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Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin auf fermentativem Wege unter Verwendung eines neuen Streptomyces-aureofaciens-Stammes.
Es wurden schon verschiedene Methoden zur Förderung der Fähigkeit von Streptomyceten, Antibiotika zu erzeugen, vorgeschlagen. In erster Linie wurden fUr diesen Zweck verschiedene Bestrahlungsmethoden verwendet (USA-Patentschrift Nr. 2, 545, 572, J. Bact. 56 [1948], S. 457), jedoch wurden zur Erzielung einer Mutation auch einige chemische Verbindungen vorgeschlagen, z. B. salpetrige Säure
EMI1.1
Streptomyceten erfolgreich angewendet werden, in andern Fällen wird die Produktionsfähigkeit lediglich um etwa 10-20% erhöht.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Antibiotikum-Produktionsfähigkeit von Strepto-
EMI1.2
EMI1.3
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mel verwenden, z. B. Nitrofuraldehyd-diacetat.
Es ist vorteilhaft, wenn man zur Erzielung der Mutation das Nitrofuranderivat in einer Konzentration von 1, 0 bis 20, 0 y/ml verwendet. Weiters empfiehlt es sich, die Mutation in Gegenwart von Säureamiden durchzuführen, welche in einer Menge von 0, 01 bis 0, 5 Vol.-%, berechnet auf das Nährmedium, verwendet werden. So kann man z. B. zweckmässig Dimethylformamid verwenden. Die als mutagene Agenten verwendeten Verbindungen werden zweckmässig in Säureamid gelöst, worauf die so erhaltene Lösung unter sterilen Bedingungen bei etwa 600C zu dem sterilen Nährmedium gegeben wird. Als Nährmedium kann man vorteilhaft Agar in erstarrtem Zustand verwenden.
Die Sporen des Stammes werden in einem synthetischen flüssigen Nährmedium unter submersen Bedingungen etwa 6 - 14 h kultiviert, worauf die Suspension der bereits keimenden Sporen auf das in oben beschriebener Weise vorbereitete Nährmedium geimpft wird. Nach dem Beimpfen wird das Nährmedium zweckmässig bei einer Temperatur von etwa 28 C 12 - 20 Tage lang inkubiert, worauf die entwickelten Kulturen in bekannter
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Weise auf ein festes Nährmedium isoliert werden. Die antibiotische Aktivität der so erhaltenen Stämme kann in Schüttelkulturen untersucht werden.
So wurden z. B. mit der oben beschriebenen Methode Streptomyces-aureofaciens-und Streptomyces-rimosus-Stämme als Testmikroorganismen verwendet, worauf die Mutationsfrequenz aus der Zahl der Rückmutationen, berechnet auf die Ausgangssporenzahl (Appl. Microbiol. 6 1958, S. 45), bestimmt wurde und zu den folgenden Ergebnissen führte :
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<tb>
<tb> Spontane <SEP> I. <SEP> II. <SEP> 1II.
<tb> Rück- <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP>
<tb> mutation <SEP> y/ml <SEP> y/ml <SEP> y/ml
<tb> . <SEP> 10-6 <SEP> 10'. <SEP> 10-6. <SEP> 10-6 <SEP>
<tb> S. <SEP> aureofaciens
<tb> N-4 <SEP> met <SEP> 1- <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> S. <SEP> aureofaciens
<tb> N-9 <SEP> met <SEP> 3- <SEP> 0, <SEP> 041 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> S.
<SEP> aureofaciens
<tb> N-11 <SEP> met <SEP> 0,088 <SEP> 0,3 <SEP> 0,2 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2
<tb> am <SEP> 2S. <SEP> rimosus
<tb> N-41 <SEP> am <SEP> 1 <SEP> 0,062 <SEP> 4,8 <SEP> 3,1 <SEP> 2,2 <SEP> 2,6 <SEP> 2,0 <SEP> 1,1 <SEP> 0,5 <SEP> 0,5 <SEP> 0,1
<tb>
EMI2.2
<tb>
<tb> I <SEP> = <SEP> 1-(5-Nitrofurfuryliden-amino)-2-imidazolidinthion
<tb> II <SEP> = <SEP> 5-Nitro-2-fuialdehyd-ssmicarbazon
<tb> III <SEP> = <SEP> N- <SEP> (5-Nitro-2-fürfuryliden)-l-amino-hydantoin <SEP>
<tb>
Aus obiger Tabelle ist ersichtlich, dass die Verbindungen im Falle von verschiedenen Streptomyceten eine mutagene Aktion ausüben.
Für diesen Zweck können folgende Stämme verwendet werden : Streptomyces aureofaciens, S. rimosus, S. antibioticus, S. erythreus, S. fradiae, S. flavoalbus, S. griseus, S. hygroscopicus, S. noursei, S. niveus usw. sowie auch weitere Streptomyces-Stämme, welche Antibiotika produzieren.
Die neuen Mutanten, welche in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurden, zeichnen sich bei der Fermentation besonders aus. So wird z. B. im Falle des Streptomyces-aureofaciens-Stammes CDSD-314 (s. deutsche Auslegeschrift 1128599) diese Methode erfolgreich verwendet. Es ist bekannt, dass dieser Stamm fähig ist, auf einem chloridhaltigen Nährboden lediglich Tetracyclin zu synthetisieren, weil durch das Ausschalten des Chlorierungsmechanismus die Biosynthese von Chlortetracyclin nicht eintritt. Zur Zeit des Auffindens dieses Stammes konnte mit dem Stamm CDSD-314 ein Gehalt von 2000 bis 2500 E/ml Tetracyclin in der Fermentbrühe erzielt werden.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin durch aerobe, submerse Fermentation mit Stämmen von Streptomyces aureofaciens, das dadurch gekennzeichnet ist, dass für die Fermentation der neueStreptomyces-aureofaciens-Stamm A-802934 (deponiert beim Staatlichen Institut für Hygiene in Budapest unter Nr. 640307. 26) oder Varianten oder Mutanten dieses Stammes verwendet werden und gegebenenfalls aus dem erhaltenen Fermentationsmedium Tetracyclin isoliert wird.
Der neue Stamm A-802934 kann nach dem eingangs beschriebenen Verfahren aus S. aureofaciens CDSD-314 gewonnen werden. Wenn man den neuen Stamm A-802934 bzw. Varianten oder in bekannter Weise hergestellte Mutanten desselben fermentiert, so wird eine bedeutende Erhöhung der Antibiotikum-Synthese im Vergleich mit dem Ausgangsstamm CDSD-314 beobachtet.
Im einzelnen wurde der neue Stamm folgendermassen hergestellt :
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EMI3.2
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EMI3.4
EMI3.5
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 2, <SEP> 5%
<tb> KHPO <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP>
<tb> (NH <SEP> SO4 <SEP> 0, <SEP> 3%
<tb> CaCO <SEP> 0, <SEP> 3%
<tb> PH <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> ;
<tb>
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EMI3.7
EMI3.8
EMI3.9
EMI3.10
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1- (5-Nitrofurfuryliden-amino) -2-imidazolidin-thionSaccharose-Nitrat-Agar (Zusammensetzung :
EMI4.1
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Dikaliumhydrophosphat <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat. <SEP> 7 <SEP> HO <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Ferrosulfat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g <SEP>
<tb> Agar <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> pH <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 0-7, <SEP> 3.) <SEP>
<tb>
Schwaches Wachstum. Entwickelt lediglich vegetative Mycelien, die eine bräunliche Farbe aufweisen. Luftmycelien fehlen, Sporen werden nicht entwickelt.
Saccharose-Ammonium-Agar (Zusammensetzung : s. Saccharose-Nitrat-Agar, jedoch mit Ammoniumchlorid an Stelle von Natriumnitrat.)
Mittelstarke Wachstumsintensität. Die vegetativen Mycelien sind hellbraun. Keine löslichen Pigmente. Nach langer Kultivierung schwache Luftmycelien- und Sporenentwicklung.
Glucose- Asparagin- Agar (Zusammensetzung :
EMI4.2
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb> Asparagin <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dikaliumhydrophosphat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> m1
<tb> PH <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 8.) <SEP>
<tb>
Wachstum : s. Saccharose-Nitrat-Agar.
Glycerin- Asparagin- Agar : (Zusammensetzung :
EMI4.3
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Asparagin <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Dikaliumhydrophosphat <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> PH <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 0, <SEP> mitNaOH.) <SEP>
<tb>
Wachstum wie im Falle von Saccharose-Ammonium-Agar.
Glycerin-Calciummalat-Agar : (Zusammensetzung :
EMI4.4
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb> Calciummalat <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Ammoniumchlorid <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Dikaliumhydrophosphat <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml.)
<tb>
Kein Wachstum. Glucose-Pepton-Agar : (Zusammensetzung :
EMI4.5
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 40,0 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> m1
<tb> PH <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 6.) <SEP>
<tb>
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Wachstum gut. Vegetative Mycelien braun. Lösliche Pigmente schwach braun. Schwache Entwicklung von Luftmycelien, keine Sporenentwicklung.
Nähr-Agar : (Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Pepton <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb> Fleischextrakt <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> m1
<tb> PH <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 7, <SEP> 4.) <SEP>
<tb>
Wachstum schwach. Die vegetativen Mycelien sind hellbraun, gelblich. Keine Luftmycelien. Keine Sporenentwicklung.
Stärke-Agar : (Zusammensetzung :
EMI5.2
<tb>
<tb> lösliche <SEP> Stärke <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Natriumnitrat <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> Dikaliumhydrophosphat <SEP> 0,3 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Magnesiumcarbonat <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml.)
<tb>
Kein Wachstum.
Glycerin-Stärke-Glutamat-Agar : (Zusammensetzung :
EMI5.3
<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb> Natriumglutamat <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb> Stärke <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Prolin <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> Vitamin <SEP> B, <SEP> Vitamin <SEP> Bg, <SEP>
<tb> Calciumpantothenat <SEP> 25 <SEP> - <SEP> 35 <SEP> mg <SEP>
<tb> Dikaliumhydrophosphat <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g <SEP>
<tb> Ferrosulfat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g <SEP>
<tb> Agar <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> m1
<tb> PH <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 2.) <SEP>
<tb>
Wachstum mittelmässig. Vegetative Mycelien braun. Sehr schwache Entwicklung von bräunlichen, löslichen Pigmenten. Keine Luftmycelien. Keine Sporenentwicklung.
Gelatine : (Zusammensetzung :
EMI5.4
<tb>
<tb> Gelatine <SEP> 200 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> m1
<tb> PH <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 4.) <SEP>
<tb>
Verflüssigt die Gelatine. Auf der Oberfläche der Gelatine erscheint ein brauner Kreis, in welchem dunkelbraune lösliche Pigmente zu beobachten sind.
Glucose-Hefeextrakt-Fleischextrakt-Pepton-Agar : (Zusammensetzung :
EMI5.5
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb> Fleischextrakt <SEP> 4,0 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 4,0 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml.)
<tb>
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Wachstum intensiv. Vegetative Mycelien rotbraun. Lösliche Pigmente rotbraun. Luftmycelienentwicklung schwach, Sporenentwicklung mittelmässig. Die Sporenschicht wird im Laufe einer längeren Kultivierung schwachbraun.
Kartoffelextrakt-Pepton-Glycerin- Agar : (Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Kartoffelextrakt <SEP> aus <SEP> 100 <SEP> g
<tb> Kartoffeln
<tb> Pepton <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Glycerin <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Dikaliumhydrophosphat <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> Ferrosulfat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g <SEP>
<tb> Agar <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> Wasserleitungswasser <SEP> 1000 <SEP> ml.)
<tb>
Wachstum intensiv. Vegetative Mycelien dunkelbraun, fast schwarz. Eine intensive Entwicklung von dunkelbraunen löslichen Pigmenten. Luftmycelien keine. Sporenentwicklung keine.
Maisquellwasser-Agar (Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser, <SEP> bis <SEP> 50% <SEP> 6,5 <SEP> g
<tb> Kaliumdihydrophosphat <SEP> 4,0 <SEP> g
<tb> Ammoniumphosphat <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 5,0 <SEP> g
<tb> pH <SEP> = <SEP> 6,6. <SEP> )
<tb>
Wachstum intensiv. Die vegetativen Mycelien sind braun und entwickeln braune, lösliche Pigmente. Luftmycelien weiss. Sporenentwicklung stark. Die Sporenschicht ist anfänglich rosafarben-hellgrau, später braun.
Cellulose-Aktivität : nicht messbar.
Lipase-Aktivität : sehr stark.
Der Stamm A-802934 bzw. die bekannterweise hergestellten Hereditären derselben können auf einem Nährboden gezüchtet werden, welcher als Kohlenstoffquelle Saccharose, Stärke, Maismehl, Haselnussmehl, Fette oder Öle, z. B. Palmöl, enthält. Als Stickstoffquellen kann man Maisquellwasser,
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Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Mangansulfat, enthält. Der PH-Wert des Nährbodens beträgt vor dem Beimpfen 6, 3-7, 0, zweckmässig 6, 5. Die Fermentation wird bei 25 - 35C, zweckmässig bei 28 C, durchgeführt. Man kann aber auch so verfahren, dass man bei 27 - 280C fermentiert und am Ende der Fermentation die Temperatur auf 30 - 320C hebt. Die Zeitdauer der Fermentation beträgt im allgemeinen 70 - 90 h, meistens 80 h.
Die Aufarbeitung des Stammes gemäss der Erfindung erfolgt durch Ansäuern des Fermentmediums auf PH = 1 - 4 und Filtrieren der Mycelien. Es ist ein Vorteil des neuen Stammes, dass die Aufarbeitung der Fermentbrühe kein Problem bereitet, da die Mycelien leicht filtriert werden können. Aus dem Filtrat kann das Tetracyclin nach den Methoden isoliert werden, die bei den Stämmen gebraucht wurden, welche weniger Tetracyclin produzieren ; die grössere Einheitszahl erschwert die Isolierung nicht, sondern wirkt vorteilhaft. Es ist z. B. zweckmässig, das Tetracyclin in Form seiner mit Tetranol gebildeten Additionsverbindung zu isolieren.
Weitere Einzelheiten des Verfahrens sind in den Beispielen zu finden.
Beispiel l : Der Streptomyces-aureofaciens-Stamm A-802934 wird auf einem festen Nährboden gezüchtet, worauf aus der entwickelten Sporenkultur 50 ml eines sterilen Inokulum-Nährbodens in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben beimpft werden. Zusammensetzung des festen Nährbodens :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (feucht) <SEP> 0, <SEP> 65%
<tb> Saccharose <SEP> 1, <SEP> 0%
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 4%
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 0, <SEP> 2%
<tb> MgSO4 <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Agar <SEP> 2, <SEP> 0%
<tb> pH <SEP> = <SEP> 6. <SEP> 6.
<tb>
Zusammensetzung des Inokulum-Nährbodens :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (feucht) <SEP> 2,0%
<tb> Saccharose <SEP> 2, <SEP> 0%
<tb> CACO <SEP> 0, <SEP> 2%
<tb> (NHS04 <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> MgSO4 <SEP> 0, <SEP> 25% <SEP>
<tb> PH <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 5. <SEP>
<tb>
EMI7.3
folgender Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (feucht) <SEP> 1, <SEP> 6% <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 3, <SEP> 0%
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 0, <SEP> 7%
<tb> CaCOg <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> PH <SEP> =6. <SEP> 5. <SEP>
<tb>
Es wird bei einer Lufteinfuhr von 6 l/min unter Umrühren mit 440 Umdr/min bei 280C 36 h lang inkubiert. 300 ml der entwickelten Kultur werden in 6 I eines Fermentations-Nährbodens übertragen (12 1-Glasfermentor), worauf 88 h lang, wie oben beschrieben, fermentiert wird. Zusammensetzung des Fermentations-Nährbodens :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (feucht) <SEP> 2,5%
<tb> Stärke <SEP> 6, <SEP> 0%
<tb> Haselnussmehl <SEP> 1, <SEP> 5%
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 0,8%
<tb> CaCO3 <SEP> 0, <SEP> 9%
<tb> MnSO4 <SEP> 0, <SEP> 014%
<tb> Palmöl <SEP> 0, <SEP> 50/0 <SEP>
<tb> PH <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 5. <SEP>
<tb>
Der Chloridgehalt des Nährbodens beträgt 310 y/ml. Im Laufe der Fermentation wird der Tetracyclingehalt des Mediums bestimmt :
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<tb>
<tb> Stunden <SEP> 40 <SEP> 64 <SEP> 70 <SEP> 88
<tb> E/ml <SEP> 2500 <SEP> 6300 <SEP> 8550 <SEP> 10450
<tb>
10 l des so erhaltenen Fermentmediums werden durch Zusetzen von konzentrierter Salzsäure auf PH = 2, 2 eingestellt und filtriert. 1 l einer 10%igen MgCl-Lösung wird zugesetzt, worauf mit einer 20loigen NaOH-Lösung der PH- Wert auf 10 eingestellt wird. Der ausgefallene Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. 250 g des trockenen Komplexes werden in 125 ml Wasser suspendiert, worauf in kleinen Portionen eine Lösung von 125 g (NH4)2SO4 unter Umrühren zugesetzt wird.
Nach einer vollständigen Lösung wird die wässerige Lösung zweimal (250 + 150 ml) mit n-Butanol je l h lang extrahiert. Die Butanolphase wird mit 5 g Lignin versetzt, worauf 50 ml Methanol zugegeben werden. Nach Umrühren während 30 min wird filtriert. Hierauf wird mit 75 ml 2n-Salzsäure und 75 ml
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EMI8.2
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 2, <SEP> 50/0
<tb> KHPO4 <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP>
<tb> (NHSO4 <SEP> 3% <SEP>
<tb> CaCO <SEP> 0, <SEP> 3%
<tb> PH <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 0. <SEP>
<tb>
(100 ml in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben)
Nach einer Inkubation von 8 h wird die keimende Sporensuspension mit einer 100fachen Verdünnung auf einen Nährboden übertragen, welcher mutagene Agentien enthält. Zusammensetzung des Nährbodens :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (feucht) <SEP> 0, <SEP> 65%
<tb> Saccharose <SEP> 1, <SEP> 0%
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,4%
<tb> (NHSO4 <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP>
<tb> MgSO <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Agar <SEP> 2, <SEP> 0%
<tb> PH <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 6. <SEP>
<tb>
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Es wird bei 280C 16 h lang inkubiert, nachdem bei 600C unter sterilen Bedingungen so viel 1- (5- -Nitrofurfuryliden-amino)-2-imidazolidinthion in einer Lösung von Dimethylformamid zugesetzt wird, dass die Konzentration dieser beiden Stoffe, auf den Nährboden berechnet, 2, 5 y/mibzw. 0, 05% beträgt. Nach erfolgter Inkubation wird mit der entstandenen Sporenkultur ein fester Nährboden obiger Zusammensetzung und ebenfalls die mutagenenAgentien enthaltend beimpft, wobei der Stamm A-801500 erhalten wird. Die antibiotische Aktivität dieses Stammes kann z. B. folgendermassen bestimmt werden :
Mit der Sporenkultur wird ein 50 ml steriler Vorinokulum-Nährboden in einem 500 ml-ErlenmeyerKolben beimpft.
Zusammensetzung des Nährbodens :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (feucht) <SEP> 2, <SEP> 0%
<tb> Saccharose <SEP> 2, <SEP> 0%
<tb> CaCO3 <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 0,1%
<tb> KH2PO4 <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP>
<tb> MgSO4 <SEP> 0, <SEP> 25%
<tb> PH <SEP> = <SEP> 6,5.
<tb>
Die Kultur wird 24 h lang bei 280C auf einem Schütteltisch (320 Umdr/min) inkubiert, worauf 5 ml der entwickelten Kultur in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben auf 50 ml sterilen Inokulum-Nährboden folgender Zusammensetzung übertragen werden :
EMI9.2
<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (feucht) <SEP> 1, <SEP> 6%
<tb> Saccharose <SEP> 3, <SEP> Wo
<tb> (NHSO <SEP> 0, <SEP> 7%
<tb> CaCO3 <SEP> 0,5%
<tb> Palmöl <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> PH <SEP> = <SEP> 6,5.
<tb>
Nach einer 24stündigen Züchtung bei 280C auf einem Schütteltisch werden 5 ml der Kultur in 50 ml eines sterilen Fermentations-Nährbodens übertragen (500 ml-Erlenmeyer-Kolben). Zusammensetzung des Nährbodens :
EMI9.3
<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> (feucht) <SEP> 2, <SEP> 5%
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 0,8%
<tb> Stärke <SEP> 6, <SEP> 0%
<tb> Haselnussmehl <SEP> 1, <SEP> 5%
<tb> CaCOg <SEP> 0, <SEP> 9"/0 <SEP>
<tb> MINS04 <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 014"/0 <SEP>
<tb> Palmöl <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP>
<tb> PH <SEP> = <SEP> 6,5.
<tb>
Der beimpfte Nährboden wird bei 280C auf einem Schütteltisch inkubiert. Nach 96 h wird der Te-
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Agar-Nährboden der neue Stamm A-802934 isoliert. Antibiotische Aktivität 6200 E/ml.
Der Streptomyces-aureofaciens-Stamm A-802934 wird auf den im ersten Absatz angegebenen festen Nährboden geimpft, wofür die entsprechend verdünnte Sporensuspension verwendet wird. Aus dieser Kultur wird durch natürliche Selektion der Stamm A-116007 isoliert, dessen antibiotische Aktivität 7300 E/ml beträgt.
Die nachstehenden Versuche beweisen die Tatsache, dass die in Gegenwart von Nitrofuranverbindungen durchgeführte Mutation bei der Herstellung des gemäss den Beispielen verwendeten Stammes nicht zufällig ist, sondern nach Reproduktion dieses Verfahrens mit andern Nitrofuranen weitere neue Stämme mit hoher Tetracyclinproduktivität liefert.
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Die Sporen des Streptomyces-aureofaciens-Stammes C-81305 werden, wie im Beispiel 4 beschrieben, einer mutagenen Behandlung unterworfen, jedoch werden in den festen Nährboden 2, 5 y/ml 5-Ni- tro-2-furaldehyd-semicarbazon und 0, 05% Dimethylformamid gegeben. Aus der 16tägigen Kultur wird durch Übertragung der Stamm A-801700 isoliert, dessen antibiotische Aktivität 4600 E/ml beträgt (Bestimmung wie im Beispiel 4). Wenn man das mutagene Verfahren wiederholt, steigt die antibiotische Aktivität ähnlich, wie in Beispiel 4 angegeben wurde.
Sporen des Stammes Streptomyces aureofaciens C-81305 werden, wie in Beispiel 4 beschrieben, einer Mutation unterworfen, wobei im festen Nährboden 2, 5 y/ml N- (5-Nitro-2-furfuryliden)-1-amino- hydantoin und 0, 05% Dimethylformamid verwendet werden. Aus der 16tägigen Kultur wird durch Übertragung der Stamm A-801300 erhalten, dessen antibiotische Aktivität 4050 E/ml beträgt. Wenn man die Mutation wiederholt, steigt die antibiotische Aktivität, wie im Beispiel 4 beschrieben wurde.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin durch aerobe submerse Fermentation mit Stämmen von Streptomyces aureofaciens, dadurch gekennzeichnet, dass für die Fermentation der Streptomyces-aureofaciens-Stamm A-802934 (deponiert beim Staatlichen Institut für Hygiene in Budapest unter Nr. 640307.26) oder Varianten oder Mutanten dieses Stammes verwendet werden und gegebenenfalls aus dem erhaltenen Fermentationsmedium Tetracyclin isoliert wird.
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