AT264004B

AT264004B - Verfahren zur Reinigung von Moenomycin

Info

Publication number: AT264004B
Application number: AT855565A
Authority: AT
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1964-09-21
Filing date: 1965-09-20
Publication date: 1968-08-12

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Reinigung von Moenomycin 
Aus der deutschen Patentschrift Nr. 1113791 ist bekannt, dass man aus Kulturen des Streptomyces bambergiensis, S. ghanaensis, S. ederenses und S. geysiriensis sowie ihrer Varianten oder Mutanten ein neues, als Moenomycin bezeichnetes Antibiotikum gewinnen kann. 



   Das Antibiotikum ist wirksam gegen grampositive Erreger, insbesondere gegen Staphylokokken, die gegen Tetracyclin, Penicillin, Streptomycin, Novobiocin und Erythromycin resistent sind. So wirkt es beispielsweise schon in einer Konzentration von 0, 125 bis   0, 25 y/ml bakteriostatisch gegen   Staphylococcus aureus P 209. 



   Es wurde nun gefunden, dass man ein hochgereinigtes Produkt mit wesentlich verbesserter antibiotischer Wirksamkeit erhält, wenn man das aus dem Mycelextrakt isolierte Rohprodukt dialysiert, das Innendialysat in schwach saurem Medium mit einem polaren, wasser-unlöslichen   oder-schwerlöslichen   Lösungsmittel extrahiert, den Extrakt im Vakuum zur Trockne eindampft, in Wasser aufnimmt, die Lösung an Magnesiumsilikat adsorbiert, mit Methanol eluiert, das eluierte Produkt in bekannter Weise isoliert und dieses entweder a) der Adsorptionschromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches von niederen
Alkoholen und Ammoniak als Eluierlösung, oder b) der Chromatographie an vernetzten Dextran-Gelen mit Wasser als Elutionsmittel oder c) der Chromatographie an Ionenaustauschern auf Cellulosebasis mit Salzlösungen als Elutionsmit- teln unterwirft,

   aus dem Eluat das reine Moenomycin in bekannter Weise isoliert und gegebenen- falls mit basischen Mitteln in die Salzform überführt. 



   Als Lösungsmittel für die Extraktion des Innendialysats eignen sich vor allem Alkohole wie beispiels-   weisen-ButanolundIsoamylalkohol. ManarbeitetbeieinempH-Wertvon   2 bis 3, vorzugsweise 2,8 bis 3. 



   Als Magnesiumsilikat kommt vor allem das unter der Bezeichnung   Florisil R   im Handel erhältliche in Frage. 



   Das für die Adsorptionschromatographie verwendete Kieselgel hat zweckmässigerweise eine Korngrösse von 75 bis   400 Il,   Es empfiehlt sich, es vor der Verwendung durch Behandlung mit halbkonzentrierter Salzsäure, Waschen mit Wasser bis zur neutralen Reaktion und anschliessendes dreistündiges Erhitzen auf zirka 1300C zu aktivieren. 



   Als Elutionsmittel kommen bei diesem Verfahren verschieden zusammengesetzte Gemische von niederen Alkoholen, insbesondere n-Propanol und Isopropanol, mit niederen wässerigen Aminen, vorzugsweise Ammoniak, in Betracht. Bisweilen kann ein Zusatz von Puffersubstanzen, beispielsweise Boratoder Phosphatpuffer, angebracht sein. Die Mengenverhältnisse von Propanol und Ammoniak können in 

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 weiten Grenzen variieren. In der Regel enthält das Elutionsmittel 50 -90%, vorzugsweise 65 - 85% Propanol. Der verwendete Ammoniak ist vorzugsweise 2-normal, doch können auch Konzentrationen bis zu etwa 14 n verwendet werden. 



   Als Dextran-Gele haben sich die Handelsprodukte Sephadex G 25, G 50 und G 100 besonders bewährt. Geeignete Ionenaustauscher auf Cellulosebasis sind beispielsweise Ecteola$-Cellulose ( Epichlorhydrin-Triäthanolamin-Kondensationsprodukt derCellulose) oder DEAE-Cellulose   (mit Diäthylaminoätha-   nol verätherte Cellulose). Die zur Elution verwendeten Salzlösungen sind vorzugsweise   l-lOig ;   be-   sonders vorteilhaft   sind Bicarbonatlösungen, doch können auch Lösungen beliebiger anderer anorganischer Salze verwendet werden. 



   Die unter b) und c) beschriebenen Reinigungsmethoden können auch in beliebiger Reihenfolge kombiniert und/oder dem Verfahren gemäss a) vorangestellt werden. Reinigungseffekte können ferner mit folgenden Methoden erzielt werden :
1. Aussalzen aus konzentrierter wässeriger Lösung, beispielsweise durch Sättigen mit Ammonium- sulfat ;
2. Gegenstromverteilung,   z. B.   im System   n-Butanol/Mc   Ilvaine-Puffer beim PH-Wert   3-5 ;  
3. Verteilungschromatographie an geeigneten Adsorbentien, z. B. Kieselgur unter Verwendung des unter 2. genannten Systems ; 
4. präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel, beispielsweise mit dem System n-Pro- panol/2 n   NH,     70 : 30 ;  
5.

   Fällung mit Metallsalzen, insbesondere Salzen des Zink, Quecksilber, Aluminium, Kupfer,
Eisen, Kobalt, Nickel, Mangan. und Chrom, aus schwach alkalischem Medium. 



   Diese Methoden können vor oder nach der Dialyse oder der Adsorptionschromatographie an Magnesiumsilikat eingeschaltet werden. 



   Das derart gereinigte Moenomycin zeichnet sich durch folgende Charakteristika aus :
Die Verbindung ist eine schwach saure, amorphe Substanz, die mit organischen und anorganischen Basen Salze bildet. Sie ist stabil in neutraler, wässeriger und methanolischer Lösung, zersetzt sich jedoch langsam im sauren und alkalischen Medium. Das Natriumsalz von Moenomycin ist in trockener fester Form selbst nach 48stündigem Erhitzen auf   800C   noch stabil. Die Elementaranalyse zeigt folgende werte :
C   48, 5%, H 7, 3%,   N   5, 10/0,   P   1, 80/0,   der Rest besteht aus Sauerstoff. Die Substanz hat keinen de- 
 EMI2.1 
 Elektrophorese zeigt das Moenomycin in Pufferlösungen von    PR     1, 9   bis 7, 8 keine Wanderung, dagegen eine starke Anodenwanderung bei PH 9, 8.

   Die Papierchromatographie gibt folgende RF-Werte : 
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> System <SEP> RF
<tb> n-Butanol/Triäthylamin/
<tb> Methyl-isobutyl-keton/
<tb> Wasser <SEP> 14 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> Benzol/Eisessig/Wasser <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> n-Butanol/Eisessig/Wasser <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 88 <SEP> 
<tb> tert. <SEP> Butanol/Eisessig/
<tb> Wasser <SEP> 60 <SEP> : <SEP> 6 <SEP> : <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 
<tb> Butanol, <SEP> wassergesättigt <SEP> 0
<tb> sec. <SEP> Butanol/Eisessig/Wasser <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> 
 
Folgende Reaktionen sind negativ :
Ninhydrin, Binret, Fehling, Ehrlich, Sakaguchi, Anilinphthalat, Eisenchlorid. 



   Dagegen gibt Moenomycin mit Antimontrichlorid und Chlorsulfonsäure (als Sprühreagenzien) rotviolette Farbreaktionen und reagiert mit Kaliumpermanganat und   Perjodsäure/Schiffsreagenz.   Potentiometrische Titration ergibt ein Äquivalentgewicht von etwa 800 und einen PK-Wert von   4, 1.   Die   Molgewichtsbestimmung mittels Ultrazentrifuge und Lichtstreuungsmessung führt zu   Werten von   68 000   bis 

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 70000. Moenomycin ist nicht dialysierbar und kann mit Neutralsalzen,   z. B.   Ammoniumsulfat, aus neutraler wässeriger Lösung ausgesalzen werden. 



   Gegenüber dem in der deutschen Patentschrift Nr. 1113791 beschriebenen Moenomycin besitzt das nach den vorstehenden verfahren gereinigte Produkt eine erheblich stärkere antibiotische Wirksamkeit. 



  Das Wirkungsspektrum und die therapeutische Aktivität sind aus nachstehenden Tabellen ersichtlich. 



   Tabelle I 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Antibiotisches <SEP> Wirkungsspektrum
<tb> Testorganismus <SEP> Hemmung <SEP> (Bakteriostase)
<tb> beiy/ml
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> P <SEP> 209 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> tetracycline <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> streptomycin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> penicillin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> novobiocin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> erythromycin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 16
<tb> Corynebact.

   <SEP> diphtheria <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> mesentericus <SEP> 0, <SEP> 24. <SEP> 
<tb> 



  Bacillus <SEP> mycoides <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 
<tb> Enterococcus <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 188
<tb> Klebs. <SEP> thinoskleromatis <SEP> 94
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 23
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 94
<tb> Salm. <SEP> paratyph. <SEP> A <SEP> 188
<tb> Salm. <SEP> paratyph. <SEP> B <SEP> 188
<tb> Salm. <SEP> pullorum <SEP> 77
<tb> Shigella <SEP> flexneri <SEP> 47
<tb> Pasteurellaseptica <SEP> 35, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> Brucella <SEP> abortus <SEP> Bang <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Brucella <SEP> melitensis <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP> 
<tb> 
 

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 Tabelle II 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Therapeutische <SEP> Aktivität <SEP> von <SEP> Moenomycin <SEP> bei <SEP> mit <SEP> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> infizierten <SEP> Mäusen <SEP> 
<tb> Infektion <SEP> :

   <SEP> intraperitoneal
<tb> Behandlung <SEP> : <SEP> 3 <SEP> Dosen <SEP> Moenomycin <SEP> sofort,
<tb> 4 <SEP> und <SEP> 20 <SEP> h <SEP> nach <SEP> der <SEP> Infektion
<tb> Gesamtdosis <SEP> mg/kg <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Versuchstiere <SEP> Überlebende <SEP> Tiere <SEP> nach
<tb> 2 <SEP> Tagen <SEP> 10 <SEP> Tagen
<tb> 75 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 37, <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 20 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 10 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 6 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 
<tb> 3 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 
<tb> 0 <SEP> (Kontrolle) <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 
 (Die Herstellung des Impfmaterials erfolgte wie in der deutschen.

   Patentschrift Nr.   11137 91   ange- geben.) 
Bei Anwendung der oben unter a) beschriebenen Methode erzielt man gleichzeitig eine Trennung in drei antibiotisch aktive Komponenten, die im folgenden Moenomycin A, B und C genannt werden und gewünschtenfalls getrennt aufgefangen werden können. Sie sind einander chemisch sehr ähnlich und verhalten sich in bezug auf Löslichkeit, Säureeigenschaften, Molekulargewicht, papierchromatographisches Verhalten, Papierelektrophorese, Farbreaktionen und Stabilität wie der Moenomycin-Komplex. 



   Auch die biologischen Eigenschaften der Teilkomponenten unterscheiden sich nur unwesentlich von denen des Komplexes. Darüber hinaus sind die Komponenten durch folgende Daten charakterisiert :
Moenomycin A 
 EMI4.2 
 H po N 5,   3%   P   1, 80/0   0 Rest. 
 EMI4.3 
 
 EMI4.4 
 
 EMI4.5 
 
 EMI4.6 
 
184-1850C.Dünnschichtchromatographie : s. Tabelle m. 



  Moenomycin B Elementaranalyse (freie Säure) :   C 47, 81o  
H   7, 21o   
 EMI4.7 
 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 
 EMI5.1 
 
 EMI5.2 
 
 EMI5.3 
 ff1/oMoenomycin C   Elementaranalyse (frei Säure) :   C 49,1%
H   7, 4%  
N 5,   31a  
P 1, 7%
0 Rest 
 EMI5.4 
 
 EMI5.5 
 
 EMI5.6 
 
 EMI5.7 
 : 178 - 179OC.Dünnschichtchromatographie : s. Tabelle III. 



   Tabelle III 
 EMI5.8 
 
<tb> 
<tb> Dünnschichtchromatographisches <SEP> Verhalten <SEP> von <SEP> Moenomycin <SEP> A, <SEP> B <SEP> und <SEP> C <SEP> an <SEP> Kieselgel <SEP> G
<tb> R-Werte
<tb> Lösungsmittelsystem <SEP> Moenomycin <SEP> A <SEP> Moenomycin <SEP> B <SEP> Moenomycin <SEP> C
<tb> Isopropanol/2n <SEP> NHs <SEP> 70 <SEP> : <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 
<tb> Isopropanol/Wasser/Boratpuffer <SEP> PH <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> 70 <SEP> : <SEP> 25 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 
<tb> Äthanol/Wasser <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 0, <SEP> 77 <SEP> 
<tb> 
 
Beispiel 1 :

   a) Isolierung
Nach dem Abernten wird das nach dem Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1113791 gewonnene Mycel von der Fermentationslösung durch Zentrifugieren abgetrennt und unter Rühren mit 10   l   Methanol extrahiert. Das Methanol wird abfiltriert und der Rückstand nochmals mit 10   l   Methanol extrahiert. Die vereinigten Methanolextrakte werden unter vermindertem Druck bis zur Entfernung des Methanols eingedampft und die erhaltene wässerige Phase (zirka 500 ml)   mit Salzsäure   auf PH 3 eingestellt und zweimal mit je 500 ml n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird im Vakuum auf 100 ml eingedampft. 



  Beim Stehen im Kühlschrank fällt das rohe Moenomycin aus. Das Produkt wird abgesaugt, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet. Ausbeute 18 g. Das Rohprodukt kann aus der konzentrierten Butanollösung auch durch Ausfällung mit Äther oder Äthylacetat gewonnen werden. Das Produkt enthält etwa 20% Moenomycin (mikrobiologischer Test). b) Reinigung durch Dialyse und Chromatographie an Magnesiumsilicat
20 g Rohprodukt aus a) werden in 200 ml Wasser aufgeschlämmt, die Lösung mit 1 n NaOH auf pH 7 eingestellt, von ungelöstem Material abfiltriert und 3 Tage lang gegen fliessendes Leitungswasser dialysiert. Die im Dialysiergefäss verbliebene Lösung wird mit HCI auf PH 3 gestellt und zweimal mit je 250 ml n-Butanol extrahiert. Nach Einengen des Butanols im Vakuum wird das angereicherte Moenomyein wie bei a) durch Ausfrierung oder Fällung mit Äther gewonnen.

   Ausbeute   8,     5 g.   Das braune Produkt enthält   481o   Moenomycin. 



   Zur Entfernung der Hauptmenge des noch anwesenden braunen Farbstoffes wird das Rohprodukt in 100 ml Methanol gelöst, von unlöslichem Material abfiltriert und die Lösung auf eine Chromatographiesäule mit 80 g Magnesium-Trisilicat (Florisil R), das in Methanol suspendiert ist, aufgebracht. Die Elution erfolgt mit   l l   Methanol (Fraktion   1)   und 500 ml   80%obigem   wässerigem Methanol (Fraktion 2). 



  Aus Fraktion 1 werden beiAbdampfen des Lösungsmittels 5, 4 g Moenomycin als helles amorphes Pulver, 

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 aus Fraktion 2 noch 1, 3 g Moenomycin etwas geringerer Aktivität gewonnen. c) Reinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel 
 EMI6.1 
 
6gelöst und 100 g gereinigtes Kieselgel in dieser Lösung suspendiert. Nach Abdampfen des Wassers im Vakuum gibt man das trockene, aus Moenomycin und Kieselgel bestehende Pulver auf den Kopf der
Säule.

   Die Elution erfolgt nun mit folgenden   Lösungsmitteln :     I)   Isopropanol/2 n   NHg   100 : 20 (7 1)
II) Isopropanol/2 n   NH,   90 : 20   (5,     5 1)  
HI) Isopropanol/2 n   NH,   80 : 20 (5, 0 1)
IV) Isopropanol/2 n NHs 80 : 30 (15, 0 1) 
Mit den Lösungsmittelsystemen   I - III   werden Verunreinigungen und Farbstoffe herausgewaschen, während mit System IV das Moenomycin eluiert wird. Man fängt Fraktionen von 500 ml auf und weist in ihnen das Vorhandensein von Moenomycin durch   dünnschichtchromatographische   Analyse nach.

   Hiefür werden mit Kieselgel beschichtete Glasplatten verwendet, als Laufmittel dient das System Isopro-   panol-2 nNHs 70 :   30, und die Sichtbarmachung der Substanzflecken erfolgt auf Grund der Fluoreszenzlöschung unter der UV-Lampe bei 260 mu oder durch Besprühen   mitChlorsulfonsäure/Eisessig 2 : 1   und anschliessendes Erhitzen auf 1050, wobei rotviolette Flecken sichtbar werden. Die Fraktionen   7 - 21   enthalten Moenomycin, die höheren Fraktionen stärker polare Verunreinigungen. 



   Zur Isolierung des gereinigten Moenomycins werden die vereinigten Fraktionen 7 - 21 im Vakuum bei 400 zur Trockne eingedampft ; den Rückstand löst man in Methanol und fällt nach Filtration das Antibiotikum durch Zusatz von überschüssigem Äther aus. Die Fällung wird abzentrifugiert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Auf diesem Wege gewinnt man gereinigtes Moenomycin als Ammoniumsalz.   d)   Reinigung durch Gelfiltration an Sephadex R
1 g Moenomycin aus b) wird in 10 ml H20 gelöst und auf eine Chromatographiesäule (80 x 5 cm), die gequollenes Sephadex enthält, aufgetragen. Bei der Entwicklung mit Wasser werden 16 Fraktionen zu je 100 ml aufgefangen und analysiert.

   Laut UV-Messung bei 258 mu und Bestimmung der mikrobio-   logischen Aktivität befindet sich Moenomycin   in den Fraktionen   5 - 10   (Maximum Fraktion 8), während die Farbstoffe in Fraktion 4 und Fraktion 11 bis 16 erscheinen. Aus der Hauptfraktion wird durch Gefriertrocknen ein farbloses amorphes Produkt (0, 55 g) mit einem Moenomycingehalt von 80 bis   85%   erhalten.   e)   Reinigung durch Chromatographie an Ionenaustauscher-Cellulose
400 mg des durch Gelfiltration nach d) gereinigten Moenomycins werden in 8 ml Wasser gelöst und auf eine Chromatographiesäule (100 x 3 cm) mit Ecteola-Anionenaustauscher-Cellulose aufgetragen. 



  Das Ecteolapulver wurde vorher mit einer   5%igenNHHCO-Lösung   in   die Bicarbonatform überführt   und wird in 0,4%iger NH4HCO3-Lösung in die Säule eingeschlämmt. Die Entwicklung der Säule geschieht mit Wasser (100 ml) und dann durch eine Gradientenelution (linearer Gradient) mit je 11   0,     4% figer   und   lomiger   NH4HCO3-Lösung.Mittels Fraktionensammler werden Fraktionen von je 10 ml aufgefangen und   durch UV-Messung   (258   mu)   und mikrobiologischen Test analysiert. Moenomycin befindet sich in Fraktion   81 - 110.   Die Fraktionen werden vereint, die Lösung mit einem Überschuss von Amberlite R   IRC-50   (Acrylsäure-Divinylbenzol-Polymerisat der Fa.

   Röhm & Haas) gerührt und auf diese Weise entsalzt. 



  Durch Gefriertrocknung der Lösung werden 180 mg reines farbloses Moenomycin (Säureform) gewonnen.   f)   Reinigung über das Zinksalz 
 EMI6.2 
 1 n-Natronlauge auf pH 8 gestellt. Die Fällung der Zinksalze, die das Moenomycin enthält, wird abzentrifugiert, mit 100 ml Wasser ausgewaschen und in 100 ml Wasser suspendiert. Nach Ansäuern auf   PH 2 mit 1 N H2 SO. wird die klare Lösung zweimal mit je 100 ml n-Butanol extrahiert, die ButanolExtrakte vereinigt, eingeengt und das Moenomycin durch Fällung mit Äthylacetat isoliert. Ausbeute     1,     9 g,   Gehalt   45%   Moenomycin. 



   Beispiel 2 : 

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K-Salz des Moenomycins
0, 5 g reines Moenomycin (Säureform) (erhalten nach 1 e) werden in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung mit   0, 51 nKOH   auf PH 7 eingestellt. Durch Gefriertrocknung werden   O, 52g   K-Salz des Moenomycins erhalten. 



   Beispiel 3 :
Na-Salz des Moenomycins
300 mg reines Moenomycin   (Säureform)   (erhalten aus 1 e) werden in 1 ml Methanol gelöst, die Lösung mit   Zloiger   methanolischer NaOH auf   I1I   7 gestellt und das Na-Salz durch Zusatz von   1 Vol   Äther ausgefällt, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 240 mg. 



   Beispiel 4 :
Diäthylaminsalz des Moenomycins
250 mg reines Moenomycin (Säureform) (erhalten nach 1 e) werden in 3 ml Wasser gelöst und dazu 2 ml einer   501eigen   wässerigen Diäthylaminlösung gegeben. Das gebildete Diäthylaminsalz des Moenomycins wird durch Eindampfen der Lösung im Vakuum isoliert. 



   Beispiel 5 :
Cyclohexylaminsalz des Moenomycins
Zu einer Lösung von 450 mg reinem Moenomycin in 10 ml Methanol werden 300 mg Cyclohexylamin gegeben und das gebildete Salz durch Eindampfen der Lösung im Vakuum isoliert. 



   Beispiel 6 :
Chromatographische Trennung von Moenomycin-Komplex und Herstellung von Moenomycin A,
B und C
400 g gesiebtes Kieselgel, Korngrösse   75-150 u,   das durch Behandeln mit halbkonzentrierter Salzsäure, nachfolgendem Neutralwaschen und Aktivieren bei 1300 gereinigt wurde, werden in eine Chromatographiesäule gefüllt. Dann werden 4 g durchchromatographie an   FlorisilgereinigtesMoenomycin   in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung auf 20 g gereinigtes Kieselgel aufgebracht und nach Trocknen auf den Kopf der Säule gegeben.

   Nun wird mit folgenden Lösungsmitteln eluiert : 
I)   n-Propanol/2 n NH, 100   20   (2,     0 I)  
II) n-Propanol/2 n   NH,     80 : 20 (2, 01)  
III) n-Propanol/2 n   NH     80 : 30 (2, 51)   
Mit den Elutionsmitteln I und II werden die restlichen Verunreinigungen und Farbstoffe eluiert, während mit System III die Fraktionierung von Moenomycin beginnt.

   Mittels Fraktionenteiler werden Fraktionen von 15 ml aufgefangen und in diesen das Vorhandensein von Moenomycin-Komponenten durch dünnschichtchromatographische Analyse (System wie in der Tabelle, Sichtbarmachung durch   Fluoreszenzlöschung mitUV-Lampe260mm f   oder durch Besprühen   mitChlorsulfonsäure/Elsessig   2 : 1 mit anschliessendem Erhitzen auf 1050, 15 min, rotviolette Flecken) überpüft.

   Hiebei erscheinen die Moenomycin-Komponenten in folgenden Fraktionen : 
 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Moenomycin-Komponente <SEP> Ausbeute <SEP> nach <SEP> Isolierung <SEP> mg
<tb> 55 <SEP> - <SEP> 95 <SEP> C <SEP> 440
<tb> 96 <SEP> - <SEP> 105 <SEP> C <SEP> + <SEP> A <SEP> (Gemisch) <SEP> 470
<tb> 106 <SEP> - <SEP> 140 <SEP> A <SEP> 585
<tb> 141 <SEP> - <SEP> 155 <SEP> A <SEP> + <SEP> B <SEP> (Gemisch) <SEP> 610
<tb> 156 <SEP> - <SEP> 170 <SEP> B <SEP> 275 <SEP> 
<tb> 
 
Zur Isolierung der reinen Komponenten werden die vereinigten Fraktionen im Vakuum zur Trockne eingedampft, die Rückstände in Methanol gelöst und nach Filtration die Moenomycin-Komponenten durch Zusatz von überschüssigem Äther ausgefällt. Die Fällungen werden abzentrifugiert, mit Äther gewaschen und getrocknet.

   Es werden farblose, amorphe Substanzen mit den in der Beschreibung angegebenen Eigenschaften erhalten. 

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Reinigung von Moenomycin, d a d u r c h g e k e n n z i e c h n e t , dass man das bei <Desc/Clms Page number 8> der Mycelextraktion gewonnene Rohprodukt dialysiert, das Innendialysat in schwach saurem Medium mit einem polaren, wasserunlöslichen oder-schwerlöslichen Lösungsmittel extrahiert, den Extrakt zur Trockne eindampft, die Lösung an Magnesiumsilikat adsorbiert, mit Methanol eluiert, das eluierte Produkt in bekannter Weise isoliert und dieses entweder a) der Adsorptionschromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches von niederen Alkoholen und wässerigem Ammoniak als Elutionsmittel, oder b) der Chromatographie an vernetzten Dextran-Gelen mit Wasser als Elutionsmittel, oder c)

der Chromatographie an Ionenaustauschern auf Cellulosebasis mit Salzlösungen als Elutionsmit- teln unterwirft, aus dem Eluat das reine Moenomycin in an sich bekannter Weise isoliert und gegebenenfalls mit basischen Mitteln in die Salzform überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Gewinnung der reinen Komponenten Moenomycin A, Moenomycin B und Moenomycin C das nach Anspruch 1 a) erhaltene Eluat in getrennten Fraktionen auffängt, aus diesen die Substanzen in an sich bekannter Weise isoliert und sie gegebenenfalls mit basischen Mitteln in die Salzform überführt.