AT224621B

AT224621B - Verfahren zum vorübergehenden Schutz der Aminogruppe des Aminoalkylrestes von α-(Aminoalkyl)-α-aminoessigsäuren und ihren Derivaten

Info

Publication number: AT224621B
Application number: AT644260A
Authority: AT
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1959-08-24
Filing date: 1960-08-23
Publication date: 1962-12-10

Description

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säure, Ornithin, Hydroxylysin und vor allem Lysin.

Als Derivate der genannten oc- (Aminoalkyl) -oc-aminoessigsäuren kommen solche der Säuregruppe, der -Aminogruppe oder beider Gruppen in Betracht. So kann die Säuregruppe verestert, oder in Form eines Anhydrids, Hydrazids oder Azids vorliegen oder, wie im Fall von Peptiden, als Säureamidgruppierung vorhanden sein. Die oc-Aminogruppe kann z. B. durch eine der in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen, vor allem solcher, die durch Hydrogenolyse entfernbar sind, wie die Carbobenzoxygruppe (im folgenden mit Z abgekürzt), die p- (Phenylazo)-benzyloxy-carbonylgruppe (PZ) oder die p- (p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonylgruppe (MZ) blockiert sein. Die oc-Aminogruppe kann aber auch Teil einer Säureamidgruppe wie in einem Peptid, sein.

Viele biologisch wichtige Polypeptide enthalten Reste von K-Aminoalkyl- < x-aminoessigsäuren, vor allem von Lysin, so z. B. Lysin-Vasopressin, die Melanophoren stimulierenden Hormone, Corticotropin und Insulin.

Daher sind Methoden, welche die Synthese von Peptiden ermöglichen, die Reste von oc-Aminoalkyl-ocaminoessigsäuren, besonders Lysin, enthalten, von grosser Bedeutung.

Der Erfolg einer derartigen Synthese hängt weitgehend von der Wahl geeigneter Schutzgruppen zur Blockierung der nicht oc-ständigen Aminogruppen dieser Aminosäuren, z. B. der s-Aminogruppe des Lysins, ab.

Die bisher verwendeten, in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen lassen sich in manchen Fällen nicht ohne Veränderung des Moleküls abspalten, wodurch ihre Anwendbarkeit nachteilig eingeschränkt ist, teils stehen sie einer selektiven Abspaltung gleichzeitig vorhandener anderer Schutzgruppen, sei es einer Amino- oder Carboxylgruppe, im Wege.
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den Nachteil, dass sie sowohl reduktiv als auch hydrolytisch abspaltbar sind und daher einer selektiven Freisetzung der oc-Aminogruppe, welche mit auf die gleiche Art abspaltbaren Schutzgruppen blockiert ist, im Wege stehen. Weiter versagt von den gebräuchlichen Methoden zur Abspaltung dieser Gruppen die katalytische Hydrierung bei schwefelhaltigen Peptiden. Abspaltung mit Halogenwasserstoff in organischen Lösungsmitteln kann vielfach nicht angewendet werden, weil das dabei gebildete Benzylhalogenid benzylierend wirkt (z.

B. wird das S-Atom im Methionin benzyliert). Die Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak schliesslich wird von vielen störenden Nebenreaktionen begleitet. Ferner ist auch die selektive hydrogenolytische Freisetzung vorhandener Benzylestergruppen bei Vorhandensein solcher Carbobenzoxyreste unmöglich.

Die Tritylgruppe kann zwar durch milde, saure Hydrolyse entfernt werden, sie wird aber auch durch katalytische Hydrierung angegriffen. Deshalb ist auch hier die Verwendung von hydrogenolytisch abspaltbaren Gruppen, wie Z, PZ oder MZ, an der -Aminogruppe nicht mehr möglich, wenn die andere Aminogruppe durch Tritylierung blockiert ist.

Der Trifluoracetylrest endlich wird zwar durch Alkali unter relativ milden Bedingungen abgespalten.

Dabei werden aber auch durch Veresterung geschützte Carboxylgruppen angegriffen ; auch der Trifluoracetylrest lässt sich somit nicht allgemein verwenden.

Es wurde nun gefunden, dass der tert.-Butyloxycarbonylrest in vortrefflicher Weise allgemein und ohne die genannten Nachteile zum Schutz der Aminogruppe des Aminoalkylrestes in K-Aminoalkyl-K-amino- essigsäuren und ihren Derivaten geeignet ist. Die t-Butyloxycarbonylgruppe wird durch katalytische Hydrierung nicht argegriffen ; sie erlaubt daher die Verwendung von hydrogenolytisch abspaltbaren Resten, wie Z, PZ, MZ, Trityl u. ähnl., zum selektiven Schutz und Freisetzen der -Aminogruppen und lässt sich darüber hinaus durch äusserst milde, saure Hydrolyse entfernen, ohne dass dabei vorhandene Estergruppen

entfernt oder sonstige störende Nebenreaktionen eintreten würden.

Anderseits lässt sich eine Estergruppe durch alkalische Verseifung leicht abspalten, ohne dass die tert.-Butyloxycarbonylgruppe entfernt wird.

Die Verfahrensprodukte, oc- (tert.-Butyloxycarbonylamino)-x-aminoessigsäuren und ihre Derivate, sind neu. Sie stellen wertvolle Zwischenprodukte in der Peptidsynthese dar. Dabei kann man z. B. so vorgehen, dass man in #-(tert.-Butyloxycarbonyl-aminoalkyl)-&alpha;-aminoessigsäuren, z. B. in N-tert.- Butyloxycarbonyl-lysin, die -Aminogruppe in bekannter Weise mittels eines durch Hydrierung abspaltbaren Restes, z. B. Z. PZ, oder MZ, schützt und die freie Carboxylgruppe, gegebenenfalls nach Überführung in ein reaktionsfähiges Derivat zur Bildung einer neuen Peptidbindung heranzieht. Hydrogenolytische Abspaltung der Schutzgruppe in oc-Stellung liefert dann ein Derivat mit freier Aminogruppe, welches zur weiteren Peptidsynthese geeignet ist.

Zum Schluss der Synthese kann die t-Butyloxycarbonylgruppe durch milde, saure Hydrolyse, z. B. durch Salzsäuregas in organischen Lösungsmitteln oder durch verdünnte, wässerige Mineralsäure, abgespalten werden.

Man kann aber auch, wenn Peptide hergestellt werden sollen, in denen die Verknüpfung nicht über die oc-Aminogruppe, sondern über die andere Aminogruppe erfolgt, zunächst die oc-Aminogruppe, wie angegeben, blockieren, dann dentert.-Butyloxycarbonylrest durch milde, saure Hydrolyse selektiv entfernen und die freie Aminogruppe zur Bildung einer neuen Peptidbindung benützen. Zum Schluss wird die Schutzgruppe an der -Aminogruppe nach bekannten Methoden entfernt.

In Peptidzstern mit einer tert.-Butyloxycarbonylaminogruppe und einer hydrogenolytisch abspaltbaren Schutzgruppe an der -Aminogruppe kann man die Carboxylgruppe durch alkalische Verseifung freisetzen und sie, g gebenenfalls nach Überführung in ein reaktionsfähiges Derivat, zur Bildung einer weiteren Peptidbindung heranziehen.

Beispielsweise kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren das Dipeptid-L-lysyl-L-lysin nach folgendem Schema hergestellt werden, wobei gleichzeitig für die weitere Peptidsynthese brauchbare Derivate als Zwischenprodukte erhalten werden :
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BOC bedeutet den tert.-Butyloxycarbonylrest, T den Trityl- (Triphenylmethyl) -rest.

Der Pentapeptidrest L-Lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl, eine Teilsequenz der adrenocorticotropen Hormone, kann nach folgendem Schema erhalten werden :
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Eine weitere Teilsequenz des ACTH, das L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin, kann beispielsweise nach folgendem Schema hergestellt werden :
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Die Einführung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschieht vorteilhaft durch Acylierung eines Metallkomplexes, vorzugsweise eines Kupferkomplexes, der freien Aminosäure, oder durch Acylierung solcher Derivate, in denen die oc-Aminogruppe geschützt oder in einer Peptidbindung vorliegt. Zur Acylierung nimmt man zweckmässig reaktionsfähige Säurederivate des Kohlensäure-tert.-butylhalbesters, wie das Chlorid, Cyanid, Anhydrid oder einen aktivierten Phenylester.

Es wurde gefunden, dass die Acylierung besonders vorteilhaft mit dem Azid durchgeführt wird. Unerwarteterweise wurde festgestellt, dass die Acylierung besonders gut verläuft, wenn man den Kupferkomplex der Säure in wässeriger Lösung mit dem Azid zur Reaktion bringt. Der Kupferkomplex lässt sich daraufhin in üblicher Weise zersetzen.

In den erhaltenen tert.-Butyloxycarbonyl-Verbindungen können freie -Aminogruppen oder Carboxylgruppen in üblicher Weise abgewandelt oder funktionell abgewandelte oc-Aminogruppen oder Carboxylgruppen auf beliebiger Stufe freigesetzt werden.

So kann man die Cl-Aminogruppen acylieren, z. B. durch die oben genannten hydrogenolytisch abspaltbaren Schutzgruppen oder die Reste weiterer Aminosäuren oder Peptide substituieren. Freie Carbonsäuregruppen können ebenfalls geschützt, z. B. verestert werden, insbesondere mittels niederer Alkanole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, oder in reaktionsfähige Derivate, wie reaktive Ester, Anhydride, oder Azide übergeführt oder in Amidgruppen, z. B. solche von Aminosäuren oder Peptiden, umgewandelt werden.

Weiter lassen sich z. B. auf beliebiger Stufe die genannten Schutzgruppen der oc-Aminogruppe durch Hydrogenolyse abspalten und/oder Estergruppen unter Beibehaltung der tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrolysieren.

Die genannten Reaktionen werden in üblicher Weise bei tiefer, gewöhnlicher oder erhöhter Temperatur, in An-oder Abwesenheit von Verdünnungs- und/oder Kondensationsmitteln oder Katalysatoren, im offenen oder geschlossenen Gefäss unter Druck durchgeführt.

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens, bei denen man auf irgendeiner Stufe als Zwischenprodukte erhältliche Verbindungen als Ausgangsstoffe verwendet und die fehlenden Verfahrensschritte durchführt oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht.

Je nach der Arbeitsweise erhält man Verbindungen mit freien Amino-und/oder Carboxylgruppen in Form ihrer Salze mit Säuren und/oder Basen. Diese lassen sich in üblicher Weise ineinander überführen.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1 : NE-t-Butyloxycarbonyl-L-lysin. a) Kupferkomplex : 15 g L-Lysin-monohydrochlorid werden in 150 cm3 Wasser gelöst, 15 g basisches Kupfercarbonat zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde lang zum Sieden erhitzt. Hierauf wird

vom ungelösten Kupferkarbonat abgenutscht und mit etwas Wasser nachgewaschen. Nach Abkühlen wird die tiefblaue Kupfer-Lysin-Lösung (Volumen 180 cm3) mit 5, 4 g Magnesiumoxyd und einer Lösung von20, 8gt-Butyloxy-azidoformat in 260 cm3 Methanol versetzt und unter intensivem Rühren 18 Stunden bei 450 gehalten. Dabei scheidet sich der Kupferkomplex des N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysins als hellblauer Niederschlag ab.

Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des überschüssigen Magnesiumoxyds unter Eiskühlung mit 200 cm3 eiskalter 2-n. Essigsäurelösung versetzt und 1 Stunde bei 50 gerührt.
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b) freies N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin aus dem Kupferkomplex : Der unter a) erhaltene Kupferkomplex von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin (14 g) wird suspendiert in 300 cm3 Wasser und 50 cm3 2-n. Ammoniaklösung zugegeben, wobei teilweise Lösung eintritt. Dann wird unter intensivem Rühren ein kräftiger Schwefelwasserstrom eingeleitet (während zirka 3 Stunden). Hierauf wird das ausgefallene Kupfersulfid durch ein Kohlefilter abgenutscht, das klare Filtrat unter Eiskühlung mit 75 cm3 2-n.

Essig-
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insgesamt 11, 5 g rohes N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin vom F. 235-2550 erhalten (92% der Theorie).

Zur weiteren Reinigung kann das Rohprodukt aus Wasser umkristallisiert werden, F. 245-251 .

Das Produkt ist in den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln schwer löslich ; etwas löslich in Wasser, leicht löslich in verdünnten Alkalien. In verdünnter Salzsäure löslich unter Gasentwicklung (Zersetzung, vgl. unten).

Bei Papierchromatographie im System t-Butanol-n-Butanol-Wasser (40 : 30 : 30) Rf Wert = 0, 73 ; im System sec.-Butanol-Isopropanol-Monochloressigsäure-Wasser (70 : 10 : 3 : 40) Rf-Wert = 0, 80.

Die tert.-Butyloxycarbonylgruppe kann nach bekannten Methoden durch Halogenwasserstoff in organischen Lösungsmitteln oder vorteilhaft in verdünnter, wässeriger Säure abgespalten werden. Eine
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gangsmaterial nachweisbar.

Beispiel 2 : Na-Carbobenzyloxy-Nz-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin.

2, 46 g des in Beispiel 1 erhaltenen rohen N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysins werden unter Eiskühlung gelöst in 5, 5 cm3 2-n. Natronlauge und dann unter Rühren innerhalb von 30 Minuten gleichzeitig 6, 0 cm3 2-n. Natronlauge sowie eine Lösung von 1, 90 g Carbobenzoxychlorid in 3 cm3 Toluol eingetropft. Das Reaktionsgemisch wird weitere 2 Stunden bei 5-10'gerührt und sodann die Toluolphase abgetrennt.

Die wässerige Lösung wird mit etwas Äther nachgewaschen und unter Eiskühlung durch Zugabe von 10% Citronensäurelösung auf PH = 2 gebracht. Das ausgeschiedene Öl wird in Äther aufgenommen, die Ätherlösung mit etwas Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Eindampfen der Lösung gibt Na-Carbobenzyloxy-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin als Öl, das ohne Reinigung weiter umgesetzt werden kann.
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mit Natriumsulfatlösung getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird zur weiteren Reinigung an der 50fachen Menge Silikagel ("Davison", Mesh 200) chromatographiert.

Die mit Benzol : Chloroform-Gemischen (1 : 4) eluierten Anteile geben den analysenreinen Na-Carbobenzyloxy-N-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin-methylester als Öl. b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester : 265 mg des unter a) erhaltenen, chromatographisch gereinigten Produktes werden in 20 cm3 Methanol gelöst und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende CO2 wird durch Ätznatron gebunden). Nach Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Abnutschen des Katalysators und Eindampfen des Filtrates gibt N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester als Öl. Das Rohprodukt ist für weitere Umsetzungen genügend rein.

Es kann auch zur Charakterisierung in das kristalline Hydrochlorid übergeführt werden : Eine Probe des öligen Esters wird in wenig Methanol gelöst, die
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Wasser, 1, 00 g Magnesiumoxyd zugegeben und das Gemisch 1 Stunde bei 50 gerührt. Hierauf werden 30 cm3 Dioxan zugefügt und eine Lösung von 3, 30 g p-Phenylazo-benzyl-kohlensäurechlorid in 30 cm3 Dioxan unter intensivem Rühren im Verlauf von 30 Minuten zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur intensiv gerührt, sodann 200 cm3 Wasser zugegeben und das Dioxan

durch Einengen am Vakuum entfernt, wobei viel amorphes, orange-rotes Material ausfällt (Gemisch von p-Phenylazo-benzylalkohol und dem Magnesiumsalz des Na- (p-Phenylazo-benzyloxy-carbonyl)-N - tert.-butyloxy-carbonyl-L-lysins).

Nach Zugabe von viel Essigester und Kühlen auf 50 wird die wässerige Phase mit eiskalter, 10% Citronensäurelösung auf PH = 2 gebracht, wobei sich nach Umschütteln das gesamte gefärbte Material im Essigester löst. Die Essigesterlösung wird hierauf mit etwas Wasser und dann so viel mal mit verdünnter Ammoniumhydroxydlösung gewaschen, bis diese nur noch schwach gelb gefärbt ist. (Die organische Phase ist immer noch stark orange-rot gefärbt und gibt beim Eindampfen 1, 5 g rohen p-Phenylazobenzylalkohol.)
Die stark orange-gelb gefärbten Ammoniumhydroxydauszüge werden vereinigt, mit viel Äther überschichtet und unter Kühlen auf 5 mit 10% Citronensäurelösung auf PH = 2 gebracht.

Das dabei ausgefallene, gelbe Öl wird in Äther aufgenommen, die Ätherlösung unter Eiskühlung mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand (3, 0 g oranges Harz) wird zur weiteren Reinigung an der 50fachen Menge Silikagel chromatographiert. Die mit Chloroform eluierten Anteile
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lysenreines Material vom F. 105-106 .

Die Substanz ist löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln, schwer löslich in Wasser und Petrol- äther, löslich in verdünnten Alkalien.

Beispiel 5 : Na- (p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-N -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin-methylester.

Eine Lösung von 5, 19 g N"-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester und 9, 70 g Na- (p-Phenylazo- benzyloxycarbonyl)-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin in 120 cm3 Acetonitril wird auf-15 gekühlt und 4, 35 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach kurzer Zeit ist die Reaktionsmasse gallertig erstarrt.

Nach 30 Minuten bei -15 0 und 2 Tagen bei 20 wird mit viel Essigester versetzt, wobei das orange, gallertige Material in Lösung geht und der Dicyclohexylharnstoff ungelöst zurückbleibt. Er wird abgenutscht (4, 14 g, Smp. 224-226 ) und das Filtrat unter Kühlung mit Eis, mit 5% Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbikarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.

Der Rückstand (16, 3 g) wird mit 100 cm3 Äther durchgerieben, wobei er kristallisiert. Es werden 10, 9 g Dipeptid-derivat vom Smp. (111 0) 119-1270 erhalten. Die Kristalle enthalten noch etwas Dicyclohexylharnstoff. Zu dessen Abtrennung wird mit wenig Aceton versetzt, wobei 175 mg Harnstoff ungelöst bleiben. Nach Abnutschen wird das Filtrat mit viel Äther versetzt, wobei 9, 14 g reines Dipeptidderivat in Nadeln
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Aus den Mutterlaugen werden durch Adsorption an Silikagel ("Davison", Mesh 200, mit Zusatz von 10% Wasser) und Elution mit Benzol-Chloroform-Gemischen (1 : 4) noch 300 mg reines Dipeptidderivat erhalten.

Beispie16 : NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nz-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester.

1, 29 g des in Beispiel 5 erhaltenen Produkts werden in 80 cm3 Methanol gelöst, 3 cm3 1-n. wässerige Essigsäurelösung zugegeben und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende Kohlendioxyd wird in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäss aufgefangen). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Der Katalysator wird abgenutscht und das. Filtrat zur Trockne verdampft. Der ölige Rückstand wird verteilt zwischen 10 cm3 1-n. Essigsäure und 50 cm3 Äther, die Essigsäurelösung passiert einen weiteren Scheidetrichter mit weiteren 30 cm3 Äther.

Beide Ätherphasen werden mit wenig Essigsäurelösung nachgewaschen, die wässerigen Phasen vereinigt, zur Trockne verdampft und der ölige Rückstand zur Entfernung der Essigsäure unter Eiskühlung verteilt zwischen 20 cm3 Wasser-gesättigtem n-Butanol und 5 cm3 gesättigter Pottaschelösung.

Die Butanollösung gibt nach Trocknen und Eindampfen 805 mg farblosen Firn (93% der Theorie). Das Produkt ist nach Papierchromatographie einheitlich ; im System n-Propanol-Äthanol-Wasser (7 : 1 : 2) Rf-Wert = 0, 88, im System n-Butanol-Äthanol-Wasser (2 : 2 : 1) Rf-Wert = 0, 91.

Beispiel 7: N&alpha;-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin.

145 nig des in Beispiel 5 erhaltenen Produktes werden in 3 cm Dioxan gelöst, 1 cm3 Wasser zugegeben, die Lösung auf 50 gekühlt und mit 0, 22 cm3 1, 0-n. Natronlauge (1, 1 Äquivalente) versetzt. Die klare Lösung wird 90 Minuten bei 50 belassen, hierauf mit etwas festem Kohlendioxyd neutralisiert, viel Wasser zugegeben und das Dioxan im Vakuum vollständig entfernt. Die schwach trübe, wässerige Lösung wird durch Waschen mit etwas Äther geklärt und dann unter Eiskühlung mit verdünnter Salzsäure angesäuert.

Der orange, flockige Niederschlag wird abgenutscht, mit viel Wasser neutral gewaschen und getrocknet.

Ausbeute 108 mg orangefarbenes Harz, Smp. zirka 60-80 . Das Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein.

Beispiel 8 : NII-Trityl-NE-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysvl-Nz-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methyl- ester.

800 mg des in Beispiel 6 erhaltenen, öligen Dipeptidesters werden in 12 cm3 trockenem Methylenchlorid gelöst und 500 mg reines Triphenylchlormethan sowie 0, 28 cm3 absolutes Triäthylamin zugegeben.

Nach 22 Stunden bei 20 wird die Lösung mit Essigester verdünnt und unter Eiskühlung mit verdünnter Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen. Trocknen der Lösung mit Natriumsulfat und Eindampfen

gibt 1, 21 g Harz. Nach mehrmaligem Umfällen aus Äther-Petroläther tritt Kristallisation ein. Es werden 1, 10 g Trityl-dipeptid-derivat vom Smp. 132-135 0 erhalten. Zur Analyse wird aus Äther-Petroläther
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Das Produkt kann wie in Beispiel 10, (4) beschrieben, auf milde Weise selektiv enttrityliert werden, ohne dass die tert.-Butyloxycarbonylgruppen angegriffen werden.

Der erhaltene N-tert.-Butyloxycar-
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Systemen einheitlich und identisch mit dem in Beispiel 6 beschriebenen Produkt. beispiel 9: N&alpha;-Trityl-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N&alpha;-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin.

1, 47 g des in Beispiel 8 erhaltenen Produktes werden, wie in Beispiel 7 beschrieben, verseift. Analoge Aufarbeitung gibt 1, 18 g N&alpha;-Trityl-N&alpha;tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N&alpha;-tert.-butyloxycarbonyl-L-
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für weitere Umsetzungen genügend rein.

Beispiel 10 : N, 1-Trityl-Nz-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-nitro- L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester.

102 mg N&alpha;-Trityl-N&alpha;-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N&alpha;-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin, 82 mg NitroL-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester und 3 cm3 Dimethylformamid werden bei-15 mit 33 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und die klare Lösung 30 Minuten bei -150 und 4 Tage bei 20 belassen. Hierauf wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht (16 mg, Smp. 224 bis 226 ) und das Filtrat im Hochvakuum von Dimethylformamid befreit. Der Eindampfrückstand wird mit viel Petroläther zerrieben und das ungelöste Pulver in Essigester aufgenommen, wobei weitere 2 mg Dicyclohexylharnstoff ungelöst bleiben. Die Essigesterlösung wird unter Eiskühlung wie üblich neutral gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.

Der Rückstand (105 mg Harz) wird zur weiteren Reinigung mit Äther zerrieben und aus Acetonlösung mit Äther ausgefällt. Das erhaltene Pentapeptidderivat zeigt Smp. 125-160 . Es stellt eine geschützte Teilsequenz der adrenocorticotropen Hormone dar.

Zur weiteren Charakterisierung wird eine Probe mit konzentrierter Salzsäure hydrolysiert (90 Minuten bei 40 ) ; das dabei erhaltene L-Lysyl-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin zeigt im Papierchromatogramm im System n-Butanol-3% Ammoniaklösung (100 : 44) eine Laufstrecke von 6 cm (26 Stunden Laufzeit). Bei Hochspannungselektrophorese (45 Volt/cm ; PH = 1, 9) bei 45 Minuten Laufzeit eine Laufstrecke von 15 cm (i. Vgl. Lysin : 17 cm ; Lysyl-lysin 24 cm).
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von 0, 87 ; im System n-Butanol-3% Ammoniaklösung (100 : 44) 0, 95.

Der als Ausgangsmaterial verwendete Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester wird durch Kondensation von Trityl-nitro-L-arginin mit L-Prolin-tert.-butylester in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid, Abspaltung des Tritylrestes mit 75% iger Essigsäure, Umsetzung des so erhaltenen Dipeptidesters mit Trityl-nitro-L-Arginin und Abspaltung des Tritylrestes aus dem Tripeptidester erhalten.

Beispiel 11: N&alpha;-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-N&alpha;-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L- valyl-glycin-äthylester.

Zu einer Lösung von 5, 47 g L-Propyl-L-valyl-glycin-äthylester und 8, 85 g Na- (p-Phenylazo-benzyl- oxycarbonyl)-N-tert.-butyloxy-carbonyl-L-lysin in 150 cm3 Acetonitril werden bei-15 4, 00 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wird zuerst 30 Minuten bei-15 , dann bei 20 belassen,
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Er wird abgenutscht (3, 2 g, entsprechen 78% der Theorie), das Filtrat zur Trockne verdampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und unter Eiskühlung wie üblich neutral gewaschen. Die neutralen Anteile (14, 72g oranges Harz) werden mehrmals mit Äther zerrieben und das ätherunlösliche Material (12, 6 g rohes Tetrapeptidderivat) zur weiteren Reinigung chromatographiert. Das Material wird in BenzolChloroform-Gemisch = 1 : 4 gelöst und auf eine Säule von 600 g Silikagel ("Davison", Mesh 200, mit Zusatz von 10% Wasser) gebracht. Elution mit weiteren 3 Liter des gleichen Gemisches gibt 0, 80 g Material, aus dem noch 290 mg Dicyclohexylharnstoff erhalten wird. Hierauf wird der Hauptteil des orangefarbenen Materials durch Elution mit 4 Liter Chloroform aus der Säule gewaschen.

Die stark orange-roten Chloroform-Eluate geben beim Eindampfen insgesamt 11, 87 g Rückstand. Es wird in wenig warmem Acetonitril gelöst ; beim langsamen Abkühlen scheiden sich insgesamt 9, 72 g kristallines Tetrapeptidderivat in Nadeldrusen vom Smp. (147 ) 149-151 ab.
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[ < x] 1, 1' (c = 1, 02 in Methanol). Das Produkt stellt eine geschützte Teilsequenz der andrenocorticotropen Hormone dar.

Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Prolyl-L-valyl-glycinäthylester vom F. 127-129 C wird durch Kondensation von L-Valyl-glycin-äthylester mit Carbobenzoxy-L-prolin und hydrogenolytische Abspaltung der Carbobenzoxygruppe erhalten.

Beispiel 12 : N"- (p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-1ysyl-L-propyl-L- valyl-glycin.

Der in Beispiel 11 erhaltene Tetrapeptid-äthylester wird in genau gleicher Weise, wie in Beispiel 7 beschrieben, verseift. Analoge aufarbeitung ergibt in 97% Ausbeute N&alpha;-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)- N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycin als Pulver vom Smp. 86-115 ; das Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein. Zur Analyse wird aus Aceton-Äther kristallisiert, Smp.

(122 ) 127-132 ; [ < x] 7 =-64, 9 1, 1 (c = 0, 80 in Methanol).

Beispiel 13 : N -tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin-äthylester.

900 mg des in Beispiel 11 erhaltenen, kristallinen Tetrapeptidderivates werden in 25 cm3 Feinsprit gelöst, 1 cm3 2-n. wässerige Essigsäure zugegeben und in Gegenwart von Pallasdiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende Kohlendioxyd wird in Natronlauge absorbiert). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Die Aufarbeitung und Überführung in den freien Ester geschieht in genau gleicher Weise wie in Beispiel 6 beschrieben. Erhalten werden 601 mg (97% der Theorie) Tetrapeptidester als farbloses Harz. Das Produkt ist nach Papierchromatographie rein, Rf-Wert = 0, 84 (System n-Butanol-Äthanol-Wasser = 2 : 2 : 1).

Beispiel 14: N&alpha;-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin-äthylester.

Aus dem in Beispiel 11 erhaltenen Produkt kann die tert.-Butyloxycarbonylgruppe wie folgt selektiv entfernt werden :
4 mg Tetrapeptidderivat werden mit 0, 4 cm3 2-n. Salzsäure in Essigester versetzt und die Lösung bei Zimmertemperatur eine Stunde belassen. Hierauf wird die klare Lösung zur Trockne verdampft. Das Produkt ist ein oranges Harz. Bei Papierchromatographie in verschiedenen Systemen wird nur ein oranger Fleck erhalten, der zugleich eine positive Ninhydrinreaktion zeigt (Ne-Aminogruppe des Lysylrestes).

Rf-Wert = 0, 77 (System n-Butanol-Äthanol-Wasser = 2 : 2 : 1) ; 0, 80 = (System t-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser = 100 : 40 : 55) ; 0, 95 = (System s-Butanol-3% Ammoniak = 100 : 44).

Beispiel 15 : N' -tert.-Butyloxycarbonyl-L-ornithin.

3, 0 g L-Ornithin-monohydrochlorid in 30 cm3 Wasser werden mit 3 g basischem Kupfercarbonat während 1# Stunden am Rückfluss gekocht. Das überschüssige Kupfercarbonat wird warm abgenutscht und mit Wasser gewaschen. Die erhaltene dunkelblaue Kupferkomplexlösung des Omithins wird mit 20 cm3 Dioxan, 3, 75 g Natriumhydrogencarbonat und 4, 9 cm3 tert. Butyloxycarbonylazid versetzt und 4 Tage bei 100 gerührt. Die entstandene Fällung wird abgenutscht, gut mit Wasser, Alkohol und Äther gewaschen.

Kupferkomplex von N-BOC-Omithin = 2, 5 g = 53% der Theorie.

Zur Zersetzung werden diese 2, 5 g des Kupferkomplexes in 75 cm3 Wasser und 10 cm3 2-n. Essigsäure suspendiert und während 30 Minuten mit Schwefelwasserstoff behandelt. Das Kupfersulfid wird abgenutscht, das Filtrat im Vakuum bei 400 eingeengt und die restliche Lösung im Hochvakuum lyophilisiert. Der pulverige Rückstand wird im Hochvakuum bei Zimmertemperatur über Kaliumhydroxyd bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute an N'1-BOC-Ornithin = 1, 83 g = 44% der Theorie.

F ; 2160 (unter Zersetzung, Braunfärbung ab zirka 1900) :
Das Produkt ist gut löslich in Wasser, Methanol, etwas schwerer in Äthanol. Aus Methanol-Äther fällt es gallertig aus.
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Kupfercarbonat abgenutscht und mit wenig warmem Wasser nachgewaschen. Das tiefblaue Filtrat wird auf ein Volumen von zirka 15 cm3 eingeengt, mit 1 g Magnesiumoxyd sowie einer Lösung von 2, 15 g tert.-Butyloxy-azidoformat in 40 cm3 Methanol versetzt und 18 Stunden bei 400 gerührt. Hierauf wird das Methanol im Vakuum abdestilliert, der hellblaue Niederschlag abgenutscht und mit wenig Wasser und Äther gewaschen. Das Produkt enthält noch etwas Magncsiumoxyd. Es wird daher mit kalter, verdünnter Essigsäurelösung gut zerrieben, abgenutscht und mit Wasser neutral gewaschen.

Die Ausbeute beträgt 1, 05 g, Smp. 229-233 (Zersetzung). b) freie N&gamma;-tert.-Butyloxycarbonyl-L-&alpha;,&gamma;-diaminobuttersäure aus dem Kupferkomplex : Die Freisetzung des Derivates aus dem Kupferkomplex geschieht in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 (Sub b) beschrieben. Das Produkt wird in Form eines feinen, gallertigen Niederschlages (aus Wasser) erhalten. Smp. 217-229 (Zersetzung). Die Substanz ist löslich in verdünnten Alkalien und verdünnter Essig-
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Claims

;PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zum vorübergehenden Schutz der Aminogruppe des Aminoalkylrestes von oc- (Amino- alkyl)- < x-aminoessigsäuren und ihren Derivaten bei Peptidsynthesen, dadurch gekennzeichnet, dass man <Desc/Clms Page number 9> die genannte Aminogruppe in dem für die Synthese verwendeten Ausgangsmaterial durch den tert.-Butyloxycarbonylrcst substituiert und nach Durchführung der Synthese den tert.-Butyloxycarbonylrest durch milde, saure Hydrolyse abspaltet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den tert.-Butyloxycarbonylrest mittels eines reaktionsfähigen Säurederivates des Kohlensäure-tert.-butyl-halbesters einführt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den tert.-Butyloxycarbonylrest mittels des Azids des Kohlensäure-tert.-butyl-halbesters einführt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man den tert.-Butyloxycarbonylrest in einen Metallkomplex der α-(Aminoalkyl)-α-aminoessigsäure einführt.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kupferkomplex einer ot- (Aminoalkyl) -oc-aminoessigsäure in wässeriger Lösung mit dem Azid des Kohlensäure-tert.- butyl-halbesters umsetzt und den Kupferkomplex zersetzt.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als K- (Aminoalkyl)- oc-aminoessigsäure Lysin verwendet.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man den tert.-Butyloxycarbonylrest in K- (Aminoalkyl)- ! x-aminoessigsäuren einführt, deren oc-Aminogruppe geschützt ist oder in einer Peptidbindung vorliegt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den tert.-Butyloxycarbonylrest in α-(Aminoalkyl)-α-aminoessigsäuren einführt, deren a-Aminogruppe durch einen Carbobenzoxy-, p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl-oder p- (p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonylrest geschützt ist.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den tert.-Butyloxycarbonylrest in x- (Aminoalkyl)-K-aminoessigsäuren einführt, deren x-Aminogruppe durch einen Tritylrest geschützt ist.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die tert.-Butyloxycarbonylgruppe durch Hydrolyse mittels verdünnter wässeriger Mineralsäure entfernt.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die tert.-Butyloxycarbonylgruppe durch Hydrolyse mittels Chlorwasserstoffgases in organischen Lösungsmitteln entfernt.