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Verfahren zur Gewinnung von novobiocin-aktiven Verbindungen
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur Gewinnung von Antibiotika aus Rohlösungen.
Im besonderen betrifft sie ein neues verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Konzentrierung von Novobiocin und seinen Analogen aus Fermentationsbrühen, welche gebildetes Novobiocin oder dessen Analoge, Myzel von Mikroorganismen und geeignete Nährmedien enthalten. In einer ihrer speziellen Ausführungformen betrifft die Erfindung die Isolierung von Novobiocin, Dihydronovobiocin und andern NovobiocinAnalogen.
Novobiocin, für das die folgende Strukturformel vorgeschlagen wurde,
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Fermentationsbrühen, rohen Konzentraten, verdünnten Lösungen, Extrakten u. dgl. durch Behandlung mit einem Anionen-Austauschharz und anschliessende Elution der daran adsorbierten novobiocin-aktiven Ver- bindungen gewonnen werden können.
Das erfindungsgemässe Verfahren besitzt gegenüber den bekannten Methoden zur Gewinnung von Novobiocin-Aktivität durch Lösungsmittelextraktion oder Lösungsmittel-Trennverfahren den Vorteil, dass die
Volumina der in dem Verfahren verwendeten Lösungen vergleichsweise klein und daher Apparatur- und
Laboratoriumsbedarf auf ein Minimum reduziert sind.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens liegt darin, dass durch die Verwendung von
Anionenaustauschharzen unter optimalen Bedingungen eine praktisch vollständige Gewinnung der novo- biocin-aktiven Verbindungen erreicht werden kann, im Gegensatz zu der bloss teilweisen, durch andere Methoden wie Lösungsmittelextraktion erzielbaren.
Insbesondere besteht das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von novobiocin-aktiven Verbindungen aus ihren Lösungen in der Behandlung dieser Lösungen mit einem stark basischen, polymeren, organischen, stickstoffhältigen Anionenaustauschharz, dessen Austauschfähigkeit im wesentlichen auf der
Anwesenheit von quaternären Ammonium- oder Amingruppen beruht, wobei die Novobiocin-Aktivität an dieses Harz adsorbiert und anschliessend durch Abtrennen des Harzes aus der Lösung und Eluieren der novobiocin-aktiven Verbindungen gewonnen wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann unter Verwendung einer geeigneten Kolonne durchgeführt werden oder es können Ansätze des novobiocin-aktiven Materials in Tanks verarbeitet werden. Nach der ersteren Methode wird das Harz in eine senkrechte Kolonne gepackt und die die Novobiocin-Aktivität enthaltende Lösung wird durch das Harzbett geleitet. Der Auslauf der Kolonne wird fortlaufend untersucht, um die Zufuhr zur Kolonne zu beenden, sobald der Auslauf mehr als einen willkürlich festgesetzten, praktisch annehmbaren Minimalgehalt an Novobiocin-Aktivität aufweist. Bei Erreichen dieses Wertes wird die weitere Zufuhr unterbrochen und die adsorbierte novobiocin-aktive Verbindung aus der Austauschharzkolonne durch Durchschicken einer geeigneten Elutionslösung eluiert.
Das ausgewaschene Harz kann dann regeneriert und wieder für den Adsorptionsprozess verwendet werden oder es kann auch frisches Harz dem regenerierten Harz hinzugefügt werden.
Bei ansatzweisem Betrieb wird das gewählte Anionenaustauschharz in einem geeigneten Gefäss mit der die novobiocin-aktive Verbindung enthaltenden Lösung verrührt, wobei die Mengenverhältnisse von Harz und Lösung empirisch auf Grund früherer Versuche festgestellt werden ; sobald die Novobiocin-Aktivität der Lösung auf den gewünschten Wert herabgesetzt ist, wird die Lösung abdekantiert oder in anderer Weise von dem Harz getrennt. Hierauf wird die novobiocin-aktive Substanz aus dem Harz eluiert, was, wenn gewünscht, in einer Kolonne geschehen kann.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Adsorption der novobiocin-aktiven Verbindungen aus diese enthaltenden Rohbrühen. Diese Rohbrühen enthalten zusätzlich noch Mycel von Mikroorganismen sowie geeignete Nährstoffe und verschiedene Fermentations-Nebenprodukte.
Die Adsorption aus der Rohbrühe wird so durchgeführt, dass man das lonenaustauschharz nach der Ernte zusetzt, das Harz die novobiocin-aktive Substanz aus der Brühe adsorbieren lässt und dann abtrennt, z. B. durch Filtrieren, Abseihen oder andere Verfahren wie Verwendung von Flüssigkeitszyklonen, Rillenherden, Klassifizierern u. dgl. Die Verwendung eines Siebes mit einer solchen Maschenweite, dass das Harz zurückgehalten und das Mycel durchgelassen wird (normalerweise etwa 10 - 200 Maschen), erwies sich für diesen Zweck als besonders vorteilhaft, da keine Verstopfung der Siebe durch Mycel oder erschöpfte Brühe zu beobachten war. Zur weiteren Erleichterung dieses Trennvorganges kann ein Vibrationssieb benutzt werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignen sich zerkleinerte Harze aus der Klasse der stark basischen, polymeren, stickstoffhältigen Anionenaustauscher. Dies sind üblicherweise Harze mit an eine Styrol-Divinylbenzolgrundmasse angelagerten quaternären Ammoniumgruppen. Beispiele
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(DowChemicalund"Duolite A-102". Ausser diesen beispielsweise angeführten Harzen können auch noch andere Ionenaustauschharze von stark basischem Typ für die Adsorption von Novobiocin verwendet werden.
Wenngleich die Teilchengrösse des Harzes nicht kritisch ist, erwiesen sich Teilchengrössen von ungefähr 10 bis 200 Maschen, vorzugsweise von 35 bis 100 Maschen für die Adsorption als besonders geeignet.
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Zur Elution der Novobiocin-Aktivität aus dem Ionenaustauschharz wird eine wässerige, einen Elektrolyten enthaltende Lösung vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel für das Antibiotikum, verwendet. Wässerige saure Lösungen mit einem Gehalt an einem organischen Lösungsmittel für die novobiocin-aktive Substanz erwiesen sich für diesen Zweck als geeignet, wie beispielsweise wässerige Lösungen von Salzsäure oder Essigsäure im Gemisch mit einem geeigneten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel wie einem Alkohol oder Keton.
Die Konzentration der sauren Verbindung in der Elutionslösung beträgt vorzugsweise ungefähr 1 - 10 Gew. Vol.-%. Die organische Phase kann durch ungefähr 70 bis 980/0 an organischem Lösungsmittel neben ungefähr 30 -'2fl/o Wasser gebildet werden.
Die Elution kann kolonnen-oder ansatzweise durchgeführt werden, wobei kolonnenweises Arbeiten bevorzugt wird, weil kleinere Volumina benötigt werden und weil bei Verwendung einer Kolonne leichter periodisch Analysen des Eluats vorgenommen werden können und dasselbe in Fraktionen aufgeteilt werden kann.
Das Eluat kann weiteren Reinigungsoperationen, wie der Chromatographie, unterworfen werden, beispielsweise durch Durchleiten durch eine Aluminiumoxydkolonne, die mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen worden war, und Behandeln des gereinigten und entfärben Eluats mit einer sauren Lösung, z. B. einer Methanol-Essigsäurelösung, um die Novobiocinsäure auszukristallisieren. Die erhaltenen Kristalle können filtriert, mit einem Waschmittel wie z. B. Wasser-Methanol, gewaschen, wieder filtriert und getrocknet werden. Wenn gewünscht, können aus dieser Novobiocinsäure mittels geeigneter Neutralisationsverfahren verschiedene Novobiocinsalze hergestellt werden. Novobiocin-Analoge, wie Dihydronovobiocin enthaltende Eluate können in gleicher Weise behandelt werden, um die NovobiocinAnalogen aus dem Eluat zu isolieren.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird nachstehend an Hand von Beispielen näher erläutert, die jedoch den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
Beispiel l : 251 einer filtrierten, durch Züchtung eines Novobiocin erzeugenden Stammes von Streptomyces sphaeroides in einem geeigneten Nährmedium erhaltenen Fermentationsbrühe, die ungefähr 7 200 000 Einheiten an Novobiocin-Aktivität enthalten, werden durch eine, 500 cm "Amberlite IRA- 411"-Harz enthaltende Kolonne geschickt. Das Harz wird nach seinem Chloridzyklus verwendet. Die Kontaktzeit zwischen Lösung und Harz in der Kolonne beträgt ungefähr 10 min. Der Auslauf zeigt keine messbare Novobiocin-Aktivität. Nach dem Kontakt mit der Lösung wird das Harz zur Entfernung der Verunreinigungen mit 95'igem Methanol gewaschen.
Dann wird das Novobiocin von dem Harz unter Verwendung einer 160/0 konzentrierte Salzsäure und 85% Methanol enhaltenden Lösung eluiert. In dem Eluat finden sich 4500000 Einheiten an Novobiocin-Aktivität. Das Eluat hat ein Gesamtvolumen von weniger
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als 3 l und enthält ungefähr 82% der gesamten, in der ursprünglichen Lösung vorhandenen NovobiocinAktivität.
Beispiel 3 : Zwei 30 cm3 -Anteile von "Dowex 1-X2"-Harz (50 - 100 Maschen, Chloridzyklus) werden zu 300 cm3 unfiltrierter Novobiocin-Fermentationsbrühe mit einer Aktivität von 510000 E zugesetzt. Jeder Harzanteil wird nach 10 min Kontaktzeit aus der erschöpften Brühe mit Hilfe eines 70 Maschen-Siebes abgesiebt und kolonnenweise mit einer 16% konzentrierte Salzsäure und 84% Methanol ent- haltenden Lösung eluiert. Im Eluat findet sich eine Aktivität von 202000 E.
Beispiel 4 : Man löst'5 g Natrium-dihydronovobiocin in 500 cms Wasser, setzt 50 cm3 "Dowex 1-X2"-Harz (Chlorid-Zyklus) zu und lässt 3 h lang stehen. Das Harz wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Dann wird ein aliquoter Anteil von 17 cm3 des Harzes kolonnenweise mit einer 16 cm kon-
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der Beschickung vorhandenen Dihydronovobiocins.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von novobiocin-aktiven Verbindungen aus diese enthaltenden Mischungen, dadurch gekennzeichnet, dass die novobiocin-aktive Verbindung an ein zerkleinertes, stark basisches lonenaustauschharz vom quaternären Ammonium- oder Amino-Typ adsorbiert und die adsorbierte Verbindung von dem Harz eluiert wird.
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Process for the production of novobiocin-active compounds
The invention relates generally to methods of recovering antibiotics from raw solutions.
In particular, it relates to a new, improved process for the recovery and concentration of novobiocin and its analogs from fermentation broths which contain formed novobiocin or its analogs, mycelium of microorganisms and suitable nutrient media. In one of its specific embodiments, the invention relates to the isolation of novobiocin, dihydronovobiocin and other novobiocin analogs.
Novobiocin, for which the following structural formula has been suggested,
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Fermentation broths, raw concentrates, diluted solutions, extracts and the like. The like. Can be obtained by treatment with an anion exchange resin and subsequent elution of the novobiocin-active compounds adsorbed thereon.
The method according to the invention has the advantage over the known methods for obtaining novobiocin activity by solvent extraction or solvent separation processes that the
Volumes of the solutions used in the process are comparatively small and therefore equipment and
Laboratory requirements are reduced to a minimum.
Another advantage of the method according to the invention is that the use of
Anion exchange resins under optimal conditions a practically complete recovery of the novobiocin-active compounds can be achieved, in contrast to the only partial recovery that can be achieved by other methods such as solvent extraction.
In particular, the method according to the invention for obtaining novobiocin-active compounds from their solutions consists in treating these solutions with a strongly basic, polymeric, organic, nitrogen-containing anion exchange resin, the exchangeability of which is essentially based on the
The presence of quaternary ammonium or amine groups is based, the novobiocin activity being adsorbed on this resin and then obtained by separating the resin from the solution and eluting the novobiocin-active compounds.
The process according to the invention can be carried out using a suitable column or batches of the novobiocin-active material can be processed in tanks. In the former method, the resin is packed in a vertical column and the solution containing the novobiocin activity is passed through the resin bed. The effluent of the column is continuously examined in order to terminate the feed to the column as soon as the effluent has more than an arbitrarily set, practically acceptable minimum level of novobiocin activity. When this value is reached, the further supply is interrupted and the adsorbed novobiocin-active compound is eluted from the exchange resin column by passing through a suitable elution solution.
The washed out resin can then be regenerated and used again for the adsorption process, or fresh resin can also be added to the regenerated resin.
In the case of batch operation, the selected anion exchange resin is stirred in a suitable vessel with the solution containing the novobiocin-active compound, the proportions of resin and solution being determined empirically on the basis of previous experiments; as soon as the novobiocin activity of the solution is reduced to the desired level, the solution is decanted or otherwise separated from the resin. The novobiocin-active substance is then eluted from the resin, which can be done in a column if desired.
According to a preferred embodiment of the invention, the novobiocin-active compounds are adsorbed from raw broths containing them. These raw broths also contain mycelium from microorganisms as well as suitable nutrients and various fermentation by-products.
The adsorption from the raw broth is carried out by adding the ion exchange resin after harvesting, allowing the resin to adsorb the novobiocin-active substance from the broth and then separating it off, e.g. B. by filtering, straining or other methods such as the use of liquid cyclones, grooved hearths, classifiers and the like. The use of a sieve with a mesh size to hold back the resin and let the mycelium through (typically about 10-200 meshes) was found to be particularly advantageous for this purpose, as no mycelium clogging or exhausted broth was observed was. A vibrating sieve can be used to further facilitate this separation process.
Comminuted resins from the class of the strongly basic, polymeric, nitrogen-containing anion exchangers are suitable for carrying out the process according to the invention. These are usually resins with quaternary ammonium groups attached to a styrene-divinylbenzene base. Examples
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(Dow Chemical and "Duolite A-102". In addition to these resins listed as examples, other ion exchange resins of the strongly basic type can also be used for the adsorption of novobiocin.
Although the particle size of the resin is not critical, particle sizes of about 10 to 200 mesh, preferably 35 to 100 mesh, have been found to be particularly suitable for adsorption.
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An aqueous solution containing an electrolyte, preferably in an organic solvent for the antibiotic, is used to elute the novobiocin activity from the ion exchange resin. Aqueous acidic solutions containing an organic solvent for the novobiocin-active substance have proven to be suitable for this purpose, such as, for example, aqueous solutions of hydrochloric acid or acetic acid in a mixture with a suitable, water-miscible organic solvent such as an alcohol or ketone.
The concentration of the acidic compound in the elution solution is preferably about 1 to 10 wt.%. The organic phase can be formed by about 70 to 980/0 of organic solvent in addition to about 30 -2 2 / o water.
The elution can be carried out in columns or in batches, with working in columns being preferred because smaller volumes are required and because when using a column it is easier to carry out periodic analyzes of the eluate and to divide it into fractions.
The eluate can be subjected to further purification operations, such as chromatography, for example by passing it through an aluminum oxide column which has been washed with dilute sulfuric acid and water, and treating the purified and decolorized eluate with an acidic solution, e.g. B. a methanol-acetic acid solution to crystallize the novobiocic acid. The crystals obtained can be filtered off with a detergent such as. B. water-methanol, washed, filtered again and dried. If desired, various novobiocin salts can be prepared from this novobiocin acid by means of suitable neutralization processes. Novobiocin analogs, such as eluates containing dihydronovobiocin, can be treated in the same way to isolate the novobiocin analogs from the eluate.
The process according to the invention is explained in more detail below using examples, which, however, are not intended to restrict the scope of the invention.
Example 1: 251 of a filtered fermentation broth obtained by culturing a novobiocin producing strain of Streptomyces sphaeroides in a suitable nutrient medium and containing approximately 7,200,000 units of novobiocin activity is passed through a 500 cm "Amberlite IRA-411" resin Column sent. The resin is used after its chloride cycle. The contact time between solution and resin in the column is approximately 10 minutes. The outlet shows no measurable novobiocin activity. After contact with the solution, the resin is washed with 95% methanol to remove the impurities.
The novobiocin is then eluted from the resin using a solution containing 160/0 concentrated hydrochloric acid and 85% methanol. The eluate contains 4,500,000 units of novobiocin activity. The eluate has a total volume of less
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than 3 liters and contains approximately 82% of the total novobiocin activity in the original solution.
Example 3: Two 30 cm3 portions of "Dowex 1-X2" resin (50-100 mesh, chloride cycle) are added to 300 cm3 of unfiltered Novobiocin fermentation broth with an activity of 510,000 U. After a contact time of 10 minutes, each resin portion is sieved out of the exhausted broth with the aid of a 70 mesh sieve and eluted in columns with a solution containing 16% concentrated hydrochloric acid and 84% methanol. The eluate has an activity of 202,000 E.
Example 4: 5 g of sodium dihydronovobiocin are dissolved in 500 cms of water, 50 cm3 of "Dowex 1-X2" resin (chloride cycle) are added and the mixture is left to stand for 3 hours. The resin is filtered off and washed with water. Then an aliquot of 17 cm3 of the resin is added in columns with a 16 cm
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Dihydronovobiocins present in the feed.
PATENT CLAIMS:
1. A method for obtaining novobiocin-active compounds from mixtures containing them, characterized in that the novobiocin-active compound is adsorbed on a comminuted, strongly basic ion exchange resin of the quaternary ammonium or amino type and the adsorbed compound is eluted from the resin.