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Verfahren zur Herstellung des neuen Antiobiotikums Pyrrolnitrin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Pyrrolnitrin.
In den Zeichnungen stellt Fig. 1 die Kurve eines Infrarotabsorptions-Spektrums von Pyrrolnitrin, Fig. 2 die Kurve eines Ultraviolettabsorptions-Spektrums von Pyrrolnitrin und Fig. 3 die Kurve eines Kernresonanz-Spektrums (NMR-Spektrums) von Pyrrolnitrin dar.
Es wurde gefunden, dass die neue antibiotische Substanz durch Kultivierung von Stämmen der Gattung Pseudomonas erzeugt werden kann. Gegenstand der Erfindung ist demgemäss ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Pyrrolnitrin, d. h. des3- (2-Nitro-3-chlorphenyl)-4-chlorpyrrols, das dadurch gekennzeichnet ist, dass als Pyrrolnitrin erzeugender Stamm der Gattung Pseudomonas Pseudomonas pyrrocinia ATCC 15958, Pseudomonas ovalis IAM 18003, Pseudomonas schuylkilliensis FRI 79, Pseudomonas pyrrolnitrica FRI 80, Pseudomonas pyrrolnitrica FRI 81, Pseudomonas pyrrolnitrica FRI 82 oder natürliche oder induzierte Mutanten oder Varianten dieser Stämme in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet und aus der so gewonnenen Gärflüssigkeit das Pyrrolnitrin abgetrennt und gereinigt wird.
Alle diese Stämme wurden aus Erde isoliert. Auf Grund mykologischer Beobachtungen an diesen Stämmen, die nachfolgend im einzelnen besprochen werden, wurde festgestellt, dass es sich bei den Stämmen B16, Nr, 29, die nicht hinterlegt wurden, Nr. 103 und CB-416 um Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mephitica, Pseudomonas ovalis bzw. Pseudomonas Schuyikilliensis handelt. Der Stamm Nr. 2327 wurde als ein neuer Stamm identifiziert und Pseudomonas pyrrocinia benannt. Eine Kultur des lebenden Mikroorganismus wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und ist dort erhältlich. Er wurde als ATCC 15958 bezeichnet.
Bei den oben erwähnten Hinterlegungsnummern steht die Abkürzung IAM für Institute of Applied Microbiology, Tokyo University, und die Abkürzung FRI für Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.
Für die vorstehend erwähnten Stämme der Gattung Pseudomonas werden in der nachfolgenden Beschreibung teilweise andere Bezeichnungen verwendet. In der nachfolgenden Tabelle sind die Namen der Stämme, deren amtliche Hinterlegungsnummern, die andern in der Beschreibung benutzten Bezeichnungen sowie die Beispiele, in denen die Gewinnung des neuen Antibiotikums Pyrrolnitrin aus den jeweiligen Stämmen beschrieben ist, zusammengestellt. Die Stämme Pseudomonas mephitica Nr. 29 und Pseudomonas aeruginosa B-16 wurden nicht hinterlegt.
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EMI2.1
<tb>
<tb>
Name <SEP> Hinterlegungs-Bezeichnung <SEP> in <SEP> Beschrieben <SEP> in
<tb> nummer <SEP> der <SEP> Erfindung <SEP> Beispiel
<tb> Pseudomonas <SEP> pyrrocinia <SEP> ATCC <SEP> 15 <SEP> 958 <SEP> Nr. <SEP> 2327 <SEP> l, <SEP> 2
<tb> Pseudomonas <SEP> ovalis <SEP> IAM <SEP> 18 <SEP> 003 <SEP> Nr. <SEP> 103 <SEP> 5
<tb> Pseudomonas <SEP> schuylkilliensis <SEP> FR <SEP> ! <SEP> 79 <SEP> CB-416 <SEP> 6
<tb> Pseudomonas <SEP> pyrrolnitrica <SEP> FRI <SEP> 80 <SEP> B-116 <SEP> 7
<tb> Pseudomonas <SEP> pyrrolnitrica <SEP> FRI <SEP> 81 <SEP> B-317 <SEP> 7
<tb> Pseudomonas <SEP> pyrrolnitrica <SEP> FRI <SEP> 82 <SEP> NB-136 <SEP> 7
<tb> Pseudomonas <SEP> mephitica-Nr.
<SEP> 29 <SEP> 4
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa-B-16 <SEP> 3 <SEP>
<tb>
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Tabelle 1
Zellformen
EMI3.1
<tb>
<tb> Nr.2327 <SEP> B-156 <SEP> Nr.29 <SEP> Nr.103 <SEP> CB-416
<tb> Stäbe <SEP> (abgerundet) <SEP> Stäbe <SEP> (abgerundet) <SEP> Stäbe <SEP> (abgerundet) <SEP> Stäbe <SEP> (abgerundet) <SEP> Stäbe <SEP> (abgerundet)
<tb> 0, <SEP> 5-0, <SEP> 8x <SEP> 0, <SEP> 5-0.
<SEP> 7x <SEP> 0, <SEP> 5-0, <SEP> 8x <SEP> 0, <SEP> 6-0, <SEP> 8x <SEP> 0, <SEP> 6-0, <SEP> 75x <SEP>
<tb> 1, <SEP> 2-2, <SEP> 0 <SEP> u <SEP> 1, <SEP> 2- <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> u <SEP> 1, <SEP> 4-1, <SEP> 6 <SEP> u <SEP> 1, <SEP> 4- <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> u <SEP> 0, <SEP> 9-l, <SEP> 35 <SEP> u <SEP>
<tb> liegen <SEP> einzeln <SEP> vor <SEP> liegen <SEP> einzeln <SEP> vor, <SEP> liegen <SEP> meist <SEP> einzeln <SEP> vor <SEP> liegen <SEP> meist <SEP> einzeln <SEP> vor <SEP> liegen <SEP> meist <SEP> einzeln <SEP> vor,
<tb> vereinzelt <SEP> in <SEP> Paaren <SEP> und <SEP> aber <SEP> manchmal <SEP> in <SEP> Paaren
<tb> in <SEP> kurzen <SEP> Ketten <SEP> und <SEP> kurzen <SEP> Ketten
<tb> beweglich <SEP> durch <SEP> Flagella <SEP> beweglich <SEP> durch <SEP> eine <SEP> beweglich <SEP> durch <SEP> polare <SEP> beweglich <SEP> durch <SEP> polare <SEP> beweglich <SEP> durch <SEP> polare
<tb> einzelne <SEP> polare <SEP> Flagella <SEP> Flagella <SEP> Flagella <SEP> Flagella
<tb> keine <SEP> Sporenbildung <SEP> keine <SEP> Sporenbildung <SEP> keine <SEP> Sporenbildung <SEP> keine <SEP> Sporenbildung <SEP> keine <SEP> Sporenbildung
<tb> gramnegativ <SEP> gramnegativ <SEP> gramnegativ <SEP> gramnegativ <SEP> gramnegativ
<tb>
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Tabelle 2 Kulturmerkmale
EMI4.1
<tb>
<tb> Nr. <SEP> 2327 <SEP> B-16 <SEP> Nr. <SEP> 29 <SEP> Nr.
<SEP> 103 <SEP> CB-416 <SEP>
<tb> Agarnährboden-Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C, <SEP> Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C, <SEP> Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 30 C, <SEP> Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 30 C, <SEP> Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 30 C,
<tb> kolonie <SEP> erhaben, <SEP> kreisförmig, <SEP> gross, <SEP> sich <SEP> ausbreitend, <SEP> konvex, <SEP> kreisförmig, <SEP> kreisförmig, <SEP> glatt, <SEP> erhaben, <SEP> glatt, <SEP> vollungefähr <SEP> 4 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> mm <SEP> im <SEP> unregelmässiger <SEP> Umriss, <SEP> gleichmässiger <SEP> Kreis- <SEP> gleichmässiger <SEP> Kreis- <SEP> Ständig <SEP> oder <SEP> leicht
<tb> Durchmesser, <SEP> gleich-durchscheinend, <SEP> hell-umfang, <SEP> grauähnlich <SEP> umfang, <SEP> hellgelb <SEP> gewellt, <SEP> durchscheinend,
<tb> mässiger <SEP> Kreisumfang,
<SEP> grau <SEP> bis <SEP> cremefarbig <SEP> hellgelb <SEP> glitzernd, <SEP> hellgelb <SEP> bis
<tb> opak, <SEP> hellgrau <SEP> bis <SEP> hell <SEP> rötlichgelb
<tb> cremefarbig
<tb> Agamährboden-Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum,
<tb> schrägkultur <SEP> sich <SEP> ausbreitend, <SEP> dick, <SEP> etwas <SEP> sich <SEP> ausbreitend, <SEP> faltig, <SEP> gräulich-braun <SEP> faserförmig <SEP> bis <SEP> sich <SEP> glatt, <SEP> vollständig,
<tb> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> erhaben, <SEP> vollständig, <SEP> glänzend <SEP> bräunlich-ausbreitend, <SEP> durch-erhaben, <SEP> durchscheinend,
<tb> 30 C) <SEP> glänzend <SEP> grau <SEP> bis <SEP> gelb.
<SEP> scheinend, <SEP> glitzernd <SEP> etwas <SEP> glitzernd,
<tb> cremefarbig <SEP> Medium <SEP> grünlich-gelb <SEP> hellgelb
<tb> Nährbouillon <SEP> Leicht <SEP> trübe <SEP> mit <SEP> Haut, <SEP> Trübe, <SEP> mit <SEP> dünner <SEP> Trübes <SEP> Sediment <SEP> Stark <SEP> trübe, <SEP> mit <SEP> dünner <SEP> Trübe, <SEP> mit <SEP> brüchiger
<tb> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> keine <SEP> Sedimentation <SEP> Haut <SEP> Haut <SEP> und <SEP> dürftigem <SEP> Haut <SEP> und <SEP> seidenglänzen-
<tb> 300C) <SEP> Sediment <SEP> dem <SEP> Sediment
<tb> Glutamat-Agar <SEP> Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C, <SEP> Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C, <SEP> Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 30 C, <SEP> Nadi <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 30oye, <SEP> Nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 30 C,
<tb> gutes <SEP> Wachstum, <SEP> gutes <SEP> Wachstum,
<SEP> mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> mässiges <SEP> Wachstum,
<tb> kein <SEP> Pigment <SEP> gebildet <SEP> sich <SEP> ausbreitend, <SEP> kein <SEP> Pigment <SEP> gebildet <SEP> grünlich <SEP> weiss, <SEP> hell <SEP> gelblich-braun <SEP> bis
<tb> leicht <SEP> gelblich-grüne <SEP> Medium <SEP> grünlich-gelb <SEP> hellbraun, <SEP>
<tb> Farbe <SEP> Medium <SEP> schwach <SEP> gelb
<tb> Glutamatbouillon <SEP> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Stark <SEP> trübe, <SEP> lösliches <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Trübe <SEP> mit <SEP> brüchiger <SEP> Stark <SEP> trübe, <SEP> mit
<tb> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> kein <SEP> Pigment <SEP> gebildet <SEP> Pigment <SEP> gebildet <SEP> kein <SEP> Pigment <SEP> gebildet <SEP> Haut <SEP> und <SEP> leicht <SEP> grün- <SEP> brüchiger <SEP> Haut, <SEP> hell-
<tb> 30 C)
<SEP> lich-gelber <SEP> Farbe <SEP> braune <SEP> Farbe
<tb>
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Tabelle 2 (Fortsetzung)
EMI5.1
<tb>
<tb> Nr. <SEP> 2327 <SEP> B-16 <SEP> Nr. <SEP> 29 <SEP> Nr. <SEP> 103 <SEP> CB-416
<tb> Peptonwasser <SEP> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Trübe <SEP> mit <SEP> brüchigerer <SEP> Mässig <SEP> trübe <SEP> mit
<tb> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> stark <SEP> trübe, <SEP> mit <SEP> seidig <SEP> stark <SEP> trübe, <SEP> mit <SEP> emp-leicht <SEP> trübe, <SEP> mit <SEP> emp- <SEP> Haut <SEP> und <SEP> grünlich-cremeartiger <SEP> Farbe
<tb> 30 C, <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 0) <SEP> zähem <SEP> Sediment. <SEP> findlicher <SEP> Haut.
<SEP> findlicher <SEP> Haut <SEP> gelber <SEP> Farbe <SEP> und <SEP> seidig <SEP> zähem
<tb> Keine <SEP> Haut, <SEP> jedoch <SEP> auf <SEP> Gelblich-grünes <SEP> Sediment
<tb> der <SEP> gealterten <SEP> Kultur <SEP> Pigment <SEP> gebildet
<tb> bildete <SEP> sich <SEP> eine
<tb> brüchige <SEP> Haut
<tb> Gelatinestich <SEP> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Wachstum <SEP> nahe <SEP> der <SEP> Schwaches <SEP> Wachstum <SEP> Gutes <SEP> Wachstum,
<tb> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> Schichtbildung <SEP> schnelle <SEP> Verflüssigung <SEP> Oberfläche, <SEP> langsame <SEP> nahe <SEP> der <SEP> Oberfläche, <SEP> Schichtbildung
<tb> 15 <SEP> bis <SEP> 200C) <SEP> (stratiform), <SEP> Verflüssi- <SEP> zu <SEP> Schichtbildung <SEP> Verflüssigung <SEP> keine <SEP> Verflüssigung <SEP> (stratiform), <SEP> Verflüssigung.
<SEP> Kein <SEP> Wechsel <SEP> (stratiform), <SEP> Medium <SEP> gung <SEP> mit <SEP> bräunlichin <SEP> der <SEP> Farbe <SEP> grün <SEP> werdend <SEP> weissem <SEP> Sediment.
<tb>
Keine <SEP> Änderung <SEP> in <SEP> der
<tb> Farbe
<tb> BCP <SEP> Milch <SEP> Verflüssigung, <SEP> schnelle <SEP> Verflüssigung, <SEP> Verflüssigung, <SEP> alkali-schwache <SEP> Verflüssigung, <SEP> Verflüssigung, <SEP> leichte
<tb> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> leichte <SEP> alkalische <SEP> sche <SEP> Eigenschaften <SEP> alkalische <SEP> Eigenschaf- <SEP> alkalische <SEP> Eigenschaf-
<tb> 30 C) <SEP> Eigenschaften <SEP> zeigend <SEP> zeigend <SEP> ten <SEP> zeigend <SEP> ten <SEP> zeigend
<tb> Kartoffel <SEP> Im <SEP> wesentlichen <SEP> farb- <SEP> Braun, <SEP> feuchtes <SEP> Wachs- <SEP> Glänzend <SEP> braun <SEP> Dünn, <SEP> gelblich <SEP> braun, <SEP> Bräunlich, <SEP> sich <SEP> aus-
<tb> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> los, <SEP> leicht <SEP> cremeartig.
<SEP> tum, <SEP> Medium <SEP> leicht <SEP> gefärbtes <SEP> Wachstum <SEP> gefärbtes <SEP> Wachstum <SEP> breitend, <SEP> klebrig, <SEP> dick
<tb> 300C) <SEP> Feucht <SEP> dünnes <SEP> Wachs- <SEP> grün <SEP> werdend
<tb> turn <SEP> (bei <SEP> 370C)
<tb>
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Tabelle 3 Physiologische Eigenschaften
EMI6.1
<tb>
<tb> Nr. <SEP> 2327 <SEP> B-16 <SEP> Nr. <SEP> 29 <SEP> Nr.
<SEP> 103 <SEP> CB-416
<tb> Pigmenthildung <SEP> wasserlöslich <SEP> Grüne <SEP> Fluoreszenz <SEP> gelegentliche <SEP> Grünlich-gelhe
<tb> hellgrüm <SEP> Fluoreszenz
<tb> wasserunlöslich <SEP> - <SEP>
<tb> Indolbildung <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Reduktion <SEP> von <SEP> Nitrat-- <SEP> !- <SEP> +-+ <SEP>
<tb> Anaerobisches
<tb> Wachstum <SEP> in <SEP> Gegenwart <SEP> von <SEP> Nitrat
<tb> Bildung <SEP> von
<tb> Schwefelwasserstoff <SEP> + <SEP> (nach <SEP> 5-7 <SEP> Tagen)
<tb> Hydrolyse <SEP> von <SEP> Stärke <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Catalasenaktivität <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Bildung <SEP> von <SEP> Acetoin <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Glutamat <SEP> Nacl <SEP> 0,2% <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Nährboden <SEP> NaCl <SEP> 0,
<SEP> 5% <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> NaCl <SEP> 1,0% <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> # <SEP> +++
<tb> Toleranz <SEP> NaCl <SEP> 3,0% <SEP> # <SEP> ##+ <SEP> -## <SEP> #+ <SEP> ++
<tb> gegen <SEP> Salz <SEP> NaCl <SEP> 5, <SEP> solo
<tb> (nach <SEP> 24 <SEP> h <SEP> Fleisch-NaCl <SEP> 0, <SEP> 2% <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> bei <SEP> 30 C) <SEP> extrakt <SEP> NaCl <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Nährboden <SEP> NaCl <SEP> 1,0% <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> # <SEP> +++
<tb> NaCl <SEP> 3,0% <SEP> # <SEP> # <SEP> # <SEP> + <SEP> - <SEP> # <SEP> 3 <SEP> # <SEP> # <SEP> + <SEP> ++
<tb> NaCl <SEP> 5,0% <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> #
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
Tabelle 3 (Fortsetzung)
EMI7.1
<tb>
<tb> Nr.
<SEP> 2327 <SEP> B-16 <SEP> Nr. <SEP> 29 <SEP> Nr. <SEP> 103 <SEP> CB-416
<tb> alkoholhaltiger <SEP> Alkohol <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Fleischextrakt- <SEP> 0% <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Nährboden <SEP> 3, <SEP> 0% <SEP> # <SEP> ##+
<tb> 5,0%
<tb> Widerstandsfähigkeit
<tb> gegen <SEP> Hitze <SEP> alle <SEP> Stämme <SEP> vollständig <SEP> abgetötet
<tb> (80#C, <SEP> 5 <SEP> min)
<tb> Wachstumstemperatur <SEP> Temperatur <SEP> 10 C <SEP> # <SEP> # <SEP> # <SEP> # <SEP> # <SEP> # <SEP> +
<tb> (nach <SEP> 24 <SEP> h, <SEP> Nahr- <SEP> Temperatur <SEP> 26,5 C <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> bouillon <SEP> und <SEP> Temperatur <SEP> 30 C <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Glutamatbouillon)
<SEP> Temperatur <SEP> 37 C <SEP> + <SEP> +++ <SEP> # <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> Temperatur <SEP> 42 C <SEP> - <SEP> ++ <SEP> - <SEP> - <SEP> Wachstums-pH <SEP> PH <SEP> 3 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> # <SEP> #
<tb> (nach <SEP> 24 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 30 C, <SEP> pH <SEP> 4 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Peptonwasser) <SEP> PH <SEP> 5 <SEP>
<tb> PH <SEP> 6 <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> PH <SEP> 7 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> PH <SEP> 8 <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> PH <SEP> 9 <SEP> + <SEP> ++ <SEP> # <SEP> + <SEP> +
<tb> Oxydationsaktivität <SEP> Glukose
<tb> Clukonsäure <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Glycerin
<tb> Chitochromoxydase
<tb>
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Tabelle 3 (Fortsetzung)
EMI8.1
<tb>
<tb> Nr. <SEP> 2327 <SEP> B-16 <SEP> Nr. <SEP> 29 <SEP> Nr.
<SEP> 103 <SEP> CB-416
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> A <SEP> B <SEP> C
<tb> Glukose <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Fructose
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> +
<tb> Trehalose <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> +
<tb> Galactose
<tb> Pepton-Medium <SEP> Mannose <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> -
<tb> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> Xyloxe <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> bei <SEP> 30 C)
<SEP> Arabinose <SEP> -## <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP>
<tb> Sucrose <SEP> + <SEP> - <SEP> # <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Lactose <SEP> ++ <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Mannitol
<tb> Mannitol <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Glycerin <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Stätke <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Inulie <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Kontrolle <SEP> + <SEP> -
<SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> Synb <SEP> teh <SEP> tisches <SEP> Glukose <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Medium <SEP> Lactose <SEP> -## <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> -
<tb> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> sucrose <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> bei <SEP> 30 C) <SEP> Glyerin <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> ##Xylosse <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb>
Bemerkung :
In der zweiten Spalte der obigen Tabelle bedeuten die Symboel "A" Wachstum, "B" Gasentweicklugn udn "C" Säurebildung.
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Tabelle 3 (Fortsetzung) Zersetzung von Zuckern (Hugh-Leifson-Verfahren)
EMI9.1
<tb>
<tb> Nr. <SEP> 2327 <SEP> B-16 <SEP> Nr. <SEP> 29 <SEP> Nr. <SEP> 103 <SEP> CB-416 <SEP>
<tb> C <SEP> # <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Lactose
<tb> Glucose <SEP> C <SEP> 3 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> #
<tb> O <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb>
C : geschlossen ;
O :offen; - bedeutet neutrale oder alkalische Reaktion ; bedeutet schwach saure Reaktion ; + bedeutet starke Reaktion
Assimilation von Kohlenstoffverbindungen
EMI9.2
<tb>
<tb> Nr. <SEP> 2327 <SEP> B-16 <SEP> Nr. <SEP> 29 <SEP> Nr. <SEP> 103 <SEP> CB-416
<tb> Glukose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Glukosäure <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> 2-Keto-Gluklionsäure <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> 5-Keto-Glukonsäure <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Zitronensäure <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Bernsteinsäure <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Äthanol <SEP> # <SEP> + <SEP>
<tb> Phenol
<tb> Benzoesäure <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> # <SEP> +
<tb> Salicylsäure
<tb> m-Hydroxybenzoesäure <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> p-Hydroxybenzoesäure <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP>
+
<tb> Protocatechusäure <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> Gentisinsäure
<tb> Anthranilsärue <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> +
<tb> p-Aminobenzoesäur <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Tabelle 3 (Fortsetzung) Wachstum auf den ausgewählten Media nach dem Verfahren von K.
Komagata
EMI10.1
<tb>
<tb> Nr. <SEP> 2327 <SEP> B-16 <SEP> Nr. <SEP> 29 <SEP> Nr. <SEP> 103 <SEP> CB-416
<tb> Glukose <SEP> + <SEP> Ammonium
<tb> Salz <SEP> + <SEP> +-H-- <SEP> --+ <SEP> + <SEP>
<tb> p-Hydroxybenzoat <SEP> t- <SEP> -' <SEP> --+ <SEP> + <SEP>
<tb> Glukose <SEP> + <SEP> Nitrat <SEP> +-+ <SEP> + <SEP>
<tb> Succinat+Nitrat- <SEP> -HGlutamat
<tb> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 30 C) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++
<tb>
EMI10.2
<Desc/Clms Page number 11>
bis 370C ausgeführt werden, und bei diesen Temperaturen erreicht die Bildung des gewünschten Antibiotikums nach 2 bis 5 Tagen ein Maximum.
Das in der Fermentationsbrühe angereicherte Pyrrolnitrin kann beispielsweise dadurch isoliert werden, dass es mit einem geeigneten Lösungsmittel aus den Zellen extrahiert wird, Verunreinigungen entfernt werden und die erhaltene Lösung auf geeignete Weise konzentriert wird. Es können die allgemein auf dem Gebiet der Antibiotika-Industrie verwendeten Extraktions- und Reinigungsverfahren angewendet werden, z. B. das Lösungsmittel-Extraktionsverfahren, das Kohleverfahren und das Verfahren der chromatographischen Absorption. Nach beendeter Züchtung werden beispielsweise mit einem Filter oder einer Zentrifuge die Zellen von der Fermentationsbrühe abgetrennt, und die abgetrennten Zellen werden dann mit Aceton oder einem ähnlichen Lösungsmittel unter Rühren extrahiert. Der Extrakt wird mit Aktivkohle gereinigt und dann unter vermindertem Druck konzentriert.
Das Konzentrat wird wieder mit einem andern Lösungsmittel, z. B. Butylacetat oder Petrolbenzin, extrahiert. Der Extrakt wird mit wässerigem Alkalioder Säure gewaschen, filtriert und dann konzentriert. Die rohe ölige Substanz wird der Chromatographie unter Verwendung von Aluminiumoxyd unterworfen und die absorbierte Substanz wird mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert, wobei eine konzentrierte Fraktion erhalten wird, aus der mit Methanol-Cyclohexan oder einem ähnlichen gemischten Lösungsmittel ein rohes kristallines Produkt erhalten werden kann.
Nach Umkristallisation aus einem Lösungsmittel wird das reine kristallisierte Antibiotikum erhalten.
EMI11.1
EMI11.2
EMI11.3
EMI11.4
<tb>
<tb> (2-Nitro-3-chlorphenyl)-4-chlorpyrrolC <SEP> H <SEP> 0 <SEP> N <SEP> Cl
<tb> berechnet <SEP> für <SEP> C1o <SEP> OzNzC <SEP> : <SEP> 46, <SEP> 71 <SEP> 2,33 <SEP> 12,45 <SEP> 10,89 <SEP> 27,68
<tb> gefunden <SEP> : <SEP> 45,68 <SEP> 2,42 <SEP> 12,41 <SEP> 10,82 <SEP> 27,23
<tb>
EMI11.5
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
EMI12.2
<tb>
<tb> (2-Nitro-3-chlorphenyl)-4-chlorpyrrol,C <SEP> H <SEP> 0 <SEP> N <SEP> Cl
<tb> berechnet <SEP> : <SEP> 41, <SEP> 60 <SEP> 1, <SEP> 98 <SEP> 31, <SEP> 78 <SEP> 6, <SEP> 94 <SEP> 17,58
<tb> gefunden <SEP> :
<SEP> 41, <SEP> 78 <SEP> 2,25 <SEP> 31, <SEP> 48 <SEP> 7,18 <SEP> 17,33
<tb>
Die Ultraviolettabsorption der Carbonsäure in Äthanol ist Xmax 283 mll (e = 1030). Infrarotabsorption der Carbonsäure erfolgt bei 1550 und 1370 cm-l (KBr Tablette). Dies stimmt überein mit der Absorption einer authentischen Probe von 2-Nitro-3-chlorbenzoesäure.
Pyrrolnitrin zeigt eine ausserordentlich grosse Aktivität gegen Fungus, insbesondere Trichophyton.
Es zeigt geringe Aktivität gegen grampositive Bakterien und ist im wesentlichen inaktiv gegen gramnegative Bakterien und säurefeste Mikroorganismen. Die antibiotische Aktivität des Produktes wird nach der Agar-Verdünnungsmethode gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben :
EMI12.3
<tb>
<tb> Wachstumshemmende
<tb> Mindestkonzentration
<tb> y/ml
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> P <SEP> 6,2
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> PCI <SEP> 219 <SEP> 12,5
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 250
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 250
<tb> Mycobacterium <SEP> SP <SEP> 607 <SEP> 250
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 12,5
<tb> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> 0,2
<tb> Trichophyton <SEP> asteroids <SEP> 0,05
<tb> Torula <SEP> utilis <SEP> 15,0
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 15,0
<tb>
Bei der Bioprüfung der Wirksamkeit einer Kultur sind Trichophyton asteroides und Penicillium chry-
EMI12.4
bebrütet. Es werden 2,5 ml steriles Wasser zugefügt und die Zellen mit einer Platinschlinge abgekratzt, um eine Zellsuspension zu bilden.
Eine geeignete Menge der Zellsuspension wird zu Sabougraud Agar gegeben und gleichmässig verrührt. In an sich bekannter Weise werden Agarplatten für den Bioversuch
EMI12.5
tungszeit möglich ist, kann durch Verdünnen der Testflüssigkeit mit einer 0,1% Chloramphenicol enthaltenden Phosphorsäure-gepufferten Lösung (PH 6,0), wenn das Schalenverfahren angewendet wird, oder, falls ein Pulpenverfahren angewendet wird, durch Verwendung einer trockenen Pulpenscheibe, die vorher mit einer 0, 1% Chloramphenicol enthaltenden methanolischen Lösung imprägniert wurde, verhindert werden.
Wenn Pyrrolnitrin Mäusen intraperitoneal injiziert wird, hat es einen LD -Wert von 500 mg/kg.
Wenn PyrrolnitrinRatten in einer Menge von 30mg/kg täglich über einen Zeitraum von 3 Monaten verabreicht wird, ist keine wesentliche Änderung in der synthetischen Kondition und in der Gewichtszu- nahme festzustellen.
Um die klinische Brauchbarkeit von Pyrrolnitrin im einzelnen festzustellen, wurden die folgenden klinischen Versuche durchgeführt. Das verwendete Pyrrolnitrin-Präparat war eine Lösung, enthaltend
EMI12.6
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
befallene Haut einmal oder dreimal täglich aufgebracht.
Die erhaltenen Ergebnisse sind wie folgt :
EMI13.2
<tb>
<tb> Krankheit
<tb> Ergebnis <SEP> Tinea <SEP> crurisTinea <SEP> tedis <SEP> Tinea <SEP> corporis <SEP> Tinea <SEP> versicolor <SEP> Gesamt
<tb> Sehr <SEP> wirksam <SEP> 28 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 34
<tb> Wirksam <SEP> 44 <SEP> 71 <SEP> 3-118
<tb> Unwirksam <SEP> 6 <SEP> 26--32
<tb> Gesamt <SEP> 78 <SEP> 100 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 184
<tb>
EMI13.3
<Desc/Clms Page number 14>
einer Kultur bei 300C über 24 h erhalten wurde, wird in einer Menge von 5 Vol. -0/0 in jedes der Gefässe eingeimpft. Die Bebrütung wird bei 28 C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 330 Umdr/min durchgeführt, wobei sterilisierte Luft in die Gefässe eingeleitet wird.
Lebhafte Schaumbildung wird durch die tropfenweise Zugabe von sterilisiertem Sojabohnenöl verhindert. Nach 48 h wird die Fermen- tationsbrühe abgetrennt und die Zellen werden mittels einer Sharples-Zentrifuge gesammelt. Zu dem erhaltenen Zellkuchen wird 70% igues wässeriges Aceton gegeben, wobei dessen Volumen dem fünffachen
Betrag Nassgewicht der gesammelten Zellen entspricht. Die erhaltene Mischung wird 24 h bei Zimmer- temperatur stehengelassen. Dann werden die Zellen abfiltriert. Der Acetonextrakt wird unter vermin- dertem Druck konzentriert, wobei ein weisses trübes flüssiges Konzentrat erhalten wird, das wieder mit dem gleichen Volumen Petrolbenzin extrahiert wird. Der erhaltene Extrakt wird nacheinander mit wäs- serigem Alkali, wässeriger Säure und Wasser gut gewaschen und dann konzentriert.
Der erhaltene kon- zentrierte Extrakt wird getrocknet und dann durch eine mit Aluminiumoxyd gefüllte Säule geschickt.
Die am Aluminiumoxyd absorbierte gewünschte antibiotische Substanz wird gewaschen, indem Petrolbenzin und n-Hexan durch die Säule geschickt werden. Das Eluieren wird mittels Benzol durchgeführt.
Die Eluate, die gegen Tricophyton aktiv sind, werden gesammelt und unter vermindertem Druck kon- zentriert, wobei ein Sirup erhalten wird. Dieser wird in Methanol aufgelöst. Die methanolische Lösung wird durch Filtrieren von Verunreinigungen befreit. Dann wird Cyclohexan in einer Menge von 3 Teilen pro 1 Teil der methanolischen Lösung zugegeben. Die Mischung wird in einem Eisschrank aufbewahrt, wobei ein gelber Niederschlag erhalten wird. Dieser wird aus Methanol-Cyclohexan umkristallisiert.
Das reine, kristalline Antibiotikum wird in einer Menge von 50 mg erhalten.
Beispiel 3 : Der Stamm Pseudomonas aeruginosa B-16 wird in eine Agarschrägkultur eingeimpft und diese bei 370C 48 h lang bebrütet. 100 ml eines Kulturmediums, das l% Polypepton, 1% Fleischextrakt, 0, 50/0 Natriumchlorid, 2, 65% Kaliumdihydrogenphosphat und 0, 18% Natriumdihydrogenphosphat (121\0) enthält, werden in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben und bei 1200C 15 min lang sterilisiert. Das dem Schrägkulturmedium entnommene Inokulat wird mit einer Platinschlinge in den Kolben eingeimpft, und diese Kultur wird 24 h lang bei 370C geschüttelt.
Die so erhaltene Kulturbouillon wird in 10 1 eines in einem 15 1-Fermentationsgefäss enthaltenen Kulturmediums eingeimpft, das die oben beschriebene Zusammensetzung aufweist und bei 1200C 30 min lang sterilisiert worden ist. Die Kultivierung wird unter Propellerrührung mit einer Geschwindigkeit von 330 Umdr/min 3 Tage lang bei 300C ausgeführt, während sterilisierte Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 l/min durchgeleitet wird.
Die so erhaltene Kulturbouillon wird mit etwa 1% Diatomeenerde versetzt und die Mischung filtriert, um die Zellen abzutrennen. Der erhaltene Zellkuchen wird mit etwa 11 80% igem wässerigem Aceton unter Erwärmen extrahiert und dann durch Filtrieren abgetrennt. Der erhaltene Acetonextrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird dann dreimal mit je 200 ml Petrolbenzin extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und mit der gleichen Menge Wasser gewaschen. Dann wird mit einer kleinen Menge Aktivkohle entfärbt und zu einem öligen Produkt eingedampft. Dieses wird in eine mit Aluminiumoxyd/Petrolbenzin gefüllte Kolonne gegeben. Die am Aluminiumoxyd absorbierte gewünschte antibiotische Substanz wird gewaschen, indem Petrolbenzin und n-Hexan durch die Kolonne geleitet werden. Dann wird mit Benzol eluiert.
Von den eluierten Fraktionen werden diejenigen, die eine starke Aktivität gegen Tricophyton zeigen, gesammelt und unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingedampft. Dieser wird in Methanol gelöst, um ungelöste Stoffe zu entfernen. Die erhaltene Lösung wird mit 3 Teilen Cyclohexan pro Teil der Lösung versetzt. Die Mischung wird in einem Eisschrank aufbewahrt. Der dabei gebildete gelbe Niederschlag wird gesammelt und aus Methanol-Cyclohexan umkristallisiert. Das erhaltene reine kristalline Antibiotikum besitzt einen Schmelzpunkt von 125 C. Die Ausbeute beträgt etwa 70 mg.
EMI14.1
triumhydrogenphosphat (12 HO) enthält, werden in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben und 15 min lang bei 1200C sterilisiert.
In mehrere so bereitete Schüttelkolben wird eine des auf einer Platinschlinge befindliche Menge von der Schrägkultur erhaltenen Inokulats eingeimpft. Die Schüttelkultur wird 24 h lang auf 300C gehalten. Aus der Fermentationsbrühe werden die Zellen mittels einer auf
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<Desc/Clms Page number 16>
Das in der Schrägkultur erhaltene Inokulat wird mit der Flachspitze einer Platinschlinge in die Kolben eingeimpft, und die Kultur wird 48 h lang bei 30 C geschüttelt. Die so erhaltene Kulturbouillon wird in 250 1 des gleichen Kulturmediums eingeimpft, das sich in einem 500 l-Fermentationsgefäss befindet und 20 min lang bei 120 C sterilisiert worden war.
Die Züchtung wird 48 h lang bei 300C unter Propellerrührung von 180 Umdr/min durchgeführt, wobei sterilisierte Luft in das Fermentationsgefäss eingeleitet wird, u. zw. pro Minute in einer Menge, die der Hälfte der Menge des Kulturmediums entspricht. 250 1 dieser Brühe werden in 2500 1 des gleichen Kulturmediums eingeimpft, das sich in einem 4000 l-Fermentationsgefäss aus rostfreiem Stahl befindet. Die Züchtung wird 96 h lang unter den gleichen Bedingungen wie in dem Impfbrühen-Tank durchgeführt. Die Pyrrolnitrin-Aktivität der Brühe be-
EMI16.1
Diese Verfahren werden zweimal wiederholt. Der erhaltene Acetonextrakt wird unter vermindertem Druck bei 40 C konzentriert. Der eingedampfte Rückstand wird mit 20 Vol.-% Aceton versetzt.
Dann werden 20 kg Aktivkohle zugefügt und etwa 1 h lang gerührt. Die Aktivkohle wird dann abfil- triert und 6 h bei 600C getrocknet. Die getrocknete Kohle wird mit 200 1 Aceton versetzt und 2 h lang bei 40 C gerührt. Diese Extraktion wird zweimal wiederholt. Der Acetonextrakt wird unter verminder- tem Druck bei 40 C konzentriert, wobei etwa 2 1 eines öligen Konzentrats erhalten werden. Dieses Konzentrat wird zweimal mit 10 1 Benzol extrahiert. Der Benzolextrakt wird mit Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Die konzentrierte Benzollösung wird unter Verwendung von aktiviertem Magnesiumsilikat der Säulenchromatographie unterworfen. Es wird unter Verwendung von Benzol eluiert. Die gelben aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck konzentriert, um dann kristallisiert zu werden.
Es wird ein reines kristallines Produkt vom Schmelzpunkt 1250C erhalten. Die Ausbeute an Pyrrolnitrin beträgt etwa 100 g.
Die Stämme B-317 und NB-136 können ebenfalls gezüchtetwerden und liefern das gewünschte Produkt in der gleichen Weise wie oben beschrieben.
Die Stämme B-116, B-317 und NB-136 zeigen die folgenden Eigenschaften und Charakteristika :
Tabelle 1
Zellformen
EMI16.2
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> Stäbe <SEP> (abgerundet) <SEP> Stäbe <SEP> (abgerundet) <SEP> Stäbe <SEP> (abgerundet)
<tb> 0, <SEP> 5-0, <SEP> 8 <SEP> X <SEP> 0, <SEP> 6-0, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 0, <SEP> 5-0, <SEP> 8 <SEP> x <SEP>
<tb> 1, <SEP> 2-2, <SEP> 0p <SEP> 0, <SEP> 9-1, <SEP> 7p <SEP> 0, <SEP> 8-1, <SEP> 3p <SEP>
<tb> liegen <SEP> einzeln <SEP> vor, <SEP> aber <SEP> liegen <SEP> einzeln <SEP> vor, <SEP> liegen <SEP> einzeln <SEP> vor,
<tb> manchmal <SEP> auch <SEP> in <SEP> Paaren <SEP> selten <SEP> in <SEP> Paaren <SEP> und <SEP> selten <SEP> in <SEP> Paaren <SEP> und
<tb> in <SEP> kurzen <SEP> Ketten. <SEP> in <SEP> kurzen <SEP> Ketten.
<tb>
Beweglich <SEP> durch <SEP> polare <SEP> Beweglich <SEP> durch <SEP> polare <SEP> Beweglich <SEP> durch <SEP> polare
<tb> Flagella. <SEP> Flagella. <SEP> Flagella. <SEP>
<tb>
Keine <SEP> Sporenbildung. <SEP> Keine <SEP> Sporenbildung. <SEP> Keine <SEP> Sporenbildung.
<tb>
Gramnegativ. <SEP> Gramnegativ. <SEP> Gramnegativ.
<tb>
Tabelle 2 Kulturmerkmale
EMI16.3
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> Agarnährkolonie <SEP> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C)
<tb> Kreisförmig, <SEP> konvex, <SEP> Kreisförmig, <SEP> konvex, <SEP> Kreisförmig, <SEP> konvex,
<tb> glatt, <SEP> opak, <SEP> vollständig, <SEP> glatt, <SEP> opak, <SEP> vollständig, <SEP> glatt, <SEP> feucht <SEP> opak,
<tb> schwach <SEP> gelb. <SEP> matt <SEP> gelb. <SEP> vollständig, <SEP> schwach
<tb> gelb.
<tb>
<Desc/Clms Page number 17>
Tabelle 2 (Fortsetzung)
EMI17.1
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> Agarnährkolonie <SEP> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C)
<tb> Reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> erhaben, <SEP> Reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> erhaben, <SEP> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> etwas
<tb> vollständig, <SEP> metallisch <SEP> glän- <SEP> vollständig, <SEP> matt <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> sich <SEP> ausbreitend, <SEP> glatt,
<tb> zend, <SEP> schwach <SEP> gelb <SEP> bis <SEP> oliv. <SEP> hell <SEP> oliv. <SEP> feucht, <SEP> schwach <SEP> gelb
<tb> bis <SEP> hell <SEP> oliv.
<tb>
Nährbouillon <SEP> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C)
<tb> Trübe <SEP> mit <SEP> Haut. <SEP> Trübe <SEP> mit <SEP> Haut. <SEP> Trübe <SEP> mit <SEP> Haut.
<tb>
Glutamatagar <SEP> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 370C)
<tb> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> Gutes <SEP> Wachstum,
<tb> cremefarbig <SEP> bis <SEP> gelb. <SEP> schwach <SEP> gelb-orange. <SEP> schwach <SEP> gelb.
<tb>
Glutamatbouillon <SEP> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C)
<tb> Stark <SEP> trübe <SEP> mit <SEP> empfindlicher <SEP> Trübe <SEP> mit <SEP> empfindlicher <SEP> Trübe <SEP> mit <SEP> brüchiger
<tb> Haut. <SEP> Wird <SEP> schwach <SEP> gelb. <SEP> Haut. <SEP> Das <SEP> Medium <SEP> wird <SEP> Haut, <SEP> das <SEP> Medium
<tb> schwach <SEP> gelb-orange. <SEP> wird <SEP> schwach <SEP> gelb.
<tb>
Peptonwasser <SEP> (nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 37 C)
<tb> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> mit <SEP> brüchi- <SEP> Gutes <SEP> Wachstum, <SEP> mit <SEP> emp- <SEP> Gutes <SEP> Wachstum <SEP> mit
<tb> ger <SEP> Haut, <SEP> wird <SEP> gelblich <SEP> grün. <SEP> findlicher <SEP> Haut, <SEP> wird <SEP> grau <SEP> Haut, <SEP> wird <SEP> grau <SEP> bis
<tb> bis <SEP> gelblich <SEP> grün. <SEP> gelblich <SEP> grün.
<tb>
Gelatinestich <SEP> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 12 <SEP> bis <SEP> 200C)
<tb> Infundibuliform <SEP> Verflüssigung, <SEP> Infundibuliform <SEP> Verflüssigung, <SEP> Langsame <SEP> Verflüssigung,
<tb> mit <SEP> Haut <SEP> und <SEP> gelb-grauem <SEP> mit <SEP> Haut <SEP> und <SEP> gelb-grauem <SEP> Napiform. <SEP> Dicke <SEP> Haut
<tb> Sediment. <SEP> Sediment. <SEP> wird <SEP> gebildet.
<tb>
B. <SEP> C. <SEP> P. <SEP> Milch <SEP> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> 37 C)
<tb> Verflüssigung, <SEP> leicht <SEP> saure <SEP> Verflüssigung, <SEP> leicht <SEP> saure <SEP> Verflüssigung, <SEP> leicht
<tb> Eigenschaften <SEP> zeigend. <SEP> Eigenschaften <SEP> zeigend. <SEP> saure <SEP> Eigenschaften
<tb> zeigend.
<tb>
Tabelle 3 Physiologische Eigenschaften
EMI17.2
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136 <SEP>
<tb> Pigmentbildung <SEP> wasserlöslich <SEP> schwach <SEP> purpurfarbiges <SEP> Pigment
<tb> gebildet
<tb> wasserunlöslich
<tb> Indolbildung
<tb> Reduktion <SEP> von <SEP> Nitrat
<tb>
<Desc/Clms Page number 18>
Tabelle 3 (Fortsetzung)
EMI18.1
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> Anaerobisches <SEP> Wachstum <SEP> in
<tb> Gegenwart <SEP> von <SEP> Nitrat <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Bildung <SEP> von <SEP> Schwefelwasserstoff--Hydrolyse <SEP> von <SEP> Stärke <SEP> - <SEP> - <SEP> Catalasenaktivität <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Bildung <SEP> von <SEP> Aceton <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
Toleranz gegen Salz (Fleischextraktnährboden nach 24 h bei 370C)
EMI18.2
<tb>
<tb> NaCl <SEP> (%) <SEP> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> 0,
<SEP> 2 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> # <SEP> # <SEP> #
<tb> 5, <SEP> 0
<tb>
Widerstandsfähigkeit gegen Hitze (80 5 min)
B-116 B-317 NB-136 alle Stämme vollständig abgetötet Wachstumstemperatur (Nährbouillon und Glutamatbouillon, nach 24 h)
EMI18.3
<tb>
<tb> Temperatur <SEP> ( C) <SEP> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> 10
<tb> 26 <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 30 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 37 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> 42 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
Tabelle 3 (Fortsetzung) Wachstums-pH (Peptonwasser,
nach 24 h bei 37 C
EMI19.1
<tb>
<tb> pH <SEP> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> 3 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 4 <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> ¯
<tb> 5 <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 6 <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 7 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> 8 <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 9 <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Oxydationsaktivität
<tb> Glukose
<tb> Glukonsäure <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Glycerin
<tb> Chitochromoxydase <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
Zersetzung von Zuckern unter aerobischen Bedingungen (nach 7 Tagen bei 37 C)
EMI19.2
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> Wachstum <SEP> Säurebildung <SEP> Gasentwicklung
<tb> (Peptonmedium)
<tb> Glukose
<tb> Fructose <SEP> + <SEP> Galactose <SEP> + <SEP> +
<tb> Mannose
<tb> Xylose <SEP> + <SEP>
<tb> Arabinose <SEP> + <SEP>
<tb> Sucrose <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> + <SEP>
<tb> Maltose
<tb> Trebhalose <SEP> +
<tb> Rhamnose <SEP> + <SEP>
<tb> Mannital <SEP> +
<tb> Glycerin
<tb> Inulin
<tb> Cellobiose <SEP> +
<tb> Raffinose <SEP> +
<tb> Stärke <SEP> +
<tb> (Synthetisches <SEP> Medium)
<tb> Glukose <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> + <SEP> +
<tb> Sucrose <SEP> + <SEP> +
<tb> Xylose
<tb> Glycerin
<tb> Stärke
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
Tabelle 3 (Fortsetzung) Wachstum auf den ausgewählten Media nach dem Verfahren von K.
Komagata (nach 7 Tagen bei 37oC)
EMI20.1
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> NB-136
<tb> Glukose-Ammonium-Salz <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> p-Hydroxybenzoat <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> Glukose-Nitrat <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> Succinat-Nitrat <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> Glutamat <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb>
Zersetzung von Zuckern nach dem Hugh-Leifson-Verfahren (nach 7 Tagen bei 37 C)
EMI20.2
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> und <SEP> NB-136
<tb> PH <SEP> Wachstum
<tb> Glukose <SEP> geschlossen <SEP> schwach <SEP> saure <SEP> +
<tb> Eigenschaften
<tb> offen <SEP> stark <SEP> saure..
<tb>
Eigenschaften
<tb> Lactose <SEP> geschlossen <SEP> unverändert
<tb> offen <SEP> sauer <SEP> im <SEP> oberen <SEP> Teil <SEP> +
<tb>
Assimilation von Kohlenstoffverbindungen (nach 7 Tagen bei 370C)
EMI20.3
<tb>
<tb> B-116 <SEP> B-317 <SEP> und <SEP> NB-136
<tb> Wachstum
<tb> Glukose <SEP> +
<tb> Glukonsäure <SEP> + <SEP>
<tb> 2-Ketoglukonat <SEP> + <SEP>
<tb> 5- <SEP> Ketoglukonat <SEP> + <SEP>
<tb> Citrat
<tb> Succinat <SEP> +
<tb> Äthanol <SEP> +
<tb> Phenol
<tb> Benzoesäure <SEP> +
<tb> m-Oxybenzoat <SEP> + <SEP>
<tb> p-Oxybenzoat
<tb> Salicylsäure
<tb> Pyrocatechussäure <SEP> +
<tb> Gentisinsäure <SEP> +
<tb> Anthranilsäure <SEP> +
<tb> p-Aminobenzoat
<tb>
Im Hinblick auf die Kulturmerkmale, wie sie oben beschrieben sind, und unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7.
Auflage) und auf Journal of Agricultural Chemistry, Japan, 35 [1961]. S. 981,36 [1962], S. 663, und 36 [1962], S. 668, werden die Stämme B-116, B-317 und NB-136 als zur Gattung Pseudomonas gehörend identifiziert. Der Stamm B-116 wird jedoch als ein
<Desc/Clms Page number 21>
neuer Stamm angesehen und die Stämme B-317 undNB-136 werden als Varianten von B-116 angesehen, wobei die folgenden Merkmale in Betracht gezogen werden :
1. Wasserlösliche Pigmente, die nicht fluoreszieren, werden gebildet.
2. 2-Ketoglukonsäure wird aus Glukonsäure gebildet.
3. Die Ausnutzung von Sacchariden, insbesondere Disacchariden, ist hochgradig, und aus Lactose und Sucrose wird jeweils eine Säure gebildet.
4. Aus Glukose wird in offenen und geschlossenen Röhrchen eine Säure gebildet. Aus Lactose wird nur in offenem Röhrchen eine Säure gebildet (Hugh-Leifson-Verfahren).
5. Die Ausnutzung der 5-Ketoglukonsäure ist merkwürdig.
6. Im B. C. P. Milch-Test wird Misch mit schwach-saurem pH-Wert flüssig.
Obwohl die obigen drei Stämme einander höchst ähnlich sind, ist weiterhin zu beachten, dass der Stamm B-116 auf Glycerin-Hefeextrakt-Agarmedium ein bläuliches, purpur-rötliches Purpurpigment in der Zelle bildet. Auf der andern Seite wird ein solches Pigment weder durch den Stamm B-317 noch durch den Stamm NB-136 auf dem erwähnten Medium in der Zelle gebildet.
Der Stamm NB-136, der mit den beiden andern Stämmen nicht übereinstimmt, ist auf üblichen Media butterartiger als die andern Stämme. Der Stamm NB-136 reduziert aber Nitrate zu Nitriten im selben Ausmass wie der Stamm B-116 : Nitrite werden nach 24 h und sogar nach 2 Wochen festgestellt.
Im Hinblick auf die obigen Merkmale wird der Stamm B-116 als eine neue Species angesehen und Pseudomonas pyrrolnitrica genannt. Die Stämme B-317 und NB-136 werden als Varianten von Pseudomonas pyrrolnitrica angesehen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Pyrrolnitrin, d. h. des 3- (2-Nitro-3-chlor- phenyl)-4-chlorpyrrols, dadurch gekennzeichnet, dass als Pyrrolnitrin erzeugender Stamm der Gattung Pseudomonas Pseudomonas pyrrocinia ATCC 15958, Pseudomonas ovalis IAM 18003, Pseudo-
EMI21.1
Pseudomonas pyrrolnitrica FRI 82 oder natürliche oder induzierte Mutanten oder Varianten dieser Stämme in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet und aus der so gewonnenen Gärflüssigkeit das Pyrrolnitrin abgetrennt und gereinigt wird.