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Verfahren zur Gewinnung von Tyrothricin und Vitamin B12
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Tyrothricin und Vitamin Biz durch aerobe Züchtung von B. brevis in Proteine bzw. Proteinabbauprodukte enthaltenden Nährlösungen, vorzugsweise nach dem Oberflächenverfahren, bis zur Erzielung einer erheblichen antibiotischen Wirksamkeit und Abtrennung des gebildeten Tyrothricine.
Es sind bereits mehrere Verfahren bekannt geworden, die für eine Erzeugung von Tyrothricin nach dem Oberflächenverfahren und gegebenenfall s auch nach dem Submersverfahren in Betracht kommen. Mit diesen bekannten Verfahren ist jedoch eine befriedigende Tyrothricinproduktion bei der Anwendung des Oberflächenverfahrens nicht immer sichergestellt.
Vor allem erfordern diese Verfahren Nährlösungen mit Bestandteilen, die teils teuer, teils nicht immer leicht zugänglich sind ; ausserdem gewährleisten sie nur niedrige Ausbeuten an Tyrothricin.
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fahren, eine Verbesserung der Ausbeuten und eine grössere Freizügigkeit bei der Auswahl der Nährmedien erreicht werden kann, wenn man den B. brevis in einer Nährlösung züchtet, die ein Kobaltsalz in einer Konzentration an Kobaltionen von ungefähr 0, 001-0, 05 o gelöst enthält.
Als Kobaltsalze kommen für das erfindungsgemässe Verfahren alle wasserlöslichen Salze und Komplexsalze des Kobalts in Frage, insbesondere Kobalt-n-chlorid und Kaliumkobalt-III-hexacyanid. Bevorzugt werden wasserlösliche Kobaltsalze in solchen Mengen eingesetzt, dass im Nährmedium 0, 005-0, 02loto an Kobaltionen vorliegen.
Die Kultur zur Beimpfung des Mediums kann auf bekannte Weise gewonnen werden. Hiezu sind Sporen oder vegetative Zellen in gleicher Weise geeignet, wobei beliebig feste oder flüssige Zwischenpassagen zur Heranführung des Impfgutes eingeschaltet werden können. So kann man z. B. ausgehend von einer Lyophilkultur über Schrägagar auf Agarnährboden in Roux-Flaschen eine Sporensuspension gewinnen, indem von den Nährböden die Sporen unter sterilen Bedingungen abgeschwemmt werden. Man kann auch ein Impfgut mit vegetativen Zellen verwenden, das über feste oder flüssige Zwischenpassagen zubereitet werden kann. Die Zusammensetzung der Nährböden, die hiebei verwendet werden, wird zweckmässig unter Berücksichtigung des Fermentiermediums gewählt. Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren bei der
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derLösungsmittel, z. B. Methanol, aufgenommen.
Aus der methanolischen Lösung wird das Tyrothricin zweckmässigerweise mit einem Überschuss an wässeriger Kochsalzlösung ausgefällt. Das Tyrothricin kann dann zur weiteren Reinigung wieder in Lösung gebracht und neu ausgefällt oder chromatographiert werden.
Es wurde ferner gefunden, dass sich der Zusatz von Kobaltsalzen bei der Erzeugung von Tyrothricin dann besonders günstig auswirkt, wenn im Nährmedium als Stickstoffquelle ein Presshefeautolysat verwendet wird. Ein Presshefeautolysat, welches im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens bevorzugt wird, kann erhalten werden, indem handelsübliche Presshefe mit 330/0 Leitungswasser, 2, 5% Kochsalz und 0, 7% Kaliummetabisulfat (letzteres auf die Gesamtmenge von Hefe und Wasser bezogen) versetzt wird. Es wird ohne Rühren 96 Stunden bei 450 C autolysiert. Nach der Ernte des Autolysates wird dieses in einer Schlammzentrifuge abgeschleudert.
Verwendet wird das klare Zentrifugat. Der Gehalt an Gesamtstickstoffim abgeschleuderten Presshefeautolysat beträgt etwa 15 g Stickstoff je 1. Die Nährlösungsbestandteile
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werden in einem hiefür geeigneten Kocher zusammengemischt, wobei neben den üblichen Nährsalzen und Spurenelementen auch noch ein Kobaltsalz zugesetzt wird. Nach Hinzufügen des Presshefeautolysateswid der pH-Wert mit Lauge auf etwa 7 eingestellt. Gemeinsam mit dem Presshefeautolysat kann eine Zuckerquelle, z. B. Glukose, verwendet werden. Diese wird vorteilhaft getrennt sterilisiert und vor dem Vereiri- gen mit dem Presshefeautolysat abgekühlt. Die Beimpfung erfolgt unter den üblichen sterilen Bedingungen mit einer aktiven Kultur von Bacillus brevis.
Nun wird durchgemischt und die beimpfte Kulturflussigkeit in den Tassen verteilt, worin bei einer Temperatur zwischen 30 und 40 C, vorzugsweise bei 370 C, Wachstum und Tyrothricin-Produktion erfolgt. Es empfiehlt sich, die Oberflächengärung so auszuführen, dass der für den aeroben Bacillus brevis erforderliche Sauerstoff in Form von Luft oder einem andern Sauerstoff enthaltenden Gas in steriler Form zugeführt wird, so dass genügend Sauerstoff für Wachstum und Tyrothricin-Bildung vorhanden ist. Eine für die Durchführung besonders geeignete Vorrichtung ist in der österr. Patentschrift Nr. 192055 beschrieben.
Durch den Gehalt an Kobaltsalzen wird aber nicht nur die Tyrothricin-Ausbeute wesentlich gesteigert und das Verfahren dadurch wirtschaftlicher gestaltet, sondern es erfolgt durch den Bacillus brevis auch Bildung bedeutender Mengen an Vitamin Blz. Es sind bereits mehrere Bakterienstämme bekannt geworden. die zur Erzeugung von Vitamin B12 geeignet sind. Es besteht die Möglichkeit, Vitamin B als Nebenprodukt bei verschiedenen Antibiotika-Gärungen, wie bei der Erzeugung von Streptomycin und Neomycin, zu gewinnen. Vor allem richtet sich das Interesse auch auf die Isolierung solcher Stämme, die das Vitamin B12 alsHauptprodukt in möglichst hoher Ausbeute erzeugen.
Als besonders guter Produzent erwies sich Streptomyces olivaceus, der 1-3 mg Vitamin B,, je 1 Nährlösung liefert. Das Verfahren gemäss der Erfindung schafft nun die Möglichkeit, Bacillus brevis als Vitamin B-Produzent zu verwenden und gestattet es, sowohl eine hohe Ausbeute an Tyrothricin wie auch gleichzeitig an Vitamin B12 zu erzielen, wodurch eine wirtschaftliche wahlweise Gewinnung des Antibiotikums oder des Vitamins bzw. beider erfolgen
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reines Cyanocobalamin anfällt ; es sind nur wenig störende Begleitsubstanzen vorhanden, so dass die Extraktion sehr leicht durchführbar ist.
Die Extraktion ist gemäss der Erfindung wesentlich einfacher als etwa im Falle der Gewinnung von Vitamin B12 neben Streptomycin oder Terramycin ; dies ist in besonderem Masse dann der Fall, wenn als Nährlösung u. a. Presshefeautolysat verwendet wird.
Die Extraktion des nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzeugten Vitamin 812 kann nach einer bekannten Methode, vorzugsweise aber nach dem nachfolgend Beschriebenen vorgenommen werden.
Abwässer aus der Tyrothricinerzeugung werden mit 20% iger Schwefelsäure auf PH 2, 5 eingestellt und hierauf mit 0, 5% Bentonit (Fullererde) vermischt. Dieses Gemisch wird bei Zimmertemperatur eine Stun-
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eine pH-Kontrolle. Die Fullererde, die das Vitamin Bj. adsorbiert enthält, wird filtriert und mit Wasser gewaschen, bis Säurefreiheit erreicht wird.
Das Fullererde-Adsorbat wird hierauf unter Rühren mit 65%igem wässerigem Methanol versetzt und der pH-Wert mit 20%iger Natronlauge auf 8, 5 eingestellt. Die Elution erfolgt in Gegenwert von Cyan-
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wässerigem Methanol und Cyanionen bei einem pH-Wert von 8,5 viermal wiederholt. Die o vereinigten Eluate werden im Vakuum bei 400 C eingeengt. Hierauf wird mit obiger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt, wobei eine Reihe von Verunreinigungen, z. B. Eiweiss, abzentrifugiert werden. Die völlig klare, rotbraun gefärbte Lösung wird auf einen pH-Wert von 9 eingestellt, wobei wieder durch Zusatz eines Cyanionen liefernden Stoffes eine entsprechende Cyanionen-Konzentration aufrecht erhalten wird.
Zu dieser klaren Lösung wird nun Ammoniumsulfat zugegeben, bis die Lösung ein spez. Gewicht von 1, 2
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inalkoholphase wird dann ein gleiches Volumen Benzol gegeben und es wird mehrmals mit destilliertem Wasser ausgeschüttelt.
Die so erhaltene wässerige B. -Lösung wird auf einen PH-Wert von 3 eingestellt, worauf ein Teil der Verunreinigungen mit Äther ausgeschüttelt wird. Dann wird die wässerige Lösung in Gegenwart von CyanIonen auf PH 8 gebracht. Im Vakuum wird dann der in der wässerigen Lösung enthaltene Äther entfernt (400 C) und das Vitamin B12 in Aktivkohle (1%) adsorbiert. Die Eluierung von der Kohle erfolgt mit 65%igem wässerigem Äthanol oder Methanol, wobei die Temperatur auf 600 C gehalten wird.
Hierauf wird im Vakuum (400 C) auf etwa 501o des Anfangsvolumens eingedampft, und das Vitamin B12 mit einer Mischung von Tetrachlorkohlenstoff und Phenol (5 : 1) extrahiert. Aus der abgetrennten Tetrachlorkohlenstoffphenolphase wird das B12 durch Behandlung mit der gleichen Menge Aceton-Wasser (6:1) in diese Acetonphase überführt. Durch Zugabe von weiterem Aceton (in der 6-10fachen Menge des Aceton-Was-
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ser-Gemisches) wird das kristallisierte Vitamin B12 ausgefällt, abgesaugt und mit wasserfreiem Aceton gewaschen. Hierauf wird getrocknet. Die Lagerung erfolgt in einem trockenen und lichtgeschützten Raum, womöglich bei weitgehender Abwesenheit von Luft.
Wenn besonders hohe Anforderungen an die Reinheit gestellt werden, erfolgt die Umkristallisation so, dass das Vitamin B12 in wenig Wasser aufgelöst wird, wobei dann die Ausfällung der Vitamin 812 -Kristalle durch Zugabe von Aceton erfolgt. An Stelle des Benzylalkohols kann mit gutem Erfolg auch Furfurylalkohol verwendet werden, wobei folgende Vorteile erzielt werden : Es werden geringere Mengen eines Alkohols, verglichen mit Benzylalkohol, benötigt, um den gleichen Effekt zu erzielen. Ferner siedet der Furfurylalkohol um 400 C niedriger als der Benzylalkohol, wodurch Vorteile bei der Regenerierung des Lösungsmittels erzielt werden. Die Ausbeute an Vita-
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sert, weil der Benzylalkohol grössere Mengen an Wasser löst, wodurch bei der Extraktion immer gewisse Verluste an Vitamin B12 entstehen.
Ferner kann man das Lösungsgemisch Aceton-Wasser in der letzten Stufe bei der Extraktion des Vitamin B12 aus der Tetrachlorkohlenstoff-Phenolphase durch Tetrahydrofuran-Wasser ersetzen. Es wird hiebei bevorzugt ein Gemisch von Tetrahydrofuran und Wasser im Verhältnis 4 : 1 angewendet.
Nachfolgend werden Beispiele von Nährlösungen angegeben, die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens mit Vorteil angewendet werden können ; ihre Anwendung gewährleistet hohe Ausbeuten an Tyrothricin und Vitamin Bu und ermöglicht eine einfache Extraktion des Vitamins.
Nährlösung l : In Roux-Flaschen bzw. in einer für Oberflächengärungen konstruierten, mit flachen Tassen ausgerüsteten Anlage gemäss der österr. Patentschrift Nr. 192055 werden Oberflächenfermen- tationen mit folgender Nährlösung ausgeführt :
0,15 % Na2 HPO4. 12 Hz 0 0, 3 % NaCl 0, 25 0 Na2 S2 O3 . 5H2 O 0, 005% K (Co (CN) 6)
0,01%CaC12
0,02%MgSO4. 7H2O
0,003% MnSO4 . 4 H2 O 3, 0 % Glukose 0, 1750/0 Stickstoff (als Presshefeautolysat) PH-Wert'7 7, 0
Die Sterilisation erfolgt durch 20-Minuten langes Erhitzen bei 1200 C, wobei die Glukose getrennt sterilisiert wird.
Nach Abkühlen und Zusatz der Glukoselösung wird die Nährlösung aseptisch mit 0, 50/0 einer von Dicfo-Agar abgespülten Sporensuspension des Bacillus brevis beimpft und 7 Tage bei 370 C bebrütet, wobei sorgfältig darauf geachtet wird, dass die auf der Oberfläche sich ausbildende Haut nicht zer-
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erhalten, während bei Anwendung von Gärtassen 3, 20 g je l Tyrothricin und 0, 86 mg je l Vitamin B12 isoliert werden können.
Die Nährlösung kann auch zur submersen Gewinnung von Tyrothricin und bzw. oder Vitamin B12 unter Verwendung von Bacillus brevis verwendet werden.
Nährlösung 2 :
0,15%Na2HPO4. 12H2O
0,5%NaC1
0,005%CoC12. 6H2O
0, 002% FeSO4. 7 Hz 0
0,025MgSO4. 7H2O
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4HPH-Wert 7, 5
Die Sterilisation erfolgt während 20 Minuten bei 1200 C, wobei die Glukose getrennt sterilisiert wird.
Nach Zusatz der Glukoselösung wird das Nährmedium unter sterilen Bedingungen mit 0, 5% einer 24 Stunden alten Submerskultur von Bacillus brevis beimpft, die auf demselben Nährmedium herangeführt worden war. Die Inkubation erfolgt bei 370 C auf einer Schüttelmaschine mit etwa 200 Umdr/min und etwa 3 cm Exzentrizität. Nach 2,3 und 4 Tagen werden aseptisch Proben entnommen und auf Tyrothricin sowie Vitamin B12 -Gehalt getestet. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten :
Tyrothricin und Vitamin B12 -Bildung im Schüttelkolben :
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<tb>
<tb> Tag: <SEP> Tyrothricin <SEP> Vitamin <SEP> B12
<tb> g <SEP> je <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> je <SEP> 1
<tb> 2. <SEP> 0,91 <SEP> 0,21
<tb> 3. <SEP> 1,18 <SEP> 0,43
<tb> 4. <SEP> 1,23 <SEP> 0,67
<tb>
.
Es ist möglich, andere Nährlösungsbestandteile zu verwenden ; so kann z. B. Kalziumkarbonat zur Stabilisierung des pli-Wertes zugesetzt werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Tyrothricin und Vitamin B12 durch aerobe Züchtung von B. brevis in Proteine bzw. Proteinabbauprodukte enthaltenden Nährlösungen, vorzugsweise nach dem Oberflächenverfahren, bis zur Erzielung einer erheblichen antibiotischen Wirksamkeit und Abtrennung des gebildeten Tyrothricins, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung von B, brevis in einer Nährlösung erfolgt, die ein Kobaltsalz in einer Konzentration an Kobaltionen von ungefähr 0,001 bis 0, 0.%0, so wie zweckmässig ein Presshefeautolysat gelöst enthalt, und dass nach beendigter Fermentation Tyrothricin und bzw. oder Vitamin B12 in an sich bekannter Weise aus dem Kulturfiltrat gewonnen werden.
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Process for obtaining tyrothricin and vitamin B12
The invention relates to a method for obtaining tyrothricin and vitamin Biz by aerobic cultivation of B. brevis in nutrient solutions containing proteins or protein degradation products, preferably by the surface method, until a considerable antibiotic activity is achieved and the tyrothricin formed is separated off.
Several processes have already become known which can be used for producing tyrothricin by the surface process and, if necessary, also by the submerged process. With these known processes, however, satisfactory tyrothricin production is not always ensured when the surface process is used.
Above all, these methods require nutrient solutions with components that are sometimes expensive and sometimes not always easily accessible; in addition, they ensure only low yields of tyrothricin.
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drive, an improvement in yields and greater freedom in the choice of nutrient media can be achieved if the B. brevis is grown in a nutrient solution that contains a cobalt salt dissolved in a concentration of cobalt ions of approximately 0.001-0.05 o .
All water-soluble salts and complex salts of cobalt are suitable as cobalt salts for the process according to the invention, in particular cobalt-n-chloride and potassium cobalt-III-hexacyanide. Water-soluble cobalt salts are preferably used in amounts such that 0.005-0.02 lots of cobalt ions are present in the nutrient medium.
The culture for inoculating the medium can be obtained in a known manner. Spores or vegetative cells are equally suitable for this, it being possible for any solid or liquid intermediate passages to be switched in for the introduction of the inoculated material. So you can z. B. win a spore suspension starting from a lyophil culture over slant agar on agar medium in Roux bottles by washing the spores from the culture medium under sterile conditions. You can also use an inoculation material with vegetative cells, which can be prepared via solid or liquid intermediate passages. The composition of the nutrient media that are used here is expediently selected taking into account the fermentation medium. The according to the inventive method in the
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the solvent, e.g. B. methanol, added.
The tyrothricin is expediently precipitated from the methanolic solution with an excess of aqueous sodium chloride solution. The tyrothricin can then be brought back into solution for further purification and re-precipitated or chromatographed.
It has also been found that the addition of cobalt salts has a particularly favorable effect in the production of tyrothricin if a compressed yeast autolysate is used as the nitrogen source in the nutrient medium. A pressed yeast autolysate, which is preferred in the context of the process according to the invention, can be obtained by adding 330/0 tap water, 2.5% table salt and 0.7% potassium metabisulphate (the latter based on the total amount of yeast and water) to commercially available pressed yeast. It is autolyzed at 450 ° C. for 96 hours without stirring. After the autolysate has been harvested, it is centrifuged in a sludge centrifuge.
The clear centrifugate is used. The total nitrogen content in the centrifuged pressed yeast autolysate is about 15 g nitrogen per 1. The nutrient solution components
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are mixed together in a suitable cooker, with a cobalt salt being added in addition to the usual nutrient salts and trace elements. After adding the pressed yeast autolysate, the pH is adjusted to about 7 with lye. Together with the compressed yeast autolysate, a source of sugar, e.g. B. glucose can be used. This is advantageously sterilized separately and cooled with the compressed yeast autolysate before freezing. Inoculation takes place under the usual sterile conditions with an active culture of Bacillus brevis.
It is now mixed and the inoculated culture liquid is distributed in the cups, in which growth and tyrothricin production takes place at a temperature between 30 and 40 ° C., preferably at 370 ° C. It is advisable to carry out the surface fermentation in such a way that the oxygen required for the aerobic Bacillus brevis is supplied in the form of air or another oxygen-containing gas in sterile form, so that sufficient oxygen is available for growth and tyrothricin formation. A device that is particularly suitable for performing this is described in Austrian patent specification no.
The cobalt salt content not only significantly increases the tyrothricin yield and thus makes the process more economical, but the Bacillus brevis also produces significant amounts of vitamin Blz. Several bacterial strains have already become known. which are suitable for the production of vitamin B12. There is the possibility of obtaining vitamin B as a by-product in various antibiotic fermentations, such as the production of streptomycin and neomycin. Above all, the interest is also directed towards the isolation of those strains that produce vitamin B12 as the main product in the highest possible yield.
Streptomyces olivaceus proved to be a particularly good producer, supplying 1-3 mg of vitamin B ,, per 1 nutrient solution. The method according to the invention now creates the possibility of using Bacillus brevis as a vitamin B producer and makes it possible to achieve both a high yield of tyrothricin and also of vitamin B12 at the same time, which means that the antibiotic or the vitamin or both take place
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pure cyanocobalamin is obtained; there are only a few interfering accompanying substances so that the extraction can be carried out very easily.
According to the invention, the extraction is much simpler than, for example, in the case of obtaining vitamin B12 in addition to streptomycin or terramycin; this is particularly the case when u as nutrient solution. a. Pressed yeast autolysate is used.
The extraction of the vitamin 812 produced by the process according to the invention can be carried out by a known method, but preferably by what is described below.
Wastewater from tyrothricin production is adjusted to pH 2.5 with 20% sulfuric acid and then mixed with 0.5% bentonite (fuller's earth). This mixture is kept for one hour at room temperature
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a pH control. The fuller's earth, which contains the vitamin Bj. Adsorbed, is filtered and washed with water until it is free from acid.
65% aqueous methanol is then added to the fuller's earth adsorbate while stirring and the pH is adjusted to 8.5 with 20% sodium hydroxide solution. The elution takes place in the equivalent of cyan
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aqueous methanol and cyanions repeated four times at pH 8.5. The combined eluates are concentrated at 400 ° C. in vacuo. The above sulfuric acid is then used to adjust the pH to 3, whereby a number of impurities, e.g. B. protein, are centrifuged. The completely clear, red-brown colored solution is adjusted to a pH value of 9, whereby a corresponding cyanion concentration is maintained again by adding a substance which provides cyanions.
Ammonium sulfate is now added to this clear solution until the solution has a spec. Weight of 1, 2
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An equal volume of benzene is then added to the alcohol phase and it is extracted several times with distilled water.
The aqueous B. solution obtained in this way is adjusted to a pH value of 3, whereupon some of the impurities are shaken out with ether. The aqueous solution is then brought to pH 8 in the presence of cyano ions. The ether contained in the aqueous solution is then removed in a vacuum (400 C) and the vitamin B12 is adsorbed in activated charcoal (1%). The carbon is eluted with 65% aqueous ethanol or methanol, the temperature being kept at 600.degree.
It is then evaporated in vacuo (400 C) to about 5010 of the initial volume, and the vitamin B12 is extracted with a mixture of carbon tetrachloride and phenol (5: 1). The B12 is converted from the separated carbon tetrachloride phenol phase into this acetone phase by treatment with the same amount of acetone-water (6: 1). By adding more acetone (6-10 times the amount of the acetone water
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ser mixture) the crystallized vitamin B12 is precipitated, filtered off with suction and washed with anhydrous acetone. It is then dried. The storage takes place in a dry and light-protected room, possibly in the absence of air.
If particularly high demands are placed on the purity, the recrystallization takes place in such a way that the vitamin B12 is dissolved in a little water, the vitamin 812 crystals then being precipitated by adding acetone. Instead of benzyl alcohol, furfuryl alcohol can also be used with good success, the following advantages being achieved: Smaller amounts of an alcohol, compared to benzyl alcohol, are required in order to achieve the same effect. In addition, the boiling point of furfuryl alcohol is 400 ° C. lower than that of benzyl alcohol, which has advantages in terms of solvent regeneration. The yield of vital
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sert, because the benzyl alcohol dissolves larger amounts of water, which always results in a certain loss of vitamin B12 during extraction.
Furthermore, the acetone-water mixed solution can be replaced by tetrahydrofuran-water in the last stage of the extraction of vitamin B12 from the carbon tetrachloride-phenol phase. A mixture of tetrahydrofuran and water in a ratio of 4: 1 is preferably used.
Examples of nutrient solutions which can be used with advantage in the context of the method according to the invention are given below; their use ensures high yields of tyrothricin and vitamin Bu and enables easy extraction of the vitamin.
Nutrient solution 1: Surface fermentations with the following nutrient solution are carried out in Roux bottles or in a system designed for surface fermentation and equipped with flat cups according to Austrian patent specification No. 192055:
0.15% Na2 HPO4. 12 Hz 0.3% NaCl 0.25 Na2 S2 O3. 5H2 O 0.005% K (Co (CN) 6)
0.01% CaC12
0.02% MgSO4. 7H2O
0.003% MnSO4. 4 H2 O 3, 0% glucose 0.1750/0 nitrogen (as pressed yeast autolysate) pH value'7.7.0
The sterilization is carried out by heating for 20 minutes at 1200 C, the glucose being sterilized separately.
After cooling and adding the glucose solution, the nutrient solution is inoculated aseptically with 0.50/0 of a spore suspension of Bacillus brevis rinsed off with Dicfo agar and incubated for 7 days at 370 ° C., being careful that the skin does not form on the surface crush
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obtained, while when using fermentation cups 3.20 g per liter of tyrothricin and 0.86 mg per liter of vitamin B12 can be isolated.
The nutrient solution can also be used for submerged production of tyrothricin and / or vitamin B12 using Bacillus brevis.
Nutrient solution 2:
0.15% Na2HPO4. 12H2O
0.5% NaCl
0.005% CoC12. 6H2O
0.002% FeSO4. 7 Hz 0
0.025MgSO4. 7H2O
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4HPH value 7.5
The sterilization takes place for 20 minutes at 1200 ° C., the glucose being sterilized separately.
After the glucose solution has been added, the nutrient medium is inoculated under sterile conditions with 0.5% of a 24-hour old submerged culture of Bacillus brevis, which had been introduced on the same nutrient medium. Incubation takes place at 370 ° C. on a shaking machine with about 200 rev / min and about 3 cm eccentricity. After 2, 3 and 4 days, samples are taken aseptically and tested for tyrothricin and vitamin B12 content. The following results were obtained:
Tyrothricin and vitamin B12 formation in the shake flask:
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<tb>
<tb> Tag: <SEP> Tyrothricin <SEP> Vitamin <SEP> B12
<tb> g <SEP> each <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> each <SEP> 1
<tb> 2. <SEP> 0.91 <SEP> 0.21
<tb> 3. <SEP> 1.18 <SEP> 0.43
<tb> 4. <SEP> 1.23 <SEP> 0.67
<tb>
.
It is possible to use other nutrient solution components; so z. B. Calcium carbonate can be added to stabilize the pli value.
PATENT CLAIMS:
1. A process for the production of tyrothricin and vitamin B12 by aerobic cultivation of B. brevis in nutrient solutions containing proteins or protein degradation products, preferably by the surface process, until a considerable antibiotic activity is achieved and the tyrothricin formed is separated off, characterized in that the cultivation of B, brevis takes place in a nutrient solution that contains a cobalt salt in a concentration of cobalt ions of approximately 0.001 to 0.00% 0, as is expediently a compressed yeast autolysate, and that after fermentation has ended, tyrothricin and / or vitamin B12 in itself be obtained in a known manner from the culture filtrate.