AT220292B - Verfahren zur Erzeugung von Vitaminen der B12-Gruppe durch Propionsäurebakterien - Google Patents

Description

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    Verfahren zur Erzeugung von Vitaminen der B -Gruppe durch Propionsäurebakterien   
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 wählt nun die Kulturen mit dem höchsten Vitamin   B-Bildungsvermögen   aus und wiederholt den Selek-   tiLonsprozess,   wie oben   unter'Reinzüchtung'beschrieben.   



   Neugewonnene Reinkulturen sind zunächst gärschwach. Erst im Verlauf weiterer Fuhrung in flüssigem   Medium und hoher SchichtundbeiEinhaltung   streng anaerober Bedingungen wird das Wachstums- und Gär-   vermögen erhöht, und die Vitamin B-Produktion erreicht dann eine Höhe von mindestens 15 mg je Liter Gärme 1um..    



   Folgende Arbeitsweise hat sich für die Erzielung gärkräftiger Kulturen bewährt :   Man beimpft das Nährmedium   jeweils   mit 10%   obiger Kultur durch   Überschichten.   Die Luft über dem   Medium verdrängt   man mit Kohlensäure. Das Gärgefäss wird auf 1 Atm Überdruck gebracht. Man bebrütet nun 2 Tage bei 300C. Während dieser Zeit wird die Glucose verbraucht, und das PH sinkt auf 4,5. Man 
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 das Medium geleitet wird. Man bebrütet nun weitere 2 Tage bei   28oC,   wobei das Medium wieder unter 1 Atm Druck steht.   Dürssh.   diese Arbeitsweise wird schliesslich der hochleistungsfähige Stamm 33 heraus-   gezüchtete.   



   Der in der geschilderten Weise gewonnene Propionibacterium shermanii-Stamm 33 besitzt folgende Eigenschaften : Die Zellen der Kultur liegen in Diplo-Form und in kurzen, höchstens viergliedrigen Ketten vor. Bei Verwendung des beschriebenen Mediums, Einhaltung einer Impfgabe von   zw   möglichst anaerober Gärführung. fortlaufender pH-Korrektur und Zuckerzugabe liegt die Grösse der Zellen noch unter 0, 5 u. 



  Im übrigen wurden bei der Identifizierung nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology alle für das Propionibacterium shermanii geforderten Charakteristika ermittelt. Der Stamm zeichnet sich durch besondere Gärfreudigkeit   z. B.   im Glucose-Medium aus, vergärt aber Lactose, im Gegensatz zu den Angaben   Bergey's,   nur in geringem Masse und sehr zögernd. Er ist in die American Type Culture Collection unter der ATCC-No. 13673 aufgenommen worden. 
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 nach zahlreichen Passagen in flüssigem Medium ein, wie oben geschildert. 



   Es ist vorteilhaft, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren durchzuführende Gärung in einem sterilen Medium, das einen assimilierbarenZucker, ein durch proteolytischen oder hydrolytischen Abbau von Proteinen gewonnenes   Aminosäuregemisch,   die üblichen Nährsalze, eine Kobaltquelle, Pantothensäure, Biotin und 5, 6-Dimethyl-benzimidazol enthält, unter anaeroben Verhältnissen bei 28 - 320C unter fortlaufendem oder zeitweisem weiterem Zusatz von Zucker und Einstellung des pH-Wertes auf 6-7 während etwa   10 -12   Tagen vor sich gehen. zu lassen. Als Zucker bewähren sich insbesondere Glucose, Invert-Zukker und Maltose. Für die Herstellung des Aminosäuregemisches können sowohl pflanzliche als auch tieri-   sche Eiweissstoffe verwendet werden, z. B. Weizen- oder Maiskleber.

   Kartoffel- oder Sojaproteine.   Casein, Blutalbumin, Fischeiweiss usw. Nach Beendigung der Gärung kann man die Bakterienmasse mit Vorteil alsdann durch Zantrifugieren oder Filtrieren von der Gärlösung abtrennen und die gebildeten Vitamine der    .2-Gruppe   daraus in an sich bekannter Weise isolieren. 



   Eine besonders geeignete Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass man ein wässeriges Gärmedium. das   1 - 20/0   eines vergärbaren Zuckers, z. B. Glucose, Invertzucker oder Maltose, ein vorzugsweise aus Casein durch proteolytischen Abbau mittels Trypsin und durch Säurehydrolyse gewonnenes Aminosäuregemisch in einer etwa 2, 5 g Stickstoff je Liter Gärmedium entsprechenden Konzentration, Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Phosphat-,   Sulphat- und   Chlorionen in üblicher Konzentration, ein wenig Pantothensäure und Biotin, Kobaltibnen in einer Konzentration von 1 bis 2, 5 mg je Liter Gärmedium   enthält,   PH 6, 6 aufweist und sterilisiert ist, mit   l   a   einer   3 - 5   Tage alten Vorkultur des Pro- 
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 trakt enthält, beimpft,

   während   10 - 12   Tagen bei   28 - 300C bebrlitet,   wobei man fortlaufend total   5-8 VoL.-%   Zucker und etwa nach dem ersten Drittel der Gesamtbebrütungsdauer 5, 6-Dimethylbenzi-   midazol,   vorzugsweise in Form einer etwa   70% igen alkoholischen Lösung,   bis zu einer Konzentration von etwa 20 mg pro Liter Gärmedium zusetzt, die Bakterienmasse alsdann von der Gärflüssigkeit abtrennt, in Wasser suspendiert, auf etwa PH 6 stellt, einige Minuten im Autoklaven auf   85 - 1200C   erhitzt und zentrifugiert, diesen Extraktionsvorgang wiederholt, die vereinigten Zentrifugierfiltrate neutral stellt, die darin enthaltenen Vitamine an Aktivkohle adsorbiert, daraus mittels eines wässerigen Alkohols, vorzugsweise Isopropanol,

   eluiert und in an sich bekannter Weise aus den vereinigten Eluaten in kristallisierter Form gewinnt. Zweckmässigerweise wird die Extraktion der Bakterienmasse mit kleineren Wassermengen so lange wiederholt (meist drei-bis viermal), bis der letzte Extrakt kaum noch gefärbt ist. 

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   Di3 nach dem obigen Verfahren erhältliche   Gärbrühe   kann als solche mittels an sich bekannter Massnahmen auf ein Vitamin   B-haltige   Konzentrat für Futtermittelzwecke verarbeitet werden. Man kann aber auch die in der obengeschilderten Weise gewonnene Vitamin   B-haltige   Bakterienmasse für denselben Zweck verwenden. 



   Beispiel : Man stellt 10   l   eines Mediums her, das folgende Bestandteile enthält : Ein durch Säurehydrolyse von Casein gewonnenes Aminosäuregemisch, das insgesamt 10 g Stickstoff enthält, ein durch 
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 und Sterilisierung des Mediums, beimpft man mit 11 einer Kultur des Propionibacterium   shermanii-Stam-   mes 33 (ATCC No. 13673), die 4 Tage bei   28 - 300   in einem gleichartigen Medium, das aber je Liter noch 5 g Hefeextrakt enthält, gezüchtet worden war. 



   Nach der Beimpfung bebrütet man den Gäransatz die ersten 2 Tage bei   300.   sodann bei 280 und stellt vom 2. Gärtag an den   PH- Wen   täglich auf 6, 6 ein. Nach dem Absinken des Zuckergehaltes unter 0, 5% setzt man täglich konzentrierte sterile Glucoselösung entsprechend etwa   1%   des Mediums zu und hält so die Gärung 10 Tage lang in Gang. Am 5. Gärtag versetzt man das Gärmedium mit 5, 6-Dimethyl-benzimidazol in   70% figer   alkoholischer Lösung in einer Menge von 20 mg je Liter. 



   Nach zwölftägiger Gärdauer wird die Gärbrühe, die nun gemäss dem mikrobiologischen Test eine Vitamin   Bu-Aktivität   von 18, 8   mg/l   aufweist, zentrifugiert, wodurch man 250 g Bakterienfeuchtmasse gewinnt. Man suspendiert dieselbe in 11 Wasser, versetzt die Suspension mit 0, 1 g Natriumsulfit, stellt auf PH 6,0 ein und erhitzt 15 min auf   900C.   Nach dem Erkalten zentrifugiert man und wiederholt den Extraktionsprozess noch viermal mit kleineren Mengen Wasser. Man gewinnt so einen orangerot gefärbten wässerigen Extrakt in einer Menge von 20% des Volumens des ursprünglichen Gärmediums. Nach Zusatz von 1% Aktivkohle (bezogen auf das Volumen) rührt man 1/2 Stunde.

   Durch Zentrifugieren erhält man das Kohleadsorbat, das man anschliessend achtmal jeweils 10 min mit einer Mischung von 70 Vol.-% Isopropanol, 25 Vol.-% Wasser und 5   Vol.-%   Benzol bei Siedetemperatur eluiert. Man erhält dabei ein rein rot gefärbtes Eluat in einer Menge von 8% des Volumens des ursprünglichen Mediums. Durch Destillation im Vakuum konzentriert man das Eluat auf 1/10 des Volumens, also etwa 0,   8%   des Volumens des ursprünglichen Mediums. Dieses Konzentrat enthält nun gemäss der spektrophotometrischen Messung 2, 2 mg   Vitamin B12je ml, also entsprechend 17. 6 mg   aus 11 des ursprünglichen Gärmediums. Durch weitere Verarbeitung dieses Eluatkonzentrates erhält man 15, 3 mg kristallisiertes Cobalamin je 11 des ursprünglichen Mediums. 



   PATENTANSPRÜCHE : 
1. Verfahren zur Erzeugung von Vitaminen der    B12-Gruppe   durch Vergärung eines Kohlehydrate, Aminosäuren und Nährsalze enthaltenden Gärmediums mittels Propionsäurebakterien, dadurch gekennzeichnet, dass man den Propionibacterium shermanii-Stamm 33 (ATCC No. 13673) verwendet.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man die Gärung in einem sterilen Medium, das einen assimilierbaren Zucker, ein durch proteolytischen oder hydrolytischen Abbau von Proteinen gewonnenes Aminosäuregemisch, die üblichen Nährsalze, ein Kobaltsalz, Pantothensäure, Biotin und 5, 6-Dimethyl-benzimidazol enthält, unter anaeroben Verhältnissen bei 28 - 320C unter fortlaufendem oder zeitweisem weiteren Zusatz von Zucker und Einstellung des pH-Wertes auf 6 - 7 während etwa 10 - 12 Tagen vor sich gehen lässt.