or higher to a reaction system in which TRACP-5a may be present, the influence of TRACP-5a can be significantly reduced and TRACP-5b can be selectively detected.
  • a method for measuring tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP-5b) in a sample comprising: A method for measuring TRACP-5b, comprising a step of carrying out a reaction to detect TRACP-5b in the presence of an organic sulfonic acid, a sulfate ester, or a salt thereof having a sulfo group (-S(O) 2 OH ), a sulfate group (-OS(O) 2 OH), and/or a salt thereof at a density of 6.5 mmol/g or more.
  • a method for measuring tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP-5b) in a sample comprising: A method for measuring TRACP - 5b, comprising a step of carrying out an enzyme reaction or an antigen-antibody reaction in the presence of an organic sulfonic acid, a sulfate ester, and/or a salt thereof having 50% by mass or more of sulfo groups (-S(O) 2 OH), sulfate groups (-OS(O) 2 OH), and/or salts thereof per unit structure in S(O) 2 O-equivalent value; or the method according to [1], wherein the organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof has 50% by mass or more of sulfo groups (-S(O) 2 OH), sulfate groups (-OS(O) 2 OH), and/or salts thereof per unit structure in S(O) 2 O - equivalent value.
  • the organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof is represented by the formula (1): (In formula (1), R is an alkyl, alkenyl, or alkynyl group having 1 to 3 carbon atoms, Y is a bond or an oxygen atom, and X is hydrogen or an alkali metal.) Is it expressed as Formula (2): (In formula (2), Y is a bond or an oxygen atom, n is an integer from 2 to 5000, and X is hydrogen or an alkali metal.) or having a repeat unit of Or, Equation (3): (In formula (3), Y is O or CH2 , two of R1 to R5 are O- or bonds, and at least two of the remaining are O-S(O) 2OX or S(O) 2OX (X is hydrogen or an alkali metal), and the one that does not fall into any of the above is OX or C(O)OX (X is hydrogen or an alkali metal).) The method according to [1] or
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the measurement is performed by an enzyme method, an enzyme immunoassay (EIA), an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), a chemiluminescent immunoassay (CLIA), or a latex agglutination method.
  • EIA enzyme immunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • CLIA chemiluminescent enzyme immunoassay
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • a kit for measuring TRACP-5b comprising: A kit comprising an organic sulfonic acid, a sulfate ester and/or a salt thereof having a sulfo group (--S(O) 2 OH), a sulfate group (--OS(O) 2 OH) and/or a salt thereof at a density of 6.5 mmol/g or more.
  • a kit for measuring TRACP-5b comprising: A kit comprising an organic sulfonic acid, a sulfate ester, and/or a salt thereof having 50% by mass or more of a sulfo group (-S(O) 2 OH), a sulfate group (-OS(O) 2 OH), or a salt thereof, calculated as an S(O) 2 O - equivalent, per unit structure; or the kit according to [8], in which the organic sulfonic acid, sulfate ester, and/or salt thereof has 50% by mass or more of a sulfo group (-S(O) 2 OH), a sulfate group (-OS(O) 2 OH), or a salt thereof, calculated as an S(O) 2 O - equivalent, per unit structure.
  • the organic sulfonic acid, sulfate ester and/or salt thereof are represented by the formula (1): (In formula (1), R is an alkyl, alkenyl, or alkynyl group having 1 to 5 carbon atoms, Y is a bond or an oxygen atom, and X is hydrogen or an alkali metal.) Is it expressed as Formula (2): (In formula (2), Y is a bond or an oxygen atom, n is an integer from 2 to 5000, and X is hydrogen or an alkali metal.) or having a repeating structure of formula (3): (In formula (3), Y is O or CH2 , two of R1 to R5 are O- or bonds, and at least two of the remaining are O-S(O) 2OX or S(O) 2OX (X is hydrogen or an alkali metal), and the one that does not fall into any of the above is OX or C(O)OX (X is hydrogen or an alkali metal).)
  • the repeat structure includes the structure The kit according
  • kits according to any one of [8] to [11] for measuring TRACP-5b by an enzymatic method, A kit comprising a substrate for TRACP-5b, the organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, and optionally a reagent for diluting a specimen.
  • kits according to any one of [8] to [11], which measures TRACP-5b by enzyme immunoassay (EIA),
  • EIA enzyme immunoassay
  • a kit comprising a solid support, an anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to the solid support, a substrate for TRACP-5b, the organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, optionally a reagent for diluting a specimen, and optionally a washing solution.
  • kits comprising: a solid support; a primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to the solid support; a secondary anti-TRACP-5b monoclonal antibody that binds to TRACP-5b via an epitope different from that of the primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody and is labeled with a substance that enables detection by an enzyme reaction; a reagent for detecting the labeled substance by an enzyme reaction; the organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof; optionally a reagent for diluting a sample; and optionally a washing solution.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • kits according to any one of [8] to [11], which measures TRACP-5b by chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA),
  • CLIA chemiluminescent enzyme immunoassay
  • a kit comprising a solid support, an anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to the solid support, a chemiluminescent substrate for TRACP-5b, the organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, optionally a reagent for diluting a specimen, and optionally a washing solution.
  • kits comprising: a solid support; a primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to the solid support; a secondary anti-TRACP-5b monoclonal antibody that binds to TRACP-5b at an epitope different from that of the primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody and is labeled with a substance that enables detection by chemiluminescence; a reagent for detecting the labeled substance by chemiluminescence; the organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof; optionally a reagent for diluting a sample; and optionally a washing solution.
  • kits according to any one of [8] to [11], which measures TRACP-5b by a latex agglutination method, A kit comprising latex particles, an anti-TRACP-5b antibody adsorbed to the latex particles, the organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, and optionally a reagent for diluting a specimen.
  • the reagent containing the anti-TRACP-5b antibody or the sample dilution reagent contains the organic sulfonic acid, sulfate ester, or a salt thereof.
  • kits according to any one of [8] to [23], wherein the sample to be measured is blood, serum, or plasma.
  • the present application provides a means for selectively detecting tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP-5b) by reducing the effects of TRACP-5b. This is therefore useful for diagnosing diseases using TRACP-5b as a marker.
  • TRACP-5b tartrate-resistant acid phosphatase 5b
  • the present invention provides a method for measuring tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP-5b) in a sample, the method comprising the step of carrying out a detection reaction for TRACP-5b in the presence of a specific organic sulfonic acid, a sulfate ester, or a salt thereof.
  • the present invention provides a kit for measuring TRACP-5b, which comprises a specific organic sulfonic acid, sulfate ester, or a salt thereof.
  • TRACP-5b 1-1 Organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof
  • TRACP-5a is inhibited by the presence in the reaction system of an organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof having a sulfo group (-S(O) 2 OH), a sulfate group (-OS(O) 2 OH), and/or a salt thereof at a density of 6.5 mmol/g or more, thereby enabling selective measurement of TRACP-5b.
  • a sulfo group -S(O) 2 OH
  • -OS(O) 2 OH sulfate group
  • the effect of inhibiting TRACP-5a increases depending on the density of the sulfo group, sulfate group, or salt thereof.
  • the organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof has a sulfo group, sulfate group, and/or salt thereof at a density of 7.5 mmol/g or more, more preferably at a density of 8.5 mmol/g or more.
  • such an organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof has a sulfo group, sulfate group, and/or salt thereof in an amount of 50 mass% or more, more preferably 60 mass% or more, and even more preferably 70 mass% or more, in terms of S(O) 2O- , per unit structure.
  • unit structure refers to the structure of the repeating unit when the target compound has a repeating structure, and refers to the structure of the entire compound when the target compound does not have a repeating structure.
  • the unit structure has a salt of a sulfo group (-S(O) 2 OH) or a sulfate group (-OS(O) 2 OH)
  • the molecular weight of the unit structure is calculated as the sulfo group (-S(O) 2 OH) or the sulfate group (-OS(O) 2 OH).
  • R is an alkyl, alkenyl, or alkynyl group having 1 to 3 carbon atoms, and is preferably an alkenyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • Y is a bond or an oxygen atom, preferably a bond.
  • X is hydrogen or an alkali metal, preferably hydrogen or Na.
  • Exemplary compounds of this embodiment include, for example, methanesulfonic acid or a salt thereof (eg, the Na salt), vinylsulfonic acid or a salt thereof (eg, the Na salt), or vinyl sulfate or a salt thereof.
  • Formula (2) examples of the compound include a compound having a repeating unit of the formula:
  • Y is a bond or an oxygen atom, and is preferably a bond.
  • n is an integer of 2 to 5,000, preferably 10 to 500, and more preferably 20 to 100.
  • X is hydrogen or an alkali metal, preferably hydrogen or Na.
  • Preferred examples of the compound of this embodiment include, for example, polyvinyl sulfonic acid or a salt thereof (e.g., Na salt) or polyvinyl sulfate or a salt thereof (e.g., Na salt), more preferably, a compound having the following repeating structure: (In formula (2-1), X is hydrogen or an alkali metal, and preferably hydrogen or Na.)
  • the polyvinyl sulfonic acid or salt thereof has a molecular weight of 2 to 5,000, more preferably 10 to 500, and further preferably 20 to 100.
  • Such polyvinyl sulfonic acid or salt thereof usually has a molecular weight of 200 to 500,000, preferably a molecular weight of 1,000 to 50,000, and more preferably a molecular weight of 4,000 to 6,000.
  • molecular weight or “average molecular weight” refers to the weight average molecular weight (Mw) unless otherwise specified.
  • the weight average molecular weight (Mw) refers to a value measured by gel permeation chromatography (GPC) using a liquid chromatograph.
  • organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof include: Formula (3):
  • the compound include a compound having a repeating unit containing the structure: In formula (3), Y is O or CH2 , and preferably O.
  • R 1 to R 5 two are O- or a bond, and at least two of the remaining are O-S(O) 2 OX or S(O) 2 OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na)), and the remaining one that does not fall into either category is OX or C(O)OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na), preferably C(O)OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na).
  • two are O- or a bond, and the remaining one is O-S(O) 2 OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na).
  • repeating units containing this structure include: Examples include: In formula (3-1), Y is O or CH2 , and preferably O. L1 and L4 are each independently O or a bond, and preferably one is O-- and the other is a bond. L2 and L3 are each independently O, CH2 or a bond, and preferably one is O and the other is CH2 or a bond.
  • At least two of R 1 to R 3 are each independently O-S(O) 2 OX or S(O) 2 OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na)), and the rest, if present, are OX or C(O)OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na), preferably C(O)OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na).
  • R 1 to R 3 are each preferably independently O-S(O) 2 OX or S(O) 2 OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na), more preferably independently O-S(O) 2 OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na).
  • At least two of R 4 to R 6 are each independently O-S(O) 2 OX or S(O) 2 OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na)), and the rest, if present, are OX or C(O)OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na), preferably C(O)OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na).
  • R 4 to R 6 are preferably each independently O-S(O) 2 OX or S(O) 2 OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na), more preferably each independently O-S(O) 2 OX (X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na).
  • n is an integer from 2 to 1,000, preferably from 3 to 700, more preferably from 4 to 200, and even more preferably from 5 to 70.
  • a preferred example of the compound of this embodiment is dextran sulfate or a salt thereof (e.g., Na), more preferably a compound having the following repeating structure: (In formula (3-2), X is hydrogen or an alkali metal (e.g., Na).)
  • dextran sulfates include dextran sulfates or salts thereof (e.g., Na) having a molecular weight of 2 to 1000, preferably 3 to 700, and more preferably 5 to 70.
  • Such dextran sulfates or salts thereof usually have a molecular weight of 1,500 to 1,000,000, preferably a molecular weight of 2,000 to 550,000, and more preferably a molecular weight of 4,000 to 55,000.
  • the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof is present in the reaction system to modify the coexisting TRACP-5a antigen characteristics and inhibit its activity.
  • TRACP-5a inhibitors can be present in the reaction system in various forms; for example, these TRACP-5a inhibitors or their solutions may be added separately to the reaction solution for detecting TRACP-5b, or they may be dissolved in a specimen dilution solution and added to the measurement sample, or, depending on the reaction system, they may be added to a reagent containing an enzyme substrate or a reagent containing an anti-TRACP-5b antibody, and a reaction (e.g., an enzyme reaction or an antigen-antibody reaction) may be carried out using these reagents.
  • a reaction e.g., an enzyme reaction or an antigen-antibody reaction
  • the TRACP-5a inhibitory activity of the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof increases depending on the density and average molecular weight of the sulfo group, sulfate group, and salt thereof of the compound, and the lower limit of the concentration of the compound in the reaction solution required to exhibit the TRACP-5a inhibitory activity decreases depending on the density and average molecular weight.
  • the inhibitory activity increases depending on the concentration within a certain range, but when the concentration reaches a certain level or higher, the inhibitory activity no longer increases depending on the concentration and is maintained at a certain level, and when the concentration reaches a certain level, the inhibitory activity gradually decreases.
  • the concentration of the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof in the reaction solution taking these points into consideration.
  • the concentration in the reaction solution is preferably 0.03 ⁇ 10 -3 to 10.0% by mass, more preferably 0.15 ⁇ 10 -3 to 5.0% by mass, and even more preferably 0.3 ⁇ 10 -3 to 1.0% by mass.
  • the concentration in the reaction solution is preferably 0.03 ⁇ 10 -4 to 5.0% by mass, more preferably 0.15 ⁇ 10 -4 to 1.0% by mass, and even more preferably 0.5 ⁇ 10 -4 to 0.5% by mass.
  • its concentration in the reaction solution is preferably 0.01 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1.0% by mass, more preferably 0.3 ⁇ 10 ⁇ 4 to 0.1% by mass, and even more preferably 0.5 ⁇ 10 ⁇ 5 to 0.05% by mass.
  • the concentration in the reaction solution is preferably 0.012 to 15.0% by mass, more preferably 0.020 to 5.0% by mass, and even more preferably 0.10 to 3.0% by mass.
  • the concentration in the reaction solution is preferably 0.08 ⁇ 10 ⁇ 3 to 5.0% by mass, more preferably 0.3 ⁇ 10 ⁇ 3 to 1.0% by mass, and even more preferably 0.3 ⁇ 10 ⁇ 2 to 0.3% by mass.
  • TRACP-5a is inhibited by making the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof present in a reaction system for detecting TRACP-5b.
  • reaction system examples include enzyme reactions and antigen-antibody reactions, and the TRACP-5a inhibitor used in the method of the present invention can be used in any of these reaction systems.
  • enzyme reaction refers to the reaction between TRACP-5b and its substrate, and examples of the substrate for TRACP-5b include, for example, p-nitrophenyl phosphate or a salt thereof, 2-chloro-4-nitrophenyl phosphate or a salt thereof, 1,2-dioxetane derivatives, acridan derivatives, and 4-methylumbelliferyl phosphate.
  • antigen-antibody reaction refers to the reaction between TRACP-5b and an antibody thereagainst, and examples of the antibody thereagainst include, for example, a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, and an antigen-binding fragment.
  • monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof include anti-TRACP-5b monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof described in Patent Documents 6 and 7, etc., and more specifically, examples of antibodies or antigen-binding fragments thereof produced by hybridomas having accession numbers IPOD FERM BP-7889, IPOD FERM BP-8249, and IPOD FERM BP-7890 are included.
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • CLIA chemiluminescent enzyme immunoassay
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • latex agglutination assay latex agglutination assay
  • the enzymatic method is a method for measuring the enzymatic activity of TRACP-5b, for example, by reacting TRACP-5b in a sample with an enzyme substrate for TRACP-5b, such as p-nitrophenyl phosphate or a salt thereof, to measure the enzymatic activity of TRACP-5b. More specifically, a chromogenic substrate solution containing tartaric acid or a salt thereof (e.g., a 2-chloro-4-nitrophenyl phosphate solution) is added to the sample to initiate the enzymatic reaction, and the enzymatic activity is determined from the change in absorbance between specific time points.
  • the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof may be added independently to the reaction solution, to the sample, or to the chromogenic substrate solution.
  • enzyme immunoassay is an immunoassay that utilizes the enzyme activity of TRACP-5b to detect TRACP-5b.
  • TRACP-5b in a sample is bound to an anti-TRACP-5b monoclonal antibody, and an enzyme substrate for TRACP-5b, such as p-nitrophenyl phosphate or a salt thereof, is reacted with the bound TRACP-5b to measure the enzyme activity of TRACP-5b.
  • the sample is first contacted with an anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to a solid support, and TRACP-5b in the sample is bound to the immobilized antibody.
  • the solid support is washed with a washing solution to remove components derived from the sample that have not been adsorbed to the antibody, and then an enzyme substrate for TRACP-5b, such as p-nitrophenyl phosphate or a salt thereof, is added to the reaction system, and the TRACP-5b bound to the antibody is reacted with the substrate.
  • an enzyme substrate for TRACP-5b such as p-nitrophenyl phosphate or a salt thereof
  • the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof may be added independently to the support, to the sample or sample dilution solution, to a reagent containing an anti-TRACP-5b monoclonal antibody, or to a color-developing substrate solution.
  • enzyme-linked immunosorbent assay is a method for measuring TRACP-5b by using two different antibodies against TRACP-5b, one of which is labeled with a substance that enables detection by an enzymatic reaction, and measuring the activity of the enzyme.
  • a sample is contacted with a primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed on a solid support to allow TRACP-5b in the sample to bind to the primary antibody, and then a secondary anti-TRACP-5b monoclonal antibody that binds to TRACP-5b at an epitope different from that of the primary antibody and is labeled with a substance that enables detection by an enzymatic reaction is contacted with the immobilized TRACP-5b to allow the secondary antibody to bind to TRACP-5b, and RACP-5b is measured by an enzymatic reaction utilizing the label of the secondary antibody.
  • a primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody is adsorbed onto a solid support, and a specimen is contacted with the immobilized primary antibody to bind TRACP-5b in the specimen to the primary antibody.
  • the solid support is washed with a washing solution to remove components derived from the specimen that have not been adsorbed to the antibody, and then the immobilized TRACP-5b is contacted with a secondary anti-TRACP-5b monoclonal or polyclonal antibody that is labeled with a substance that enables detection by an enzyme reaction, such as an enzyme or biotin, and binds to TRACP-5b at an epitope different from that of the primary antibody, to bind the secondary antibody to TRACP-5b.
  • biotin is reacted with peroxidase-labeled streptavidin, followed by a peroxidase enzyme reaction, or by reacting the labeling enzyme with its substrate, to produce a color-developing substance, and the absorbance of this color-developing substance is measured, thereby measuring TRACP-5b.
  • Enzymes used as substances that enable detection by enzymatic reactions include peroxidase, alkaline phosphatase, etc., and substances that enable detection by enzymatic reactions other than enzymes include avidin and substrates for various enzymes. When avidin is used, ABC color development can be utilized.
  • the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof may be added independently to the support, to the specimen or specimen dilution solution, to a reagent containing a primary antibody and/or a secondary antibody, or to a color-developing substrate solution.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay is an immunoassay for detecting the enzyme activity of TRACP-5b by chemiluminescence, and for example, a specimen is brought into contact with an anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to a solid support such as beads to bind TRACP-5b in the specimen to the antibody, and a chemiluminescent substrate for TRACP-5b is brought into contact with the immobilized TRACP-5b, and the generated chemiluminescence is measured to measure TRACP-5b activity.
  • a specimen is first brought into contact with an anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to a solid support such as magnetic particles, and TRACP-5b in the specimen is bound to the immobilized antibody.
  • a solid support such as magnetic particles
  • TRACP-5b in the specimen is bound to the immobilized antibody.
  • the solid support on which the magnetic particles are immobilized by magnetic force or the like is washed with a washing solution to remove components derived from the sample that are not adsorbed to the antibody, and then a chemiluminescent substrate for TRACP-5b, for example, 2-chloro-5- ⁇ 4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decane]-4-yl ⁇ phenylphosphate disodium salt (CDP-Star, registered trademark) is added to the reaction system, and TRACP-5b bound to the antibody is reacted with the substrate to measure the lumin
  • the luminescence intensity reflects the TRACP-5b enzyme activity, and the TRACP-5b in the sample can be measured from the value.
  • the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof may be added independently to the support, to the specimen or specimen dilution solution, to a reagent containing an anti-TRACP-5b monoclonal antibody, or to a color-developing substrate solution.
  • Chemiluminescence enzyme immunoassay can also be used to measure TRACP-5b by contacting a specimen with a primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody immobilized on a solid support to allow TRACP-5b in the specimen to bind to the primary antibody, then contacting the immobilized TRACP-5b with a secondary anti-TRACP-5b monoclonal antibody that binds to TRACP-5b at an epitope different from that of the primary antibody and is labeled with a chemiluminescent substrate or a substance that enables detection by chemiluminescence to allow TRACP-5b to bind to the secondary antibody, and generating chemiluminescence from or using the label of the secondary antibody, and measuring the luminescence intensity.
  • the primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody is adsorbed to a solid support, for example, magnetic particles, and the specimen is contacted with the immobilized primary antibody to allow TRACP-5b in the specimen to bind to the primary antibody.
  • the solid support on which the magnetic particles are fixed is washed with a washing solution to remove components derived from the sample that have not been adsorbed to the antibody, and then the fixed TRACP-5b is contacted with a secondary anti-TRACP-5b monoclonal or polyclonal antibody that is labeled with an enzyme or a substance that can generate chemiluminescence using an enzyme reaction and binds to TRACP-5b at an epitope different from that of the primary antibody, allowing the secondary antibody to bind to TRACP-5b.
  • chemiluminescence is generated from or by using the label of the secondary antibody, and the luminescence intensity is measured, thereby allowing TRACP-5b to be measured.
  • the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof may be added independently to the support, may be added to the sample, or may be added to a reagent containing a primary antibody and/or a secondary antibody.
  • the latex agglutination method is a method for measuring TRACP-5b by measuring the turbidity caused by the agglutination of latex particles as absorbance. For example, a specimen is brought into contact with an anti-TRACP-5b polyclonal antibody adsorbed to latex particles to cause agglutination of the latex particles via TRACP-5b, and the resulting turbidity (absorbance) is measured to measure TRACP-5b.
  • the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof may be added independently to the reaction solution, to the specimen, or to a reagent containing latex particles.
  • the sample in which TRACP-5b is measured may be from any living organism, but is usually from a mammal, and in most cases, from a human.
  • the sample may be from any tissue or body fluid, but in most cases, blood, serum, and plasma are used.
  • TRACP-5b Assay Kit Another embodiment of the present invention relates to a TRACP-5b assay kit, which is characterized in that the kit contains the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester and/or salt thereof.
  • the organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof may be included in the kit 1) as an independent solution, 2) contained in a sample diluent, 3) contained in a substrate-containing reagent, or 4) contained in a reagent containing an anti-TRACP-5b antibody, depending on the kit configuration and the measurement principle.
  • the concentration of the organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof in each solution or reagent is preferably adjusted to the concentration in the reaction solution described above according to the density of the sulfo group (-S(O) 2 OH), sulfate group (-OS(O) 2 OH) and/or salt thereof of the organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof, the molecular weight of these compounds, and the measurement protocol (particularly, dilution factor (volume (vol) of reaction solution/volume (vol) of solution or reagent in which the organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof is dissolved or added)).
  • the concentration (C) in the solution or reagent is preferably 0.03 ⁇ 10 -3 to 10.0% by mass, more preferably 0.15 ⁇ 10 -3 to 5.0% by mass, and even more preferably 0.3 ⁇ 10 -3 to 1.0% by mass.
  • the concentration in the solution or reagent is preferably 0.03 ⁇ 10 -4 to 5.0% by mass, more preferably 0.15 ⁇ 10 -4 to 1.0% by mass, and even more preferably 0.5 ⁇ 10 -4 to 0.5% by mass.
  • the concentration (C) in the solution or reagent is preferably 0.01 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1.0% by mass, more preferably 0.3 ⁇ 10 ⁇ 4 to 0.1% by mass, and even more preferably 0.5 ⁇ 10 ⁇ 5 to 0.05% by mass.
  • the concentration (C) in the solution or reagent is preferably 0.012 to 15.0% by mass, more preferably 0.020 to 5.0% by mass, and even more preferably 0.10 to 3.0% by mass.
  • the concentration (C) in the solution or reagent is preferably 0.08 ⁇ 10 -3 to 5.0% by mass, more preferably 0.3 ⁇ 10 -3 to 1.0% by mass, and even more preferably 0.3 ⁇ 10 -2 to 0.3% by mass.
  • TRACP-5b can be measured using a variety of methods, and TRACP-5b measurement kits have different reagent compositions depending on the measurement method.
  • a kit for measuring TRACP-5b by an enzymatic method includes a substrate for TRACP-5b, the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof, and optionally a reagent for diluting a specimen.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be contained in an independent solution, or in a reagent containing a substrate for TRACP-5b, or in a reagent for diluting a specimen.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be dissolved in a buffer solution such as Tris.
  • a kit for measuring TRACP-5b by enzyme immunoassay comprises a solid support such as a multiwell plate, an anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to the solid support, a substrate for TRACP-5b, the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, optionally a reagent for diluting a sample, and optionally a washing solution.
  • the anti-TRACP-5b monoclonal antibody may be included in the kit as an antibody solution separate from the solid support, and in this case, when measuring TRACP-5b, the antibody is adsorbed to the solid support.
  • the washing solution is used to remove components in the sample that have not been adsorbed after TRACP-5b in the sample is bound to the antibody.
  • a Tris buffer solution containing a surfactant can be used as the washing solution.
  • the specimen dilution solution is used to adjust the concentration of the specimen, and can be, for example, a buffer solution such as Tris etc.
  • a chelating agent such as EDTA.2Na or an inorganic salt such as table salt may be added to the buffer solution.
  • materials for the solid support include polystyrene, polypropylene, polycarbonate, polyethylene, nylon, methacrylate, etc.
  • shapes of the solid support include plates, (magnetic) beads (particles), etc.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be contained in an independent solution, or in a reagent containing a substrate for TRACP-5b, a reagent containing an anti-TRACP-5b monoclonal antibody, or a reagent for diluting a specimen.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be dissolved in a buffer solution such as Tris.
  • a kit for measuring TRACP-5b by enzyme-linked immunosorbent assay comprises a solid support, a primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody immobilized on the solid support, a secondary anti-TRACP-5b monoclonal antibody that binds to TRACP-5b at an epitope different from that of the primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody and is labeled with a substance that enables detection by enzyme reaction, a reagent for detecting the labeled substance of the secondary anti-TRACP-5b monoclonal antibody by enzyme reaction, the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, optionally a reagent for diluting a sample, and optionally a washing solution.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody may be included in the kit as an antibody solution separate from the solid support. In this case, when measuring TRACP-5b, the primary antibody is adsorbed to the solid support.
  • the washing solution is used to remove components that have not bound to the primary or secondary antibodies after TRACP-5b in the sample is bound to these antibodies.
  • a Tris buffer solution containing a surfactant can be used as the washing solution.
  • the specimen dilution solution is used to adjust the concentration of the specimen, and can be, for example, a buffer solution such as Tris etc. If necessary, a chelating agent such as EDTA.2Na or an inorganic salt such as table salt may be added to the buffer solution.
  • the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be contained in an independent solution, or in a reagent for making the label of the secondary anti-TRACP-5b monoclonal antibody detectable by an enzyme reaction, a reagent containing a primary antibody or a secondary antibody, or a reagent for diluting a specimen.
  • a buffer solution such as Tris.
  • Substances that enable detection in an enzyme reaction include enzymes other than ACP, substrates for enzymes other than ACP, and biotin.
  • the reagent for detecting the labeling substance by an enzyme reaction is, for example, a reagent containing peroxidase-labeled streptavidin, a peroxidase enzyme substrate of tetramethylbenzidine, and hydrogen peroxide when the labeling substance is biotin, or a substrate thereof when the labeling substance is an enzyme, such as p-nitrophenyl phosphate when the labeling substance is alkaline phosphatase.
  • Materials for the solid support include polystyrene, polypropylene, polycarbonate, polyethylene, nylon, methacrylate, etc. Shapes of the solid support include plates, (magnetic) beads (particles), etc.
  • a kit for measuring TRACP-5b by chemiluminescent enzyme immunoassay contains, for example, a solid support, an anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to the solid support, a chemiluminescent substrate for TRACP-5b, the above-mentioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, optionally a reagent for diluting a sample, and optionally a washing solution.
  • the anti-TRACP-5b monoclonal antibody may be contained in the kit as an antibody solution separate from the solid support. In this case, when TRACP-5b is measured, the antibody is adsorbed to the solid support.
  • chemiluminescent substrates include: (1) 3-(4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decane ⁇ -4-yl)phenylphosphoric acid, disodium salt, 4-chloro-3-(methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decane ⁇ -4-yl)phenylphosphoric acid, disodium salt, 3-(4-methoxyspiro ⁇ 1,2-dioxetane- 1,2-dioxetane derivatives such as 3,2'-tricyclo[3.3.1.1(3,7)]decane ⁇ -4-yl)phenyl phosphate disodium salt and 4-methoxy-4-(3-phenyl phosphate)spiro[1,2-dioxetane-3,2'-adamantane
  • the sample diluent is used to adjust the concentration of the sample, and examples of the diluent include 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer solution, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPSO) buffer solution, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) buffer solution, N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) buffer solution, N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES) buffer solution, 2-[4-(2- A buffer selected from the group consisting of N-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, N-(2-acetamido)iminodiacetic acid (ADA) buffer, N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid (ACES) buffer, bis(2-hydroxye
  • Cobalt ions or manganese ions can be added as metal ions to the buffer, if necessary.
  • the washing solution is used to remove unadsorbed components from the sample after TRACP-5b in the sample is bound to the antibody.
  • the washing solution for example, the above-mentioned buffer solution containing a surfactant can be used.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be contained in an independent solution, or in a reagent containing a chemiluminescent substrate for TRACP-5b, a reagent containing an anti-TRACP-5b monoclonal antibody, or a reagent for diluting a specimen.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be dissolved in, for example, the above-mentioned buffer solution.
  • a kit for measuring TRACP-5b by chemiluminescence immunoassay also comprises a solid support, a primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to the solid support, a secondary anti-TRACP-5b monoclonal antibody that binds to TRACP-5b at an epitope different from that of the primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody and is labeled with a substance that enables detection by chemiluminescence, a reagent that makes the label detectable by chemiluminescence, the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, optionally a reagent for diluting a sample, and optionally a washing solution.
  • the primary anti-TRACP-5b monoclonal antibody may be included in the kit as an antibody solution separate from the solid support. In this case, when measuring TRACP-5b, the primary antibody is adsorbed to the solid support.
  • the washing solution is used to remove components that have not bound to the primary or secondary antibodies after TRACP-5b in the sample is bound to these antibodies.
  • the washing solution and sample dilution solution are the same as those described above.
  • the reagent that makes the label detectable by chemiluminescence is, for example, a reagent containing peroxidase-labeled streptavidin, a peroxidase chemiluminescent substrate, and hydrogen peroxide when the label is biotin, and a substrate for the enzyme, for example, p-nitrophenyl phosphate, when the label is an enzyme, for example, alkaline phosphatase.
  • the chemiluminescent substrate is the same as described above.
  • materials for the solid support include polystyrene, polypropylene, polycarbonate, polyethylene, nylon, methacrylate, etc.
  • shapes of the solid support include plates, (magnetic) beads (particles), etc.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be contained in an independent solution, or in a reagent that renders the label detectable by chemiluminescence, a reagent containing a primary antibody or a secondary antibody, or a reagent for diluting a specimen.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester, or salt thereof can be dissolved in, for example, the above-mentioned buffer solution.
  • a kit for measuring TRACP-5b by the latex agglutination method comprises latex particles, an anti-TRACP-5b polyclonal antibody or an anti-TRACP-5b monoclonal antibody adsorbed to the latex particles, the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof, and optionally a reagent for diluting a specimen.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof can be contained in an independent solution, or in a reagent containing latex particles, or in a reagent for diluting a specimen.
  • the aforementioned organic sulfonic acid, sulfate ester or salt thereof can be dissolved in, for example, a buffer solution.
  • the buffer solution include 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer solution, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPSO) buffer solution, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) buffer solution, N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) buffer solution, N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES) buffer solution, 2-[4-(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid ( ...
  • buffers examples include N-(2-(diethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, N-(2-acetamido)iminodiacetic acid (ADA) buffer, N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid (ACES) buffer, bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane (Bis-Tris) buffer, tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) buffer, and phosphate buffer.
  • HEPES diethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid
  • ADA N-(2-acetamido)iminodiacetic acid
  • AVS N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid
  • Bis-Tris bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane
  • Tris tris(hydroxymethyl)aminome
  • Test 1 Evaluation of TRACP-5a Inhibitors by Enzymatic Method 1-1. Compounds Evaluated The following compounds were evaluated for their TRACP-5a inhibitory effect by the enzymatic method.
  • Measurement sample TRACP-5b manufactured by Nittobo Medical Co., Ltd. and TRACP-5a manufactured by R&D Systems Co., Ltd. were diluted with 22 mM MES buffer (pH 5.0) to prepare 7 U/L TRACP-5b solution and 7 U/L TRACP-5a solution, which were used as the measurement sample.
  • 7 U/L TRACP-5b solution and 8 U/L TRACP-5a solution prepared in the same manner were used.
  • Measurement reagent (chromogenic substrate solution) A color-developing substrate solution having the following composition was used. 5mM 2-chloro-4-nitrophenyl phosphate 109mM MES 40mM Sodium Tartrate 0.1% by mass of the compound to be evaluated pH 6.6
  • Measurement method A general-purpose Hitachi automatic analyzer 7180 (Hitachi High-Tech) was used for the measurement. 200 ⁇ L of a chromogenic substrate solution containing an evaluation compound was added to 16 ⁇ L of a 7 U/L TRACP-5b solution, or a 7 U/L TRACP-5a solution or an 8 U/L TRACP-5a solution to initiate the enzyme reaction, and the absorbance (main wavelength 405 nm, secondary wavelength 480 nm) was measured from 340.5 seconds to 516.0 seconds. The amount of absorbance change per minute (absorbance change per unit time during the enzyme reaction) was calculated from the change in absorbance between the two points in time.
  • serial dilutions of TRACP-5b solutions with known activity in 22 mM MES buffer (pH 5.0) and 22 mM MES buffer (pH 5.0) as a blank were prepared, and serial dilutions of TRACP-5b solutions were measured using a chromogenic substrate solution containing each evaluation compound to prepare a standard line for TRACP-5b.
  • serial dilutions of TRACP-5b solutions were measured using a chromogenic substrate solution not containing the evaluation compound to prepare a standard line for TRACP-5b.
  • activity values were calculated from the change in absorbance obtained by measuring a TRACP-5b solution and a TRACP-5a solution using a chromogenic substrate solution containing each evaluation compound and a chromogenic substrate solution not containing the evaluation compound.
  • the measurement using sodium hyaluronate was carried out in a batch separate from that for the other evaluation compounds.
  • Measurement Reagent Chromogenic Substrate Solution
  • Measurement Method A chromogenic substrate solution with the same composition as in Test 1 was used, except that the concentrations of each evaluation compound were as described above. The measurement method was performed in the same manner as in Test 1.
  • Example 4 is data from a different batch, but the data from Test 1 is included for reference.
  • Example 5 is data from a different batch, but the data from Test 1 is listed for reference.
  • Example 1 is data from a different batch, but the data from Test 1 is listed for reference.
  • Example 2 is data from a different batch, but the data from Test 1 is included for reference.
  • TBS-T 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.5
  • 300 ⁇ L of 1.5% BSA-containing TBS was added and the plate was left standing overnight in a refrigerator.
  • a color-developing substrate solution (5 mM 2-chloro-4-nitrophenyl phosphate, 109 mM MES, 40 mM Na tartrate, pH 6.6) containing a compound to be evaluated at a concentration of 0.1% by mass was added to each well and allowed to stand at 37°C for 1 hour. Thereafter, 50 ⁇ L of 0.5 N NaOH was added, and the absorbance (main wavelength 405 nm, secondary wavelength 490 nm) was measured using a plate reader.
  • a color-developing substrate solution 5 mM 2-chloro-4-nitrophenyl phosphate, 109 mM MES, 40 mM Na tartrate, pH 6.6

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Abstract

ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定において、共存するＴＲＡＣＰ－５ａの影響をより低減してＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に検出可能な測定法を提供する。　スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、６．５ｍｍｏｌ／ｇ以上の密度で有する、有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の存在下で、ＴＲＡＣＰ－５ｂを検出する反応を行う。

Description

ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法およびそのためのキット
　本発明は、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法およびそのためのキットに関し、より具体的には、ＴＲＡＣＰ－５ａの影響を受けずにＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定する方法およびそのためのキットに関する。
　酸性ホスファターゼ（Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＣＰ）は、酸性条件下において有機モノリン酸エステルの加水分解活性を有する酵素である。ＡＣＰには複数のアイソザイムが存在し、様々な組織に分布している。血清中に存在するＡＣＰとしては、血小板由来、赤血球由来、前立腺由来、破骨細胞由来、マクロファージ由来などが知られている。これらのアイソザイムはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され、破骨細胞由来およびマクロファージ由来のＡＣＰは原点より５番目に位置し、酒石酸に対する抵抗性を有することから、Ｂａｎｄ－５　酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（Ｂａｎｄ－５　Ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＴＲＡＣＰ－５）とも呼ばれている（特許文献５、Ｌａｍ　Ｗ．Ｋ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２４（７）：１１０５－１１０８，１９７８およびＬａｍ　Ｗ．Ｋ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４，１７７－１８１，１９８１等）。ＴＲＡＣＰ－５は、糖鎖へのシアル酸の結合が多いＴＲＡＣＰ－５ａと、シアル酸の結合が少ないＴＲＡＣＰ－５ｂに分類され、５ａがマクロファージ由来、５ｂが破骨細胞由来とされている。血清中のＴＲＡＣＰ－５ｂ濃度は破骨細胞の活性を鋭敏に反映することから、骨吸収マーカーとして、代謝性骨疾患および骨転移癌の診断補助並びに治療効果判定で利用されている。そのため、血清中のＡＣＰの中からＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に測定する方法が検討されている。
　従来、ＴＲＡＣＰ－５の測定法として、酒石酸の存在下でｐ－ニトロフェニルリン酸などの合成基質を用いて酵素反応を行い、生ずる反応生成物を比色定量することにより酵素活性を求める方法がある。しかし、酒石酸は前立腺由来ＡＣＰを阻害することはできるが、ＴＲＡＣＰ－５ａや赤血球由来、血小板由来ＡＣＰは酒石酸に対して抵抗性を有するため、この方法では、これらのアイソザイムも測定してしまい、ＴＲＡＣＰ－５ｂを特異的に測定することができない。
　上記方法のＴＲＡＣＰ－５ｂ特異性を改善する方法として、血清を５倍に希釈した液を３７℃で１時間インキュベートした後、同様に酵素活性を測定する方法が知られている（非特許文献３）。この方法においては、前立腺由来ＡＣＰに加え赤血球由来ＡＣＰの影響も回避することができるが、ＴＲＡＣＰ－５ａや血小板由来ＡＣＰについては依然として回避することができない。
　ＴＲＡＣＰ－５ｂ活性を特異的に測定する他の方法としては、酒石酸の存在下で測定したＡＣＰ活性から、酒石酸とフッ化物の共存下で測定したＡＣＰ活性を差し引くことにより、ＴＲＡＣＰ－５ｂの活性を算出する方法がある（特許文献１）。この方法では、フッ化物に対する感受性の差を利用して赤血球由来および血小板由来ＡＣＰの影響を回避することができる。しかしながら、ＴＲＡＣＰ－５ａの影響を除くことができず、また差し引きによってＴＲＡＣＰ－５ｂの活性を求めており、精度の点で問題を有する。
　さらに他の方法としては、ＴＲＡＣＰ－５ｂ以外の酸性ホスファターゼの阻害物質として酸性ムコ多糖を用いて、ＴＲＡＣＰ－５ｂ活性を特異的に測定する方法が報告されている（特許文献２）。しかし、酸性ムコ多糖のＴＲＡＣＰ－５ａ活性の阻害効果は十分ではなく、ＴＲＡＣＰ－５ｂに対する特異性をより改善することが求められる。
　化学発光基質を用いたＴＲＡＣＰ－５ｂの活性測定法として、ＴＲＡＣＰ－５ｂと化学発光性１，２－ジオキセタン系化合物とを酸性条件下で反応させた後、反応溶液をアルカリ条件にして発光強度を測定する方法が知られている（特許文献３）。また、酵素反応時にＭＥＳなどの特定の緩衝剤を使用することや、マンガンイオンまたはコバルトイオンを添加することで、ＴＲＡＰＣ－５ａに対するＴＲＡＣＰ－５ｂの発光強度比が大きくなることを利用してＴＲＡＣＰ－５ｂを特異的に測定する方法が報告されている（特許文献４）。しかし、これらの方法は化学発光基質を用いた活性測定に限られ、より安価な方法でもＴＲＡＣＰ－５ｂを特異的に測定することが要求されている。
　抗体を用いたＴＲＡＣＰ－５ｂの免疫測定法としては、例えば、ＴＲＡＣＰ－５に特異的な抗体を用いて、ＴＲＡＣＰ－５ａおよびＴＲＡＣＰ－５ｂの両者を結合した後に、両者の至適ｐＨの差を利用してＴＲＡＣＰ－５ｂを特異的に測定する方法がある（特許文献５）。しかし、至適ｐＨの差のみではＴＲＡＣＰ－５ｂに対する特異性が十分ではなく、差し引きでＴＲＡＣＰ－５ｂ量を求めているため、精度の点でも問題を有している。
　また、ＴＲＡＣＰ－５ｂに対して一定の選択性を有する抗体を使用し、さらに抗体結合後に発色基質として２－クロロ－４－ニトロフェニルリン酸を用いた活性測定を行うことにより、ＴＲＡＣＰ－５ｂをより特異的に測定する方法がある(特許文献６および７)。しかし、この抗体も、ＴＲＡＣＰ－５ｂ選択性をより高めることが望まれている。
　また、ＴＲＡＣＰ－５ｂに対して高い特異性を有するモノクローナル抗体を２クローン使用してＴＲＡＣＰ－５ｂのタンパク量を定量する方法もある(特許文献８)
特開平１０－３３７１９８ 特開２００１－２３１５９５ 特開２０１１－０２４４７０ 特開２０２２－１７４０１５ 特表２００２－５１００５０ 特開２００４－０２６８０５ ＷＯ２００４／０７７０５９ ＷＯ２０１６／０２７６９７
非特許文献　Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：４５８－４６２．１９８７
　上述した従来技術に対して、本発明は、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定において、共存するＴＲＡＣＰ－５ａの影響をより低減してＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に検出可能な測定法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に検出可能な測定法を検討し、ＴＲＡＣＰ－５ａが存在し得る反応系に、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を一定以上の密度で有する化合物を存在させることで、ＴＲＡＣＰ－５ａの影響を大幅に低減でき、ＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に検出可能であることを見出した。
　即ち、本発明は、以下のＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法およびＴＲＡＣＰ－５ｂ測定用キットを提供するものである。
［１］　検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の測定方法であって、
　スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、６．５ｍｍｏｌ／ｇ以上の密度で有する、有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の存在下で、ＴＲＡＣＰ－５ｂを検出する反応を行う工程を含む、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法。
［２］　検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の測定方法であって、
　単位構造あたり、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、Ｓ（Ｏ）２Ｏ－換算値で、５０質量％以上有する有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩の存在下で、酵素反応または抗原抗体反応を行う工程を含む、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法；あるいは
　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、単位構造あたり、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、Ｓ（Ｏ）２Ｏ－換算値で、５０質量％以上有する、［１］に記載の方法。
［３］　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式（１）中、Ｒは、炭素数１～３のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｙは結合、または酸素原子であり、Ｘは水素またはアルカリ金属である。）
で表されるか、
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式（２）中、Ｙは結合、または酸素原子であり、ｎは、２～５０００の整数であり、Ｘは水素またはアルカリ金属である。）
の繰り返し単位を有するか、
あるいは
　式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式（３）中、Ｙは、ＯまたはＣＨ２であり、Ｒ１～Ｒ５のうち、２つは、Ｏ－または結合手であり、残りのうち少なくとも２つは、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属である。）であり、いずれにも該当しないものは、ＯＸまたはＣ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属である。）である。）
の構造を含む繰り返し単位を有する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩が、ビニルスルホン酸もしくはその塩、硫酸ビニルもしくはその塩、ポリビニルスルホン酸もしくはその塩、ポリビニル硫酸もしくはその塩、メタンスルホン酸もしくはその塩、またはデキストラン硫酸もしくはその塩である、［１］または［２］に記載の方法。
［５］　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩が、１）独立して検体または反応系に添加され、あるいは２）検体希釈液、３）基質含有試薬、または４）抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体（典型的には抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクロナール抗体）を含有する試薬に含まれ、これにより、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の存在下で、ＴＲＡＣＰ－５ｂを検出する反応が行われる、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］　酵素法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、またはラテックス凝集法で測定する、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］　前記検体が、血液、血清または血漿である、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］　ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定キットであって、
　スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、６．５ｍｍｏｌ／g以上の密度で有する有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩を含む、キット。
［９］　ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定キットであって、
　単位構造あたり、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）またはそれらの塩を、Ｓ（Ｏ）２Ｏ－換算値で、５０質量％以上有する有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩を含む、キット；あるいは
　前記有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩は、単位構造あたり、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）またはそれらの塩を、Ｓ（Ｏ）２Ｏ－換算値で、５０質量％以上有する、［８］に記載のキット。
［１０］　前記有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩は、式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式（１）中、Ｒは、炭素数１～５のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｙは結合、または酸素原子であり、Ｘは水素またはアルカリ金属である。）
で表されるか、
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式（２）中、Ｙは結合、または酸素原子であり、ｎは、２～５０００の整数であり、Ｘは水素またはアルカリ金属である。）
の繰り返し構造を有するか、あるいは
　式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 
（式（３）中、Ｙは、ＯまたはＣＨ２であり、Ｒ１～Ｒ５のうち、２つは、Ｏ－または結合手であり、残りのうち少なくとも２つは、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属である。）であり、いずれにも該当しないものは、ＯＸまたはＣ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属である。）である。）
の構造を含む繰り返し構造を有する、
［８］または［９］に記載のキット。
［１１］　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩が、硫酸ビニルもしくはその塩、ビニルスルホン酸もしくはその塩、ポリビニルスルホン酸もしくはその塩、ポリビニル硫酸もしくはその塩、メタンスルホン酸もしくはその塩、またはデキストラン硫酸もしくはその塩である、［８］または［９］に記載のキット。
［１２］　酵素法によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定するための、［８］～［１１］のいずれか１項に記載のキットであって、
　ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬とを含む、キット。
［１３］　前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質を含有する試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、［１２］に記載のキット。
［１４］　酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する、［８］～［１１］のいずれか１項に記載のキットであって、
　固相支持体と、前記固相支持体に吸着される抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む、キット。
［１５］　前記抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含有する試薬、前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質を含有する試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、［１４］に記載のキット。
［１６］　酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する、［８］～［１１］のいずれか１項に記載のキットであって、
　固相支持体と、前記固相支持体に吸着される第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合し、酵素反応での検出を可能とする物質で標識されている第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記標識物質を酵素反応で検出するための試薬と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む、キット。
［１７］　前記第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含有する試薬、前記標識物質を酵素反応で検出するための試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、［１６］に記載のキット。
［１８］　化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する、［８］～［１１］のいずれか１項に記載のキットであって、
　固相支持体と、前記固相支持体に吸着される抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの化学発光基質と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む、キット。
［１９］　前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの化学発光基質を含有する試薬、前記抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含有する試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、［１８］に記載のキット。
［２０］　化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する、［８］～［１１］のいずれか１項に記載のキットであって、
　固相支持体と、前記固相支持体に吸着される第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合し、化学発光での検出を可能とする物質で標識されている第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記標識物質を化学発光で検出するための試薬と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む、キット。
［２１］　前記第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含む試薬、前記第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含む試薬、前記標識物質を化学発光で検出するための試薬、または前記検体希釈用試薬を含む試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、［２０］に記載のキット。
［２２］　ラテックス凝集法によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する［８］～［１１］のいずれか１項に記載のキットであって、
　ラテックス粒子と、前記ラテックス粒子に吸着された抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬とを含む、キット。
［２３］　前記抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体を含む試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、［２２］に記載のキット。
［２４］　測定される検体が、血液、血清または血漿である、［８］～［２３］のいずれか１項に記載のキット。
　本願によれば、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の影響を低減してＴＲＡＣＰ－５ｂを選択的に検出可能な手段が提供される。したがって、ＴＲＡＣＰ－５ｂをマーカーとする疾患の診断を行う際に有用である。
　本発明の実施の形態を詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に限定して理解されるべきものではない。
　本発明は、一の実施形態において、特定の有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の存在下で、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の検出反応を行う工程を含む、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法を提供する。
　また、本発明は、他の実施形態において、特定の有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含むＴＲＡＣＰ－５ｂ測定用キットを提供する。
　以下では、これら実施形態を詳細に説明する。
１．ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法
１－１．有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩
　この測定方法においては、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、６．５ｍｍｏｌ／ｇ以上の密度で有する、有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を反応系に存在させることで、ＴＲＡＣＰ－５ａを阻害し、ＴＲＡＣＰ－５ｂの選択的な測定を可能とする。
　後述する実施例で示す通り、スルホ基、硫酸基またはそれらの塩の密度に応じて、ＴＲＡＣＰ－５ａを阻害する効果が大きくなり、好ましい実施形態において、有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、スルホ基、硫酸基および／またはそれらの塩を、７．５ｍｍｏｌ／ｇ以上の密度で有し、より好ましくは、８．５ｍｍｏｌ／ｇ以上の密度で有する。
　また、好ましい実施形態において、このような有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、単位構造あたり、スルホ基、硫酸基、および／またはそれらの塩を、Ｓ（Ｏ）２Ｏ－換算値で、５０質量％以上有し、より好ましくは、６０質量％以上有し、さらに好ましくは、７０質量％以上有する。
　ここで、本願明細書で使用する場合に、「単位構造」とは、対象とする化合物が繰り返し構造を有する場合には、その繰り返し単位の構造を意味し、対象とする化合物が繰り返し構造を有しない場合には、化合物全体の構造を意味する。また、単位構造が、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、または硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）の塩を有する場合には、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、または硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）として単位構造の分子量を算出することとする。
　このような有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の具体的な一の実施形態としては、
　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
で表される化合物が挙げられる。
　式（１）中、Ｒは、炭素数１～３のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、好ましくは、炭素数１～３のアルケニルである。
　Ｙは結合、または酸素原子であり、好ましくは、結合である。
　Ｘは水素またはアルカリ金属であり、好ましくは、水素またはＮａである。
　この実施形態の化合物の例としては、例えば、メタンスルホン酸もしくはその塩（例えば、Ｎａ塩）、ビニルスルホン酸もしくはその塩（例えば、Ｎａ塩）、または硫酸ビニルもしくはその塩が挙げられる。
　上述の有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の他の具体的な実施形態としては、
　式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
の繰り返し単位を有する化合物が挙げられる。
　式（２）中、Ｙは結合、または酸素原子であり、好ましくは、結合である。
　ｎは、２～５０００の整数であり、好ましくは、１０～５００であり、より好ましくは、２０～１００である。
　Ｘは水素またはアルカリ金属であり、好ましくは、水素またはＮａである。
　この実施形態の化合物の好ましい例としては、例えば、ポリビニルスルホン酸もしくはその塩（例えば、Ｎａ塩）またはポリビニル硫酸もしくはその塩（例えば、Ｎａ塩）が挙げられ、より好ましくは、以下の繰り返し構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式（２―１）中、Ｘは水素またはアルカリ金属であり、好ましくは、水素またはＮａである。）
を２～５０００、より好ましくは１０～５００、さらに好ましくは２０～１００有するポリビニルスルホン酸もしくはその塩が挙げられる。このようなポリビニルスルホン酸もしくはその塩は、通常、２００～５０００００の分子量を有し、好ましくは、１０００～５００００の分子量を有し、より好ましくは、４０００～６０００の分子量を有する。
　ここで、本願明細書で「分子量」または「平均分子量」という場合、特に異なる意味で使用しない限り、重量平均分子量（Ｍｗ）を意味する。また、重量平均分子量（Ｍｗ）は、液体クロマトグラフを使用し、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）によって測定した値を意味する。
　上述の有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩のさらに他の具体的な実施形態としては、
　式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
の構造を含む繰り返し単位を有する、化合物が挙げられる。
　式（３）中、Ｙは、ＯまたはＣＨ２であり、好ましくは、Ｏである。
　Ｒ１～Ｒ５のうち、２つは、Ｏ－または結合であり、残りのうち少なくとも２つは、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。）であり、いずれにも該当しないものは、ＯＸまたはＣ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）であり、好ましくは、Ｃ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。好ましくは、Ｒ１～Ｒ５のうち、２つは、Ｏ－または結合であり、残りは、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。
　また、この構造を含む繰り返し単位としては、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
が挙げられる。
　式（３－１）中、Ｙは、ＯまたはＣＨ２であり、好ましくは、Ｏである。
　Ｌ１およびＬ４は、それぞれ独立して、Ｏまたは結合であり、好ましくは、一方がＯ－であり、他方が結合である。
　Ｌ２およびＬ３は、それぞれ独立して、Ｏ、ＣＨ２または結合であり、好ましくは、一方がＯであり、他方がＣＨ２または結合である。
　Ｒ１～Ｒ３のうち、少なくとも２つは、それぞれ独立して、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは、水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。）であり、残りは、存在する場合、ＯＸまたはＣ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは、水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）であり、好ましくは、Ｃ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは、水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。Ｒ１～Ｒ３は、好ましくは、それぞれ独立して、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは、水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）であり、より好ましくは、それぞれ独立して、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。
　Ｒ４～Ｒ６のうち、少なくとも２つは、それぞれ独立して、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは、水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。）であり、残りは、存在する場合、ＯＸまたはＣ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは、水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）であり、好ましくは、Ｃ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは、水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。Ｒ４～Ｒ６は、好ましくは、それぞれ独立して、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは、水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）であり、より好ましくは、それぞれ独立して、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。
　ｎは、２～１０００であり、好ましくは、３～７００であり、より好ましくは、４～２００であり、５～７０がさらに好ましい。
　また、この実施形態の化合物の好ましい例としては、例えば、デキストラン硫酸もしくはその塩（例えば、Ｎａ）が挙げられ、より好ましくは、以下の繰り返し構造：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式（３－２）中、Ｘは水素またはアルカリ金属（例えば、Ｎａ）である。）
を２～１０００、好ましくは３～７００、より好ましくは５～７０有するデキストラン硫酸もしくはその塩（例えば、Ｎａ）が挙げられる。このようなるデキストラン硫酸もしくはその塩は、通常、１５００～１００００００の分子量を有し、好ましくは、２０００～５５００００の分子量を有し、より好ましくは、４０００～５５０００の分子量を有する。
　本発明の方法においては、上述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を反応系に存在させることで、共存するＴＲＡＣＰ－５a抗原特性を改変し、その活性を阻害する。これらＴＲＡＣＰ－５a阻害剤は、様々な形態で、反応系に存在させることができ、例えば、ＴＲＡＣＰ－５ｂを検出するための反応液中に別途これらＴＲＡＣＰ－５ａ阻害剤またはその溶液を添加してもよいし、検体希釈液中に溶解しておき、これを測定試料に添加してもよいし、反応系に応じて、酵素基質を含有する試薬、または抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体を含有する試薬に添加しておき、これらの試薬を用いて反応（例えば、酵素反応または抗原抗体反応）を行ってもよい。
　前述の有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、後述する実施例に示す通り、これら化合物のスルホ基、硫酸基、およびそれらの塩の密度、ならびに平均分子量に依存してＴＲＡＣＰ－５ａ阻害活性が増大し、ＴＲＡＣＰ－５ａ阻害活性を奏するために必要なこれら化合物の反応液中の濃度の下限値は、当該密度および平均分子量に依存して小さくなる。いずれの化合物でも、この下限値から反応液中の濃度を増大すると、一定範囲では濃度に依存して阻害活性が増大するが、一定以上の濃度になると、阻害活性は濃度に依存して増加しなくなり、一定レベルを維持するようになり、一定レベルの濃度に達すると徐々に阻害活性が減少するようになる。ただし、阻害活性がプラトーに達した場合でも依然として広範囲の濃度で高い阻害活性は維持しており、実用上は、阻害活性が反応液中の濃度に依存して増大しなくなった濃度より高い濃度で使用することが多い。
　このため、前述の有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の反応液中の濃度は、これらの点を考慮して決定することが好ましい。
　例えば、平均分子量が４０００～６０００のデキストラン硫酸もしくはその塩を使用する場合、その反応液中の濃度は、０．０３×１０－３～１０．０質量％が好ましく、０．１５×１０－３～５．０質量％がより好ましく、０．３×１０－３～１．０質量％がさらに好ましい。また、分子量４００００～６００００のデキストラン硫酸もしくはその塩を使用する場合、その反応液中の濃度は、０．０３×１０－４～５．０質量％が好ましく、０．１５×１０－４～１．０質量％がより好ましく、０．５×１０－４～０．５質量％がさらに好ましい。また、分子量４０００００～６０００００のデキストラン硫酸もしくはその塩を使用する場合、その反応液中の濃度は、０．０１×１０－５～１．０質量％が好ましく、０．３×１０－４～０．１質量％がより好ましく、０．５×１０－５～０．０５質量％がさらに好ましい。
　また、ビニルスルホン酸もしくはその塩を使用する場合、その反応液中の濃度は、０．０１２～１５．０質量％が好ましく、０．０２０～５．０質量％がより好ましく、０．１０～３．０質量％がさらに好ましい。また、例えば、平均分子量が４０００～６０００のポリビニルスルホン酸もしくはその塩を使用する場合、その反応液中の濃度は、０．０８×１０－３～５．０質量％が好ましく、０．３×１０－３～１．０質量％がより好ましく、０．３×１０－２～０．３質量％がさらに好ましい。
　測定方法においては、上述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩をＴＲＡＣＰ－５ｂを検出する反応系に存在させることで、ＴＲＡＣＰ－５ａを阻害するが、この「反応系」としては、酵素反応および抗原抗体反応が挙げられ、本発明の方法で使用されるＴＲＡＣＰ－５ａ阻害剤は、これらのいずれの反応系でも用いることができる。
　本願明細書において、「酵素反応」とは、ＴＲＡＣＰ－５ｂとその基質との反応をいい、ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質には、例えば、ｐ－ニトロフェニルリン酸またはその塩、２－クロロ－４－ニトロフェニルリン酸またはその塩、１，２－ジオキセタン誘導体、アクリダン誘導体、リン酸4-メチルウンベリフェリルが含まれる。また、本願明細書において、「抗原抗体反応」とは、ＴＲＡＣＰ－５ｂとそれに対する抗体との反応をいい、ＴＲＡＣＰ－５ｂに対する抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗原結合断片が含まれる。モノクローナル抗体またはその抗原結合断片としては、特許文献６および７等に記載する抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が挙げられ、より具体的には、例えば、受託番号ＩＰＯＤ　ＦＥＲＭ　ＢＰ－７８８９、受託番号ＩＰＯＤ　ＦＥＲＭ　ＢＰ－８２４９、または受託番号ＩＰＯＤ　ＦＥＲＭ　ＢＰ－７８９０のハイブリドーマで産生される抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
　酵素反応および抗原抗体反応を利用した方法には、様々な測定法があり、例えば、酵素法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、およびラテックス凝集測定法が挙げられる。
　本願明細書において、酵素法は、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を測定する方法であり、例えば、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素基質、例えばＰ‐ニトロフェニルリン酸またはその塩と反応させて、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を測定する。より具体的には、検体に、酒石酸もしくはその塩を含む発色基質溶液（例えば、２－クロロ－４－ニトロフェニルリン酸溶液）を添加し酵素反応を開始させ、特定の時点の間の吸光度変化から酵素活性を求める。この酵素法において、上述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立に反応液に添加してもよいし、検体に添加してもよいし、発色基質溶液に添加してもよい。
　本願明細書において、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を利用して検出する免疫測定法であり、例えば、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを、抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体に結合させ、結合したＴＲＡＣＰ－５ｂに対して、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素基質、例えばＰ‐ニトロフェニルリン酸またはその塩を反応させて、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を測定する。より具体的には、まず、固相支持体に吸着している抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体に検体を接触させ、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを固定されている抗体に結合させる。次いで、固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、反応系にＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素基質、例えばｐ－ニトロフェニルリン酸またはその塩を加え、抗体に結合しているＴＲＡＣＰ－５ｂと基質とを反応させる。反応停止液で酵素反応を停止した後、反応により生成したフェノール類、例えば、ｐ－ニトロフェノールを、所定の波長、例えば、３９０ｎｍ～４５０ｎｍ、好ましくは４００～４３０ｎｍの波長で吸光度を測定する。その吸光度の大きさは、ＴＲＡＣＰ－５ｂ酵素活性を反映するので、その値から、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを測定できる。この酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において、上述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立に支持体に添加してもよいし、検体もしくは検体希釈液に添加してもよいし、抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含む試薬に添加してもよいし、発色基質溶液に添加してもよい。
　本願明細書において、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＴＲＡＣＰ－５ｂに対する２つの異なる抗体であって、その一方には、酵素反応による検出を可能とする物質で標識されている抗体を用い、酵素の活性を計測してＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する方法である。例えば、固相支持体に吸着された第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体に検体を接触させて検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを第一次抗体に結合させ、次いで、第一次抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合し、酵素反応による検出を可能とする物質で標識されている第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を、固定されているＴＲＡＣＰ－５ｂと接触させて第二次抗体をＴＲＡＣＰ－５ｂに結合させ、第二次抗体の標識を利用して酵素反応によりＲＡＣＰ－５ｂを測定する。
　より具体的には、まず、第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を、固相支持体に吸着させ、固定された第一次抗体に検体を接触させ検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを第一次抗体と結合させる。次いで、固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、固定されたＴＲＡＣＰ－５ｂに、酵素反応による検出を可能とする物質、例えば、酵素またはビオチンで標識し、第一次抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合する第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を接触させて第二次抗体をＴＲＡＣＰ－５ｂに結合させる。次いで、第二次抗体の標識から、例えば、ビオチンを、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ酵素反応を行う、あるいは標識酵素とその基質とを反応させるなどして、発色物質を生じさせ、この発色物質の吸光度を測定することにより、ＴＲＡＣＰ－５ｂを測定することができる。酵素反応による検出を可能とする物質として用いられる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等が挙げられ、酵素以外の酵素反応による検出を可能とする物質としては、アビジン、各種酵素の基質が挙げられ、アビジンを用いる場合には、ＡＢＣ系の発色を利用すればよい。
　この酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において、上述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立に支持体に添加してもよいし、検体もしくは検体希釈液に添加してもよいし、第一次抗体および／または第二次抗体を含む試薬に添加してもよいし、発色基質溶液に添加してもよい。
　本願明細書において、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）は、ＴＲＡＣＰ－５ｂの酵素活性を化学発光により検出する免疫測定法であり、例えば、ビーズなどの固相支持体に吸着させた抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体に検体を接触させて抗体に検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを結合させ、ＴＲＡＣＰ－５ｂの化学発光基質を、固定されたＴＲＡＣＰ－５ｂに接触させ、生じる化学発光を測定することによりＴＲＡＣＰ－５ｂ活性を測定する。より具体的には、まず、磁性粒子などの固相支持体に吸着している抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体に検体を接触させ、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを固定されている抗体に結合させる。次いで、磁性粒子を磁力で固定するなどして固定した固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、反応系にＴＲＡＣＰ－５ｂの化学発光基質、例えば２－クロロ－５－｛４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］－４－イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ、登録商標））を加え、抗体に結合しているＴＲＡＣＰ－５ｂを基質と反応させ、発光強度を測定する。その発光強度は、ＴＲＡＣＰ－５ｂ酵素活性を反映するので、その値から、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを測定できる。
　この化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）において、上述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立に支持体に添加してもよいし、検体もしくは検体希釈液に添加してもよいし、抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含む試薬に添加してもよいし、発色基質溶液に添加してもよい。
　化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）はまた、固相支持体に固定された第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体に検体を接触させて検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを第一次抗体に結合させ、次いで、第一次抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合し、化学発光基質または化学発光による検出を可能とする物質で標識されている第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を、固定されたＴＲＡＣＰ－５ｂと接触させてＴＲＡＣＰ－５ｂを第二次抗体に結合させ、第二次抗体の標識から、または当該標識を利用して化学発光を生じさせその発光強度を計測して、ＴＲＡＣＰ－５ｂを測定することもできる。より具体的には、まず、第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を、固相支持体、例えば、磁性粒子に吸着させ、固定された第一次抗体に検体を接触させ検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを第一次抗体と結合させる。次いで、磁性粒子を磁力で固定するなどして固定した固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、固定されたＴＲＡＣＰ－５ｂに、酵素または酵素反応を利用して化学発光を生じさせることができる物質で標識され、第一次抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合する第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を接触させて第二次抗体をＴＲＡＣＰ－５ｂに結合させ、次いで、第二次抗体の標識から、またはこれを利用して化学発光を生じさせその発光強度を計測することにより、ＴＲＡＣＰ－５ｂを測定することができる。
　この化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）において、上述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立に支持体に添加してもよいし、検体に添加してもよいし、第一次抗体および／または第二次抗体を含む試薬に添加してもよい。
　本願明細書において、ラテックス凝集法は、ラテックス粒子の凝集によって生じる濁度を吸光度として計測してＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する方法であり、例えば、ラテックス粒子に吸着された抗ＴＲＡＣＰ－５ｂポリクローナル抗体に検体を接触させて、ＴＲＡＣＰ－５ｂを介してラテックス粒子の凝集を生じさせ、それによって生じる濁度（吸光度）を計測してＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する。このラテックス凝集法において、上述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立に反応液に添加してもよいし、検体に添加してもよいし、ラテックス粒子を含む試薬に添加してもよい。
　ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定対象とされる検体は、いかなる生体由来の検体でもよいが、通常、哺乳動物由来の検体であり、多くの場合ヒト由来の検体である。また、検体は、いかなる組織または体液由来の検体でもよいが、多くの場合、血液、血清および血漿が使用される。
２．ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定キット
　本発明の他の実施形態は、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定キットに関し、このキットは、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩を含むことを特徴とする。
　有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、キット構成および測定原理に応じて、１）独立した溶液として、２）検体希釈液に含有させて、３）基質含有試薬に含有させて、または４）抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体を含有する試薬に含有させてキットに含ませることができる。
　各溶液もしくは試薬中の有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の濃度は、上述した反応液中の濃度となるように、有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩のスルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩の密度、これら化合物の分子量ならびに測定プロトコル（特に、希釈倍数（反応液の量（ｖｏｌ）／有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を溶解もしくは添加する溶液もしくは試薬の量（ｖｏｌ））に応じて調整することが好ましい。
　例えば、平均分子量が４０００～６０００のデキストラン硫酸もしくはその塩を使用する場合、その溶液もしくは試薬中の濃度（Ｃ）は、０．０３×１０－３～１０．０質量％が好ましく、０．１５×１０－３～５．０質量％がより好ましく、０．３×１０－３～１．０質量％がさらに好ましい。また、分子量４００００～６００００のデキストラン硫酸もしくはその塩を使用する場合、その溶液もしくは試薬中の濃度は、０．０３×１０－４～５．０質量％が好ましく、０．１５×１０－４～１．０質量％がより好ましく、０．５×１０－４～０．５質量％がさらに好ましい。また、分子量４０００００～６０００００のデキストラン硫酸もしくはその塩を使用する場合、その溶液もしくは試薬中の濃度（Ｃ）は、０．０１×１０－５～１．０質量％が好ましく、０．３×１０－４～０．１質量％がより好ましく、０．５×１０－５～０．０５質量％がさらに好ましい。
　また、ビニルスルホン酸もしくはその塩を使用する場合、その溶液もしくは試薬中の濃度（Ｃ）は、０．０１２～１５．０質量％が好ましく、０．０２０～５．０質量％がより好ましく、０．１０～３．０質量％がさらに好ましい。また、例えば、平均分子量が４０００～６０００のポリビニルスルホン酸もしくはその塩を使用する場合、その溶液もしくは試薬中の濃度（Ｃ）は、０．０８×１０－３～５．０質量％が好ましく、０．３×１０－３～１．０質量％がより好ましく、０．３×１０－２～０．３質量％がさらに好ましい。
　前述の通り、ＴＲＡＣＰ－５ｂは様々な方法で測定することができ、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定キットも測定方法に応じて、異なる試薬構成となる。
　例えば、酵素法によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定するためのキットは、ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質と、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬とを含む。また、このキットにおいて、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立の溶液中に、あるいは、ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質を含有する試薬、または検体希釈用試薬に含有させることができる。独立してキットに含まれる溶液、および検体希釈用試薬では、例えば、トリス等の緩衝液中に前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を溶解することができる。
　酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定するためのキットは、マルチウェルプレートなどの固相支持体と、固相支持体に吸着されている抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質と、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む。
　抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体は、固相支持体とは別に抗体溶液としてキットに含まれてもよく、この場合には、ＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する際、抗体を固相支持体に吸着させる。洗浄液は、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを抗体に結合させた後、吸着しなかった検体中の成分を除去するために使用され。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。
　検体希釈液は、検体の濃度を調製する際に使用され、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。また、緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
　固相支持体の材料としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ナイロン、メタアクリレートなどが挙げられる。固相支持体の形状としては、プレート、（磁気）ビーズ（粒子）等が挙げられる。
　このキットにおいて、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立の溶液中に、あるいは、ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質を含む試薬、抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含む試薬、または検体希釈用試薬に含有させることができる。独立してキットに含まれる溶液、および検体希釈用試薬では、例えば、トリス等の緩衝液中に前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を溶解することができる。
　酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定するためのキットは、固相支持体と、固相支持体に固定された第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合し、酵素反応での検出を可能とする物質で標識されている第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体の標識物質を酵素反応で検出するための試薬と、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む。
　第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体は、固相支持体とは別に抗体溶液としてキットに含まれてもよく、この場合には、ＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する際、第一次抗体を固相支持体に吸着させる。洗浄液は、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを第一次抗体または第二次抗体に結合させた後、これら抗体に結合しなかった成分を除去するために使用される。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。
　検体希釈液は、検体の濃度を調製する際に使用され、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。また、緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
　このキットにおいて、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立の溶液中に、あるいは、第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体の標識を酵素反応で検出可能とするための試薬、第一次抗体または第二次抗体を含む試薬、または検体希釈用試薬に含有させることができる。独立してキットに含まれる溶液、および検体希釈用試薬では、例えば、トリス等の緩衝液中に前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を溶解することができる。
　酵素反応での検出を可能とする物質としては、ＡＣＰ以外の酵素、ＡＣＰ以外の酵素の基質またはビオチンを上げることができる。
　また、標識物質を酵素反応で検出するための試薬は、例えば、標識物質がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ酵素基質、及び過酸化水素を含む試薬である。また、標識物質が、酵素である場合には、その基質であり、例えば、アルカリホスファターゼの場合は、その酵素の基質であるｐ－ニトロフェニルリン酸などである。
　固相支持体の材料としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ナイロン、メタアクリレートなどが挙げられる。固相支持体の形状としては、プレート、（磁気）ビーズ（粒子）等が挙げられる。
　化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定するためのキットは、例えば、固相支持体と、固相支持体に吸着された抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、ＴＲＡＣＰ－５ｂの化学発光基質と、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む。
　抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体は、固相支持体とは別に抗体溶液としてキットに含まれてもよく、この場合には、ＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する際、抗体を固相支持体に吸着させる。
　化学発光基質としては、例えば、
（１）３－（４－メトキシスピロ{１，２－ジオキセタン－３，２－（５'－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン}－４－イル）フェニルリン酸・二ナトリウム塩、４－クロロ－３－（メトキシスピロ{１，２－ジオキセタン－３，２'―（５'－クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン}－４－イル）フェニルリン酸・二ナトリウム塩、３－（４－メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２’－トリシクロ［３．３．１．１（３，７）］デカン｝－４－イル）リン酸フェニル・二ナトリウム塩、４－メトキシ－４－（３－リン酸フェニル）スピロ［１，２－ジオキセタン－３，２’－アダマンタン］・二ナトリウム塩などの１，２－ジオキセタン誘導体；あるいは
（２）［１０－メチル－９（１０Ｈ）－アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩などのアクリダン誘導体
が挙げられる。
　検体希釈液は、検体の濃度を調製する際に使用され、例えば、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝液、３－モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝液、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝液、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝液、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝液、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、およびリン酸緩衝液から成る群より選ばれる緩衝液を使用できる。また、緩衝液には、必要に応じて、金属イオンとしてコバルトイオンまたはマンガンイオンを加えてもよい。
　洗浄液は、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを抗体に結合させた後、吸着しなかった検体中の成分を除去するために使用され。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含む上述の緩衝液を使用することができる。
　このキットにおいて、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立の溶液中に、あるいは、ＴＲＡＣＰ－５ｂの化学発光基質を含む試薬、抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含む試薬、または検体希釈用試薬に含有させることができる。独立してキットに含まれる溶液、および検体希釈用試薬では、例えば、上述の緩衝液中に前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を溶解することができる。
　化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定するためのキットはまた、固相支持体と、固相支持体に吸着された第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合し、化学発光での検出を可能とする物質で標識されている第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、標識を化学発光で検出可能とする試薬と、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む。
　第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体は、固相支持体とは別に抗体溶液としてキットに含まれてもよく、この場合には、ＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する際、第一次抗体を固相支持体に吸着させる。洗浄液は、検体中のＴＲＡＣＰ－５ｂを第一次抗体または第二次抗体に結合させた後、これら抗体に結合しなかった成分を除去するために使用される。　洗浄液および検体希釈液は、上述と同様である。
　標識を化学発光で検出可能とする試薬は、例えば、標識がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、ペルオキシダーゼ化学発光基質、及び過酸化水素を含む試薬であり、標識が酵素、例えば、アルカリホスファターゼの場合は、その酵素の基質、例えば、ｐ－ニトロフェニルリン酸などである。化学発光基質は、上述と同様である。
　固相支持体の材料としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ナイロン、メタアクリレートなどが挙げられる。固相支持体の形状としては、プレート、（磁気）ビーズ（粒子）等が挙げられる。
　このキットにおいて、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立の溶液中に、あるいは、標識を化学発光で検出可能とする試薬、第一次抗体または第二次抗体を含む試薬、または検体希釈用試薬に含有させることができる。独立してキットに含まれる溶液、および検体希釈用試薬では、例えば、上述の緩衝液中に前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を溶解することができる。
　ラテックス凝集法によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定するためのキットは、ラテックス粒子と、ラテックス粒子に吸着された抗ＴＲＡＣＰ－５ｂポリクローナル抗体または抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬とを含む。このキットにおいて、前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、独立の溶液中に、あるいは、ラテックス粒子を含む試薬、または検体希釈用試薬に含有させることができる。独立してキットに含まれる溶液、および検体希釈用試薬では、例えば、緩衝液中に前述した有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を溶解することができる。また、緩衝液としては、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝液、３－モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝液、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝液、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝液、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝液、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液およびリン酸緩衝液を挙げることができる。
　以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　なお、実施例で使用されている略語の意味は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
試験１．酵素法でのＴＲＡＣＰ－５ａ阻害剤の評価
１－１．評価化合物
　以下の化合物について、酵素法でのＴＲＡＣＰ－５a阻害効果を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
１－２．測定試料
　ニットーボーメディカル社製ＴＲＡＣＰ－５ｂおよびＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製ＴＲＡＣＰ－５ａを、２２ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈して、７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液、および７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ａ溶液を調製し、測定試料とした。なお、ヒアルロン酸Ｎａの測定では、同様に調製した、７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液、および８Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ａ溶液を用いた。
１－３．測定試薬（発色基質溶液）
　以下の組成の発色基質溶液を用いた。
　５ｍＭ　２－クロロ－４－ニトロフェニルリン酸
　１０９ｍＭ　ＭＥＳ
　４０ｍＭ　酒石酸Ｎａ
　０．１質量％　評価化合物
　ｐＨ６．６
１－４．測定方法
　測定には汎用の日立自動分析装置７１８０形（日立ハイテク）を用いた。７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液、または７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ａ溶液もしくは８Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ａ溶液１６μＬに、評価化合物を含む発色基質溶液２００μＬを添加し酵素反応を開始させ、その３４０．５秒後から５１６．０秒間の吸光度（主波長４０５ｎｍ、副波長４８０ｎｍ）を測定した。両時点間の吸光度変化から１分間あたりの吸光度変化量（酵素反応中の単位時間当たりの吸光度変化量）を求めた。
　また、活性既知のＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液の２２ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）での連続希釈溶液、ならびにブランクとしての２２ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）を調製し、各評価化合物を含む発色基質溶液を用いてＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液の連続希釈溶液を測定してＴＲＡＣＰ－５ｂの標準直線を作製し、評価化合物を含まない発色基質溶液を用いて同様にＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液の連続希釈溶液を測定してＴＲＡＣＰ－５ｂの標準直線を作製した。これらの標準直線を用いて、各評価化合物を含む発色基質溶液および評価化合物を含まない発色基質溶液を用いてＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液、およびＴＲＡＣＰ－５ａ溶液を測定して得られた吸光度変化量から活性値を算出した。
　なお、ヒアルロン酸Ｎａを用いた測定は、他の評価化合物とは別バッチで測定した。
１－５．測定結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
試験２．ＴＲＡＣＰ－５ａ阻害剤の添加濃度の検討
　デキストラン硫酸Ｎａ（５Ｋ）、デキストラン硫酸Ｎａ（５０Ｋ）、ポリビニルスルホン酸Ｎａ（５Ｋ）、およびビニルスルホン酸Ｎａについて、添加濃度の阻害活性への影響を検討した。
２－１．各評価化合物の添加濃度
　各評価化合物の測定試薬（発色基質溶液）中の濃度を以下の通りに調整した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
２－２．測定試料
　デキストラン硫酸Ｎａ（５Ｋ）、およびデキストラン硫酸Ｎａ（５０Ｋ）を含む試薬を用いた試験では、７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液、および７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ａ溶液を使用し、ポリビニルスルホン酸Ｎａ（５Ｋ）を含む試薬を用いた試験では、７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液、および７Ｕ／Ｌもしくは８Ｕ／ＬＴＲＡＣＰ－５ａ溶液を使用し、ビニルスルホン酸Ｎａを含む試薬を用いた試験では、７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液、および８Ｕ／ＬＴＲＡＣＰ－５ａ溶液を使用した。
２－３．測定試薬（発色基質溶液）および測定方法
　各評価化合物の濃度を上述にした以外は、試験１と同様の組成の発色基質溶液を用いた。また、測定方法は、試験１と同様の手順で実施した。
２－４．測定結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　実施例４は、別バッチでのデータであるが、試験１でのデータを参考として掲載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
実施例５は、別バッチでのデータであるが、試験１でのデータを参考として掲載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　実施例１は、別バッチでのデータであるが、試験１でのデータを参考として掲載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
実施例２は、別バッチでのデータであるが、試験１でのデータを参考として掲載した。
３．ＥＩＡ法でのＴＲＡＣＰ－５ａ阻害剤の評価
３－１．評価化合物
　以下の化合物について、ＥＩＡ法でのＴＲＡＣＰ－５a阻害効果を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
３－２．抗体固定化プレートの作製
　ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体（受託番号ＩＰＯＤ　ＦＥＲＭ　ＢＰ－７８９０）を、ＰＢＳ（８ｍＭ　リン酸水素二ナトリウム、１．５ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）にて１０　μｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、品番４６８６６７）の各ウェルに１００μＬ添加した。一晩冷蔵で静置後、ＴＢＳ－Ｔ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）３００μＬで３回洗浄後、１．５％ＢＳＡ含有ＴＢＳを３００μＬ添加し一晩冷蔵で静置した。
３－３．測定方法
　作製した抗体固定化プレートから１．５％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去後、ＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１００μＬ、及び７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ｂ溶液もしくは７Ｕ／Ｌ　ＴＲＡＣＰ－５ａ溶液を各ウェルに５０μＬ添加し、攪拌しながら１時間反応させた（２５℃、７００ｒｐｍ）。ＴＢＳ－Ｔ３００μＬで３回洗浄後、評価化合物を０．１質量％の濃度で添加した発色基質溶液（５ｍＭ　２－クロロ－４－ニトロフェニルリン酸、１０９ｍＭ　ＭＥＳ、４０ｍＭ　酒石酸Ｎａ、ｐＨ６．６）１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間静置した。その後、０．５Ｎ　ＮａＯＨを５０μL添加し、プレートリーダーにて吸光度（主波長４０５ｎｍ、副波長４９０ｎｍ）を測定した。
３－４．測定結果
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
 
 

Claims (24)

  1. 　検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ－５ｂ）の測定方法であって、
    　スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、６．５ｍｍｏｌ／ｇ以上の密度で有する、有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の存在下で、ＴＲＡＣＰ－５ｂを検出する反応を行う工程を含む、ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定方法。
  2. 　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、単位構造あたり、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、Ｓ（Ｏ）２Ｏ－換算値で、５０質量％以上有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩は、式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式（１）中、Ｒは、炭素数１～３のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｙは結合、または酸素原子であり、Ｘは水素またはアルカリ金属である。）
    で表されるか、
    　式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式（２）中、Ｙは結合、または酸素原子であり、ｎは、２～５０００の整数であり、Ｘは水素またはアルカリ金属である。）
    の繰り返し単位を有するか、
    あるいは
    　式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    （式（３）中、Ｙは、ＯまたはＣＨ２であり、Ｒ１～Ｒ５のうち、２つは、Ｏ－または結合であり、残りのうち少なくとも２つは、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属である。）であり、いずれにも該当しないものは、ＯＸまたはＣ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属である。）である。）
    の構造を含む繰り返し単位を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩が、ビニルスルホン酸もしくはその塩、硫酸ビニルもしくはその塩、ポリビニルスルホン酸もしくはその塩、ポリビニル硫酸もしくはその塩、メタンスルホン酸もしくはその塩、またはデキストラン硫酸もしくはその塩である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩が、１）独立して反応系または検体に添加され、あるいは２）検体希釈液、３）基質含有試薬、または４）抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体を含有する試薬に含まれ、これにより、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩の存在下で、ＴＲＡＣＰ－５ｂを検出する反応が行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　酵素法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、またはラテックス凝集法で測定する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記検体が、血液、血清または血漿である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　ＴＲＡＣＰ－５ｂの測定キットであって、
    　スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）および／またはそれらの塩を、６．５ｍｍｏｌ／g以上の密度で有する有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩を含む、キット。
  9. 　前記有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩は、単位構造あたり、スルホ基（－Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、硫酸基（－ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ）またはそれらの塩を、Ｓ（Ｏ）２Ｏ－換算値で、５０質量％以上有する、請求項８に記載のキット。
  10. ・　　前記有機スルホン酸、硫酸エステルおよび／またはそれらの塩は、式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    （式（１）中、Ｒは、炭素数１～５のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｙは結合、または酸素原子であり、Ｘは水素またはアルカリ金属である。）
    で表されるか、
    　式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    （式（２）中、Ｙは結合、または酸素原子であり、ｎは、２～５０００の整数であり、Ｘは水素またはアルカリ金属である。）
    の繰り返し構造を有するか、あるいは
    　式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    （式（３）中、Ｙは、ＯまたはＣＨ２であり、Ｒ１～Ｒ５のうち、２つは、Ｏ－または結合手であり、残りのうち少なくとも２つは、Ｏ－Ｓ（Ｏ）２ＯＸまたはＳ（Ｏ）２ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属である。）であり、いずれにも該当しないものは、ＯＸまたはＣ（Ｏ）ＯＸ（Ｘは水素またはアルカリ金属である。）である。）
    の構造を含む繰り返し構造を有する、
    請求項８または９に記載のキット。
  11. 　前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩が、ビニルスルホン酸もしくはその塩、硫酸ビニルもしくはその塩、ポリビニルスルホン酸もしくはその塩、ポリビニル硫酸もしくはその塩、メタンスルホン酸もしくはその塩、またはデキストラン硫酸もしくはその塩である、請求項８または９に記載のキット。
  12. 　酵素法によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定するための、請求項８～１１のいずれか１項に記載のキットであって、
    　ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬とを含む、キット。
  13. 　前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質を含有する試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 　酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する、請求項８～１１のいずれか１項に記載のキットであって、
    　固相支持体と、前記固相支持体に吸着される抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む、キット。
  15. 　前記抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含有する試薬、前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質を含有する試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、請求項１４に記載のキット。
  16. 　酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する、請求項８～１１のいずれか１項に記載のキットであって、
    　固相支持体と、前記固相支持体に吸着される第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合し、酵素反応での検出を可能とする物質で標識されている第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記標識物質を酵素反応で検出を可能とするための試薬と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む、キット。
  17. 　前記第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含有する試薬、前記標識物質を酵素反応で検出を可能とするための試薬、または検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、請求項１６に記載のキット。
  18. 　化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する、請求項８～１１のいずれか１項に記載のキットであって、
    　固相支持体と、前記固相支持体に吸着される抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの化学発光基質と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む、キット。
  19. 　前記ＴＲＡＣＰ－５ｂの基質を含有する試薬、前記抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含有する試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、請求項１８に記載のキット。
  20. 　化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する、請求項８～１１のいずれか１項に記載のキットであって、
    　固相支持体と、前記固相支持体に吸着される第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と異なるエピトープでＴＲＡＣＰ－５ｂに結合し、化学発光での検出を可能とする物質で標識されている第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体と、前記標識物質を化学発光で検出可能とする試薬と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬と、場合により洗浄液とを含む、キット。
  21. 　前記第一次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含む試薬、前記第二次抗ＴＲＡＣＰ－５ｂモノクローナル抗体を含む試薬、前記標識を化学発光で検出可能とする試薬、または前記検体希釈用試薬を含む試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、請求項２０に記載のキット。
  22. 　ラテックス凝集法によりＴＲＡＣＰ－５ｂを測定する請求項８～１１のいずれか１項に記載のキットであって、
    　ラテックス粒子と、前記ラテックス粒子に固定された抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体と、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩と、場合により検体希釈用試薬とを含む、キット。
  23. 　前記抗ＴＲＡＣＰ－５ｂ抗体を含む試薬、または前記検体希釈用試薬に、前記有機スルホン酸、硫酸エステルまたはそれらの塩を含む、請求項２２に記載のキット。
  24. 　測定される検体が、血液、血清または血漿である、請求項８～２３のいずれか１項に記載のキット。
     
     
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