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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung einer neuen und wertvollen antibiotischen Substanz, die im Rahmen der Erfindung als Lösefaktor bezeichnet wird und die von einem Stamm der neuen Art
Staphylococcus staphylolyticus nach Schindler und Schuhardt gebildet wird. Die Erfindung betrifft die Herstellung dieser Substanz durch Fermentation sowie ferner deren Isolierung aus Kulturbrühen.
Das Verfahren gemäss der Erfindung besteht darin, dass man den Stamm NRRL B-2628 der neuen Art Staphylococcus staphylolyticus oder Mutanten oder Varianten dieses Stammes auf wässerigem Nährmedium, das assimilierbare Kohlehydrat- und Stickstoffquellen enthält, in an sich bekannter Weise züchtet, bis eine wesentliche Löseaktivität gegenüber Arten des Staphylococcus, die von Staphylococcus staphylolyticus verschieden sind, erreicht ist, und dass man gewünschtenfalls den entstehenden Lösefaktor isoliert.
Ein Stamm der neuen Art des Staphylococcus staphylolyticus, von welcher gefunden wurde, dass sie dieses Antibiotikum beim Züchten unter geregelten Bedingungen bildet, wurde im Rasen des Kelly-Stammes von Staphylococcus aureus gefunden, nachdem dieser nach Einwirkung des Staphylococcus-spezifischen Phagen Nr. 6 gezüchtet wurde. Der Mikroorganismus wurde mit der Numerierung K-6-WI der noch nicht endgültigen taxonomischen Klassifizierung bezeichnet.
Eine lebensfähige Kultur des Mikroorganismus wurde in der Kultursammlung der Fermentation Division des Northern Regional Research Laboratory, Büro für Landwirtschaftliche und Industrielle Chemie, US-Department of Agriculture in Peoria, Illinois, hinterlegt. Er hat in dieser Kultursammlung die Katalognummer NRRL B-2628 erhalten.
Der Mikroorganismus bildet einen unbeweglichen, grampositiven, nichtsporenbildenden Coccus, der 1, 0 - 1, 2 fI. misst und als einzelne, abgesonderte Zellen Zellenpaare, vierzellige Verbände oder Ketten mit nicht mehr als vier Elementen und kleinen Klumpen erscheint. Der Mikroorganismus ist ein fakultativer Anaerobe, der hohe Natriumchlorid-Konzentrationen (12%) verträgt. Glukose wird anaerob unter Bildung von Säure fermentiert. Säure, jedoch kein Gas, wird in lagern Peptonwasser, das l% der folgenden Kohlehydrate enthält, gebildet : d-Fructose, d-Mannose, d (+)-Galactose, Lactose, Glukose und Saccharose. Weder Säure noch Gas wird mit l (+)-Arabinose, Salicin, Inulin, d-Sorbit, d-Mannit, 1 (+) - Xylose, Glycerin und Maltose, gebildet.
Säure bildet sich auch in Lackmusmilch, worauf Koagulation eintritt. Der Mikroorganismus kann Ammoniumdihydrogenphosphat als einzige Stickstoffquelle nicht verwerten und bildet weder Caseinase, Lipase, Acetylmethylcarbinol, Schwefelwasserstoff, Koagulase, noch bildet er Hämotoxine für rote Blutkörperchen der Kaninchen oder Schafe. Er bildet Ammoniak und Katalase, reduziert Nitrat und ergibt einen negativen Methylrot-Test. Er wird von den 26 hauptsächlichen Staphylococcenspezifischen Phagen nicht angegriffen.
Dieser Mikroorganismus entspricht nicht der Beschreibung irgendeines der in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, 1957, angegebenen Mikroorganismen. Er ist als eine neue Spezies anzusehen. Die Ergebnisse von Vergleichen bei taxonomischen Versuchen mit Staphylococcus staphylolyticus NRRL B-2628 und Staphylococcus aureus (Kelly), aus dessen Rasen er isoliert worden ist, zeigen bemerkenswerte Unterschiede in der Maltosefermentation, Lipasebildung, Koagulasebildung, Toxinbildung, Empfindlichkeit gegen Staphylococcen-Phagen, wie dies in den Tabellen 1 und 2 angegeben ist.
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Tabelle 1
EMI2.1
<tb>
<tb> Zuckerfermentationstest <SEP> zur <SEP> Differenzierung <SEP> von <SEP> Spezies.
<tb>
Substrat <SEP> : <SEP> Staphylococcus <SEP> Staphylococcus
<tb> staphylolyticus <SEP> aureus
<tb> (NRRL <SEP> B-2628) <SEP> : <SEP> (Kelly-Stamm) <SEP> : <SEP>
<tb> l <SEP> (+)-Arabinose <SEP> (Pfanstiehl)
<tb> Laevulose <SEP> (Difco) <SEP> + <SEP> +
<tb> Salicin <SEP> (Difco)
<tb> d-Mannose <SEP> (Difco) <SEP> + <SEP> +
<tb> Inulin <SEP> (NBC)
<tb> d-Sorbit <SEP> schwach <SEP>
<tb> d-Mannit <SEP> (Pfanstiehl) <SEP> schwach <SEP>
<tb> d <SEP> (+)-Galactose <SEP> (Pfanstiehl) <SEP> + <SEP> +
<tb> d <SEP> (+)-Xylose <SEP> (Difco)
<tb> Glycerin <SEP> (Sargent) <SEP> - <SEP> schwach <SEP>
<tb> Maltose <SEP> (Difco)-+
<tb> Lactose <SEP> (Difco) <SEP> + <SEP> +
<tb> Glucose <SEP> (Difco) <SEP> + <SEP> +
<tb> Saccharose <SEP> + <SEP> +
<tb> Lackmusmilch <SEP> + <SEP> +
<tb> koaguliert <SEP> koaguliert
<tb>
+ = Säure - = neutral oder alkalisch, keine Gasbildung.
Tabelle 2
EMI2.2
<tb>
<tb> Andere <SEP> biochemische <SEP> und <SEP> physiologische <SEP> Versuche <SEP> zur <SEP> Differenzierung <SEP> der <SEP> Spezies.
<tb>
Taxonomische <SEP> Versuche <SEP> : <SEP> Staphylococcus <SEP> Staphylococcus
<tb> staphylolyticus <SEP> aureus
<tb> (NRRL <SEP> B-2628) <SEP> : <SEP> (Kelly-Stamm) <SEP> : <SEP>
<tb> Ammoniumdihydrogenphosphat
<tb> als <SEP> einzige <SEP> Stickstoffquelle <SEP> kein <SEP> Wachstum <SEP> kein <SEP> Wachstum
<tb> Katalasebildung <SEP> + <SEP> +
<tb> Gelatineverflüssigung <SEP> (Frazier's <SEP> Medium) <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Bildung <SEP> von <SEP> proteolytischem <SEP> Enzym
<tb> (Caseinase)
<tb> Stärkehydrolyse
<tb> Lipasebildung
<tb> Methylrot-Test <SEP> negativ <SEP> negativ
<tb> Acetylmethylcarbinolbildung-+
<tb> Ammoniakbildung <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Nitratreduktion <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Coagulasebildung
<tb>
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Tabelle 2 (Fortsetzung)
EMI3.1
<tb>
<tb> Taxonomische <SEP> Versuche <SEP> :
<SEP> Staphylococcus <SEP> Staphylococcus
<tb> staphylolyticus <SEP> aureus
<tb> (NRRL <SEP> B-2628) <SEP> : <SEP> (Kelly-Stamm) <SEP> : <SEP>
<tb> Toxinbildung-+ <SEP> (Beta)
<tb> Schwefelwasserstoffbildung
<tb> Indoltest <SEP> negativ <SEP> negativ
<tb> Phagentype <SEP> nicht <SEP> befallen <SEP> 80++/81++/52A++/
<tb> 7+/52LH+/
<tb> Beweglichkeit <SEP> unbeweglich <SEP> unbeweglich
<tb> fakultativer <SEP> Anaerobe
<tb> Hämolyse <SEP> des <SEP> Blutagars <SEP> (Mensch)
<tb>
+ = gebildet - = nicht gebildet.
Das neue, gemäss der Erfindung hergestellte Antibiotikum ist ein proteinartiges, bakterizides Mittel, das die Eigenschaft hat, lebensfähige Zellen, durch Hitzeeinwirkung getötete Zellen und Zellwände von
Bakterien der Gattung des erzeugenden Staphylococcus staphylolyticus, die von diesem verschieden sind, aufzulösen. Es hat einen isoelektrischen Punkt von etwa PH 11, ist wärmeempfindlich und nicht dialy- sierbar. Es wird unter Verlust der Löseaktivität durch das Enzym Trypsin hydrolysiert und es bildet bei saurer Hydrolyse Ammoniak und verschiedene natürliche a-Aminosäuren, Unter "natürlichen ex-Amino- säuren" sind ex-Aminosäuren zu verstehen, die als normale Proteinbestandteile gefunden worden sind.
Der Sedimentationskoeffizient und das IR-Absorptionsspektrum in einer gereinigten Probe des Lösefaktors wurden wie nachstehend beschrieben bestimmt. Der Lösefaktor zeigt ein Maximum der Absorption im UV-
Bereich des Spektrums bei 278 mll. Aus dem Wert des Sedimentationskoeffizienten und der Tatsache, dass die Substanz nicht dialysierbar ist, wurde das Molekulargewicht dieser Substanz mit 20 000-30 000 ge- schätzt.
59 getestete Stämme der Gattung des Staphylococcus wurden gelöst, wenn sie dem Lösefaktor aus- gesetzt wurden. Der Stoff wurde ferner auf seine Löseaktivität gegenüber Suspensionen von 29 weiteren
Bakterienspezies, die aus 19 von Staphylococcen verschiedenen Gattungen ausgewählt worden sind, ge- prüft. Keine dieser weiteren Bakterien wurden gelöst.
Im Hinblick auf die unübliche Spezifität für Sta- phylococcen und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass ausser jenem spezifischen Mikroorganismus, der das neue Mittel produziert, ohne Rücksicht auf den Phagentyp, die Antigenzusammensetzung oder die Empfindlichkeit gegen andere Antibiotika kein resistenter Staphylococcus ermittelt werden konnte, ist das neue, gemäss der Erfindung verwendete Reagens für die rasche taxonomische Klassifikation und
Identifizierung von Organismen der Gattung des Staphylococcus von Wert.
Eine Zusammenstellung der 59 Stämme des Staphylococcus, gegen welche der Lösefaktor gemäss der
Erfindung geprüft worden ist, ist in Tabelle 3 angeführt. Andere Spezies, die geprüft wurden und bei welchen gefunden wurde, dass sie gegen dieses Mittel unempfindlich sind, sind in Tabelle 4 zusammen- gestellt.
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Tabelle 3
EMI4.1
<tb>
<tb> Vom <SEP> Lösefaktor <SEP> des <SEP> Staphylococcus <SEP> staphylolyticus <SEP> NRRL <SEP> B-2628 <SEP> gelöste <SEP> Bakterien.
<tb>
Name <SEP> Quelle <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Kennmerkmale <SEP> oder <SEP> Herkunft
<tb> geprüften <SEP> gelösten
<tb> Stämme <SEP> Stämme
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Universität <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> ss-hämolytisch <SEP> ; <SEP>
<tb> von <SEP> Texas <SEP> coagulasepositiv <SEP>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Universität <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> ss-hämolytisch <SEP> ; <SEP>
<tb> von <SEP> Texas <SEP> coagulasenegativ
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Universität <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> ct-hämolytisch <SEP> ; <SEP>
<tb> von <SEP> Texas <SEP> coagulasepositiv
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Universität <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> kein <SEP> gebildetes <SEP> Toxin <SEP> ;
<SEP>
<tb> von <SEP> Texas <SEP> coagulasepositiv
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Universität <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> umfasst <SEP> einen <SEP> penicillinresistenten
<tb> von <SEP> Texas <SEP> und <SEP> einen <SEP> streptomycinresistenten
<tb> Stamm
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Universität <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> coagulasenegativ
<tb> von <SEP> Texas
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Southwestern <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> Blairbakteriophagentypen <SEP> 52 <SEP> (LH),
<tb> Medical <SEP> School <SEP> 52A/79, <SEP> 3C, <SEP> 55,523, <SEP> 7,73,
<tb> 42E, <SEP> 42D, <SEP> 44A <SEP> (LH), <SEP> 80 <SEP> und <SEP> 81
<tb> 'S. <SEP> aureus <SEP> Southwestern <SEP> 19 <SEP> 19 <SEP> Blairbakteriophagentypen <SEP> 80/81 <SEP> ; <SEP>
<tb> Medical <SEP> School <SEP> coagulasepositiv <SEP> ;
<SEP>
<tb> klinisch <SEP> isoliert
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Universität <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> Smith <SEP> und <SEP> K <SEP> Maus-virulente
<tb> von <SEP> Oklahoma <SEP> Stämme
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> EliLiIlyand <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> Antibiotika-resistent <SEP> ; <SEP>
<tb> Company <SEP> klinisch <SEP> isoliert
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Merck <SEP> & <SEP> Co., <SEP> Inc. <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> Antibiotika-resistent <SEP> ;
<SEP>
<tb> klinisch <SEP> isoliert
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> ATCC <SEP> 155 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> h <SEP> mit <SEP> dem <SEP> erforderlichen
<tb> Lösemittel <SEP> bebrütet
<tb> S. <SEP> epidermidis <SEP> Walter <SEP> Reed <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> klinische <SEP> Penicillinase-bildende
<tb> Armee- <SEP> Stämme <SEP> aus <SEP> gemischten
<tb> Krankenhaus <SEP> Gonococcus/StaphylococcusInfektionen
<tb>
* = Die Stämme aus der Universität von Texas wurden von Studenten aus Furunkeln, Nasenwegen und Halsabstrichen isoliert.
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Tabelle 4
EMI5.1
<tb>
<tb> Durch <SEP> den <SEP> Lösefaktor <SEP> von <SEP> Staphylococcus <SEP> staphylolyticus <SEP> NRRL <SEP> B-2628
<tb> nichtgelöste <SEP> Organismen.
<tb>
Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> Proteus <SEP> morgani
<tb> Bacillus <SEP> megaterium <SEP> ++ <SEP> Proteus <SEP> rettgeri
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> Proteus <SEP> vulgaris
<tb> Bordetella <SEP> pertussis <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa
<tb> Brucella <SEP> abortus <SEP> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> (Panama <SEP> Trägerstamm)
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> (gravis) <SEP> Sarcina <SEP> lutea
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheria <SEP> (mitis) <SEP> Serratia <SEP> marcescens
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> + <SEP> Staphylococcus <SEP> staphylolyticus <SEP> ++ <SEP> NRRL <SEP> B-2628
<tb> Gaffkya <SEP> tetragena <SEP> Streptococcus <SEP> fecalis
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> Streptococcus <SEP> lactis
<tb> Lactobacillus <SEP> plantarum <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> (A)
<tb> Listeria <SEP> monocytogenes <SEP> type <SEP> I <SEP> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> (Inaba-Stamm)
<tb> Micrococcus <SEP> lysodeikticus <SEP> ++ <SEP> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> (Ogawa-Stamm)
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> Salmonella <SEP> paratyphi
<tb> Pasteurella <SEP> tularensis <SEP> Salmonella <SEP> schottmuelleri
<tb>
+ = Durch Erhitzen getötete Zellen und lebensfähige Zellen sind resistent.
++ = Durch Erhitzen getötete Zellen, lebensfähige Zellen und Zellwände sind resistent.
Die Zellensuspensionen, wie sie bei der Prüfung der Empfindlichkeit verschiedener Mikroorganismen gegenüber dem Lösefaktor verwendet wurden, und Suspensionen einer Standard S. aureus-Kultur, wie sie zur Bestimmung der Aktivität der verschiedenen Lösungen des Lösefaktors verwendet wurden, wurden auf einem pankreatischen Abbauprodukt von Kasein-Soja-Fleischbrühe erhalten, wobei die Kulturen bei 37 C 18 h auf einer Schüttelmaschine, die mit einem Ausschlag von 6,35 cm arbeitet, bei 76 Ausschlägen/min bebrütet wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren dieser Kulturen bei 10900 Umdr/ min (13 000 X g) während 10 min und zweimaligem Waschen mit 0,05molarer tris-Hydroxymethylaminomethanhydrochloridpufferlösung (Tris) bei PH 7, 5, die einen 0, 145 molaren Anteil Natriumchlorid einverleibt enthielt, erhalten.
Für Vergleichsuntersuchungen bezüglich der Löseaktivität von Staphylococcus staphylolyticus-Fil- traten und daraus hergestellten Lösefaktor-Konzentraten wurde eine Standardmethode zur Erzielung rascher, quantitativer Ergebnisse entwickelt. Diese Methode beruht auf der Lichtdurchlässigkeit, gemessen mit einem photoelektrischen, mit einem 500 - 570 mJl-Filter ausgestatteten Kolorimeter (Klett-Summerson) in Zeitabständen unter Anwendung einer Standardsuspension von Versuchsindikator-Bakterienzellen.
Als Versuchsindikator-Mikroorganismus für den Standard wurde der Stamm S. aureus FDA 209P verwendet. Das Kolorimeter wurde so eingestellt, dass ein Wert entsprechend einer zuigen Durchlässigkeit (110 Klett-Einheiten) mit 0,001molarem Bariumsulfat abzulesen war. Die Zellen einer 18 h alten Schüttelkultur der Standardkultur wurden zweimal mit 0,05molarem Tris-Puffer (PH 7, 5), der Natriumchlorid enthielt, gewaschen, worauf die Zellen in diesem Puffer erneut in einer Konzentration suspendiert wurden, die eine Ablesung entsprechend einer zuigen Durchlässigkeit (300 Klett-Einheiten) ergab.
Durch Zugabe von 1, 5 ml dieser Suspension zu den Messröhrchen, die genug Tris-Puffer, gegebenenfalls Filtrat, enthielten, um ein Gesamtvolumen von 5,0 ml einzustellen, erhält man eine Suspension mit einer Trübung entsprechend 55 - 570/0 Durchlässigkeit (125 5 Klett-Einheiten).
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Die angewendete Testbebrütungstemperatur betrug 370C. Als eine Einheit der Lösefaktoraktivität wurde jene in der Menge der Probe enthaltene bezeichnet, die eine SOige Verringerung der Trübung in
10 min ergibt, verglichen mit der Kontrollsuspension von S. aureus FDA 209P-Zellen, die dem Löse- faktor nicht ausgesetzt sind, wobei die Proben bei 370C bebrütet werden.
Um die Gültigkeit des Tests im Hinblick auf die verminderte Bakterienvermehrung zu bestätigen, wurden Versuche durchgerührt, bei welchen Zählungen der lebensfähigen Mikroorganismen in den Testlösungen in Abständen vorgenommen wurden, die mit den Ablesungen der Messungen der optischen Dichte übereinstimmen. Bakterienzählungen wurden nach der Plattenausbreitungsmethode durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zahl der lebensfähigen Mikroorganismen direkt proportional zur Abnahme der optischen Dichte abnimmt.
Die Zellen einer aktiven Kultur von S. staphylococcus werden abgetrennt und mechanisch zerkleinert, um zu bestimmen, ob das Lösemittel innerhalb der Zellen vorhanden ist. Es wurde gefunden, dass die überstehende Flüssigkeit der zerkleinerten Zellen keine Löseaktivität aufweist. Daraus wurde geschlossen, dass das Lösemittel nicht innerhalb der Zellen zurückgehalten wird, sondern extracellular in aktiven Kulturen des S. staphylococcus vorkommt.
Um zu bestimmen, ob die Lösegeschwindigkeit der Staphylococcen-Indikatorzellen durch den PHWert beeinflusst wird, wurde ein Sorenson-Puffer mit abgestuften pH-Werten als Suspendiermedium in einer Reihe von Versuchsansätzen verwendet, wobei S. aureus (Kelly) als Indikatororganismus verwendet wurde. Es wurden identische Mengen des Lösemittels (1, 0 ml eines zellenfreien S. staphylolyticus NRRL B-2628-Filtrates) zu jeder einer Reihe von Röhrchen, die den Puffer und die Indikatorzellen enthalten, zugesetzt, und die Röhrchen wurden bei 370C bebrütet. Periodische Messungen der Lichtdurchlässigkeit wurden mit einem photoelektrischen Analysekolorimeter durchgeführt und die Zeit, die für eine SOige Verminderung der Trübung in jedem Röhrchen erforderlich war, wurde festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben.
Die Lösung erfolgt am raschesten bei pH-Wert 7, 5. Dieser Wert wurde auch bei Anwendung anderer Puffersysteme, wie Tris-Salz-und Veronalpuffern, bestätigt.
Tabelle 5
EMI6.1
<tb>
<tb> Wirkung <SEP> des <SEP> PH- <SEP> Wertes <SEP> auf <SEP> die <SEP> Löseaktivität.
<tb>
PH-Wert <SEP> Für <SEP> eine <SEP> SOige <SEP> Verringerung
<tb> der <SEP> Trübung <SEP> erforderliche <SEP> Zeit
<tb> (in <SEP> Minuten)
<tb> 6,10 <SEP> 65
<tb> 6, <SEP> 20 <SEP> 50
<tb> 6, <SEP> 35 <SEP> 35
<tb> 6, <SEP> 50 <SEP> 25
<tb> 6,70 <SEP> 16
<tb> 6, <SEP> 90 <SEP> 15
<tb> 7,10 <SEP> 12
<tb> 7, <SEP> 30 <SEP> 11
<tb> 7, <SEP> 50 <SEP> 7
<tb> 7, <SEP> 65 <SEP> 8
<tb> 7, <SEP> 75 <SEP> 9
<tb> 7, <SEP> 85 <SEP> 10
<tb> 7,95 <SEP> 11
<tb>
Eine Untersuchung über die Wirkung der Natriumchloridkonzentration auf die Eignung des Lösefaktors des S. staphylococcus zur Auflösung der S. aureus FDA 209P-Indikatorzellen ergab, dass die optimale Aktivität bei einer Natriumchloridkonzentration zu beobachten ist, die einer isotonischen Lösung, z. B. einer 0, 145molaren Natriumchloridlösung, entspricht.
Für diese Untersuchungen wurde die Standardtestmethode durch Ersatz des Tris-Puffers mit PH-Wert 7, 5 durch einen solchen, der verschiedene Konzentrationen von Natriumchlorid enthielt, für das Waschen und Suspendieren der Indikatorzellen modifiziert. Fünf verschiedene Natriumchloridkonzentrationen im Bereich von 0-bis 0, 145molar wurden angewendet.
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Das Ausmass des Lösens hängt auch von der Reaktionstemperatur ab. Dies wurde durch Bebrüten von zehn äquivalenten Präparaten des S. aureus FDA 209P mit identischen Mengen des Lösefaktors bei Tem- peraturen im Bereich von 34 bis 55 C bestimmt. Es wurde beobachtet, dass die Geschwindigkeit des Lö- sens zunimmt, wenn die Temperatur bis zu 50 C erhöht wird. Durch Bebrüten bei 550C während 10 min oder länger wird die Lösegeschwindigkeit verringert und nach 40 min bei 550C wird kein weiteres Lösen mehr beobachtet. Ein maximales Gesamtlösen wird innerhalb 50 min bei Bebrütungstemperaturen zwi- schen 34 und 400C erzielt.
Diese Ergebnisse zeigen eine Ähnlichkeit mit biochemischen Reaktionen, wo- bei die Reaktionsgeschwindigkeit mit ansteigender Temperatur zunimmt, bis entweder ein oder beide
Reaktionsteilnehmer durch die Wärme inaktiviert werden. Es wird angenommen, dass ein Aktivitätsverlust bei 55 C eine Zersetzung des Lösefaktors widerspiegelt, was dessen thermolabilen Charakter veran- schaulicht.
Indikatorzellen des S. aureus FDA 209P wurden in einem Autoklaven auf verschiedene Temperaturen erhitzt und dann auf ihre Empfindlichkeit gegenüber dem Lösefaktor geprüft. Die maximale, durch die
Einwirkung des Lösefaktors bei solchen Zellen erhaltene Gesamtverminderung der Trübung ist eine Funk- tion der Erhitzungstemperatur. Verminderungen der Trübung von nicht hitzebehandelten Kulturen waren jedoch nicht so gross wie jene, die bei lebensfähigen Kulturen erhalten wurden. Das Lösen, wie es die
Verminderung der Trübung widerspiegelt, war weniger vollständig, wenn Zellen angewendet wurden, die auf 65 - 750C erhitzt worden waren, als mit auf 100 - 1210C erhitzten Zellen.
Es war jedoch offensicht- lich, dass die Zellen durch den Lösefaktor gelöst wurden, selbst wenn sie durch in oben angegebener
Weise durchgeführtes Autoklavieren abgetötet worden waren. Es wird angenommen, dass die verhältnis- mässig unvollständige Verminderung der Trübung mit den durch Wärme abgetöteten Zellen im Vergleich mit jener, die bei lebensfähigen Kulturen auftritt, auf die Gegenwart von in der Zellsuspension vorlie- genden unlöslichen koagulierten Proteinen zurückzuführen ist, die aus der Wärmebehandlung der Bakte- rienindikatorkulturen herstammen.
Zellwandmaterial des S. aureus FDA 209P-Indikatorkulturproduktes wurde durch mechanische Zer- kleinerung in einem Gewebehomogenisator erhalten. Ein Mickle-Gewebehomogenisator wurde unter An- wendung von Ballotini-"perlen"Nr. 13 während 50 min bei 40C angewendet. Das Zellwandmaterial wur- de dann in der von Salton und Horne, Biochem. Biophys. Acta 7 [1951], S. 177 - 197, und von Newton,
J. Gen. Microbiol. 12 [1955], S. 226 - 236, beschriebenen Weise gewonnen.
Um signifikante Trübungs- ablesungen in dem photoelektrischen Kolorimeter mit dem Zellwandmaterial aus der mechanischen Zer- kleinerung zu erhalten, war es notwendig, eine Menge von Zellwandmaterial zu verwenden, das einer weitaus grösseren Menge von S. aureus-Indikatorzellen entspricht, als sie im Standardtest benutzt wird.
Ferner ist, wie mit den autoklavierten Zellen, die Gesamtverminderung der mit dem Zellwandmaterial erzielbaren Trübung nicht so gross wie für lebensfähige Kulturen. Trotzdem war offensichtlich, dass ein
Lösen des mechanisch zerkleinerten Zellwandmaterials vor sich ging.
Es wurden ferner Versuche durchgeführt, um die Wirkung von menschlichem Blutserum auf die Eig- nung des Lösefaktors von S. staphylolyticus zur Zerstörung von lebenden Zellen des S. aureus FDA 209P festzustellen. Diese Versuche wurden nach der oben beschriebenen Versuchsmethode durchgeführt, wobei jedoch entsprechende Kontrollröhrchen, die eine erhöhte optische Dichte auf Grund der Anwesenheit von
Serum zulassen, angewendet wurden. Es wurde gefunden, dass eine geringe Abnahme der Lösegeschwin- digkeit des S. aureus FDA 209P durch den Lösefaktor auftrat, wenn lOOo Serum als Suspensionsträger ver- wendet wurden, dass aber das Gesamtausmass der Spaltung das gleiche war, wie wenn eine Pufferlösung als Suspensionsmedium benutzt wurde.
Die höchste Verringerung der Trübung trat bei Anwendung eines Zell-Puffer-Testsystems nach 25 min auf, während für dieselbe Verringerung der Trübung unter Anwen- dung einer Zell-Serumpräparation für Versuchszwecke 65 min erforderlich waren.
Andere Versuche wurden mit wiederholten Zusätzen von S. aureus-Indikatorzellen zu den Teströhr- chen durchgeführt, die bereits zum Lösen ähnlich bemessener aliquoter Mengen der Indikatorzellen ver- wendet worden waren. Dies wurde innerhalb von fünf aufeinanderfolgenden Tests mit nur geringer Ver- minderung der Lösegeschwindigkeit wiederholt. Daraus geht hervor, dass das Lösemittel im Laufe des Lösens der Staphylococcen-Testkultur nicht zerstört wurde. Dies wurde auch dadurch bestätigt, dass eine starke Zunahme in der Lösegeschwindigkeit bei Parallelversuchen mit der gleichen Zahl von Indikatorzellen, jedoch einer grösseren Menge des Lösefaktors auftrat.
Dies schliesst die Möglichkeit aus, dass das Fehlen verringerter Lösekapazität, wie es in der ersten Reihe der Versuche nach Zugabe von aufeinanderfolgenden aliquoten Teilen von Indikatorzellen beobachtet wird, darauf zurückzuführen ist, dass ein Überschuss des Lösemittels angewendet worden ist. Es wird daher angenommen, dass die Menge des Lösemittels nach Angriff auf empfindliche Bakterienzellen weder zunimmt noch erschöpft wird.
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Die Lösegeschwindigkeit der S. aureus-Zellen ist, wie gefunden wurde, von der Konzentration des verwendeten Lösefaktors abhängig. In dem Masse, wie die Konzentration des Lösefaktors zunimmt, nimmt die Lösegeschwindigkeit einer gegebenen Menge eines Staphylococcen-Zellmaterials zu. Gegebenenfalls wird ein Punkt erreicht, in welchem das Zellmaterialsubstrat den Grenzfaktor erreicht und eine weitere
Erhöhung der Menge des Lösefaktors beeinflusst die Geschwindigkeit bzw. das Ausmass der Spaltung nicht mehr wesentlich.
Vier übliche metabole Hemmstoffe, Natriumfluorid, Natriumarsenat, Natriumazid und 2, 4-Dinitro- phenol, bewirken keine Hemmung des Lösefaktors beim Lösen lebensfähiger Staphylococcenzellen. Wenn diese zu Versuchsröhrchen üblicher Grösse in Mengen entsprechend 5 Mikromol Natriumfluorid und Na- triumarsenat zugesetzt werden, tritt vielmehr eine Zunahme der Lösegeschwindigkeit auf, während mit
Natriumazid und 2, 4-Dinitrophenol weder eine Zunahme noch eine Abnahme des Ausmasses oder der Ge- schwindigkeit des Lösens erfolgt.
Die elektrophoretische Beweglichkeit eines gereinigten Präparates wurde dazu benutzt, um die Ho- mogenität desselben und den isoelektrischen Punkt des Lösefaktors festzustellen. An Doppelstreifen von Filtrierpapier (Beckmann Part No. 300-028) wurden je 0,03 ml eines Filtrats, das, wie durch Versuch bestimmt, 260 Einheiten Lösefaktor je ml enthielt, absorbiert und in die Zelle eines Papierelektrophorese- apparates (Spinco Modell R, Serie D) eingebracht. Puffer mit einer 0, 05molaren Ionenstärke, die den pH-Bereich von 3, 6 bis 11, 4 überdeckten, wurden als Elektrolyten verwendet. Die Elektrophoresezelle wurde auf einer Temperatur von 4 C gehalten und arbeitet bei einem konstanten Strom von 10 mA während 8 h.
Die Streifen wurden herausgenommen und ein jeder Doppelstreifen wurde 5 min auf 1000C erhitzt und zur Feststellung von Protein mit Bromphenolblau, wie von Dawson et al beschrieben (Data for Biochemical Research, Oxford University Press, London [1959]), gefärbt. Um eine Beziehung zwischen dem Bioautogramm und den Orten des Proteins herzustellen, wurde der zweite Doppelstreifen in noch nassem Zustand auf ein pankreatisches Abbauprodukt einer Kasein-Soja-Agarplatte gebracht, das vorher mit S. aureus FDA 209P beimpft und 8 h bebrütet worden war. Nach 45 min dauernder Berührung mit dem Agar wurden die Streifen entfernt und die Platte wurde weitere 8 h bei 370C bebrütet, wobei zellenfreie Zonen auf der Platte erhalten wurden, die den Stellen des Lösefaktors am Papier entsprachen.
Mit Pufferlösungen mit PH- Werten im Bereich von 3, 6 bis 10, 4 wandert der Lösefaktor gegen die Kathode. Mit dem PH-Wert 11, 4-Puffer blieb der Lösefaktor stationär und zeigte keine Tendenz, zur Anode oder Kathode zu wandern. Daraus wurde geschlossen, dass die Substanz einen isoelektrischen Punkt von etwa PH 11 aufwies, oder, genauer ausgedrückt, einen Wert von mehr als PH 10, 4 und nicht grösser als 11, 4.
Die Nichtdialysierbarkeit des Lösefaktors wird durch die folgenden Versuche erläutert, bei welchen ein zellen freies Fermentationsfiltrat der im Beispiel l beschriebenen Art mit einem Testwert von 265 Einheiten des Lösefaktors je ml angewendet wurde. Ein aliquoter 2 ml-Anteil dieses Filtrats wurde bei 40C unter Verwendung einer Cellophanmembrane (Visking Co. ) gegen das 100fache ihres Volumens eines 0, 05molaren Tris-HCl-Puffers bei PH-Wert 7, 5 dialysiert. Die Dialyse wurde 4 h fortgesetzt, wobei die Pufferlösung jede Stunde erneuert wurde. Die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Die Testwerte des den Lösefaktor enthaltenden, als Ausgangsmaterial verwendeten Filtrats vor und nach der Dialyse sind innerhalb der experimentellen Fehlergrenzen als identisch anzusehen.
Tabelle 6
EMI8.1
<tb>
<tb> Dialyseversuch.
<tb>
Material <SEP> Zunahme <SEP> des <SEP> Beim <SEP> Versuch <SEP> % <SEP> Verminderung <SEP> Test,
<tb> Volumens <SEP> bei <SEP> verwendetes <SEP> der <SEP> Trübung <SEP> in <SEP> Gesamteinheiten
<tb> der <SEP> Dialyse <SEP> Volumen <SEP> 10 <SEP> min <SEP> in <SEP> der <SEP> Probe
<tb> Rohes <SEP> Filtrat-0, <SEP> 4ml <SEP> 52, <SEP> 5 <SEP> 5, <SEP> 30 <SEP>
<tb> dialysiertes
<tb> Filtrat <SEP> 270/0 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> ml <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 10 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
: zu1100C erhitzt, worauf der Inhalt entfernt und bei 450C in einem Kaliumhydroxydplätzchen enthaltenden Vakuumexsikkator eingedampft wurde.
Das entstehende Pulver wurde erneut in 5 ml 0, 20n-Citratpuffer (PH 2, 20) suspendiert und quantitativ sowie qualitativ auf Ammoniak und Aminosäurezusammensetzung in einer automatischen Vorrichtung analysiert, wobei ein Spinco-Aminosäureanalysator, Modell MS, verwendet wurde. Der Arbeitsgang dieser Vorrichtung umfasst die Absorption der Probe an einem lonenaustauscherharz und die bemessene Eluierung derselben mit kontinuierlicher photometrischer Analyse des Eluats nach Behandlung mit Ninhydrin. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben.
Tabelle 7
EMI9.2
<tb>
<tb> Aminosäuren <SEP> und <SEP> Ammoniak <SEP> nach <SEP> saurer <SEP> Hydrolyse <SEP> des <SEP> Lösefaktors.
<tb>
Produkt <SEP> Mikromol <SEP> Molverhalmis <SEP> im
<tb> erhalten <SEP> Verhältnis <SEP> zum
<tb> halben <SEP> Cystin
<tb> Asparaginsäure <SEP> 7,13 <SEP> 54, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Threonin <SEP> 3, <SEP> 75 <SEP> 28, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Serin <SEP> 3, <SEP> 28 <SEP> 25,0
<tb> Prolin <SEP> 2, <SEP> 90 <SEP> 22,1
<tb> Glutaminsäure <SEP> 5, <SEP> 45 <SEP> 41, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Glycin <SEP> 6, <SEP> 58 <SEP> 50, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Alanin <SEP> 4, <SEP> 68 <SEP> 35,7
<tb> Valin <SEP> 3, <SEP> 62 <SEP> 27, <SEP> 6 <SEP>
<tb> halbes <SEP> Cystin <SEP> 0, <SEP> 131 <SEP> 1,0
<tb> Methionin <SEP> 1, <SEP> 84 <SEP> 14, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Isoleucin <SEP> 2, <SEP> 60 <SEP> 19, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Leucin <SEP> 2, <SEP> 80 <SEP> 21, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Tyrosin <SEP> 3, <SEP> 45 <SEP> 26, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Phenylalanin <SEP> 1, <SEP> 97 <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Ammoniak <SEP> 14,
<SEP> 7 <SEP> 112, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Lysin <SEP> 2, <SEP> 65 <SEP> 20, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Histidin <SEP> 2, <SEP> 08 <SEP> 15, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Arginin <SEP> 1, <SEP> 31 <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Tierversuche werden an 32 weiblichen C3H-Mäusen durchgeführt. Jede derselben wurde intraperitoneal mit 1 X 108-Zellen von S. aureus Sv infiziert. Diese Tiere wurden intraperitoneal mit Lösefaktor von S. staphylolyticus in Gruppen von je vier behandelt. Zehn Einheiten des Lösefaktors wurden jeder Maus verabreicht, u. zw. an sechs der Gruppen in Zeitabständen von 2 h vor bis 4 h nach der Infektion.
Eine Gruppe erhielt 20 Einheiten Lösefaktor je Maus 1 h nach der Infektion. Eine infizierte Kontrollgruppe wurde nicht therapeutisch behandelt. Zwei infizierte Kontrollgruppen erhielten 10 und 20 Einheiten des Lösefaktors je Maus, drei der vier infizierten Kontrollmäuse starben in kürzerer Zeit als 24 h. Nur eines der behandelten Tiere starb und dieses Tier erhielt 20 Einheiten des Lösefaktors. Von den acht nichtinfizierten, mit Lösefaktor behandelten Kontrolltieren starb keines.
Zur quantitativen Feststellung der Virulenz des infizierenden Stammes wurde eine der infizierten Kontrollmäuse des obigen Versuches autopsiert und ein Bauchhöhlenabstrich wurde zur Gewinnung der S. aureus-Kultur gezüchtet. Mit diesem frisch isolierten virulenten S. aureus-Stamm wurden 28 männli-
EMI9.3
<Desc/Clms Page number 10>
Eine zweite Reihe von Schutzversuchen an Tieren wurde mit 36 männlichen C3H-Mäusen durchge- führt. Jedes derselben wurde intraperitoneal mit 0, 1 ml-Inokulat, das die 5fache LD 50-Menge (7, 5 X 107-
Zellen) der S. aureus Sv-Kultur enthielt, infiziert. 12 Mäuse in Gruppen zu je 4 wurden subkutan mit
10, 7, 5 oder 5 Einheiten des Lösefaktors 15 min nach der intraperitonealen Infektion behandelt. 16 Mäuse in Gruppen zu je 4 wurden intraperitoneal mit 7, 5, 5, 2, 5 oder 1 Einheiten des Lösefaktors 1 h nach der intraperitonealen Infektion behandelt. Eine Kontrollgruppe von acht infizierten Mäusen blieb unbehan- delt. Alle acht der unbehandelten Kontrolltiere starben in weniger als 11 h.
Eine der vier subkutan mit
7, 5 Einheiten behandelten Mäuse starb im Zeitraum zwischen 96 und 120 h nach der Behandlung. Alle andern behandelten Mäuse sowohl der subkutan als auch der intraperitoneal behandelten Gruppen blieben am Leben und waren nach 1 Woche Beobachtung offensichtlich völlig normal.
Die intraperitoneale LD 50 des Lösefaktors für Mäuse vom Stamm C3H wurde mit 30 Einheiten je
Tier bestimmt. Weitere Versuche zur Bestimmung des intraperitonealen und subkutanen therapeutischen
Index wurden mit Mäusen des C3H-Stammes durchgeführt, die intraperitoneal mit der 5fachen Menge der
LD 50 von S. aureus Sv-Kultur infiziert worden waren. Die Ergebnisse der 2 h nach der Infektion einset- zenden intraperitonealen Behandlung (unter Verwendung von 0, 1 ml Injektionen) sind in Tabelle 8 ange- geben. Diese Ergebnisse lassen einen intraperitonealen therapeutischen Index von etwa 3000 (30/0,01) erkennen.
Tabelle 8
EMI10.1
<tb>
<tb> Ergebnisse <SEP> der <SEP> 14tägigen <SEP> Nachbehandlung <SEP> von <SEP> 2 <SEP> h <SEP> nach <SEP> der <SEP> Infektion
<tb> intraperitoneal <SEP> mit <SEP> Lösefaktor <SEP> behandelten <SEP> Versuchstieren.
<tb>
Einheiten <SEP> des <SEP> injizierten <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> überlebenden <SEP> Tiere/
<tb> Lösefaktors <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> infizierten <SEP> Tiere
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 4/4
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> 4/4
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 4/4
<tb> 0, <SEP> 05 <SEP> 7/7
<tb> 0, <SEP> 02 <SEP> 4/4
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 3/4
<tb> 0, <SEP> 005 <SEP> 0/4
<tb> keine <SEP> 1/8
<tb>
Die Ergebnisse der subkutan 1 h nach der Infektion durchgeführten Behandlung sind in Tabelle 9 angegeben. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass der subkutane therapeutische Index etwa 60 beträgt, unter der Annahme, dass die LD 50 des Lösefaktors bei subkutaner und intraperitonealer Injektion ähnlich ist.
Tabelle 9
EMI10.2
<tb>
<tb> Ergebnisse <SEP> 14 <SEP> Tage <SEP> nach <SEP> einer <SEP> Behandlung, <SEP> die <SEP> 1 <SEP> h <SEP> nach <SEP> Infektion
<tb> durch <SEP> subkutane <SEP> Therapie <SEP> mit <SEP> dem <SEP> Lösefaktor <SEP> erzielt <SEP> wurde.
<tb>
Einheiten <SEP> des <SEP> injizierten <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> überlebenden <SEP> Tiere/
<tb> Lösefaktors <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> infizierten <SEP> Tiere
<tb> 5, <SEP> 0 <SEP> 8/8
<tb> 2, <SEP> 5 <SEP> 2/4
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 2/5
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> 6/12
<tb> keine <SEP> 1/8
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Die allumfassende Eignung des Lösefaktors zur Zerstörung von Mikroorganismen der Gattung des Sta- phylococcus, wie dies durch die beschriebenen in vitro-Versuche veranschaulicht ist, sowie die vorste- henden Tierversuche und Toxizitätsbestimmungen lassen die Nützlichkeit des Lösefaktors gemäss der Er- findung bei der Behandlung von Infektionen, die durch Mikroorganismen der Gattung des Staphylococcus hervorgerufen werden, erkennen. S. staphylolyticus, der den Lösefaktor bildet, ist gegen den Lösefaktor selbstverständlich resistent.
Soweit bisher festgestellt werden konnte, ist S. staphylolyticus ein nichtpa- thogener Mikroorganismus und verursacht daher auch keine Infektionen.
Da die Funktion des Lösefaktors auf eine Spaltung des Zellwandmaterials zurückgeht, besteht das
Problem seiner Anwendung darin, diesen Faktor mit den infizierenden Mikroorganismen in Berührung zu bringen. Es können beliebige physikalische Mittel, die mit der üblichen pharmazeutischen oder Spitals- praxis in Einklang stehen, zur Erreichung eines solchen Kontaktes angewendet werden. Das einfachste
Mittel besteht darin, das Antibiotikum einfach auf das infizierte Gewebe aufzubringen ; wie z. B. bei der lokalen Anwendung bei Infektionen der Haut oder anderer zugänglicher Strukturen, wie Schleimhäute.
Zu diesem Zweck können Salben, Lösungen, Suspensionen, Salze, Suppositorien, Vaginaltabletten, Tabletten u. dgl. angewendet werden. Der Lösefaktor ist sowohl als Desinfektionsmittel als auch als therapeutisches Mittel anwendbar.
Das Verfahren gemäss der Erfindung wird vorzugsweise in wässerigen Nährmedien bei Temperaturen von etwa 30 bis 400C und vorzugsweise von 34 bis 400C durchgeführt. Nährmedien, welche für diese Verfahren geeignet sind, umfassen Dextrose oder andere ähnliche Kohlehydratnährstoffe, wie Fruktose, Saccharose, Lactose und Dextrine aus der Hydrolyse von Stärke, eine organische Stickstoffquelle, wie Pepton, andere hydrolysierte Proteine, vorzugsweise enzymatisch hydrolysiertes Protein, wie pankreatische Abbauprodukte von Kasein und Papainabbauprodukte von Sojamehl.
Wenn während der Fermentation übermässiges Schäumen verhindert werden soll, können Antischaummittel, wie pflanzliche Öle, höhere Alkanole und Silikone, zum Fermentationsmedium zugegeben werden, wie dies üblicherweise bei submersen, aeroben Fermentationen geschieht.
Für eine Erzeugung in grossem Massstab wird der Mikroorganismus am besten unter submersen Bedingungen und unter Rühren und Belüftung gezüchtet. Eine Impfkultur kann auf mit S. staphylolyticus beimpftem Schrägagar oder in Schüttelkolben erhalten werden. Diese Kultur kann verwendet werden, um Impftanks zu beimpfen, die wieder zur Beimpfung von Grossfermentern benutzt werden können.
Die Fermentation wird vorzugsweise bei PH- Werten von etwa 7, 5 oder wenigstens im Bereich von PH 7, 3 bis 7, 7 durchgeführt. Da der Organismus bei der Glukoseverwertung Säure erzeugt, wird der PHWert des Fermentationsmediums vorzugsweise periodisch gemessen und das Fermentationsmedium mit einer geeigneten Base, wie Natriumhydroxyd, neutralisiert, falls das Medium saurer als PH 7, 3 wird. Es ist beobachtet worden, dass nach Erreichen eines Maximums der antibiotischen Produktion der PH- Wert die Tendenz zeigt, stärker alkalisch zu werden. Für die Erzielung maximaler Ausbeuten ist es vorteilhaft, die Fermentation zu unterbrechen, bevor die Mischung basischer als PH 7, 7 wird, da bei Überschreiten eines PH-Wertes von 7, 7 zunehmende Aktivitätsverluste beobachtet werden.
Das oben beschriebene Testverfahren wird periodisch angewendet, um das Ausmass zu bestimmen, in welchem die Fermentation fortgeschritten ist. Da die Versuche in einem kurzen Zeitraum durchgeführt werden können, z. B. in 10 oder 15 min, und es möglich ist, rasch das Stadium der Antibiotikaproduktion in einer gegebenen Fermentationsperiode zu bestimmen, wird die Fermentationsperiode in Abhängigkeit vom Lösefaktorwert, der auf diese Weise gemessen wird, bestimmt. Zeitabschnitte zwischen etwa 12 und 36 h oder länger haben sich als zufriedenstellend erwiesen. Der erforderliche Zeitabschnitt steht in Beziehung zur Fermentationstemperatur, der Menge des Impfmaterials usw., wobei längere Zeiträume bei niedrigeren Temperaturen und geringeren Impfmaterialmengen benötigt werden.
Die Erfindung umfasst nicht nur die Verwendung des oben beschriebenen Mikroorganismus S. staphylolyticus NRRL B-2628, der lediglich zu Illustrationszwecken angegeben ist, sondern auch die Anwendung von Mutanten, wie sie durch Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, Behandlung mit Stickstofflost oder andern chemischen oder physikalischen Mutationsmitteln, durch genetische Kreuzung usw., erhalten werden. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von Subkulturen, wie sie durch verschiedene mikrobiologische Verfahrensweisen, wie Einzelkolonieisolationsmethoden, erhalten werden. Solche Mutanten oder Subkulturen können in gewisser Hinsicht von der oben beschriebenen Kultur abweichen. Durch die Erfindung wird auch die Verwendung von Mikroorganismen dieser Spezies mitumfasst, die von andern Quellen erhalten worden sind.
Da der Lösefaktor des S. staphylolyticus ein Protein oder ein proteinähnliches Material zu sein scheint, kann er durch Anwendung vieler Methoden erhalten werden, die bei der Isolierung von Enzymen
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aus verdünnten Lösungen benutzt werden. Zuerst werden die Bakterienzellen des S. staphylolyticus durch
Zentrifugieren oder andere zweckmässige Massnahmen abgetrennt. Das Proteinmaterial, welches antibio- tisch aktiv ist, wird dann durch Behandlung der zellenfreien Kultur mit hydrophilen Mitteln, wie anorga- nischen oder organischen Salzen, die eine hohe Wasserlöslichkeit aufweisen, gefällt. Solche Salze um- fassen Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Ammoniumbromid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumdithionat und Ammoniumformiat.
Nach Fällung des Antibiotikums und anderer Proteinmaterialien aus der zellenfreien Fermentations- brühe können verschiedene andere Verfahrensweisen, wie Verteilungschromatographie und andere Arten der Chromatographie, in Kombination mit solchen Reinigungsverfahren, wie Elektrophorese, Papierchro- matographie und Lösungsmittelextraktion, angewendet werden.
Andere Mittel zur Gewinnung des Antibiotikums, wie Dialyse, sind, wie nachstehend näher erläutert wird, ebenfalls wertvoll. Eine andere Dialysiermethode, die bei der Gewinnung des Lösefaktors Anwen- dung gefunden hat, ist diejenige von. Kohn (Nature, 11. April 1959, S. 1055), gemäss welcher die Lö- sung des Lösefaktors in einen Behälter eingefüllt und in den Behälter ein Cellophanbeutel, der eine hydrophile Substanz, wie Dextran oder Polyäthylenglykol, enthält, eingebracht wird. Das Wasser wird von der hydrophilen Substanz durch die Membran absorbiert und wenn das Verfahren zu Ende geführt wird, ist nur nichtdialysierbares Material einschliesslich Lösefaktor in dem Behälter zurückgeblieben und das Wasser ist durch das hydrophile, im Cellophanbeutel enthaltene Absorptionsmittel entfernt.
Das erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum kann auch in verdünnten Lösungen, als Rohkonzentrate, wie solche, die bei der Fermentation erhalten werden, und in gereinigter Form vorliegen. Die verdünnten Formen, wie zellenfreie Fermentationsbrühen, sind weniger teuer und können daher eine vorteilhafte Anwendungsform für gewisse Zwecke, wie Desinfektionsmittel und Tierheilmittel, darstellen.
Gemäss den in Tabelle 7 angegebenen sauren Hydrolyseprodukten wird eine Mischung von Ammoniak und bekannten natürlichen a-Aminosäuren erhalten, in Übereinstimmung mit dem Schluss, wonach der Lösefaktor proteinartiger Natur ist. Die Aminosäuren Cystein und Cystin scheinen, wenn überhaupt, so nur in geringen Mengen vorzuliegen. In der Tabelle sind die Molverhältnisse der Hydrolyseprodukte im Verhältnis zum halben Cystin angegeben. Die Ergebnisse sind als Halb-Cystin auf Grund der Tatsache angegeben, dass bei diesem Verfahren in der ursprünglichen Probe nicht zwischen Cystein und Cystin unterschieden wird. Die erhaltene relativ grosse Menge Ammoniak geht offenbar auf die teilweise Hydrolyse von Glutamin und Asparagin zurück, die beim Prozess wieder in Glutaminsäure umgewandelt werden.
Die letzteren werden in hoher Konzentration in bezug auf Halb-Cystin gewonnen. Tryptophan wird, wenn es vorhanden ist, durch dieses Verfahren nicht festgestellt, da es unter den sauren, bei der Hydrolyse angewendeten Bedingungen zerstört wird.
Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren gemäss der Erfindung.
Beispiel l : Es wird ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt ; 1000 ml desselben werden mit Staphylococcus staphylolyticus NRRL B-2628 beimpft und etwa 18 h bei 370C in Fembach-Kolben in einer Reziprokschüttelmaschine, die mit einer Ausschlagweite von 6, 35 cm bei 76 Ausschlägen/min arbeitet, bebrütet :
EMI12.1
<tb>
<tb> Komponenten <SEP> g/l
<tb> Pankreatisches <SEP> Abbauprodukt <SEP> von <SEP> Kasein <SEP> + <SEP> 17, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Papainabbauprodukt <SEP> von <SEP> Sojamehl <SEP> ++ <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5, <SEP> 0
<tb> Dikaliumnitrogenphosphat <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> + <SEP> = <SEP> Trypticase <SEP> (Baltimore <SEP> Biological <SEP> Laboratory)
<tb> ++ <SEP> = <SEP> Phytone <SEP> (Baltimore <SEP> Biological <SEP> Laboratory)
<tb>
Vor der Beimpfung wird das Nährmedium mit wässerigem Natriumhydroxyd auf PH 7, 3 eingestellt.
Nach 18stündiger Bebrütung steigt der pH-Wert auf 7, 5 an. Die Zellen werden dann bei 40C in einer Kühlzentrifuge (Lourdes LRA) bei 9000 Umdr/min (13 200 X g) 20 min zentrifugiert.
Die klare überstehende Flüssigkeit wird durch eine Cellulosemembran mit einem Porendurchmesser von 0, 5/l (Schleicher und Schüll Bac-T-Flax) filtriert, um die Sterilität zu gewährleisten. Das erhaltene klare, gelbe Filtrat wird, wie oben beschrieben, getestet, wobei festgestellt wird, dass es 2, 5 E/ml des Lösefaktors enthält.
<Desc/Clms Page number 13>
Andere bekannte Kohlehydrate können im Fermentationsmedium an Stelle der Dextrose des Beispiels l ohne störende Wirkung verwendet werden. In ähnlicher Weise können andere Stickstoffquellen, wie Fleischextrakt und verschiedene andere, bekannte enzymatisch hydrolysierte Proteine an Stelle von Trypticase und Phytone verwendet werden. Als Quelle für Kohlehydrate und stickstoffhaltige Nährstoffe kann auch Cornsteepliquor verwendet werden.
Beispiel 2 : Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, jedoch wird als Fermentationsmedium das Hirn-Herz-Infusionsmedium verwendet, das in National Formulary IX beschrieben ist. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung :
EMI13.1
<tb>
<tb> Komponente <SEP> g/l
<tb> Kalbshirn, <SEP> Infusion <SEP> aus <SEP> 200
<tb> Rindsherz, <SEP> Infusion <SEP> aus <SEP> 250
<tb> Pankreatisches <SEP> Abbauprodukt <SEP> aus <SEP> Gelatine <SEP> + <SEP> 10
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5
<tb> Saures <SEP> Dinatriumphosphat <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> 2,0
<tb> + <SEP> = <SEP> Gelysate <SEP> (Baltimore <SEP> Biological <SEP> Laboratory)
<tb>
Das filtrierte, zellfreie Fermentationsfiltrat weist einen experimentell bestimmten Lösefaktor von etwa 0,5 E/ml auf.
Im Beispiel 2 kann ein anderes Hirn-Herz-Infusionsmedium eingesetzt werden, wobei im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten werden.
Beispiel 3 : Es werden 2,7 1 des Kulturmediums gemäss Beispiel 1 verwendet, das mit Staphylo- coccus staphylolyticus NRRL B-2628 beimpft ist und bei 370C während 27 h in Fernbach-Kolben auf einer Längsschüttelmaschine, wie in diesem Beispiel beschrieben, geschüttelt wird. Innerhalb dieser Zeit steigt der PH- Wert des Kulturmediums auf 7,5 an. Die in der Kultur gebildeten Zellen werden durch Zentrifugieren entfernt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wird, und die überstehende Flüssigkeit wird in einer Eis-Salz-Kältemischung in einem mit einem mechanischen Rührer ausgestatteten Behälter abgekühlt.
Analytisch reines, kristallines Ammoniumsulfat wird der überstehenden Flüssigkeit langsam unter Rühren zugesetzt, bis eine Menge von Ammonsulfat gelöst ist, die etwa 65% der Sättigungskonzentration entspricht. Während des Zusatzes wird der PH- Wert auf 7,5 gehalten. Die Mischung wird 1 h bei 40C gehalten, während welcher Zeit eine Fällung gebildet wird. Die Fällung wird in einer gekühlten Zentrifuge bei 2 - 30C abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und die Fällung wird in 40 ml kaltem, 0, 05molarem tris- (Hydroxymethyl)-aminomethanhydrochloridpuffer mit dem PH-Wert 7, 5 (TrisHCl) gelöst. Die Lösung wird dann in einen Cellophan-Dialysebeutel (Visking Co., Division of Union Carbide Corp., New York, N.
Y.) gebracht und bis zur Sulfationenfreiheit dialysiert. Die Dialyse wird bei 40C durchgeführt.
Die sulfationenfreie Lösung des Lösefaktors (75 ml) wird aus dem Dialysebeutel genommen und in eine Anionenaustauscherkolonne gebracht, die 2,5 cm Durchmesser und 25 cm Länge aufweist und mit
EMI13.2
Kolonne wird dann mit Tris-HCl-Puffer, der Natriumchlorid enthält und auf 40C abgekühlt ist, entwikkelt. Die Natriumchloridkonzentration zu Beginn der Entwicklung der Kolonne ist 0,05molar und steigt in Stufen während der Entwicklung auf 0,145molar an. Das Eluat wird in 15 Fraktionen zu 17 ml aufgefangen, wobei jede derselben in bezug auf Lösefaktor und Proteingehalt getestet wurde. Bei den Fraktio-
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Fraktionen werden für die weiteren Isolierungsschritte vereinigt.
Das Proteinmaterial wird aus den vereinigten Fraktionen mit einem speziellen, enzymfreien Ammonsulfat, wie oben beschrieben, ausgefällt. Es wird eine 807o der Sättigungskonzentration entsprechende Endkonzentration an Ammoniumsulfat angewendet. Das gefällte Material wird durch Zentrifugieren bei 2 - 30C und 16000 X g während 20 min abgetrennt.
Das gefällte Material wird in 1, 5 ml kaltem, 0,05molarem Kaliumphosphatpuffer mit PH- Wert 7,0 gelöst und bei 4 C während 24 h bei mehrfachem Wechsel der Pufferlösung gegen eine frische Pufferlösung dialysiert. Die Lösung des Lösefaktors wird dann aus dem Dialysebeutel entfernt und in einer gekühlten Ultrazentrifuge (Spinco Modell L) bei 39 000facher Erdbeschleunigung (39000 X g) während 20 min
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zur Entfernung von Spuren teilchenförmigen Materials zentrifugiert und bei -200C gelagert. Das flüssige
Konzentrat zeigt im Test eine Aktivität von 105 E/ml des Lösefaktors und 6, 7 mg/ml Protein oder eine
Aktivität von 15, 7 E/mg Protein auf.
Zur Bestimmung der Sedimentationskonstante des Lösefaktors, die zum Molekulargewicht in Bezie- hung steht, wird das wie in Beispiels beschrieben hergestellte, gereinigte Material bei 59780 Umdr/min (254500 x g) in einer Analysen-Ultrazentrifuge (Spinco Modell E) zentrifugiert, wobei eine Temperatur von 5 0, 1 C eingehalten wird ; die Sedimentationsgrenze wird in Zeitabständen photographiert. Aus diesen Daten wird der Sedimentationskoeffizient(So ) mit 2, 35 S berechnet.
Beispiel 4 : Das Verfahren des Beispiels 3 wird bis zur ersten Ammonsulfatfällung und dem Di- alyseschritt unter Verwendung von 0, 05molarem Tris-HCl-Puffer wiederholt. Die sulfatfreie Lösung des
Lösefaktors wird dann in eine mit synthetischem Polysaccharid (Sephadex G25, Aktieselskabet Pharma- cia, Upsala, Schweden) beschickte Chromatographiersäure gebracht. Die Säule wird mit Tris-HCl-Puf- fer entwickelt (0, 05-bis 0, 145molar, in Natriumchlorid). In diesem Falle ist eine starke Entwicklung der Säure nicht notwendig, da der Lösefaktor an derselben nicht absorbiert wird, sondern auf einmal hin- durchgeht. Eine Eluierung ist nur in dem Masse notwendig, wie es durch das Fliessen der ursprünglichen
Lösung durch die Kolonne bedingt wird.
Verunreinigungen werden jedoch in der Kolonne zurückgehalten.
Das Proteinmaterial wird dann zur Rückgewinnung des Produktes, wie vorstehend angegeben, aus dem
Eluat gefällt.
Beispiel 5 : Rindfleischextraktnährstoff-Agarplatten werden mit dem Mikroorganismus Staphylo- coccus staphylolyticus NRRL B-2628 strichförmig beimpft ; senkrecht dazu werden Strichimpfungen mit verschiedenen Stämmen des Staphylococcus aureus ausgeführt. Nach Bebrütung bei 370C während 7 h werden Bereiche der Auflösung im Wuchs der Staphylococcus aureus-Querstriche an den Kreuzungsstellen festgestellt. In dem Masse, wie die Bebrütungszeit fortschreitet, nehmen die Bereiche der Spaltung an Grösse zu, was anzeigt, dass im Medium die Bildung des Lösefaktors durch Staphylococcus staphylolyticus aufrechterhalten wird.
Zehn verschiedene Stämme des Staphylococcus aureus mit den folgenden Phagentypen wurden bei diesem Versuch angewendet : 80,81, 52A, 7,6 und 42D. Das Auflösen wird in jedem Falle beobachtet.
Beispiel 6 : Das Verfahren des Beispiels 3 wird bis zum Verfahrensschritt des Chromatographierens an der Säule wiederholt. Beim zweiten Dialyseschritt wird Tris-Salzpuffer mit einer Molarität von 0, 05 bei pH-Wert von 7, 5 an Stelle des Phosphatpuffers verwendet. Spuren teilchenförmigen Materials werden durch Zentrifugieren, wie vorstehend angegeben, entfernt, wobei ein Produkt erhalten wird, das gemäss Test 260 Einheiten des Lösefaktors je ml und 4, 3 mg Protein je ml enthält. Zu jedem der beiden Proberöhrchen, die 3, 5 ml eines 0, 05molaren Tris-Salzpuffers (PH 7, 5) enthalten, werden 0,01 ml dieses hochgereinigten Präparates des Lösefaktors zugesetzt.
Eines dieser Röhrchen dient als Vergleich, während zu dem andern Röhrchen 5 mg Trypsin (Nutritional Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) zugesetzt werden ; beide Röhrchen werden bei 370C 20 min bebrütet. Sie werden dann auf Löseaktivität nach dem oben beschriebenen Verfahren untersucht.
Beim Versuch des Beispiels 6 wurde gefunden, dass das mit Trypsin bebrütete Röhrchen seine Lösefaktoraktivität vollkommen eingebüsst hatte, während das Vergleichsröhrchen eine tige Verminderung der Trübung in 5 min aufwies, was dem Lösefaktor-Aktivitätswert, bezogen auf den ursprünglichen Testwert der beim Versuch eingesetzten Probe, entsprach.
Die Lösung des Lösefaktors, die in der Analysen-Ultrazentrifuge bei Bestimmung des Sedimentationskoeffizienten (Beispiel 3) angewendet worden war, wurde bei 40C gegen entionisiertes Wasser dialysiert, bis die Ionenkomponenten des Phosphatpuffers entfernt waren. Die Probe wurde dann dem Dialysierbeutel entnommen, gefroren und aus dem gefrorenen Zustand getrocknet. Eine 10/0ige Verdünnung derselben in Kaliumbromid wurde in üblicher Weise zu Tabletten verpresst und es wurde das Infrarot-Absorptionsspek-
EMI14.1
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