AT250590B

AT250590B - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Δ<4>-3-Keto-steroiden

Info

Publication number: AT250590B
Application number: AT1016263A
Authority: AT
Inventors: Gyoergy Dr Wix; Antal Dipl Ing Dr Szabo; Maria Dipl Ing Varga; Erzsebet Dipl Ing Dr Weisz; Istvan Dipl Ing Dr Horvath; Tibor Dipl Ing Kovacs; Bela Dipl Ing Kasszan; Balint Dipl Ing Doczy
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1962-12-30
Filing date: 1963-12-17
Publication date: 1966-11-25

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von   D. 4-3-Keto-steroiden    
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur   Herstellungvon 6. 4 -3-Keto-steroiden   durch mikrobiologische Umsetzung von   A-36-Hydroxy-steroiden.   



   Unter den Steroiden kommt bekanntlich eine besondere Bedeutung solchen Verbindungen zu, welche 
 EMI1.1 
    4 -3-Keto-Gruppe- Struktur   unter Schutz der schon ausgebildeten Dihydroxyaceton-Seitenkette ernste Schwierigkeiten. Die aus Pregnadienolonacetat ausgehende, 10-12 Schritte umfassende Synthese kann mit einer, auf den Ausgangsstoff berechnet etwa   zuigen   Ausbeute verwirklicht werden. Auf Grund der früheren Erkenntnis, dass der Mikroorganismus Flavobacterium dehydrogenans zur Überführung der   #5-3ss-Hydroxy-Struktur der   Steroide in eine   #4-3-Keto-Struktur   fähig sei (Boll. Ist. Sieroterap. Milanese 21, 1   [1942] ; Zentralbi. Bakt.   



  Parasitenk. 105, 352   [1942]), wurde   in der USA-Patentschrift Nr. 3, 009,936 ein Verfahren zur Herstellung der Reichstein'schen Verbindung   S aus 17&alpha;-Hydroxy-3ss,21-diacetoxy-#5-pregnen-20-on   (Verbindung R) mit Hilfe eines Stammes des Flavobacterium dehydrogenans var. hydrolyticum beschrieben. Dieses Verfahren ist auf die Erkenntnis gegründet, dass eine Variante des Flavobacterium dehydrogenans bei der Ausbildung der   6. 4 -3-Keto-Struktur   zugleich auch die Desacetylierung der Verbindung R durchführen kann.

   Die Herstellung der Verbindung R auf chemischem Wege aus Pregnadienolonacetat und ihre nachfolgende mikrobiologische Überführung in die Reichstein'sche Verbindung S ist sowohl wegen der Kürze, als auch der besseren Ausbeute des Verfahrens wesentlich vorteilhafter, als die rein chemische Herstellung dieser Verbindung. 



   Wir haben nun aus einem Bodenmuster einen als Streptomyces K-451 bezeichneten Mikroorganismus isoliert, welchen wir bei dem Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen am 29. Dezember 1962 unter Nr. 20/1962 deponiert haben und welcher in Gegenwart von mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln die   A-3ss-Hydroxy-Struktur   enthaltenden Steroide unmittelbar, ferner nach vorheriger Adaptation auch die in der 3-oder 21-Stellung eine Estergruppe enthaltenden   A-3ss-Hydroxy-   - steroide in die entsprechende   6. 4 -3-Keto-steroide überführen kann.   Dieser von uns entdeckte Mikroorganismus Streptomyces K-451 zeigt überraschende biochemische Eigenschaften. So kann er z.

   B. das   17ct,   21-Dihydroxy-pregnenolon unter den üblichen Züchtungsbedingungen nur in etwa 50% in die Reichstein'sche Verbindung S   überführen.   Wenn aber der Kultur neben dem umzusetzenden Steroid zugleich auch Dichloräthan zugesetzt wird, dann geht die Überführung in Gegenwart des mit Wasser nicht misch- 

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 baren organischen Lösungsmittels quantitativ vor sich. Wird dagegen die Verbindung R als umzusetzender
Ausgangsstoff mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel der Kultur zugesetzt, dann findet keine Überführung statt. Überraschenderweise kann aber auch diese Überführung durchgeführt werden, wenn die Kultur vorher in Gegenwart einer eine Estergruppe enthaltenden Verbindung (z. B. des   21-Ace-   tats der Reichstein'schen Verbindung S) adaptiert wurde.

   Das mit Wasser nicht mischbare organische Lö- sungsmittel soll in diesem Fall nur in einer zur Sättigung der wässerigen Phase nötigen Menge zugesetzt werden ; wenn der Überschuss dieses mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels eine separate Phase bil- det, dann bleiben die Estergruppen enthaltenden   A-38-Hydroxy-steroide   in dieser organischen Phase und die mikrobiologische Konversion kann nicht in genügendem Mass stattfinden. 



   Der von uns entdeckte Stamm Streptomyces K-451 besitzt also die Fähigkeit, die   A-30-Hydroxy-   - Struktur der Steroide in eine   6. 4 -3-Keto-Struktur   zu überführen. So können mit Hilfe dieses Stammes 
 EMI2.1 
    5, 16 - Pregnadienolon in. 6. 16 - Dehydro - progesteron, 16ct, 17ct- Oxido - pregnenolon16ex,     17ct-Oxido-progesteron,   17ct,   21-Dihydroxy-pregnenolon   in die Reichstein'sche Verbindung S mit guter Ausbeute übergeführt werden. Als mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel können beliebige apolare Lösungsmittel,   z. B.   Äthyläther, Butylacetat, Toluol, Benzol, Dichloräthan, Trichlor- äthan, Methylenchlorid, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid bzw. deren Gemische verwendet werden. 



  Nach unseren Erfahrungen ist die Anwendung von weniger polaren organischen Lösungsmitteln vorteilhafter, da mit dem Zunehmen des polaren Charakters der Wirkungsgrad der mikrobiologischen Konversion abnimmt. 



   Die von uns erzielten Ergebnisse waren durchaus nicht vorauszusehen, sie sind sogar aus mehreren Gründen als überraschend anzusehen. Diese Gründe sind die folgenden : 
 EMI2.2 
 ;Steroid-Umsetzungen fähigen Mikroorganismen erschlossen. 



   Die Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln bei den mikrobiologischen Umsetzungen beeinflusst nach den bisherigen Kenntnissen die Lebensfunktionen der Zellen und die Wirksamkeit der Enzyme im allgemeinen nachteilig, so dass es bisher als ratsam galt, von der Anwendung solcher Lösungsmittel bei den mikrobiologischen Umsetzungen abzustehen.

   Wir sind im Zusammenhang mit dem Stamm Streptomyces K-451 zu der aus theoretischer und praktischer Hinsicht gleichsam überaus wichtigen Erkenntnis gekommen, dass das desacetylierende Enzym von adaptiver Natur sei und dass die Adaptation durch die Zugabe von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln verhindert werden könne, u. zw. so, dass dabei weder die die Konversion verursachenden Enzyme, nämlich das   3B-Hydroxysteroid-dehydrogenase   und das   A-A-Steroid-isomerase,   noch die schon ausgebildeten Steroidesterasen beschädigt und in ihren Funktionen gehindert werden. 



   Der Mikroorganismus K-451 zeigt an synthetischen Nährböden ein langsam einsetzendes, an kompletten natürlichen Nährböden ein rasch einsetzendes, gutes Wachstum. Bei gutem Wachstum produzieren die Organismen ein gelbes oder gelbbraunes, lösliches Pigment, in solchen Fällen ist auch das vegetative Mycel gelb oder gelblich. Das sporenbildende Luftmycel ist weiss, die Sporenträger sind im allgemeinen paarenweise angeordnet und haben eine für die biverticille Sektion charakteristische Form. Nach 
 EMI2.3 
 ist dieser Organismus auf Grund der nachstehend ausführlich angegebenen Prüfungsergebnisse in die weisse Reihe der biverticillen Sektion einzureihen. Bei der Untersuchung des Wachstums zeigte dieser Organismus die folgenden Ergebnisse :
Saccharose-Agar nach Czapek, bei 280 C : langsam einsetzendes, schwaches Wachstum ; das sporenbildende Luftmycel ist weiss. 



   Glukose-Asparagin-Agar, bei   28OC :   langsam einsetzendes, gutes Wachstum ; das sporenbildende Luftmycel ist weiss, der Mikroorganismus produziert ein schwach gelbes, lösliches Pigment. 



   Glycerin-Kaliumnitrat-Agar, bei 280C : langsam einsetzendes, gutes Wachstum ; das sporenbildende Luftmycel ist weiss, der Mikroorganismus produziert ein schwach gelbes, lösliches Pigment. 



   Calciummalat-Agar, bei   28OC :   langsam einsetzendes Wachstum von mittlerer Stärke ; Farbe des sporenbildenden Luftmycels : weiss. 



     Glycerin-Calciummalat-Agar,   bei   28  C :   langsam einsetzendes Wachstum von mittlerer Stärke ; Farbe des sporenbildenden Luftmycels : weiss ; der Mikroorganismus produziert ein schwach gelbes, lösliches Pigment. 



   Tyrosin-Agar, bei   280 C,   in Stichkultur : mittelstarkes Wachstum ; sporenbildendes Luftmycel wird 

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 kaum produziert ; Farbe des vegetativen Mycels : gelb. 



   Liebig'scher Pepton-Agar, bei 280 C : gutes Wachstum ; Bildung von braunem Pigment. 



   Stärke-Agar, bei 280 C : schwaches Wachstum ; Farbe des sporenbildenden Luftmycels : weiss. 



     Stärke- Calciumnitrat- Agar,   bei 280 C : langsam einsetzendes mittelstarkes Wachstum ; Farbe des sporenbildenden Luftmycels : weiss. 



   Glukose-Kartoffelsaft-Agar, bei   28OC :   gutes Wachstum ; die Produktion des sporenbildenden Luftmycels setzt langsam ein ; das Luftmycel ist   weiss ;   der Mikroorganismus produziert ein braunes, lösliches Pigment. 



   Emerson-Agar, bei 280 C : gutes Wachstum ; die Produktion des sporenbildenden Luftmycels beginnt langsam, das Luftmycel ist   weiss ;   der Mikroorganismus produziert ein braungelbes lösliches Pigment. 



   Hafermehl-Agar, bei 280 C : langsam einsetzendes, mittelstarkes Wachstum ; sporenbildendes Luftmycel wird schwach produziert ; seine Farbe ist   weiss ;   der Mikroorganismus produziert wenig gelbes, lösliches Pigment. 



   Loeffler'sches Serum, bei 280 C : gutes Wachstum, schwache Produktion von sporenbildendem Luftmycel ; Farbe des Luftmycels : weiss ; der Mikroorganismus produziert ein braunes, lösliches Pigment ; das Medium wird schwach verflüssigt. 



   Kartoffelschnitzel, bei 280 C : langsam beginnendes, mittelstarkes Wachstum ; sporenbildendes Luftmycel wird kaum produziert ; Farbe des Luftmycels : weiss ; der Mikroorganismus produziert ein braunes, lösliches Pigment. 



   Plotho-Agar, bei 280 C : langsam einsetzendes gutes Wachstum ; sporenbildendes Luftmycel wird gut produziert ; Farbe des Luftmycels : weiss ; der Mikroorganismus produziert ein gelbes, lösliches Pigment. 



   Kellner-Morton'scher Agar, bei   280C :   gutes Wachstum ; sporenbildendes Luftmycel wird kaum produziert ; der Mikroorganismus produziert ein dunkles, grau-braunes, lösliches Pigment. 



   Blut-Agar, bei   28OC :   gutes Wachstum, Hämolyse. 



   Lakmus-Milch, bei 280 C : langsam einsetzendes, mittelstarkes Wachstum ; Koagulation, schwache Peptonisierung, schwache Ansäuerung. 



   Gelatine, in Stichkultur, bei 220   C : mittelstarkes Wachstum ; Verflüssigung ;   es wird ein braunes, lösliches Pigment gebildet. 



     DerStammStreptomycesK-451kann-nach der Methode vonT. G.   Pridham und P. Gottlieb   0.   Bact. 56, 107   [1948]) gemessen - die   folgenden Kohlenhydrate und andere Kohlenstoffquellen gut verwerten : Glukose, Fruktose, Inosit, Maltose, Mannose, Trehalose, Natriumsuccinat, Natriumacetat, Stärke. Schwaches Wachstum wird gewährt durch Inulin, Laktose, Mannit und Salicin. Kein Wachstum wurde an Arabinose, Dulcit, Galaktose, Raffinose, Rhamnose, Saccharose, Sorbit, Sorbose und Xylose erhalten. 



   Der Mikroorganismus Streptomyces K-451 wurde zur Erzeugung einer zur Durchführung der mikrobiologischen Konversion geeigneten Biomasse an den folgenden Nährböden   gezüchtet :   
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Nährboden <SEP> D <SEP> : <SEP> Sojamehl'2f1/0 <SEP> 
<tb> Glukose <SEP> (techn.) <SEP> 310 <SEP> 
<tb> Maisquellwasser-Extrakt <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Kasein-Hydrolysat <SEP> 0, <SEP> 1%
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 3 < <SEP> )
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> 
 in Leitungswasser ; der pH-Wert des Nährbodens wurde vor dem Sterilisieren auf   7 - 7, 1   eingestellt. 
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> 



  Nährboden <SEP> D <SEP> : <SEP> Sojamehl <SEP> 2o
<tb> Glukose <SEP> (techs.) <SEP> 3% <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> 
 in Leitungswasser ; der pH-Wert des Nährbodens wurde vor dem Sterilisieren auf   7 - 7, 1   eingestellt. 



   Diese Nährböden wurden zu je 100 ml in 500 ml Erlenmeyer-Kolben verteilt und in Autoklaven bei 1210 C 15 min sterilisiert. Das umzusetzende Steroid wurde in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst, der Kultur zugesetzt ; die Konzentration der Verbindung R, des Dihydroxy-pregnenolons bzw. der Verbindung S in den Kulturen wurde nach der   Schwefelsäure-Chromogen-Methode   ermittelt. Die durch Auswertung der Chromogen-Analyse erhaltenen Ergebnisse wurden auch durch qualitative und quantitative papierchromatographische Messungen unterstützt. Zu diesem Zweck wurde das Fermentationspro- 

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 dukt z. B. mit Dichloräthan extrahiert, der Extrakt verdampft und der   Verdampfungsrückstand   im Gemisch von Aceton und Chloroform gelöst, so dass eine Lösung von etwa 4 mg/ml Steroidkonzentration erhalten wurde.

   Diese Lösung wurde dann in Dosen von 50 bis   100 fil   auf ein mit   30%   Äthylenglykol enthaltendem Methanol imprägniertes und vorher mit Äthanol in der Form eines überfliessenden Chromatogrammes gewaschens Papier (Macherey-Nagel Nr. 214) aufgetropft. Als mobile Phase wurde ein vorher mit Äthylenglykol gesättigtes Gemisch von Tetrachlorkohlenstoff und Dichloräthan   l : l   angewendet. In diesem System läuft die Verbindung R nahezu zusammen mit der Lösungsmittelfront, die Verbindung S mit einem Rf-Wert von etwa 0,75 und das Dihydroxypregnenolon mit etwa 0, 5.

   Die Flecken wurden an den Chro-   matogrammenmitalkalischemTriphenyltetrazoliumchlorid-Reagenz entwickelt   bzw. im Falle von quantitativen Bestimmungen der gebildeten Verbindung S wurde die Lage dieses, die   D, 4. -3-Keto-Gruppe   enthaltenden Steroids durch ultraviolette Kontaktphotographie festgestellt, der den Fleck enthaltende Papierteil ausgeschnitten, das Steroid mit 10 ml abs. Äthanol p. a. eluiert und die Extinktion des Eluats bei 242 mu gemessen ;

   der Steroidgehalt der Lösung wurde dann nach Abzug des entsprechenden Blindwertes (des mit aus einem steroidfreien Papierteil hergestellten Eluat erhaltenen Wertes) auf Grund der Standard- 
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 wart von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln mit einer Kultur des Mikroorganismus Streptomyces K-451 behandelt und das entstandene   D, 4. -3-Keto-steroid   nach an sich bekannten Methoden isoliert. Wenn als Ausgangsstoffe   A-30-Hydroxy-steroide   angewendet werden, welche in der 3-oder 21-Stellung Estergruppen enthalten, dann wird die mikrobiologische Umsetzung mit solchen Kulturen des Stammes Streptomyces K-451 durchgeführt, welche vorher in Gegenwart von Estergruppen enthaltenden   é -3- Keto-   - steroide adaptiert wurden.

   In diesem Fall wird das mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel der Kultur nur in zur Sättigung der Kultur erforderlichen Mengen zugesetzt. Als mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel wird zweckmässig Dichloräthan angewendet. 



   Die Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht. 



   Beispiel 1 : Aus einer an   Kartoffel-Agarschrägkultur gezüchteten einwöchigen Kultur des Stam-   mes Streptomyces K-451 wurde mit 5 ml sterilem Leitungswasser eine Sporensuspension hergestellt. Je 100 ml des sterilisierten Nährbodens D wurden in 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit je 1 ml dieser Sporensuspension eingeimpft. Die Kolben wurden an einem mit 200 Umdr/min bewegten flachen Schütteltisch von 2 cm Ausschlag während 48 h bei 280 C inkubiert. Dann wurden je 20 mg 17a, 21-Dihydroxy-pregnenolon in 0, 5 ml Dioxan gelöst den Kulturen zugesetzt. Nach unter den gleichen Bedingungen erfolgter weiteren Inkubation von 24 bzw. 48 h wurden die Kulturen mit 0,5 Vol. Dichloräthan extrahiert und es wurde die Menge der im Extrakt enthaltenen Verbindung S bestimmt.

   Es wurden sowohl nach 24 als auch nach 48 h Inkubation gleichweise 4,8 mg Verbindung S gefunden ; das Dihydroxy-pregnenolon war aus allen   Kulturen. völlig   verschwunden. 



   Beispiel 2 : Zu je 100 ml der auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellten Kultur wurden je 16 mg   17 a, 21- Dihydroxy-pregnenolon zugesetzt ;   ausserdem wurden einem der Kolben gleichzeitig mit dem Steroid auch 100 ml Dichloräthan zugegeben. Nach 4 h Schütteln wurde nach der Chromo- 
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 bindung S festgestellt, während in der ohne organisches Lösungsmittel bereiteten Kultur eine Konversion von   74%   festgestellt wurde. Dihydroxy-pregnenolon war in keinem der Kolben nachweisbar. 



   Beispiel 3 : Zu je 100 ml der auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellten Kultur wurden je 16 mg   17a,   21-Dihydroxy-pregnenolon und 100 ml der nachstehend angegebenen organischen Lösungsmittel zugesetzt : 
 EMI4.3 
 
<tb> 
<tb> Kolben <SEP> A <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> Gemisch <SEP> von <SEP> Chloroform <SEP> und <SEP> Kohlenstofftetrachlorid
<tb> Kolben <SEP> B <SEP> : <SEP> Chloroform
<tb> Kolben <SEP> C <SEP> : <SEP> Dichlormethan
<tb> Kolben <SEP> D <SEP> : <SEP> Dichloräthan. <SEP> 
<tb> 
 
Nach 8 h Schütteln wurden in den einzelnen Kolben die nachstehenden Konversionen zur Reichstein'schen Verbindung S gefunden : 
 EMI4.4 
 
<tb> 
<tb> Kolben <SEP> A <SEP> : <SEP> 96% <SEP> 
<tb> Kolben <SEP> B <SEP> : <SEP> 821o <SEP> 
<tb> Kolben <SEP> C: <SEP> 79gO <SEP> 
<tb> Kolben <SEP> D <SEP> :

   <SEP> 99%. <SEP> 
<tb> 
 

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     Beispiel 4 :   Der Einfluss von verschiedenen Lösungsmitteln auf die Bildung der Reichstein'schen Substanz S wurde in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise untersucht. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten : 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> Konversion <SEP> zur <SEP> Reichstein'schen
<tb> Substanz <SEP> S <SEP> nach <SEP> stündigem
<tb> Verwendetes <SEP> Lösungsmittel <SEP> : <SEP> Schütteln <SEP> : <SEP> 
<tb> Dichloräthan <SEP> 1000/0
<tb> Trichloräthylen <SEP> 94%
<tb> Benzol <SEP> 86%
<tb> Toluol <SEP> 95%
<tb> Monochlorbenzol <SEP> 64%
<tb> Methylacetat <SEP> 31, <SEP> 40/0 <SEP> 
<tb> Äthylacetat <SEP> 42, <SEP> 5%
<tb> Butylacetat <SEP> 87, <SEP> 5%
<tb> n-Butylalkohol <SEP> 5% <SEP> 
<tb> Methylisobutylketon <SEP> 66, <SEP> 5%
<tb> Äthyläther <SEP> 100%
<tb> Nitromethan <SEP> 21%
<tb> 
 
Beispiel 5 :

   Die nach Beispiel 1 hergestellten Kulturen wurden mit in je 1 ml Aceton gelöstem 20 mg Methylandrostendiol versetzt ; die einzelnen Kulturen wurden nach Ablauf der in der nachstehenden Tabelle angegebenen Zeitintervalle mit je 2 x 0,5 Vol. Chloroform extrahiert und dann wurde in den Extrakten die Menge des entstandenen Methyltestosterons durch quantitative Papierchromatographie bestimmt.

   Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten : 
 EMI5.2 
 
<tb> 
<tb> Konversion <SEP> zu <SEP> MethylZeitdauer <SEP> der <SEP> Umsetzung <SEP> : <SEP> testosteron <SEP> in <SEP> 0/0 <SEP> : <SEP> 
<tb> 4h <SEP> 27
<tb> 8h <SEP> 43
<tb> 12 <SEP> h <SEP> 43
<tb> 16 <SEP> h <SEP> 59
<tb> 24 <SEP> h <SEP> 74
<tb> 
 
Beispiel 6 : Es wurde in der im Beispiel 5 beschriebenen Weise vorgegangen, mit dem Unterschied, dass je 20 mg Dehydroepiandrostenon den Kulturen zugesetzt wurden. 
 EMI5.3 
 
<tb> 
<tb> 



  Konversion <SEP> zu <SEP> #4-AndroZeitdauer <SEP> der <SEP> Umsetzung: <SEP> stendion <SEP> in <SEP> %:
<tb> 4h <SEP> 49
<tb> 8h <SEP> 63
<tb> 12h <SEP> 62 <SEP> 
<tb> 
 
Beispiel 7 : Es wurde in der im Beispiel 5 beschriebenen Weise vorgegangen, mit dem Unterschied, dass je 20 mg Pregnenolon den Kulturen zugesetzt wurden. 
 EMI5.4 
 
<tb> 
<tb> Zeitdauer <SEP> der <SEP> Umsetzung <SEP> : <SEP> Konversion <SEP> zu <SEP> Progesteron <SEP> : <SEP> 
<tb> 4 <SEP> h <SEP> 151o <SEP> 
<tb> 8 <SEP> h <SEP> 131o <SEP> 
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

   Tabelle   (Fortsetzung) 
 EMI6.1 
 
<tb> 
<tb> Zeitdauer <SEP> der <SEP> Umsetzung <SEP> : <SEP> Konversion <SEP> zu <SEP> Progesteron <SEP> : <SEP> 
<tb> 12h <SEP> 24% <SEP> 
<tb> 16h <SEP> 60% <SEP> 
<tb> 
 
Beispiel 8 :

   Es wurde in der im Beispiel 5 beschriebenen Weise vorgegangen, mit dem Unterschied, dass je 20 mg Pregnadienolonacetat den Kulturen zugesetzt wurde : 
 EMI6.2 
 
<tb> 
<tb> Konversion <SEP> zu <SEP> A-DehydroZeitdauer <SEP> der <SEP> Umsetzung <SEP> : <SEP> progesteron <SEP> in <SEP> 0/0 <SEP> : <SEP> 
<tb> 4h <SEP> 8
<tb> 8h <SEP> 12
<tb> 12 <SEP> h <SEP> 49
<tb> 
 
Beispiel 9 : Zu je 100 ml der nach Beispiel 1 hergestellten Kultur des Stammes Streptomyces K-451 wurden je 20 mg der Reichstein'schen Substanz S in der Form von Acetat zugesetzt. Nach 8stündiger Inkubation wurden die Kulturen mit 0,25 Vol. Dichloräthan extrahiert und nach Abtrennen der organischen Phase wurde das Mycel in der mit dem organischen Lösungsmittel gesättigten Fermentationsflüssigkeit aufgeschlämmt.

   Zu den derart erhaltenen zwei adaptierten Kulturen   (A und B) von je 100 ml   wurden je 20 mg der Substanz R zugesetzt. Die Kultur A wurde in diesem Zustand wieder auf den Schüt- 
 EMI6.3 
   39% igen Konversion   gebildet wurde. 



   Beispiel 10 : Von drei Portionen (A, B und C) zu je 200 ml der nach Beispiel 1 erhaltenen Kultur des Stammes Streptomyces K-451 wurde das Mycel durch Zentrifugieren getrennt und in je 200 ml sterilem Wasser suspendiert. Die Suspensionen A und B wurden mit 10 mg Acetat der Reichstein'schen Substand S versetzt und nach 12stündiger Inkubation wurde die Menge der anwesenden Reichstein'schen Substanz S papierchromatographisch bestimmt ; es wurde 6,8 mg Reichstein'sche Substanz S gefunden. Der pH-Wert der Suspension B und der unbehandelten Suspension C wurde mit 2N Na   PO   4 auf 8,5 eingestellt. Beide Suspensionen wurden mit je 4,4 ml Dichloräthan versetzt ; diese Lösungsmittelmenge genügt zur Sättigung der wässerigen Phase mit diesem organischen Lösungsmittel. Beiden Suspensionen wurden dann je 40 mg Substanz R zugesetzt.

   Nach 16 h Schütteln bei 280 C wurden die Kulturen mit je 200 ml Dichloräthan extrahiert und die Menge der entstandenen Reichstein'schen Substanz S wurde durch quantitative Papierchromatographie bestimmt. In der Kultur B wurden 35,2 mg der Reichstein'schen Substanz S gefunden ; nach Abrechnung der aus dem zugesetzten S-Acetat entstandenen Menge ergibt sich also, dass 28,4 mg Reichstein'sche Substanz S aus der zugesetzten Substanz R erhalten wurde, was einer   89% gen   Konversion entspricht. Demgegenüber konnte in der nicht adaptierten Kultur C nur 2, 4 mg Reichstein'sche Substanz S gefunden werden, was einer Konversion von lediglich 7,   50/0   entspricht. 



   Beispiel 11 : 200 ml einer nach Beispiel 1 hergestellten, aber am Nährboden   D   gezüchteten Kultur des Stammes Streptomyces K-451 wurde abzentrifugiert und das Mycel in gleichem Volumen sterilem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde mit 10 mg Acetat der Reichstein'schen Substanz S versetzt und die Kultur 12 h lang adaptiert. Dann wurde der pH-Wert der Suspension mit 2 N Na PO auf 8,5 eingestellt und 4,4 ml Dichloräthan wurden zugesetzt. Die Suspension wurde in zwei Teile geteilt und in 100 ml wurde die Menge der während des Adaptierens entstandenen Reichstein'schen Substanz S bestimmt ; es wurden 3,2 mg dieses Produktes gefunden. Den übrigen 100 ml wurden 20 mg Substanz R zugesetzt und nach 14stündiger Inkubation wurde durch quantitative Papierchromatographie die Bildung von 18,6 mg Reichstein'scher Substanz S nachgewiesen.

   Wenn man davon die aus dem Acetat der Reichstein'schen Substanz S stammenden   3, 2mg   abrechnet, ergibt sich, dass aus der Substanz R 15, 4 mg Reichstein'sche Substanz S gebildet wurden, was einer   zuigen   Konversion entspricht.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung von - 3 - Keto - steroiden durch mikrobiologische Umsetzung von #5-3ss-Hydroxy-steroiden, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass man die umzusetzenden #5-3ss-Hy- droxy-steroide in Gegenwart von mit Wasser nicht mischbaren apolaren Lösungsmitteln mit einer Kultur des Mikroorganismenstammes Streptomyces K-451 (hinterlegt bei dem Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen unter Nr. 20/1962. OKI) behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von/14 -3-Keto-steroiden durch mikrobiologische Umsetzungvon in der Stellung 3 und/oder 21 durch Estergruppen substituierte #5-3ss-Hydroxy-steroide, d a - durch gekennzeichnet, dass man die zur Durchführung der mikrobiologischen Umsetzung anzuwendende Kultur des Stammes Streptomyces K-451 vorher in Gegenwart eines Estergruppen enthaltenden Steroids adaptiert, und bei der Umsetzung die mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel lediglich in einer zur Sättigung des wässerigen Kulturmediums erforderlichen Menge anwendet. EMI7.1 als umzusetzenden Ausgangsstoff verwendet und #4-Androsten-dion als Produkt erhält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Methylandrostendiol als umzusetzenden Ausgangsstoff verwendet und Methyltestosteron als Produkt erhält.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Pregnenolon als umzusetzenden Ausgangsstoff verwendet und Progesteron als Produkt erhält.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man A-Pregnadienolon als umzusetzenden Ausgangsstoff verwendet und A-Dehydro-progesteron als Produkt erhält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man 16/X, 17/X-Oxydo-pre- gnenolon als umzusetzenden Ausgangsstoff verwendet und 16cl, 17 < x-Oxydo-progesteron als Produkt erhält.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man 17α, 21-Dihydroxy-pregnenolon als umzusetzenden Ausgangsstoff verwendet und 17Oc, 21-Dihydroxy-A*-pregnen-3, 20-dion als Produkt erhält.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultur mit 17α-Hydroxy-21-acetoxy-#4-pregnen-3,20-dion adaptiert, und 17a, 21-Dihydroxy-A4-pregnen-3, 20-dion als Produkt erhält.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass man 17α-Hydroxy-3ss,21-diacetoxy-#5-pregnen-20-on als umzusetzenden Ausgangsstoff verwendet und 17c 21-Dihydroxy-A4-pregnen-3, 20-dion als Produkt erhält.