AT214071B

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Info

Publication number: AT214071B
Application number: AT741859A
Authority: AT
Original assignee: Farbwerke Hoechst Aktiengesellschaft Vormals Meister Lucius & Bruening
Priority date: 1958-06-07
Filing date: 1959-01-20
Publication date: 1961-03-10

Description

Verfahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzmitteln
EMI1.1

derjenigen beträgt, die sich aus der Anzahl der vorhandenen Amino- und Guanidinogruppen errechnet, das entstandene Vernetzungsprodukt einem schonenden hydrolytischen Abbau bis zu einer Molekülgrösse von 10 000 bis 100000, vorzugsweise 30000 bis 60000, unterwirft, die so erhaltene Lösung auf einen PH-Wert von etwa 7 einstellt und durch Salzzusatz isotonisch macht.

Nach dem vorliegenden Verfahren erfolgt zunächst eine Vernetzung des Ausgangsmaterials zu grösse- -ren Molekülen, die anschliessend zu solchen der gewünschten Molekülgrösse abgebaut werden. Das als Ausgangssubstanz verwendete Material soll frei sein von pyrogenen und sonstigen pharmakologisch wirksamen Bestandteilen ; am geeignetsten ist eine möglichst reine Knochengelatine. Unerwünschte anorganische Bestandteile, vor allem Calciumsalze, können durch Dialyse, Elektrodialyse oder am besten durch Behandeln mit einem Ionenaustauscher entfernt werden.

Bei der Reaktion derKollagenabbauprodukte mit mehrfunktionellen Isocyanaten reagiert dielsocyan- gruppe mit den reaktionsfähigen Aminogruppen bzw. Amid- oder Guanidinogruppen der Peptidketten unter Bildung von Harnstoffgruppen. Hiedurch findet eine Vernetzung zweier oder mehrerer Polypeptidketten über Harnstoffbrücken zu einem grösseren Molekül statt. Die Blockierung von Amino- oder Guanidinogruppen in den Endprodukten durch die mit Hilfe des Isocyanats eingeführten Harnstoffbrücken bewirkt eine Verschiebung des Verhältnisses von freien Carboxyl-zu Aminogruppen zugunsten der ersteren. Dadurch steigt die Löslichkeit und sinkt die Gelierfähigkeit.

Die Vernetzungsreaktion wird zweckmässig bei neutralem bis schwach alkalischem PH vorgenommen, da in saurer Lösung die Reaktion sehr langsam oder gar nicht vor sich geht. Da bei der Umsetzung die basischen Aminogruppen in sehr schwach basische Harnstoffgruppierungen übergehen, werden vorher als innere Salze vorliegende Carboxylgruppen frei und das PH verschiebt sich nach sauren Werten. Es ist daher zweckmässig, durch laufende Zugabe von verdünntem Alkali nach Massgabe des Verbrauches des Isocyanats das PH nachzustellen und bei einem Wert zwischen 7 und 8 zu halten. Die Zugabe des Isocyanats erfolgt, zweckmässig unter starkem Rühren der Lösung, entweder direkt oder gelöst in einem organischen, mit Wasser mischbaren, aber gegen Isocyanate indifferenten Lösungsmittel, z. B. Tetrahydrofuran oder Aceton.

Die Temperatur der Lösung kann weitgehend-zwischen 0 und 1000-variiert werden, am zweckmässigsten arbeitet man bei 30 . Die Zugabe des Isocyanats wird am besten fraktioniert vorgenommen, wobei der Verlauf der Reaktion an der pH-Änderung bzw. an dem obengenannten Verbrauch von Alkali verfolgt werden kann. Als Isocyanate kommen z. B. in Frage : aliphatischePolyiso- cyanate, besonders solche vom Typ OCN- (CH2) x'NCO, wobei x in der Grösse von 2 bis 20 liegen kann, oder auch aromatische und hydroaromatische Polyisocyanate.

Die zur Vernetzung günstigste Isocyanatmenge hängt von der Molekülgrösse und auch von der Qualität des Ausgangsmaterials ab ; sie kann zwischen 10 und 100% der durch die NH2-Analyse zu berechnenden Menge liegen. Da bei der Vernetzung die Viskosität steigt und die Lösung nach einiger Zeit geliert, ist eine fraktionierte Zugabe des Isocyanats über eine längere Zeit und eine Nachstellung des PH-Wertes nach der Gelierung nicht mehr zweckmässig. Durch mehrstündiges Stehenlassen der Vernetzungslösung nach der Gelierung erreicht man aber die vollständige Umsetzung des Isocyanats mit dem zu vernetzenden Ausgangsmaterial.

Der Abbau der Vernetzungsprodukte kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden, z. B. durch saure, alkalische oder fermentative Hydrolyse. Bei Vernetzungsprodukten aus Gelatine lässt sich eine besonders schonende Hydrolyse dadurch erreichen, dass man eine wässerige Lösung bei etwa neutraler Reaktion so lange auf eine Temperatur zwischen 60 und 1500, vorzugsweise 1200, erhitzt, bis der gewünsche Hydrolysegrad mit einer Molekülgrösse zwischen 10000 und 60000 erreicht ist. Hiezu reicht im allgemeinen eine Erhitzungsdauer von etwa 5 bis 6 Stunden auf 1200 im geschlossenen Gefäss.

Die vorzugsweise verwendete Konzentration der Gelatine bzw. der fertigen Plasmaersatzmittel liegt bei 4-6ut, da dies etwa der Proteinkonzentration im Blut entspricht, doch lässt sich die Vernetzung und der anschliessende hydrolytische Abbau auch mit niedriger oder höher konzentrierten Lösungen durchführen.

Die durch die Vernetzung neu gebildeten Harnstoffbrücken zwischen verschiedenen Molekülen werden unter den angewandten schonenden Hydrolysebedingungen nicht gespalten ; eine Spaltung findet nur zwischen den Peptidbindungen der Proteinketten statt.

Nach der Hydrolyse muss das eventuell bei der Vernetzungsreaktion zur Lösung des Isocyanats ver- wendete organische Lösungsmittel aus dem Endprodukt entfernt werden. Dies geschieht am besten durch Destillation im Vakuum, wobei zur Verhinderung des Schäumens eine geringe Menge eines Antischaum- mittels, wie Octylalkohol, zugesetzt werden kann, das bei der Destillation mit dem Wasserdampf wieder übergeht. Die Endprodukte besitzen je nach den Arbeitsbedingungen einMolgewicht von 10 000 bis 60 000 und stellen ausgezeichnete Plasmaersatzmittel dar. Sie zeichnen sich gegenüber bekannten Mitteln durch

eine Reihe von Vorzügen aus.

Ihre Lösungen sind vollkommen klar und im Gegensatz zu andern aus Gelatine hergestellten Ersatzmitteln auch farblos ; der Erstarrungspunkt liegt unterhalb von 100. Das Molekulargewicht der Verfahrensprodukte liegt bei 15 000-60 000, es kann durch Variation der Herstellungsbedingungen weitgehend den Bedürfnissen der Praxis angepasst werden. Am besten haben sich Produkte mit einem Molekulargewicht von etwa 20000 bewährt. Die Endprodukte besitzen, wie Messungen in der Ultrazentrifuge zeigen, im wesentlichen einheitliche Molekülgrösse.

Im Tierversuch zeigen die Lösungen eine ausgezeichnete Verträglichkeit und besitzen keinerlei toxische Wirkungen. Hiebei ist besonders hervorzuheben, dass mit Produkten vom Molekulargewicht von nur etwa 20 000 im Blutaustauschversuch und im Überlebensversuch volle Plasmaersatzwirkung erzielt wird. Ausscheidungsversuche ergaben, dass erst nach 24 Stunden die Hälfte der Substanz aus dem Blut verschwunden und die weitere Ausscheidung innerhalb von 2 bis 3 Tagen vollendet ist. Im Gegensatz hiezu zeigt Gelatine viel ungünstigere Ausscheidungsverhältnisse und ist schon nach wenigen Stunden im Blut nicht mehr nachweisbar.

Die Ursache für diese erwünschte verlängerte Verweilzeit der vernetzten Produkte im Blut liegt darin, dass sie durch Fermente, wie Trypsin, Pepsin und Gewebsfermente, langsamer gespalten werden als Gelatine. Auch die durch die Vernetzung erhöhte Sperrigkeit der Moleküle trägt zu einer langsameren Ausscheidung bei. Trotzdem konnte im Tierversuch eine Speicherung nicht nachgewiesen werden. Durch die lange Erhitzungszeit beim Abbau werden geringe Mengen antigen wirkender Stoffe, die eventuell im Ausgangsmaterial noch vorhanden sind, mit Sicherheit zerstört. Dementsprechend konnte in ausgedehnten Anaphylaxie-Versuchen das vollständige Fehlen antigener Eigenschaften erhärtet werden.

Beispiel 1: 2 1 einer 5% igen wässerigen Lösung von Knochengelatine werden auf den PH-Wert 7 eingestellt. Dann lässt man unter starkem Rühren 3,32 cm3 Hexamethylendiisocyanat, gelöst in 25 cm3 Tetrahydrofuran, bei 300 zufliessen. Bei der nun stattfindenden Vernetzungsreaktion steigt die Viskosität immer mehr an, bis die Lösung zu einer Gallerte erstarrt ; dies ist nach etwa 1/2 Stunde der Fall. Das Rühren wird unterbrochen, und man lässt die Lösung noch 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Anschliessend wird die Gallerte im geschlossenen Gefäss 5 1/2 Stunden auf 1200 erhitzt. Zu der nun wieder flüssigen Lösung setzt man 18 g Kochsalz hinzu und engt sie zur Entfernung des Tetrahydrofurans im Vakuum auf 2/3 des Ausgangsvolumens ein. Hiebei kann man zur Verhinderung des Schäumens Octylalkohol zusetzen, der bei der Destillation mit übergeht.

Man füllt die Lösung mit Wasser wieder auf das ursprüngliche Volumen auf, stellt gegebenenfalls den PH-Wert auf etwa 7 ein und füllt dann in Flaschen oder Ampullen ab. Diese werden durch 20 Minuten langes Erhitzen auf 1200 sterilisiert.

In der gleichen Weise kann man die Vernetzung auch durchführen, wenn man als Lösungsmittel für das Diisocyanat Aceton an Stelle von Tetrahydrofuran anwendet und sonst wie oben verfährt.

Beispiel 2 : 200 cm3 einer 5% gen Gelatinelösung vom pH-Wert 7, 15 werden bei 300 unter starkem Rühren mit 0,32 cm3 Hexamethylendiisocyanat, die in 10 cm3 Wasser suspendiert und durch Turbinieren emulgiert sind, versetzt. Die nach 20 Minuten Rührzeit entstandene Gallerte lässt man dann ohne Rühren noch einige Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird durch 5 1/2stündiges Erhitzen im geschlossenen Gefäss auf 1200 abgebaut und die nun wieder flüssige Lösung mit 0, 9% Kochsalz versetzt.

Nach Filtrieren und gegebenenfalls Einstellen des pH-Wertes auf etwa 7 füllt man in Flaschen ab und sterilisiert durch 20 Minuten langes Erhitzen auf 1200.

Claims

PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzmitteln unter Verwendung von Kollagenabbaupro- dukten, dadurch gekennzeichnet, dass man Kollagenabbauprodukte, vorzugsweise Gelatine, mit einem mehrfunktionellen Isocyanat vernetzt, wobei die angewandte Menge Isocyanat etwa 20 - 8fJ1/o derjenigen beträgt, die sich aus der Anzahl der vorhandenen Amino- und Guanidinogruppen errechnet, das entstandene Vernetzungsprodukt einem schonenden hydrolytischen Abbau bis zu einer Molekülgrösse von 10000 bis 100000, vorzugsweise 30000 bis 60000, unterwirft, die so erhaltene Lösung auf einen PHWert von etwa 7 einstellt und durch Salzzusatz isotonisch macht.