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Diagnostikum zum quantitativen immunelektrophoretischen Nachweis von Gammaglobulinen und Verfahren zu dessen Herstellung
Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum zum immunoelektrophoretischen Nachweis von Gammaglobulinen mit einer elektrophoretischenMobilitätvon etwa 0, 00002 bis etwa 0, 00008 cm/sec pro
V/cm in freiem Diäthyl-barbiturat-Säurepuffer in einer freien Elektrophorese und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Das erfindungsgemässe Diagnostikum ist dadurch charakterisiert, dass es aus von Säugetieren stammenden Anti (human) gammaglobulinen besteht, worin 1/5 bis 4/5 der freien Aminogruppen des Ursprungsglobulins durch aliphatische Carbonsäurereste mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen im aliphatischen Rest, vorzugsweise durch den Bernsteinsäurerest, blockiert sind.
Die erfindungsgemässen diagnostischen Mittel dienen dazu, die elektrophoretische Mobilität animalischer Anti (human) gammaglobuline durch Blockieren ihrer zugänglichen Aminogruppen zu erhöhen.
Der Ausdruck"Gammaglobuline"oder"Gammaglobulin"deckt einen oder mehrere der speziellen Typen von Gammaglobulinen, die auch als yA, yD, yG, yM oder IgA, IgD, IgG und IgM bekannt sind (Ig = Immunglobulin).
Ein immunelektrophoretisches Verfahren zum quantitativen Nachweise humanen Albumins ist von Carl-Bertil Laurell in Analytical Biochemistry, 15 [1966]. S. 45 bis 52, beschrieben worden.
Der Unterschied in der elektrophoretischen Mobilität bei Albumin und bei der Gammaglobulinfraktion kann in cm/sec/V/cm ausgedrückt werden. Bei Untersuchung in Diäthylbarbiturat-Pufferlösung in freier Elektrophorese beträgt die Mobilität des Albumins 0, 000059 im Vergleich zu 0, 000012 für die Gammaglobulinfraktion.
Das Laurellsche Verfahren gründet sich auf den Unterschied zwischen den elektrophoretischen Mobilitätender schnell wandernden Albuminfraktion von humanem Serum und der Antialbumin enthaltenden Antikörperfraktion von animalischem Antiserum, welche die langsam wandernde Gammaglobulinfraktion ist.
Wenn nun einem Tier, z. B. einer Ziege, eine humane Gammaglobulinfraktion eingespritzt wird, entstehen in der Gammaglobulinfraktion des betreffenden Tierserums Antikörper gegen das humane Gammaglobulin. Gammaglobuline verschiedener Tiere weisen dieselbe elektrophoretische Mobilität auf. Da also hier in bezug auf elektrophoretische Mobilität kein Unterschied vorliegt, lässt sich die diagnostische Methode für Albumin von Laurell für eine Analyse des Gehaltes an humanem Gammaglobulin nicht verwenden.
Vom klinischen Gesichtspunkt aus ist die Laboratoriumsdiagnostik pathologischer Veränderungen des Gammaglobulins bedeutend wichtiger als der Nachweis des Albumingehaltes, da Abweichungen von der normalen Menge an Gammaglobulin mit ernsten Krankheitszuständen im Zusammenhang steht.
Die Erfindung bringt eine Verbesserung beim Nachweis von Gammaglobulinen von Säugetieren, indem beispielsweise dem Anti (human) gammaglobulin von Säugetieren grössere elektrophoretische
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Mobilität erteilt wird und somit ermöglicht wird, in der elektrophoretischen Mobilität Unterschiede zu erhalten, ohne dass dadurch die immunologische Reaktivität beeinträchtigt würde.
Einem geeigneten Tier, z. B. Meerschweinchen, Ziege, Kaninchen, Ratte oder Schaf, wird eine Gammaglobulinfraktion humanen Serums,-IgA, IgD, IgG oder IgM, allein oder als beliebige Mischung-eingespritzt. Das Tier entwickelt Antikörper gegen die fremde (humane) Proteinfraktion. Unter Beachtung der Bedingungen für die Herstellung von Antiserum wird Blut entnommen und für die Erzeugung von Serum oder Gammaglobulinfraktion verarbeitet, die Antikörper gegen die für die Immunisierung verwendete humane Gammaglobulinfraktion enthält.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Diagnostikums besteht darin, dass eine humane Gammaglobulinfraktion einem Säugetier eingespritzt, dem Tier Antikörper gegen die humane Proteinfraktion enthaltendes Blut. abgenommen wird und in der so gewonnenen Antigammaglobulinfraktion die leicht zugänglichen Aminogruppen zu 1/5 bis 4/5 der vorhandenen Gruppen durch Behandeln mit einem aliphatischen Acylierungsmittel blockiert werden, dessen Kette weniger als 10 Kohlenstoffatome enthält, und schliesslich die in einem Teil der freien Aminogruppen mit Carboxyalkylacylgruppen substituierte Antigammaglobulinfraktion isoliert wird.
Geeignete Acylierungsmittel sind Anhydride von Dicarbonsäuren mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, welche durch Reaktion mit einer freien Aminogruppe eine Carboxyalkylcarbamidgruppe ergeben.
Das Blockieren der leicht zugänglichen freien Aminogruppe der Antigammaglobulinfraktion erfolgt durch Mischen der Antigammaglobulinfraktion mit dem erwähnten aliphatischen Acylierungsagens in Proportionen, die den erwünschten Blockierungsumfang der freien Aminogruppen unter den vorliegenden Reaktionsbedingungen ergeben. Danach wird die so carboxyalkylacyl-substituierte, veränderte Antigammaglobulinfraktion isoliert.
Die Reaktion zwischen dem blockierenden Reagens und der Antigammaglobulinfraktion lässt sich vorteilhaft unter alkalischen Bedingungen ausführen, bei einem PH-Wert von etwa 8 bis 8, 5. Die modifizierte Antigammaglobulinfraktion mit blockierten Aminogruppen wird am besten durch Dialyse der dialysierbaren Ingredienzien der Reaktionsmischung gegen Salzlösung isoliert, vorzugsweise gegen eine physiologische Kochsalzlösung. Das Endprodukt kann danach durch ein zweckmässiges Verfahren, wobei sich Gefriertrocknen als das effektivste Verfahren erwiesen hat, von der Reaktionslösung ausgeschieden werden.
Durch eine derartige chemische Modifikation des Antiserums oder dessen Antigammaglobulinfraktion ändert sich die elektrophoretische Mobilität der Antigammaglobulinfraktion und ergibt ein Produkt mit erhöhter elektrophoretischer Mobilität im Vergleich zu der unbearbeiteten Fraktion, ohne dass die immunologische Reaktivität dadurch beeinträchtigt wird.
Für die Blockierung der freien Aminogruppen können folgende Acylierungsverbindungen verwendet werden : alle aliphatischen Dicarbonsäuren, deren Kohlenstoffkette weniger als 10 Kohlenstoffatome enthält, wie z. B. Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Korksäure, Azelainsäure und Sebacinsäure.
Durch Wandlung eines Teils der leicht zugänglichen Aminogruppen der Antigammaglobulinfraktion in Carboxyalkylcarbamidgruppen erhält die so veränderte Fraktion höhere elektrophoretische Mobilität, ohne dass dabei die immunologische Reaktivität des Antigammaglobulins beeinträchtigt wird.
Durch Blockierung der freien Aminogruppen zu 1/5 bis 4/5 erreicht man eine Mobilität von 0, 00002 bis 0, 00008 cm/sec/V/cm in freier Elektrophorese in einem Standardsystem. Die Mobilitätswerte für die verschiedenen Grade der Aminogruppenblockierung, wie sie sich aus der Gel-Elektrophorese und im Vergleich mit Albumin ergeben, gehen aus der Tabelle im untenstehenden Beispiel 2 hervor.
Die Anzahl nicht blockierter, leicht zugänglicher Aminogruppen lässt sich nach einer chemischen Blockierungsreaktion mit beispielsweise Succinylanhydrid (wie in Beispiel 1) feststellen, u. zw. nach der Methode A. F. S. A. Habeebs, Analytical Biochemistry, 14 [1966], S. 328 bis 336, unter Verwendung von 2, 4, 6-Trinitrobenzolsulfonsäure.
Die Erfindung ist in gewissen einzelnen Ausführungen genau beschrieben worden ; es ist jedoch zu verstehen, dass verschiedene Modifikationen und Substitutionen innerhalb der vorliegenden Ansprüche möglich sind.
Beispiel l : Blockierungsagens Succinylanhydrid.
EMI2.1
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restlichen 25 ml wurden unter Umrühren und Abkühlen im Eisbad mit 125 mg Succinylanhydrid versetzt. Der PH-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit Kaliumhydroxydlösung dauernd bei 8 gehalten. Nach 2-stündiger Reaktionszeit erfolgte eine 24-stündige Dialyse gegen physiologische Kochsalzlösung sowie Gefriertrocknen des Reaktionsproduktes.
Das entstehende Succinylderivat des Ziegen-Anti (human) gammaglobulins wurde bis zu einer Konzentration von 2% in Wasser gelöst. Während einer 2-stündigen, vergleichenden Elektrophorese wanderte die ursprüngliche Gammaglobulinlösung nicht, wogegen die succinyl-modifizierte Präparation etwa 5, 5 und Albumin 4, 5 cm wanderte. Dieses Succinylderivat des Antigammaglobulins bewahrte volle immunologische Reaktivität gegen humanes Gammaglobulin der für die Immunisierung verwendeten Art.
Beispiel 2 : Variierende Blockierungsgrade.
Eine Probesrzie wurde mit Antihumangammaglobulin ausgeführt, dessen freie Aminogruppen gemäss Beispiel 1 mit Succinylanhydrid blockiert waren. Die Proben sollten das Verhältnis zwischen der Anzahl blockierter Aminogruppen und der elektrophoretischen Mobilität sowie der immunologischen Spezifität der sich ergebenden, veränderten Antigammaglobuline zeigen. Folgende Ergebnisse wurden mit den hier beschriebenen Verfahren erreicht.
EMI3.1
<tb>
<tb>
Menge <SEP> Succinylanhydrid/ml <SEP> Elektrophoretische <SEP> Mobilität <SEP> Immunologische <SEP> ReaktiviAntigammaglobulinlösung <SEP> (2%) <SEP> in <SEP> Agarosegel <SEP> im <SEP> Verhältnis <SEP> tät <SEP> des <SEP> veränderten
<tb> nach <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> zu <SEP> Albumin <SEP> Gammaglobulins
<tb> 0 <SEP> 1 <SEP> 00/0 <SEP> - <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> 15% <SEP> voll
<tb> 0, <SEP> 3 <SEP> mg <SEP> 25% <SEP> voll
<tb> 1 <SEP> mg <SEP> 75% <SEP> voll
<tb> 5 <SEP> mg <SEP> 135% <SEP> voll
<tb> 10 <SEP> mg <SEP> 175% <SEP> beeinträchtigt
<tb>
Durch Blockieren von 1/5 bis 4/5 der leicht zugänglichen Aminogruppen der Antigammaglobulinfraktion von immunisierten Tieren erhält die Fraktion eine elektrische Mobilität, die die Auswertung der Muster mit humanen Gammaglobulinen, wie sie untenstehend beschrieben wird,
ermöglicht. Der Nachweis der leicht zugänglichen Aminogruppen erfolgt nach der zitierten Methode von Habeeb.
Beispiel 3 : Blockierungsagens gepuffertes Succinylanhydrid.
10 ml Ziegen-Anti (human) gammaglobulin wurden mit 20 ml physiologischem Phosphatpuffer ver- setzt. Die Lösung wurde im Eisbad abgekühlt und 5 mg/ml Succinylanhydrid unter Umrühren zugegeben.
Der PH-Wert der Reaktionslösung wurde mit Kaliumhydroxydlösung dauernd bei 8 gehalten. Nach 1,stündiger Reaktion wurde die Lösung 20 h dialysiert, wonach der Rückstand durch Gefriertrocknen isoliert wurde. Eine immunelektrophoretische Probe mit einer 2% igen wässerigen Lösung der entstandenen Succinylpräparation ergab das Vorhandensein voller immunologischer Reaktivität mit humanem Gammaglobulin, und die erhöhte elektrophoretische Mobilität ermöglichte den quantitativen Nachweis von humanem Gammaglobulin in einem unbekannten Muster.
Das Succinylanhydrid kann durch eine entsprechende Menge des Anhydrids jeder der andern hier erwähnten zweibasischen Säuren ersetzt werden. So kann auch jedes dieser Anhydride durch ein anderes acylierendes Derivat jeder dieser zweibasischen Säuren ersetzt werden, so wie das jeweilig entsprechende Monoacylhalid in der Monoacylchloridform. Die zugänglichen freien Aminogruppen können durch jeweilige Umsetzung mit jedem einzelnen dieser Monoacylchloride blockiert werden, unter den richtigen Bedingungen für eine solche Acylierung mit Acylhalid, um die jeweils entsprechenden Carboxyalkylcarbamidgruppen zu bilden.
Labormethode zur Bestimmung von Gammaglobulinen von Säugetieren.
Auf einer Glasplatte von 120 x 120 mm wird eine 2 mm dicke Schicht aus 1%piger Agarose oder Agar gegossen. Diese Agarose oder das Agar muss vorher im Diäthylbarbiturat-Säurepuffer (Ionenstärke 0, 07 ; 0, 002m-Calciumlactat ; p = 8, 6) gelöst werden. Die Methode entspricht dem oben zitierten, von Laurell beschriebenen Verfahren. Wenn die Agaroseschicht erstarrt ist, wird ein 95 x 25 mm grosses Stück aus der Mitte herausgenommen, so dass man ein Becken erhält.
In diesem Becken wird eine 2 mm dicke Schicht aus gepufferter l% iger Agarose oder Agar, mit Antigammaglobulin mit blockierten Aminogruppen versetzt, gegossen. Nachdem die Schicht erstarrt ist,
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wird eine Reihe 2 mm grosser Löcher in Abständen von 5 bis 10 mm gestanzt. Diese Löcher sollen die
Proben enthalten. Der Abstand vom Beckenrand zur Lochmitte soll etwa 4 mm betragen. Insgesamt finden 12 bis 20 Löcher auf einer Standardplatte Platz.
Bei der einen Alternative für die Ausführung des elektrophoretischen Nachweises wird die Agaroseschicht als Träger verwendet. Bei dieser Ausführung ist ein schnell wanderndes Gammaglobulin mit blockierten Aminogruppen, dessen Mobilität der des Albumins entspricht, vorzuziehen. Die Platte mit der Agaroseschicht wird in einem Elektrophoreseapparat appliziert, wobei die Löcher des Antigammaglobulin enthaltenden Beckens der Anode zu liegen sollen (+). Die Agaroseschicht wird an den Elektrolyt des betreffenden Elektrodengefässes angeschlossen.
In jedem der für Standard- oder Musterproben vorgesehenen Löcher wird die gleiche Menge, vorzugsweise 4 bis 10 p l, eines Humangammaglobulinstandards oder eines Humanserummusters appliziert ; danach wird die Elektrophorese gestartet und für 100 min bei einem Spannungsfall von 10 V/cm ohne Kühlung fortgesetzt.
Nach Abschluss der Elektrophorese werden eventuelle Reste überflüssigen löslichen Proteins mit physiologischer Kochsalzlösung aus den Löchern entfernt. Die Agaroseschicht wird danach getrocknet und mit einem für Proteine geeigneten Farbstoff, wie z. B. Amidoschwarz, Azocarmin oder Bromo-phenolblau, eingefärbt.
Von den Löchern in der Schicht, die die verschiedenen Lösungen des humanen Gammaglobulinstandards und des unbekannten Probemusters von Humanserum enthalten, entwickeln sich in dem Becken mit dem modifizierten Antigammaglobulin Präzipitatspitzen, die sich zu der Anode hin ausbilden.
Für die andere Alternative wird Agar als Träger verwendet. Unbehandeltes Gammaglobulin sowie unbehandeltes Antigammaglobulin zeigen im Agargel elektroosmotische Mobilität in der Richtung zur Kathode.
Die Verwendung eines Antigammaglobulins mit mässiger Aminogruppenblockierung, welches im Verhältnis zu Albumin eine Mobilität von etwa 15 bis 25% besitzt, kompensiert die osmotische Mobilität und lässt das Antigammaglobulin unbeweglich bleiben. Die Löcher für die einzelnen, bestimmten Mengen der verschiedenen Lösungen von Standardgammaglobulin bzw. Probemustern werden ausserhalb des Antigammaglobulin enthaltenden Beckens der Kathode (-) zu gestanzt. Nach der Elektrophorese entwickeln sich Präzipitatspitzen, wenn die Gammaglobuline in das Becken mit den unbeweglichen, chemisch veränderten Antigammaglobulinen wandern.
Labornachweis von Gammaglobulinen von Säugetieren.
Die oben beschriebene Methode wird für die Bestimmung des Gammaglobulingehaltes in Humanserummustern, die serienmässig, d. h. im Verhältnis 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16 und 1 : 32, mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt sind, angewendet.
Das Agarosebecken wird mit l% des nach Beispiel 1 oder 2 erhaltenen, chemisch modifizierten Ziegen-Anti (human) gammaglobulins versetzt.
Für dieBestimmung der Probemuster werdenStandardgammaglobulinlösungenindenKonzentrationen 0, 05 ; 0, 01 ; 0, 2 ; 0, 4 und 0, 8% in die gestanzten Löcher gefüllt.
Die Längen der jeweils entwickelten Präzipitatspitzen werden nach 1- bis 2-stündiger Elektrophorese gemessen. Die Länge der Spitzen bei den bekannten Mustern wird für die Bestimmung der Gammaglobulinmenge in jeder der verschiedenen Lösungen von unbekannten Probemustern benutzt.
Labordiagnostik mit modifiziertem Ziegen-Antigammaglobulinserum.
Nach der vorstehend beschriebenen Methode wurde eine Bestimmung des Gammaglobulingehaltes in einem Humanserummuster ausgeführt.
Das Agarbecken wurde mit 2% des chemisch modifizierten Ziegen-Anti (human) gammaglobulin- serums nach Beispiel 3 versetzt.
Die Verdünnungen des Standardgammaglobulins und der unbekannten Probemuster waren dieselben wie vorstehend angeführt. Drei unbekannte Serummuster wurden untersucht, von denen das eine von einer gesunden Versuchsperson, das zweite von einem Patienten mit klinischen Agammaglobulinämieerscheinungen und das dritte von einem Patienten mit verdächtiger, als rekurrierende Infektionen der oberen Luftwege erscheinende Hypogammaglobulinämie stammte.
In dem ersten Muster wurden 12 mg/ml, im zweiten 0, 1 mg/ml und im dritten 3 mg/ml Gammaglobulin festgestellt, wodurch die klinischen Befunde bestätigt wurden.