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Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein besonderes Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe, die in 1, 2- und 4, 5-Stelll1ng eine Doppelbindung aufweisen.
Das in der Patentschrift Nr. 201246 beschriebene Verfahren zur Herstellung von Oxydationsprodukten der Steroidreihe betrifft den biochemischen Abbau der Seitenkette von Pregnanverbindungen zu Androstanverbindungen und gegebenenfalls Aufspaltung des Ringes D, wobei gleichzeitig in 1, 2-und ge-
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5-StellungProgesteron. wie auch As-38-Oxy-20-oxo-pregnen, 11-Desoxycorticosteron oder 3, 20-Dioxo-allopregnan in einer Verfahrensstufe in Al, 4-3, 17-Dioxo-androstadien bzw. 1, 2-Dehydro-testolacton. überführen.
Es wurde nun gefunden, dass in Steroidverbindungen, insbesondere der Pregnanreihe, die 1, 2-und bzw. oder die 4, 5-Doppelbindung ohne Seitenkettenabbau oder Ringaufspaltung auf biochemischem Wege eingeführt werden kann, wenn man in 1, 2-und bzw. oder in 4, 5-Stellung gesättigte Steroidverbindungen der aeroben Einwirkung von Enzymen von Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus, oder Ophiobolus Miyabeanus unterwirft.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Steroidverbindungen sind z. B. Abkömmlinge des Spirostans, Allospirostans, Furostans, Allofurostans, Cholans, Allocholans, Pregnans, Allopregnans, Androstans und Testans und weisen vorzugsweise in 3-Stellung eine freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppe auf. Sie können gesättigt sein oder Doppelbindungen enthalten, z. B. in l-oder 4-Stellung, ferner in 5-, 6-, 7-, 8-, 9 : 11-, 14-oder 16-Stellung, oder zusätzliche Substituenten besitzen, wie freie oder abgewandelte Oxy-, Oxo-oder Carboxylgruppen, ferner Epoxygruppen oder Halogenatome, beispielsweise
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oder 17ss-Stellung. Die oben genannten Ausgangsstoffe sind von beliebiger sterischer Konfiguration und können auch als Racemate vorliegen.
Sie umfassen auch solche der sogenannten Nor- und/oder HomoReihen, insbesondere 19-Nor-und D-Homo-Verbindungen. Besonders wichtige Ausgangsstoffe sind Verbindungen der Pregnanreihe, die in 3- und 20-Stellung freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder
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B.pregnan-3, 20-dion, Pregnan- und Allopregnan-3,11,20-trion-17α,21-diol, Pregnan- und Allopregnan- 3, 20-dion-llss 17ct, 21-triol, Pregnan- und Allopregnan-3, 18, 20-trion-llss, 21-diol, Pregnan- und Allo- pregnan-3,20-dion-11ss,18,21-triol, Pregnan- und Allopregnan-3,0-dion-18,21-diol, die entsprecheuden 21-Oxo-verbindungen und bzw. oder 9a-Fluor- und Chlor-derivate, beispielsweise 9a-Fluor- cortison, 9α
-Fluor-hydrocortison, 9α-Fluor-aldosteron und 9c < -Fluor-18-oxy-corticosteron, ferner in.
1, 2- und bzw. oder in 4, 5-Stellung gesättigte Androstanverbindungen, z. B. A -oderAS-Androsten-
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3, 17-dion, Testosteron, AS-Androsten-3-ol-17-on, Adrenosteron, Androstan-3, 17-dion, Ätiansäuren, z. B. #4- oder #5-Ätiensäuren, Alloätiansäuren, die insbesondere in3-, 11-und bzw. oder 18-Stellung Oxy- oder Oxogruppen aufweisen bzw. funktionelle Derivate der genannten Verbindungen, d. h. entsprechendeVerbindungen mit funktionell abgewandelten Oxy- oder Oxogruppen. In den Ausgangsstoffen stellt die funktionell abgewandelte Oxygruppe z.
B. eine mit einer aliphatischcn, aromatischen oder hetero cyclischen Carbonsäure, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure oder Furancarbonsäure ver- esterte oder eineverätherte Oxygruppe dar, z. B. die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy- oder Triphenyl- methoxygruppe. Die funktionell abgewandelte Oxogruppe ist vorteilhaft eine ketalisierte Oxogruppe, abgeleitet insbesondere von einem zweiwertigen Alkohol, wie die Äthylendioxygruppe.
Die genannten Ausgangsstoffe werden verfahrensgemäss mit Enzymen von Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus in Reaktion gebracht. Für ihre Gewinnung eignen sich Kulturen dieser Pilze in an sich hiefür bekannten Medien, z. B. solche mit Zuckern, wie Glucose oder Lactose, mit Peptonen, Maisquellwasser, Sojaprodukten u. dgl., sowie mit Mineralsalzen, oder aber synthetische Nährlösungen. Man arbeitet insbesondere unter aeroben Bedingungen, beispielsweise in Schüttelkultur oder bei submersem Wachstum unter Rühren und Luftzufuhr. Die genannten Pilze unterscheiden sich von andern Mikroorganismen, z. B. den Bakterien, durch gutes Wachstum unter verhältnismässig einfachen Zuchtbedingungen.
Die verfahrensgemässe Reaktion findet in der beschriebenen Pilzkultur bzw. mit Hilfe der darin enthaltenen, gegebenenfalls angereicherten oder abgetrennten Enzyme statt, im einfachsten Fall also in einer Aufschwemmung des abgetrennten Pilzmycels, des homogenisierten Pilzmycels oder in Filtraten bzw. wasserhaltigen Extrakten davon.
Die Isolierung der Verfahrensprodukte lässt sich nach bekannten Methoden vornehmen. Ihre Abtrennung kann z. B. durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit einem organischen Lösungsmittel, z. B.
Methylenchlorid oder Essigester, erfolgen. Für die weitere Reinigung des so erhaltenen Extraktes eignen sich besonders Chromatographie, z. B. an Aluminiumoxyd oder Silicagel, Anwendung von Verteilungsmethoden, z. B. dem Gegenstromverfahren, oder die Trennung mittels Girard-Reagentien, wie Trimethylammonium- oder Pyridinium-essigsaurehydrazid. Anschliessend an die Reinigung oder an ihrer Stelle wird schliesslich vorzugsweise aus organischen oder wasserig-organischen Ihungsmitteln umkristal- lisiert.
Durch Einführung der l, 2-und bzw. oder 4, 5-Doppelbindung gelangt man an wertvollen Heilmitteln der Steroid-, insbesondere der Pregnanreihe, die sich verglichen mit den i)) l, 2-Stelllng gesättigten,
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die entsprechenden 21-Oxo-sowie 21-Desoxy-verbindungen, ferner entsprechende funktionelle Derivate, wie Ester, Äther, Halogen-Derivate, z. B. 9a-Halogen-, insbesondere die Fluor- oder Chlorverbindungen. Sofern die Verfahrensprodukte nicht die Konfiguration und die Substituenten von therapeutisch verwendbaren Steroiden aufweisen, können sie als Zwischenprodukte zu deren Herstellung, z. B. der obengenannten Verbindungen dienen.
Die verfahrensgemäss erhältlichen Umsetzungsprodukte lassen sich in an sich bekannter Weise in ihre funktionellen Derivate, wie Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffderiva te, beispielsweise Ester, Äther, Enolester, Enoläther, Ketale, Thioäther und Thioketale, ferner Hydrazone, Oxime und Enamine überführen.
In diesen Verbindungen können die Oxy- und/oder Oxogruppen vollständig oder teilweise funktionell abgewandelt sein.
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fluoressigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, Valeriansäuren, Diäthylessigsäure, Capronsäuren, Önanthsauren, Caprylsauren, Palmitinsäuren, Crotonsäure, Undecansäure, Undecylensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Carbaminsäuren, Alkoxycarbonsäuren, ss-Cyclopentylpropion- säure, Hexahydrobenzoesäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Cyclohexylebsigsäure.
Phenylpropion-
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säuren, Trimethylgallussäure, Phthalsäure, Furan-2-carbonsäure, Isonicotinsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Schwefelsäuren, Halogenwasserstoffsäuren oder Phosphorsäuren.
Wenn erwünscht, lassen sich in erhaltenen Verbindungen funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen in freie Gruppen überführen. Auf diese Weise können insbesondere in polysubstituierten Derivaten die funktionell abgewandelten Gruppen auch teilweise in Freiheit gesetzt werden. Dies erfolgt z. B. aurch chemische oder enzymatische Hydrolyse, beispielsweise unter Verwendung saurer oder basischer Mittel, durch Umesterung oder Umacetalisierung. Aus den auf diese Weise oder auch direkt erhaltenen, nur partiell abgewandelten, wie veresterten bzw. verätherten Derivaten lassen sich durch anschliessende funktionelle Abwandlung, z. B. Veresterung oder Verätherung, polysubstituierte Derivate, insbesondere auch gemischte Ester oder Äther bzw. Ester-Äther, herstellen.
Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel oder als Zwischenprodukte zu deren Herstellung Verwendung finden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
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teln. Nach 2 Tagen wird das Mycel abgetrennt und gut mit Wasser und Essigester gewaschen. Nach er- schöpfender Extraktion dervereinigtenFiltrate mit insgesamt 4 I Essigester werden die Extrakte mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der so gewonnene rohe Extrakt (1, 1 g) wird an einer Säule von 30 g Silicagel nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wobei man mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton-Gemischen steigenden Acetongehaltes eluiert. Die einzelnen Fraktionen (je 100 cm ?) untersucht man papierchromatographisch.
Die mit Chloroform eluierten Anteile enthalten nur Verunreinigungen, während sich in den Chloroform- Aceton (9 : 1) -Fraktionen eine neue Substanz befindet, die im Papierchromatogramm (System Propylenglykol-Toluol) etwas weniger weit als Cortexon wandert. Die Fraktionen mit höherem Acetongehalt enthalten nur wenig hochpolares Material. Die die erwähnte neue Substanz enthaltenden Fraktionen vereinigt man und dampft sie im Vakuum ein. Durch Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton-Petroläther-Gemischen erhält man das reine 1-DehydroCortexon vom F. = 185-1920 in beinahe quantitativer Ausbeute. Diese Verbindung reduziert alkalische Silberdiamin-Lösung rasch und stark. Die Analyse stimmt auf die BruttoformelC.H 0, (Ber. C 76, 79 H 8, 59%, Gef.
C 76,67 H 8, 84%). Das UV-Spektrum der freien Verbindung zeigt eine starke Bande mit dem Maximum bei 244 mll (E = 14200), dasjenige des Dinitrophenylhydrazons eine solche bei 388 mu (E = 39000). Die entsprechenden Banden des Cortexons liegen bei 240 mg (E = 16200) resp. 378 mg (E = 39000).
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das 1-Dehydro-Cortexon in hoher Ausbeute.
Beispiel 3 : Man züchtet, wie in Beispiel 1 beschrieben, in einem Schüttelgefäss 4 I einer Kultur von Calonectria decora und gibt unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Cortison in 25 cm ! Methanol zu. Das Gefäss wird darauf bei 27 geschüttelt. Nach 4 Tagen trennt man das Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat erschöpfend mit insgesamt 3 l Essigester. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der so erhaltene rohe Rückstand wird wie in Beispiel 1 beschrieben, an 30 g Silicagel nach der Durchlaufmethode chromatographiert. Die mit Chloroform-Aceton (6 : 4)-Gemischen eluierten Anteile bestehen zur Hauptsache aus einer Substanz, die etwas polarer ist als das Ausgangsmaterial.
Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft.
Aus Aceton-Äther-Gemischen wird das 1-Dehydro-Cortison kristallisiert. F. = 231-2340. Die Substanz reduziert alkalische Silberdiamin-Lösung rasch und stark und zeigt im UV-Spektrum eine starke Absorption bei 240 mg (e = 15800). Durch Acetylierung mit Pyridin-Acetanhydrid erhält man das entsprechende 21-Acetat vom F. = 224-2300C. In ähnlicher Weise lässt sich z. B. das Önanthat oder Un- decylenat herstellen.
Beispiel 4: Zu 4 l einer gut entwickelten Kultur von Calonectria decora gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Hydrocortison in 25 cms Methanol. Nach 4-tägigem Schütteln bei 270 wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert und chromatographiert. Die mit Chloroform-Aceton (1 : 1)-Gemischen eluierten Anteile enthalten eine Substanz, die etwas polarer als Hydrocortison ist. Die-
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se Fraktionen vereinigt man und dampft sie ein. Das 1-Dehydro-Hydrocortison wird aus Methanol oder Aceton-Äther-Gemischen umkristallisiert. F. = 238-241 . Es reduziert alkalische Silberdiamin- Lösung rasch und stark und zeigt im UV-Spektrum eine starke Absorption bei 244 mu (e = 5100).
Beispiel 5 : In einem Erlenmeyerkolben von 500 ems Fassungsvermögen werden 150 cm3 tige Bierwürze sterilisiert und mitCalonectria decora beimpft. Man lässt 2 Tage bei 27 schütteln und gibt zu der nun gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg Aldosteron in 1, 5 cm* Aceton zu. Dann schüttelt man bei 270 weiter und filtriert nach 38 Stunden das Mycel ab. Das Kulturfiltrat wird mit Essigester erschöpfend extrahiert, die Extrakte mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedanpft. Der Rückstand wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, an 1 g Silicagel chromatographiert, wobei die einzelnen Fraktionen (je 20 cms) papierchromatographisch untersucht werden.
In den mit Chloroform-Aceton (l : l)-Gemischen eluierten Anteilen befindet sich eine Substanz, die etwas polarer ist als Aldosteron und alkalische Silberdiamin-Lösung reduziert. Sie wird aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert und stellt das 1-Dehydro-Aldosteron dar. Im UV-Spektrum zeigt sie starke Absorption bei 244 mull.
Beispiel 6 : In 14 Erlsnmeyerkclben von 200 cm* Fassungsvermögen werden je 50 cl* 70%oigne
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3, 17-don. Man lässt 2 Tage lang bei 270 weiter schütteln und extrahiert dann die Kulturen mit Essigester. Die papierchromatographische Untersuchung der einzelnen Extrakte zeigt, dass alle Ausgangssubstanzen in die entsprechenden l-Deyhdro-Verbindungen übergeführt worden sind, die gegenüber den Ausgangsstoffen ganz leicht erhöhte Polarität besitzen und sich in ihren Spektren charakteristisch von diesen unterscheiden.
Beispiel 7 : Verwendet man zur Dehydrierung der in Beispiel 6 genannten Substanzen statt der dort beschriebenen Kulturen von Calonectria decora Kulturen von Alternaria passiflorae Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus, so zeigt die papierchromatographische Untersuchung der Extrakte die gleichen Umsetzungsprodukte wie sie in Beispiel 6 beschrieben sind.
Beispiel 8 : Zu 41 einer gut entwickelten Kultur von Calonectria decora gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 3,11, 20-Triketo-17a, 21-dioxy-allopregnan in 25 cm3 Methanol. Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und trennt dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes wird. in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
Die mit Chloroform-Aceton (1-1)-Gemischen eluierten Anteile enthalten das 1-Dehydro-cortison, das aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert erhalten wird, F. = 230-233 . Es besitzt die in Beispiel 3 beschriebenen Eigenschaften.
Wird an Stelle der Lösung von 3, 11, 20-Triketo-17α,21-dioxy-alloprognan eine Lösung von 3, 11,20Triketo-17a, 21-dioxy-pregnan in 25 cru ? Methanol einer analogen Kultur von Calonectria decora zugesetzt und in der beschriebenen Weise aufgearbeitet, so erhält man ebenfalls das 1-Dehydro-cortison in guter Ausbeute.
Beispiel 9 : Unter sterilen Bedingungen wird eine Lösung von 1 g 3, 29-Diketo-llss, 17a, 21- trioxy-allopregnan in 25 cm3 Methanol zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora gegeben und die Mischung 4 Tage bei 27 geschüttelt. Dann trennt man vom Mycel ab und führt die Extraktion des Kulturfiltrates und die chromatographische Auftrennung des Extraktes wie in Beispiel 1 beschrieben durch. Aus den mit Chloroform-Aceton-(1:1)-Gemischen eluierten Anteilen wird das 1-Dehydrocortison in guter Ausbeute kristallisiert erhalten, F. = 239-242 . Es besitzt die in Beispiel 4 beschriebenen Eigenschaften.
Beispiel 10: Eine Lösung von 1 g Androstan-3,17-dion in 25 cm* Aceton wird unter sterilen Bedingungen zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora gegeben. Nach 36-stündigem Schütteln bei 27 trennt man das Mycel ab und schüttelt das Kulturfiltrat erschöpfend mit Methylenchlorid aus. Der Extrakt
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waschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Den Rückstand (1, 2 g) chromatographiert man an 30 g Aluminiumoxyd nach der Durchlaufmethode, wobei man mitPetroläther-Benzol-Gemischen, mit Benzol, mit Benzol-Äther-Gemischen und mit Äther eluiert. Die mit Petroläther-Benzol und mit Benzol abgelösten Anteile enthalten das bekannte #1,4-Androstadien, 3,17-dion, das aus einem Aceton-Petrol- rather-gemisch in rhombischen Platten kristallisiert.
F. = 140-146 ; < x]D = + 1100 (CHC ).
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Pyridin werden mit 2 cnss Essigsäureanhydrid versetzt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 16 Stunden dampft man die Lösung im Vakuum bei 300 ein und nimmt den Rückstand in einem Chloro- form-Äther- (1 : 4) -Gemisch auf. Man wäscht die Lösung je dreimal mit 0, In-Salzsäure, mit 2 %iger Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Durch Umkristallisieren des erhaltenen Rückstandes aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch erhält man das reine 1-De-
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turfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Die Chloroform- und die Chloroform-Aceton (95 : 5)-Fraktionen enthalten Verunreinigungen und etwas Ausgangsmaterial, während die Chloroform-Aceton (90 : 10)-Fraktionen zur Hauptsache aus einer Substanz bestehen, die im Papierchromatogramm etwas langsamer läuft als das Ausgangsmaterial.
Diese Substanz stellt das #1,4-3,11,20-Triketo-21-oxy-pregnadien dar, das aus Aceton-Äther kristallisiert wird. Die Kristalle zersetzen sich zwischen 200 und 2200, je nach Heizgeschwindigkeit etwas verschieden. Die Substanz absorbiert im UV bei 240 mg und zeigt im IR die für die A-3-Keto-Gruppie- rung charakteristischen Banden bei 5, 99 , 6, 14p und 6, 22je. Durch Acetylierung mit Pyridin-Acetanhydrid erhält man das entsprechende 21-Acetat vom F. = 188-1910. In ähnlicher Weise lässt sich z. B. das Önanthat oder Undecylenat herstellen.
Beispiel 13 : Zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Corticosteron in 25 cm3 Aceton.
Man lässt 4 Tage bei 27 schütteln und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton (95:5) eluierten Auteile enthalten Verunreinigungen und Ausgangsmaterial. Mit Chloroform-Aceton (90:10) und (80:20) wird zur Hauptsache eine Substanz eluiert, die im Papierchromatogramm etwas langsamer wandert als das Ausgangsmaterial. Es handelt sich um das 1-Dehydro-corticosteron, das aus Aceton umkristallisiert wird. F. = 216-2200 (Zers. ), [cdD=+1580
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=Beispiel 14 : Zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 17 a- OXy-cortexon (Reichstein's Substanz S) in 25 cm3 Methanol. Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und filtriert dann das Mycel ab.
Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Chloroform- und die Chloroform-Aceton (9/, 5 : 2, 5)-Fraktionen enthalten Verunreinigungen, während mit Chloroform-Aceton (95 : 5) etwas Ausgangsmaterial eluiert wird.
Die Chloroform-Aceton (90 : 10)-Fraktionen bestehen aus einem Gemisch, das neben wenig Ausgangsmaterial und höher polaren Produkten zur Hauptsache 1-Dehydro-17α-oxy-cortexon enthält. Dieses wird durch Kristallisation aus Aceton rein erhalten ; F. = 227-2330 (Zers.); [α]D = +76 (Äthanol); UV-Ab- sorptionsspektrum : #max 244 m (# = 16200). Im IR finden sich Banden u. a. bei 2, 76p,' 2, 85 p, 5,84 , 6,00 ,6,15 ,6,23 ,9,01 ,9,20 ,9,55 und10,04 .
Das mittels Pyridin-Acetanhydrid hergestellte 21-Acetat schmilzt bei 216-2220, [c < ] p = + 86 (Dioxan); UV-Absorptionsspektrum 3max 244 m (# = 15400).
Beispiel'15., Zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Progesteron in 25 cms Aceton.
Man lässt 24 Stunden bei 27 schütteln und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Der Rohextrakt wird an einer Säule von 30 g alkalifreiem Aluminiumoxyd chromatographiert, wobei die einzelnen Fraktionen (je 100 cm3) papierchromatographisch untersucht werden. Die Petroläther-Benzol-Fraktionen enthalten Ausgangsmaterial, während mit Benzol zur Hauptsache 1-Dehydro-progesteron eluiert wird. Dieses wird aus Äther-Petroläther kri- stallisiert, F. =151-1520; [α]D23 = + 12 (Äthanol); UV.-Absorptionsspektrum #max 245 mp (# = 16150).
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Cortison in 8 cms Methanol.
Man schüttelt weiter bei 270, filtriert nach 3 Tagen das Mycel ab und ex- trahiert das Kulturfiltrat wie in Beispiel 1 beschrieben mit Essigester. Die papierchromatographische
Untersuchung des Rohextraktes zeigt, dass neben wenig höherpolaren Anteilen nur 1-Dehydro-cortison, aber kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist. Mittels Kristallisation aus Aceton-Äther und aus Me- thanol wird das 1-Dehydro-cortison rein erhalten.
Beispiel 17 : 2 g Natriumnitrat, 1 g prim. Kalium-ortho-phosphat, 0, 5 g Magnesiumsulfat- heptahydrat, 0, 5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g Difco-Hefeextrakt werden in 1 1 Leitungswasser gelöst, durch Zusatz von Natronlauge auf Ph 5 gebracht und sterilisiert. Die erhaltene Nährlösung be- impft man mit 50 cms einer 4 Tage alten Schüttelkultur von Didymella lycopersici und schüttelt sie
48 Stunden bei 270, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann wird unter sterilen Bedingungen eine
Lösung von 250 mgCortexon in 10 cm'Aceton zugegeben. Man schüttelt weitere 2 Tage bei 270, nutscht dann das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert die vereinigten Filtrate mit Essig- ester.
Die Essigester-Lösungen wäscht man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein, wo- bei sich der erhaltene kristalline Rückstand bei der papierchromatographischen Untersuchung im System
Bush Bs [ Ligroin:benzol:Methanol:Wasser (6, 67:3, 33:8, 0:2, 0)]als fast reines 1-Dehydrocortexonerweist.
Zur Reinigung lässt man es in Chloroformlösung durch eine Schicht Silicagel laufen. Das Chloroform-
Filtrat enthält wenig Öl. Die weiteren, mit Chloroform unter Zusatz von 1 bis 30/0 tertiar-Butanol erhal- tenen Filtrate vereinigt man und dampft sie ein. Der Rückstand liefert, aus einem Aceton-Isopropyl- äther-Gemisch umkristallisiert 220 mg 1-Dehydrocortexon vom F. = 189-1950 (Zers.).
Beispiel 18 : Zu 1 l einer gut entwickelten, wie im Beispiel 17 dargestellten Kultur von Didy- mella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 250 mg Cortison in 10 cm* Me- thanol und lässt 72 Stunden bei 270 schütteln, wonach die Kultur-Flüssigkeit wie in Beispiel 17 angege- ben aufgearbeitet wird. Auf Grund der papierchromatograplilichen Untersuchung im System Propylen- glykol-Toluol enthält der Rückstand der Essigester-Extrakte als Steroidantell praktisch ausschliesslich
1-Dehydrocortison. Man filtriert den Rückstand in Chloroform-Lösung durch Silicagel. Die Chloroform-
Filtrate geben wenig Öl.
Mit Chloroform-Aceton (6 : 4) erhält man einen krista lliL en Ruckstand, der aus einem Aceton-Äther-Gemisch umkristallisiert 225 mg reines 1-Dehydrocortison vom F. = 231-2340 lie- fert.
Beispiel 19 : Zu l l einer gut entwickelten, wie in Beispiel 17 hergestellten Kultur von Didy- mella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 250 mg Hydrocortison in 10 cm*
Methanol. Nach 10-tagigem Schütteln bei 27 wird die Kultur wie in Beispiel 17 ausgeben, aufgear- beitet. Der Rückstand der Essigesterlösungen erweist sich im Papierchromatogramm (System Propylen- ; glykol-Toluol) als fast reines 1-Dehydro-hydrocortison. Zur Abtrennung von Begleitsubstanzen nimmt man ihn in Chloroform auf und filtriert die Lösung durch Silicagel. Die Chlufuform-Eluate, die eine kleine Menge eines Öls enthalten, werden verworfen. Die Chloroform-Aeeton (t : l)-Eluate vereinigt man und dampft sie ein.
Der Rückstand wird aus Methanol oder einem Aceton-Äther-Gemisch umkristallisiert,
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dioxy-allopregnan in 2 cm* Methanol. Man lässt 10 Tage bei 27 schütteln und arbeitet die Kultur wie in Beispiel 17 angegeben, auf. Der Rückstand der Essigester-Extrakte enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung im System Propylenglykol-Toluol neben unverändertem ausgangsmateriall- Dehydrocortison, das durch Chromatographie an Silicagel und anschliessende Kristallisation aus einem Aceton-Äther-Gemisch In reiner Form gewonnen wird. beispiel 21 :
Auf analoge Weise erhält man aus Progesteron, #1-Allopregnen-3,20-dion, Pregnan- 3,20-dion, Corticosteron, 11-Dehydro-corticosteron, 17α-Oxy-cortexon, Testosteron, #1- oder #4-An- drosten- 3, 17 ; "dion die entsprechenden ta4 -Diene.
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+ 1350 (Chloroform), UV.-Absorptionsspektrum #max 240 m (# = 14800).
Beispiel 23 : Zu 4 1 einer gut entwickelten, wie in Beispiel 17 erhaltenen Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 17 ct-Äthinyl-testosteron in 25 cm ! Aceton. Man lässt 8 Tage lang, bei 270 schütteln und arbeitet dann die Kultur gemäss den Angaben in Beispiel 17 auf. Die papierchromatographische Untersuchung des Extraktionsrückstandes zeigt, dass er praktisch nur aus 1-Dehydro-17 tx-äthinyl-testosteron besteht. Durch Kristallisation aus einem Aceton- Äther-Gemisch wird die reine Substanz erhalten. F. = 228-2330, [α]D = -17 (Chloroform).
Beispiel 24 : Zu 2 I einer gut entwickelten, wie in Beispiel 17 erhaltenen Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 180 mg 6-Dehydro-cortexon-21-acetat in 10 cm'Aceton und lässt dann 3 Tage lang bei 270 schütteln. Dann wird die Kultur wie in Beispiel 17 beschrieben, aufgearbeitet. Der Extraktionsrückstand (190 mg) besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung praktisch ausschliesslich aus freiem 1, 6-Bis-dehydro-cortexon, das aus Aceton-Äther-Ge-
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t, 4-3-Ketonelycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 11-Dehydro-progesteron in 20 cm2 Aceton. Man lässt 8 Tage bei 27 schütteln und arbeitet dann wie in Beispiel 17 beschrieben auf.
Im Extraktionsrückstand kann mittels papierchromatographischer Untersuchung ausschliesslich das 1, 11- Bis-de-
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u,Beispiel 26 : Zu 2 1 einer gut entwickelten, wie in Beispiel 17 erhaltenen Kultur von Didymella lycopersici wird unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 500 mg 17cx-Methyl-tlZStosteron in 15 cms Aceton gegeben. Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und arbeitet dann die Kultur gemäss den Angaben
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wenigheptahydrat, 0, 5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g Difco-Hefeextrakt werden in 11 Leitungswasser gelöst, durch Zusatz von Natronlauge auf PH 5 gebracht und sterilisiert.
Die erhaltene Nährlösung beimpft man mit 50 cm2 einer 4 Tage alten Schüttelkultur von Didymella lycopersici und schüttelt sie 48 Stunden bei 270, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Zu 120 cm ? dieser Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg 9 α-fluor-hydrocortison in 2 cmsMe- thanol. Man lässt 5 Tage bei 270 schütteln, nutscht dann das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert die vereinigten Filtrate mit Essigester. Die Essigester-Lösungen wäscht man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein.
Der Extraktionsrückstand enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung 1-Dehydro-9α-fluor-hydrocortison, das mittels eines präpa- rativen Papierchromatogramms (System Propylenglykol-Toluol) von unverändertem Ausgangsmaterial abgetrennt wird. Aus Aceton bildet es Kristalle vom F. = 263-2660 (Zers.), [α]D23= +108 (Äthanol) UV.-Absorptionsspektrum #max 240 m (# = 15800). Es wird im Hochvakuum getrocknet und mit 4 cm3 Pyridin-Essigsäureanhydrid-(1:1)-Gemisch in üblicher Weise bei Zimmertemperatur acetyliert.
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(Zers. al D = +1080 spektrum ,max 240 n (e= 16250).
Beispiel 28 : 2 g Natriumnitrat, 1 g prim. Kalium-ortho-phosphat, 0, 5 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g Difco-Hefeextrakt werden in 11 Leitungswasser gelöst, durch Zusatz von Natronlauge auf pH 5 gebracht und sterilisiert. Die erhaltene Nährlösung beimpft man mit 50 cnss einer 4 Tage alten Schüttelkultur von Didymella lycopersici und schüttelt sie 48 Stunden bei 270, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Zu 120 cm3 dieser Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg 9, 11-Oxido-17α-oxy-cortexon-21- acetat in 2 ems Methanol. Man lässt 5 Tage bei 270 schütteln, nutscht dann das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert dievereinigtenFiltrate mit Essigester.
Die Essigester-Lösungen wäscht
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man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vdkuum ein. Der Extraktionsrückstand enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung 1-Dehydr-9,11ss-oxido-17α-oxy-cortexon, das mittels eines praparativen Papierchromatogramms (System Propylenglykol-Toluol) von unverändertem Ausgangsmaterial abgetrennt wird. Das Rohprodukt wird im Hochvakuum getrocknet und mit 4 CIT. Pyridin-Essig-
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peratur stehen. Dann gibt man Wasser zu und extrahiert mit Chloroform-Äther (1 ; 3). Nach dem Waschen mit Wasser, Trocknen und Verdampfen der Lösungsmittel im Vakuum erhält man das 1-Dehydro-9 < x- fluor-hydrocortison-21-acetat. vomF. = 235- 2370.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe, die in 1, 2- und 4. 5-Stellung je eine Doppelbindung aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man in 1, 2-Stellung gesättigte Steroid-Verbindungen der aeroben Einwirkung von Enzymen von Calonectria decora, Alternaria passi- florae. Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus unterwirft.
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Process for the preparation of dehydro compounds of the steroid series
The present invention relates to a special process for the production of dehydro compounds of the steroid series which have a double bond in the 1, 2 and 4, 5 positions.
The process described in patent specification No. 201246 for the production of oxidation products of the steroid series relates to the biochemical degradation of the side chain of pregnane compounds to androstane compounds and, if necessary, splitting of the ring D, with 1, 2 and
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5-position progesterone. as well as As-38-oxy-20-oxo-pregnen, 11-deoxycorticosterone or 3, 20-dioxo-allopregnan in one process stage in Al, 4-3, 17-dioxo-androstadiene or 1, 2-dehydro-testolactone. convict.
It has now been found that in steroid compounds, in particular of the pregnane series, the 1, 2 and / or or the 4, 5 double bond can be introduced biochemically without side chain degradation or ring splitting if one in 1, 2 and / or or Steroid compounds saturated in the 4,5-position are subjected to the aerobic action of enzymes from Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus, or Ophiobolus Miyabeanus.
The steroid compounds used as starting materials are z. B. descendants of Spirostans, Allospirostans, Furostans, Allofurostans, Cholans, Allocholans, Pregnans, Allopregnans, Androstans and Testans and preferably have a free or functionally modified oxy or oxo group in the 3-position. They can be saturated or contain double bonds, e.g. B. in the l- or 4-position, also in the 5-, 6-, 7-, 8-, 9: 11-, 14- or 16-position, or have additional substituents, such as free or modified oxy, oxo or carboxyl groups, also epoxy groups or halogen atoms, for example
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or 17ss position. The abovementioned starting materials have any steric configuration and can also be present as racemates.
They also include those of the so-called Nor and / or Homo series, in particular 19-Nor and D-Homo compounds. Particularly important starting materials are compounds of the Pregnan series, which are free or functionally modified in the 3- and 20-position oxy or
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B. Pregnan-3, 20-dione, Pregnan- and Allopregnan-3,11,20-trione-17α, 21-diol, Pregnan- and Allopregnan- 3, 20-dione-llss 17ct, 21-triol, Pregnan- and allopregnan-3, 18, 20-trione-llss, 21-diol, pregnan-and allo-pregnan-3,20-dione-11ss, 18,21-triol, pregnan-and allopregnan-3,0-dione-18 , 21-diol, the corresponding 21-oxo compounds and / or 9a-fluorine and chlorine derivatives, for example 9a-fluorocortisone, 9?
-Fluoro-hydrocortisone, 9α-fluoro-aldosterone and 9c <-fluoro-18-oxy-corticosterone, also in.
1, 2- and / or androstane compounds saturated in the 4, 5-position, e.g. B. A -orAS-Androsten-
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3, 17-dione, testosterone, AS-androsten-3-ol-17-one, adrenosterone, androstan-3, 17-dione, ethic acids, e.g. B. # 4 or # 5 ethenic acids, alloetic acids which have oxy or oxo groups in particular in the 3-, 11- and / or 18-position or functional derivatives of the compounds mentioned, d. H. corresponding compounds with functionally modified oxy or oxo groups. In the starting materials, the functionally modified oxy group z.
B. with an aliphatic, aromatic or heterocyclic carboxylic acid, for example acetic acid, propionic acid, benzoic acid or furancarboxylic acid or an etherified oxy group, z. B. the tetrahydropyranyloxy, benzyloxy or triphenyl methoxy group. The functionally modified oxo group is advantageously a ketalized oxo group, derived in particular from a dihydric alcohol, such as the ethylenedioxy group.
According to the method, the starting materials mentioned are brought into reaction with enzymes from Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus or Ophiobolus Miyabeanus. Cultures of these fungi in media known per se are suitable for their extraction, e.g. B. those with sugars such as glucose or lactose, with peptones, corn steep liquor, soy products and the like. Like., As well as with mineral salts, or synthetic nutrient solutions. One works in particular under aerobic conditions, for example in shaking culture or with submerged growth with stirring and a supply of air. The fungi mentioned differ from other microorganisms, e.g. B. the bacteria, through good growth under relatively simple cultivation conditions.
The reaction according to the method takes place in the described fungal culture or with the aid of the optionally enriched or separated enzymes contained therein, in the simplest case in a suspension of the separated fungal mycelium, the homogenized fungal mycelium or in filtrates or water-containing extracts thereof.
The process products can be isolated by known methods. Their separation can, for. B. by extracting the reaction mixture with an organic solvent, e.g. B.
Methylene chloride or ethyl acetate. Chromatography is particularly suitable for the further purification of the extract obtained in this way, e.g. B. on alumina or silica gel, application of distribution methods, e.g. B. the countercurrent process, or the separation using Girard reagents, such as trimethylammonium or pyridinium acetic acid hydrazide. Subsequent to cleaning or instead of it, it is finally recrystallized, preferably from organic or aqueous-organic cleaning agents.
By introducing the 1,2 and / or 4,5 double bond one arrives at valuable remedies of the steroid series, in particular the pregnan series, which are more saturated compared to the i)) 1,2 positions,
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the corresponding 21-oxo and 21-deoxy compounds, also corresponding functional derivatives such as esters, ethers, halogen derivatives, e.g. B. 9a-halogen, especially the fluorine or chlorine compounds. If the products of the process do not have the configuration and the substituents of therapeutically useful steroids, they can be used as intermediates for their preparation, e.g. B. serve the above compounds.
The reaction products obtainable according to the process can be converted in a manner known per se into their functional derivatives, such as oxygen, sulfur or nitrogen derivatives, for example esters, ethers, enol esters, enol ethers, ketals, thioethers and thioketals, and also hydrazones, oximes and enamines.
In these compounds, the oxy and / or oxo groups can be completely or partially functionally modified.
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fluoroacetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, diethyl acetic acid, caproic acid, enanthic acid, caprylic acid, palmitic acid, crotonic acid, undecanoic acid, undecylenic acid, oxalic acid, succinic acid, pimelic acid, maleic acid, lactic acid, carbamic acid, alkoxycarboxylic acid, phenoxy-benzyl acetic acid, phenoxy-benzyl-benzoic acid, benzyl-benzoic acid, Cyclohexyl acetic acid.
Phenylpropion
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acids, trimethylgallic acid, phthalic acid, furan-2-carboxylic acid, isonicotinic acid, methanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, sulfuric acids, hydrohalic acids or phosphoric acids.
If desired, functionally modified oxy or oxo groups in the compounds obtained can be converted into free groups. In this way, the functionally modified groups can also be partially set free, particularly in polysubstituted derivatives. This is done e.g. B. aurch chemical or enzymatic hydrolysis, for example using acidic or basic agents, by transesterification or transacetalization. From the in this way or directly obtained, only partially modified, such as esterified or etherified derivatives, by subsequent functional modification, e.g. B. esterification or etherification, polysubstituted derivatives, especially mixed esters or ethers or ester-ethers, produce.
The products of the process can be used as medicinal products or as intermediate products for their manufacture.
The invention is described in more detail in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
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teln. After 2 days, the mycelium is separated off and washed well with water and ethyl acetate. After exhaustive extraction of the combined filtrates with a total of 4 l of ethyl acetate, the extracts are washed with water, dried and evaporated in vacuo. The crude extract obtained in this way (1.1 g) is chromatographed on a column of 30 g of silica gel by the continuous flow method, eluting with chloroform and with chloroform-acetone mixtures of increasing acetone content. The individual fractions (100 cm each) are examined by paper chromatography.
The fractions eluted with chloroform contain only impurities, while the chloroform-acetone (9: 1) fractions contain a new substance that migrates a little less than cortexon in the paper chromatogram (propylene glycol-toluene system). The fractions with a higher acetone content contain only a small amount of highly polar material. The fractions containing the new substance mentioned are combined and evaporated in vacuo. By recrystallizing the residue from acetone-petroleum ether mixtures, the pure 1-dehydrocortexone with a melting point of 185-1920 is obtained in an almost quantitative yield. This compound reduces alkaline silver diamine solution quickly and strongly. The analysis agrees with the gross formula C.H 0, (Ber. C 76, 79 H 8, 59%, Gef.
C 76.67 H 8, 84%). The UV spectrum of the free compound shows a strong band with the maximum at 244 ml (E = 14200), that of the dinitrophenylhydrazone one at 388 mu (E = 39000). The corresponding bands of the cortexon are 240 mg (E = 16200) resp. 378 mg (E = 39,000).
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the 1-dehydro-cortexone in high yield.
Example 3: As described in Example 1, a culture of Calonectria decora is grown in a 4 l shaking vessel and a solution of 1 g of cortisone in 25 cm! Is added under sterile conditions. Methanol too. The vessel is then shaken at 27. After 4 days, the mycelium is separated off and the culture filtrate is extracted exhaustively with a total of 3 liters of ethyl acetate. The combined extracts are washed with water, dried and evaporated in vacuo. The crude residue obtained in this way is chromatographed as described in Example 1 on 30 g of silica gel by the continuous flow method. The components eluted with chloroform-acetone (6: 4) mixtures consist mainly of a substance that is somewhat more polar than the starting material.
These fractions are combined and evaporated in vacuo.
The 1-dehydro-cortisone is crystallized from acetone-ether mixtures. F. = 231-2340. The substance reduces alkaline silver diamine solution quickly and strongly and shows a strong absorption in the UV spectrum at 240 mg (e = 15800). Acetylation with pyridine acetic anhydride gives the corresponding 21-acetate with a temperature of 224-2300C. In a similar way, z. B. produce enanthate or undecylenate.
Example 4: A solution of 1 g of hydrocortisone in 25 cms of methanol is added under sterile conditions to 4 l of a well-developed culture of Calonectria decora. After shaking for 4 days at 270, extraction and chromatography are carried out as described in Example 1. The parts eluted with chloroform-acetone (1: 1) mixtures contain a substance that is somewhat more polar than hydrocortisone. The-
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These fractions are combined and evaporated. The 1-dehydro-hydrocortisone is recrystallized from methanol or acetone-ether mixtures. F. = 238-241. It reduces alkaline silver diamine solution quickly and strongly and shows strong absorption in the UV spectrum at 244 mu (e = 5100).
Example 5: 150 cm3 wort is sterilized in an Erlenmeyer flask with a capacity of 500 ems and inoculated with Calonectria decora. The mixture is shaken for 2 days at 27 and a solution of 30 mg aldosterone in 1.5 cm * acetone is added to the now well-developed culture under sterile conditions. Then shake again at 270 and after 38 hours the mycelium is filtered off. The culture filtrate is exhaustively extracted with ethyl acetate, and the extracts are washed with water, dried and evaporated. As described in Example 1, the residue is chromatographed on 1 g of silica gel, the individual fractions (20 cms each) being examined by paper chromatography.
The components eluted with chloroform-acetone (l: l) mixtures contain a substance that is somewhat more polar than aldosterone and alkaline silver diamine solution. It is crystallized from acetone-ether mixtures and represents 1-dehydro-aldosterone. In the UV spectrum, it shows strong absorption at 244 mull.
Example 6: In 14 Erlsnmeyer bottles of 200 cm * capacity, 50 cl * 70% oigne
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3, 17-don. The shaking is continued for 2 days at 270 and then the cultures are extracted with ethyl acetate. The paper chromatographic examination of the individual extracts shows that all the starting substances have been converted into the corresponding l-Deyhdro compounds, which have a slightly higher polarity than the starting substances and differ from them in their spectra.
EXAMPLE 7 If, instead of the cultures of Calonectria decora described there, cultures of Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus or Ophiobolus Miyabeanus, are used for the dehydration of the substances mentioned in Example 6, the paper chromatographic analysis of the extracts shows the same reaction products as are described in Example 6.
Example 8: A solution of 1 g of 3,11, 20-triketo-17a, 21-dioxy-allopregnan in 25 cm 3 of methanol is added under sterile conditions to a well-developed culture of Calonectria decora. The mixture is shaken at 270 for 3 days and then the mycelium is separated off. The extraction of the culture filtrate and the chromatography of the crude extract is. in the same way as described in Example 1 carried out.
The fractions eluted with chloroform-acetone (1-1) mixtures contain the 1-dehydrocortisone, which is obtained crystallized from acetone-ether mixtures, F. = 230-233. It has the properties described in Example 3.
Instead of the solution of 3, 11, 20-triketo-17α, 21-dioxy-alloprognane, will a solution of 3, 11,20-triketo-17a, 21-dioxy-pregnane in 25 cru? Methanol is added to an analogous culture of Calonectria decora and worked up in the manner described, so that 1-dehydrocortisone is likewise obtained in good yield.
Example 9: A solution of 1 g of 3, 29-diketo-llss, 17a, 21-trioxy-allopregnan in 25 cm3 of methanol is added to 4 l of a culture of Calonectria decora under sterile conditions and the mixture is shaken at 27 for 4 days. The mycelium is then separated off and the culture filtrate is extracted and the extract is separated by chromatography as described in Example 1. The 1-dehydrocortisone is obtained in good yield crystallized from the fractions eluted with chloroform-acetone (1: 1) mixtures, m.p. = 239-242. It has the properties described in Example 4.
Example 10: A solution of 1 g of androstane-3,17-dione in 25 cm * acetone is added to 4 l of a culture of Calonectria decora under sterile conditions. After 36 hours of shaking at 27, the mycelium is separated off and the culture filtrate is exhaustively shaken with methylene chloride. The extract
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wash, dry and evaporate in vacuo. The residue (1.2 g) is chromatographed on 30 g of aluminum oxide by the continuous flow method, eluting with petroleum ether-benzene mixtures, with benzene, with benzene-ether mixtures and with ether. The portions detached with petroleum ether-benzene and with benzene contain the well-known # 1,4-androstadiene, 3,17-dione, which crystallizes from an acetone-petroleum ether mixture in rhombic plates.
F. = 140-146; <x] D = + 1100 (CHC).
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2 cnss acetic anhydride are added to pyridine and the mixture is left to stand at room temperature. After 16 hours, the solution is evaporated in vacuo at 300 and the residue is taken up in a chloroform-ether (1: 4) mixture. The solution is washed three times with 0.1 In hydrochloric acid, with 2% strength sodium bicarbonate solution and with water, dried and evaporated in vacuo. By recrystallizing the residue obtained from an acetone-petroleum ether mixture, the pure 1-De-
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Turfiltrates and the chromatography of the crude extract on silica gel is carried out as described in Example 1.
The chloroform and chloroform-acetone (95: 5) fractions contain impurities and some starting material, while the chloroform-acetone (90:10) fractions mainly consist of a substance that is slightly slower than the starting material in the paper chromatogram.
This substance is # 1,4-3,11,20-triketo-21-oxy-pregnadiene, which is crystallized from acetone-ether. The crystals decompose between 200 and 2200, depending on the heating speed. The substance absorbs in the UV at 240 mg and shows in the IR the bands characteristic of the A-3-keto group at 5, 99, 6, 14p and 6, 22je. Acetylation with pyridine acetic anhydride gives the corresponding 21-acetate with a melting point of 188-1910. In a similar way, z. B. produce the enanthate or undecylenate.
Example 13: A solution of 1 g of corticosterone in 25 cm3 of acetone is added under sterile conditions to 4 l of a culture of Calonectria decora which is grown as described in Example 1.
It is left to shake for 4 days at 27 and then the mycelium is filtered off. The extraction of the culture filtrate and the chromatography of the crude extract on silica gel are carried out as described in Example 1. The auto parts eluted with chloroform and chloroform-acetone (95: 5) contain impurities and raw material. With chloroform-acetone (90:10) and (80:20), a substance is mainly eluted which, in the paper chromatogram, migrates somewhat more slowly than the starting material. It is 1-dehydro-corticosterone, which is recrystallized from acetone. F. = 216-2200 (dec), [cdD = + 1580
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= Example 14: To 4 l of a culture of Calonectria decora, which is grown as described in Example 1, a solution of 1 g of 17α-OXy-cortexon (Reichstein's substance S) in 25 cm3 of methanol is added under sterile conditions. The mixture is shaken at 270 for 3 days and the mycelium is then filtered off.
The extraction of the culture filtrate and the chromatography of the crude extract on silica gel are carried out as described in Example 1. The chloroform and chloroform-acetone (9 /, 5: 2, 5) fractions contain impurities, while some starting material is eluted with chloroform-acetone (95: 5).
The chloroform-acetone (90:10) fractions consist of a mixture which, besides little starting material and more highly polar products, mainly contains 1-dehydro-17α-oxycortexon. This is obtained pure by crystallization from acetone; M.p. = 227-2330 (dec.); [α] D = +76 (ethanol); UV absorption spectrum: #max 244 m (# = 16200). In the IR there are bands u. a. at 2.76p, '2, 85p, 5.84, 6.00, 6.15, 6.23, 9.01, 9.20, 9.55 and 10.04.
The 21-acetate prepared by means of pyridine acetic anhydride melts at 216-2220, [c <] p = + 86 (dioxane); UV absorption spectrum 3max 244 m (# = 15400).
Example 15. To 4 l of a culture of Calonectria decora, which is grown as described in Example 1, a solution of 1 g of progesterone in 25 cms of acetone is added under sterile conditions.
It is left to shake for 24 hours at 27 and then the mycelium is filtered off. The extraction of the culture filtrate is carried out as described in Example 1. The crude extract is chromatographed on a column of 30 g of alkali-free aluminum oxide, the individual fractions (100 cm3 each) being examined by paper chromatography. The petroleum ether-benzene fractions contain starting material, while benzene mainly elutes 1-dehydro-progesterone. This is crystallized from ether-petroleum ether, F. = 151-1520; [α] 23 D = + 12 (ethanol); UV absorption spectrum # max 245 mp (# = 16150).
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Cortisone in 8 cms of methanol.
The mixture is shaken further at 270, after 3 days the mycelium is filtered off and the culture filtrate is extracted as described in Example 1 with ethyl acetate. The paper chromatographic
Examination of the crude extract shows that in addition to slightly more polar components, only 1-dehydrocortisone, but no starting material, is present. The 1-dehydrocortisone is obtained in pure form by means of crystallization from acetone-ether and from methanol.
Example 17: 2 g sodium nitrate, 1 g prim. Potassium orthophosphate, 0.5 g magnesium sulfate heptahydrate, 0.5 g potassium chloride, 50 g glucose and 1 g Difco yeast extract are dissolved in 1 liter of tap water, brought to pH 5 by adding sodium hydroxide solution and sterilized. The nutrient solution obtained is inoculated with 50 cms of a 4-day-old shaking culture of Didymella lycopersici and shaken
48 hours at 270 with the culture developing well. Then, under sterile conditions, a
Solution of 250 mg cortexon in 10 cm acetone added. It is shaken for a further 2 days at 270, then the mycelium is suctioned off, washed with water and ethyl acetate and the combined filtrates are extracted with ethyl acetate.
The ethyl acetate solutions are washed with water, dried and evaporated in vacuo, the crystalline residue obtained being in the system on paper chromatographic analysis
Bush Bs [ligroin: benzene: methanol: water (6, 67: 3, 33: 8, 0: 2, 0)] to be almost pure 1-dehydrocortexone.
For purification, it is run through a layer of silica gel in chloroform solution. The chloroform
The filtrate contains little oil. The other filtrates obtained with chloroform with the addition of 1 to 30/0 tertiary butanol are combined and evaporated. The residue gives, recrystallized from an acetone-isopropyl ether mixture, 220 mg of 1-dehydrocortexone with a melting point of 189-1950 (decomp.).
EXAMPLE 18 A solution of 250 mg of cortisone in 10 cm * methanol is added under sterile conditions to 1 l of a well-developed culture of Didymella lycopersici as shown in Example 17 and the mixture is shaken at 270 for 72 hours, after which the culture Liquid is worked up as indicated in Example 17. Based on the paper chromatographic investigation in the propylene glycol toluene system, the residue of the ethyl acetate extracts contains almost all of the steroid material
1-dehydrocortisone. The residue in chloroform solution is filtered through silica gel. The chloroform
Filtrates give little oil.
With chloroform-acetone (6: 4) a crystalline residue is obtained which, recrystallized from an acetone-ether mixture, gives 225 mg of pure 1-dehydrocortisone with a melting point of 231-2340.
EXAMPLE 19: A solution of 250 mg hydrocortisone in 10 cm * is added under sterile conditions to a well-developed culture of Didymella lycopersici prepared as in Example 17.
Methanol. After shaking for 10 days at 27, the culture is output as in Example 17 and processed. The residue of the ethyl acetate solutions turns out to be almost pure 1-dehydro-hydrocortisone in the paper chromatogram (propylene-; glycol-toluene system). To remove accompanying substances, it is taken up in chloroform and the solution is filtered through silica gel. The Chlufuform eluates, which contain a small amount of an oil, are discarded. The chloroform-acetone (t: l) eluates are combined and evaporated.
The residue is recrystallized from methanol or an acetone-ether mixture,
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dioxy-allopregnan in 2 cm * methanol. The mixture is shaken at 27 for 10 days and the culture is worked up as indicated in Example 17. The residue of the ethyl acetate extracts contains, based on the paper chromatographic analysis in the system, propylene glycol-toluene in addition to unchanged starting material dehydrocortisone, which is obtained in pure form by chromatography on silica gel and subsequent crystallization from an acetone-ether mixture. example 21:
Progesterone, # 1-allopregnen-3,20-dione, pregnan-3,20-dione, corticosterone, 11-dehydro-corticosterone, 17α-oxycortexone, testosterone, # 1- or # 4 are obtained in an analogous manner from progesterone -An- drosten- 3, 17; "dion the corresponding ta4 service.
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+ 1350 (chloroform), UV absorption spectrum #max 240 m (# = 14800).
Example 23: To 4 liters of a well-developed culture of Didymella lycopersici as obtained in Example 17, a solution of 1 g of 17 ct-ethynyl-testosterone in 25 cm is added under sterile conditions! Acetone. The mixture is left to shake for 8 days at 270 and then the culture is worked up as described in Example 17. The paper chromatographic analysis of the extraction residue shows that it consists practically only of 1-dehydro-17 tx-ethinyl-testosterone. The pure substance is obtained by crystallization from an acetone-ether mixture. F. = 228-2330, [α] D = -17 (chloroform).
Example 24: A solution of 180 mg of 6-dehydrocortexon-21-acetate in 10 cm of acetone is added under sterile conditions to 2 l of a well-developed culture of Didymella lycopersici as obtained in Example 17 and then left for 3 days 270 shake. The culture is then worked up as described in Example 17. According to paper chromatographic analysis, the extraction residue (190 mg) consists almost exclusively of free 1,6-bis-dehydro-cortexon, which is made up of acetone-ether-gel
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t, 4-3-Ketonelycopersici is given under sterile conditions a solution of 1 g of 11-dehydro-progesterone in 20 cm2 of acetone. The mixture is shaken at 27 for 8 days and then worked up as described in Example 17.
In the extraction residue, only the 1, 11 bis-de-
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u, Example 26: To 2 l of a well-developed culture of Didymella lycopersici as obtained in Example 17, a solution of 500 mg of 17cx-methyl-tlZstosterone in 15 cms of acetone is added under sterile conditions. It is left to shake for 3 days at 270 and then work the culture according to the instructions
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A little heptahydrate, 0.5 g of potassium chloride, 50 g of glucose and 1 g of Difco yeast extract are dissolved in 11 tap water, brought to pH 5 by adding sodium hydroxide solution and sterilized.
The nutrient solution obtained is inoculated with 50 cm 2 of a 4-day-old shaking culture of Didymella lycopersici and shaking it for 48 hours at 270 ° C., the culture developing well. To 120 cm? A solution of 30 mg of 9α-fluorohydrocortisone in 2 cm of methanol is added to this culture of Didymella lycopersici under sterile conditions. The mixture is shaken at 270 ° for 5 days, the mycelium is then suction filtered, washed with water and ethyl acetate and the combined filtrates are extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate solutions are washed with water, dried and evaporated in vacuo.
According to the paper chromatographic analysis, the extraction residue contains 1-dehydro-9α-fluorohydrocortisone, which is separated from the unchanged starting material by means of a preparative paper chromatogram (propylene glycol-toluene system). From acetone it forms crystals of F. = 263-2660 (decomp.), [Α] D23 = +108 (ethanol) UV absorption spectrum #max 240 m (# = 15800). It is dried in a high vacuum and acetylated with 4 cm 3 of pyridine-acetic anhydride (1: 1) mixture in the usual way at room temperature.
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(Dec. Al D = +1080 spectrum, max 240 n (e = 16250).
Example 28: 2 g sodium nitrate, 1 g prim. Potassium ortho-phosphate, 0.5 g magnesium sulfate heptahydrate, 0.5 g potassium chloride, 50 g glucose and 1 g Difco yeast extract are dissolved in 11 tap water, brought to pH 5 by adding sodium hydroxide solution and sterilized. The resulting nutrient solution is inoculated with 50 cnss of a 4-day-old shaking culture of Didymella lycopersici and shaken for 48 hours at 270, the culture developing well. A solution of 30 mg of 9,11-oxido-17α-oxy-cortexon-21-acetate in 2 ems of methanol is added under sterile conditions to 120 cm3 of this culture of Didymella lycopersici. The mixture is shaken at 270 for 5 days, then the mycelium is suctioned off, washed with water and ethyl acetate and the combined filtrates are extracted with ethyl acetate.
The ethyl acetate solutions washes away
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one with water, dries them and evaporates them in the vacuum. Based on the paper chromatographic analysis, the extraction residue contains 1-dehydr-9,11ss-oxido-17α-oxycortexon, which is separated from the unchanged starting material by means of a preparative paper chromatogram (propylene glycol-toluene system). The crude product is dried in a high vacuum and with 4 CIT. Pyridine vinegar
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stand temperature. Then water is added and the mixture is extracted with chloroform-ether (1; 3). After washing with water, drying and evaporation of the solvent in vacuo, 1-dehydro-9-x-fluoro-hydrocortisone-21-acetate is obtained. vomF. = 235-2370.
PATENT CLAIMS:
1. A process for the preparation of dehydro compounds of the steroid series which each have a double bond in the 1, 2- and 4, 5-positions, characterized in that steroid compounds saturated in the 1, 2-position of the aerobic action of enzymes of Calonectria decora , Alternaria passiflorae. Ophiobolus heterostrophus or Ophiobolus Miyabeanus subjects.
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